[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

CN110229219B - 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途 - Google Patents

一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN110229219B
CN110229219B CN201910547720.2A CN201910547720A CN110229219B CN 110229219 B CN110229219 B CN 110229219B CN 201910547720 A CN201910547720 A CN 201910547720A CN 110229219 B CN110229219 B CN 110229219B
Authority
CN
China
Prior art keywords
ser
protein
leu
asn
lys
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910547720.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110229219A (zh
Inventor
肖庚富
张艳君
朱圣淋
张磊珂
吴妍
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Institute of Virology of CAS
Original Assignee
Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Institute of Virology of CAS filed Critical Wuhan Institute of Virology of CAS
Priority to CN201910547720.2A priority Critical patent/CN110229219B/zh
Publication of CN110229219A publication Critical patent/CN110229219A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110229219B publication Critical patent/CN110229219B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55572—Lipopolysaccharides; Lipid A; Monophosphoryl lipid A
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18522—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途，涉及生物医药技术领域，该疫苗蛋白包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白组成的融合蛋白，该融合蛋白能有效刺激机体产生较高滴度的中和抗体以及SH蛋白特异性抗体，在病毒感染时，能够有效清除受试者肺部的病毒滴度，同时，也能减轻受试者肺部因病毒感染引起的病理损伤，此外，还能够降低被感染者肺部的促炎症因子含量。

Description

一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途。
背景技术
目前，呼吸道合胞病毒属于单股负链RNA病毒目，肺病毒科，正肺炎病毒属，根据病毒表面的抗原特性差异分为A和B两个亚型。病毒基因组为单链负义非分节的RNA，共包含10个基因，编码11个蛋白。呼吸道合胞病毒是引起婴幼儿下呼吸道疾病的重要病原体之一，婴幼儿时期感染呼吸道合胞病毒是引起支气管炎及哮喘的重要因素，而且呼吸道合胞病毒可以重复感染并引起相关的疾病症状。
由于接种福尔马林灭活的全病毒疫苗所造成的疫苗引起的疾病增强现象，严重阻碍了呼吸道合胞病毒的疫苗研究进展，呼吸道合胞病毒的疫苗设计面临着很多困难与挑战。截止到目前为止，并未有安全有效的呼吸道合胞病毒疫苗批准上市。
呼吸道合胞病毒的F糖蛋白参与病毒进入的膜融合过程，能够刺激引起机体有效的抗体应答反应。目前FDA批准的用于抑制呼吸道病毒感染的帕丽珠单抗所识别的抗原表位位于F糖蛋白表面，并且F蛋白的氨基酸在病毒的两个亚型中相对保守，因此F蛋白是呼吸道合胞病毒疫苗设计的重要靶位点之一。
目前，进入到临床阶段的呼吸道合胞病毒疫苗有约18种，其中有11种含有F蛋白抗原。F糖蛋白作为呼吸道合胞病毒疫苗的抗原之一，但是现有F蛋白亚单位疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度较低。
发明内容
为了弥补现有F蛋白单位疫苗刺激机体产生的中和抗体滴度较低的技术问题，本发明提供了一种新的针对呼吸道合胞病毒的疫苗抗原，该疫苗抗原包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白。
本申请的发明人将F蛋白和SH蛋白组成的疫苗抗原作为新型疫苗，其能够由此刺激机体产生较高滴度的中和抗体以及SH蛋白特异性抗体，在病毒感染时，能够有效清除受试者肺部的病毒滴度，同时，也能减轻受试者肺部因病毒感染引起的病理损伤，此外，还能够降低被感染者肺部的促炎症因子含量。
优选地，本发明实施例提供的疫苗抗原为F蛋白和SH蛋白的融合蛋白。
更优选地，融合蛋白中的SH蛋白优选采用呼吸道合胞病毒的SH蛋白的胞外域(SHe)，组成的融合蛋白为融合蛋白F-SHe。具体地，融合蛋白F-SHe的氨基酸序列如SEQ IDNo.1所示。编码该融合蛋白F-SHe的核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.4所示。
相对于F蛋白与SH蛋白混合作为疫苗抗原进行的免疫，将融合蛋白F-SHe免疫机体，更能有效刺激机体的免疫应答，在病毒感染时，即能有效降低被感染者的肺部病理滴度，又能减轻被感染者肺部的病理损伤。
进一步地，本申请的发明人通过付出一系列创造性劳动，优化了上述融合蛋白的序列，通过密码子优化以及蛋白氨基酸序列的优化，有效提高了融合蛋白的表达水平。具体地，序列优化后，融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，编码该优化后的融合蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.5所示。
进一步地，发明人将F蛋白的第26～513位氨基酸(去除136～145位氨基酸，提高表达效率)与SH蛋白的26个氨基酸克隆到表达载体上，F蛋白与SH蛋白之间通过GS linker(接头序列)相连。GS linker的序列为CGGGS。
相对于没有去除融合肽的融合蛋白，去除了融合肽的融合蛋白能够更有效刺激机体产生较高滴度的中和抗体。去除了融合肽的融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码去除了融合肽的融合蛋白的核酸分子的碱基序列如SEQ ID No.6所示。
需要说明的是，在上述优化前的融合蛋白的基础上，去除融合肽也在本发明的保护范围中。
本发明实施例还提供了一种表达载体，其包括有上述疫苗抗原的融合蛋白的编码序列，该表达载体用于转载上述疫苗抗原的编码序列。
优选地，该表达载体可以为PsecTag2A。
本发明实施例还提供了一种疫苗抗原的制备方法，其包括在使宿主细胞能够产生上述疫苗抗原的条件下，将一个或多个上述表达载体导入宿主细胞。
优选地，宿主细胞选自真核细胞。F蛋白为病毒的膜蛋白，采用真核细胞为宿主细胞具有表达优势，能够更有效地完成蛋白的翻译后修饰等过程。
优选地，宿主细胞采用真核悬浮细胞，悬浮细胞表达蛋白能够提高蛋白的表达产量，且悬浮细胞培养所使用的为无血清的培养基，方便进行后续的蛋白纯化工作，避免了血清等不明成分的蛋白干扰。需要说明的是，在一些实施例中，也可以通过其他的宿主细胞所代替，例如CHO-S细胞，昆虫细胞表达，以及其他的贴壁细胞。表达条件中所采用的转染试剂以及转染方法也可以用其他方法代替。
