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CN114262683B - 一种表达vegfr3 d2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用 - Google Patents

一种表达vegfr3 d2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用 Download PDF

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CN114262683B CN202210191147.8A CN202210191147A CN114262683B CN 114262683 B CN114262683 B CN 114262683B CN 202210191147 A CN202210191147 A CN 202210191147A CN 114262683 B CN114262683 B CN 114262683B
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Abstract

本发明公开一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用，属于分子生物学技术领域。本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂将生物药载体与抗肿瘤多肽结合，通过在细菌菌体的基因组中整合入编码VEGFR3 D2多肽的基因或在细菌菌体中转入表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体构建获得，这种细菌制剂能够稳定表达VEGFR3 D2多肽并将其释放出来，其不仅能够将传统的抗肿瘤药物经注射给药的方式转化为经口服给药，使给药方式更加简便，而且能够实现更好的抗肿瘤效果。本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂能够用于制备抗肿瘤药物。

Description

一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用。
背景技术
淋巴管系统的功能异常会导致先天性或获得性疾病，如淋巴水肿、癌症、肥胖症、动脉粥样硬化和高血压等。目前主流观点认为，淋巴管生成会促进肿瘤的发展。有研究表明，多种癌症术后淋巴结中存在肿瘤细胞是患者预后不良的关键因素，而淋巴管生成生长因子的表达、高淋巴管密度和淋巴高侵袭率通常与淋巴结转移和低生存率有关。肿瘤内部及其周围组织中常伴有大量的淋巴管新生，肿瘤细胞和基质细胞释放淋巴管生成生长因子（如VEGFC），会促进淋巴内皮细胞（LECs）的增殖和迁移，导致肿瘤淋巴管生成和血管增生，从而促进肿瘤淋巴管转移。一方面，淋巴管为肿瘤细胞转移提供物理途径：介导原发肿瘤细胞向肿瘤引流淋巴结的淋巴播散进而引起肿瘤的侵袭-转移。另一方面，淋巴管内皮细胞参与调控宿主免疫反应：通过分泌免疫抑制因子和抑制树突状细胞成熟，从而抑制T细胞功能；调控跨内皮运输，控制肿瘤抗原从慢性炎症组织到引流淋巴结的运输，维持免疫耐受。因此，通过抑制肿瘤相关的淋巴管生长可抑制肿瘤的发展，进而实现治疗肿瘤的目的。
然而，目前以淋巴管为靶点的抗肿瘤药物多处于研发阶段，且以抗体类药物为主，存在生产成本高、体内代谢具有不确定性和抗肿瘤效果不理想等缺点。
发明内容
针对现有技术中存在的一个或多个问题，本发明一个方面提供一种表达VEGFR3D2多肽的细菌制剂，其中所述细菌制剂的基因组中整合有编码VEGFR3 D2多肽的基因和表达相关元件，或所述细菌制剂包含转入细菌菌体中的表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体；其中：
所述重组表达载体包含骨架质粒和编码VEGFR3 D2多肽的基因；
所述细菌菌体可为选自以下属中的一种或几种细菌：乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、拟杆菌属、普氏菌属、艾克曼菌属和埃希氏菌属。
在一些实施方式中，所述编码VEGFR3 D2多肽的基因可包含如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，可选地，该编码VEGFR3 D2多肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在一些实施方式中，所述重组表达载体可包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施方式中，所述细菌菌体可选自以下中的一种或几种：乳酸乳球菌Lactococcus lactis、嗜酸乳杆菌Lactobacillus acidophilus、植物乳杆菌Lactobacillu plantarum、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、德氏乳杆菌Lactobacillus delbrueckii、酿脓链球菌Streptococcus pyogenes、嗜热链球菌Streptococcus thermophilus、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis、两岐双歧杆菌Bifidobacterium bifidum、凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans、斯密氏芽孢杆菌Bacillus smithi、嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus、粪肠球菌Enterococcus faecalis、屎肠球菌Enterococcus faecium、鸟肠球菌Enterococcus avium、脆弱拟杆菌Bacteroides fragilis、Prevotella histicola、大肠杆菌Escherichia coli和嗜黏蛋白阿克曼氏菌Akkermansia muciniphila。
