CN108949789A - 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 - Google Patents
抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN108949789A CN108949789A CN201810671873.3A CN201810671873A CN108949789A CN 108949789 A CN108949789 A CN 108949789A CN 201810671873 A CN201810671873 A CN 201810671873A CN 108949789 A CN108949789 A CN 108949789A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- gcc
- nucleotide sequence
- nucleic acid
- cells
- car
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Withdrawn
Links
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title claims abstract description 78
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title claims abstract description 78
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title claims abstract description 68
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 62
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 62
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 claims abstract description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 32
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 27
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 25
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 21
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 claims description 20
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 claims description 20
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 claims description 19
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000008272 agar Substances 0.000 claims description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 12
- 101000851370 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Proteins 0.000 claims description 11
- 102100036856 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 9 Human genes 0.000 claims description 11
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 claims description 11
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 9
- 108010082161 Chemokine CCL19 Proteins 0.000 claims description 8
- 102000003805 Chemokine CCL19 Human genes 0.000 claims description 8
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 7
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 claims description 5
- 102100022153 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 4
- 102100027207 CD27 antigen Human genes 0.000 claims description 3
- 101000914511 Homo sapiens CD27 antigen Proteins 0.000 claims description 3
- 101000914514 Homo sapiens T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Proteins 0.000 claims description 3
- 101000679851 Homo sapiens Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100027213 T-cell-specific surface glycoprotein CD28 Human genes 0.000 claims description 3
- 210000004405 cytokine-induced killer cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 3
- 210000003071 memory t lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 210000003289 regulatory T cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 5
- 210000004882 non-tumor cell Anatomy 0.000 abstract description 4
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 abstract 2
- 101001075055 Spinacia oleracea 50S ribosomal protein L19, chloroplastic Proteins 0.000 abstract 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract 1