进一步地，上述将表达载体导入宿主细胞具体包括将表达载体与转染试剂混合后转染宿主细胞，转染试剂优选为PEI，转染试剂与表达载体的质量比为1.25：(4.1～5.5)。
进一步优选地，上述导入包括将转染试剂与表达载体混合后的混合物室温静置5～15min后转染宿主细胞，转染后4～6h，加入转染体系40％～60％体积的新鲜培养基和18～22mM的VPA。
进一步地，宿主细胞表达得到融合蛋白F-SHe后，制备方法还包括对F-SHe蛋白进行蛋白纯化。优选地，蛋白纯化包括将上述转染后得到的细胞溶液进行离心，收集细胞上清，对细胞上清通过透析、亲和层析纯化后，得到纯化后的融合蛋白。
进一步优选地，上述离心条件为：4800～5200rpm，0～6℃离心8～12min，以去除细胞；
上述透析的条件为：将离心后的细胞上清转移到7～14Mw的透析袋中，在90～110mM磷酸盐、140～160mM NaCl、pH7.0～7.6的溶液中2～6℃透析过夜；
上述亲和层析纯化的条件为：将透析后的细胞上清通过亲和层析进行富集，然后采用90～110mM磷酸盐，140～160mM NaCL,280～320mM咪唑(post-fusion F 280～320mM咪唑，pre-fusion F 80～120mM咪唑)pH 7.2～7.6进行洗脱。具体地，可以采用镍柱亲和层析来纯化，然后用300mM的咪唑洗脱，得到的蛋白通过SDS-PAGE鉴定其纯度。需要说明的是，采用镍柱亲和层析对融合蛋白F-SHe进行蛋白纯化取决于融合蛋白F-SHe所携带的标签，在其他实施例中，也可以通过更换标签选择其他的纯化方法。
进一步地，本发明实施例提供的制备方法包括对蛋白纯化后的融合蛋白继续拧浓缩，优选采用超滤管进行浓缩，浓缩后，将融合蛋白与佐剂混合，佐剂优选为MPL。
具体地，浓缩步骤包括将蛋白纯化后的融合蛋白F-SHe透析在PBS溶液中，通过超滤管进行浓缩，然后采用BCA蛋白定量试剂盒确定蛋白的浓度。
本发明实施例还提供一种免疫原性组合物，其包括至少一种上述的疫苗抗原。优选地，该免疫原性组合物还可以包括有佐剂，佐剂优选主要含有MPL(单磷酰脂质A，3-0-descyl-4’-monophosphoryl lipidA)。
优选地，本实施例提供的免疫原性组合物中，佐剂由以下方法制得：在MPL中加入2％triethylamine生理盐水，v/v，溶解，溶解后MPL的浓度为2mg/ml，65℃水浴锅中溶解5min，并用涡旋仪振荡，以便MPL充分溶解。
进一步优选地，在免疫原性组合物中，佐剂和融合蛋白的质量比为1：(1～3)，优选为1：2。
此外，本发明实施例还提供一种在对象中产生针对呼吸道合胞病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予对象有效量的上述免疫原性组合物。
具体地，该方法包括给予患者有效量的免疫原性组合物，可通过粘膜、皮内、皮下、肌肉内和/或口服来给予免疫原性组合物，在某些方面，接种引起的免疫应答使得该对象可抵御一种或多种呼吸道合胞病毒的多种亚型。
优选地，该方法能够用于以非治疗诊断为目的应用中。
本发明实施例还提供了上述融合蛋白F-SHe在制备用于抑制促炎症因子降低的药物中的应用。
优选地，上述促炎症因子优选为IL-1β和MIP-1α。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实施例2中提供的F-SHe融合蛋白的免疫效果图，其中，附图1A为中和抗体滴度图，附图1B为针对SH蛋白胞外域的抗体滴度图；
图2为本发明实施例2中感染后小鼠肺部的病毒滴度(图2A)和体重的检测结果图(图2B)；
图3为本发明实施例2中感染后第7天，小鼠体重的检测结果图；
图4为本发明实施例2中病理损伤的实验结果图，其中，图4A为病理切片染色结果图，图4B为对疫苗对肺部的炎症状况的打分结果图；
图5为本发明实施例2中融合蛋白F-SHe对被感染者体内IL-1β的含量影响的结果图；
图6为本发明实施例2中融合蛋白F-SHe对被感染者体内MIP-1α的含量影响的结果图；
图7为本发明对比例1中优化制备工艺前后蛋白产量的检测图；
图8为本发明对比例2中融合蛋白F-SHe序列优化前后的蛋白表达量的差异结果图；
图9为本发明对比例3中融合蛋白F-She与F蛋白、SH蛋白混合的差异结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
定义
本发明提供的疫苗抗原能够在合适的表达系统中重组表达蛋白质后自发形成，生成特定疫苗抗原的方法在本领域中已知，并在下文中更详细地讨论。重组表达病毒蛋白后，疫苗抗原的存在能够采用本领域已知的常规技术进行检测，领域通过电子显微镜、生物物理和免疫学表征等。
本文所述的有效量为足以实现生物学效果所需的疫苗抗原剂量。组合物的有效量可以是获得所需结果的量，该量可以由本领域技术人员通过常规实验确定。
本文中“佐剂”是指当在制剂汇总与特定免疫抗原(疫苗抗原)组合使用时，能够增强或改良其所产生的的免疫应答的化合物。
实施例1
本实施例提供的一种呼吸道合胞病毒疫苗的制备方法，其包括以下步骤。
1.构建融合蛋白F-SHe的表达质粒：
将F蛋白的26～513(去除融合肽136～145氨基酸，提高表达效率)位氨基酸与SH蛋白的胞外域的26个氨基酸(F蛋白和SH蛋白的胞外域之间通过GS linker相连，GS linker的序列为：CGGGS)的融合蛋白克隆到PsecTag2A真核表达载体上，得到包含F-SHe的表达质粒，载体自带His标签。
融合蛋白F-SHe的碱基序列如SEQ ID No.6所示，融合蛋白F-SHe的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.融合蛋白F-SHe的表达和纯化：
将步骤1中构建好的的表达质粒瞬时转染到Freestyle 293-F真核细胞系中，所用转染试剂为PEI。
转染前24小时，将细胞传代，密度控制在1×106个/ml。对细胞进行计数，取出转染所需的细胞(转染时细胞密度为1×106个/ml，10ml的转染体系需107个细胞)，100g离心5分钟，去除培养基上清，加入待转染体系一半体积的新鲜培养基(转染体系为10ml时加入5ml的新鲜培养基)，将细胞重悬吹打混匀，放置在细胞摇床中培养待用。
1×106个细胞转染所需质粒为1.25μg，转染试剂PEI 5μg。将1.25μg质粒和5μgPEI分别溶解在25μl的150mM的NaCl溶液中去。将质粒与PEI等体积混匀后，室温静置10分钟，加入到已准备好的细胞中去。4-6小时候后，补加转染体系一半体积的新鲜培养基到已转染质粒的细胞中去，并加入20mM的VPA(丙戊酸)。
转染6-7天后，5000rpm，4℃离心10分钟，去除细胞，收集细胞上清，将上清转移到7-14Mw的透析袋中，在100mM磷酸盐，150mM NaCl,pH7.4的溶液中4℃透析过夜。透析结束后，细胞上清通过0.8μm的滤膜去除残留细胞残渣。
处理过的细胞上清通过镍亲和层析进行富集，通过100mM磷酸盐，150mM NaCL,300mM咪唑(post-fusion F 300mM咪唑，pre-fusion F 100mM咪唑)pH7.4进行洗脱。得到的融合蛋白F-SHe通过SDS-PAGE鉴定其纯度。
3.F-SHe蛋白疫苗的制备：
纯化后的融合蛋白F-SHe透析在PBS溶液中，通过超滤管进行浓缩，BCA蛋白定量试剂盒确定蛋白的浓度。
佐剂MPL，购买自Sigma，加入2％triethylamine生理盐水，v/v，溶解，储存浓度为2mg/ml，65℃水浴锅中溶解5min,并用涡旋仪振荡，以便MPL充分溶解。
将经过透析超滤之后的融合蛋白F-SHe与上述充分溶解后佐剂MPL以质量比为2：1混合，混合后置于4℃，以备使用。
实施例2
验证实施例1中提供的疫苗抗原的效果。
1.抗体滴度的检测
实验方法
采用实施例1中制备得到的融合蛋白F-SHe免疫BaLb/C雌性小鼠，对照设置3组对照例，2组对照例的信息请参照表1。间隔两周免疫一次，第二免疫结束后14天后，采集免疫小鼠血清，检测其抗体应答水平，包括针对SH蛋白胞外域的抗体滴度(图1B)，以及中和抗体的滴度(图1A)。
表1对照例的具体信息
Figure BDA0002103434310000091
实验结果
请参照附图1A和附图1B，F-SH融合蛋白相较F蛋白免疫对照组3(Post-fusion F)，产生了较高滴度的中和抗体，以及SHe蛋白胞外域特异性抗体。
2.肺部病毒滴度实验及体重变化实验
