CN118085111A - 一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白gE‑Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用，涉及重组带状疱疹疫苗制备技术领域，gE‑Fc包括VZV糖蛋白E的可溶性胞外结构域和人IgG1 Fc结构域，其中，可溶性胞外结构域为31~538aa，如SEQ ID No.1所示；Fc结构域包括Hinge‑CH2‑CH3，如SEQ ID No.2所示，将该融合蛋白与复合佐剂混合，制备重组带状疱疹疫苗，显著提高了细胞免疫效果和抗体效价，增强了对带状疱疹的预防能力。

Description

一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用

技术领域

本发明涉及重组带状疱疹疫苗制备技术领域，更具体的说是涉及一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用。

背景技术

水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus，VZV)属疱疹病毒科(Herpesviridase) α疱疹病毒亚科家族的成员。病毒主要由4部分构成：中央为圆杆状病毒的核心，主要是双链病毒DNA；核心外面为核衣壳，直径约100nm，由162个壳粒构成二十面体对称结构；核衣壳外有一层无定形的物质覆盖称之为皮层，含有蛋白质和酶类；最外一层为囊膜，呈典型的脂质双层膜结构，上有很多突起，囊膜主要由脂质、糖类和蛋白质组成。完整病毒颗粒呈圆形或多角形，直径120~300nm。

VZV DNA分子由125kb组成，分子质量为(80±3)MDa，是目前已知最小的疱疹病毒，VZV基因组由两个相互连接的长片段(L)和短片段(S)DNA构成。VZV全基因组序列含72个可读框，根据DNA序列推断病毒基因编码69种蛋白。基因转录可分为立早期(IE)、早期(E)和晚期(L)3个阶段，表达产物包括各种调节蛋白、结构蛋白及酶类等。目前已知VZV晚期基因产物由30多种，其中至少包括8种糖蛋白：gE、gB、gH、gI、gC、gL、gK及gM，这些糖蛋白主要存在与病毒囊膜和感染细胞的胞膜中，与病毒的致病性和免疫原性有着密切关系。其中gE(也称gpI)分子质量为60~98kDa，是VZV囊膜和感染细胞膜上含量最丰富、抗原性最强的糖蛋白，具有典型的I型跨膜蛋白结构，包括一个544aa的亲水性胞外区、17aa的疏水性跨膜区和62aa富含电荷的胞内区，含N-糖基化和O-糖基化、Cys富含区、唾液酸化微店及Ser/Thr酪氨酸激酶II作用位点。gE在核糖体翻译结束后，通过信号肽进入内质网，在内质网中将信号肽切除，并发生甘露糖基化，通过胞内区的二酸性氨基酸信号肽(DXE)转运至高尔基体，进一步加工呈N-糖基化、O-糖基化的成熟糖蛋白。gE形成的同源二聚体可发生酪氨酸磷酸化。gE可引起T_H/T_C细胞的增殖反应，其特异性抗体具有补体依赖性的中和活性和ADCC作用。

带状疱疹（HZ）是由水痘-带状疱疹病毒（VZV）复苏引起的急性感染性疾病，好发于老年人和免疫低下人群，常伴剧烈的顽固性带状疱疹后神经痛（PHN），严重影响患者生活质量。此外，HZ还可导致病毒播散、中风、脑炎和视力损伤（包括失明）等严重并发症。HZ发病率较高，研究发现90%以上的成人均感染过VZV，其中约 20%的血清学阳性个体在一生中会发生HZ。HZ的治疗包括及时应用抗病毒和镇痛类药物，但这些药物只能减少急性HZ 患者的不适及疼痛症状，不能明显的缩短HZ的病程以及缓解/减少后遗症的发生。随着我国社会老龄化加剧，HZ防控形势更加严峻。