- 238000005336 cracking Methods 0.000 abstract 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 20
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 20
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 20
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 15
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 15
- 102100036842 C-C motif chemokine 19 Human genes 0.000 description 13
- 101000713106 Homo sapiens C-C motif chemokine 19 Proteins 0.000 description 13
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 11
- 108010019670 Chimeric Antigen Receptors Proteins 0.000 description 10
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 9
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 9
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 7
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 208000000461 Esophageal Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 201000004101 esophageal cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 5
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 5
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 5
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 206010030155 Oesophageal carcinoma Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 4
- 238000011357 CAR T-cell therapy Methods 0.000 description 3
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 3
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 3
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 3
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 108091007741 Chimeric antigen receptor T cells Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000000820 Enterotoxin Receptors Human genes 0.000 description 2
- 108010001687 Enterotoxin Receptors Proteins 0.000 description 2
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 2
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710165473 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 4 Proteins 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000139 costimulatory effect Effects 0.000 description 2
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 2
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 239000008279 sol Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- BALXSYQWXWVVJJ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3,7-dihydropurin-6-one;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.O=C1NC(N)=NC2=C1NC=N2 BALXSYQWXWVVJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000036764 Adenocarcinoma of the esophagus Diseases 0.000 description 1
- 102100036301 C-C chemokine receptor type 7 Human genes 0.000 description 1
- 101150011672 CCL9 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010052358 Colorectal cancer metastatic Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 101000716065 Homo sapiens C-C chemokine receptor type 7 Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 108010078049 Interferon alpha-2 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 206010025323 Lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 206010030137 Oesophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 208000015634 Rectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 108010087230 Sincalide Proteins 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000004271 bone marrow stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000009702 cancer cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010609 cell counting kit-8 assay Methods 0.000 description 1