在一些实施方式中，所述重组表达载体的骨架质粒可为选自以下中的任一种：pGAPA8149、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150、pNZ8151、pNZ8152、pNZ9530、pNZ8120、pNZ8121、pNZ8122、pNZ8123、pNZ8124、pNZ124、pNZ2105、pNZ2103、pNZ7021、pNZ2122、pNZ2123、pNZ2125、pNZ7025、pMG36e、pEPR、pLEISS、pLEB590、pPG611.1、 pPG612.1、 pVE5523、pSLP111.3、pLEB590、pIAβ5、pW425et、pW425t、pW425、pVA838、pMB1、pRM2、pDOJHR、pHT304、pHCMC04、pXMJ19、pHT43、pHIS1525、pHT01、pWB980、pMUTIN4、pllp-OmpA、pllp-STII、pMBP-P、pMBP-C、pET-His、pET-GST、pET-Trx、pET-CKS、pET-DsbA。
本发明的另一方面提供一种表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体，其可包含如SEQID NO:2所示的核苷酸序列。
本发明的又一方面提供一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂的构建方法，其可包括以下步骤：
S1：将编码VEGFR3 D2多肽的基因构建入骨架质粒中，获得表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体；
S2：将步骤S1获得的表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体转化入细菌菌体中，得到表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂。
本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂、表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的内容。基于此，本发明还提供一种抗肿瘤药物，其包括上述的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂作为活性成分。
在一些实施方式中，所述抗肿瘤药物能够通过DC细胞和/或肠道免疫增强T细胞活性，，从而发挥抗肿瘤疗效。
在一些实施方式中，所述抗肿瘤药物的剂型可包括片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、口服液、栓剂、注射剂型（例如可以将抗肿瘤药物通过注射的方式递送至肠道的剂型）和喷鼻剂型。
在一些实施方式中，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、淋巴癌、黑色素瘤、肾癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、脑胶质瘤和头颈癌。
基于以上技术方案提供的表达VEGFR3 D2多肽（VEGFR3胞外域D2多肽）的细菌制剂通过在细菌菌体的基因组中整合入编码VEGFR3 D2多肽的基因，或者在细菌菌体中转入表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体构建获得，该细菌制剂能够稳定表达VEGFR3 D2多肽并将其释放出来，能够将生物药载体（例如可口服施用的细菌菌体）与抗肿瘤多肽结合，两者在肠道中共同作用不仅能够将传统的抗肿瘤药物经静脉注射给药的方式转化为经口服给药，使给药方式更加简便，而且实施例结果表明，相对于传统的抗肿瘤药物（例如抗体类药物VEGFR3蛋白），本发明提供的细菌制剂能够实现更好的抗肿瘤效果，并且相对于生物药载体与VEGFR2 D2多肽的结合方式也具有更好的抗肿瘤效果，另外还具有低成本、体内代谢途径清楚等优势，弥补了目前市场上抗肿瘤药物生产周期长、高成本和体内代谢不确定性的缺点，能更大范围内满足一线临床与肿瘤患者的用药需求。另一方面，本发明通过在细菌菌体中转入表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体构建获得细菌制剂的方式中，在有序合成并释放VEGFR3 D2多肽的同时，能够在肠道内肠激酶的作用下将重组表达载体中还可包含的信号肽序列SPusp45、LEISS序列等酶切分离出来，因此表达得到的VEGFR3 D2多肽不含其他修饰或标签成分，由此具有抗原性低、安全性高等优点。
附图说明
图1A-B为Western检测pGAPA8149-VEGFR3 D2重组表达载体在重组大肠杆菌和重组乳酸乳球菌中的分泌表达胶图，其中图1A表示由重组大肠杆菌表达的VEGFR3 D2多肽的纯化，图1B表示由重组乳酸乳球菌表达的VEGFR3 D2的鉴定。
图2A-D为pGAPA8149×VEGFR3 D2重组乳酸乳球菌的抗肿瘤效果，其中图2A表示不同给药处理后模型小鼠的肿瘤照片，图2B表示不同给药处理后模型小鼠的肿瘤重统计结果柱状图，图2C表示不同给药处理条件下模型小鼠体内肿瘤体积随时间的变化曲线，图2D表示不同给药处理后模型小鼠体内肿瘤的相对抑制情况。
图3为灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2重组乳酸乳球菌后模型小鼠的生存曲线。
图4A-K为灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2重组乳酸乳球菌后模型小鼠体内肿瘤细胞和免疫细胞的变化；其中图4A表示不同处理组模型小鼠体内肿瘤细胞占比，图4B表示不同处理组模型小鼠体内免疫细胞占比，图4C-K分别表示不同处理组模型小鼠体内树突状细胞（DC细胞）、T淋巴细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞、自然杀伤T淋巴细胞、交叉呈递型树突状细胞、迁移型树突状细胞、细胞毒T细胞和CD8效应T淋巴细胞占比。
具体实施方式
针对现有技术中仍缺乏以淋巴管为靶点的抗肿瘤药物，本发明提供一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂，该细菌制剂可以经口服给药，且其能够稳定表达VEGFR3 D2多肽并将其释放出来，进而将生物药载体与抗肿瘤多肽结合，两者在肠道中共同作用能够有效抑制LECs中的VEGFC/VEGFR3信号轴，进而能够有效抑制新生淋巴管的生长，从而能够有效治疗肿瘤。另一方面，本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂经灌胃施用后，可以诱导受试者体内免疫细胞的显著上调，尤其是DC细胞和T细胞，其中在DC细胞中以交叉呈递型DC细胞和迁移型DC细胞占比升高为主，在T细胞中以CD8 T细胞（细胞毒T细胞和效应T细胞）占比升高为主；因此本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂还可能通过诱导受试者体内DC细胞的显著上调，进而激活CD8+ T细胞的机制发挥抗肿瘤疗效。本发明还提供了构建该表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂的方法，并基于此提供一种以淋巴管为靶点的抗肿瘤药物。