在VZV免疫反应中，抗体有一定的作用但并不关键，由于VZV是细胞内病毒故细胞介导免疫(CMI)在灭活病毒、阻止病毒感染细胞及带状疱疹起着重要作用。参与细胞免疫的细胞有多种，主要有细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、K细胞和NK细胞等。CMI对于VZV感染的恢复和带状疱疹预防很重要，它保持着宿主与潜伏VZV之间的平衡，VZV复发不与VZV抗体水平下降有关而与CMI的丢失有关。

国内尚无重组带状疱疹疫苗上市，有5家企业获得带状疱疹疫苗临床批件，申报品种均为减毒活疫苗。国外已有默克公司的ZOSTAVAX和GSK公司的SHINGRIX（本品）两种带状疱疹疫苗获准上市使用。ZOSTAVAX为全球首个带状疱疹病毒减毒活疫苗，于2005年12月获FDA批准上市，主要用于50岁以上人群 HZ的预防。SHINGRIX为重组带状疱疹疫苗，于2017年10月获 FDA批准上市。重组VZV病毒gE疫苗使用的AS01B佐剂中含有QS21、3D-MPL、以及磷脂酰胆碱等油性佐剂，尽管其效果明显优于VZV减毒活疫苗Zostavax，但它的最大缺点是导致注射部位产生暂时的结节或需要经过较长时间才能消退的结节。本发明致力于通过抗原的合理设计降低佐剂的复杂性进而减少接种的不良反应。

1985年，Wroblewska用提纯的gE/gH接种新西兰兔，检测证明免疫血清具有中和活性。但是大规模从完整病毒中制备亚单位疫苗受到抗原量的限制，成本较高。利用异源宿主系统高效表达外源基因为重组疫苗的发展提供了一个途径。一些学者将缺失胞内区和膜结合区的病毒gE基因片段基因重组后，在CHO细胞、痘苗病毒和昆虫细胞中进行表达，获得一个含511aa的分泌性蛋白。该重组蛋白可刺激产生识别天然gE蛋白的中和抗体和特异性识别感染细胞表面VZV抗原的淋巴细胞，其产生的免疫应答能迅速清除血清中的病毒颗粒。重组疫苗制备工艺复杂，且胞外区gE只含有部分体液和细胞免疫表位，与减毒活疫苗相比所诱导的免疫应答并不充分，免疫原性较弱，所以往往要结合适合的佐剂或者引入额外的蛋白形成二聚体或多聚体以增加其免疫原性。

Fc融合蛋白(Fc-fusion protein)是以免疫球蛋白的Fc段作为分子伴侣，通过分子生物学手段将功能性蛋白与之融合，从而极大地延长功能性蛋白的半衰期。Fc融合蛋白在血浆内有较长的半衰期。Fc段与新生Fc受体（FcRn）的结合并呈pH依赖性：在pH 7.4的生理条件下，FcRn与Fc不结合；在细胞内涵体pH 6.0~6.5的酸性条件下，两者结合，从而避免了融合蛋白在细胞内被溶酶体等快速降解。另外，Fc 段能够增大分子体积，不易被肾小球滤过，也从一定程度上延长了半衰期。 Fc融合蛋白通过Fc铰链区的二硫键连接形成稳定的二聚体。另外，Fc区域可以独立折叠，确保分子的稳定性。Fc融合蛋白可以结合不同的Fc受体，包括FcγRⅠ (CD64)、FcγRⅡ (CD32)、FcγRⅢ (CD16)、FcεRⅠ、FcεRⅡ和FcRn，从而介导不同的生物学功能，如炎症反应、抗体依赖性细胞毒性（ADCC）和补体依赖性细胞毒性（CDC）、调节细胞因子分泌等。而疫苗设计的关键在于有效活化抗原递呈细胞（antigenpresenting cell，APC），由于 APC 表面能够表达 FcR，所以抗原-Fc 融合蛋白能够作为抗原运载工具，借助Fc片段靶向结合 APC，缩短抗原在血浆中的游离时间，减少蛋白酶对抗原的降解，提高抗原半衰期，从而加强抗原的递呈。

