CN118792300A - 一种启动子、基因编辑方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子、基因编辑方法及其应用。本发明通过使用CRISPR/Cas9基因编辑技术对水稻Ehd1基因启动子区域进行突变，获得一种促进水稻提前开花的启动子，以及使用基因编辑技术提早水稻开花的方法。

Description

一种启动子、基因编辑方法及其应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种启动子、基因编辑方法及其应用。

背景技术

基因编辑是对物种进行性状改良的有效工具。除了能够对基因进行编辑外，也可以对启动子进行编辑，通过改变启动子特性改变基因的表达，从而实现性状改良的效果。例如，修饰水稻OsSWEET基因启动子可以提高水稻对白叶枯病的抗性(Oliva,R.,Ji,C.,Atienza-Grande,G.et al.Broad-spectrum resistance to bacterial blight in riceusing genome editing[J].Nat Biotechnol.,2019,37,1344-1350)；编辑番茄中的SlCLV3等启动子可以获得连续变化的表型，从而可以对表型进行微调(Rodríguez-Leal D,LemmonZ H,Man J,et al.Engineering Quantitative Trait Variation for Crop Improvementby Genome Editing[J].Cell,2017,171:470-480.e8.)。

Ehd1是水稻中的重要花期调控基因。对Ehd1启动子区域的编辑可以延迟水稻的开花期/抽穗期，例如CN108841855A和CN117625602A。然而本领域尚无法通过编辑Ehd1基因或启动子实现水稻开花期/抽穗期的提早。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型启动子。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供一种启动子，其特征在于：所述启动子序列如SEQ ID NO.12或SEQ IDNO.13所示。

本发明还提供一种表达盒，其特征在于：由上述的启动子、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子、SEQ ID NO.3所示序列的终止子顺序连接而成。

在一些实施方案中，上述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

本发明还提供一种提早水稻开花期的方法，其特征在于：包括如下任一种：

(1)使用基因工程手段靶向修改SEQ ID NO.1所示的水稻基因组区域序列，选择水稻开花期提前的植株；

(2)将含有权利要求2所述的表达盒插入水稻基因组，选择水稻开花期提早的植株。

在一些实施方案中，上述的基因工程手段采用CRISPR/Cas9基因编辑方法。

本发明还提供一种提早水稻开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)能够同时识别SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示靶标序列的RNA分子，或能够同时识别SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示靶标序列的RNA分子；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

在一些实施方案中，上述的试剂盒还包括Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的核酸分子或表达Cas9蛋白的载体。

在一些实施方案中，上述的RNA分子为SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示序列的组合，或SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示序列的组合。

本发明还提供上述的启动子在增强基因表达中的应用。

本发明还提供上述的表达盒、方法、试剂盒在提早水稻开花期中的应用。

本发明的创新性及有益效果如下：在启动子结构的复杂性和不可预测性的背景下，本发明获得了一种新型的启动子。该启动子能够具有提早水稻开花期的技术效果。

附图说明

图1Ehd1启动子区的顺式元件以及基因编辑靶点位置。

图2基因编辑载体T-DNA区结构示意图。

图3各编辑株系在武汉长日照和海南短日照环境下的开花期/抽穗期表现。

图4PT1和PT2编辑株系的靶点序列编辑情况。

具体实施方式

提供以下定义和方法用以更好地界定本申请以及在本申请实践中指导本领域普通技术人员。除非另作说明，术语按照相关领域普通技术人员的常规用法理解。本文所引用的所有专利文献、学术论文、行业标准及其他公开出版物等，其中的全部内容整体并入本文作为参考。