将步骤1中，第二次免疫结束后14天，F-SHe蛋白免疫小鼠及3组对照组小鼠，均采用滴鼻的方式感染6×106PFU的RSV A2，感染后每天测量小鼠的体重变化以观察小鼠的病情反应，感染后第4天，处死小鼠，检测其肺部的病毒滴度。检测请参照附图2。
由图2和图3可知，和对照组相比，F-SHe蛋白疫苗组的小鼠肺部病毒滴度明显下降，感染病毒后体重减轻的现象也得到了很好的控制。
3.小鼠肺部组织的病理损伤情况
病毒感染后的第7天，处死小鼠，获取小鼠肺部组织，制备肺部组织的石蜡切片，并通过H&E染色及PAS染色来判断小鼠肺部组织的病理损伤情况。检测结果请参照附图4A和4B。图4A为病理切片染色结果图，图4B为对疫苗对肺部的炎症状况的打分结果图。
病毒感染后的第7天，也通过检测小鼠肺部中促炎症因子IL-1β及MIP-1α的含量来进一步判断小鼠肺部的炎症状况，检测结果请参照附图5和图6。
由图4A和图4B可知，和对照组相比，实施例1提供的F-SHe融合蛋白免疫能够明显减轻小鼠肺部因RSV感染引起的病理损伤。
由附图5和图6可知，与对照组相比，实施例1提供的免疫抗原F-SHe能显著降低被感染者的促炎症因子含量，尤其是显著降低被感染者体内IL-1β和MIP-1α的含量。
对比例1
验证实施例1中提供的制备方法的效果。
采用实施例1中提供的制备方法进行疫苗抗原(F-SHe)的制备，对照设置一组对比例，对比例1的制作条件如下：
(1)转染前24小时，将细胞传代，密度控制在1×106个/ml。
(2)对细胞进行计数，取出转染所需的细胞(转染时细胞密度为1×106个/ml，10ml的转染体系需107个细胞)，100g离心5分钟，去除培养基上清，加入新鲜培养基。
(3)1×106个细胞转染所需质粒为1.25μg，转染试剂PEI 2-4μg。将1.25μg质粒和PEI分别溶解在25μl的表达培养基中。将质粒与PEI等体积混匀后，室温静置10分钟，加入到已准备好的细胞中去。
制备好后，对制备的F-SHe蛋白产量的检测，检测结果请参照附图7。由附图7可知，本实施例提供的制备方法制备的蛋白显著优于现有工艺。
对比例2
验证实施例1提供提供的疫苗抗原(融合蛋白F-SHe)与现有疫苗的区别。
实验方法
设置3组实施方案，实施方案1采用密码子未优化前的F-SHe融合蛋白(碱基序列SEQ ID No.4所示)。
实施方案2中采用密码子优化后的F-SHe融合蛋白(碱基序列SEQ ID No.5所示)；
实施方案3(实施例1)中采用密码子优化后且去除了融合肽(136-145未氨基酸)F-SHe融合蛋白(碱基序列SEQ ID No.6所示)。
采用实施例1中的转染步骤，转染后48h，收集细胞上清中的蛋白，通过WesternBlot印记检测蛋白的表达，检测结果请参照附图8。
实验结果
由附图8可知，优化后的融合蛋白F-SHe的表达量显著优于优化前的融合蛋白F-SHe的表达量，实施例1中的F-SHe表达量显著高于优化前的融合蛋白F-SHe的表达量。
对比例3
验证实施例1中提供的融合蛋白F-SHe与F蛋白、SH蛋白的混合的区别。
采用实施例1中提供的融合蛋白免疫小鼠，免疫方法同参照实施例2，检测融合蛋白刺激小鼠所产生的抗体滴度，对照设置一组对照例，对照例为F蛋白与SH蛋白混合免疫小鼠的效果。检测结果请参照附图9。
由附图9可知，融合蛋白F-SHe的免疫效果优于F和SH混合免疫的结果。
综上所述，该疫苗蛋白包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白组成的融合蛋白，该融合蛋白能有效刺激机体产生较高滴度的中和抗体以及SH蛋白特异性抗体，在病毒感染时，能够有效清除受试者肺部的病毒滴度，同时，也能减轻受试者肺部因病毒感染引起的病理损伤，此外，还能够降低被感染者肺部的促炎症因子含量。
本发明还提供了上述疫苗抗原的制备方法，包括上述疫苗抗原的表达载体、免疫原性组合物以及一种在对象中产生针对呼吸道合胞病毒的免疫应答的方法，该方法包括给予患者有效量的免疫原性组合物，可通过粘膜、皮内、皮下、肌肉内和/或口服来给予免疫原性组合物，在某些情况下，接种本发明提供的免疫抗原引起的免疫应答使得接种对象可抵御一种或多种呼吸道合胞病毒的多种亚型。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院武汉病毒研究所
<120> 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile
20 25 30
Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Lys Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp
35 40 45
Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala
50 55 60
Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Gln Ala Thr Asn Asn
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn
85 90 95
Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe
100 105 110
Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala
115 120 125
Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser
130 135 140
Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys
165 170 175
Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile
180 185 190
Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile
195 200 205
Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr
210 215 220
Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val
245 250 255
Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu
260 265 270
Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys
275 280 285
Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly
290 295 300
Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn
305 310 315 320
Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln
325 330 335
Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser
340 345 350
Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys
355 360 365
Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser
370 375 380
Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser
385 390 395 400
Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr
405 410 415
Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr
420 425 430
Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro
435 440 445
Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp
450 455 460
Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe
465 470 475 480
Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Asn Lys Leu
485 490 495
Ser Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu Pro Arg Ala
500 505 510
Arg Val Asn Thr
515
<210> 2
<211> 516
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile
20 25 30
Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp
35 40 45
Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala
50 55 60
Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn
85 90 95
Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Phe
100 105 110
Leu Gly Phe Leu Leu Gly Val Gly Ser Ala Ile Ala Ser Gly Val Ala
115 120 125
Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu Val Asn Lys Ile Lys Ser
130 135 140
Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val Ser Leu Ser Asn Gly Val
145 150 155 160
Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu Lys Asn Tyr Ile Asp Lys
165 170 175
Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser Cys Ser Ile Ser Asn Ile
180 185 190
Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn Asn Arg Leu Leu Glu Ile
195 200 205
Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val Thr Thr Pro Val Ser Thr
210 215 220
Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser Leu Ile Asn Asp Met Pro
225 230 235 240
Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser Asn Asn Val Gln Ile Val
245 250 255
Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile Ile Lys Glu Glu Val Leu
260 265 270
Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly Val Ile Asp Thr Pro Cys
275 280 285
Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr Thr Asn Thr Lys Glu Gly
290 295 300
Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg Gly Trp Tyr Cys Asp Asn
305 310 315 320
Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala Glu Thr Cys Lys Val Gln
325 330 335
Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn Ser Leu Thr Leu Pro Ser
340 345 350
Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe Asn Pro Lys Tyr Asp Cys
355 360 365
Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser Ser Ser Val Ile Thr Ser
370 375 380
Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys Thr Lys Cys Thr Ala Ser
385 390 395 400
Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe Ser Asn Gly Cys Asp Tyr
405 410 415
Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser Val Gly Asn Thr Leu Tyr
420 425 430
Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu Tyr Val Lys Gly Glu Pro
435 440 445
Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe Pro Ser Asp Glu Phe Asp
450 455 460
Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile Asn Gln Ser Leu Ala Phe
465 470 475 480
Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys Gly Gly Gly Ser Asn Lys Leu
485 490 495
Ser Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr Phe Glu Leu Pro Arg Ala
500 505 510
Arg Val Asn Thr
515
<210> 3
<211> 506
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Gln Asn Ile Thr Glu Glu Phe Tyr Gln Ser Thr Cys Ser Ala Val Ser
1 5 10 15
Lys Gly Tyr Leu Ser Ala Leu Arg Thr Gly Trp Tyr Thr Ser Val Ile
20 25 30
Thr Ile Glu Leu Ser Asn Ile Lys Glu Asn Lys Cys Asn Gly Thr Asp
35 40 45
Ala Lys Val Lys Leu Ile Lys Gln Glu Leu Asp Lys Tyr Lys Asn Ala
50 55 60
Val Thr Glu Leu Gln Leu Leu Met Gln Ser Thr Pro Ala Thr Asn Asn
65 70 75 80
Arg Ala Arg Arg Glu Leu Pro Arg Phe Met Asn Tyr Thr Leu Asn Asn
85 90 95
Ala Lys Lys Thr Asn Val Thr Leu Ser Lys Lys Arg Lys Arg Arg Ala
100 105 110
Ile Ala Ser Gly Val Ala Val Ser Lys Val Leu His Leu Glu Gly Glu