因此，提供一种融合蛋白gE-Fc，并将其应用于制备重组带状疱疹疫苗中是本领域技术人员亟需解决的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种融合蛋白gE-Fc及其在制备重组带状疱疹疫苗中的应用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

一种融合蛋白gE-Fc，包括VZV糖蛋白E的可溶性胞外结构域和人IgG1 Fc结构域，其中，可溶性胞外结构域为31~538aa，如SEQ ID NO.1所示；Fc结构域包括Hinge-CH₂-CH₃，如SEQ ID No.2所示。

上述所述的融合蛋白gE-Fc的制备方法，过程包括。

1）将水痘带状疱疹病毒糖蛋白E的可溶性胞外结构域基因与人IgG1 Fc结构域基因进行融合，并连接至载体上，构建重组表达载体。

2）将重组表达载体电转化至CHO细胞中，培养、纯化，获得融合蛋白。

本发明还请求保护所述的融合蛋白gE-Fc在制备重组带状疱疹疫苗中的应用。

本发明还请求保护一种重组带状疱疹疫苗，包括融合蛋白gE-Fc与复合佐剂。

优选地，所述复合佐剂包括铝佐剂和诱导细胞免疫的分子佐剂；所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂；所述诱导细胞免疫的分子佐剂为Toll样受体激动剂，所述Toll样受体激动剂为TLR3和TLR9的激动剂，TLR3的激动剂为dsRNA，特别是聚肌胞。TLR9的激动剂为CpG，特别是CpG ODNs。

优选地，所述铝佐剂的含量为每剂0.4~1.0mg，CpG和或dsRNA含量为每剂5~100μg。

优选地，每1次人用剂量中含有融合蛋白10~200μg。

作为与上述技术方案相同的发明构思，本发明还请求保护一种重组带状疱疹疫苗的制备方法，由融合蛋白gE-Fc与复合佐剂配制而成，包括以下步骤。

（1）制备复合佐剂：将氢氧化铝佐剂和Toll样受体的激动剂混合，氢氧化铝佐剂与Toll样受体激动剂的体积比为10:1~20:1，获得复合佐剂。

（2）将融合蛋白gE-Fc与复合佐剂混合，体积比为1:2~1:5，混匀配制成疫苗。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明实现了VZV gE-Fc融合蛋白基因在哺乳类动物表达系统中的高效表达，在不改变其氨基酸序列的情况下，我们根据哺乳动物细胞偏爱的密码子进行优化，合成VZV糖蛋白E的可溶性胞外结构域，构建gE-Fc融合基因后再以此构建真核表达载体，并转染CHO-K1细胞，利用Protein A-HPLC或ELISA法检测其蛋白表达情况，证实成功实现了VZVgE-Fc融合基因在CHO细胞中的分泌表达。将纯化后的VZV gE-Fc融合蛋白与复合佐剂同时免疫C57BL/6J小鼠，免疫2次以后可以产生高效价的抗体滴度和T细胞反应。

与现有技术相比本发明具有以下优势。

1.本发明选用哺乳类动物细胞CHO-K1高效表达了分泌型的gE-Fc融合蛋白，收获液中融合蛋白产量可达6g/L，所获得的的目标产物为糖蛋白，表达产物主要为二聚体，每个二聚体形式的分子中含2个分子的gE。

2.本发明的gE-Fc为VZV gE的可溶性胞外结构域与人免疫球蛋白Fc结构域(Hinge-CH2-CH3区)的融合蛋白，为降低二硫键错配导致的聚集将其中一个氨基酸进行了突变，后续采用Protein A亲和层析、离子交换层析、疏水层析对目标蛋白进一步的纯化，纯度可达99%左右。

3.本发明的CHO细胞表达的重组gE-Fc融合蛋白为糖基化蛋白且可以液体状态稳定保存，与复合佐剂制备成液体制剂可以高效诱导CMI，成本较冻干制剂低，具有良好的前景和优势。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

