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KR20220012292A - 세포 배양 배지를 모니터링하는 방법 - Google Patents

세포 배양 배지를 모니터링하는 방법 Download PDF

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Publication number
KR20220012292A
KR20220012292A KR1020217041640A KR20217041640A KR20220012292A KR 20220012292 A KR20220012292 A KR 20220012292A KR 1020217041640 A KR1020217041640 A KR 1020217041640A KR 20217041640 A KR20217041640 A KR 20217041640A KR 20220012292 A KR20220012292 A KR 20220012292A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
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cell culture
culture medium
days
hours
Prior art date
Application number
KR1020217041640A
Other languages
English (en)
Inventor
페가 아바디안
카트린 아론
Original Assignee
브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 filed Critical 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니
Publication of KR20220012292A publication Critical patent/KR20220012292A/ko

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Abstract

본 개시내용은 세포 배양 배지 제조 오류, 분해, 또는 세포 배양 용도에서 준최적이게 만들 수 있는 배지에서의 다른 변화를 검출하기 위해 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 샘플을 핑거프린팅하고 분석하는 방법을 제공한다.

Description

세포 배양 배지를 모니터링하는 방법
관련 출원의 상호 참고
본 출원은 2019년 5월 23일에 출원된 미국 가출원 번호 62/852,230을 우선권으로 주장하며, 그의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
상류 생물가공에 이용되는 준최적 배지는 노동력 손실 및 생산 지연 측면에서 수십만 달러의 비용이 들 수 있다. 배지는 부정확하게 제조된 경우, 즉, 특정한 성분이 실수로 제외되거나 잘못된 양으로 첨가된 경우, 또는 그의 최적 만료가 지난 후에 이용된 경우에 준최적으로 간주된다. 배지 품질은 전형적으로 시간 및 자원-집약적인 매일 샘플링 및 공급으로 14 일 생산 생물반응기 공정에서 HPLC 기능 테스팅에 의해, 예컨대 아미노산 분석에 의해 평가되는 중요한 성능 파라미터이다. 준최적 배지의 사용은 역가를 감소시킬 수 있고/거나 산물 속성을 변경시킬 수 있다. 그러나, 중요한 성분의 물리적 존재를 보장하고, 중요한 분해 마커의 측정을 통해 만료를 모니터링하기 위해, 배지 조성을 적절히 측정할 수 있는 분석 방법을 갖는 것이 중요하다. 따라서, 배양 배지의 조건을 측정할 수 있는 비용 효율적이고 정확한 방법을 개발할 필요가 있다.
본 개시내용은 임의의 환경에서 성장하는 세포에 대한 그의 효과에 영향을 미칠 수 있는 세포 배양 배지에서의 변화를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 세포 배양 배지의 성분의 공지된 스펙트럼과 비교하기 위해 세포 배양 배지 샘플의 라만(Raman) 스펙트럼을 측정하는 것에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 배지를 핑거프린팅하고/거나 세포 배양 배지에 대한 최적 보관 조건을 확인하는 방법으로서, 하나 이상의 성분의 혼합물을 함유하는 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 하나 이상의 성분 각각과 연관된 하나 이상의 기준 스펙트럼 또는 기준 배지 조성물과 연관된 하나 이상의 기준 스펙트럼과 비교하는 것인 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은 또한 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 배지에서의 특정한 성분의 변화율을 확인하고/거나 세포 배양 배지의 변화를 실시간으로 모니터링하는 방법으로서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것 ("수집된 스펙트럼")을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 하나 이상의 성분 각각과 연관된 기준 스펙트럼과 비교하는 것인 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 기준 스펙트럼에는 분해가 없다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것은 적어도 약 1 시간마다, 적어도 약 2 시간마다, 적어도 약 3 시간마다, 적어도 약 4 시간마다, 적어도 약 5 시간마다, 적어도 6 시간마다, 적어도 7 시간마다, 적어도 약 8 시간마다, 적어도 약 9 시간마다, 적어도 약 10 시간마다, 적어도 약 11 시간마다, 적어도 약 12 시간마다, 적어도 약 13 시간마다, 적어도 약 14 시간마다, 적어도 약 15 시간마다, 적어도 약 16 시간마다, 적어도 약 17 시간마다, 적어도 약 18 시간마다, 적어도 약 19 시간마다, 적어도 약 20 시간마다, 적어도 약 21 시간마다, 적어도 약 22 시간마다, 적어도 약 23 시간마다, 또는 적어도 약 24 시간마다 수행된다.
일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 적어도 5개 데이터 포인트, 적어도 10개 데이터 포인트, 적어도 15개 데이터 포인트, 적어도 16개 데이터 포인트, 적어도 17개 데이터 포인트, 적어도 18개 데이터 포인트, 적어도 19개 데이터 포인트, 적어도 20개 데이터 포인트, 적어도 21개 데이터 포인트, 적어도 22개 데이터 포인트, 적어도 23개 데이터 포인트, 적어도 24개 데이터 포인트, 적어도 25개 데이터 포인트, 적어도 26개 데이터 포인트, 적어도 27개 데이터 포인트, 적어도 28개 데이터 포인트, 적어도 29개 데이터 포인트, 적어도 30개 데이터 포인트, 적어도 31개 데이터 포인트, 적어도 32개 데이터 포인트, 적어도 33개 데이터 포인트, 적어도 34개 데이터 포인트, 적어도 35개 데이터 포인트, 적어도 36개 데이터 포인트, 적어도 37개 데이터 포인트, 적어도 38개 데이터 포인트, 적어도 39개 데이터 포인트, 적어도 40개 데이터 포인트, 적어도 41개 데이터 포인트, 적어도 42개 데이터 포인트, 적어도 43개 데이터 포인트, 적어도 44개 데이터 포인트, 적어도 45개 데이터 포인트, 적어도 46개 데이터 포인트, 적어도 47개 데이터 포인트, 적어도 48개 데이터 포인트, 적어도 49개 데이터 포인트, 또는 적어도 50개 데이터 포인트의 평균을 갖는다. 일부 측면에서, 각각의 데이터 포인트는 10 초마다, 15 초마다, 20 초마다, 25 초마다, 30 초마다, 35 초마다, 40 초마다, 45 초마다, 50 초마다, 55 초마다, 또는 60 초마다 측정된다.
본 개시내용의 방법은 또한 샘플로부터 수집된 미가공 라만 스펙트럼의 분석을 수반한다. 일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 다변량 분석에 의해 분석된다. 일부 측면에서, 다변량 분석은 주성분 분석 (PCA)이다. 일부 측면에서, PCA는 라만 스펙트럼에 대한 PC 점수를 생성한다. 일부 측면에서, 다변량 분석은 부분 최소 제곱 분석 (PLS)이며, 여기서 분석은 보정 예측 모델을 생성한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 세포 배양 배지의 수집된 스펙트럼을 비교하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 비교하는 것은 수집된 스펙트럼의 PC 점수를 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 비교하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 적어도 약 10만큼, 적어도 약 11만큼, 적어도 약 12만큼, 적어도 약 13만큼, 적어도 약 14만큼, 적어도 약 15만큼, 적어도 약 16만큼, 적어도 약 17만큼, 적어도 약 18만큼, 적어도 약 19만큼, 적어도 약 20만큼, 적어도 약 21만큼, 적어도 약 22만큼, 적어도 약 23만큼, 적어도 약 24만큼, 적어도 약 25만큼, 적어도 약 26만큼, 적어도 약 27만큼, 적어도 약 28만큼, 적어도 약 29만큼, 또는 적어도 약 30만큼 상이할 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수보다 높을 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수보다 낮을 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 분해되고, 상기 분해된 세포 배양 배지는 비-분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 생존력을 약 1%만큼, 약 2%만큼, 약 3%만큼, 약 4%만큼, 약 5%만큼, 약 6%만큼, 약 7%만큼, 약 8%만큼, 약 9%만큼, 또는 약 10%만큼 감소시킨다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 분해되고, 상기 분해된 세포 배양 배지는 비-분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 생존 세포 밀도를 약 1 x 106세포/mL만큼, 약 2 x 106세포/mL만큼, 약 3 x 106세포/mL만큼, 약 4 x 106세포/mL만큼, 약 5 x 106세포/mL만큼, 약 6 x 106세포/mL만큼, 약 7 x 106세포/mL만큼, 약 8 x 106세포/mL만큼, 약 9 x 106세포/mL만큼, 약 10 x 106세포/mL만큼, 약 11 x 106세포/mL만큼, 또는 약 12 x 106세포/mL만큼 감소시킨다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 분해되고, 상기 분해된 세포 배양 배지는 비-분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 항체 생산 역가를 약 0.1 g/L만큼, 약 0.2 g/L만큼, 약 0.3 g/L만큼, 약 0.4 g/L만큼, 약 0.5 g/L만큼, 약 0.6 g/L만큼, 약 0.7 g/L만큼, 약 0.8 g/L만큼, 약 0.9 g/L만큼, 약 1.0 g/L만큼, 약 1.1 g/L만큼, 약 1.2 g/L만큼, 약 1.3 g/L만큼, 약 1.4 g/L만큼, 약 1.5 g/L만큼, 약 1.6 g/L만큼, 약 1.7 g/L만큼, 약 1.8 g/L만큼, 약 1.9 g/L만큼, 약 2.0 g/L만큼, 약 2.1 g/L만큼, 약 2.2 g/L만큼, 약 2.3 g/L만큼, 약 2.4 g/L만큼, 약 2.5 g/L만큼, 약 2.6 g/L만큼, 약 2.7 g/L만큼, 약 2.8 g/L만큼, 약 2.9 g/L만큼, 또는 약 3.0 g/L만큼 감소시킨다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지에 마커가 첨가된다. 일부 측면에서, 마커는 리신 (Lys), 히스티딘 (His), 아스파라긴 (Asn) 및 아르기닌 (Arg)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 마커는 티로신이다. 일부 측면에서, 마커는 글루코스가 아니다. 일부 측면에서, 마커는 락테이트가 아니다. 일부 측면에서, 마커는 시아노코발라민 (B12), 엽산 (B9), 니아신아미드 (B3), 피리독살 HCl (B6(AL)), 및 피리독신 HCl (B6(INE))로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 약 500 cm-1 내지 약 1700 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 1800 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 1900 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2000 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2100 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2200 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2300 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2400 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2500 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2600 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2700 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2800 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2900 cm-1, 또는 약 500 cm-1 내지 약 3000 cm-1의 범위에서 측정된다. 일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 500 cm-1 내지 3000 cm-1의 범위에서 측정된다.
일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 동일하거나 또는 약 10 이하만큼, 약 9 이하만큼, 약 8 이하만큼, 약 7 이하만큼, 약 6 이하만큼, 약 5 이하만큼, 약 4 이하만큼, 약 3 이하만큼, 약 2 이하만큼, 또는 약 1 이하만큼 유사할 때 세포 배양 배지가 안정한 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 약 8 일 동안, 약 9 일 동안, 약 10 일 동안, 약 11 일 동안, 약 12 일 동안, 약 15 일 동안, 약 16 일 동안, 약 17 일 동안, 약 18 일 동안, 약 19 일 동안, 약 20 일 동안, 약 21 일 동안, 약 22 일 동안, 약 23 일 동안, 약 24 일 동안, 약 25 일 동안, 약 26 일 동안, 약 27 일 동안, 약 28 일 동안, 약 29 일 동안, 약 30 일 동안, 약 1 개월 동안, 약 1.5 개월 동안, 약 40 일 동안, 약 50 일 동안, 약 60 일 동안, 약 2 개월 동안, 약 70 일 동안, 약 80 일 동안, 약 90 일 동안, 약 3 개월 동안, 약 100 일 동안, 약 110 일 동안, 약 120 일 동안, 약 4 개월 동안, 약 5 개월 동안, 또는 약 6 개월 동안의 보관을 위해 결정된다.
본 개시내용은 또한 세포 배양 배지를 분석할 수 있는 장치를 이용하여 라만 스펙트럼의 측정을 수행하는 장치에 관한 것이다. 일부 측면에서, 장치는 세포 배양 배지 중에 하나 이상의 성분의 혼합물을 포함하고, 장치는 세포 배양 배지 샘플을 보유하기 위한 세포 배양 배지 샘플 홀더; 세포 배양 배지 샘플 홀더에 의해 보유된 세포 배양 배지 샘플을 조명하기 위한 레이저 공급원; 세포 배양 배지 샘플 홀더에 의해 보유된 세포 배양 배지 샘플에서 세포 배양 배지 중 하나 이상의 성분의 움직임을 검출하도록 위치된 입자 움직임 검출기; 및 레이저 공급원에 의한 조명으로부터 생성된 세포 배양 배지 샘플로부터의 스펙트럼을 수신하도록 위치된 스펙트럼 검출기를 포함한다.
도 1은 적외선 (IR) 흡수, 레일리(Rayleigh) 산란 및 라만 산란 (스토크스 및 안티-스토크스)의 과정에 상응하는 진동 에너지 준위들 사이의 전이 에너지 다이어그램을 제시한다. E0 및 E1 (E0+h νm)은 전자 기저 및 여기 상태이다. ν0 및 νm은 진동 기저 및 여기 상태이다.
도 2A, 2B, 및 2C. 도 2A는 연동 펌프를 사용하여 공급 배지 백에 연결되고 라만을 통해 흐르는 T-커넥터의 개략도를 제시하고, 도 2B는 T-커넥터 구성 및 부착 튜빙의 사진을 제시한다. 도 2C는 오프라인 측정을 위해 사용되는 유리 바이알 및 호박색 비커를 제시한다. 광 간섭을 제거하기 위해 유리 바이알은 알루미늄 호일로 덮여 있고, 호박색 비커는 검은색 폴리프로필렌으로 덮여 있었다. T-커넥터는 12mm OD 프로브를 위한 3/4 인치 위생 플랜지 입구/출구를 갖춘 316L 스테인리스 스틸 파일럿 규모 유동 셀이다.
도 3은 실시간 공급 배지 분석의 측정 횟수에 대한 PC1 점수 플롯을 제시한다. 측정은 라만 분광법을 이용하여 3 시간마다 수행되었다. 예를 들어, X 축 상에서, 5의 측정값은 초기 모니터링으로부터 15 시간 후의 측정을 나타낸다. 화살표는 라만 스펙트럼이 초기 모니터링 이후 대략 90 시간째에 변화하기 시작한 측정값을 나타낸다.
도 4A 및 4B. 도 4A는 배지에서의 주요 변화가 발생한 파수를 나타내는 실시간 공급 배지 분석의 라만 이동에 대한 PC1 로딩을 제시한다. 도 4B는 티로신 결정의 라만 스펙트럼을 제시한다. (Freire, P., et al., Raman Spectroscopy of Amino Acid Crystals. Raman Spectroscopy and Applications, 2017).
도 5는 B9 기초 배지에 첨가된 상이한 포스페이트 수준의 PC1 점수 플롯을 제시한다. 첫번째 포인트는 1.5g/L의 포스페이트 수준을 제시하고, 마지막 포인트는 3g/L 포스페이트를 갖는 샘플을 나타낸다.
도 6은 공급/기초 배지 강제 분해의 PC1-PC2 평면 점수 플롯을 제시한다.