115 120 125
Val Asn Lys Ile Lys Ser Ala Leu Leu Ser Thr Asn Lys Ala Val Val
130 135 140
Ser Leu Ser Asn Gly Val Ser Val Leu Thr Ser Lys Val Leu Asp Leu
145 150 155 160
Lys Asn Tyr Ile Asp Lys Gln Leu Leu Pro Ile Val Asn Lys Gln Ser
165 170 175
Cys Ser Ile Ser Asn Ile Glu Thr Val Ile Glu Phe Gln Gln Lys Asn
180 185 190
Asn Arg Leu Leu Glu Ile Thr Arg Glu Phe Ser Val Asn Ala Gly Val
195 200 205
Thr Thr Pro Val Ser Thr Tyr Met Leu Thr Asn Ser Glu Leu Leu Ser
210 215 220
Leu Ile Asn Asp Met Pro Ile Thr Asn Asp Gln Lys Lys Leu Met Ser
225 230 235 240
Asn Asn Val Gln Ile Val Arg Gln Gln Ser Tyr Ser Ile Met Ser Ile
245 250 255
Ile Lys Glu Glu Val Leu Ala Tyr Val Val Gln Leu Pro Leu Tyr Gly
260 265 270
Val Ile Asp Thr Pro Cys Trp Lys Leu His Thr Ser Pro Leu Cys Thr
275 280 285
Thr Asn Thr Lys Glu Gly Ser Asn Ile Cys Leu Thr Arg Thr Asp Arg
290 295 300
Gly Trp Tyr Cys Asp Asn Ala Gly Ser Val Ser Phe Phe Pro Gln Ala
305 310 315 320
Glu Thr Cys Lys Val Gln Ser Asn Arg Val Phe Cys Asp Thr Met Asn
325 330 335
Ser Leu Thr Leu Pro Ser Glu Val Asn Leu Cys Asn Val Asp Ile Phe
340 345 350
Asn Pro Lys Tyr Asp Cys Lys Ile Met Thr Ser Lys Thr Asp Val Ser
355 360 365
Ser Ser Val Ile Thr Ser Leu Gly Ala Ile Val Ser Cys Tyr Gly Lys
370 375 380
Thr Lys Cys Thr Ala Ser Asn Lys Asn Arg Gly Ile Ile Lys Thr Phe
385 390 395 400
Ser Asn Gly Cys Asp Tyr Val Ser Asn Lys Gly Val Asp Thr Val Ser
405 410 415
Val Gly Asn Thr Leu Tyr Tyr Val Asn Lys Gln Glu Gly Lys Ser Leu
420 425 430
Tyr Val Lys Gly Glu Pro Ile Ile Asn Phe Tyr Asp Pro Leu Val Phe
435 440 445
Pro Ser Asp Glu Phe Asp Ala Ser Ile Ser Gln Val Asn Glu Lys Ile
450 455 460
Asn Gln Ser Leu Ala Phe Ile Arg Lys Ser Asp Glu Leu Leu Cys Gly
465 470 475 480
Gly Gly Ser Asn Lys Leu Ser Glu Tyr Asn Val Phe His Asn Lys Thr
485 490 495
Phe Glu Leu Pro Arg Ala Arg Val Asn Thr
500 505
<210> 4
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
caaaacatca ctgaagaatt ttatcaatca acatgcagtg cagttagcaa aggctatctt 60
agtgctctga gaactggttg gtataccagt gttataacta tagaattaag taatatcaag 120
aaaaataagt gtaatggaac agatgctaag gtaaaattga taaaacaaga attagataaa 180
tataaaaatg ctgtaacaga attgcagttg ctcatgcaaa gcacacaagc aacaaacaat 240
cgagccagaa gagaactacc aaggtttatg aattatacac tcaacaatgc caaaaaaacc 300
aatgtaacat taagcaagaa aaggaaaaga agatttcttg gttttttgtt aggtgttgga 360
tctgcaatcg ccagtggcgt tgctgtatct aaggtcctgc acctagaagg ggaagtgaac 420
aagatcaaaa gtgctctact atccacaaac aaggctgtag tcagcttatc aaatggagtt 480
agtgttttaa ccagcaaagt gttagacctc aaaaactata tagataaaca attgttacct 540
attgtgaaca agcaaagctg cagcatatca aatatagaaa ctgtgataga gttccaacaa 600
aagaacaaca gactactaga gattaccagg gaatttagtg ttaatgcagg cgtaactaca 660
cctgtaagca cttacatgtt aactaatagt gaattattgt cattaatcaa tgatatgcct 720
ataacaaatg atcagaaaaa gttaatgtcc aacaatgttc aaatagttag acagcaaagt 780
tactctatca tgtccataat aaaagaggaa gtcttagcat atgtagtaca attaccacta 840
tatggtgtta tagatacacc ctgttggaaa ctacacacat cccctctatg tacaaccaac 900
acaaaagaag ggtccaacat ctgtttaaca agaactgaca gaggatggta ctgtgacaat 960
gcaggatcag tatctttctt cccacaagct gaaacatgta aagttcaatc aaatcgagta 1020
ttttgtgaca caatgaacag tttaacatta ccaagtgaag taaatctctg caatgttgac 1080
atattcaacc ccaaatatga ttgtaaaatt atgacttcaa aaacagatgt aagcagctcc 1140
gttatcacat ctctaggagc cattgtgtca tgctatggca aaactaaatg tacagcatcc 1200
aataaaaatc gtggaatcat aaagacattt tctaacgggt gcgattatgt atcaaataaa 1260
ggggtggaca ctgtgtctgt aggtaacaca ttatattatg taaataagca agaaggtaaa 1320
agtctctatg taaaaggtga accaataata aatttctatg acccattagt attcccctct 1380
gatgaatttg atgcatcaat atctcaagtc aacgagaaga ttaaccagag cctagcattt 1440