附图1为亲和层析纯化后的重组VZV gE-Fc的SEC-HPLC色谱图。

附图2为原液中重组VZV gE-Fc的SEC-HPLC色谱图。

附图3为VZV gE-Fc+Al(OH)₃的Elispot斑点图(从上至下，依次为阳性、阴性、试验孔)。

附图4为VZV gE-Fc+CpG+Al(OH)₃的Elispot斑点图(从上至下，依次为阳性、阴性、试验孔)。

附图5为VZV gE-Fc+聚肌胞+Al(OH)₃的Elispot斑点图(从上至下，依次为阳性、阴性、试验孔)。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

SVLRYDDFHIDEDKLDTNSVYEPYYHSDHAESSWVNRGESSRKAYDHNSPYIWPRNDYDGFLENAHEHHGVYNQGRGIDSGERLMQPTQMSAQEDLGDDTGIHVIPTLNGDDRHKIVNVDQRQYGDVFKGDLNPKPQGQRLIEVSVEENHPFTLRAPIQRIYGVRYTETWSFLPSLTCTGDAAPAIQHICLKHTTCFQDVVVDVDCAENTKEDQLAEISYRFQGKKEADQPWIVVNTSTLFDELELDPPEIEPGVLKVLRTEKQYLGVYIWNMRGSDGTSTYATFLVTWKGDEKTRNPTPAVTPQPRGAEFHMWNYHSHVFSVGDTFSLAMHLQYKIHEAPFDLLLEWLYVPIDPTCQPMRLYSTCLYHPNAPQCLSHMNSGCTFTSPHLAQRVASTVYQNCEHADNYTAYCLGISHMEPSFGLILHDGGTTLKFVDTPESLSGLYVFVV YFNGHVEAVA YTVVSTVDHF VNAIEERGFP PTAGQPPATT KPKEITPVNP GTSPLLRY，如SEQ IDNO.1所示。

EPKSSDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC SVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK，如SEQ ID NO.2所示。

AGCGTGCTGAGGTACGATGACTTCCACATCGATGAGGACAAGCTGGACACCAACAGCGTGTACGAGCCCTACTACCACTCCGATCACGCCGAGTCCAGCTGGGTGAATAGAGGCGAGAGCAGCAGGAAGGCCTACGATCACAACAGCCCCTACATCTGGCCTAGAAATGACTACGACGGCTTTCTGGAGAACGCCCACGAGCACCACGGCGTGTACAACCAGGGCAGGGGCATCGATTCCGGCGAGAGGCTGATGCAGCCCACACAGATGAGCGCCCAGGAGGATCTGGGCGACGATACAGGCATCCACGTGATCCCTACCCTGAACGGCGATGACAGGCACAAGATCGTGAATGTGGACCAGAGACAGTACGGCGACGTGTTTAAGGGCGACCTGAATCCCAAGCCCCAGGGCCAGAGGCTGATCGAGGTGTCCGTGGAGGAGAATCACCCTTTCACCCTGAGGGCCCCCATCCAGAGAATCTACGGCGTGAGATACACCGAGACCTGGTCCTTCCTGCCCTCCCTGACCTGTACAGGCGATGCCGCCCCTGCCATCCAGCACATCTGCCTGAAGCACACCACATGTTTTCAGGACGTGGTGGTGGATGTGGACTGTGCCGAGAACACAAAGGAGGATCAGCTGGCCGAGATCAGCTACAGGTTTCAGGGCAAGAAGGAGGCCGACCAGCCTTGGATCGTGGTGAATACAAGCACCCTGTTTGATGAGCTGGAGCTGGATCCCCCTGAGATCGAGCCCGGCGTGCTGAAGGTGCTGAGGACCGAGAAGCAGTACCTGGGCGTGTACATCTGGAACATGAGGGGCAGCGATGGCACCAGCACATACGCCACATTCCTGGTGACATGGAAGGGCGACGAGAAGACAAGGAACCCCACCCCCGCCGTGACCCCCCAACCAAGAGGCGCTGAGTTTCACATGTGGAACTACCACAGCCACGTGTTTTCCGTGGGCGATACCTTTTCCCTGGCCATGCACCTGCAGTACAAGATCCACGAGGCCCCTTTCGACCTGCTGCTGGAGTGGCTGTACGTGCCCATCGACCCTACATGCCAGCCTATGAGACTGTACTCCACCTGCCTGTACCACCCTAATGCCCCCCAGTGTCTGAGCCACATGAATTCCGGCTGCACATTCACTTCCCCCCACCTGGCCCAGAGAGTGGCCAGCACAGTGTACCAGAACTGTGAGCACGCCGACAACTACACAGCCTACTGCCTGGGCATCTCCCACATGGAGCCTAGCTTTGGCCTGATCCTGCACGACGGCGGCACAACACTGAAGTTTGTGGATACCCCCGAGAGCCTGTCCGGCCTGTACGTGTTTGTGGTGTACTTCAACGGCCACGTGGAGGCCGTGGCCTACACAGTGGTGAGCACCGTGGACCACTTCGTGAACGCCATCGAGGAGAGGGGCTTTCCCCCCACCGCCGGACAGCCTCCAGCCACCACAAAGCCCAAGGAGATCACACCTGTGAACCCCGGCACATCCCCTCTGCTGAGATACGAGCCCAAATCTTCTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACGTGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCCGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA，如SEQ ID NO.3所示。