- 230000022534 cell killing Effects 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 230000009028 cell transition Effects 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000028653 esophageal adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 201000006585 gastric adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 229940088592 immunologic factor Drugs 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003871 intestinal function Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 208000021601 lentivirus infection Diseases 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 102000027427 receptor guanylyl cyclases Human genes 0.000 description 1
- 108091008596 receptor guanylyl cyclases Proteins 0.000 description 1
- 206010038038 rectal cancer Diseases 0.000 description 1
- 201000001275 rectum cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N sincalide Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O)C1=CC=C(OS(O)(=O)=O)C=C1 IZTQOLKUZKXIRV-YRVFCXMDSA-N 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000012756 sodium ion homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000002626 targeted therapy Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 108091005703 transmembrane proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035160 transmembrane proteins Human genes 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/523—Beta-chemokines, e.g. RANTES, I-309/TCA-3, MIP-1alpha, MIP-1beta/ACT-2/LD78/SCIF, MCP-1/MCAF, MCP-2, MCP-3, LDCF-1, LDCF-2
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/10—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
- A61K40/11—T-cells, e.g. tumour infiltrating lymphocytes [TIL] or regulatory T [Treg] cells; Lymphokine-activated killer [LAK] cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/30—Cellular immunotherapy characterised by the recombinant expression of specific molecules in the cells of the immune system
- A61K40/31—Chimeric antigen receptors [CAR]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K40/00—Cellular immunotherapy
- A61K40/40—Cellular immunotherapy characterised by antigens that are targeted or presented by cells of the immune system
- A61K40/41—Vertebrate antigens
- A61K40/42—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/521—Chemokines
- C07K14/522—Alpha-chemokines, e.g. NAP-2, ENA-78, GRO-alpha/MGSA/NAP-3, GRO-beta/MIP-2alpha, GRO-gamma/MIP-2beta, IP-10, GCP-2, MIG, PBSF, PF-4, KC
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
- C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0636—T lymphocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
- C12N5/0646—Natural killers cells [NK], NKT cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2510/00—Genetically modified cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Virology (AREA)
- Mycology (AREA)
- Developmental Biology & Embryology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
抗GCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用，抗GCC的核酸，其至少包含Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜‑刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列。本发明能够提高免疫细胞的针对性，减少对非肿瘤细胞的伤害，提高有效性、安全性。
Description
技术领域
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及一种抗GCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用。
背景技术
结直肠癌是常见的消化道恶性肿瘤之一，占全球所有肿瘤的10％，在全世界恶性肿瘤的发病率中占第3位。手术虽为有效的治疗方法，但仍有近1/3的结直肠癌患者在术后出现复发和远处转移，5年生存率不足50％。目前，相关研究也表明结直肠发病具有逐年上升和年轻化趋势，严重影响危害人类健康。因此，早期发现、早期治疗是提高结直肠癌疗效、改善预后和提高生存率的关键。
在恶性肿瘤治疗方法中，使用手术、放化疗和靶向治疗的治愈率以及预后都很差，对患者造成极大的伤害，而嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor T cells，CAR-T)过继性免疫治疗策略克服了以上治疗方法的缺点，给癌症治愈带来了希望。CAR-T治疗的原理如下：通过基因工程修饰技术，使体外分离收集的癌症患者的T细胞表达识别肿瘤特异性抗原的嵌合抗原受体(CAR)，并在体外大量扩增CAR-T细胞后将其输回癌症患者体内，达到清除肿瘤的目的。相关研究表明CAR-T细胞疗法在急性淋巴细胞白血病(ALL)和淋巴瘤等恶性肿瘤治疗中取得了良好效果，因此，CAR-T技术具有较大的应用前景。
因此，开发一种抗GCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和工业应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。
发明内容
为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。
具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供抗GCC的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用，以提高免疫细胞的针对性，减少对非肿瘤细胞的伤害，提高有效性、安全性。
为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
第一方面，本发明提供了抗GCC的核酸，其至少包含Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列选自CD8、CD27、CD28、CD137(即4-1BB)、CD134(即OX40)、ICOS分子的全部或部分DNA片段。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗GCC的核酸，其包括依序排列的
如SEQ ID NO.2所述的Leader核苷酸序列；
如SEQ ID NO.3所述的GCC单链抗体核酸人工序列；
如SEQ ID NO.4所述的CD8的铰链区核苷酸序列；
跨膜-刺激结构域核苷酸序列；
如SEQ ID NO.6所述的4-1BB胞内区核酸序列；
如SEQ ID NO.7所述的CD3ζ信号传导区核苷酸序列；
如SEQ ID NO.8所述的自裂解肽T2A核酸人工序列；
如SEQ ID NO.9所述的趋化因子IL7核苷酸序列；
如SEQ ID NO.10所述的趋化因子CCL19核苷酸序。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列采用如SEQ ID NO.5所述的CD8跨膜区核酸人工序列。
本发明中，作为一种优选的技术方案，所述抗GCC的核酸的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所述。
第二方面，本发明提供了该核酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GCC-CAR；
(2)将pUC-GCC-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GCC-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GCC-CAR DNA片段。
第三方面，本发明提供了免疫细胞，包含具有如上所述核酸的质粒。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述质粒是将融合基因片段GCC-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-GCC-CAR质粒。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的GCC-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GCC-CAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA片段：4μl，连接形成。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述免疫细胞的采用包括如下步骤的方法制备得到：
首先将上述的pLent-GCC-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。
第四方面，本发明提供了抗GCC核酸的应用，是指该基因在制备治疗实体瘤的药物中能够得以应用。所述药物形式包括但不限于试剂盒。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，所述实体瘤包括结直肠癌、胃癌、食道癌。
在本发明中，作为一种优选的技术方案，该试剂盒，包括
(1)获得如上所述的稳定表达GCC-CAR的载体；
(2)载体稀释液。
采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：
本发明中，鸟苷酸环化酶C(guanylyl cyclase C，GCC)是一种肠道组织特异性表达的多肽，属于受体鸟苷酸环化酶家族成员，是N-连接糖蛋白受体。GCC包括胞外N末端受体结合区、激酶同源调节区、C末端催化区及羧基末端四个部分。GCC具有以下功能:调节Na+动态平衡；刺激CL-分泌/抑制Na+吸收，调节肠道功能；调节肠道pH值，促进食物消化吸收；通过开放CNG通路和抑制Ca2+和Na+交换,调节肠上皮细胞的转变和增殖；分泌黏液、水，清除肠、肺等组织中的病原菌。GCC亦可表达于结直肠癌细胞株、原发性和转移性结直肠癌，调节肠上皮细胞转变，抑制结直肠癌细胞增殖和DNA合成。体内GCC抗体可能通过环磷酸鸟嘌呤(cGMP)依赖的相关机制来调节小肠黏膜上皮细胞的增殖和分化(见图1)。另外，研究发现在食管和胃腺癌中也可见GCC高表达。因此，可以利用GCC作为治疗结肠癌、胃癌或食道癌的CAR-T的靶点，为临床诊治提供有效的治疗方法。但是，由于单纯的利用GCC作为治疗结肠癌、胃癌或食道癌的CAR-T的靶点，其免疫细胞容易对非肿瘤细胞的造成伤害。
因此，发明人经过反复的筛选试验，付出创造性的劳动，将本发明所述的共表达免疫加强因子IL7和CCL19抗GCC的CAR-T在常规CAR-T基础上进行改造，使常规CAR-T可以表达IL7和CCL19两种趋化因子，特异性识别结肠癌细胞表面GCC肿瘤相关抗原。所述白介素-7(interleukin-7,IL-7)是一种细胞因子，由胸腺细胞、骨髓基质细胞、小肠上皮细胞等分泌，在人体免疫系统的正常发育和维持正常免疫功能中起重要作用，在促进T细胞增殖的同时可维持T细胞稳定。所述CCL19是趋化因子CC家族成员，它的特异性受体CCR7是一种分布于细胞表面的7次跨膜蛋白。CCL19具有募集外周T细胞及树突状细胞进入淋巴组织的功能，可抑制人结直肠癌细胞株SW620细胞增殖、迁移和侵袭能力，具有抑制结直肠癌的作用，除此之外CCL19还可以有效抑制肺癌、卵巢癌、纤维肉瘤等实体肿瘤。
本发明在第三代CAR-T技术的基础上，首次提出将GCC作为结直肠癌、胃癌、食道癌等恶性肿瘤表达量高的GCC作为靶点，制备了一共同表达免疫加强因子IL7和CCL19抗GCC嵌合抗原受体的免疫细胞，该细胞即可特异性杀死表达GCC靶细胞，又能减少对非肿瘤细胞的伤害，有效性更好、安全性更高。
本发明构造的新一代CAR-T载体，加入了免疫加强因子IL7和CCL19，其中IL7可促进T细胞增殖并维持T细胞稳定，CCL19可以募集外周T细胞及树突状细胞进入淋巴组织，因此，本发明构造的7×19CAR-T细胞增殖和杀伤能力比普通的CAR-T细胞提高2倍。而且本发明所述的趋化因子可被用于任何CAR技术改造的免疫细胞，极大的提高CAR技术的临床有效性。
附图说明
图1GCC结构示意图。
图2共表达免疫加强因子IL7和CCL19Anti-GCC的CAR模块图。
图3流式细胞术检测抗7×19GCC-CAR载体在T细胞表面的表达情况。
图4CFSE标记的7×19CAR-T细胞和CAR-T细胞数量比较图。
图5结直肠癌鼠模型T淋巴细胞治疗后肿瘤大小变化图。
图6为本发明所述的Leader-scFv(GCC)-CD8-4-1BB-CD3ζ-T2A-IL7-T2A-CCL19重组基因设计图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。
实施例1
抗GCC的核酸，其至少包含Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列。其中，跨膜-刺激结构域核苷酸序列选自CD8、CD27、CD28、CD137(即4-1BB)、CD134(即OX40)、ICOS分子的全部或部分DNA片段。
本实施例中，所述抗GCC的核酸，其包括依序排列的CD8Leader核酸人工序列(SEQIDNO.2)、GCC单链抗体核酸人工序列(SEQIDNO.3)、CD8铰链区核酸人工序列(SEQIDNO.4)、CD8跨膜区核酸人工序列(SEQIDNO.5)、4-1BB共刺激区核酸人工序列(SEQIDNO.6)、CD3ζ信号区传导区核酸人工序列(SEQIDNO.7)、自裂解肽T2A核酸人工序列(SEQIDNO.8)、趋化因子IL7核酸人工序列(SEQIDNO.9)、自裂解肽T2A核酸人工序列(SEQIDNO.8)、趋化因子CCL19核酸人工序列(SEQIDNO.10)。
实施例2
治疗GCC的核酸的制备方法，包括如下步骤：
(1)分别按Leader核酸人工序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、自裂解肽T2A核酸人工序列、IL7核酸人工序列、自裂解肽T2A核酸人工序列、CCL19核酸人工序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GCC-CAR；
(2)将pUC-GCC-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GCC-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GCC-CAR DNA片段。
本实施例中，更详细的步骤为：
(1)分别按Leader核酸人工序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、自裂解肽T2A核酸人工序列、IL7核酸人工序列、自裂解肽T2A核酸人工序列、CCL19核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-GCC-CAR；
(2)将pUC-GCC-CAR载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和FastDigest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将把含有GCC-CAR DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DFbuffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DFColumn，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl Wash Buffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DF Column转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的GCC-CAR DNA片段。
实施例3
含有如实施例2所述基因的质粒，所述质粒是将融合基因片段GCC-CAR DNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的质粒，命名为7×19pLent-GCC-CAR。所述质粒采用如下制备方法制备得到：将上述纯化的GCC-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段在连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GCC-CAR DNA片段：4μl；线性化的pLent-C-GFPDNA片段：4μl，连接形成。
本实施例中，该质粒采用如下的方法制备得到：
分别按Leader核酸人工序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8铰链区核酸人工序列、CD8跨膜区核酸人工序列、4-1BB共刺激区核酸人工序列、CD3ζ信号传导区核酸人工序列、自裂解肽T2A核酸人工序列、IL7核酸人工序列、自裂解肽T2A核酸人工序列、CCL19核酸人工序列委托生工生物工程(上海)有限公司合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，因此命名为pUC-GCC-CAR，同时将pUC-GCC-CAR和pLent-C-GFP载体进行Fast Digest AsiSI(购自ThermoFisher公司)和Fast Digest NotI(购自ThermoFisher公司)双酶切，37℃，酶切20min。100μl酶切体系为：10×buffer：10μl；DNA 6μg；AsiSI酶：3μl；NotI酶：3μl；去离子水补足体积。利用琼胶电泳将分别把含有GCC-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段的琼胶部位切下，放在两个离心管中。采用DNA extraction kit(购自ThermoFisher公司)将DNA从琼胶中溶出并浓缩，首先往上述离心管加入500μl DF buffer，55℃作用10分钟，每2-3分钟摇晃一次，直至琼胶完全溶解。再将琼胶溶液全部吸入DF Column，并套上Collection Tube(收集过滤液)。8000rpm离心1分钟，将过滤液倒掉。再加入500μl WashBuffer，8000rpm离心1分钟，过滤液倒掉。12000rpm离心2分钟确保乙醇被去除。最后将DFColumn转移至上另一干净的微量离心管，加入25μl Elution Buffer，室温静置2分钟后，14000rpm离心2分钟，微量离心管内的液体即为纯化的GCC-CAR DNA片段和线性化的pLent-C-GFP DNA片段。
将上述两种DNA片段在16℃进行过夜连接形成7×19pLent-GCC-CAR质粒。连接体系为：10×buffer：1μl；T4连接酶：1μl；GCC-CAR DNA：4μl；线性化的pLent-C-GFP DNA：4μl。
实施例4
质粒的纯化：将上述7×19pLent-GCC-CAR转化到E.coli(DH5α)。具体步骤如下：将质粒和感受态细胞混匀在冰上孵育半小时，再42度热激90秒，再冰上放置2min，最后加液体LB培养基缓摇1个小时左右再3000rpm离心5min，将100μl菌液涂布在含有氨苄LB固体平板。次日挑取单菌落进行过夜培养，采用质粒提取纯化试剂盒(购自Qiagen公司)提取pLent-GCC-CAR质粒，具体步骤如下：(1)取1.5ml菌液室温10000×g离心1min。(2)去上清，加250μl溶液Ⅰ(含RNase A)，涡漩振荡器震荡至菌体完全悬浮。(3)加入250μl溶液Ⅱ，温和颠倒离心管4～6次，获得澄清的裂解液。最好室温孵育2min。(4)加350μl溶液Ⅲ，温和颠倒数次混合，至出现白色絮状沉淀，室温10000×g离心10min。(5)特别小心吸取上清，移至洁净的装配好容积2ml离心管的吸收柱中。要保证没有吸入沉淀和细胞碎片。室温10000×g离心1min，至裂解物完全通过吸收柱。(6)弃滤过液，加500μl Buffer HBC，10000×g离心1min，清洗吸收柱，除去残余蛋白质保证DNA的纯度。(7)弃滤过液，再用100％乙醇稀释的750μlWashBuffer清洗吸收柱，10000×g离心1min。(8)再加750μl Wash Buffer清洗吸收柱。(9)必须将吸收柱10000×g离心2min确保乙醇被去除。(10)将吸收柱放入干净1.5ml离心管，加50-100μl(取决于需要的终浓度)无菌去离子水或TE缓冲液在滤膜上，10000×g离心5min，收集质粒DNA。(11)和预知浓度DNA样品(Marker)一起做琼脂糖凝胶电泳，对比结果，得出7×19pLent-GCC-CAR质粒浓度为360ng/μl。
实施例5
免疫细胞，包含具有如上所述核酸的质粒。本实施例，首先将如实施例4纯化的7×19pLent-GCC-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。
详细的步骤为：
(1)慢病毒包装及滴度检测
将慢病毒包装细胞系293T接种于含有DMEM+10％FBS 10cm培养皿中，37℃，5％CO2条件下培养，贴壁率为70％-80％后进行转染。将实施例1中的重组质粒(约10μg)和空载质粒(约10μg)分别与慢病毒包装质粒采用磷酸钙转染法共转染293T细胞，轻轻混匀，置于37℃、5％CO2培养箱中培养12h，加入含10％FBS的DMEM液体培养基8mL，继续培养至48小时。48h后在倒置荧光显微镜下观察到细胞内有绿色荧光蛋白表达。72h后，收集上清，除去细胞碎片，收获病毒后进行浓缩，获得浓缩过的GCC-CAR病毒液，-70℃低温冰箱中保存备用。根据Lenti-XTMGoStixTM试剂盒(北京华夏远洋科技有限公司产品)测定病毒滴度，结果表明，重组慢病毒的滴度3.12×106pfu/mL。
实施例3：慢病毒感染T细胞
(2)T细胞的制备
取50ml患者自体外周血，用TBD样本密度分离液(购自天津灏洋华科生物)，分离外周血单个核细胞。用含有1000IU/ml的重组干扰素α2a(购自沈阳三生制药)的培养基(购自CORNING公司，88-551-CM)诱导培养24小时后，加入1000IU/ml的重组白细胞介素2(购自沈阳三生制药)、50ng/ml的OKT-3和5％的患者自体血浆诱导继续培养24小时。每隔两天倍比加液，培养至第14天，流式细胞术检测T细胞中的CD3+、CD56+的阳性表达率(CD3-FITC，CD16/CD56-PE抗体购自BECKMAN公司，A07735)。CD3+阳性率>80％，CD3+CD56+双阳性率>20％，视为T细胞诱导成功，并留取该细胞待病毒感染。
(3)慢病毒感染T细胞及CAR-T细胞的扩增培养
T细胞经活化后，取出1×106个细胞，加入浓缩过的GCC-CAR病毒液，混匀，MOI＝6。分别在一周后对转染的T细胞进行相关检测。通过荧光显微镜检测嵌合抗原受体表达，由于GFP与CAR共表达，检测GFP的阳性细胞即为表达嵌合抗原受体的阳性细胞。
图3为流式细胞术检测的利用本发明构建的7×19GCC-CAR载体在T细胞表面上的表达情况。结果表明有28.9％的细胞是GFP(慢病毒载体本身表达GFP蛋白)阳性，说明利用本发明构建的7×19GCC-CAR能够在T细胞表面表达，且转染效率为28.9％。
实施例6
CFSE标记CAR-T细胞检测细胞增殖
用CFSE(购自Invitrogen，USA)标记7×19CAR-T细胞和CAR-T细胞(未加免疫因子IL7和CCL9的抗GCC CAR-T细胞)，置于5％CO2、37℃培养箱中培养。分别在第3、5/7天收集细胞，用流式缓冲液洗涤细胞2次，表面染色，4℃避光30min，再洗涤2次，重悬细胞，用流式细胞仪检测细胞的数量(图4)。
图4表明，培养至第7天，表达IL7和CCL19的CAR-T细胞，增殖能力是普通CAR-T细胞的两倍，因此，在CAR-T中加入IL7和CCL19可以促进T细胞增殖，进而增强CAR-T细胞的杀伤能力。
实施例7
抗GCC-CAR T细胞杀伤性效果评估
1、体外杀伤实验
将接种100μL本发明制备7×19CAR-T细胞、CAR-T细胞和空载慢病毒感染T细胞作为效应细胞进行杀伤活性测定，靶细胞为结肠癌细胞系T84。按照效应细胞与靶细胞数量比例为5:1加入96孔培养板中置于5％CO2、37℃培养箱培养24h后每孔加入20ml CCK-8，继续孵育2h后，酶标仪检测450nm波长，读取OD值，杀伤率＝[1-(实验组OD值-效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值]×100％。以空载慢病毒感染T细胞作为对照组。7×19CAR-T细胞对GCC表达阳性结肠癌细胞T84的杀伤效率高达95％，而CAR-T细胞杀伤率不足60％。因此，7×19CAR-T细胞特异性杀伤活性显著高于CAR-T细胞组和对照组，说明本发明制备的抗GCC 7×19CAR-T细胞具有高效杀伤GCC阳性细胞的能力。
2、体内杀伤实验
选取4个月大的雄性Wistar大鼠模型(购自广州中医药大学)于动物房饲养(室温23±2℃，湿度50％±10％)，将DMH用生理盐水配置成浓度为4mg/ml的溶液，用1mol/LNaHCO3溶液调节pH值为6.5，过滤除菌后备用。在无菌条件下，腹腔注射小鼠，每次剂量21mg/kg，每周一次，连续注射20周，获得结直肠癌小鼠。将上述结直肠癌小鼠，分为4组，A组为实施例3制备的7×19GCC-CART细胞治疗组；B组为实施例3制备GCC-CAR T细胞治疗组；C组为实施例3制备的未转染的T淋巴细胞治疗组；D组为生理盐水对照组。A组在7×19GCC-CART细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×106细胞，B组在GCC-CAR T细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×106细胞，C组在未转染的T淋巴细胞培养到第14天和第16天，尾静脉注射2×106细胞，D组与A组、B组和C组的治疗时间相同，尾静脉注射同体积的生理盐水。治疗后持续观察一个月，分别于7d、14d、21d和28d拉颈处死，取出结直肠癌小鼠模型肿瘤组织，计算鼠模型肿瘤大小。
图4鼠模型T淋巴细胞治疗完之后肿瘤大小变化图，空白对照D组和7×19GCC-CART细胞治疗组A组、GCC-CAR T细胞治疗组B组相比，治疗组A和B中肿瘤大小均缩少，但治疗A组比治疗B组的肿瘤缩少明显，A组肿瘤最终几乎全部消失。因此，本发明提高的7×19GCC-CAR T细胞对结直肠癌细胞具有强大的杀伤作用，其杀伤效果显著优于普通的CAR-T细胞。
因此，本发明提供的7×19GCC-CAR T细胞对肿瘤具有较强的杀伤能力。
实施例8
抗GCC核酸的应用，将其制备成试剂盒形式，用以治疗包括直肠癌、胃癌、食道癌在内的实体瘤，该试剂盒包括
(1)获得如上所述的稳定表达GCC-CAR的载体；
(2)载体稀释液；
(3)使用说明书，该说明书中包含如实施例7的方法。
应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。
Claims (10)
1.抗GCC的核酸，其特征在于：至少包含Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的抗GCC的核酸，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列选自CD8、CD27、CD28、4-1BB、CD134、ICOS分子的全部或部分DNA片段。
3.如权利要求2所述的抗GCC的核酸，其特征在于：其包括依序排列的
如SEQ ID NO.2所述的Leader核苷酸序列；
如SEQ ID NO.3所述的GCC单链抗体核酸人工序列；
如SEQ ID NO.4所述的CD8的铰链区核苷酸序列；
跨膜-刺激结构域核苷酸序列；
如SEQ ID NO.6所述的4-1BB胞内区核酸序列；
如SEQ ID NO.7所述的CD3ζ信号传导区核苷酸序列；
如SEQ ID NO.8所述的自裂解肽T2A核酸人工序列；
如SEQ ID NO.9所述的趋化因子IL7核苷酸序列；
如SEQ ID NO.10所述的趋化因子CCL19核苷酸序。
4.如权利要求3所述的抗GCC的核酸，其特征在于：所述跨膜-刺激结构域核苷酸序列采用如SEQ ID NO.5所述的CD8跨膜区核酸人工序列。
5.如权利要求4所述的抗GCC的核酸，其特征在于：所述抗GCC的核酸的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所述。
6.制备如权利要求1所述核酸的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1)分别按Leader核苷酸序列、GCC单链抗体核酸人工序列、CD8的铰链区核苷酸序列、跨膜-刺激结构域核苷酸序列、CD3ζ信号传导区核苷酸序列、自裂解肽T2A核苷酸序列、趋化因子IL7核苷酸序列及趋化因子CCL19核苷酸序列合成其整个表达框并插入标准载体pUC上，得到pUC-GCC-CAR；
(2)将pUC-GCC-CAR进行双酶切，利用琼胶电泳将GCC-CAR DNA片段琼胶部位切下，利用DNA extraction kit溶胶液处理、过DF柱弃滤液、漂洗DF柱、空离、洗脱DF柱、收集离心物，得到纯化的GCC-CAR DNA片段。
7.免疫细胞，其特征在于：包含具有如上所述核酸的质粒。
8.如权利要求7所述的免疫细胞，其特征在于：所述免疫细胞选自自体的或转基因的T细胞、NK细胞、细胞毒性T淋巴细胞或调节T细胞、记忆性T细胞、双特异性T细胞、CIK细胞。
9.如权利要求8所述的免疫细胞，其特征在于：所述质粒是将融合基因片段GCC-CARDNA插入慢病毒表达载体pLent-C-GFP得到的pLent-GCC-CAR质粒；再将上述的pLent-GCC-CAR质粒进行慢病毒包装，然后利用重组慢病毒感染免疫细胞。
10.抗GCC核酸在制备治疗实体瘤药物中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810671873.3A CN108949789A (zh) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810671873.3A CN108949789A (zh) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN108949789A true CN108949789A (zh) | 2018-12-07 |
Family
ID=64486891
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810671873.3A Withdrawn CN108949789A (zh) | 2018-06-26 | 2018-06-26 | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN108949789A (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110117329A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-13 | 河北浓孚雨生物科技有限公司 | 包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途 |
| CN110922490A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 浙江启新生物技术有限公司 | 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用 |
| CN112795584A (zh) * | 2020-08-20 | 2021-05-14 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 |
| WO2022123316A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Compositions of guanylyl cyclase c (gcc) antigen binding agents and methods of use thereof |
| WO2024067762A1 (en) * | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Antibody and chimeric antigen receptors targeting gcc and methods of use thereof |
| EP4239060A4 (en) * | 2020-10-28 | 2024-10-30 | TSD Life Sciences Co., Ltd. | TRANSFORMED IMMUNE CELLS TO INDUCE CHEMOTAXIS AGAINST HETEROGENEOUS IMMUNE CELLS |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108064235A (zh) * | 2015-01-12 | 2018-05-22 | 阿菲博迪公司 | Il-17a结合多肽 |