도 7은 열 (H) 또는 광 (L) 강제 분해 뿐만 아니라 4℃에서 정상적인 노화로 인해 라만 테스팅에 의해 기초 배지에서 검출된 변화를 나타내는 PC2 점수 플롯을 제시한다. 보관 시간은 주 (예를 들어, 1W) 또는 개월 (3M)로 표시된다. 3M 시점은 규모로 표시되지 않음을 주의한다.
도 8A, 8B 및 8C는 상이하게 노화된 기초 및 신선한 공급이 이용될 때 생산 VCD (도 8A), 생존력 (도 8B), 및 항체 역가 (도 8C)를 제시한다.
도 9는 광 (L) 및 열 (H) 분해로 인한 기초 배지의 아미노산 수준에서의 변화를 제시한다. 파선은 광 분해로 인한 변화 경향을 제시하고, 실선은 열 분해로 인한 변화를 나타낸다.
도 10은 시간 경과에 따라 (주의 경우 W 또는 개월의 경우 M) 광 (L) 및 열 (H) 분해로 인한 공급 배지의 PC1 점수 플롯를 제시한다.
도 11A 내지 11C는 상이하게 노화된 공급 배지 및 신선한 기초가 생산 결과에 영향을 미칠 수 있음을 제시한다. 도 11A는 생존 세포 밀도 (VCD)를 제시한다. 도 11B는 생존력을 제시한다. 도 11C는 항체 역가 (C) 결과를 제시한다.
도 12A는 아르기닌의 예측 모델에 대한 보정 곡선을 제시한다. 도 12B는 모델을 구축하는데 이용된 스파이크 실험의 첫번째 잠재적인 변형을 제시한다. 도 12C는 물 중 아르기닌 용액의 라만 스펙트럼을 제시한다. 파선은 LV1 플롯에서의 주요 변동이 아르기닌의 라만 이동과 관련있음을 확인시켜 준다.
도 13A-13H는 4가지 아미노산 및 4가지 비타민의 농도에 대한 예측 모델을 제시한다. 피팅 라인은 원으로 제시된 각각의 화학물질에 대해 공지된 농도를 이용하여 구축된 보정 곡선의 피팅 라인이다. 다이아몬드는 미지 수준의 Arg (도 13A), Asn (도 13B), His (도 13C), Lys (도 13D), B6(AL) (도 13E), B6(INE) (도 13F), B9 (도 13G), 또는 B12 (도 13H)의 예측된 수준을 제시한다. 1:1 라인은 측정치와 예측치 사이의 1:1 비를 제시하고, 측정치는 최종 스파이크 농도이다. 예측 모델이 더 강할수록 피팅 및 1:1 라인 오버레이가 더 양호하다.
도 14A-14H는 각각의 화학물질에 대한 각각의 농도 수준에서 % 회수를 제시한다. 원은 보정 곡선을 구축하기 위해 사용된 포인트를 나타내고, 다이아몬드는 Arg (도 14A), Asn (도 14B), Lys (도 14C), His (도 14D), B6(AL) (도 14E), B6(INE) (도 14F), B9 (도 14G), B12 (도 14H)와 관련하여 보정 곡선을 이용하여 예측된 농도이다.
도 15A는 아미노산 아르기닌, 아스파라긴, 히스티딘 및 리신에 대한 기준 스펙트럼을 제시한다. 도 15B 및 15C는 비타민 시아노코발라민 (B12), 엽산 (B9), 니아신아미드 (B3), 피리독살 HCl (B6(AL)), 및 피리독신 HCl (B6(INE))에 대한 기준 스펙트럼을 제시한다.
본 개시내용은 배지 조성에서의 실시간 변화를 모니터링하고, 배지 제조에서의 특정한 오류를 확인하고, 배지 안정성을 모니터링할 수 있는 방법에 관한 것이다. 이 목적을 위해 무표지 핑거프린팅 기술의 한 예인 라만 분광법이 이용될 수 있다. 본 개시내용은 또한 라만 기반 모델이 배지에서 아미노산 및 비타민 성분을 정량적으로 모델링하기 위해 구축될 수 있음을 제시한다. 본 개시내용은 라만 기술이 기능적 테스팅을 대체하고 손실된 배치로 인한 위험을 최소화하기 위해 분석 테스팅으로서 이용될 수 있음을 제시한다.
라만은 일반적으로 레이저 공급원으로부터 단색광의 비탄성 산란을 기반으로 하는 분광 기술이며, 광의 광자의 주파수가 화학적 결합과의 상호작용 시에 이동한다. "라만 이동"이라 불리는 이러한 이동은 해당 결합의 회전, 진동 및 다른 저주파 전이에 대한 유용한 정보를 제공한다. 모든 분자가 그의 구조를 구성하는 고유의 화학 결합 세트를 갖기 때문에, 라만은 각각의 분자에 대해 고유한 시그니처 패턴을 형성하는 "핑거프린팅 기술"로서 이용될 수 있다. 도 1은 라만 산란의 원리를 제시하고, 이를 2가지 대안적인 분광 기술 (IR 및 레일리)과 비교한다.
라만의 일부 이점에는 샘플 표지 또는 샘플 제조의 필요없이 분자를 풋프린트하는 그의 능력이 포함된다. 이는 실시간으로 측정하는 수단을 제공하고, 이는 공정 분석 기술 (PAT) 적용을 위해 유용한 기술이 되게 한다.
I. 용어
본원에서 사용된 용어 "및/또는"은 명시된 2가지 특징 또는 성분 각각이 다른 것과 함께 또는 없이 구체적으로 개시된 것으로 고려되어야 한다. 따라서, 본원에서 "A 및/또는 B"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독), 및 "B" (단독)을 포함하는 것으로 의도된다. 마찬가지로, "A, B 및/또는 C"와 같은 문구에서 사용된 용어 "및/또는"은 하기 각각의 측면을 포함하는 것으로 의도된다: A, B, 및 C; A, B, 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독).
본원에서 측면이 용어 "포함하는"으로 기재된 곳이면 어디에서나, 용어 "이루어진" 및/또는 "본질적으로 이루어진"과 관련하여 기재된 다른 유사한 측면 또한 제공되는 것으로 이해된다.
달리 정의되지 않는다면, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 개시내용과 관련된 기술분야의 통상의 기술자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, "the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press"; 및 "the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press"는 본 개시내용에서 사용된 여러 용어의 일반 사전을 기술자에게 제공한다.
단위, 접두사 및 기호는 그들의 국제 단위 체계 (SI: Systeme International de Unites) 승인된 형태로 표시된다. 수치 범위는 상기 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 본원에 제공된 표제는 명세서를 전체적으로 참고하여 가질 수 있는 본 개시내용의 다양한 측면을 제한하는 것이 아니다. 따라서, 바로 아래에 정의된 용어들은 그의 전체가 명세서를 참고하여 더욱 완전하게 정의된다.
대안 (예를 들어, "또는")의 사용은 대안 중 하나, 둘 다, 또는 임의의 조합을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 본원에 사용된 바와 같이, 단수 형태는 인용되거나 나열된 임의의 성분 중 "하나 이상"을 지칭하는 것으로 이해되어야 한다.
용어 "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 측정 시 특정한 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 값 또는 조성을 지칭하며, 이는 부분적으로 값 또는 조성이 어떻게 측정 또는 결정되었는지, 즉, 측정 시스템의 한계에 따라 좌우될 것이다. 예를 들어, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 관련 기술분야의 실무에 따라 1 이내 또는 1 초과의 표준 편차를 의미할 수 있다. 대안적으로, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"은 10% 이하의 범위를 의미할 수 있다. 추가로, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 소정 값의 10배 이하 또는 5배 이하를 의미할 수 있다. 특정한 값 또는 조성이 출원 및 청구항에 제공되는 경우, 달리 명시되지 않는다면, "약" 또는 "본질적으로 포함하는"의 의미는 해당 특정한 값 또는 조성에 대해 허용가능한 오차 범위 내에 있는 것으로 가정되어야 한다.
본원에 기재된 바와 같이, 임의의 농도 범위, 백분율 범위, 비율 범위 또는 정수 범위는 달리 나타내지 않는다면 인용된 범위 내의 임의의 정수 값, 및 적절한 경우 그의 분수 (예컨대 정수의 1/10 및 1/100)를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
본원에서 상호교환적으로 사용된 바와 같이, 용어 "정제하는", "분리하는" 또는 "단리하는"은 관심 단백질 및 하나 이상의 불순물을 포함하는 조성물 또는 샘플로부터 관심 단백질의 순도를 증가시키는 것을 지칭한다. 전형적으로, 관심 단백질의 순도는 조성물로부터 적어도 하나의 불순물을 (완전히 또는 부분적으로) 제거함으로써 증가된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "완충제"는 용액 중에서 그의 존재에 의해 pH 단위 변화를 초래하기 위해 첨가되어야 하는 산 또는 알칼리의 양을 증가시키는 물질을 지칭한다. 완충된 용액은 그의 산-염기 접합체 성분의 작용에 의해 pH 변화에 저항한다. 생물학적 시약과 함께 사용하기 위한 완충된 용액은 일반적으로 용액의 pH가 생리학적 범위 내에 있도록 일정한 농도의 수소 이온을 유지할 수 있다. 전형적인 완충제 성분에는 유기 및 무기 염, 산 및 염기가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "라만 산란"은 시스템에서 진동, 회전, 및 다른 저주파 모드를 관찰하는데 이용되는 분광 기술을 지칭한다. 이는 일반적으로 가시광, 근적외선 또는 근자외선 범위의 레이저로부터 단색광의 비탄성 산란 또는 라만 산란에 의존한다. 레이저 광은 시스템에서 분자 진동, 포논 또는 다른 여기와 상호작용하여 레이저 광자의 에너지를 위 또는 아래로 이동시킨다. 에너지 이동은 시스템에서 진동 모드에 대한 정보를 제공한다. 광도 의존성에서 선형 및 비선형 둘 다인 다양한 광학 공정은 근본적으로 라만 산란과 관련이 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "라만 산란"에는 "자극된 라만 산란" (SRS), "자발적 라만 산란", "간섭성 안티-스토크스 라만 산란" (CARS), "표면-강화된 라만 산란" (SERS), "Tip-강화된 라만 산란" (TERS) 또는 "진동 광음향 단층촬영"이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "분해" 및/또는 "분해된"은 의도한 대로 효과적으로 사용되는 조성물의 능력에서의 감소를 지칭한다. 예를 들어, 세포 배양 배지는 열, 광, 습도, 또는 배지 성분의 원치않는 효과를 유발할 수 있는 다른 환경적 조건에 노출 시에 분해될 수 있다. 세포 배양물의 다양한 성분의 시간 경과에 따른 농도에서의 변화 또한 분해된 세포 배양 배지를 초래할 수 있다. 배지 제조에서의 오류 또한 본 개시내용의 기술을 이용하여 분해된 세포 배양 배지로서 검출될 수 있다. 모든 예에서, 분해된 세포 배양 배지는 비-분해된 배지와 비교하여 세포 배양물의 생존력 및/또는 성장을 유지하는데 효과적이지 않을 수 있다. 분해된 세포 배양물은 상류 제조 동안에 상류 세포 성장 및/또는 단백질 발현 속도, 세포 카운트 및/또는 세포 밀도, 또는 총 세포 생존력에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 이는 비-분해된 배지와 비교하여 상류 생물제조에서 덜 효과적일 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배양물", "세포 배양물" 및 "진핵생물 세포 배양물"은 세포 집단의 생존 및/또는 성장에 적합한 조건하에 배지 (하기 "배지"의 정의 참고)에서 유지되거나 또는 성장하는, 표면-부착된 또는 현탁액 중의 세포 집단을 지칭한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 본원에 사용된 이들 용어는 세포 집단 및 상기 집단이 현탁된 배지를 포함하는 조합물을 지칭할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배지들", "배지", "세포 배양 배지", "배양 배지", "조직 배양 배지", "조직 배양 배지들", 및 "성장 배지"는 성장하는 배양된 숙주 세포에 영양을 공급하기 위해 사용될 수 있는 영양분을 함유하는 용액을 지칭한다. 전형적으로, 이들 용액은 최소 성장 및/또는 생존을 위해 세포에 필요한 필수 및 비필수 아미노산, 비타민, 에너지원, 지질, 및 미량 원소를 제공한다. 용액은 호르몬 및 성장 인자를 비롯하여 성장 및/또는 생존을 최소 속도보다 높게 증강시키는 성분을 또한 함유할 수 있다. 용액은 세포 생존 및 증식에 최적인 pH 및 염 농도로 제형화된다. 배지는 또한 "한정된 배지" 또는 "화학적으로 한정된 배지" (단백질, 가수분해물 또는 미지의 조성을 갖는 성분을 함유하지 않는 혈청-무함유 배지)일 수 있다. 한정된 배지는 동물-유래된 성분을 함유하지 않고, 모든 성분은 공지된 화학적 구조를 갖는다. 관련 기술분야의 기술자는 한정된 배지가 재조합 당단백질 또는 단백질, 예를 들어 비제한적으로 호르몬, 시토카인, 인터류킨 및 다른 신호전달 분자를 포함할 수 있음을 이해한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "세포 생존력"은 배양물 중에서 세포가 주어진 세트의 배양 조건 또는 실험 변형하에 생존하는 능력을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 상기 용어는 또한 특정한 시간에 배양물 중에서 살아있는 및 죽은 세포의 총 개수에 비해 해당 시간에 살아있는 세포의 부분을 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "상류 공정", "상류 세포 배양 공정" 또는 "상류 제조 공정"은 일반적으로 용기, 예컨대 생물반응기에서 미생물 또는 세포, 예를 들어 박테리아 또는 포유동물 세포가 성장하는 제조 공정에서 첫번째 단계 또는 단계들을 지칭한다. 상류 공정은 접종물 발달, 배지 발달, 단백질 발현, 유전자 조작 공정에 의한 접종물 개선, 및 성장 동역학의 최적화와 관련된 모든 단계를 수반한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "배치 배양" 또는 "배치 반응기 공정"은 배지 (하기 "배지"의 정의 참고)를 비롯하여 세포를 배양하는데 궁극적으로 사용되는 모든 성분 뿐만 아니라, 세포 자체가 배양 공정을 시작할 때 제공되는 것인 세포 배양 방법을 지칭한다. 배치 배양은 전형적으로 일부 시점에 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 성분이 수확되고, 임의적으로 정제된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "유가식 배양물" 또는 "유가식 반응기 공정"은 배양 공정을 시작한 이후 일부 시점에서 추가적인 성분이 배양물에 제공되는 것인 세포 배양 방법을 지칭한다. 유가식 배양은 기초 배지를 사용하여 시작될 수 있다. 배양 공정을 시작한 이후 일부 시점에서 추가적인 성분이 배양물에 제공되는 배양 배지는 공급 배지이다. 유가식 배양은 전형적으로 일부 시점에서 중단되고, 배지 중의 세포 및/또는 성분이 수확되고, 임의적으로 정제된다.