实施例1质粒表达载体的构建。

本发明所述的水痘带状疱疹病毒糖蛋白E(VZV gE)是gE蛋白的可溶性胞外结构域(31~538aa)，共508个氨基酸；Fc段为人IgG1 Fc，包括Hinge-CH₂-CH₃，共232个氨基酸(SEQID No.2)，在不影响免疫原性的前提下对1个氨基酸进行了突变，将SEQ ID No.2中的第5位半胱氨酸突变为丝氨酸。将水痘带状疱疹病毒糖蛋白E的可溶性胞外结构域基因与人IgG1Fc结构域进行融合，委托机构合成基因并连接至载体上，所合成的基因包括酶切位点、Kozak序列、信号肽、目的基因(2220bp)（SEQ ID No.3）、终止密码子、筛选基因等。该基因合成时进行了密码子优化以利于目标蛋白的分泌与表达。

实施例2稳转株的筛选。

在生物安全柜内，设定基因脉冲发生器的穿孔电压为250V电压、800μF单脉冲、电阻无穷大，取出间隙为4mm的一次性电击杯，加入350μg直线化的质粒DNA(100μl)及0.5mlCHO K1细胞悬液(2.0×10⁷cells/ml)，通过电转染的方法将线性化后的质粒VZV gE-Fc转染至CHO K1细胞内，将电击杯内的细胞转移至125ml摇瓶内，加入250ml CHO培养液，于36.5℃、5％CO₂摇床上培养，125转/分钟，培养24小时之后，低速离心收集细胞，更换为含25μMMSX的CHO培养液，通过有限稀释法将细胞转入96孔平底培养板内，将培养板置于36.7℃、10％CO₂培养箱内培养，倒置显微镜下观察，标记单克隆细胞孔，之后通过ELISA和proteinA-HPLC方法筛选出表达量较高的单克隆株，连续传代培养、检测，最终获得了3个高表达目的基因的细胞克隆株，克隆编号分别为B39、B52和B69；根据传代稳定性研究结果，选择表达和遗传稳定且产量高的单克隆细胞株进行放大试验。

实施例3目标蛋白的表达。

将获得的单克隆细胞接种到含80ml CHO培养基的250ml摇瓶内，旋紧透气瓶盖，于36~37℃、5％CO₂、125r/min的摇床上培养，培养3~4天之后，将细胞转移到一个内含400mlCHO培养基的1.6L摇瓶内，进行Fed-Batch培养。培养3~4天细胞数达到5~8*10⁶vc/ml后开始每天补料，补加3%A、0.3%B，逐日取样检测细胞密度、细胞活率、结团率、粒径、葡萄糖含量、乳酸含量及渗透压，如果葡萄糖含量低于10mmole/L，则补加50％葡萄糖溶液到摇瓶内，直到葡萄糖含量达到20mmole/L；培养14天或细胞活力低于85%进行收获，3000rpm离心20min去除细胞及细胞碎片，收集细胞培养物上清。

