CN102134277A

CN102134277A - 可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig、其制备方法及用途

Info

Publication number: CN102134277A
Application number: CN2010100231578A
Authority: CN
Inventors: 郭亚军; 张大鹏; 谈珉; 钱卫珠; 李博华
Original assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER
Current assignee: ANTIBODIES NATIONAL ENGINEERING RESEARCH CENTER; Shanghai National Engineering Research Center of Antibody Medicine Co
Priority date: 2010-01-22
Filing date: 2010-01-22
Publication date: 2011-07-27

Abstract

本发明公开了一种可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。本发明公开的可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig既能与VEGF-A和VEGF-B结合，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合，可用于制备抗肿瘤药物。

Description

可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig、其制备方法及用途

技术领域

本发明属于生物技术领域，更具体地，本发明公开了一类双功能融合受体、其制备方法及其在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

肿瘤尤其是恶性肿瘤是当今世界严重危害人类健康的疾病，在各种疾病所致死亡中高居第二位。而且近年来，其发病率呈明显上升趋势。恶性肿瘤治疗效果差，晚期转移率高，预后多不佳。目前临床上所采用的常规治疗方法如放、化疗和手术治疗虽然在很大程度上缓解了病痛，延长了生存时间，但这些方法均存在很大的局限性，其疗效难以进一步提高。

肿瘤的生长有两个明显不同的阶段，即从无血管的缓慢生长期转为有血管的快速增殖期，血管的生成使肿瘤能获得足够的营养而完成血管切换期，如果没有血管的生成，原发肿瘤的生长不超过1～2mm，转移则无法实现。血管内皮生长因子(VEGF)是一类能促进内皮细胞分裂增殖、促进新生血管的形成、提高血管通透性的生长因子，它与细胞表面的血管内皮生长因子受体结合，通过激活酪氨酸激酶信号转导途径发挥功能。在肿瘤组织中，肿瘤细胞、肿瘤侵入的巨噬细胞和肥大细胞能分泌高水平的VEGF，以旁分泌的形式刺激肿瘤血管内皮细胞，促进内皮细胞增殖、迁移，诱导血管形成，促进肿瘤持续生长，并提高血管通透性，引起周围组织纤维蛋白沉着，促进单核细胞、成纤维细胞内皮细胞侵润，有利于肿瘤基质形成和肿瘤细胞进入新生血管，促进肿瘤转移，因而抑制肿瘤血管生成被认为是当前最具有前途的肿瘤治疗方法之一。Genentech公司的抗癌新药Avastin(抗VEGF人源化抗体)已于2004年2月获得美国FDA批准上市，用于一线治疗转移性结直肠癌，并有望用于其它肿瘤，包括非小细胞肺癌和肾癌的治疗。此外，用可溶性受体阻断VEGF和VEGFR的传导途径也被证明是一种行之有效的方法。VEGF家族包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E及PIGF(胎盘生长因子)，它们之间的氨基酸序列高度同源，都与同型的酪氨酸激酶受体结合。血管内皮生长因子受体(VEGFR)属于酪氨酸激酶受体超家族，它们有相似的结构，均由胞外区、跨膜区、胞内区组成。目前发现的VEGFR主要有3种：VEGFR1(Flt-1)，VEGFR2(KDR)，VEGFR3。与VEGFR1结合的主要是VEGF-A、VEGF-B，与VEGFR2结合的主要是VEGF-A、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E，与VEGFR3结合的主要是VEGF-C、VEGF-D。VEGFR1和VEGFR2主要位于肿瘤血管内皮细胞表面，VEGFR1主要介导细胞骨架重排及引起细胞迁移，VEGF对内皮细胞的增殖、分化由VEGFR2介导。VEGFR3特异表达在淋巴内皮细胞中，在动脉、静脉、毛细血管内皮中基本没有表达。VEGF-C和VEGF-D可通过VEGF-C/VEGF-D/VEGFR3信号系统发挥作用，从而导致肿瘤淋巴管的增生和淋巴结的转移[Neufeld G等，FASEB J，1999，13：9-22]。Regeneron制药公司将VEGFR1膜外区与抗体Fc进行融合，制备了VEGFR1-Fc融合蛋白，它能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF-A和VEGF-B，从而抑制VEGF-A和VEGF-B的生物活性，阻断新生血管的形成，实验结果表明VEGFR1-Fc具有比Avastin更强的抗肿瘤作用[Wulff C等，J ClinEndocrinol Metab.2001，86(7)：3377-86.Holash J等，PNAS 2002，17：11393-11398]。但是，无论是Avastin还是VEGFR1-Fc都是通过阻断VEGF-A或/和VEGF-B所诱导的生物学功能，即抑制肿瘤的血管生成来发挥抗肿瘤作用。它们均不能与VEGF-C或VEGF-D相结合，而VEGF-C和VEGF-D可诱导肿瘤内淋巴管生成，进而促进肿瘤淋巴结转移，所以它们不能抑制肿瘤淋巴结转移。

因此，研究出既能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF-A和VEGF-B，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合，从而不仅抑制VEGF-A和VEGF-B的生物活性，阻断新生血管的形成，还能阻断VEGF-C和VEGF-D对肿瘤内淋巴管生成的诱导，防止肿瘤淋巴结转移的高效抗肿瘤药物一直是本领域的技术人员急待解决的问题。

发明内容

本发明公开了：

1.一种可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig，为包含VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3在内的融合蛋白，既能与VEGF-A和VEGF-B结合，还能与VEGF-C或VEGF-D相结合。

2.上述1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig，其轻链的氨基酸序列为SEQID NO：8所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示。

3.一种分离的核酸分子，编码上述1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig。

4.上述3所述的核酸分子，其中编码可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：7，编码重链的核苷酸序列为SEQ ID NO：9。

5.一种载体，含有上3、4任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR之一。

6.上述5所述的载体，为pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)。

7.一种宿主细胞，含有上述6所述的载体，为真核细胞。

8.上述7所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。

9.上述8所述的宿主细胞，为CHO细胞。

10.一种制备上述1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig的方法，该方法包括：

a)在表达条件下，培养上述7~9任一所述的宿主细胞，表达双功能融合受体，

b)分离或纯化所述的双功能融合受体VEGFR31-Ig。

11.一种组合物，含有上述1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig和药学上可接受的载体。

12.上述1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig在制备抗肿瘤药物中的用途。

13.上述11所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

14.上述12、13任一所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。

任何编码VEGFR1、VEGFR2和VEGFR3的合适的DNA都适合于本发明，这样的结构包括从根据GenBank|NM_002019中序列全基因合成的VEGFR1，从根据GenBank|NP_002244中序列全基因合成的VEGFR2，从根据embl|AR860556中序列全基因合成的VEGFR3。

本发明中，任何合适的载体都可以使用，可以为pDR1(如图1)，pCDNA3.1，pDHFF之一，表达载体中包括连接有合适的转录和翻译调节序列的融合DNA序列。

哺乳动物或昆虫宿主细胞培养系统可用于本发明的融合蛋白的表达，COS，CHO，NSO，sf9及sf21等均可适用于本发明。

可用的宿主细胞为含有上述载体的原核细胞，可以为DH5a，BL21(DE3)，TG1之一。

本发明中公开的VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig的制备方法为在表达条件下，培养上述的宿主细胞，从而表达双功能融合受体，分离或纯化所述的双功能融合受体VEGFR31-Ig。

利用上述方法，可以将融合蛋白纯化为基本均一的物质，例如在SDS-PAGE电泳上为单一条带。

可以利用亲和层析的方法对本发明公开的融合蛋白进行分离纯化，根据所利用的亲和柱的特性，可以使用常规的方法例如高盐缓冲液、改变PH等方法洗脱结合在亲和柱上的融合蛋白多肽。

本发明公开的上述可溶性双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig是通过以下方法得到的：VEGFR12和VEGFR23基因根据NM_002019和NP_002244中序列由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成，与人抗体轻链恒定区(k constantregion)基因以overlapPCR连接后克隆到pGEM-T载体中进行处理构建真核表达载体pDR(VEGFR31-Ig-L)，VEGFR3基因信号肽和Ig1-2区与重链恒定区(I gG1constant region)基因连接，构建成真核表达载体pDR(VEGFR31-Ig-H)；上述质粒一起用脂质体法转染CHO-K1细胞，并用含600μg/ml G418和250μg/mlZeocin的选择培养基筛选稳定表达可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig的细胞克隆.利用Protein A柱通过亲和层析从细胞培养物的上清中纯化可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig。

发明的申请人对上述的可溶性双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig进行亲和力检测、抑制HUVEC细胞增殖、蛋白药代动力学实验、体内抑瘤和抑制肿瘤转移等实验，实验结果表明，本发明公开的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig可以与VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D结合，同时具有可溶性VEGFR1和VEGFR3的功能，可以结合VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D四种血管内皮生长因子，阻断其信号传导通路。一方面，它能够能阻断血管内皮细胞的活化，增值，分化和迁移，既阻断肿瘤中新生血管的形成、减少肿瘤的供血和供氧，限制肿瘤的生长，又能降低血管通透性，减少肿瘤通过血管发生转移的机会。另一方面，它能够阻断淋巴内皮细胞的激活，阻断肿瘤中新生淋巴管的形成，阻止肿瘤细胞顺淋巴管转移的功能。这样，就几乎全部阻断VEGF/VEGFR传导途径，阻断肿瘤中内皮细胞分裂增殖、抑制新生血管的形成、降低血管通透性、减少肿瘤的供血和供氧，同时也可阻断肿瘤内淋巴管生成，抑制肿瘤的淋巴管转移，产生更强的抗肿瘤治疗疗效。此外，这个双功能融合受体VEGFR31-Ig具有比VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更大的分子量，因而其半衰期明显延长，实验表明，在相等剂量下，双功能融合受体VEGFR31-Ig具有比联合应用VEGFR1-Fc和VEGFR3-Fc更好的抗肿瘤治疗效果，本发明公开的双功能融合受体VEGFR31-Ig和本发明的发明人与2008年5月9日申请、2009.11.11公开中国专利申请号200810043351.5发明名称为《可溶性VEGFR双功能融合受体、其制备方法及用途》中公开的可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFRIgM、VEGFRIg相比，其拮抗VEGF-A的作用较VEGFRIgM、VEGFRIg显著增强，对照实验证明其与VEGF-A的结合力、竞争性抑制VEGF-A与VEGFR1Fc结合的能力、抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖的活性都较VEGFRIg和VEGFRIgM强，其在体内半衰期高于VEGFRIgM和VEGFRIg且体内抑制肿瘤也强于VEGFRIgM和VEGFRIg。

本发明公开的上述可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig，既能与血管内皮细胞表面的VEGFR竞争性结合VEGF-A，还能与VEGF-C相结合，从而不仅抑制VEGF-A的生物活性，阻断新生血管的形成，还能阻断VEGF-C对肿瘤内淋巴管生成的诱导，防止肿瘤淋巴结转移，并且其拮抗VEGF-A的作用较VEGFRIgM、VEGFRIg显著增强，达到了本发明的目的。

本发明公开上述可溶性双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig，可以和药学上可以接受的辅料一起组成药物制剂组合物从而更稳定地发挥疗效，这些制剂可以保证本发明公开的融合受体氨基酸核心序列的构像完整性，同时还要保护蛋白质的多官能团防止其降解(包括但不限于凝聚、脱氨或氧化)。通常情况下，对于液体制剂，通常可以在2℃-8℃条件下保存至少稳定一年，对于冻干制剂，在30℃至少六个月保持稳定。在这里制剂可为制药领域常用的混悬、水针、冻干等制剂，优选水针或冻干制剂，对于本发明公开的上述可溶性双功能VECFR融合受体的水针或冻干制剂，药学上可以接受的辅料包括表面活性剂、溶液稳定剂、等渗调节剂和缓冲液之一或其组合，其中表面活性剂包括非离子型表面活性剂如聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯(吐温20或80)；poloxamer(如poloxamer188)；Triton；十二烷基硫酸钠(SDS)；月桂硫酸钠；十四烷基、亚油基或十八烷基肌氨酸；Pluronics；MONAQUAT^TM等，其加入量应使双功能VECFR融合受体的颗粒化趋势最小，溶液稳定剂可以为糖类，包括还原性糖和非还原性糖，氨基酸类包括谷氨酸单钠或组氨酸，醇类包括三元醇、高级糖醇、丙二醇、聚乙二醇之一或其组合，溶液稳定剂的加入量应该使最后形成的制剂在本领域的技术人员认为达到稳定的时间内保持稳定状态，等渗调节剂可以为氯化钠、甘露醇之一，缓冲液可以为TRIS、组氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液之一。

上述制剂为包含双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig的组合物，在对包括人在内的动物给药后，抗肿瘤效果明显。具体来讲，对肿瘤的预防和/或治疗有效，可以作为抗肿瘤药物使用。

本发明所指的肿瘤，包括腺癌、白血病、淋巴瘤、黑色素瘤、肉瘤，肿瘤组织的来源包括但不限于肾上腺、胆囊、骨、骨髓、脑、乳腺、胆管、胃肠道、心脏、肾脏、肝脏、肺、肌肉、卵巢、胰腺、甲状旁腺、阴茎、前列腺、皮肤、唾液腺、脾脏、睾丸、胸腺、甲状腺和子宫。除了上述的肿瘤外，还可用于中枢神经系统的肿瘤如胶质细胞多样性瘤、星细胞瘤等，此外眼部的肿瘤包括基底细胞癌、鳞状细胞癌、黑色素瘤等，还包括内分泌腺肿瘤、神经内分泌系统肿瘤、胃肠道胰腺内分泌系统肿瘤，生殖系统肿瘤及头颈部肿瘤等。这里不再一一列举。

本发明所称的抗肿瘤药物，指具有抑制和/或治疗肿瘤的药物，可以包括伴随肿瘤生长相关症状发展的延迟和/或这些症状严重程度的降低，它进一步还包括已存在的肿瘤生长伴随症状的减轻并防止其他症状的出现，还也减少或防止转移。

本发明中双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig及其组合物在对包括人在内的动物给药时，给药剂量因病人的年龄和体重，疾病特性和严重性，以及给药途径而异，可以参考动物实验的结果和种种情况，总给药量不能超过一定范围。具体讲静脉注射的剂量是1～1800mg/天。

本发明公开的双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig及其组合物还可以和其他的抗肿瘤药联合给药，用于肿瘤的治疗，这些抗肿瘤药包括1、细胞毒类药物(1)作用于DNA化学结构的药物：烷化剂如氮芥类、亚硝尿类、甲基磺酸酯类；铂类化合物如顺铂、卡铂和草酸铂等；丝裂霉素(MMC)；(2)影响核酸合成的药物：二氢叶酸还原酶抑制剂如甲氨喋呤(MTX)和Alimta等；胸腺核苷合成酶抑制剂如氟尿嘧啶类(5FU、FT-207、卡培他滨)等；嘌呤核苷合成酶抑制剂如6-巯基嘌呤(6-MP)和6-TG等；核苷酸还原酶抑制剂如羟基脲(HU)等；DNA多聚酶抑制剂如阿糖胞苷(Ara-C)和健择(Gemz)等；(3)作用于核酸转录的药物：选择性作用于DNA模板，抑制DNA依赖RNA聚合酶，从而抑制RNA合成的药物如：放线菌素D、柔红霉素、阿霉素、表阿霉素、阿克拉霉素、光辉霉素等；(4)主要作用于微管蛋白合成的药物：紫杉醇、泰索帝、长春花碱、长春瑞滨、鬼臼硷类、高三尖杉酯碱；(5)其他细胞毒药：门冬酰胺酶主要抑制蛋白质的合成；2、激素类抗雌激素：三苯氧胺、屈洛昔芬、依西美坦等；芳香化酶抑制剂：氨鲁米特、兰特隆、来曲唑、瑞宁德等；抗雄激素：氟它氨RH-LH激动剂/拮抗剂：诺雷德、依那通等；3、生物反应调节剂：主要通过机体免疫功能抑制肿瘤干扰素；白细胞介素-2；胸腺肽类；4、单克隆抗体：美罗华(MabThera)；Cetuximab(C225)；赫赛汀(Trastuzumab)Bevacizumab(Avastin)；5、其他括一些目前机制不明和有待进一步研究的药物；细胞分化诱导剂如维甲类；细胞凋亡诱导剂。本发明公开的双功能VECFR融合受体VEGFR31-Ig及其组合物可以和上述的抗肿瘤药物之一或其组合联合用药。

附图说明

图1pDR1表达载体结构示意图，hCMV表示人巨细胞病毒Major Immediate早期启动子；BGH pA表示Bovine growth hormone多腺苷化信号；SV40 ori表示SV40病毒早期复制起点；DHFR表示二氢叶酸还原酶基因；pUC ori为质粒复制起点；AMP为氨苄青霉素抗性基因；

图2.VEGFRIg-L基因结构示意图；

图3.VEGFR31-Ig-H(同VEGFRIg-H)基因结构示意图；

图4.VEGFRIg双功能融合受体结构示意图；

图5.VEGFR31-Ig-L基因结构示意图；

图6.VEGFR31-Ig双功能融合受体结构示意图；

图7.双功能融合受体与VEGF-A结合力实验；

图8.双功能融合受体与VEGF-C结合力实验；

图9.双功能融合受体与VEGF-A的竞争抑制曲线；

图10.双功能融合受体与VEGF-C的竞争抑制曲线；

图11.双功能融合受体抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖活性实验

图12.双功能融合受体抑制VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖活性实验

图13.双功能融合受体体内血药浓度时间曲线

图14.可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤生长曲线

具体实施方式

以下实施例、实验例对本发明进行进一步的说明，不应理解为对本发明的限制。实施例不包括对传统方法的详细描述，如那些用于构建载体和质拉的方法，将编码蛋白的基因插入到这样的载体和质拉的方法或将质粒引入宿主细胞的方法.这样的方法对于本领域中具有普通技术的人员是众所周知的，并且在许多出版物中都有所描述，包括Sambrook，J.，Fritsch，E.F.and Maniais，T.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2^nd edition，Coldspring Harbor Laboratory Press.

VEGFRIgM、VEGFRIg的制备参照2009.11.11公开中国专利申请号200810043351.5发明名称为《可溶性VEGFR双功能融合受体、其制备方法及用途》中公开的方法制备得到。

实施例1.人抗体轻、重链恒定区和Fc区基因的克隆

用淋巴细胞分离液分离健康人淋巴细胞，用Trizol试剂(Invitrogen公司产品)提取总RNA，根据文献(Cell，1980，22：197-207)和文献(Nucleic AcidsResearch，1982，10：4071-4079)报道的序列分别设计引物扩增抗体重链和轻链恒定区基因，并用引物FC有义：GAAGCTTAATAATGGCCCGGGCGAGCCCAAATCTTGTGAC和FC反义：CGAATTCTCATTTACCCGGAGACAGG扩增抗体Fc区。PCR反应均采用热启动，反应条件：94℃分钟；94℃ 45秒，60℃ 45秒，72℃ 1分10秒，30个循环；72℃10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化回收并克隆到pGEM-T载体中，测序验证后确认获得了正确的克隆。SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2分别显示了重链恒定区(CH)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4分别显示了轻链恒定区(CL)的核苷酸和氨基酸序列。SEQ ID NO：5和SEQ ID NO：6分别显示了Fc区的核苷酸序列和氨基酸序列。本例中的正确克隆记作pGEM-T/CH、pGEM-T/CL和pGEM-T/Fc。

实施例2.可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig的构建

VEGFR12和VEGFR23基因根据NM_002019和NP_002244中序列由上海生物工程技术服务有限公司全基因合成，与人抗体轻链恒定区(k constant region)基因(以引物LC有义：ACTGTGGCTGCACCATCTGT；LC反义：GAATTCCTAACACTCTCCCCTGTTG以pGEM-T/CL为模板)以overlapPCR连接(序列见SEQ ID NO：3)，并且被克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，挑选阳性克隆，测序正确，以HinDIII和EcoRI酶切(Promega公司产品)，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收获得1kb的酶切片断与同酶切的质粒pDR1(图1)用T4 DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体pDR(VEGFR31-Ig-L)。图5为VEGFR31-Ig-L的基因结构图。SEQ ID NO：7和SEQID NO：8分别显示了VEGFR31-Ig-L的核苷酸和氨基酸序列。

VEGFR3基因信号肽和Ig1-2区(以引物VEGFR31有义：TAAGCTTGCCGCCACCATGCAGCGGGGCGCCGCGCTGTGCCTGCGACTGTGGCTCTGCCTGGGACTCCTGGACGGCCTGGTGAGTGACTACTCCATGACCCCCCCGACCTTGAACATC；VEGFR31反义：AGCTAGCGCCTGTGATGTGCACCAGGAAG，以PGEM-T/VEGFR1为模板扩增)，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收PCR产物并克隆到pGEM-T载体(Promega公司产品)中，筛选阳性克隆测序。将测序正确的克隆用HindIII和NheI双酶消化，回收700bp酶切片断与与同酶切的质粒pGEM-T/CH连接，挑选正确克隆后以HinDI11和EcoRI酶切，经琼脂糖凝胶电泳纯化回收2.3kb片段，与同酶切的质粒pDR1(图1)用T4DNA连接酶(Invitrogen公司产品)进行连接，构建成真核表达载体pDR(VEGFRIg-H)。图3为VEGFRIg-H的基因结构图。SEQ ID NO：9和SEQ ID NO：10分别显示了VEGFR31-Ig-H的核苷酸和氨基酸序列(同VEGFRIg-H的核苷酸和氨基酸序列)。

于3.5cm组织培养皿中接种3×10⁵CHO-K1细胞，细胞培养至90％-95％融合时进行转染：取质粒10μg(质粒pDR(VEGFRIg-H)4μg，质粒pDR(VEGFR31-Ig-L)6μg)和20μl Lipofectamine2000 Reagent[Invitrogen公司产品]分别溶于500μl无血清DMEM培养基，室温静置5分钟，将以上2种液体混合，室温孵育20分钟以使DNA-脂质体复合物形成，其间用3ml无血清的DMEM培养基替换培养皿中的含血清培养基，然后将形成的DNA-脂质体复合物加入到板中，CO₂孵箱培养4小时后补加2ml含10％血清的DMEM完全培养基，置于CO₂孵箱中继续培养。转染进行24h后细胞换含600μg/ml G418和250μg/mlZeocin的选择培养基筛选抗性克隆。取细胞培养上清用ELISA检测筛选高表达克隆：小鼠抗人IgG(CH2)包被于ELISA板，4℃过夜，用2％BSA-PBS于37℃封闭2小时，加入待测的培养上清和标准品(Human myeloma IgG1，κ)，37℃孵育2小时，加入HRP-小鼠抗人IgG(CH3)进行结合反应，37℃孵育1小时，加入TMB于37℃作用5分钟，最后用H₂SO₄终止反应，测OD₄₅₀值。将筛选得到的高表达克隆用无血清培养基扩大培养，用Protein A亲和柱(GE公司产品)分离纯化VEGFR31-Ig融合受体，经测序，和SEQ ID NO：8、SEQID NO：10序列一致，将纯化融合受体用PBS进行透析，最后以紫外吸收法定量。图6为VEGFR31-Ig融合受体结构图。

实验例

实验例1.可溶性双功能VEGFR融合受体亲和力检测实验-ELISA法

实验步骤：分别将VEGF-A、VEGF-C(R&D公司产品)用0.05mmol/L碳酸钠.碳酸氢钠缓冲液(pH 9.6)稀释成2ug/ml，100ul/孔，4℃包被过夜。3％脱脂奶室温封闭2h后，加入不同浓度的可溶性VEGFR融合受体VEGFR31-Ig、VEGFRIg、VEGFRIgM，100ul/孔，每个浓度取3个平行孔，PBS作为阴性对照，室温孵育2h。弃上清液，PBS洗涤3次，加入按效价稀释好的HRP标记的小鼠抗人IgG单抗(DAKO公司产品)，50ul/孔，室温孵育45min。PBS充分洗涤后，OPD避光显色，加入2mol/L H₂SO₄终止反应后，置酶标仪(Elx型自动酶标比色仪，美国BIO-TEK公司)中测定492nm吸光度(A492)值。

实验结果：如图7，图8所示。

实验结果表明：可溶性VEGFR融合受体VEGFR31-Ig可同时结合VEGF-A、VEGF-C，且与VEGF-A的结合力较VEGFRIg和VEGFRIgM强。

实验例2.可溶性双功能VEGFR融合受体亲和力检测实验

实验步骤：不同量的可溶性VEGFR融合受体VEGFR31-Ig、VEGFRIg、VEGFRIgM分别与50ng的AP标记的VEGFR 1 Fc(见文章Suppression of tumor angiogenesisand growth by gene transfer of a soluble form of vascular endothelialgrowth factor receptor into a remote organ.Takayama，-K，Cancer-Res.2000 Apr 15；60(8)：2169-77)、50ng的AP标记的VEGFR 3 Fc(见文章Inhibitionof lymphangiogenesis with resulting lymphedema in transgenic miceexpressing soluble VEGF receptor-3 TAIJA MAKINEN NATURE MEDICINE 200147 199-205)混合并在室温湿育1个小时。将混合物转移到用VEGF-A(200ng/孔)或VEGF-C(200ng/孔)(R&D公司产品)包被的96孔微量滴定权并在室温继续温育2小时，然后将滴定板洗5次，加入AP的底物以对结合的VEGFRFc-AP分子定量.然后计算IC50，即，50％抑制VEGFR融合受体与VEGF结合所需要的VEGFR融合受体浓度。如图9，图10所示，结果表明，可溶性VEGFR融合受体VEGFR31-Ig既能竞争性抑制VEGF-A与VEGFR1Fc的结合，又能竞争性抑制VEGF-C与VEGFR3Fc的结合，且其竞争性抑制VEGF-A与VEGFR1Fc结合的能力较VEGFRIg和VEGFRIgM强。

实验例3.可溶性双功能VEGFR融合受体抑制HUVEC细胞增殖实验

实验步骤：取生长状态良好的HUVEC细胞，调整细胞浓度为2.5×10⁴/ml，接种于96孔细胞培养板，200μl/孔，于37℃、5％CO2孵箱中培养24h后换无血清培养基，继续培养72h，加入不同浓度梯度的VEGFR融合受体，以PBS为对照，每个浓度取3个平行孔，37℃孵育1h，加入终浓度为25ng/ml的VEGF-A或100ng/ml的VEGF-C继续培养24h后，加入10μl[3H].TdR(18.5kBq/孔)，37℃孵箱中孵育7h，细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤膜上，采用[3H]液闪计数仪进行测定。如图11，图12所示，结果表明可溶性融合受体VEGFR31-Ig、VEGFRIg、VEGFRIgM可同时抑制VEGF-A、VEGF-C引起的HUVEC细胞增殖，且VEGFR31-Ig抑制VEGF-A引起的HUVEC细胞增殖的活性较VEGFRIg强。

实验例4.可溶性双功能VEGF融合受体药代动力学检测

实验步骤：四周龄C57BL/6雌性小鼠(体重15-19g)皮下注射(s.c.)60μg(0.4μg/μl*150μl)/mice①VEGFR31-Ig、②VEGFRIgM、③VEGFRIg，分别于注射后1hr，6hr，24hr，48hr，4d，7d，10d，13d，16d，20d后取血，每只小鼠取血约100μl(内眦静脉取血)加0.1％的肝素混匀，离心4000rpm*20min。取上清，弃沉淀。ELISA检测血浆中抗体的浓度(以小鼠抗人CH3单克隆抗体包被96孔板，加血浆后，以HRP标记的小鼠抗人CH2单克隆抗体检测)。检测结果如图13所示，VEGFR31-Ig的体内半衰期较长，高于VEGFRIgM和VEGFRIg。其24小时浓度达到最高，在6-48小时维持较高的浓度(10-12μg/ml)并持续到13天后仍有0.02μg/ml。

实验例5.可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤生长实验

实验步骤：为检测可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑瘤活性，首先用LM3细胞(人肝癌细胞)，接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军医大学实验动物中心)右胁侧皮下，接种肿瘤当天给予可溶性双功能VEGFR融合受体25mg/kg(VEGFR31-Ig、VEGFRIgM和VEGFRIg)及无关对照蛋白G10和PBS，然后隔天皮下注射持续4周.6周后，每3天测量肿瘤的长宽，计算肿瘤体积，结果如图14所示。结果表明：VEGFR31-Ig、VEGFRIgM和VEGFRIg受体融合蛋组肿瘤大小显著小于无关对照蛋白G10和PBS组(P＜0.01)，VEGFR31-Ig组肿瘤体积较VEGFRIgM和VEGFRIg略小，有显著性差异(P＜0.05)。

实验例6.可溶性双功能VEGFR融合受体体内抑制肿瘤转移实验

实验步骤：用LM3细胞(人肝癌细胞)，接种于到雌性重症免疫缺陷小鼠(第二军医大学实验动物中心)右胁侧皮下，接种肿瘤当天给予可溶性双功能VEGFR融合受体25mg/kg(VEGFR31-Ig、VEGFRIgM和VEGFRIg)及无关对照蛋白G10和PBS，然后隔天皮下注射持续4周.6周后处死小鼠，检测淋巴结转移数目及转移淋巴结的大小。实验结果见表1

表1 可溶性双功能融合受体抑制肿瘤淋巴转移活性

组别	转移淋巴结数目/只(12只/组)
		PBS_c	6.0±1.0

阴性对照G10	5.8±1.2
		VEGFR31-Ig	0.4±0.2
VEGFRIgM_a	0.5±0.2
		VEGFRIg_b	0.4±0.1

注：a，VEGFR31-Ig组与VEGFRIgM组，p＞0.3；b，VEGFR31-Ig组与VEGFRIg组，p＞0.3；c，与阴性对照组，P＝0.008。(非配对t检验)

上述结果表明，VEGFR31-Ig融合受体可明显抑制肿瘤的淋巴结转移，与VEGFRIgM、VEGFRIg无显著性差异。

序列表

<110>上海抗体药物国家工程研究中心有限公司

上海中信国健药业有限公司

<120>可溶性VEGFR双功能融合受体VEGFR31-Ig、其制备方法及用途

<130>Wulff C等，J Clin Endocrinol Metab.2001，86(7)：3377-86

<160>10

<170>PatentIn version 3.4

<210>1

<211>990

<212>DNA

<213>Gammal chain constant region DNA sequence

<400>1

gctagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagag agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggaggag 720

atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctat agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc cccgggtaaa 990

<210>2

<211>330

<212>PRT

<213>Gammal chain constant region amino acid sequence

<400>2

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210>3

<211>318

<212>DNA

<213>Kappa chain constant region DNA sequence

<400>3

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgt 318

<210>4

<211>106

<212>PRT

<213>Kappa chain constant region amino acid sequence

<400>4

Arg Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210>5

<211>693

<212>DNA

<213>Gamma1 chain Fc region DNA sequence

<400>5

ggcccgggcg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 60

gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 120

atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 180

gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 240

gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 300

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 360

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 420

ccatctcggg aggagatgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 480

tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 540

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctatagcaa gctcaccgtg 600

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 660

cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctg 693

<210>6

<211>231

<212>PRT

<213>Gamma1 chain Fc region amino acid sequence

<400>6

Gly Pro Gly Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

1 5 10 15

Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

20 25 30

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

35 40 45

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

50 55 60

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

65 70 75 80

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

85 90 95

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

100 105 110

Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

115 120 125

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys

130 135 140

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

145 150 155 160

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

165 170 175

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

180 185 190

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

195 200 205

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

225 230

<210>7

<211>933

<212>DNA

<213>VEGFR31-Ig轻链核苷酸

<400>7

agtgataccg gtagaccttt cgtagagatg tacagtgaaa tccccgaaat tatacacatg 60

actgaaggaa gggagctcgt cattccctgc cgggttacgt cacctaacat cactgttact 120

ttaaaaaagt ttccacttga cactttgatc cctgatggaa aacgcataat ctgggacagt 180

agaaagggct tcatcatatc aaatgcaacg tacaaagaaa tagggcttct gacctgtgaa 240

gcaacagtca atgggcattt gtataagaca aactatctca cacatcgaca aaccaataca 300

atcatagatg tggttctgag tccgtctcat ggaattgaac tatctgttgg agaaaagctt 360

gtcttaaatt gtacagcaag aactgaacta aatgtgggga ttgacttcaa ctgggaatac 420

ccttcttcga agcatcagca taagaaactt gtaaaccgag acctaaaaac ccagtctggg 480

agtgagatga agaaattttt gagcacctta actatagatg gtgtaacccg gagtgaccaa 540

ggattgtaca cctgtgcagc atccagtggg ctgatgacca agaagaacag cacatttgtc 600

agggtccatg aaaagactgt ggctgcacca tctgtcttca tcttcccgcc atctgatgag 660

cagttgaaat ctggaactgc ctctgttgtg tgcctgctga ataacttcta tcccagagag 720

gccaaagtac agtggaaggt ggataacgcc ctccaatcgg gtaactccca ggagagtgtc 780

acagagcagg acagcaagga cagcacctac agcctcagca gcaccctgac gctgagcaaa 840

gcagactacg agaaacacaa agtctacgcc tgcgaagtca cccatcaggg cctgagctcg 900

cccgtcacaa agagcttcaa caggggagag tgt 933

<210>8

<211>311

<212>PRT

<213>VEGFR31-Ig轻链氨基酸

<400>8

Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro Cys Arg Val

20 25 30

Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro Leu Asp Thr

35 40 45

Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg Lys Gly Phe

50 55 60

Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu Thr Cys Glu

65 70 75 80

Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu Thr His Arg

85 90 95

Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile

100 105 110

Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr

115 120 125

Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys

130 135 140

His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly

145 150 155 160

Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr

165 170 175

Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met

180 185 190

Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys Thr Val Ala

195 200 205

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

210 215 220

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

225 230 235 240

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

245 250 255

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

260 265 270

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

275 280 285

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

290 295 300

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

305 310

<210>9

<211>1602

<212>DNA

<213>VEGFR31-Ig重链核苷酸

<400>9

agtgactact ccatgacccc cccgaccttg aacatcacgg aggagtcaca cgtcatcgac 60

accggtgaca gcctgtccat ctcctgcagg ggacagcacc ccctcgagtg ggcttggcca 120

ggagctcagg aggcgccagc caccggagac aaggacagcg aggacacggg ggtggtgcga 180

gactgcgagg gcacagacgc caggccctac tgcaaggtgt tgctgctgca cgaggtacat 240

gccaacgaca caggcagcta cgtctgctac tacaagtaca tcaaggcacg catcgagggc 300

accacggccg ccagctccta cgtgttcgtg agagactttg agcagccatt catcaacaag 360

cctgacacgc tcttggtcaa caggaaggac gccatgtggg tgccctgtct ggtgtccatc 420

cccggcctca atgtcacgct gcgctcgcaa agctcggtgc tgtggccaga cgggcaggag 480

gtggtgtggg atgaccggcg gggcatgctc gtgtccacgc cactgctgca cgatgccctg 540

tacctgcagt gcgagaccac ctggggagac caggacttcc tttccaaccc cttcctggtg 600

cacatcacag gcgctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 660

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 720

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 780

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 840

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 900

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 960

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 1020

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 1080

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 1140

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 1200

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1260

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1320

tcccgggagg agatgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1380

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1440

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct atagcaagct caccgtggac 1500

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1560

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tccccgggta aa 1602

<210>10

<211>534

<212>PRT

<213>VEGFR31-Ig重链氨基酸

<400>10

Ser Asp Tyr Ser Met Thr Pro Pro Thr Leu Asn Ile Thr Glu Glu Ser

1 5 10 15

His Val Ile Asp Thr Gly Asp Ser Leu Ser Ile Ser Cys Arg Gly Gln

20 25 30

His Pro Leu Glu Trp Ala Trp Pro Gly Ala Gln Glu Ala Pro Ala Thr

35 40 45

Gly Asp Lys Asp Ser Glu Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Cys Glu Gly

50 55 60

Thr Asp Ala Arg Pro Tyr Cys Lys Val Leu Leu Leu His Glu Val His

65 70 75 80

Ala Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Val Cys Tyr Tyr Lys Tyr Ile Lys Ala

85 90 95

Arg Ile Glu Gly Thr Thr Ala Ala Ser Ser Tyr Val Phe Val Arg Asp

100 105 110

Phe Glu Gln Pro Phe Ile Asn Lys Pro Asp Thr Leu Leu Val Asn Arg

115 120 125

Lys Asp Ala Met Trp Val Pro Cys Leu Val Ser Ile Pro Gly Leu Asn

130 135 140

Val Thr Leu Arg Ser Gln Ser Ser Val Leu Trp Pro Asp Gly Gln Glu

145 150 155 160

Val Val Trp Asp Asp Arg Arg Gly Met Leu Val Ser Thr Pro Leu Leu

165 170 175

His Asp Ala Leu Tyr Leu Gln Cys Glu Thr Thr Trp Gly Asp Gln Asp

180 185 190

Phe Leu Ser Asn Pro Phe Leu Val His Ile Thr Gly Ala Ser Thr Lys

195 200 205

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

210 215 220

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

225 230 235 240

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

245 250 255

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

260 265 270

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

275 280 285

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

290 295 300

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

305 310 315 320

Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

325 330 335

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

340 345 350

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

355 360 365

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

370 375 380

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

385 390 395 400

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro

405 410 415

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

420 425 430

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn

435 440 445

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

450 455 460

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

465 470 475 480

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

485 490 495

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

500 505 510

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

515 520 525

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

530

Claims

2.权利要求1所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig，其轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO：8所示，重链的氨基酸序列为SEQ ID NO：10所示。

3.一种分离的核酸分子，编码权利要求1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig。

4.权利要求3所述的核酸分子，其中编码可溶性双功能VEGFR融合受体EGFR31-Ig轻链的核苷酸序列为SEQ ID NO：7，编码重链的核苷酸序列为SEQ IDNO：9。

5.一种载体，含有权利要求3、4任一所述的核酸分子和所述核酸分子的序列操作性相连的表达调控序列，其中载体可以为pDR1，pcDNA3.1(+)，pcDNA3.1/ZEO(+)，pDHFR之一。

6.权利要求5所述的载体，为pcDNA3.1(+)或pcDNA3.1/ZEO(+)。

7.一种宿主细胞，含有权利要求6所述的载体，为真核细胞。

8.权利要求7所述的宿主细胞，为哺乳动物细胞。

9.权利要求8所述的宿主细胞，为CHO细胞。

10.一种制备权利要求1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig的方法，该方法包括：

a)在表达条件下，培养权利要求7~9任一所述的宿主细胞，表达双功能融合受体，

b)分离或纯化所述的双功能融合受体VEGFR31-Ig。

11.一种组合物，含有权利要求1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig和药学上可接受的载体。

12.权利要求1-2任一所述的可溶性双功能VEGFR融合受体VEGFR31-Ig在制备抗肿瘤药物中的用途。

13.权利要求11所述的组合物在制备抗肿瘤药物中的用途。

14.权利要求12、13任一所述的用途，还包括和其它的抗肿瘤药物联合使用。