-
2018
- 2018-06-26 CN CN201810671873.3A patent/CN108949789A/zh not_active Withdrawn
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108064235A (zh) * | 2015-01-12 | 2018-05-22 | 阿菲博迪公司 | Il-17a结合多肽 |
Cited By (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110117329A (zh) * | 2019-04-03 | 2019-08-13 | 河北浓孚雨生物科技有限公司 | 包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途 |
| CN110117329B (zh) * | 2019-04-03 | 2020-12-08 | 河北浓孚雨生物科技有限公司 | 包含趋化因子与结合伴侣的融合多肽及其用途 |
| CN110922490A (zh) * | 2019-12-05 | 2020-03-27 | 浙江启新生物技术有限公司 | 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用 |
| CN110922490B (zh) * | 2019-12-05 | 2023-03-03 | 浙江启新生物技术有限公司 | 分泌白介素7和趋化因子21的car表达载体及应用 |
| CN112795584A (zh) * | 2020-08-20 | 2021-05-14 | 山东兴瑞生物科技有限公司 | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 |
| EP4239060A4 (en) * | 2020-10-28 | 2024-10-30 | TSD Life Sciences Co., Ltd. | TRANSFORMED IMMUNE CELLS TO INDUCE CHEMOTAXIS AGAINST HETEROGENEOUS IMMUNE CELLS |
| WO2022123316A1 (en) * | 2020-12-09 | 2022-06-16 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Compositions of guanylyl cyclase c (gcc) antigen binding agents and methods of use thereof |
| WO2024067762A1 (en) * | 2022-09-28 | 2024-04-04 | Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. | Antibody and chimeric antigen receptors targeting gcc and methods of use thereof |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN108949789A (zh) | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 | |
| CN106279434B (zh) | 工程化cd20靶向性的nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN105087495B (zh) | 双嵌合抗原受体修饰的t淋巴细胞及其制备方法 | |
| US20180369285A1 (en) | Specific Chimeric Antigen Receptor T Cells Targeting To NKG2DL, Its Preparation Method and Application Thereof | |
| CN107557336B (zh) | 一种抗muc16安全型嵌合抗原受体修饰的免疫细胞及其应用 | |
| CN105924527B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car30-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN110684121B (zh) | 一种靶向her2联合表达pd1-mica融合蛋白的嵌合抗原受体及其表达载体和应用 | |
| CN110684790A (zh) | 抗b7-h3嵌合抗原受体的编码基因、制备方法、具有该基因的质粒、免疫细胞及其应用 | |
| WO2019062518A1 (zh) | 一种新型可调控的双嵌合抗原受体，t细胞及其构建方法和应用 | |
| WO2024113649A1 (zh) | 提高nk细胞存活和抗肿瘤活性的方法及其应用 | |
| CN105924530B (zh) | 嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、car20-nkt细胞及其制备方法和应用 | |
| CN117024598A (zh) | 长效的Meso-B7H3双靶点嵌合抗原受体及其应用 | |
| CN116064620A (zh) | 一种增强向肿瘤部位浸润能力的car-nk细胞制备及应用 | |
| CN101063142B (zh) | 人乳头瘤病毒16型dna疫苗和基因佐剂及其应用 | |
| CN109265561B (zh) | 抗EGFRvⅢ安全型嵌合抗原受体、其制备方法、利用其修饰的NK细胞及应用 | |
| WO2020019983A1 (zh) | 一种用于治疗肿瘤的基因工程细胞 | |
| CN110305906A (zh) | 一种靶向pdl1的car嵌合受体的慢病毒载体及pdl1-car-t细胞 | |
| CN110423767A (zh) | 表达可溶性pd-1的嵌合抗原受体car基因及应用 | |
| CN112795584B (zh) | 抗gcc的核酸、其制备方法、具有该核酸的免疫细胞及其应用 | |
| CN107164412B (zh) | 一种安全型抗cea嵌合抗原受体修饰t细胞的制备方法及其应用 | |
| CN116814664B (zh) | 一种扩展肿瘤识别表位的cea嵌合抗原受体t细胞的制备与应用 | |
| CN111499766A (zh) | 针对慢性淋巴细胞白血病的免疫效应细胞、其制备方法和应用 | |
| CN115960256A (zh) | 一种长效的嵌合抗原受体、载体及其构建方法和应用 | |
| CN105920592B (zh) | Carher1-nkt细胞在制备用于治疗进展期her1阳性肺癌的制剂中的应用 | |
| CN114958770A (zh) | 嵌合抗原受体nk细胞及其制备方法和细胞药物及其应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |
Application publication date: 20181207 |
|
| WW01 | Invention patent application withdrawn after publication |