在本发明的第一方面，提供一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂，其中所述细菌制剂的基因组中整合有编码VEGFR3 D2多肽的基因和表达相关元件，或所述细菌制剂包含转入细菌菌体中的表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体；其中：
所述重组表达载体包含骨架质粒和编码VEGFR3 D2多肽的基因；
所述细菌菌体没有特别限制，只要该细菌菌体能够作为药学中的生物药载体，且可口服给药，并且能够使得转入其的重组表达载体能够在肠道中表达并分泌目的多肽即可，可选地，所述细菌菌体可为选自以下属中的一种或几种细菌：乳球菌属、乳杆菌属、链球菌属、双歧杆菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、拟杆菌属、普氏菌属、艾克曼菌属和埃希氏菌属等。
在一些实施例中，所述细菌菌体可为选自以下中的一种或几种：乳球菌属的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）等菌株；乳杆菌属的嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus）、植物乳杆菌（Lactobacillu plantarum）、干酪乳杆菌（Lactobacillus casei）、德氏乳杆菌（Lactobacillus delbrueckii）等菌株；链球菌属的酿脓链球菌（Streptococcus pyogenes）、嗜热链球菌（Streptococcus thermophilus）等菌株；双歧杆菌属的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）、两岐双歧杆菌（Bifidobacterium bifidum）等菌株；芽孢杆菌属的凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）、斯密氏芽孢杆菌（Bacillus smithi）、嗜热脂肪芽孢杆菌（Bacillus stearothermophilus）等菌株；肠球菌属的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、屎肠球菌（Enterococcus faecium）、鸟肠球菌（Enterococcus avium）等菌株；拟杆菌属的脆弱拟杆菌（Bacteroides fragilis）等菌株；普氏菌属中的Prevotella histicola等菌株；埃希氏菌属的大肠杆菌（Escherichia coli）；艾克曼菌属的嗜黏蛋白阿克曼氏菌（Akkermansia muciniphila）等菌株。
在一些实施例中，向宿主（例如上述的细菌菌体）的基因组中整合外源基因的方式没有特别限制，只要外源基因能够整合入宿主的基因组中并稳定表达该外源基因即可。
在一些实施例中，所述编码VEGFR3 D2多肽的基因是本领域技术人员熟知的，只要能够表达VEGFR3 D2多肽即可，可选地，所述编码VEGFR3 D2多肽的基因可包含如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列，进一步可选地，该编码VEGFR3 D2多肽的基因的核苷酸序列如SEQID NO:1所示。
在一些实施例中，所述重组表达载体可包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在一些实施例中，所述重组表达载体的骨架质粒没有限制，只要使得该重组表达载体能够表达VEGFR3 D2多肽即可，可选地所述重组表达载体的骨架质粒可为选自以下中的任一种：pGAPA8149、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150、pNZ8151、pNZ8152、pNZ9530、pNZ8120、pNZ8121、pNZ8122、pNZ8123、pNZ8124、pNZ124、pNZ2105、pNZ2103、pNZ7021、pNZ2122、pNZ2123、pNZ2125、pNZ7025、pMG36e、pEPR、pLEISS、pLEB590、pPG611.1、 pPG612.1、pVE5523、pSLP111.3、pLEB590、pIAβ5、pW425et、pW425t、pW425、pVA838、pMB1、pRM2、pDOJHR、pHT304、pHCMC04、pXMJ19、pHT43、pHIS1525、pHT01、pWB980、pMUTIN4、pllp-OmpA、pllp-STII、pMBP-P、pMBP-C、pET-His、pET-GST、pET-Trx、pET-CKS、pET-DsbA。
在本发明的第二方面，提供一种表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体，其可包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在本发明的第三方面，提供一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂的构建方法，其可包括以下步骤：
S1：将编码VEGFR3 D2多肽的基因构建入骨架质粒中，获得表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体；
S2：将步骤S1获得的表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体转化入细菌菌体中，得到表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂。
本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂、表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的内容。基于此，在本发明的第四方面，提供一种抗肿瘤药物，其包括上述的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂作为活性成分。
在一些实施例中，所述抗肿瘤药物能够通过DC细胞和/或肠道免疫增强T细胞活性，，从而发挥抗肿瘤疗效。