如本文所用，“水稻”是任何水稻植物并包括可以与水稻育种的所有植物品种，包括整株植物、植物细胞、植物器官、植物原生质体、植物可以从中再生的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物或植物部分中完整的植物细胞，所述植物部分例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、茎杆、根、根尖、花药等。除非另有所指，核酸以5’至3’方向从左向右书写；氨基酸序列以氨基至羧基方向从左向右书写。氨基酸在本文可以用其通常所知的三字母符号或IUPAC-IUB生物化学命名委员会推荐的单字母符号来表示。同样地，可以用通常接受的单字母码表示核苷酸。数字范围包括限定该范围的数字。如本文所用，“核酸”包括涉及单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸多聚物，并且除非另有限制，包括具有天然核苷酸基本性质的已知类似物(例如，肽核酸)，所述类似物以与天然存在的核苷酸类似的方式与单链核酸杂交。如本文所用，术语“编码”或“所编码的”用于特定核酸的上下文时，指该核酸包含指导该核苷酸序列翻译成特定蛋白的必需信息。使用密码子表示编码蛋白的信息。如本文所用，涉及特定多核苷酸或其所编码的蛋白的“全长序列”指具有天然(非合成)内源序列的整个核酸序列或整个氨基酸序列。全长多核苷酸编码该特定蛋白的全长、催化活性形式。本文可互换地使用术语“多肽”和“蛋白”，以指氨基酸残基的多聚物。该术语用于氨基酸多聚物，其中一个或多个氨基酸残基是相应天然存在的氨基酸的人工化学类似物。该术语还用于天然存在的氨基酸多聚物。本文可互换地使用术语“残基”或“氨基酸残基”或“氨基酸”，以指被并入蛋白、多肽或肽(统称“蛋白”)的氨基酸。氨基酸可以是天然存在的氨基酸，并且除非另有限制，可以包括天然氨基酸的已知类似物，所述类似物可以与天然存在的氨基酸相似的方式起作用。

如本文所用，可以互换地使用术语“分离的”和“纯化的”，以涉及核酸或多肽或其生物学活性部分，其基本上或本质上不含如在其天然存在的环境中所发现的通常伴随或反应于该核酸或多肽的组分。因而，用重组技术产生分离的或纯化的核酸或多肽时，分离的或纯化的核酸或多肽基本上不含其它细胞物质或培养基，或者化学合成分离的或纯化的核酸或多肽时，基本上不含化学前体或其它化学品。“分离的”核酸通常不含在该核酸所衍生自的生物体的基因组DNA中天然侧翼于该核酸(即位于该核酸5’和3’端的序列)的序列(诸如，编码蛋白的序列)。例如，在各种实施方案中，所分离的核酸可以包含在该核酸所衍生自的细胞的基因组DNA中天然侧翼于该核酸的少于约0.5kb的核苷酸序列。

在本申请中，将词语“包括”、“包含”或其变体应理解为除所描述的元素、数或步骤外，还包含其它元素、数或步骤。“受试植物”或“受试植物细胞”是指遗传改造已经生效的植物或植物细胞，或者如此改造的植物或细胞的子代细胞，该子代细胞包含所述改造。“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供用于测量受试植物或植物细胞表型改变的参考点。对照植物或植物细胞可以包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即与遗传改造起始材料具有相同基因型的植物或细胞，所述遗传改造产生受试植物或细胞；(b)与所述起始材料具有相同基因型但已用空构建体(即用对目的性状无已知效果的构建体，诸如包含标物基因的构建体)转化的植物或植物细胞；(c)是受试植物或植物细胞的非转化分离子的植物或植物细胞；(d)与所述受试植物或植物细胞在遗传上一致但未暴露于会诱导目的基因表达的条件或刺激物的植物或植物细胞；或(e)受试植物或植物细胞自身，其处于目的基因不被表达的条件下。

本领域技术人员会容易地认同，诸如位点特异性诱变和随机诱变、聚合酶链式反应方法和蛋白工程化技术的分子生物学领域的进步提供了广泛的适当的工具和操作步骤，以用于改造或者工程化农业上感兴趣的蛋白的氨基酸序列和潜在的基因序列。