attcgtaaat ccgatgaatt attatgcggt ggaggctcaa acaagctgag cgagtacaac 1500
gtgttccaca acaagacctt cgagctgccc agagccagag tgaacacc 1548
<210> 5
<211> 1548
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
cagaacatca ccgaggaatt ctaccagagc acctgtagcg ccgtgtccaa gggctacctg 60
agcgccctgc ggaccggctg gtacaccagc gtgatcacca tcgagctgag caacatcaaa 120
gaaaacaagt gcaacggcac cgacgccaaa gtgaagctga tcaagcagga actggacaag 180
tacaagaacg ccgtgaccga gctgcagctg ctgatgcaga gcacccccgc caccaacaac 240
cgggccagac gggagctgcc ccggttcatg aactacaccc tgaacaacgc caaaaagacc 300
aacgtgaccc tgagcaagaa gagaaagcgg cggtttcttg gttttttgtt aggtgttgga 360
tctgccattg ctagcggagt ggccgtgtct aaggtgctgc acctggaagg cgaagtgaac 420
aagatcaagt ccgccctgct gagcaccaac aaggccgtgg tgtccctgag caacggcgtg 480
tccgtgctga ccagcaaggt gctggatctg aagaactaca tcgacaagca gctgctgccc 540
atcgtgaaca agcagagctg cagcatcagc aacatcgaga cagtgatcga gttccagcag 600
aagaacaacc ggctgctgga aattacccgc gagttcagcg tgaacgctgg cgtgaccacc 660
cccgtgtcca cctacatgct gaccaacagc gagctgctga gcctgatcaa cgacatgccc 720
atcaccaacg accagaaaaa gctgatgagc aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagagc 780
tactccatca tgtccatcat caaagaagag gtgctggcct acgtggtgca gctgcccctg 840
tacggcgtga tcgacacccc ctgctggaag ctgcacacca gccccctgtg caccaccaac 900
accaaagagg gcagcaacat ctgcctgacc cggaccgacc ggggctggta ctgcgataat 960
gccggcagcg tgtcattctt tccacaagcc gagacatgca aggtgcagag caaccgggtg 1020
ttctgcgaca ccatgaacag cctgaccctg ccctccgaag tgaacctgtg caacgtggac 1080
atcttcaacc ctaagtacga ctgcaagatc atgacctcca agaccgacgt gtccagctcc 1140
gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc tgctacggca agaccaagtg caccgccagc 1200
aacaagaacc ggggcatcat caagaccttc agcaacggct gcgactacgt gtccaacaag 1260
ggggtggaca ccgtgtccgt gggcaacacc ctgtactacg tgaacaaaca ggaaggcaag 1320
agcctgtacg tgaagggcga gcccatcatc aacttctacg accccctggt gttccccagc 1380
gacgagttcg acgccagcat cagccaggtc aacgagaaga tcaaccagag cctggccttc 1440
atcagaaaga gcgacgagct gctgtgcggt ggaggctcaa acaagctgag cgagtacaac 1500
gtgttccaca acaagacctt cgagctgccc agagccagag tgaacacc 1548
<210> 6
<211> 1518
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cagaacatca ccgaggaatt ctaccagagc acctgtagcg ccgtgtccaa gggctacctg 60
agcgccctgc ggaccggctg gtacaccagc gtgatcacca tcgagctgag caacatcaaa 120
gaaaacaagt gcaacggcac cgacgccaaa gtgaagctga tcaagcagga actggacaag 180
tacaagaacg ccgtgaccga gctgcagctg ctgatgcaga gcacccccgc caccaacaac 240
cgggccagac gggagctgcc ccggttcatg aactacaccc tgaacaacgc caaaaagacc 300
aacgtgaccc tgagcaagaa gagaaagcgg cgggccattg ctagcggagt ggccgtgtct 360
aaggtgctgc acctggaagg cgaagtgaac aagatcaagt ccgccctgct gagcaccaac 420
aaggccgtgg tgtccctgag caacggcgtg tccgtgctga ccagcaaggt gctggatctg 480
aagaactaca tcgacaagca gctgctgccc atcgtgaaca agcagagctg cagcatcagc 540
aacatcgaga cagtgatcga gttccagcag aagaacaacc ggctgctgga aattacccgc 600
gagttcagcg tgaacgctgg cgtgaccacc cccgtgtcca cctacatgct gaccaacagc 660
gagctgctga gcctgatcaa cgacatgccc atcaccaacg accagaaaaa gctgatgagc 720
aacaacgtgc agatcgtgcg gcagcagagc tactccatca tgtccatcat caaagaagag 780
gtgctggcct acgtggtgca gctgcccctg tacggcgtga tcgacacccc ctgctggaag 840
ctgcacacca gccccctgtg caccaccaac accaaagagg gcagcaacat ctgcctgacc 900
cggaccgacc ggggctggta ctgcgataat gccggcagcg tgtcattctt tccacaagcc 960
gagacatgca aggtgcagag caaccgggtg ttctgcgaca ccatgaacag cctgaccctg 1020
ccctccgaag tgaacctgtg caacgtggac atcttcaacc ctaagtacga ctgcaagatc 1080
atgacctcca agaccgacgt gtccagctcc gtgatcacct ccctgggcgc catcgtgtcc 1140
tgctacggca agaccaagtg caccgccagc aacaagaacc ggggcatcat caagaccttc 1200
agcaacggct gcgactacgt gtccaacaag ggggtggaca ccgtgtccgt gggcaacacc 1260
ctgtactacg tgaacaaaca ggaaggcaag agcctgtacg tgaagggcga gcccatcatc 1320