在一些实施例中，所述抗肿瘤药物的剂型可包括片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、口服液、栓剂、注射剂型（例如可以将抗肿瘤药物通过注射的方式递送至肠道的剂型）和喷鼻剂型。
在一些实施例中，所述肿瘤包括但不限于胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、淋巴癌、黑色素瘤、肾癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、脑胶质瘤和头颈癌。
以下结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应当理解的是，具体实施例仅用于进一步说明本发明，而不是用于限制本发明的内容。
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。具体步骤可参见：《分子克隆实验指南》（《Molecular Cloning: A Laboratory Manual》 Sambrook，J.，Russell， DavidW.，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，3rd edition，2001，NY，Cold SpringHarbor）。
实施例中描述到的各种生物材料的取得途径仅是提供一种实验获取的途径以达到具体公开的目的，不应成为对本发明生物材料来源的限制。事实上，所用到的生物材料的来源是广泛的，任何不违反法律和道德伦理能够获取的生物材料都可以按照实施例中的提示替换使用。下述实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为常规生化试剂，可通过商业途径购买得到。
以下实施例中涉及的序列均可使用已有技术合成。
以下实施例中以乳酸乳球菌作为生物药载体为例，构建表达多肽的重组乳酸乳球菌作为细菌制剂，根据相同的操作方法也可以构建出以其他细菌菌体作为生物药载体的表达多肽的细菌制剂，并且均能够发挥出与重组乳酸乳球菌类似的功能，即能够在肠道中稳定表达并分泌多肽，由此能够有效抑制新生淋巴管的生长，从而能够有效治疗肿瘤。
实施例1：表达多肽的重组表达载体的构建
该实施例中构建了表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体和表达VEGFR2 D2多肽的重组表达载体，具体包括以下步骤。
1.1、全序列合成SPusp45-LEISS-DDDDK-VEGFR3 D2（其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示），以及全序列合成SPusp45-LEISS-DDDDK-VEGFR2 D2（其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示），并在两者的序列上下游分别连接酶切位点NcoI和XbaI。在合成的两条序列中VEGFR3D2表示编码VEGFR3 D2多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，VEGFR2 D2表示编码VEGFR2 D2多肽的基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，SPusp45表示信号肽，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，LEISS表示一个整体带负电荷的前导肽，其融合在SPusp45和多肽之间可以增强多肽的表达水平，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示，DDDDK表示肠激酶识别位点，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示。随后将合成的两条序列分别连接在pUC57载体中，分别获得携带VEGFR3 D2多肽的编码基因、VEGFR2 D2多肽的编码基因的重组质粒，分别命名为pUC57-VEGFR3 D2质粒和pUC57-VEGFR2 D2质粒。该步骤由上海生工生物工程有限公司完成。
1.2、采用天根质粒小提试剂盒，按照说明书操作分别提取pGAPA8149质粒（参见CN111518801A，是以食用级别的蛋白表达载体pNZ8149（MoBiTec，Germany）为基础，将强启动子PgapA对pNZ8149上的诱导型启动子pNisin进行替换得到）、步骤1.1构建获得的pUC57-VEGFR3 D2质粒和pUC57-VEGFR2 D2质粒。
1.3、使用NcoI和XbaI分别酶切pGAPA8149质粒、pUC57-VEGFR3 D2质粒和pUC57-VEGFR2 D2质粒。酶切后利用1%琼脂糖凝胶进行电泳，120V电压下电泳30min后切胶回收，获得各自的酶切产物。酶切体系如下表1所示。
表1：酶切体系
组分 体积（μl）
10XCutSmart缓冲液 5
NcoI 1
XbaI 1
质粒 3 μg
水 -
总和 50
1.4、将步骤1.3获得的pGAPA8149质粒的酶切产物与pUC57-VEGFR3 D2质粒的酶切产物，或者将步骤1.3获得的pGAPA8149质粒的酶切产物与pUC57-VEGFR2 D2质粒的酶切产物在T4连接酶的作用下16℃酶连过夜。
1.5、将步骤1.4获得的连接产物纯化回收：制备好的连接产物中加入2.5倍体积的无水乙醇，1/10体积的2.5mol/L乙酸钠，混匀后于20℃放置l h，12000 r/min离心5 min，弃上清；用1 mL 75%乙醇沉淀一次，12000 r/min离心5 min，弃上清，室温干燥20 min，用去离子水溶解沉淀。经测序验证后，分别获得表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体pGAPA8149-SPusp45-LEISS-DDDDK-VEGFR3 D2，命名为pGAPA8149-VEGFR3 D2；表达VEGFR2 D2多肽的重组表达载体pGAPA8149-SPusp45-LEISS-DDDDK-VEGFR2 D2，命名为pGAPA8149-VEGFR2 D2。
实施例2：表达多肽的重组乳酸乳球菌和重组大肠杆菌构建
该实施例中构建了表达VEGFR3 D2多肽的重组乳酸乳球菌、表达VEGFR2 D2多肽的重组乳酸乳球菌和表达VEGFR3 D2多肽的重组大肠杆菌，具体包括以下步骤。
2.1表达多肽的重组乳酸乳球菌构建
2.1.1乳酸乳球菌NZ3900感受态制备
1）取-80℃冻存的乳酸乳球菌NZ3900接种于5 mL含有5%葡萄糖的M17液体培养基中，30℃过夜培养；
2）将获得菌液按照1%接种于含有2.5%Gly和5%葡萄糖的M17液体培养基中，30℃静置培养至菌体OD 600值为0.3-0.4，收集备用；
3）将以上收集的菌体培养物冰浴10 min，4℃离心5000 rpm/min，5 min；收集菌体沉淀；
4）收集的菌体沉淀用冰冷的10%蔗糖和10%甘油混合溶液1/10体积清洗两次，4℃离心8000 rpm/min，5 min，收集沉淀；
5）将沉淀重悬于1/100体积10%蔗糖和10%甘油混合溶液中，冰浴10 min后使用。
2.1.2乳酸乳球菌NZ3900感受态电转化
1）吸取40μl新鲜制备的感受态乳酸乳球菌NZ3900悬液于冰冷的无菌EP管中，冰浴5 min；
2）吸取1μl纯化后的连接产物（实施例1获得的pGAPA8149-VEGFR3 D2或pGAPA8149-VEGFR2 D2）加入感受态乳酸乳球菌NZ3900，混匀后，置于冰上5 min；
3）将步骤2）的混合液加入冰冷的电转杯中，放入电击仪，设置条件为2500V，200Ω，25μF；
4）电击完毕后，迅速加入1ml冰冷的GM17-MC恢复培养基；混匀后转入EP管中冰浴5~10min；30℃培养2 h；
5）取100μl恢复培养的菌液接种于Elliker选择培养基，30℃过夜培养，挑取黄色菌落进行鉴定。
2.1.3转化菌的验证
从培养的转化菌体中提取质粒，之后用PCR扩增，所述PCR扩增引物为SEQ ID NO：8（F:cttattgagaaagggaaacgacgg)和SEQ ID NO：9(R：tcaactgctgctttttggcta)；所述PCR扩增的反应程序：94℃，3 min；{94℃，30s；58℃，30 s；72℃，1 min 30s} 38个循环；72℃，5min。将上述PCR产物进行测序鉴定，鉴定结果为核苷酸序列与预期相符的质粒，即pGAPA8149-VEGFR3 D2和pGAPA8149-VEGFR2 D2，最终获得已转化入重组表达载体pGAPA8149-VEGFR3 D2和pGAPA8149-VEGFR2 D2的乳酸乳球菌，分别命名为pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株和pGAPA8149×VEGFR2 D2菌株。
2.2表达VEGFR3 D2多肽的重组大肠杆菌构建
2.2.1原核表达载体VEGFR3 D2-PMAL-C5X的构建
以PMAL-C5X为质粒骨架，在其BamHI和EcoRI位点间插入VEGFR3 D2核苷酸序列（SEQ ID NO：1）。该重组质粒VEGFR3-PMAL-C5X由金斯瑞生物科技有限公司合成。
2.2.2原核表达质粒的转化
1）吸取1μl重组质粒VEGFR3-PMAL-C5X与BL21(DE3)PlysS感受大肠杆菌混合均匀；
2）将感受态细胞冰浴25 min；
3）将感受态细胞取出后立即放入水浴锅中42℃，热激60s；
4）将感受态细胞再次放于冰上2 min；
5）将感受态细胞取出后，取500 μl LB液体培养基加入到已转入质粒的感受态细胞中；
6）放入摇床，37℃，200 rpm，45 min，提前20 min烧平板；
7）将感受态细胞取出，离心，4000 r/min，1min；
8）去掉400 μl上清，留100 μl左右上清重悬沉淀，20 μl涂平板；
9）平板倒置，37℃过夜培养（12h至16h）。
2.2.3 VEGFR3 D2多肽表达鉴定
1）每个平板挑取单菌落至对应抗性的LB（3ml）试管中；
2）将试管放入摇床中，37℃，200 rpm，3h后用可见分光光度计测OD值，当OD值为0.4-0.6时，1:1000加入IPTG诱导（IPTG母液浓度为0.8M），25℃，10-16h或37℃诱导3-4h；
3）将诱导后的菌液离心，12000 rpm，2 min，去掉上清留沉淀；
4）加80 μl水重悬菌液，再加入20 μl 5Xloading buffer，混匀后，100℃煮10min，制备SDS-PAGE上样蛋白样品；
5）上样15 μl，SDS-PAGE检测蛋白表达情况。
2.2.4 VEGFR3 D2多肽纯化
1）用上述2.2.2和2.2.3方法，大量扩增表达VEGFR3 D2多肽的重组大肠杆菌，12000 rpm离心5 min，收集菌体；
2）收集得到的菌体用PBS重悬后超声破碎，在冰水中用超声探头破碎5s停9s，每次超声完暂停2 min，100 ml菌液用中等探头超声8-10次，至菌液变得澄清透明；
3）将得到的菌液离心，12000 rpm，4℃离心20 min，收集上清；
4）上清用滤膜过滤除杂质；
5）蛋白挂柱：将菌液上清加入至His柱上，进行挂柱。重复6-8遍；
6）用100 ml 20 mM咪唑清洗His柱，15-20遍；
7）洗脱蛋白：分别用不同浓度的咪唑（100,150,200,300,400和500 mM）进行洗脱，浓度由低到高依次加入至His柱中；
8）超滤：将洗脱后的溶液用10 ml超滤管超滤，4000 rpm离心20-30 min，浓缩到约2 ml体积后，取10 μl进行SDS-PAGE检测杂蛋白情况。
VEGFR3 D2多肽纯化的结果如图1 A所示，从左至右分别表示不同浓度咪唑洗脱后的VEGFR3 D2蛋白表达量，可见，其中400 mM和500 mM的咪唑洗脱后所得的VEGFR3 D2蛋白纯度最高。
实施例3：Western检测重组表达载体在乳酸乳球菌中的分泌表达
该实施例以实施例2构建的表达VEGFR3 D2多肽的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2为例，通过Western方法检测该重组乳酸乳球菌中VEGFR3 D2多肽的分泌表达，具体包括以下步骤。
3.1、pGAPA8149-VEGFR3 D2在乳酸乳球菌中的诱导分泌表达
1）将已转化入重组表达载体pGAPA8149-VEGFR3 D2的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2接入M17液体培养基（称取21.125g M17肉汤培养基，溶于400 ml蒸馏水中，用10 mol/L NaOH调pH值至7.2，定容至500 ml，高压灭菌）中，30℃静置培养过夜；在该步骤中，同步以转化入pGAPA8149空载体的乳酸乳球菌（转入方法同实施例2）作为对照；
2）培养结束后10000 rpm/min离心20 min，取上清，用0.22 μm的过滤膜过滤上清，加入N-月桂酰肌氨酸钠至终浓度0.1%，室温15 min；
3）加入三氯醋酸至终浓度7.5%，混匀，冰上放置2 h；
4）10000 rpm/min离心10 min，弃上清，加入2 ml四氢呋喃，10000 rpm/min离心10min；
5）10000 rpm/min离心10 min，弃上清，加入2 ml四氢呋喃，10000 rpm/min离心10min；
6）弃上清，晾干，加入1 ml 8M尿素溶解，获得诱导表达的蛋白样本。
3.2、电泳
1）配制10% SDS-PAGE凝胶；
2）向步骤3.1中收集的蛋白样品中加入浓度5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，100℃加热5~10 min；
3）冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内；100V电泳90~120min；
4）按照Pierce银染试剂盒（Thermo，#24600）要求，对上述SDS-PAGE胶进行银染。
结果如图1B所示，为pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株特异性表达VEGFR3-D2多肽的SDS-PAGE胶电泳图，其中泳道1为pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株上清蛋白，即分子量为约13kDa的目的条带（图1B中箭头所示），泳道2为pGAPA8149空载体重组菌株上清蛋白。由图1B可知，本发明构建的表达VEGFR3-D2多肽的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2能够成功诱导表达VEGFR3-D2多肽。
按照上述方法步骤，也验证了表达VEGFR2-D2多肽的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR2 D2也能够成功诱导表达VEGFR2-D2多肽。
实施例4：重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2的抗肿瘤效果
该实施例以实施例2构建的表达VEGFR3-D2多肽的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2为例，验证其抗肿瘤效果，同步以实施例2中构建的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR2 D2，以及VEGFR3 D2蛋白（由实施例3诱导表达获得）注射剂作为对比例，具体包括以下步骤。
4.1、造模：选取6周龄的雄性BALB/c小鼠（购自于维通利华），向小鼠右侧腋下注射1×105个CT26细胞（小鼠结肠癌细胞株，购自于北京协和细胞资源中心），一周后测量肿瘤大小，待肿瘤体积平均增长至100 mm3后，即可开始给药；
4.2、给药：pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天（对应VR3口服益生菌）；pGAPA8149×VEGFR2 D2菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天（对应VR2口服益生菌）；pGAPA8149空载菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天，作为阴性对照（对应PNZ菌株对照）；VEGFR3蛋白注射剂的注射剂量为：25 μg/只/天，注射部位为：瘤周皮下（对应VR3蛋白注射剂）；同时设置空白对照。小鼠每天给药，并隔天测量肿瘤体积，连续给药10天后，处死小鼠，取肿瘤，称重统计。
结果如图2A-D所示，其中图2A表示不同给药处理（空白对照、灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株和pGAPA8149空载菌株）10天后的不同小鼠的肿瘤照片，图2B表示不同给药处理（空白对照、灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株和pGAPA8149空载菌株）10天后的模型小鼠的肿瘤重量统计结果，图2C表示不同给药处理（空白对照、灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株和pGAPA8149空载菌株）后的模型小鼠的肿瘤体积随时间的变化曲线，图2D表示不同给药处理（空白对照、灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株、pGAPA8149×VEGFR2 D2菌株和pGAPA8149空载菌株，以及注射VEGFR3蛋白）10天后的模型小鼠的相对肿瘤抑制率情况。由图2A-C所示，给药后，pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株组的小鼠肿瘤体积与瘤重显著低于pGAPA8149空载菌株组，表明pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株具有良好的体内抗肿瘤作用。由图2D所示，相对于灌胃pGAPA8149×VEGFR2 D2菌株和pGAPA8149空载菌株，以及注射VEGFR3蛋白，向模型小鼠灌胃pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株更能够显著抑制模型小鼠体内肿瘤的生长。表明本发明提供的pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株能够将生物药载体乳酸乳球菌和VEGFR3D2多肽有效结合起来，两者共同作用能够发挥优异的抗肿瘤效果。
实施例5：重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2的延长模型小鼠生存期效果
该实施例以实施例2构建的表达VEGFR3-D2多肽的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2为例，验证其延长模型小鼠的生存期的效果，具体包括以下步骤。
5.1、造模：选取6周龄的雄性BALB/c小鼠，向小鼠右侧腋下注射1×105个CT26细胞（小鼠结肠癌细胞株），一周后测量肿瘤大小，待肿瘤体积平均增长至100 mm3后，即可开始给药；
5.2、给药：pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天；pGAPA8149空载菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天；同时设置空白对照。小鼠每天给药。
5.3、测量：隔天测量肿瘤体积，待肿瘤体积长至1500 mm3（认为小鼠死亡），处死小鼠，统计各组小鼠存活与死亡数量。
结果如图3所示，可见相对于pGAPA8149空载菌株和空白对照，pGAPA8149×VEGFR3D2菌株能够显著延长小鼠的生存期，表明pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株具有良好的延长带瘤小鼠生存期的效果。
实施例6：重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2的抗肿瘤机制
该实施例以实施例2构建的表达VEGFR3-D2多肽的重组乳酸乳球菌pGAPA8149×VEGFR3 D2为例，探究其抗肿瘤机制，具体包括以下步骤。
6.1、造模：选取6周龄的雄性BALB/c小鼠，向小鼠右侧腋下注射GFP标记的CT26细胞（小鼠结肠癌细胞株），1×105个/只，一周后测量肿瘤大小，按瘤体积进行随机分组后开始给药；
6.2、给药：pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天；pGAPA8149空载菌株的灌胃剂量为：1010个活菌／只/天；同时设置空白对照。小鼠每天给药，连续给药9天后，处死小鼠。取出肿瘤组织，经研磨、过筛、染色后，用流式细胞仪检测各组肿瘤组织中免疫细胞和肿瘤细胞（CT26-GFP）的百分比，以及各组单位质量（g）的肿瘤组织中各类免疫细胞（巨噬细胞、NK细胞、NKT细胞、DC细胞和T细胞）的占比。
结果如图4A-K所示，可见，pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株能够显著降低肿瘤组织中肿瘤细胞的百分比，并提高肿瘤组织中免疫细胞的百分比（图4A-B所示）；其中，单位质量（g）的肿瘤组织中DC细胞与T细胞的比例显著上调（图4C-D所示），而巨噬细胞、NK细胞和NKT细胞相较对照组无统计学差异（图4E-G所示）；在DC细胞中，以交叉呈递型DC细胞和迁移型DC细胞占比升高为主（图4H-I所示）；在T细胞中，以CD8 T细胞（细胞毒T细胞和效应T细胞）占比升高为主（图4J-K所示）。结果表明，pGAPA8149×VEGFR3 D2菌株可能通过调控DC细胞显著上调，进而激活CD8+ T细胞，从而发挥抗肿瘤疗效。
综上实施例结果表明，本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂能够将生物药载体与抗肿瘤多肽结合，一方面，本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂可以经口服给药，并能够在肠道中稳定表达VEGFR3 D2多肽并将其释放出来，因此能够通过肠道免疫的途径有效抑制LECs中的VEGFC/VEGFR3信号轴，进而能够有效抑制新生淋巴管的生长，从而能够有效治疗肿瘤。另一方面，本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂经施用后，可以诱导受试者体内免疫细胞的显著上调，尤其是DC细胞和T细胞，其中在DC细胞中以交叉呈递型DC细胞和迁移型DC细胞占比升高为主，在T细胞中以CD8 T细胞（细胞毒T细胞和效应T细胞）占比升高为主；因此本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂还可能通过诱导受试者体内DC细胞的显著上调，进而激活CD8+ T细胞的机制发挥抗肿瘤疗效。因此，基于本发明提供的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂，可以制备以淋巴管为靶点的抗肿瘤药物，能够通过DC细胞和/或肠道免疫增强T细胞活性，可以用于治疗包括但不限于以下类型的肿瘤：胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、淋巴癌、黑色素瘤、肾癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、脑胶质瘤和头颈癌。并且，本发明可以将本发明提供的抗肿瘤药物制备成以下剂型：片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、口服液、栓剂、注射剂型（例如可以将抗肿瘤药物通过注射的方式递送至肠道的剂型）和喷鼻剂型，因此可以将传统的抗肿瘤药物经静脉注射给药的方式转化为经口服给药或肠道给药，使给药方式更加简便。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 中国科学院动物研究所
<120> 一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂及其构建方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 222
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atcaacaagc ctgacacgct cttggtcaac aggaaggacg ccatgtgggt gccctgtctg 60
gtgtccatcc ccggcctcaa tgtcacgctg cgctcgcaaa gctcggtgct gtggccagac 120
gggcaggagg tggtgtggga tgaccggcgg ggcatgctcg tgtccacgcc actgctgcac 180
gatgccctgt acctgcagtg cgagaccacc tggggagacc ag 222
<210> 2
<211> 363
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc tgatactaat tctgatttgg aaatatcgtc gacttgtgat 120
gctgacgatg acgataagat caacaagcct gacacgctct tggtcaacag gaaggacgcc 180
atgtgggtgc cctgtctggt gtccatcccc ggcctcaatg tcacgctgcg ctcgcaaagc 240
tcggtgctgt ggccagacgg gcaggaggtg gtgtgggatg accggcgggg catgctcgtg 300
tccacgccac tgctgcacga tgccctgtac ctgcagtgcg agaccacctg gggagaccag 360
taa 363
<210> 3
<211> 240
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
aacaaaaaca aaactgtggt gattccatgt ctcgggtcca tttcaaatct caacgtgtca 60
ctttgtgcaa gatacccaga aaagagattt gttcctgatg gtaacagaat ttcctgggac 120
agcaagaagg gctttactat tcccagctac atgatcagct atgctggcat ggtcttctgt 180
gaagcaaaaa ttaatgatga aagttaccag tctattatgt acatagttgt cgttgtaggg 240
<210> 4
<211> 381
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc tgatactaat tctgatttgg aaatatcgtc gacttgtgat 120
gctgacgatg acgataagaa caaaaacaaa actgtggtga ttccatgtct cgggtccatt 180
tcaaatctca acgtgtcact ttgtgcaaga tacccagaaa agagatttgt tcctgatggt 240
aacagaattt cctgggacag caagaagggc tttactattc ccagctacat gatcagctat 300
gctggcatgg tcttctgtga agcaaaaatt aatgatgaaa gttaccagtc tattatgtac 360
atagttgtcg ttgtagggta a 381
<210> 5
<211> 96
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
atgaaaaaaa agattatctc agctatttta atgtctacag tgatactttc tgctgcagcc 60
ccgttgtcag gtgtttacgc tgatactaat tctgat 96
<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ttggaaatat cgtcgacttg tgatgct 27
<210> 7
<211> 15
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gacgatgacg ataag 15
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
cttattgaga aagggaaacg acgg 24
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
tcaactgctg ctttttggct a 21

Claims (8)

1.一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂，其特征在于，所述细菌制剂包含转入细菌菌体中的表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体；其中：
所述重组表达载体包含骨架质粒和编码VEGFR3 D2多肽的基因，所述编码VEGFR3 D2多肽的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；
所述细菌菌体为乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）或大肠杆菌（Escherichia coli）。
2.根据权利要求1所述的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂，其特征在于，所述重组表达载体的骨架质粒为选自以下中的任一种：pGAPA8149、pNZ8148、pNZ8149、pNZ8150、pNZ8151、pNZ8152、pNZ9530、pNZ8120、pNZ8121、pNZ8122、pNZ8123、pNZ8124、pNZ124、pNZ2105、pNZ2103、pNZ7021、pNZ2122、pNZ2123、pNZ2125、pNZ7025、pMG36e、pEPR、pLEISS、pLEB590、pPG611.1、pPG612.1、pVE5523、pSLP111.3、pIAβ5、pW425et、pW425t、pW425、pVA838、pMB1、pRM2、pDOJHR、pHT304、pHCMC04、pXMJ19、pHT43、pHIS1525、pHT01、pWB980、pMUTIN4、pllp-OmpA、pllp-STII、pMBP-P、pMBP-C、pET-His、pET-GST、pET-Trx、pET-CKS、pET-DsbA。
3.一种表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
4.一种表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括以下步骤：
S1：将核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的基因构建入骨架质粒中，获得表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体；
S2：将步骤S1获得的表达VEGFR3 D2多肽的重组表达载体转化入细菌菌体中，得到表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂。
5.权利要求1或2所述的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂、权利要求3所述的表达VEGFR3D2多肽的重组表达载体在制备抗肿瘤药物中的应用，其中权利要求1或2中的细菌菌体为乳酸乳球菌。
6.一种抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物包括权利要求1或2所述的表达VEGFR3 D2多肽的细菌制剂作为活性成分，其中权利要求1或2中的细菌菌体为乳酸乳球菌。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述抗肿瘤药物的剂型包括片剂、颗粒剂、丸剂、胶囊剂、口服液、栓剂、注射剂型和喷鼻剂型。
8.根据权利要求6或7所述的抗肿瘤药物，其特征在于，所述肿瘤包括以下类型：胃癌、胰腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌、乳腺癌、鼻咽癌、宫颈癌、淋巴癌、黑色素瘤、肾癌、食道癌、口腔鳞状细胞癌、脑胶质瘤和头颈癌。
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