在一些实施方案中，可以对本申请的核苷酸序列进行改变，以进行保守氨基酸替换。保守氨基酸替换的原则和实例在下文中进一步描述。在某些实施方案中，可以依照公开的单子叶密码子偏好性对本申请的核苷酸序列进行不改变氨基酸序列的替换，例如可以用单子叶植物偏好的密码子替换编码同一氨基酸序列的密码子，而不改变该核苷酸序列所编码的氨基酸序列。在一些实施方案中，以编码同一氨基酸序列的不同密码子替换本申请中的部分核苷酸序列，从而在改变核苷酸序列的同时不改变其编码的氨基酸序列。保守变体包括由于遗传密码子简并性而编码实施方案的蛋白中的一种的氨基酸序列的那些序列。在一些实施方案中，根据单子叶植物偏好密码子替换本申请中的部分核苷酸序列。本领域技术人员会认识到氨基酸添加和/或取代通常基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，所述取代基的疏水性、电荷、大小等等。具有各种前述所考虑性质的示例性氨基酸取代基团为本领域技术人员所公知，并且包括精氨酸与赖氨酸；谷氨酸和天门冬氨酸；丝氨酸和苏氨酸；谷氨酰胺和天冬酰胺；以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸。关于不影响目的蛋白生物学活性的适当氨基酸取代的指南可以在Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(蛋白序列和结构图集)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C)(通过引用并入本文)的模型中找到。可以进行诸如将一个氨基酸换作具有相似性质的另一个氨基酸的保守性取代。序列一致性的鉴定包括杂交技术。例如，将已知核苷酸序列的全部或部分用作与其它相应核苷酸序列选择性杂交的探针，所述其它相应核苷酸序列存在于来自所选生物体的已克隆基因组DNA片段或cDNA片段群(即基因组文库或cDNA文库)。

在一些实施方案中，还包括核苷酸序列及其编码的氨基酸序列的片段。如本文所用，术语“片段”指实施方案的多核苷酸的核苷酸序列的一部分或者多肽的氨基酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白片段，所述蛋白片段保留天然或相应全长蛋白的生物学活性，并因而具有蛋白活性。突变体蛋白包括天然蛋白的生物活性片段，其包含保留天然蛋白生物学活性的连续氨基酸残基。一些实施方案还包括转化的植物细胞或转基因植物，其包含至少一种实施方案的核苷酸序列。在一些实施方案中，使用表达载体转化植物，所述表达载体包含至少一种实施方案的核苷酸序列以及与其可操作地连接的在植物细胞中驱动表达的启动子。转化的植物细胞和转基因植物表示基因组内包含异源多核苷酸的植物细胞或植物。一般来说，所述异源多核苷酸在转化的植物细胞或转基因植物的基因组内稳定地整合，以致将所述多核苷酸传递给后代。可以将所述异源多核苷酸单独地或作为表达载体的一部分整合进基因组。在一些实施方案中，本申请涉及的植物包括植物细胞、植物原生质体、可以再生出植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物细胞，其为完整的植物或者植物的部分，诸如胚胎，花粉，胚珠，种子，叶，花，果实，穗，壳，秸秆，根，根尖，花药等等。本申请还包括源于本申请的转基因植物或其子代、并因而至少部分地包含本申请的核苷酸序列的植物细胞、原生质体、组织、愈伤组织、胚胎以及花、茎、果实、叶以及根。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本申请的范围。若无特别指明，实施例按照常规实验条件，如Sambrook等人的分子克隆实验手册(SambrookJ&Russell D W,Molecular cloning:a laboratory manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。若未特别指明，实施例中所用的化学试剂均为常规市售试剂，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例

实施例1Ehd1启动子元件分析及靶点设计

Ehd1是水稻中的花期正调控因子。提高Ehd1的表达能够促进水稻提前开花，从而缩短水稻的生育期，降低种植成本。然而超表达Ehd1的水稻材料市场价值较低，使用基因编辑技术敲除Ehd1无法实现水稻开花期提早的技术效果。对启动子的编辑能够调控基因的表达，然而至今为止，本领域技术人员对Ehd1启动子的编辑均表现花期延迟的技术效果。