aacttctacg accccctggt gttccccagc gacgagttcg acgccagcat cagccaggtc 1380
aacgagaaga tcaaccagag cctggccttc atcagaaaga gcgacgagct gctgtgcggt 1440
ggaggctcaa acaagctgag cgagtacaac gtgttccaca acaagacctt cgagctgccc 1500
agagccagag tgaacacc 1518

Claims (17)

1.一种疫苗抗原，其特征在于，其包括至少一种呼吸道合胞病毒的F蛋白以及至少一种呼吸道合胞病毒的SH蛋白；
所述疫苗抗原为F蛋白和SH蛋白的融合蛋白；
所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。
2.一种编码如权利要求1所述的疫苗抗原的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的碱基序列如SEQ IDNo.6所示。
4.一种表达载体，其特征在于，其包含有如权利要求2所述的核酸分子。
5.根据权利要求4所述的表达载体，其特征在于，所述表达载体为PsecTag2A。
6.一种疫苗抗原的制备方法，其特征在于，其包括：在使宿主细胞能够生产如权利要求1所述的疫苗抗原的条件下，将一个或多个如权利要求4或5所述的表达载体导入所述宿主细胞。
7.根据权利要求6所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞选自真核细胞。
8.根据权利要求7所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述导入包括将所述表达载体与转染试剂混合后转染宿主细胞，所述转染试剂与所述表达载体的质量比为1.25：(4.1～5.5)，所述转染试剂为PEI。
9.根据权利要求8所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，将所述表达载体与所述转染试剂混合后的混合物室温静置5～15min后转染宿主细胞，转染后4～6h，加入转染体系40％～60％体积的新鲜培养基和18～22mM的丙戊酸VPA。
10.根据权利要求6所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括将转染后得到的融合蛋白进行蛋白纯化。
11.根据权利要求10所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述蛋白纯化包括将转染后得到的细胞溶液进行离心，收集细胞上清，对细胞上清通过透析、亲和层析纯化后，得到纯化后的融合蛋白。
12.根据权利要求10所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将纯化过后得到的融合蛋白进行浓缩。
13.根据权利要求12所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将纯化过后得到的融合蛋白采用超滤管进行浓缩。
14.根据权利要求12所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括将浓缩后的融合蛋白与佐剂混合。
15.根据权利要求14所述的疫苗抗原的制备方法，其特征在于，所述佐剂为单磷酰脂质A。
16.采用如权利要求6～15任一项所述的疫苗抗原的制备方法制备的疫苗抗原。
17.一种免疫原性组合物，其特征在于，其包括至少一种如权利要求1所述的疫苗抗原。
CN201910547720.2A 2019-06-21 2019-06-21 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途 Active CN110229219B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910547720.2A CN110229219B (zh) 2019-06-21 2019-06-21 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910547720.2A CN110229219B (zh) 2019-06-21 2019-06-21 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110229219A CN110229219A (zh) 2019-09-13
CN110229219B true CN110229219B (zh) 2021-03-30

Family

ID=67857146

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910547720.2A Active CN110229219B (zh) 2019-06-21 2019-06-21 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110229219B (zh)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112190705A (zh) * 2020-09-25 2021-01-08 广州源博医药科技有限公司 一种rsv-sh亚单位疫苗及其制备方法和应用
CN116162136B (zh) * 2021-11-24 2024-08-23 成都奥达生物科技有限公司 一种抗合胞病毒膜融合抑制剂

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1402792A (zh) * 1999-07-09 2003-03-12 美国政府健康及人类服务部 减毒的人－牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产
CN1468301A (zh) * 2000-06-23 2004-01-14 从邻近启动子的基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒疫苗
CN1578672A (zh) * 2001-09-28 2005-02-09 南佛罗里达大学 Rsv基因表达疫苗
CN102078606A (zh) * 2010-12-08 2011-06-01 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种呼吸道合胞病毒体疫苗及其制备方法
WO2013052859A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
CN103379916A (zh) * 2010-11-15 2013-10-30 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 呼吸道合胞病毒疫苗
CN105381457A (zh) * 2011-09-30 2016-03-09 诺瓦瓦克斯股份有限公司 用于呼吸道合胞病毒的重组纳米颗粒rsv f疫苗
WO2016040556A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Rsv Corporation Virosomes containing respiratory syncytial virus strain line 19 fusion protein and uses thereof
CN108348593A (zh) * 2015-08-31 2018-07-31 泰克诺瓦克斯股份有限公司 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗
CN108653726A (zh) * 2017-03-30 2018-10-16 武汉博沃生物科技有限公司 Rsv-pcv联合疫苗及其制备方法
WO2018204669A1 (en) * 2017-05-03 2018-11-08 Nanobio Corporation Intravenous immunoglobulin compositions specific for respiratory syncytial virus and methods of making and using the same