实施例4目标蛋白的纯化。

ProteinA亲和层析柱预先用20mM PBS(pH7.4，150mM NaCl)平衡，上样前将细胞培养物上清经0.45μm滤膜过滤。之后用20mM PBS冲洗5个柱体积至A280回到基线水平；将冲洗液换成0.1M柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH3.5~4.5)洗脱目标蛋白，将收集到的洗脱物室温下放置60分钟(低pH灭活病毒)，之后用2M Tris调节pH至7.0~7.4，经0.45μm滤膜过滤进一步除去不溶性颗粒。Protein A亲和层析纯化获得的蛋白质溶液经日立D-2000 Elite HPLC(东曹G3000PWXL色谱柱，7.8mm×30cm，东曹(上海)生物科技有限公司))检测，主峰(二聚体)占比约为85％左右，单体和多聚体占比分别在10%以内，色谱图见图1。

之后将收获的含目标产物的溶液加载到经20mM PB(pH7.0~7.4)缓冲液平衡好的QSepharose High Performance (或Maxtar Q HR等)，加载完成后，使用20mM PB缓冲液流洗色谱柱至A280回到基线水平，用150~250mM NaCl溶液洗杂，300~500mM NaCl溶液洗脱目标蛋白VZV gE-Fc，用2.0M NaCl溶液再生阴离子交换色谱柱2个柱体积，最后经20mM PB(pH7.0~7.4)缓冲液平衡后备用。

将收获的VZV gE再加载至经20mM PB-0.5M 硫酸铵(pH6.0~6.5)缓冲液平衡好的Maxtar Phenyl HR(或其他适宜的疏水色谱柱)，加载完成后使用20mM PB-0.5M 硫酸铵冲洗层析柱至A280回到基线水平，然后用0.3~0.45M 硫酸铵洗杂，20mM PB洗脱目标产物。

将疏水层析收获的目标蛋白用50kD膜包进行超滤浓缩并换液至20mM PB，蛋白浓度在5~10mg/ml之间，0.22μm除菌过滤后2~8℃保存，即为原液。

纯化后的VZV gE-Fc用日立D-2000 Elite HPLC(东曹G3000PWXL色谱柱，7.8mm×30cm，东曹(上海)生物科技有限公司))进行纯度检测，流动相为0.14 mol/L KH₂PO₄+0.06 MK₂HPO₄+0.25 M KCl (pH 6.2)，流速0.5ml/min，A280检测结果表明VZV gE-Fc纯度达99％以上，结果见图2，相对分子量约200KDa。

实施例5制备含佐剂的疫苗。

将实施例4所得疫苗原液，用20mMPB(pH7.0~7.4)稀释到1mg/ml，室温条件下与复合佐剂混悬液混合均匀，2~8℃孵育30~40min。

自2~8℃取出含复合佐剂的疫苗溶液，无菌条件下分装入2ml西林瓶内，每瓶0.3ml，密封后放置于2~8℃避光保存。

下表以配制300ml体积的不同VZV gE-Fc含量的疫苗为例，使用含VZV gE-Fc浓度为1mg/ml的疫苗原液配制含复合佐剂疫苗，配制方法如下：

表1 不同抗原含量的VZV gE-Fc氢氧化铝复合佐剂疫苗液的配制

实施例6动物试验。

自2~8℃中取出含VZV gE-Fc 5~10mg/ml的原液，用20mM PB稀释成含VZV gE-Fc1.0mg/ml的溶液，之后加入5倍体积的佐剂，配制成含VZV gE 50μg/0.3ml的动物实验用佐剂疫苗。