본원에 사용된 바와 같이, "관류" 또는 "관류 배양" 또는 "관류 반응기 공정"은 세포 집단을 통해 또는 그에 걸쳐 정상 속도로 생리학적 영양분 용액의 연속적인 흐름을 지칭한다. 관류 시스템이 일반적으로 배양 유닛 내에 세포의 보유를 수반하기 때문에, 관류 배양은 특징적으로 비교적 높은 세포 밀도를 갖지만, 배양 조건을 유지 및 제어하기가 어렵다. 또한, 세포가 성장한 다음, 배양 유닛에서 높은 밀도로 보유되기 때문에, 전형적으로 시간 경과에 따라 성장 속도가 지속적으로 감소하여, 세포 성장의 후기 지수 또는 심지어 정지 단계가 초래된다. 이러한 연속 배양 전략은 일반적으로 연속 세포 배양 시스템에서 생산 단계 동안에 관심 폴리펩티드 및/또는 바이러스를 발현하는 포유동물 세포, 예를 들어 부착 비의존성 세포를 배양하는 것을 포함한다. "부착 비의존성 세포"는 전파 동안에 고체 기질에 부착되거나 또는 고정되는 것과는 대조적으로 벌크 배양물에 걸쳐 현탁액에서 자유롭게 전파하는 세포를 의미한다. 연속 세포 배양 시스템은 관류 시스템에서 사용된 것과 유사하지만 상당 부분의 세포가 연속적으로 제거되게 하는 세포 보유 기기를 포함할 수 있고, 그에 따라 관류 배양에 비해 더 적은 백분율의 세포가 보유된다. "세포 보유 기기"는 세포 배양 동안에 특정한 위치에서 세포, 특히 부착 비의존성 세포를 보유할 수 있는 임의의 구조체를 의미한다. 비제한적인 예에는 생물반응기 내에서 부착 비의존성 세포를 보유할 수 있는 미세 담체, 미세 메쉬 스핀 여과기, 중공 섬유, 평판 막 여과기, 침강 튜브, 초음파 세포 보유 기기 등이 포함된다. 관심 폴리펩티드 및/또는 바이러스 (예를 들어, 재조합 폴리펩티드 및/또는 재조합 바이러스)는 세포 배양 시스템으로부터, 예를 들어 세포 배양 시스템으로부터 제거된 배지로부터 회수될 수 있다.
일부 측면에서, 용어 "항체"는 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 2개의 중쇄 (H) 및 2개의 경쇄 (L)를 포함하는 단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역 (본원에서 CH로 약칭됨)으로 구성된다. 일부 항체, 예를 들어 천연 발생 IgG 항체에서, 중쇄 불변 영역은 힌지, 및 3개의 도메인, CH1, CH2 및 CH3으로 구성된다. 일부 항체, 예를 들어 천연 발생 IgG 항체에서, 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 경쇄 불변 영역은 1개의 도메인 (본원에서 CL로 약칭됨)으로 구성된다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 지칭되는 더욱 보존된 영역 사이에 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 지칭되는 초가변 영역으로 추가로 세분될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 하기 순서로 배열된 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, 및 FR4. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. 중쇄는 C-말단 리신을 가질 수 있거나 또는 그렇지 않을 수 있다. 용어 "항체"에는 이중특이적인 항체 또는 다중특이적인 항체가 포함될 수 있다.
일부 측면에서, 본원에 사용된 바와 같이, "IgG 항체", 예를 들어 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체는 천연 발생 IgG 항체의 구조를 가지며, 즉, 이는 동일한 서브클래스의 천연 발생 IgG 항체와 동일한 중쇄 및 경쇄 및 디술피드 결합을 갖는다. 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체는 2개의 중쇄 (HC) 및 2개의 경쇄 (LC)로 이루어질 수 있고, 2개의 HC 및 LC는 각각 천연 발생 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4 항체에서 발생하는 동일한 수 및 위치의 디술피드 가교에 의해 연결된다 (항체가 디술피드 가교를 변형시키도록 돌연변이되지 않았다면).
이뮤노글로불린은 IgA, 분비 IgA, IgG 및 IgM을 비롯하여 이에 제한되지는 않는 일반적으로 공지된 임의의 이소타입으로부터의 것일 수 있다. IgG 이소타입은 특정한 종에서 서브클래스로 나뉜다: 인간에서는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4, 및 마우스에서는 IgG1, IgG2a, IgG2b 및 IgG3. 이뮤노글로불린, 예를 들어 IgG1은 많아야 몇 개의 아미노산에서 서로 상이한 몇몇 알로타입으로 존재한다. "항체"에는 예를 들어 천연 발생 및 비-천연 발생 항체; 모노클로날 및 폴리클로날 항체; 키메라 및 인간화 항체; 인간 및 비인간 항체 및 전체 합성 항체 둘 다가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 항체의 "항원-결합 부분"은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 항체의 1개 이상의 단편을 지칭한다. 항체의 항원-결합 기능이 전장 항체의 단편에 의해 수행될 수 있는 것으로 제시되어 있다. 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 결합 단편의 예에는 (i) Fab 단편 (파파인 절단으로부터의 단편), 또는 VL, VH, LC 및 CH1 도메인으로 이루어진 유사한 1가 단편; (ii) F(ab')2 단편 (펩신 절단으로부터의 단편), 또는 힌지 영역에서 디술피드 가교에 의해 연결된 2개의 Fab 단편을 포함하는 유사한 2가 단편; (iii) VH 및 CH1 도메인으로 이루어진 Fd 단편; (iv) 항체의 단일 아암의 VL 및 VH 도메인으로 이루어진 Fv 단편, (v) VH 도메인으로 이루어진 dAb 단편 (Ward et al., (1989) Nature 341:544-546); (vi) 단리된 상보성 결정 영역 (CDR) 및 (vii) 임의적으로 합성 링커에 의해 결합될 수 있는 2개 이상의 단리된 CDR의 조합물이 포함된다. 추가로, Fv 단편의 두 도메인, VL 및 VH가 별개의 유전자에 의해 코딩되지만, 이들은 재조합 방법을 이용하여, VL 및 VH 영역이 쌍을 형성하여 1가 분자를 형성하는 단일 단백질 쇄로서 만들어질 수 있게 하는 합성 링커에 의해 결합될 수 있다 (단일 쇄 Fv (scFv)로 공지됨; 예를 들어 문헌 [Bird et al. (1988) Science 242:423-426; 및 Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883] 참고). 이러한 단일 쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되는 것으로 의도된다. 이들 항체 단편은 관련 기술분야의 기술자에게 공지된 통상적인 기술을 이용하여 수득되며, 단편은 온전한 항체와 동일한 방식으로 유용성에 대해 스크리닝된다. 항원-결합 부분은 재조합 DNA 기술에 의해, 또는 온전한 이뮤노글로불린의 효소적 또는 화학적 절단에 의해 생산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "재조합 인간 항체"에는 재조합 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 모든 인간 항체, 예컨대 (a) 인간 이뮤노글로불린 유전자에 대해 트랜스제닉 또는 트랜스크로모소말인 동물 (예를 들어, 마우스), 또는 그로부터 제조된 하이브리도마로부터 단리된 항체, (b) 항체를 발현하도록 형질전환된 숙주 세포로부터, 예를 들어 트랜스펙토마로부터 단리된 항체, (c) 재조합의 조합 인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체, 및 (d) 인간 이뮤노글로불린 유전자 서열을 다른 DNA 서열로 스플라이싱하는 것을 수반하는 임의의 다른 수단에 의해 제조되거나, 발현되거나, 생성되거나 또는 단리되는 항체가 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, "이소타입"은 중쇄 불변 영역 유전자에 의해 코딩되는 항체 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgM, IgA1, IgA2, IgD, 및 IgE 항체)를 지칭한다.
본원에서 아미노산은 IUPAC-IUB 생화학 명명법 위원회(Biochemical Nomenclature Commission)에 의해 권장된 일반적으로 공지된 그들의 세 글자 기호 또는 한 글자 기호로 표시된다. 마찬가지로, 뉴클레오티드는 일반적으로 허용되는 그들의 단일 글자 코드로 표시된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미드 결합 (펩티드 결합으로도 공지됨)에 의해 선형으로 연결된 단량체 (아미노산)로 구성된 분자를 지칭한다. 용어 "폴리펩티드" 또는 "단백질" 또는 "산물" 또는 "산물 단백질" 또는 "아미노산 잔기 서열"은 상호교환적으로 사용된다. 용어 "폴리펩티드"는 2개 이상의 아미노산의 임의의 쇄 또는 쇄들을 지칭하며, 특정한 길이의 산물을 지칭하지는 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "단백질"은 일부 예에서 아미드 결합 이외의 결합에 의해 회합될 수 있는 1개 이상의 폴리펩티드로 구성된 분자를 포함하는 것으로 의도된다. 한편, 단백질은 또한 단일 폴리펩티드 쇄일 수 있다. 후자의 예에서, 단일 폴리펩티드 쇄는 일부 예에서 함께 융합되어 단백질을 형성하는 2개 이상의 폴리펩티드 서브유닛을 포함할 수 있다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 또한 비제한적으로 글리코실화, 아세틸화, 인산화, 아미드화, 공지된 보호기/차단기에 의한 유도체화, 단백질 분해 절단, 또는 비-천연 발생 아미노산에 의한 변형을 비롯하여 이에 제한되지는 않는 발현 후 변형의 산물을 지칭한다. 폴리펩티드 또는 단백질은 천연 생물학적 공급원으로부터 유래될 수 있거나 또는 재조합 기술에 의해 생성될 수 있지만, 반드시 지정된 핵산 서열로부터 번역되는 것은 아니다. 이는 화학적 합성을 비롯하여 임의의 방식으로 생산될 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "폴리뉴클레오티드" 또는 "뉴클레오티드"는 단일 핵산 뿐만 아니라 복수개의 핵산을 포함하는 것으로 의도되고, 단리된 핵산 분자 또는 구축물, 예를 들어 메신저 RNA (mRNA), 상보성 DNA (cDNA), 또는 플라스미드 DNA (pDNA)를 지칭한다. 특정한 측면에서, 폴리뉴클레오티드는 통상적인 포스포디에스테르 결합 또는 비-통상적인 결합 (예를 들어, 펩티드 핵산 (PNA)에서 발견되는 것과 같은 아미드 결합)을 포함한다.
용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드에 존재하는 임의의 1개 이상의 핵산 절편, 예를 들어 DNA, cDNA, 또는 RNA 단편을 지칭한다. 핵산 또는 폴리뉴클레오티드에 적용되는 경우, 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거된 핵산 분자, DNA 또는 RNA를 지칭하며, 예를 들어 벡터에 함유된 항원 결합 단백질을 코딩하는 재조합 폴리뉴클레오티드는 본 개시내용의 목적을 위해 단리된 것으로 고려된다. 단리된 폴리뉴클레오티드의 추가의 예에는 이종성 숙주 세포에서 유지되거나 또는 용액 중에서 다른 폴리뉴클레오티드로부터 (부분적으로 또는 실질적으로) 정제된 재조합 폴리뉴클레오티드가 포함된다. 단리된 RNA 분자에는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 시험관내 RNA 전사체가 포함된다. 본 개시내용에 따른 단리된 폴리뉴클레오티드 또는 핵산에는 합성에 의해 생산된 이러한 분자가 추가로 포함된다. 또한, 폴리뉴클레오티드 또는 핵산은 조절 요소, 예컨대 프로모터, 인핸서, 리보솜 결합 부위, 또는 전사 종결 신호가 포함될 수 있다.
II. 배지를 모니터링하는 방법
본 개시내용은 테스트 세포 배양 배지로부터 수득된 라만 스펙트럼을 비교하고, 이를 분해되지 않은 세포 배양 배지의 하나 이상의 공지된 성분의 라만 스펙트럼과 비교함으로써, 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 배지의 분해를 분석하기 위한 고도로 효율적인 접근법을 제공한다. 각각의 라만 스펙트럼은 배지 자체 또는 그의 하나 이상의 성분으로부터 획득될 수 있다. 예를 들어, 세포 배양 배지의 단일 성분, 예컨대 티로신 또는 다른 아미노산에 대해 1개의 또는 복수개의 라만 스펙트럼이 획득될 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 분해에 대해 테스트될 세포 배양 배지 샘플로부터 1개의 또는 복수개의 라만 스펙트럼이 획득될 수 있다. 이러한 방식으로, 세포 배양 배지 제조에서 침전물 또는 다른 분해 요소가 검출될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 표적 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하기 위해 샘플 내에서 표적화된 부피의 라만 스펙트럼을 수집하도록 라만 분광계를 제어하는 것을 포함한다. 상기 방법은 세포 배양 배지의 공지된 성분과 고유하게 연관된 기준 스펙트럼을 수득하는 것을 추가로 포함한다. 기준 스펙트럼은 하나 이상의 세포 배양 배지 성분의 적어도 하나의 스펙트럼 측정을 포함한다. 더욱이, 상기 방법은 또한 공정 기기를 사용하여 기준 스펙트럼을 수집된 스펙트럼과 비교하고, 기준 스펙트럼과 수집된 스펙트럼의 비교를 기반으로 하여 수집된 스펙트럼 내에서 적어도 하나의 원치않는 분자 조성이 있는지 여부를 확인하는 것을 포함한다. 이와 관련하여, 상기 방법은 수집된 스펙트럼 내에서 적어도 하나의 원치않는 분자 조성이 확인된 경우에 수집된 라만 스펙트럼의 분석을 기반으로 하여 세포 배양 배지 분해가 발생하였는지 여부에 대한 표시를 제공하고, 수집된 라만 스펙트럼에서 분해가 검출된 경우에 제조 공정을 중단하고/거나 제조 공정 동안에 사용하기 전에 분해된 배지를 폐기하는 것을 추가로 포함한다. 원치않는 분자 조성은 수집된 스펙트럼과 분해가 없는 세포 배양 배지 조성물의 기준 스펙트럼 사이에서 컴퓨팅된 차이 스펙트럼의 분석을 기반으로 하여 원치않는 분자 또는 침전물을 확인함으로서 확인될 수 있다.
본 개시내용의 추가의 측면에 따라, 제조 공정에서 분해를 검출하는 시스템은 광학 영상화 시스템 및 프로세서를 포함한다. 광학 영상화 시스템은 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하기 위해 샘플 영역 내에서 표적화된 부피에 대해 레이저를 지시하도록 제어되는 라만 분광계를 구현한다. 프로세서는 광학 영상화 시스템에 커플링된다. 이러한 방식으로, 프로세서는 라만 스펙트럼을 수신하고, 공지된 성분을 설명하는 기준 스펙트럼에 접근하기 위해 프로그램 코드를 실행한다. 기준 스펙트럼은 하나 이상의 세포 배양 배지 성분의 스펙트럼 측정을 포함한다. 프로세서는 기준 스펙트럼을 수집된 스펙트럼과 비교하고, 기준 스펙트럼과 수집된 스펙트럼의 비교를 기반으로 하여 수집된 스펙트럼 내에서 적어도 하나의 원치않는 분자 조성이 있는지 여부를 확인하기 위해 프로그램 코드를 추가로 실행한다. 또한, 프로세서는 수집된 스펙트럼 내에서 적어도 하나의 원치않는 분자 조성이 확인되는지 여부를 기반으로 하여 수집된 라만 스펙트럼에 분해가 존재하는지 여부에 대한 표시를 제공하고, 수집된 라만 스펙트럼에서 분해가 검출된 경우에 제조 공정을 중단시키고/거나 제조 공정 동안에 사용하기 전에 분해된 배지를 폐기하기 위해 프로그램 코드를 실행한다. 컴퓨팅 유닛은 적어도 하나의 물질의 투여 전에 획득된 라만 스펙트럼 및 적어도 하나의 물질의 투여 후에 획득된 라만 스펙트럼의 통계적 평가에 의해 적어도 하나의 물질에 대한 생물학적 대상의 반응을 결정하도록 구성될 수 있다. 통계적 평가는 주성분 분석 (PCA), 부분 최소 제곱 분석 (PLS), 클러스터 분석 및/또는 선형 판별 분석 (LDA)을 포함할 수 있다. 일부 측면에서, 통계적 평가는 PCA를 포함할 수 있다.
본 개시내용의 방법은 또한 공지된 라만 스펙트럼을 갖는 세포 배양 배지에 첨가된 마커를 모니터링하는데 유용하다. 일부 측면에서, 첨가된 마커는 하나 이상의 아미노산이다. 일부 측면에서, 첨가된 마커는 리신 (Lys), 히스티딘 (His), 아스파라긴 (Asn), 아르기닌 (Arg), 알라닌 (Ala), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루탐산 (Glu), 글루타민 (Gln), 글리신 (Gly), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 및 발린 (Val)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이다. 일부 측면에서, 첨가된 마커는 리신 (Lys), 아스파라긴 (Asn), 알라닌 (Ala), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루탐산 (Glu), 글루타민 (Gln), 글리신 (Gly), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 및 발린 (Val)으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 아미노산이다. 다른 측면에서, 마커는 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 또는 아르기닌이다. 일부 측면에서, 마커는 리신 (Lys) 및 아스파라긴 (Asn)으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 측면에서, 마커는 티로신이다. 일부 측면에서, 마커는 리신이다. 일부 측면에서, 마커는 히스티딘이다. 다른 측면에서, 마커는 아스파라긴이다. 다른 측면에서, 마커는 아르기닌이다. 일부 측면에서, 아미노산 마커는 형광 활성이 아니다. 일부 측면에서, 첨가된 마커는 비타민이다. 일부 측면에서, 마커는 시아노코발라민 (B12), 엽산 (B9), 니아신아미드 (B3), 피리독살 HCl (B6(AL)), 및 피리독신 HCl (B6(INE))을 포함하는 군으로부터 선택된 하나 이상의 비타민이다. 일부 측면에서, 마커는 B12이다. 일부 측면에서, 마커는 B9이다. 일부 측면에서, 마커는 B3이다. 일부 측면에서, 마커는 피리독살 HCl (B6(AL))이다. 일부 측면에서, 마커는 피리독신 HCl (B6(INE))이다.
세포 배양 배지는 라만 분광법 신호를 차폐시키는 경향이 있는, 형광을 나타내는 물질을 포함할 수 있다. 형광은 전형적으로 여기 파장과는 무관하다. 스펙트럼이 2가지 약간 상이한 파장에서 획득되는 경우, 각각의 스펙트럼에서 형광은 대략 동일해야 하지만, 라만 피크는 여기 파장에 의해 이동해야 한다. 따라서, 스펙트럼은 형광이 없는 스펙트럼을 생성하도록 (예를 들어, 주성분 분석에 의해) 분해될 수 있다.
본 개시내용은 또한 임의의 환경에서 성장하는 세포에 대한 그의 효과에 영향을 미칠 수 있는 세포 배양 배지에서의 변화를 모니터링하는 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 한 측면은 세포 배양 배지 샘플의 라만 스펙트럼을 측정하여, 이를 세포 배양 배지의 성분의 공지된 스펙트럼과 비교하는 것에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 배지를 핑거프린팅하고/거나 세포 배양 배지에 대한 최적 보관 조건을 확인하는 방법으로서, 하나 이상의 성분의 혼합물을 함유하는 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 하나 이상의 성분 각각과 연관된 하나 이상의 기준 스펙트럼 또는 기준 배지 조성물과 연관된 기준 스펙트럼과 비교하는 것인 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 방법은 또한 보관된 세포 배양 배지에서의 특정한 성분의 변화율을 확인하고/거나 보관된 세포 배양 배지의 변화를 모니터링하는 방법으로서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것 ("수집된 스펙트럼")을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 하나 이상의 성분 각각과 연관된 기준 스펙트럼과 비교하는 것인 방법에 관한 것이다.
일부 측면에서, 기준 스펙트럼에는 분해가 없다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것은 적어도 약 1 시간마다, 적어도 약 2 시간마다, 적어도 약 3 시간마다, 적어도 약 4 시간마다, 적어도 약 5 시간마다, 적어도 6 시간마다, 적어도 7 시간마다, 적어도 약 8 시간마다, 적어도 약 9 시간마다, 적어도 약 10 시간마다, 적어도 약 11 시간마다, 적어도 약 12 시간마다, 적어도 약 13 시간마다, 적어도 약 14 시간마다, 적어도 약 15 시간마다, 적어도 약 16 시간마다, 적어도 약 17 시간마다, 적어도 약 18 시간마다, 적어도 약 19 시간마다, 적어도 약 20 시간마다, 적어도 약 21 시간마다, 적어도 약 22 시간마다, 적어도 약 23 시간마다, 또는 적어도 약 24 시간마다 수행된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것은 적어도 약 25 시간마다, 적어도 약 26 시간마다, 적어도 약 27 시간마다, 적어도 약 28 시간마다, 적어도 약 29 시간마다, 적어도 약 30 시간마다, 적어도 약 31 시간마다, 적어도 약 32 시간마다, 적어도 약 33 시간마다, 적어도 약 34 시간마다, 적어도 약 35 시간마다, 적어도 약 36 시간마다, 적어도 약 37 시간마다, 또는 적어도 약 38 시간마다, 적어도 약 39 시간마다, 적어도 약 40 시간마다, 적어도 약 41 시간마다, 적어도 약 42 시간마다, 적어도 약 43 시간마다, 적어도 약 44 시간마다, 적어도 약 45 시간마다, 적어도 약 46 시간마다, 적어도 약 47 시간마다, 적어도 약 48 시간마다, 적어도 약 49 시간마다, 또는 적어도 약 50 시간마다 수행된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것은 약 3 시간마다 수행된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것은 약 2 시간 내지 약 3 시간, 1 시간 내지 4 시간, 1 시간 내지 3 시간, 또는 2 시간 내지 4 시간 사이에 수행된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것은 약 3 시간마다 수행된다.
일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 적어도 5개 데이터 포인트, 적어도 10개 데이터 포인트, 적어도 15개 데이터 포인트, 적어도 16개 데이터 포인트, 적어도 17개 데이터 포인트, 적어도 18개 데이터 포인트, 적어도 19개 데이터 포인트, 적어도 20개 데이터 포인트, 적어도 21개 데이터 포인트, 적어도 22개 데이터 포인트, 적어도 23개 데이터 포인트, 적어도 24개 데이터 포인트, 적어도 25개 데이터 포인트, 적어도 26개 데이터 포인트, 적어도 27개 데이터 포인트, 적어도 28개 데이터 포인트, 적어도 29개 데이터 포인트, 적어도 30개 데이터 포인트, 적어도 31개 데이터 포인트, 적어도 32개 데이터 포인트, 적어도 33개 데이터 포인트, 적어도 34개 데이터 포인트, 적어도 35개 데이터 포인트, 적어도 36개 데이터 포인트, 적어도 37개 데이터 포인트, 적어도 38개 데이터 포인트, 적어도 39개 데이터 포인트, 적어도 40개 데이터 포인트, 적어도 41개 데이터 포인트, 적어도 42개 데이터 포인트, 적어도 43개 데이터 포인트, 적어도 44개 데이터 포인트, 적어도 45개 데이터 포인트, 적어도 46개 데이터 포인트, 적어도 47개 데이터 포인트, 적어도 48개 데이터 포인트, 적어도 49개 데이터 포인트, 또는 적어도 50개 데이터 포인트의 평균이다. 일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 적어도 51개 데이터 포인트, 적어도 52개 데이터 포인트, 적어도 53개 데이터 포인트, 적어도 54개 데이터 포인트, 적어도 55개 데이터 포인트, 적어도 56개 데이터 포인트, 적어도 57개 데이터 포인트, 적어도 58개 데이터 포인트, 적어도 59개 데이터 포인트, 적어도 60개 데이터 포인트, 적어도 61개 데이터 포인트, 적어도 62개 데이터 포인트, 적어도 63개 데이터 포인트, 적어도 64개 데이터 포인트, 적어도 65개 데이터 포인트, 적어도 66개 데이터 포인트, 적어도 67개 데이터 포인트, 적어도 68개 데이터 포인트, 적어도 69개 데이터 포인트, 적어도 70개 데이터 포인트, 적어도 71개 데이터 포인트, 적어도 72개 데이터 포인트, 적어도 73개 데이터 포인트, 적어도 74개 데이터 포인트, 적어도 75개 데이터 포인트, 적어도 76개 데이터 포인트, 적어도 77개 데이터 포인트, 적어도 78개 데이터 포인트, 적어도 79개 데이터 포인트, 적어도 80개 데이터 포인트, 적어도 81개 데이터 포인트, 적어도 82개 데이터 포인트, 적어도 83개 데이터 포인트, 적어도 84개 데이터 포인트, 적어도 85개 데이터 포인트, 적어도 86개 데이터 포인트, 적어도 87개 데이터 포인트, 적어도 88개 데이터 포인트, 적어도 89개 데이터 포인트, 적어도 90개 데이터 포인트, 적어도 91개 데이터 포인트, 또는 적어도 92개 데이터 포인트, 적어도 93개 데이터 포인트, 적어도 94개 데이터 포인트, 적어도 95개 데이터 포인트, 적어도 96개 데이터 포인트, 적어도 97개 데이터 포인트, 적어도 98개 데이터 포인트, 적어도 99개 데이터 포인트, 또는 적어도 100개 데이터 포인트의 평균이다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지에 대한 라만 스펙트럼은 35개 데이터 포인트의 평균이다.
일부 측면에서, 각각의 데이터 포인트는 10 초마다, 15 초마다, 20 초마다, 25 초마다, 30 초마다, 35 초마다, 40 초마다, 45 초마다, 50 초마다, 55 초마다, 또는 60 초마다 측정된다. 일부 측면에서, 각각의 데이터 포인트는 65 초마다, 70 초마다, 75 초마다, 80 초마다, 85 초마다, 90 초마다, 95 초마다, 100 초마다, 105 초마다, 110 초마다, 115 초마다, 또는 120 초마다 측정된다.
본 개시내용의 방법은 또한 샘플로부터 수집된 미가공 라만 스펙트럼의 분석을 수반한다. 일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 다변량 분석에 의해 분석된다. 일부 측면에서, 다변량 분석은 주성분 분석 (PCA)이다. 일부 측면에서, PCA는 라만 스펙트럼에 대한 PC 점수를 생성한다. 일부 측면에서, 다변량 분석은 부분 최소 제곱 분석 (PLS)이며, 분석은 보정 예측 모델을 생성한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 세포 배양 배지의 수집된 스펙트럼을 비교하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 비교하는 것은 수집된 스펙트럼의 PC 점수를 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 비교하는 것을 포함한다.
일부 측면에서, 분석은 예측 모델을 기반으로 한다. 모델로서 유용한 또는 예측 모델을 설계하는데 유용한, 관련 기술분야에 널리 공지된 확립된 통계적 알고리즘 및 방법에는 무엇보다도 하기가 포함될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다: 부분 최소 제곱 (PLS) 분석, 표준 정규 변량 (SNV) 분석, 분산 분석 (ANOVA); 베이지안(Bayesian) 네트워크; 부스팅 및 Ada-부스팅; 부트스트랩 합계 (또는 배깅) 알고리즘; 결정 트리 분류 기술, 예컨대 분류 및 회귀 트리 (CART), 부스팅된 CART, 랜덤 포레스트 (RF), 재귀적 분할 트리 (RPART) 등; 커즈(Curds) 및 웨이(Whey) (CW); 커즈 및 웨이-라쏘(Whey-Lasso); 차원 축소 방법, 예컨대 주성분 분석 (PCA) 및 요인 회전 또는 요인 분석; 판별 분석, 예컨대 선형 판별 분석 (LDA), 아이젠진(Eigengene) 선형 판별 분석 (ELDA), 및 이차 판별 분석; 판별 기능 분석 (DFA); 요인 회전 또는 요인 분석; 유전자 알고리즘; 은닉 마코브(Markov) 모델; 커널(kernel) 기반 기계 알고리즘, 예컨대 커널 밀도 추정, 커널 부분 최소 제곱 알고리즘, 커널 매칭 추구 알고리즘, 커널 피셔(Fisher) 판별 분석 알고리즘, 및 커널 주성분 분석 알고리즘; 순방향 선형 단계적 회귀, 라쏘 (또는 LASSO) 수축 및 선택 방법, 및 탄성 네트 정규화 및 선택 방법을 포함하거나 또는 이용하는 선형 회귀 및 일반화된 선형 모델; glmnet (라쏘 및 탄성 네트-정규화된 일반화된 선형 모델); 로지스틱 회귀 (LogReg); 메타-러너 알고리즘; 분류 또는 회귀를 위한 최근린 방법, 예를 들어 Kth-최근린 (KNN); 비-선형 회귀 또는 분류 알고리즘; 신경 네트워크; 부분 최소 제곱; 규칙 기반 분류기; 축소된 중심 (SC); 슬라이싱된 역회귀; 제품 모델 데이터의 교환에 대한 표준, 응용 해석된 구축 (StepAIC); 수퍼 주성분 (SPC) 회귀; 및 지지 벡터 기계 (SVM) 및 재귀 지지 벡터 기계 (RSVM). 추가적으로, 관련 기술분야에 공지된 클러스터화 알고리즘이 대상 하위 그룹을 결정하는데 유용할 수 있다.
관심 피분석물의 고유 라만 스펙트럼을 통한 다변량 통계적 수단, 예컨대 주성분 분석 (PCA)이 이용될 수 있다. 구체적으로, 데이터 세트에서 통계적으로 가장 유의한 변동을 제공하고 샘플 매트릭스의 차원을 축소시키는 주성분 벡터 (PC)를 확립함으로써 스펙트럼 데이터 세트의 선형 다변량 모델이 구축될 수 있다. 이 접근법은 수집된 각각의 스펙트럼의 PC에 대한 점수를 배정한 후, 스펙트럼을 이차원 플롯에서 단일 데이터 포인트로서 플롯하는 것을 수반한다. 플롯은 유사한 스펙트럼의 클러스터를 나타낼 것이며, 따라서 개별적인 생물학적 종 (피분석물 및 간섭 분자)이 분류되고, 심지어 밀접하게 관련된 종에 대해서도 구분될 수 있다.
본 개시내용의 방법은 하나 이상의 기준 라만 스펙트럼에 대한 지식을 필요로 한다. 하나 이상의 기준 스펙트럼은 하나 이상의 기준 샘플을 기반으로 하여 생성될 수 있다. 각각의 기준 샘플은 하나 이상의 기본 (생화학적) 성분을 포함할 수 있다. 프로세서는 하나 이상의 라만 스펙트럼을 기반으로 하여 하나 이상의 재구축된 라만 영상을 생성하도록 구성될 수 있다. 프로세서는 기준 라만 스펙트럼을 기반으로 하여 형광 백그라운드를 제거하도록 구성될 수 있다.
일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 적어도 약 10만큼, 적어도 약 11만큼, 적어도 약 12만큼, 적어도 약 13만큼, 적어도 약 14만큼, 적어도 약 15만큼, 적어도 약 16만큼, 적어도 약 17만큼, 적어도 약 18만큼, 적어도 약 19만큼, 적어도 약 20만큼, 적어도 약 21만큼, 적어도 약 22만큼, 적어도 약 23만큼, 적어도 약 24만큼, 적어도 약 25만큼, 적어도 약 26만큼, 적어도 약 27만큼, 적어도 약 28만큼, 적어도 약 29만큼, 또는 적어도 약 30만큼 상이할 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수보다 높을 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수기 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수보다 낮을 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지가 분해되지 않고, 비-분해된 세포 배양 배지가 분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 생존력을 약 1%만큼, 약 2%만큼, 약 3%만큼, 약 4%만큼, 약 5%만큼, 약 6%만큼, 약 7%만큼, 약 8%만큼, 약 9%만큼, 약 10%만큼, 약 11%만큼, 약 12%만큼, 약 13%만큼, 약 14%만큼, 약 15%만큼, 약 16%만큼, 약 17%만큼, 약 18%만큼, 약 19%만큼, 약 20%만큼, 약 21%만큼, 약 22%만큼, 약 23%만큼, 약 24%만큼, 약 25%만큼, 약 26%만큼, 약 27%만큼, 약 28%만큼, 약 29%만큼, 약 30%만큼 개선시킨다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지가 분해되지 않고, 비-분해된 세포 배양 배지는 분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 생존 세포 밀도를 약 1 x 106세포/mL만큼, 약 2 x 106세포/mL만큼, 약 3 x 106세포/mL만큼, 약 4 x 106세포/mL만큼, 약 5 x 106세포/mL만큼, 약 6 x 106세포/mL만큼, 약 7 x 106세포/mL만큼, 약 8 x 106세포/mL만큼, 약 9 x 106세포/mL만큼, 약 10 x 106세포/mL만큼, 약 11 x 106세포/mL만큼, 약 12 x 106세포/mL만큼, 약 13 x 106세포/mL만큼, 약 14 x 106세포/mL만큼, 약 15 x 106세포/mL만큼, 약 16 x 106세포/mL만큼, 약 17 x 106세포/mL만큼, 약 18 x 106세포/mL만큼, 약 19 x 106세포/mL만큼, 약 20 x 106세포/mL만큼, 약 21 x 106세포/mL만큼, 약 22 x 106세포/mL만큼, 약 23 x 106세포/mL만큼, 약 24 x 106세포/mL만큼, 약 25 x 106세포/mL만큼, 약 26 x 106세포/mL만큼, 약 27 x 106세포/mL만큼, 약 28 x 106세포/mL만큼, 약 29 x 106세포/mL만큼, 또는 약 30 x 106세포/mL만큼 개선시킨다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지가 분해되지 않고, 분해되지 않은 세포 배양 배지는 분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 항체 생산 역가를 약 0.1 g/L만큼, 약 0.2 g/L만큼, 약 0.3 g/L만큼, 약 0.4 g/L만큼, 약 0.5 g/L만큼, 약 0.6 g/L만큼, 약 0.7 g/L만큼, 약 0.8 g/L만큼, 약 0.9 g/L만큼, 약 1.0 g/L만큼, 약 1.1 g/L만큼, 약 1.2 g/L만큼, 약 1.3 g/L만큼, 약 1.4 g/L만큼, 약 1.5 g/L만큼, 약 1.6 g/L만큼, 약 1.7 g/L만큼, 약 1.8 g/L만큼, 약 1.9 g/L만큼, 약 2.0 g/L만큼, 약 2.1 g/L만큼, 약 2.2 g/L만큼, 약 2.3 g/L만큼, 약 2.4 g/L만큼, 약 2.5 g/L만큼, 약 2.6 g/L만큼, 약 2.7 g/L만큼, 약 2.8 g/L만큼, 약 2.9 g/L만큼, 약 3.0 g/L만큼, 약 3.1 g/L만큼, 약 3.2 g/L만큼, 약 3.3 g/L만큼, 약 3.4 g/L만큼, 약 3.5 g/L만큼, 약 3.6 g/L만큼, 약 3.7 g/L만큼, 약 3.8 g/L만큼, 약 3.9 g/L만큼, 약 4.0 g/L만큼, 약 4.1 g/L만큼, 약 4.2 g/L만큼, 약 4.3 g/L만큼, 약 4.4 g/L만큼, 약 4.5 g/L만큼, 약 4.6 g/L만큼, 약 4.7 g/L만큼, 약 4.8 g/L만큼, 약 4.9 g/L만큼, 약 5.0 g/L만큼, 약 5.1 g/L만큼, 약 5.2 g/L만큼, 약 5.3 g/L만큼, 약 5.4 g/L만큼, 약 5.5 g/L만큼, 약 5.6 g/L만큼, 약 5.7 g/L만큼, 약 5.8 g/L만큼, 약 5.9 g/L만큼, 또는 약 6.0 g/L만큼 개선시킨다.
일부 측면에서, 공지된 기준 스펙트럼을 갖는 마커는 본 개시내용의 방법을 통해 분석될 수 있고, 세포 배양 조성물에 존재한다. 본 개시내용의 방법은 마커로서 공지된 성분의 첨가를 통해 조성물의 분해를 검출하는데 유용할 수 있다. 일부 측면에서, 마커는 세포 배양 배지에 첨가된다. 일부 측면에서, 마커는 리신, 히스티딘, 아스파라긴, 알라닌, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루탐산, 글리신 이소류신, 류신, 리신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 발린, 및 아르기닌으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 마커는 티로신이다. 다른 측면에서, 마커는 당이다. 일부 측면에서, 마커는 프럭토스, 말토스, 헥소스, 아라비노스, 또는 수크로스로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 마커는 글루코스가 아니다. 일부 측면에서, 마커는 락테이트가 아니다. 일부 측면에서, 마커는 비타민이다. 일부 측면에서, 비타민은 비타민 A, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 비타민 K, 비타민 B6, 비타민 B12, 엽산염, 티아민, 리보플라빈, 니아신, 판토텐산, 비오틴, 및 엽산염으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일부 측면에서, 마커는 비타민이고, 시아노코발라민 (B12), 엽산 (B9), 니아신아미드 (B3), 피리독살 HCl (B6(AL)), 및 피리독신 HCl (B6(INE))로 이루어진 군으로부터 선택된다.
일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 약 500 cm-1 내지 약 1700 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 1800 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 1900 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2000 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2100 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2200 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2300 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2400 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2500 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2600 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2700 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2800 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2900 cm-1, 또는 약 500 cm-1 내지 약 3000 cm-1의 범위에서 측정된다. 일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 500 cm-1 내지 3000 cm-1의 범위에서 측정된다.
일부 측면에서, 라만 스펙트럼은 약 500 cm-1 내지 약 3000 cm-1, 약 600 cm-1 내지 약 3000 cm-1, 약 600 cm-1 내지 약 2900 cm-1, 약 700 cm-1 내지 약 2900 cm-1, 약 700 cm-1 내지 약 2800 cm-1, 약 800 cm-1 내지 약 2800 cm-1, 약 800 cm-1 내지 약 2700 cm-1, 약 900 cm-1 내지 약 2700 cm-1, 약 900 cm-1 내지 약 2600 cm-1, 약 1000 cm-1 내지 약 2600 cm-1, 약 1000 cm-1 내지 약 2500 cm-1, 약 1100 cm-1 내지 약 2500 cm-1, 약 1100 cm-1 내지 약 2400 cm-1, 또는 약 1200 cm-1 내지 약 2400 cm-1, 약 1200 cm-1 내지 약 2300 cm-1, 약 1300 cm-1 내지 약 2300 cm-1, 약 1300 cm-1 내지 약 2200 cm-1, 약 1400 cm-1 내지 약 2200 cm-1, 약 1400 cm-1 내지 약 2100 cm-1, 약 1500 cm-1 내지 약 2100 cm-1, 약 1500 cm-1 내지 약 2000 cm-1, 약 1600 cm-1 내지 약 2000 cm-1, 약 1600 cm-1 내지 약 1900 cm-1, 약 1700 cm-1 내지 약 1900 cm-1, 또는 약 1800 cm-1 내지 약 1900 cm-1의 범위에서 측정된다.
일부 측면에서, 상기 방법은 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 동일하거나 또는 약 20 이하만큼, 약 19 이하만큼, 약 18 이하만큼, 약 17 이하만큼, 약 16 이하만큼, 약 15 이하만큼, 약 14 이하만큼, 약 13 이하만큼, 약 12 이하만큼, 약 11 이하만큼, 약 10 이하만큼, 약 9 이하만큼, 약 8 이하만큼, 약 7 이하만큼, 약 6 이하만큼, 약 5 이하만큼, 약 4 이하만큼, 약 3 이하만큼, 약 2 이하만큼, 또는 약 1 이하만큼 유사할 때 세포 배양 배지가 안정한 것으로 결정하는 것을 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 세포 배양 배지는 약 8 일 동안, 약 9 일 동안, 약 10 일 동안, 약 11 일 동안, 약 12 일 동안, 약 15 일 동안, 약 16 일 동안, 약 17 일 동안, 약 18 일 동안, 약 19 일 동안, 약 20 일 동안, 약 21 일 동안, 약 22 일 동안, 약 23 일 동안, 약 24 일 동안, 약 25 일 동안, 약 26 일 동안, 약 27 일 동안, 약 28 일 동안, 약 29 일 동안, 약 30 일 동안, 약 1 개월 동안, 약 1.5 개월 동안, 약 40 일 동안, 약 50 일 동안, 약 60 일 동안, 약 2 개월 동안, 약 70 일 동안, 약 80 일 동안, 약 90 일 동안, 약 3 개월 동안, 약 100 일 동안, 약 110 일 동안, 약 120 일 동안, 약 4 개월 동안, 약 5 개월 동안, 또는 약 6 개월 동안의 보관을 위해 결정된다. 일부 측면에서, 세포 배양 배지는 약 12 개월 동안, 약 18 개월 동안, 약 24 개월 동안, 약 30 개월 동안, 약 36 개월 동안, 약 42 개월 동안, 약 48 개월 동안, 약 54 개월 동안, 또는 약 60 개월 동안의 보관을 위해 결정된다.
본 개시내용의 방법은 제조 공정 동안에 세포 배양물을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상기 방법은 상류 세포 배양 공정을 모니터링하는 것을 추가로 포함한다. 일부 측면에서, 상류 세포 배양 공정은 배치 반응기 공정을 포함한다. 일부 측면에서, 상류 세포 배양 공정은 관류 반응기 공정을 포함한다. 다른 측면에서, 상류 세포 배양 공정은 유가식 반응기 공정을 포함한다.
포유동물 세포 배양물에서, 세포 배양 배지는 최대 약 100가지의 화합물 및 그 초과를 포함할 수 있다. 예를 들어, 탄수화물 (예를 들어 이화작용 반응에 의해 에너지 생성을 위해 또는 보급대사 반응에 의해 빌딩 블록으로서), 아미노산 (예를 들어 치료용 단백질 생산의 경우 세포 단백질 및 산물에 대한 빌딩 블록), 지질 및/또는 지방산 (예를 들어 세포 막 합성을 위해), DNA 및 RNA (예를 들어 성장 및 세포 유사분열 및 감수분열을 위해), 비타민 (예를 들어 효소 반응을 위한 보조 인자로서), 미량 원소, 상이한 염, 성장 인자, 담체, 수송체 등. 이들 성분 또는 화합물 그룹은 기술적인 배양 환경에서 포유동물 세포의 복잡한 영양분 요건을 충족시키기 위해 필요하다. 일부 측면에서, 본 개시내용에 사용되는 배양 배지는 모든 성분 및 모든 농도가 공개된 전형적인 세포 배양 배지, 예를 들어 DMEM (둘베코(Dulbecco) 변형된 이글(Eagle) 배지)를 포함한다. 이러한 세포 배양 배지의 개발은 1950년대 후반으로 거슬러 올라가고, 학술 문헌에서 포괄적으로 설명되어 있다. 또 다른 예는 1970년대에 개발된 햄(Ham) F12 (햄 영양분 혼합물 F12), 또는 이러한 전형적인 세포 배양물의 혼합물/변형, 예컨대 1970년대 및 1980년대에 개발된 DMEM:F12 (둘베코 변형된 이글 배지/햄 영양분 혼합물 F12)이다. 본 개시내용에 유용한 또 다른 배양 배지는 RPMI를 포함한다. RPMI는 1970년대에 무어(Moore) 등에 의해 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute)에서 개발되었다 (따라서 약어 RPMI). 동물 세포 배양물에서 상이한 변형, 예를 들어 RPMI-1640이 사용된다. 이들 여러 전형적인 배지가 수십년 전에 개발되었지만, 이들 제형은 여전히 오늘날 발생하는 많은 세포 배양 연구에 대한 기초를 형성하며, 각각의 화합물에 대해 완전하게 공지된 조성 및 완전하게 공지된 농도를 갖는 배지에 대해 동물 세포 배양에서 최신 기술을 나타낸다. 이들 모든 배지는 상업적으로 입수가능하며, 공급업체로부터 (예를 들어 시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)로부터) 구입할 수 있다.
다른 측면에서, 본 개시내용에 유용한 세포 배양 배지에는 상업적인 세포 배양 배지, 예를 들어 기초 배지 (ActiCHO P) 및 공급 배지 (ActiCHO 공급물 A + B)로 이루어진 상업적으로 입수가능한 배지 ActiCHO (PAA에 의해)가 포함되며, 이는 공급자 정의에 따라 화학적으로 한정된다 (동물 유래된 물질, 성장 인자, 펩티드, 및 펩톤이 없는 단일 화학물질만). 상기 두 공급물은 농축된 아미노산, 비타민, 염 미량 원소 및 탄소 공급원 (공급물 A), 및 농축된 형태의 선택된 아미노산 (공급물 B)으로 이루어진다. 일부 측면에서, 배양 배지는 Ex-Cell CD CHO (에스에이에프씨 바이오사이언시즈(SAFC Biosciences))를 포함한다. 이 배지에는 동물성 성분이 없고, SAFC에 따라 화학적으로 한정되고, 혈청-무함유이며, 제형 또한 독점적이다. 다른 측면에서, 배양 배지는 CD CHO (라이프 테크놀로지즈(Life technologies))를 포함한다. 이 배지는 단백질 무함유, 혈청-무함유이며, 라이프 테크놀로지즈에 따라 화학적으로 한정된다. 이는 동물, 식물 또는 합성 기원의 단백질 / 펩티드, 또는 정의되지 않은 용해물/가수분해물을 함유하지 않는다. 이 CD CHO 기초 배지는 효율적인 공급물(Efficient Feed) A, B 및 C로 명명되는 공급 배지와 조합될 수 있다. 상기 공급물은 동물 기원-무함유이며, 성분들은 보다 높은 농도로 함유된다. 상기 공급물은 화학적으로 한정된다. 단백질, 지질, 성장 인자, 가수분해물, 및 미지의 조성을 갖는 성분이 사용되지 않는다. 이는 탄소원, 농축된 아미노산, 비타민 및 미량 원소를 함유한다. 상업적으로 입수가능한 또 다른 공급물은 셀 부스트(Cell Boost) 1-6의 이름으로 써모 피셔(Thermo Fisher)에 의해 입수될 수 있다. 이는 써모 피셔에 따라 화학적으로 한정되며, 단백질 무함유 및 동물 유래된 성분 무함유이다. 셀 부스트 1 및 2는 아미노산, 비타민, 및 글루코스를 함유한다. 셀 부스트 3은 아미노산, 비타민, 글루코스, 및 미량 원소를 함유한다. 셀 부스트 4는 아미노산, 비타민, 글루코스, 미량 원소, 및 성장 인자를 함유한다. 그리고, 셀 부스트 5 및 6은 아미노산, 비타민, 글루코스, 미량 원소, 성장 인자, 지질, 및 콜레스테롤을 함유한다.
아미노산은 세포 단백질을 위해, 및 재조합 단백질 또는 단백질-유래된 물질 둘 다의 경우 산물의 생산을 위해 단백질 합성에서 필수적인 역할을 한다. 예를 들어, 단백질은 단일 아미노산 분자로부터 세포 기구에 의해 합성되어, 더 큰 단백질 또는 단백질 복합체를 형성한다. 포유동물 세포 배양에서, 필수 아미노산은 세포 배양 배지와 함께 제공될 필요가 있으며, 이는 포유동물 세포가 다른 전구체 및 빌딩 블록으로부터 필수 아미노산을 합성할 수 없기 때문이다. 아미노산은 이들이 다른 생물학적 분자와 상호작용하게 하는 2가지 관능기 (아미노 기 및 산성 기)를 갖기 때문에, 이들 분자는 생화학적으로도 중요하다. 이러한 이유로, 아미노산을 함유하는 세포 배양 배지는 종종 다양한 (한정된 및 한정되지 않은) 소형 펩티드, 가수분해물, 단백질, 및 상이한 기원으로부터의 단백질 혼합물 (동물 유래된, 식물 유래된 또는 화학적으로 한정된)로도 보충된다. 따라서, 하나 이상의 아미노산은 본 개시내용에 따른 라만 분광법을 위한 마커로서 사용될 수 있다.
본 개시내용에 유용한 하나 이상의 아미노산에는 보편적인 유전 암호에 의해 코딩되며 전형적으로 L-형태인 20가지 천연 아미노산이 포함된다 (즉, L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파라긴, L-아스파르트산, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이소류신, L-류신, L-리신, L- 메티오닌, L- 페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신 및 L-발린). 다른 측면에서, 본 개시내용을 위한 하나 이상의 아미노산에는 비-천연 발생 아미노산이 포함된다. 아미노산 (예를 들어, 글루타민 및/또는 티로신)은 증가된 안정성 및/또는 가용성을 갖는, 예를 들어 L-알라닌 (L-ala-x) 또는 L-글리신 연장 (L-gly-x), 예컨대 글리실-글루타민 및 알라닐-글루타민을 함유하는 디펩티드로서 제공될 수 있다. 추가로, 시스테인은 L-시스틴으로도 제공될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "아미노산"은 그의 모든 상이한 염, 예컨대 (비제한적으로) L-아르기닌 모노히드로클로라이드, L-아스파라긴 일수화물, L-시스테인 히드로클로라이드 일수화물, L-시스틴 디히드로클로라이드, L-히스티딘 모노히드로클로라이드 이수화물, L-리신 모노히드로클로라이드 및 히드록실 L-프롤린, L-티로신 이나트륨 탈수화물을 포함한다. 가용성, 삼투성, 안정성, 순도와 같은 특징이 손상되지 않는다면 아미노산의 정확한 형태는 본 개시내용에서 중요하지 않다. 일부 측면에서, L-아르기닌은 L-아르기닌 x HCI로서 사용되고, L-아스파라긴은 L-아스파라긴 x H20로서 사용되고, L-시스테인은 L-시스테인 x HCI x H20로서 사용되고, L-시스틴은 L-시스틴 x 2 HCI로서 사용되고, L-히스티딘은 L-히스티딘 x HCI x H20로서 사용되고, L-티로신은 L-티로신 x 2 Na x 2 H20로서 사용되며, 여기서 각각의 아미노산 형태는 서로 독립적으로 또는 함께 또는 이들의 임의의 조합으로 선택될 수 있다. 관련 아미노산 중 1개 또는 2개를 포함하는 디펩티드 또한 포함된다. 예를 들어, 보관 시에 또는 장기간 배양 동안에 개선된 안정성 및 감소된 암모늄 축적을 위해 L-글루타민은 종종 디펩티드, 예컨대 L-알라닐-L-글루타민의 형태로 세포 배양 배지에 첨가된다.
일부 측면에서, 본 발명의 방법을 이용하여 하나 이상의 폴리펩티드를 생산한다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 항체 또는 그의 항원 결합 부분을 포함한다. 다른 측면에서, 폴리펩티드는 이뮤노글로불린 성분 (예를 들어 Fc 성분) 및 성장 인자 (예를 들어 인터류킨)로 이루어진 융합 단백질, 항체 또는 임의의 항체 유래된 분자 포맷 또는 항체 단편을 포함한다.
다른 측면에서, 폴리펩티드는 천연 발생 단백질을 포함한다. 다른 측면에서, 폴리펩티드는 단백질, 폴리펩티드, 그의 단편, 펩티드, 융합 단백질 (이들 모두는 선택된 숙주 세포에서 발현될 수 있음), 예를 들어 재조합 단백질, 즉, 분자 클로닝으로부터 생성되는 재조합 DNA에 의해 코딩되는 단백질을 포함한다. 이러한 폴리펩티드는 항체, 효소, 시토카인, 림포카인, 부착 분자, 수용체, 및 그의 유도체 또는 단편, 및 효능제 또는 길항제로서 작용할 수 있고/거나 치료적으로 또는 진단적으로 사용되거나 또는 연구 시약으로서 사용될 수 있는 임의의 다른 폴리펩티드일 수 있다. 일부 측면에서, 폴리펩티드는 분비된 단백질 또는 단백질 단편, 예를 들어 항체 또는 항체 단편 또는 Fc-융합 단백질이다.
일부 측면에서, 폴리펩티드는 배양된 세포로부터 생산된다. 일부 측면에서, 세포는 원핵생물이다. 박테리아 시스템에서, 수많은 발현 벡터는 발현될 단백질 분자에 대해 의도된 용도에 따라 유리하게 선택될 수 있다. 예를 들어, 다량의 이러한 단백질이 생산되는 경우, 단백질 분자의 제약 조성물의 생성을 위해, 높은 수준의 단백질 산물 발현을 지시하는 용이하게 정제된 벡터가 바람직할 수 있다.
다른 측면에서, 세포는 진핵생물이다. 일부 측면에서, 세포는 포유동물 세포이다. 일부 측면에서, 세포는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HEK293 세포, 마우스 골수종 (NS0), 새끼 햄스터 신장 세포 (BHK), 원숭이 신장 섬유모세포 세포 (COS-7), 마딘-다비(Madin-Darby) 소 신장 세포 (MDBK), 및 이들의 임의의 조합물로부터 선택된다. 한 측면에서, 세포는 중국 햄스터 난소 세포이다. 일부 측면에서, 세포는 곤충 세포, 예를 들어 스포도테라 프루기페르다(Spodoptera frugiperda) 세포이다.
다른 측면에서, 세포는 포유동물 세포이다. 이러한 포유동물 세포에는 CHO, VERO, BHK, Hela, MDCK, HEK 293, NIH 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O 및 T47D, NS0, CRL7O3O, COS (예를 들어, COS1 또는 COS), PER.C6, VERO, HsS78Bst, HEK-293T, HepG2, SP210, R1.1, B-W, L-M, BSC1, BSC40, YB/20, BMT10 및 HsS78Bst 세포가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 포유동물 세포는 CHO 세포이다. 일부 측면에서, CHO 세포는 CHO-DG44, CHOZN, CHO/dhfr-, CHOK1SV GS-KO, 또는 CHO-S이다. 일부 측면에서, CHO 세포는 CHO-DG4이다. 일부 측면에서, CHO 세포는 CHOZN이다.
본원에 개시된 다른 적합한 CHO 세포주에는 CHO-K (예를 들어, CHO K1), CHO pro3-, CHO P12, CHO-K1/SF, DUXB11, CHO DUKX; PA-DUKX; CHO pro5; DUK-BII 또는 이들의 유도체가 포함된다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 따른 배양 배지에 의해 생산된 단백질은 융합 단백질이다. "융합" 또는 "융합" 단백질은 천연에서는 천연적으로 연결되지 않는 제2 아미노산 서열에 프레임 내에서 연결된 제1 아미노산 서열을 포함한다. 별개의 단백질에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열이 함께 융합 폴리펩티드에서 결합될 수 있거나, 또는 동일한 단백질에 정상적으로 존재하는 아미노산 서열이 융합 폴리펩티드에서 새로운 배열로 배치될 수 있다. 융합 단백질은 예를 들어 화학적 합성에 의해 생성되거나, 또는 펩티드 영역이 원하는 관계로 코딩된 폴리뉴클레오티드를 생성하고 번역함으로써 생성된다. 융합 단백질은 공유의 비-펩티드 결합 또는 비-공유 결합에 의해 제1 아미노산 서열과 회합된 제2 아미노산 서열을 추가로 포함할 수 있다. 전사/번역 시, 단일 단백질이 제조된다. 이러한 방식으로, 다중 단백질 또는 그의 단편이 단일 폴리펩티드에 혼입될 수 있다. "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 요소 사이의 기능적 연결을 의미하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 두 폴리펩티드 사이의 작동가능한 영역은 두 폴리펩티드를 프레임 내에서 함께 융합시켜 단일 폴리펩티드 융합 단백질을 생산한다. 특정한 측면에서, 융합 단백질은 하기에서 추가로 상세하게 논의되는 바와 같이 링커 서열을 포함할 수 있는 제3 폴리펩티드를 추가로 포함한다.
일부 측면에서, 본 개시내용에 따른 배양 배지에 의해 생산된 단백질은 항체이다. 항체에는 예를 들어 모노클로날 항체, 재조합에 의해 생산된 항체, 단일특이적인 항체, 다중특이적인 항체 (예컨대 이중특이적인 항체), 인간 항체, 인간화 항체, 키메라 항체, 이뮤노글로불린, 합성 항체, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄 분자를 포함하는 사량체 항체, 항체 경쇄 단량체, 항체 중쇄 단량체, 항체 경쇄 이량체, 항체 중쇄 이량체, 항체 경쇄-항체 중쇄 쌍, 인트라바디, 이종접합체성 항체, 단일 도메인 항체, 1가 항체, 단일 쇄 항체 또는 단일 쇄 Fvs (scFv), 낙타화 항체, 아피바디, Fab 단편, F(ab')2 단편, 디술피드-연결된 Fvs (sdFv), 항-이디오타입 (항-Id) 항체 (예를 들어, 항-항-Id 항체), 및 상기 임의의 것의 항원-결합 단편이 포함될 수 있다. 특정한 측면에서, 본원에 기재된 항체는 폴리클로날 항체 집단을 지칭한다. 항체는 이뮤노글로불린 분자의 임의의 유형 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 또는 IgY), 임의의 클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 또는 IgA2), 또는 임의의 서브클래스 (예를 들어, IgG2a 또는 IgG2b)일 수 있다. 특정한 측면에서, 본원에 기재된 항체는 IgG 항체, 또는 그의 클래스 (예를 들어, 인간 IgG1 또는 IgG4) 또는 서브클래스이다. 특정한 측면에서, 항체는 인간화 모노클로날 항체이다. 또 다른 특정한 측면에서, 항체는 인간 모노클로날 항체, 바람직하게는 이뮤노글로불린이다. 특정한 측면에서, 본원에 기재된 항체는 IgG1, 또는 IgG4 항체이다.
일부 측면에서, 본원에 기재된 단백질은 "항원-결합 도메인", "항원-결합 영역", "항원-결합 단편" 및 유사한 용어이며, 이는 항체 분자 상에서 항원에 대한 그의 특이성을 부여하는 아미노산 잔기 (예를 들어, 상보성 결정 영역 (CDR))를 포함하는 항체 분자의 부분을 지칭한다. 항원-결합 영역은 임의의 동물 종, 예컨대 설치류 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 햄스터) 및 인간으로부터 유래될 수 있다.
일부 측면에서, 단백질은 항-LAG3 항체, 항-CTLA-4 항체, 항-TIM3 항체, 항-NKG2a 항체, 항-ICOS 항체, 항-CD137 항체, 항-KIR 항체, 항-TGFβ 항체, 항-IL-10 항체, 항-B7-H4 항체, 항-Fas 리간드 항체, 항-메소텔린 항체, 항-CD27 항체, 항-GITR 항체, 항-CXCR4 항체, 항-CD73 항체, 항-TIGIT 항체, 항-OX40 항체, 항-PD-1 항체, 항-PD-L1 항체, 항-IL8 항체, 또는 이들의 임의의 조합물이다. 일부 측면에서, 단백질은 아바타셉트(Abatacept) NGP이다. 다른 측면에서, 단백질은 벨라타셉트(Belatacept) NGP이다.
일부 측면에서, 단백질은 항-GITR (글루코코르티코이드-유도된 종양 괴사 인자 수용체 패밀리-관련 유전자) 항체이다. 일부 측면에서, 항-GITR 항체는 6C8의 CDR 서열을 갖고, 예를 들어 WO2006/105021에 기재된 바와 같이 6C8의 CDR을 갖는 인간화 항체; WO2011/028683에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체; JP2008278814에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체, WO2015/031667, WO2015/187835, WO2015/184099, WO2016/054638, WO2016/057841, WO2016/057846, WO 2018/013818에 기재된 항-GITR 항체의 CDR을 포함하는 항체, 또는 본원에 기재되거나 또는 언급된 다른 항-GITR 항체가 있으며, 이들 모두는 그들의 전문이 본원에 참고로 포함된다.
다른 측면에서, 단백질은 항-LAG3 항체이다. LAG-3으로도 공지된 림프구-활성화 유전자 3은 인간에서 LAG3 유전자에 의해 코딩되는 단백질이다. 1990년도에 발견된 LAG3은 T 세포 기능에 대해 다양한 생물학적 효과를 갖는 세포 표면 분자이다. 이는 면역 체크포인트 수용체이며, 따라서 암 및 자가면역 장애에 대한 새로운 치료를 개발하고자 하는 제약 회사의 다양한 약물 개발 프로그램의 표적이다. 가용성 형태에서, 이는 자체적으로 암 약물로도 개발되고 있다. 항-LAG3 항체의 예에는 WO 2017/087901 A2, WO 2016/028672 A1, WO 2017/106129 A1, WO 2017/198741 A1, US 2017/0097333 A1, US 2017/0290914 A1, 및 US 2017/0267759 A1 (이들 모두는 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 단백질은 항-CXCR4 항체이다. CXCR4는 G1에 커플링된 7 막횡단 단백질이다. CXCR4는 조혈 기원의 세포에서 널리 발현되고, CD4+와 함께 인간 면역결핍 바이러스 1 (HIV-1)에 대한 주요 공동-수용체이며, 문헌 [Feng, Y., Broeder, C.C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996) Science 272, 872-877]을 참고한다. 항-CXCR4 항체의 예에는 WO 2009/140124 A1, US 2014/0286936 A1, WO 2010/125162 A1, WO 2012/047339 A2, WO 2013/013025 A2, WO 2015/069874 A1, WO 2008/142303 A2, WO 2011/121040 A1, WO 2011/154580 A1, WO 2013/071068 A2, 및 WO 2012/175576 A1 (이들 모두는 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 단백질은 항-CD73 (엑토-5'-뉴클레오티다제) 항체이다. 일부 측면에서, 항-CD73 항체는 아데노신의 형성을 억제한다. AMP에서 아데노신으로의 분해는 암의 개시 및 진행을 촉진시키는 종양 미세환경 내에서 면역억제된 및 혈관형성전 니쉐를 생성한다. 항-CD73 항체의 예에는 WO 2017/100670 A1, WO 2018/013611 A1, WO 2017/152085 A1, 및 WO 2016/075176 A1 (이들 모두는 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 단백질은 항-TIGIT (Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T 세포 면역수용체) 항체이다. TIGIT는 이뮤노글로불린 단백질의 PVR (폴리오바이러스 수용체) 패밀리의 구성원이다. TIGIT는 여포성 B 헬퍼 T 세포 (TFH)를 비롯하여 몇몇 클래스의 T 세포에서 발현된다. 단백질은 높은 친화도로 PVR에 결합하는 것으로 제시되어 있고; 이 결합은 TFH와 수지상 세포 사이의 상호작용을 보조하여 T 세포 의존성 B 세포 반응을 조절하는 것으로 생각된다. 항-TIGIT 항체의 예에는 WO 2016/028656 A1, WO 2017/030823 A2, WO 2017/053748 A2, WO 2018/033798 A1, WO 2017/059095 A1, 및 WO 2016/011264 A1 (이들 모두는 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨)의 항체가 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 단백질은 항-OX40 (즉, CD134) 항체이다. OX40은 종양 괴사 인자 (TNF) 리간드 패밀리의 시토카인이다. OX40은 T 세포 항원-제시 세포 (APC) 상호작용에서 기능하고, 내피 세포에 대한 활성화된 T 세포의 부착을 매개한다. 항-OX40 항체의 예에는 WO 2018/031490 A2, WO 2015/153513 A1, WO 2017/021912 A1, WO 2017/050729 A1, WO 2017/096182 A1, WO 2017/134292 A1, WO 2013/038191 A2, WO 2017/096281 A1, WO 2013/028231 A1, WO 2016/057667 A1, WO 2014/148895 A1, WO 2016/200836 A1, WO 2016/100929 A1, WO 2015/153514 A1, WO 2016/002820 A1, 및 WO 2016/200835 A1 (이들 모두는 그들의 전문이 본원에 참고로 포함됨)이 포함되나 이에 제한되지는 않는다.
일부 측면에서, 단백질은 항-IL8 항체이다. IL-8은 호중구, 호염기구 및 T-세포를 유인하지만 단핵구는 유인하지 않는 화학주성 인자이다. 이는 또한 호주구 활성화에 관여한다. 이는 염증성 자극에 대한 반응으로 몇몇 세포 유형으로부터 방출된다.
일부 측면에서, 단백질은 아바타셉트 (오렌시아(ORENCIA)®로 판매됨)이다. 아바타셉트 (본원에서 Aba로도 약칭됨)는 T 세포의 면역 활성을 방해함으로써 류마티스성 관절염과 같은 자가면역 질환을 치료하기 위해 사용되는 약물이다. 아바타셉트는 CTLA-4의 세포외 도메인에 융합된 이뮤노글로불린 IgG1의 Fc 영역으로 구성된 융합 단백질이다. T 세포가 활성화되고 면역 반응을 생성하도록 하기 위해, 항원 제시 세포는 T 세포에 2가지 신호를 제시해야 한다. 이들 신호 중 하나는 항원과 조합된 주요 조직적합성 복합체 (MHC)이고, 다른 신호는 CD80 또는 CD86 분자 (B7-1 및 B7-2로도 공지됨)이다.
일부 측면에서, 단백질은 벨라타셉트 (상표명 눌로직스(NULOJIX)®)이다. 벨라타셉트는 CTLA-4의 세포외 도메인에 연결된 인간 IgG1 이뮤노글로불린의 Fc 단편으로 구성된 융합 단백질이며, 이는 T 세포 공동자극의 조절에 중요한 분자이며, T-세포 활성화 과성을 선택적으로 차단한다. 이는 표준 면역 억제 레지멘, 예컨대 칼시뉴린 억제제에 의해 생성된 독성을 제한하면서 연장된 그래프트 및 이식편 생존을 제공하도록 의도된다. 이는 아바타셉트 (오렌시아®)와 단지 2개의 아미노산만이 상이하다.
본 개시내용은 또한 세포 배양 배지를 분석할 수 있는 장치를 사용하여 라만 스펙트럼의 측정을 수행하기 위한 장치에 관한 것이다. 일부 측면에서, 장치는 세포 배양 배지 중에 하나 이상의 성분의 혼합물을 포함하고, 장치는 세포 배양 배지 샘플을 보유하기 위한 세포 배양 배지 샘플 홀더; 세포 배양 배지 샘플 홀더에 의해 보유된 세포 배양 배지 샘플을 조명하기 위한 레이저 공급원; 세포 배양 배지 샘플 홀더에 의해 보유된 세포 배양 배지 샘플에서 세포 배양 배지 중 하나 이상의 성분의 움직임을 검출하도록 위치된 입자 움직임 검출기; 및 레이저 공급원에 의한 조명으로부터 생성된 세포 배양 배지 샘플로부터의 스펙트럼을 수신하도록 위치된 스펙트럼 검출기를 포함한다.
본 개시내용의 다양한 측면이 하기 서브섹션에서 추가로 상세하게 기재된다. 본 개시내용은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되며, 이는 추가로 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다. 본 출원에 걸쳐 인용된 모든 참고문헌의 내용은 명시적으로 본원에 참고로 포함된다.
실시예
배지 조성을 "핑거프린팅"하는 특정한 라만 기술의 능력 및 이러한 조성의 변화율을 일련의 연구에서 평가하였다. 결과는 이 기술이 배지 제조로 인한 오류를 검출하고, 노화됨에 따라 배지에서의 변화를 모니터링하고, 상이한 방식의 분해 (광 대 열)로 인한 변화를 검출할 수 있음을 제시한다. 분해 조건에 적용된 배지는 또한 생산 생물반응기 작동에서 테스트되어, 라만-검출된 분해의 기능적 확인을 제공하였다. 라만 모델은 배지 내에서 특정한 아미노산 및 비타민을 정량적으로 모니터링하도록 구축되었고, 모델의 정확도는 공지된 농도에 대해 평가되었다. 하기 실시예를 기반으로 하여, 라만은 배지 변화를 모니터링하기 위한 분석 도구로서 이용될 수 있고, 라만 기반 모델은 배지 내에서 각각의 성분의 수준을 모니터링할 수 있다.
실시예 1
장치 구성
라만은 온라인 또는 오프라인으로 제공되는 샘플로부터의 측정을 제공할 수 있다. 온라인 측정의 경우, 본 발명자들은 스테인리스 스틸 T 커넥터를 사용하였다 (도 2A 및 2B). 오염을 방지하기 위해, 먼저 부착된 튜빙 (하단) 및 라만 프로브 (상단)를 갖는 T-커넥터 구성을 오토클레이빙한 다음, 멸균 튜브 연결 절차에 따라 백에 연결하였다. 연동 펌프를 이용하여 배지를 커넥터를 통해 흘려 보내고, 데이터는 조정가능한 시간 증분으로 수집하였다. 오프라인 측정 동안에, 20mL 유리 바이알 또는 200mL 비커를 사용하여 배지를 수집하였다. 두 컨테이너 모두 덮어서 라만 산란에 대한 광 간섭을 제거하였다 (도 3). 공급 및 기초 배지 둘 다 평가하였다. 기초 배지는 접종 시에 공정에 있는 배지이다. 공급 배지는 더 높은 농도의 여러 성분을 가지며, 생산 공정에 걸쳐 배양물에 첨가된다.
노출 조건을 최적화하여, 12 분에 걸쳐 수집된 35개 데이터 포인트 (20 초마다 1개 데이터 포인트)로부터 평균 라만 결과를 수득하였다. 평균 데이터는 합리적인 시간 내에 신호를 포화시키지 않고 최적의 해상도를 제공하였다. 각각의 측정의 라만 스펙트럼은 다변량 분석에 의해 분석되었다.
다변량 분석은 여러 변수를 동시에 해석하는데 이용되는 기술이다. 주성분 분석 (PCA)은 더 큰 세트의 변수를 필요한 정보를 함유하는 더 적은 세트로 좁히는데 도움이 될 수 있는 다변량-기반 기술이다. PCA에서, 주성분 (PC)으로 명명되는 직교축 변수는 미가공 라만 스펙트럼이 차지하는 동일한 데이터 공간에서 생성되어, 원래의 변수 (즉, 파수)의 선형 조합을 형성한다. 첫번째 PC 값은 데이터에서의 변동성을 가능한 한 많이 설명하고, 각각의 이어지는 값은 나머지 변동성을 가능한 한 많이 설명한다. PC 점수는 스펙트럼이 유사한지 또는 상이한지를 제시할 수 있으며, 즉, 두 측정의 라만 스펙트럼이 같으면 PC 점수를 함께 그룹화할 것이고, 그렇지 않으면 측정이 분기될 것이다. PC 로딩 플롯은 특정한 PC에 대한 각각의 파수의 기여를 나타내고, 주요 차이(들)이 어디에서 나오는지를 알려준다. 모든 계산은 매트랩(Matlab) (v. 8.6.2 )에 의해 보완된 PLS_Toolbox를 이용하여 수행되었다.
PCA를 수행하기 전에 미가공 라만 데이터를 먼저 전처리하여, 데이터에서 관련이 없고 고의적인 변동을 감소시키나 또는 제거하였다. 전처리는 주로 기준선을 오프셋하고 백그라운드 노이즈를 제거하기 위해 필요하고, 즉, 잠재적인 스케일링을 제거하고, 효과 및 변수 중심화를 획득하기 위해 데이터를 정규화한다. 이 연구에서, 최적의 PCA 결과는 하기 전처리 단계를 이용하여 수득되었다: 기준선을 제거하기 위해 사비츠키-골레이(Savitzky-Golay) 알고리즘을 이용하여 스펙트럼의 1차 도함수를 취하고, 여과기 폭이 15로 피팅된 2차 다항식을 이용하고; 표준 정규 변량 (SNV)을 이용하여 스펙트럼을 정규화하고; 차이를 전체 원래 데이터 매트릭스와 비교하기 위해 데이터를 평균 중심화함.
실시예 2
침전으로 인한 배지에서의 변화를 실시간 모니터링
상기 개략된 라만 기술을 이용하여, 상기 기재되고 도 2에 제시된 장치를 사용하여 공급 배지를 실시간으로 모니터링하였다. 구성은 상기 기재된 바와 같다. 상기 기재된 접근법을 이용하여 라만 측정값을 3 시간마다 수득하고, 상기 기재된 바와 같이 PCA를 미가공 라만 스펙트럼에 적용하여 4 일의 기간에 걸쳐 배지에서의 변화를 모니터링하였다.
이 실험에서, 분석을 위해 선택된 영역은 500-3000 cm-1이었으며, 이는 공급 배지 성분에서의 변화를 평가하는데 가장 적절한 범위이기 때문에다. 퍼센트 분산 플롯으로부터 결정되는 바와 같이 PC의 실험을 이용하여 라만 데이터의 스펙트럼 특징에서의 변화를 조사하였다. 데이터는 모든 스펙트럼 변동의 >99%가 PC1에 의해 설명될 수 있음을 제시하였다. 99.15%의 설명된 스펙트럼 변동을 갖는 첫번째 주성분인 PC1은 각각의 측정 동안의 변화가 포착된 도 3에 제시된다. PC1 점수는 대략 90 시간 (화살표로 표시됨)인 30번째 측정까지 유사하고, 이는 샘플이 처음 90 시간 동안에는 변하지 않았고, 그 후에 배지가 이 시점에서 물리적으로 변화하기 시작하여 PC1 점수의 편차를 일으켰음을 의미한다. 화학적 변화의 원인을 더 잘 이해하기 위해, PC1 로딩 값을 라만 이동에 대해 플롯하였다 (도 4). PC1 로딩 플롯은 PC1 점수 (y-축)에서 급격한 변화를 갖는 X-절편이 있는 주요 변화가 발생하는 파수를 나타낸다. 상응하는 파수는 도 4A 및 4B에서 표지된다. 이전의 경험으로부터, 변화가 L-티로신 침전으로 인한 것으로 가정되었다. 도 4B는 825, 984, 1179, 1200, 1326, 1613, 2931, 2967 및 3062cm-1에서 발생하는 티로신 결정에 대한 주요 라만 이동을 제시하며, 이는 PC1 로딩 플롯에서 관찰되는 라만 이동과 정확하게 일치하였다 (도 4A). 따라서, 이 라만 기술은 티로신의 정확하고 명확한 확인을 통해 배지 변화의 원인을 정확하게 확인할 수 있었다. 본 발명자들은 배지로부터 침전된 임의의 아미노산이 이 기술에 의해 유사한 효율로 모니터링될 수 있을 것으로 기대한다. 이 라만 기술이 배지 제조 오류를 검출하는 능력을 실험하였다. 인산나트륨은 성장 배지의 필수 성분이지만, 너무 많이 또는 너무 적게 첨가되면, 생성된 배지가 세포 성장에 유해할 수 있다. 따라서, 사용하기 전에 포스페이트 농도를 확인하는 능력을 갖는 것이 중요하다. 이 실시예에서, 배지에서의 인산나트륨의 양은 1.5 g/L의 정상 수준에서 측정되었고, 정상 수준의 2배 (3 g/L)와 비교하였다.