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1402792A (zh) * 1999-07-09 2003-03-12 美国政府健康及人类服务部 减毒的人－牛嵌合呼吸道合胞病毒疫苗的生产
CN1468301A (zh) * 2000-06-23 2004-01-14 从邻近启动子的基因表达保护性抗原的呼吸道合胞病毒疫苗
CN1578672A (zh) * 2001-09-28 2005-02-09 南佛罗里达大学 Rsv基因表达疫苗
CN103379916A (zh) * 2010-11-15 2013-10-30 非营利性组织佛兰芒综合大学生物技术研究所 呼吸道合胞病毒疫苗
CN102078606A (zh) * 2010-12-08 2011-06-01 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所 一种呼吸道合胞病毒体疫苗及其制备方法
CN105381457A (zh) * 2011-09-30 2016-03-09 诺瓦瓦克斯股份有限公司 用于呼吸道合胞病毒的重组纳米颗粒rsv f疫苗
WO2013052859A2 (en) * 2011-10-05 2013-04-11 Genvec, Inc. Adenoviral vector-based respiratory syncytial virus (rsv) vaccine
WO2016040556A1 (en) * 2014-09-12 2016-03-17 Rsv Corporation Virosomes containing respiratory syncytial virus strain line 19 fusion protein and uses thereof
TW201617363A (zh) * 2014-09-12 2016-05-16 Ｒｓｖ公司 含呼吸道融合病毒系１９融合蛋白的仿病毒顆粒及其用途
CN108348593A (zh) * 2015-08-31 2018-07-31 泰克诺瓦克斯股份有限公司 基于人呼吸道合胞病毒(hrsv)病毒样颗粒(vlps)的疫苗
CN108653726A (zh) * 2017-03-30 2018-10-16 武汉博沃生物科技有限公司 Rsv-pcv联合疫苗及其制备方法
WO2018204669A1 (en) * 2017-05-03 2018-11-08 Nanobio Corporation Intravenous immunoglobulin compositions specific for respiratory syncytial virus and methods of making and using the same

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A novel RSV F-Fc fusion protein vaccine reduces lung injury induced by respiratory syncytial virus infection;Yanjun Zhang等;《Antiviral Research》;20190226;第165卷;11-22 *
Chain A, Fusion glycoprotein F0,Fusion glycoprotein F0;Goodwin,E.等;《Genbank Database》;20180514;6APB_A *
F [Human respiratory syncytial virus MinA];Le Nouen,C.等;《Genbank Database》;20140922;AIO08046 *
Improved Prefusion Stability, Optimized Codon Usage, and Augmented Virion Packaging Enhance the Immunogenicity of Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein in a Vectored-Vaccine Candidate;Bo Liang等;《Journal of Virology》;20170712;第91卷(第15期);1-23 *
Infants Infected with Respiratory Syncytial Virus Generate Potent Neutralizing Antibodies that Lack Somatic Hypermutation;Eileen Goodwin等;《Immunity》;20180220;第48卷(第2期);339-349 *
呼吸道合胞病毒F蛋白抗体的研究进展;任正祥等;《微生物学免疫学进展》;20190118(第1期);1-6 *
呼吸道合胞病毒融合蛋白(F蛋白)结构及中和表位的研究进展;曹健力等;《中国免疫学杂质》;20171231;第33卷(第10期);1568-1573 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110229219A (zh) 2019-09-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113164586B (zh) 免疫组合物及其制备方法与应用
JP7088841B2 (ja) 安定化された可溶性融合前ｒｓｖ ｆタンパク質
CN112062862B (zh) 疫苗通用载体及其制备方法和应用
CN113201507B (zh) 一种重组的伪狂犬病病毒及其疫苗组合物
CN113666990B (zh) 一种诱导广谱抗冠状病毒的t细胞疫苗免疫原及其应用
EP2794637A1 (en) Vesicular stomatitis virus for prime boost vaccines
CN113151184A (zh) 基于细胞膜展示冠状病毒免疫原以诱导中和抗体的方法
CA2916789C (en) Modified matrix proteins of vesicular stomatitis virus
WO2019092002A1 (en) Pharmaceutical compositions for treatment or prevention of viral infections
CN110229219B (zh) 一种新型的呼吸道合胞病毒疫苗抗原的制备方法及其用途
CN115925822A (zh) 一种重组蛋白及其在制备呼吸道合胞病毒疫苗中的应用
US20230174588A1 (en) A vaccine against sars-cov-2 and preparation thereof
WO2023207717A1 (zh) H5n8禽流感广谱性疫苗的开发及其应用
CN107344969B (zh) 一种纳米流感疫苗及构建方法和应用
CN111073861A (zh) 人呼吸道合胞病毒毒株、应用、抗体或杂交瘤细胞或抗血清
CN115161344A (zh) 一种针对呼吸道合胞病毒感染的疫苗的制备方法
CN115322247A (zh) 一种新型冠状病毒受体结合区电荷突变体抗原及应用
JP4797149B2 (ja) インフルエンザウイルスに対するベクターワクチン
KR101366702B1 (ko) 호흡기 신시치아 바이러스 백신 조성물 및 그의 제조방법
WO2023236822A1 (zh) H5n6禽流感广谱性疫苗的开发及其应用
CN114632148A (zh) 病原样抗原疫苗及其制备方法
CN111166881A (zh) 一种重组呼吸道合胞病毒多表位嵌合疫苗及其制备方法和应用
CN113801206A (zh) 利用受体识别域诱导抗新冠病毒中和抗体的方法
CN116785424B (zh) 一种mRNA多价流感疫苗及其制备方法
CN112592410B (zh) 犬腺病毒基因工程亚单位疫苗、其制备方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant