CN114395580B - 用于控制玉米株高的基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及ZmTPK2基因在控制玉米株高和/或穗位高性状中的应用，属于分子遗传学领域。本发明公开了ZmTPK2基因在控制玉米株高和/或穗位高性状中的应用。进一步地，本发明提供了降低玉米株高和/或穗位高的方法。

Description

用于控制玉米株高的基因

技术领域

本发明涉及ZmTPK2基因在控制玉米株高性状中的应用，属于分子遗传学领域。

背景技术

矮化性状带来了作物产量的突破，降低作物株高的方法具有极大的应用潜力。在玉米的主要农艺性状中，株高影响到玉米的抗倒性、光合效能、收获指数，与玉米产量密切相关。因此，在玉米育种实践与种质资源改良工作中，株高性状具有重要的价值。

由于株高、穗位高性状受主效基因和微效多基因的共同控制，表现为典型的数量性状遗传。尽管有一些调控玉米株高的基因被定位与克隆(华南农业大学.玉米ZmPIF3s突变型蛋白、其编码基因及其在育种上的应用：

CN201910273522.1[P].2019-08-02.；杭州瑞丰生物科技有限公司.CYP78A基因在增加玉米株高和增强植株长势中的应用：CN201510230547.5[P].2016-12-07.；中国农业大学.与玉米株高相关基因及其编码蛋白与应用：CN200410037404.4[P].2005-01-26.；中国农业科学院作物科学研究所.利用基因编辑技术创制玉米矮化材料的方法：CN201910371358.8[P].2019-08-16.)，更多的株高性状相关基因有待进一步克隆。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供了一个新的可以控制玉米株高和/或穗位高的基因，抑制该基因编码蛋白的表达或活性能够降低玉米株高和/或穗位高，可用于培育矮秆玉米品种。

本发明的目的之一在于提供一个影响玉米株高和/或穗位高性状的基因ZmTPK2的核酸序列及其编码的氨基酸序列。

本发明的目的之二在于公开一种改良玉米株高和/或穗位高性状的方法。

本发明的目的之三在于公开一种矮秆玉米的突变基因。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种玉米基因在调控玉米株高和/或穗位高性状中的应用，其特征在于：上述基因序列如SEQ ID NO.2-SEQ ID NO.3任意一个所示。其中SEQ ID NO.2为该基因在玉米中的基因组序列，SEQ ID NO.3为该基因的cDNA序列。本发明鉴定结果显示，利用基因编辑手段敲除该基因后，玉米株高和/或穗位高降低，因此可以通过将SEQ ID NO.2或SEQID NO.3所示序列构建到超表达载体上以达到提高玉米株高和/或穗位高的技术效果，也可根据SEQ ID NO.2或SEQ ID NO.3所示序列设计相应地gRNA识别靶标或RNAi干涉序列，通过基因编辑或RNAi干涉或T-DNA定向插入的方式干扰基因的正常表达，以达到降低玉米株高和/或穗位高的技术效果。

在另一方面，本发明提供一种降低玉米株高和/或穗位高的方法，其特征在于：抑制玉米中SEQ ID NO.1所示蛋白的表达和/或活性，选择玉米株高和/或穗位高降低的植株。

在一些实施方案中，上述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。

在一些实施方案中，上述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

在一些实施方案中，上述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

在另一方面，本发明还提供一种降低玉米株高和/或穗位高的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)靶向SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列的RNA分子；该RNA分子可以是包含gRNA、crRNAs和tracrRNA结构的sgRNA分子，也可以是gRNA、crRNAs和tracrRNA单独形成的复合体，或包括gRNA、crRNAs的复合体；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

在一些实施方案中，上述RNA分子的序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7所示。

在另一方面，本发明还提供一种玉米突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

在另一方面，本发明还提供上述的玉米突变基因在降低玉米株高和/或穗位高中的应用。通过常规的杂交转育的方法将上述突变基因导入到其他玉米材料中，能够达到降低受体玉米株高和/或穗位高的技术效果。

与现有的技术相比，本发明的有益效果是，本发明提供的ZmTPK2基因及其编码的蛋白具有调控玉米株高和/或穗位高性状的功能，该功能是之前的公开资料中未报道也没有技术启示的。利用CRISPR/Cas9方法敲除该基因能够降低玉米株高和/或穗位高。本发明鉴定了基因敲除后的突变基因序列，利用这些突变基因可以进一步改良其他玉米品种的株高和/或穗位高性状，从而培育矮化玉米品种，提高玉米抗倒伏性。

附图说明

图1玉米穗长QTL定位结果。1-10分别代表第1号染色体到第10号染色体。纵轴表示LOD值，横轴表示染色体上的遗传距离

图2基因编辑载体图。主要元件标注在图上。

图3基因编辑的靶标位置、靶标序列(灰色)和编辑后的序列展示。“-”表示缺失。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“玉米”是任何玉米植物并包括可以与玉米育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas ofProtein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，枝，果实，果仁，穗，穗轴，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

本发明从KUI3和B77构建的RIL群体中定位影响玉米穗长性状的QTL，在第6号染色体58kb区间内发现一个主效位点。根据基因功能注释信息推测Zm00001d037916是QTL区间内控制玉米穗长性状的基因，命名为ZmTPK2。

本发明进一步通过基因编辑敲除实验验证该基因的功能，意外地发现ZmTPK2基因编辑后玉米株高和穗位高均降低。

株高和/或穗位高降低的玉米可用于培育矮化玉米品种，增加玉米的抗倒伏性。本发明进一步测定了基因敲除后的突变基因序列，这些突变基因可以转育到其他玉米品种中改良受体的株高和/或穗位高性状，从而培育矮化品种，增加玉米抗倒伏性。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:alaboratory manual，2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1玉米穗长QTL的定位

本发明从短穗玉米自交系材料KUI3和长穗玉米自交系材料B77作为亲本构建了RIL群体，通过调查不同种植时间和地点的玉米穗长表型值，并利用亲本Illumina MaizeSNP50 BeadChip基因型数据和RNA-seq数据，在玉米第六号染色体134.1-139.3Mb(V2版本)区间范围内鉴定到一个控制穗长和行粒数的QTL qEL6.2，可以解释18.92％的表型变异。根据定位结果，该QTL在8个环境点检测时，其最高LOD值大小、效应值大小和解释的表型变异率有所不同，但在8个环境点都可以检测到，说明该QTL非常稳定，可以在多个环境点起作用(图1)。

为了精细定位QTL qEL6.2，选择RIL群体中F6剩余杂合材料(Heterogeneousinbred family，HIF)：HZAU-551-1作为初始定位材料，设计分子标记IDP8645、IDP785、B4、B14等对背景杂合区段进行筛选，最终选择在定位区段杂合而背景纯合的材料对该QTL进行验证并进行下一步精细定位。在精细定位过程中，通过不断筛选新的标记和新的重组单株繁种后对近等基因系穗长表型进行单因素方差分析从而缩小定位区段。根据不同近等基因系穗长表型分析结果将QTL qEL6.2分成了两个更小的QTL，分别命名为qEL6.2-1和qEL6.2-2。

为了克隆到qEL6.2-1中的穗长基因，于2018年春在武汉种植了定位区间内的多个不同重组类型的玉米分离后代，并对其进行基因型鉴定。利用qEL6.2-2区间内的多个标记，从中获得了不同家系在相同染色体区段纯合的NIL^KUI3基因型和纯合NIL^B77基因型材料，同时也筛选出了新的染色体重组的单株进行自交。将上述获得的不同重组类型的自交后代和新的重组单株的子代于2019年春在河北保定种植，筛选新的基因型纯合材料，并利用进一步的基因分型和精细定位将qEL6.2-1位点位于标记S155-S157区间。基于玉米B73参考基因组(RefGenV4)注释信息，这一区间大约58kb，含有一个完整的功能注释基因Zm00001d037915，以及Zm00001d037916基因的启动子区。

实施例2基因的功能验证

Zm00001d037916基因编码硫胺素焦磷酸激酶2，本发明将其命名为ZmTPK2。根据玉米参考基因组上的注释信息，ZmTPK2编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，基因组序列如SEQ ID NO.2所示。为了验证该基因的功能，本发明利用CRISPR/Cas9基因编辑技术将该基因进行敲除操作。具体步骤如下：

利用在线软件CRISPR-P 2.0(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)在基因CDS区域上各选取两个靶标编辑位点设计gRNA(序列见表1)。直接合成约2000bp的“U6-promoter1-gRNA1-sgRNA-U6 promoter2-gRNA2-sgRNA”融合单元序列，利用双酶切体系将其从中间载体PUC57上切下，并通过同源重组的方法将酶切片段连接到骨架载体CPB-ZmUbi-hspCas9上(图2)。将重组载体转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，检测目标序列，序列检测无误后转化玉米自交系KN5585。对获得的T0代转化植株，每个基因的两个靶标位点进行检测。检测通过PCR扩增后测序，根据测序序列分析编辑类型。

表1基因编辑的靶标序列和检测引物信息

总共获得2个成功编辑的株系，分别命名为KO1和KO2，靶标序列的编辑情况见图3所示。KO1和KO2中ZmTPK2基因突变后的序列如SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

进一步分析敲除株系的农艺性状，本发明意外地发现，当敲除该基因后，玉米株型显著变小，株高和穗位高显著降低，同时开花期却不受影响(表2)。

表2ZmTPK2对株型和开花期的影响

KO1，KO2：2个敲除材料；NT：受体对照；N：材料数。表型值以平均值±标准差表示，显著性用单因素方差分析计算获得。

上述结果显示，KO1和KO2中的ZmTPK2突变基因可以降低玉米株高和/或穗位高。将这两个突变序列的任何一个杂交导入到常规玉米材料中均可以降低玉米株高和/或穗位高，培育矮化玉米品种。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (8)

1.玉米基因在调控玉米株高和/或穗位高性状中的应用，其特征在于：所述基因序列如SEQ ID NO.2所示；所述调控方式为基因被抑制后玉米株高和/或穗位高降低。

2.一种降低玉米株高和/或穗位高的方法，其特征在于：抑制玉米中SEQ ID NO.1所示蛋白的表达和/或活性，选择玉米株高和/或穗位高降低的植株。

3.根据权利要求2所述降低玉米株高和/或穗位高的方法，其特征在于：所述抑制蛋白表达和/或活性的方法包括基因编辑、RNA干扰、T-DNA插入中任一种。

4.根据权利要求3所述降低玉米株高和/或穗位高的方法，其特征在于：所述基因编辑采用CRISPR/Cas9方法。

5.根据权利要求4所述降低玉米株高和/或穗位高的方法，其特征在于：所述CRISPR/Cas9方法在玉米中的基因组靶标区域的DNA序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

6.一种降低玉米株高和/或穗位高的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)靶向SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示序列的RNA分子；所述RNA分子的序列如SEQID NO.6或SEQ ID NO.7所示；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

7.一种玉米突变基因，其特征在于：所述突变基因序列为SEQ ID NO.8或SEQ ID NO.9所示。

8.权利要求7所述的玉米突变基因在降低玉米株高和/或穗位高中的应用。