发明人拟通过编辑Ehd1启动子实现水稻开花期提早的技术效果，因此首先分析了该启动子上的顺式元件。结合水稻4726份遗传群体中SNP和InDel的分析结果，通过在线CRISPR-P2.0工具(http://crispr.hzau.edu.cn/CRISPR2/)设计Ehd1启动子区的靶位点。考虑到单个顺式元件的作用较小以及启动子区靶点的特异性，最终选取了6个相距较远且特异性高的靶点，分别是T1、T2、T3、T4、T5、T6(图1所示)序列分别为：T1：TAGCCAAAGGAGTCAGTTAT；T2：CGTCATGATCATATCAACGG；T3：CTGTCGTATATAGTATTTAC；T4：AATTAGGTGAAATTGACCGG；T5：TCCTCCACAACCGCAATGCG；T6：TATGGGTTAGGATATGGGAA。

实施例2Ehd1启动子的遗传编辑

选择编码分别识别2个靶点的gRNA构建到一个基因编辑载体上获得PD1(T1+T2)、PD2(T1+T3)、PD3(T3+T4)、PD4(T2+T4)、PD5(T4+T5)、PD6(T4+T6)、PD7(T3+T5)共7个双靶点编辑载体(载体图见图2)，每个载体单独转化水稻愈伤组织，获得转化植株。

基因编辑载体使用常规的构建方法获得(例如CN110093349A专利所公开的方法)，构建好的编辑载体转到农杆菌菌株EHA105中保存备用。

使用种子诱导愈伤和农杆菌介导转化的流程获得转化植株，具体过程参考本领域常规的操作方法(例如：陈秋红，陈太钰，林拥军，陈浩.(2018).农杆菌介导粳稻遗传转化.Bio-101e1010174.)。

实施例3鉴定编辑植株的基因型和表型

将获得的转化植株进行基因型的鉴定，挑选靶位点成功获得编辑的植株。其中有7个载体(PD1～PD7)成功获得了片段缺失的编辑植株。具体缺失情况见表1。

表1 7个载体的基因编辑水稻靶点缺失情况

然后将表1中的所有纯合缺失和杂合缺失共61个株系在湖北武汉夏季的长日照环境下和海南陵水冬季的短日照环境下调查开花期/抽穗期性状。结果显示，其中PD1载体编辑获得的株系PT1和PD2载体编辑获得的株系PT2表现出明显的开花/抽穗提早(图3)，长日照下能够比野生型对照提早3.4天或8.2天，短日照下提早5.1天或6.3天(表2)。

表2编辑水稻的抽穗期表现

各20个T2代株系的统计结果，“**”表示差异极显著。

对PT1和PT2编辑后基因型的数据分析结果显示，PT1(SEQ ID NO.12)在T1和T2靶点间缺失了374bp，PT2(SEQ ID NO.13)在T1和T3靶点间缺失了526bp(图4)。这两个编辑后的启动子具有提高Ehd1表达量，提早水稻开花的作用。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (9)

1.一种启动子，其特征在于：所述启动子序列如SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13所示。

2.表达盒，其特征在于：由权利要求1所述的启动子、编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子、SEQ ID NO.3所示序列的终止子顺序连接而成；任选地，所述编码SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

3.一种提早水稻开花期的方法，其特征在于：包括如下任一种：

(1)使用基因工程手段靶向修改SEQ ID NO.1所示的水稻基因组区域序列，选择水稻开花期提前的植株；

(2)将含有权利要求2所述的表达盒插入水稻基因组，选择水稻开花期提早的植株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的基因工程手段采用CRISPR/Cas9基因编辑方法。

5.一种提早水稻开花期的试剂盒，其特征在于：包括如下任一种：

(1)能够同时识别SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7所示靶标序列的RNA分子，或能够同时识别SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.8所示靶标序列的RNA分子；

(2)编码(1)所述RNA的DNA分子；

(3)表达(1)所述RNA的载体。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的试剂盒还包括Cas9蛋白或编码Cas9蛋白的核酸分子或表达Cas9蛋白的载体。

7.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于：所述的RNA分子为SEQ ID NO.9和SEQ IDNO.10所示序列的组合，或SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.11所示序列的组合。

8.权利要求1所述的启动子在增强基因表达中的应用。

9.权利要求2所述的表达盒、权利要求3-4任一项所述的方法、权利要求5-7任一项所述的试剂盒在提早水稻开花期中的应用。