将4~6周龄的雌性C57BL/6J随机分成6组，每组6只，三组佐剂对照组每只小鼠皮下注射佐剂0.3ml；3个实验组分别皮下注射0.3ml佐剂和VZV gE-Fc，每组注射6只小鼠；初次免疫后间隔三周免疫第2次，共免疫2次，第2次免疫后14天眼球取血，分离血清后冻存于-20℃，取脾脏立即进行Elispot试验。

ELISA抗体效价检测：用碳酸盐缓冲液将重组VZV gE蛋白稀释到2μg/ml，包被 96孔酶标板(Thermo)，每孔100μl，2~8℃放置过夜；倒掉96孔板内的液体，用20mM PBST洗3次，之后每孔加入300μl封闭液(5％脱脂奶粉)，室温封闭1.5小时；倒掉孔内的封闭液，用20mMPBS-T溶液洗涤3遍，将经过1:1000(或1:10000)预稀释的小鼠血清加入到96孔酶标板的第一列孔内，之后进行2倍系列稀释，阴性对照为使用PBS皮下免疫的小鼠血清(1:1000或1:2000)，37℃反应60分钟，倒掉孔内的封闭液，用20mM PBS-T溶液洗涤3遍；取出羊抗小鼠IgG-HRP结合物，用酶结合物稀释液1:20000稀释，然后加入到96孔酶标板内，每孔100μl，37℃反应1小时；吸出孔内的封闭液，用20mM PBS-T溶液洗涤5~6遍，每孔加入TMB显色液50μl，室温放置15分钟后加入50μl终止液终止反应，之后用深圳汇松酶标仪测定A450/A630吸光值，以阴性对照组混合血清A450/A630的2.1倍作为Cut-Off值(如阴性对照A450值低于0.05，按0.05计算)，判定免疫后血清的效价。各实验组小鼠的血清中抗VZV gE抗体滴度的几何平均值及标准差见下表2；2次免疫后，小鼠血清抗体均出现阳转；对各组实验动物测定的抗体效价进行统计分析显示，不同佐剂组合物的实验小鼠经2次免疫后ELISA效价介于40万~144万之间，CpG或PolyIC的ELISA效价无明显差异。

血清中和抗体效价测定：本试验为在平底96孔微孔板上进行的VZV血清中和试验，细胞基质为对VZV敏感的MRC-5细胞(购自ATCC)。自-20℃冰箱内取出冻存的血清，室温下融化后，56℃水浴灭活30min，在无菌净化工作台内将待检血清用含10％灭活牛血清的MEM培养液(Gibco)进行1：2倍系列稀释，共8个稀释度，每个稀释度做两孔测定，阳性对照血清为豚鼠VZV抗血清，阴性对照血清使用PBS免疫的小鼠混合血清(1:4稀释)，将稀释好的待检血清与500~1000PFU的VZV Oka株病毒(购自美国ATCC)在1.5mlEP管内进行混合，之后放置于37℃水浴箱内孵育60min。

自二氧化碳培养箱内取出已长满单层的96孔板MRC-5细胞(ATCC，代次30~35代)，在百级净化工作台内倒出96孔板内的培养液。自培养箱内取出含待测血清的1.5mlEP管，用移液器沿壁加入96孔板内，盖好板盖，微孔板振荡器上震荡30秒钟，放入5%CO₂、37℃培养箱内培养7~10天，准确记录每个孔的病变情况。采用Reed-Mucnch公式计算50%中和终点，即血清的中和效价。

表2 不同铝佐剂组合物疫苗免疫C57BL/6J小鼠后的血清抗体效价(ELISA)

将ELISA效价达到1:1280000的任意抗血清进行混合，然后测定中和抗体效价，结果为155。

细胞免疫评价的Elispot方法：疫苗制剂诱导细胞免疫反应通过体外的脾细胞刺激后可以分泌γ-干扰素的细胞频率来确定。免疫程序结束后，小鼠眼球取血后断颈处死，在超净台内解剖小鼠并取出脾脏，将脾脏放入含无菌PBS的EP管中。准备一个六孔板，每孔中加入4ml分离液，将脾脏转移至70μm筛网中并放入脾细胞分离液中，用注射器活塞进行研磨，此时分离液即为脾细胞悬液，每个脾脏可以分离出2*10⁷~1*10⁸个脾细胞。在96孔Elispot板(提前包被γ-干扰素抗体)中，每孔加入20万个脾细胞和4μg的重组蛋白VZV gE-Fc ，阴性孔加入培养基，阳性孔加入PMA+离子霉素。在37℃的细胞培养箱中静置培养35~45h后进行斑点显色，并用Elispot读板仪进行读数。结果如图3~图5所示。

gE-Fc与Al(OH)₃佐剂的组合物免疫的小鼠，诱导出γ-干扰素阳性的T细胞几乎为零。但是，Al(OH)₃佐剂与TLR受体CpG或聚肌胞的复合佐剂分别诱导了大量的γ-干扰素阳性的T细胞，其中每百万个脾细胞中，CpG-Al(OH)₃配制的疫苗诱导的γ-干扰素阳性的T 细胞高达1000SFU，聚肌胞-Al(OH)₃配制的疫苗诱导的γ-干扰素阳性的T 细胞高达2300SFU。说明本发明中的gE-Fc蛋白与配方简单的复合佐剂就能产生有效的细胞免疫，进而有效预防带状疱疹的发生。

表3 不同佐剂疫苗免疫C57BL/6J小鼠后诱导γ-干扰素阳性的T细胞数

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种融合蛋白gE-Fc，其特征在于，包括VZV糖蛋白E的可溶性胞外结构域和人IgG1Fc结构域，其中，可溶性胞外结构域为31~538aa，如SEQ ID NO.1所示；Fc结构域包括Hinge-CH₂-CH₃，如SEQ ID No.2所示。

2.权利要求1所述的融合蛋白gE-Fc的制备方法，其特征在于，过程包括：

1）将水痘带状疱疹病毒糖蛋白E的可溶性胞外结构域基因与人IgG1 Fc结构域基因进行融合，并连接至载体上，构建重组表达载体；

2）将重组表达载体电转化至CHO细胞中，培养、纯化，获得融合蛋白。

3.权利要求1所述的融合蛋白gE-Fc在制备重组带状疱疹疫苗中的应用。

4.一种重组带状疱疹疫苗，其特征在于，包括融合蛋白gE-Fc与复合佐剂。

5.根据权利要求4所述的一种重组带状疱疹疫苗，其特征在于，所述复合佐剂包括铝佐剂和诱导细胞免疫的分子佐剂；所述铝佐剂为氢氧化铝佐剂；所述诱导细胞免疫的分子佐剂为Toll样受体激动剂，所述Toll样受体激动剂为TLR3和TLR9的激动剂，TLR3的激动剂为dsRNA，所述dsRNA为聚肌胞；TLR9的激动剂为CpG，所述CpG为CpG ODNs。

6.根据权利要求5所述的一种重组带状疱疹疫苗，其特征在于，所述铝佐剂的含量为每剂0.4~1.0mg，CpG和或dsRNA含量为每剂5~100μg。

7.根据权利要求6所述的一种重组带状疱疹疫苗，其特征在于，每1次人用剂量中含有融合蛋白10~200μg。

8.一种重组带状疱疹疫苗的制备方法，其特征在于，由融合蛋白gE-Fc与复合佐剂配制而成，包括以下步骤：

（1）制备复合佐剂：将氢氧化铝佐剂和Toll样受体的激动剂混合，氢氧化铝佐剂与Toll样受体激动剂的体积比为10:1~20:1，获得复合佐剂；

（2）将融合蛋白gE-Fc与复合佐剂混合，体积比为1:2~1:5，混匀配制成疫苗。