1.5g/L 인산나트륨을 포함하는 배지, 3g/L 인산나트륨을 포함하는 배지, 및 1.5, 2.25, 2.6 및 3 g/L 농도를 생성하는 이들 두 용액의 혼합물을 이 라만 기술에 의해 모니터링하였고, PCA 방법을 이용하여 데이터를 평가하였다. 인산나트륨은 ~1000cm-1에서 주요 라만 이동을 가지므로, 분석을 위해 선택된 영역은 700-1200 cm-1이었다. 데이터는 모든 스펙트럼 변동의 >93%가 처음 두 PC에 의해 포착되었음을 제시하였다. 도 5에 제시된 바와 같이, 첫번째 주성분인 PC1은 두 배지에 첨가된 포스페이트의 상대적인 양을 정확하게 측정할 수 있었다. 구체적으로, 인산나트륨의 수준은 PC1 점수와 간접적으로 상관관계가 있는 것으로 제시되었다. 상기 기술이 재현가능함을 제시하기 위해 1.5 및 3.0 g/L 샘플을 3회 실행하였다. 중요하게도, 데이터는 이 기술이 적절한 측정 표준이 주어지면 0.4g/L만큼 낮은 인산나트륨 수준 변화를 구별할 수 있음을 제시하였다. 각각의 라만 측정이 대략 12 분 걸렸음을 고려할 때, 오류를 발견하는데 필요한 노력은 배치 실패 시에 오류를 발견하는 것에 비해 시간 및 비용적 측면에서 더욱 유리할 것이다.
실시예 3
배지 안정성의 모니터링
배지 만료는 최적의 성장 속도에 도달하고, 전형적으로 시간 및 자원 집약적인 기능 테스팅에서 결정되는 예상된 산물 속성을 달성하는데 중요한 공정 파라미터이다. 기초 및 공급 배지의 보관 조건은 각각 2-8℃ 및 실온이며, 광으로부터 차단된다. 상기 기술이 안정성 마커를 확인하는 능력을 실험하기 위해, 표준 조건하에 보관된 기초 및 공급 배지로부터 수집된 라만 데이터를 2 및 4 주 동안 광 (10 KLux) 또는 열 (36℃)에 노출시킨 배지와 비교하였다. 이 라만 기술이 덜 극심한 상황하에서 배지 차이를 확인할 수 있는지를 알아보기 위해, 신선하게 제조된 및 노화된 (표준 보관 조건에서 3 개월) 배지 또한 비교하였다.
모든 배지 샘플을 이전에 기재된 바와 같이 라만 분광법으로 모니터링하고 PCA를 이용하여 평가하였다. 이 평가에서, 데이터를 먼저 PC 점수에 따라 그룹화하여 기초 배지와 공급 배지를 구분한 다음, PCA에 의해 평가하여 더 미묘한 변화를 추가로 분석하였다. 처음 2개의 PC 점수가 대부분의 변화를 나타낸다. 도 6은 PC1이 주요 변화의 ~96%를 포착하고, PC2가 ~3%를 포착한 PC1-PC2 평면을 제시한다. PC1은 기초 배지를 공급 배지로부터 분리시키고, 기초 배지는 양의 점수를 갖고, 공급 배지는 음의 점수를 갖는다 (도 6). 각각의 PC1 클러스터 내에서, 샘플은 PC2 축을 따라 그들의 분해 모드 및 분해 정도에 의해 구분되었다. 기초 및 공급 배지로부터의 샘플을 PCA에 의해 별도로 추가로 가공하였다. 기초 배지의 경우, 데이터는 두 PC 점수가 모든 스펙트럼 변동의 >80%를 설명하였고, 따라서 이들 두 점수가 앞으로 사용됨을 제시하였다. 대표적인 분산의 ~19%를 설명하는 PC2 점수를 도 7에서 다양한 조건하에 (4, 36℃, 광-노출 등) 배지 분해에 대해 플롯하였다. 이 분석에서, 높은 열은 유사한 시점 동안에 광에 비해 기초 배지에 더 많은 변화를 유발한다. 데이터는 또한 2-8℃의 표준 조건에서 3 개월 이하 동안의 보관이 변화를 유발하지 않음을 시사한다.
라만 분석을 공정 성능에 대한 영향과 연관시키기 위해, 라만에 의해 관찰된 PC 경향이 성능을 예측할 수 있는지 여부를 알아보기 위해, 신선한 및 분해된 기초 배지를 생성 작동에서 사용하였다.
생산 설정은 다음과 같았다: 15mL AMBR 미니 생물반응기를 사용하여, 14 일 생산 작동으로 모노클로날 항체를 생산하는 CHO 세포주를 성장시켰다. 기초의 효과를 평가하기 위해, 상이하게 분해된 기초를 세포 생산을 위해 사용하였고, 세포를 신선한 공급으로 하루에 한번 공급하였다. AMBR 생산 작동에 걸쳐 세포 생존력 및 생존 세포 밀도 (VCD)를 모니터링하는 베크만 코울터(Beckman Coulter)로부터의 바이-셀(Vi-CELL) 세포 생존 분석기에 AMBR 시스템을 연결하였다. 항체 역가를 로슈(Roche)로부터의 세덱스(CEDEX) HT에 의해 측정하였다. % 생존력, VCD 및 역가는 세포 생산 평가의 3가지 주요 특징이다.
Ambr15 기초 분해 연구로부터의 세포 성장 파라미터 결과가 도 8A-8C에 제시된다. 신선한 및 2-8℃에서 보관된 3 개월 노화된 기초 둘 다에서 세포 생존력 및 밀도는 매우 유사하였지만, 열 또는 광에 의해 분해된 기초 배지를 이용할 때 신선한 배지 대조군과 큰 차이가 관찰되었다. 역가를 평가할 때 유사한 결과가 관찰되었지만, 4 주간의 열은 2 주간의 광-노출에 비해 세포 성장에 대해 악화 효과를 일으켰고, 이는 라만 데이터와 비교할 때 본 발명자들이 예상한 것과 반대였다. 이러한 불일치는 광 및 열이 상이한 메카니즘에 의해 분해시켜서, 반드시 동일한 배지 성분을 분해시키지 않을 것이라는 점을 주목함으로써 설명될 수 있다. 라만은 성분이 무엇인지에 관계없이 샘플의 변화를 포착하는 반면에, 생산 결과는 세포에 대한 분해된 성분의 효과를 제시한다. 이 데이터는 세포가 광보다는 열에 의해 분해된 성분(들)에 의해 더 많은 영향을 받았음을 시사한다.
이들 변화를 추가로 이해하기 위해, 역상 HPLC 기술을 이용하여 각각의 분해된 배지의 아미노산 함량을 측정하였다. 결과는 Cys, Met, Trp 및 His가 분해에 가장 큰 영향을 받는 배지-함유 아미노산인 반면에, Met, Trp 및 His가 2 주간의 광 분해에 의해 대부분 분해되었고, Cys가 광 효과로 인해 변하지 않았음을 제시하였다. 한편, Cys는 열로 인해 분해된 유일한 아미노산이었고, 다른 아미노산은 유의한 영향을 받지 않았다. 도 8A-8C는 각각 2 및 4 주에 걸친 광 또는 열 노출 동안 기초 배지에서의 이들 4가지 아미노산의 수준에서의 변화를 나타낸다. 시스테인 형태는 배지 pH에 영향을 미칠 수 있고, 이는 필요한 배지 성분이다. 따라서, 열로 인한 Cys 분해는 도 8A-8C에서 관찰된 세포 성장 및 생산 프로파일에 영향을 미친 반면에, 한편 Met, Trp 및 His는 세포 성장에 유의한 영향을 미치지 않았다.
단백질 품질에 대한 기초 배지 분해의 영향 또한 iCIEF에 의해 평가하였다. iCIEF 결과는 광 분해 시에 Met, Trp 및 His의 분해와 함께 증가된 염기성 전하 변이체를 제시하였고, 다른 조건의 경우에는 그렇지 않았다. 라만 분광법은 공정 성능 및 산물 품질 둘 다에 중요한 배지 분해를 검출할 수 있다.
공급 배지에서의 변화는 PCA에서도 별도로 처리되었다. 공급 데이터에서 모든 스펙트럼 변동의 95% 초과는 두 PC에서 설명되었다. 도 10에서 PC1 점수 플롯은 RT에서 1 주 열 분해, 2 주 광 분해 및 3 개월 노화된 공급 샘플을 나타낸다 (공급에 대한 전형적인 보관 한계는 약 3 주임). 결과는 공급 배지가 분해됨에 따라 점수가 PC1 축의 음수 쪽을 향해 이동하였음을 제시하였다. 신선한 샘플로부터의 PC1 점수 변화의 비교는 스트레스 조건에 비해 RT에서 3 개월 동안 더 많은 분해가 관찰되었음을 제시하였다. 2 주간의 광 노출은 그룹의 가장 적은 분해를 가졌다.
신선한 기초 배지 및 신선한 및 노화된 공급물을 사용하여 14 일 작동 동안에 15mL AMBR 생물반응기를 사용하는 생산 작동을 위해 동일한 샘플을 선택하였다. 3가지 주요 생산 결과는 도 11A-11C에 제시된다. VCD 및 IgG 결과는 신선한 공급물을 사용하였을 때 더 높은 피크 VCD 및 더 높은 IgG 농도를 제시하였고, 광, RT 또는 열에 의해 분해된 공급물은 유사한 VCD를 나타내었지만 IgG 역가에는 영향을 미치지 않았다. 신선한 공급물이 전체 14 일 생산 동안에 사용되었을 때, %생존력은 96%보다 높게 유지되었지만, 분해된 공급물이 사용되었을 때에는, 생존력이 10 일째에 저하되기 시작하였다. 3 개월 노화된 공급물 및 1 주 열은 ~89%의 가장 낮은 생존력을 나타내었고, 2 주 광-노출된 공급물은 ~92%의 생존력을 가졌다. 이들 결과는 라만에 의해 관찰된 변화 및 후속적인 PCA 기반 데이터 평가와 일치하였다.
실시예 4
배지 성분의 정량적인 분석을 위한 모델 개발
이전 섹션에서, 배지 제조 오류 또는 분해로 인한 배지에서의 변화를 모니터링하는 라만의 능력을 논의하였다. 하기 연구는 배지의 특정한 성분의 변화율을 확인하기 위해 이 라만 기술의 정량적인 적용을 확장시키는데 전념하였다.
4가지 아미노산, 리신 (Lys), 히스티딘 (His), 아스파라긴 (Asn) 및 아르기닌 (Arg)이 배지에서 용이하게 용해되기 때문에, 이들을 이 연구를 위해 선택하였다. Lys, Asn 및 Arg가 형광 활성이 아니기 때문에, 여기 방출 분광법과 같은 다른 방법에 비해 라만과 같은 기술에 의해서만 직접적으로 검출될 수 있다. 평가된 비타민에는 시아노코발라민 (B12), 엽산 (B9), 니아신아미드 (B3), 피리독살 HCl (B6(AL)), 및 피리독신 HCl (B6(INE))이 포함되었다.
각각의 측정의 라만 스펙트럼은 부분 최소 제곱 (PLS) 분석으로 처리하였다. PLS는 예측과 관련된 입력 데이터에서 분산을 설명하는 인자, 즉, "잠재 변수" 또는 LV만을 확인한다. 이는 PC가 나타내는 상대적인 변량만을 기반으로 하여 그들이 선택되는 PCA와는 대조적이다.
각각의 실험에서, 상이한 농도의 상기 각각의 화학물질을 공급 배지에 섞은 다음, 라만에 의해 평가하였다. 이어서, 데이터를 PLS에 의해 가공하여 보정 예측 모델을 구축하였다. 예를 들어, 도 12A는 PLS 분석을 이용하여 LV1을 기반으로 하는 아르기닌에 대한 예측 보정 모델을 제시하고, 도 12B는 예측 모델을 만드는 것과 관련된 주요 변화와 상간관계가 있는 파수를 나타낸다. 도 12C는 아르기닌 용액의 라만 스펙트럼을 제시하고, 파선 화살표는 아르기닌에 대해 특이적인 주요 라만 이동 (도 12C)을 모델이 구축된 파장 (도 12B)과 연결하여, 모델이 아르기닌 수준에서의 변화를 기반으로 하여 구축되었음을 확인시켜 준다. 이러한 방식으로 각각의 화학물질에 대한 고유 프로파일이 제공될 수 있으며, 이 연구에서 동일한 접근법을 취하여 4가지 아미노산 및 4가지 비타민 각각에 대한 예측 모델을 구축하였다.
각각의 예측 모델의 정확도를 테스트하기 위해, 먼저 모델을 이용하여 관련 화학물질의 공지된 농도를 예측하였다. 이어서, 예측된 수준을 이론적 수준과 비교하여, 테스트한 각각의 배지 성분에 대한 모델의 정확도를 평가하였다. 도 13A-13H는 각각의 테스트한 배지 성분에 대한 예측 모델을 제시하며, 여기서 피팅 선은 공지된 농도의 각각의 화학물질을 사용하여 구축된 보정 곡선의 피팅 선이다. 점은 예측 모델을 구축하기 위해 사용된 농도 수준을 제시한다. 1:1 선은 측정치와 예측치 사이의 1:1 비를 나타내며, 따라서 예측 모델이 더 강할수록 피팅 및 1:1 선 오버레이가 더 양호하다. 도 13A-13H에서 다이아몬드는 이 연구에서 각각의 아미노산 및 비타민에 대한 미지 샘플의 예측된 수준을 제시한다. 이론치와 비교하여 실험 결과의 정확도를 나타내기 위한 또 다른 방식으로서, 도 14A-14H는 각각의 화학물질에 대한 % 회수를 제시한다. 여기서, 원은 보정 곡선을 구축하기 위해 사용된 포인트를 나타내고, 다이아몬드는 보정 곡선을 사용하여 예측된 농도이다. % 회수는 방정식 1을 사용하여 계산하였다:
Figure pct00001
파선은 80% 내지 120% 회수 경계를 제시한다. 전반적으로, 실험치는 이론치와 거의 일치하였으며, 전형적인 회수율은 이론치의 90 - 110%였다.
실시예 5
기준 스펙트럼의 생성
라만 분석에 유용한 아미노산 및 비타민에 대한 기준 스펙트럼의 생성을 수행하였고, 도 15A-15C에서 확인할 수 있다. 라만 스펙트럼 측정을 위한 최적의 노출 조건에 영향을 미치는 3가지 인자는 해상도, 신호 포화, 및 합리적인 스펙트럼 수집 시간이다. 해상도는 획득 횟수 및 획득당 노출 길이를 증가시킴으로써 개선될 수 있지만, 이들 값을 증가시키면 측정 기간이 증가할 것이고, 신호 포화를 초래할 수 있다. 3가지 조건을 초기에 평가하였고, 첫번째 조건은 총 대략 11 min 동안 각각 20 sec에서 35개 스펙트럼 획득의 공동 추가로 이루어지고, 두번째 조건은 총 대략 22 min 동안 각각 40 sec에서 35개 스펙트럼 획득의 공동 추가로 이루어지고, 세번째 조건은 총 대략 12 min 동안 각각 75 sec에서 10개 스펙트럼 획득의 공동 추가로 이루어졌다. 세번째 조건은 몇몇 경우에 과도한 노출을 나타내었고, 두번째 조건은 첫번째와 비교하여 신호 해상도에서 어떠한 개선도 나타내지 않았다. 최종적으로, 첫번째 조건이 라만 스펙트럼 수집 방법으로 선택되었다.

Claims (30)

  1. 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 배지를 핑거프린팅하고/거나 세포 배양 배지에 대한 최적 보관 조건을 확인하는 방법으로서, 하나 이상의 성분의 혼합물을 함유하는 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 하나 이상의 성분 각각과 연관된 하나 이상의 기준 스펙트럼 또는 기준 배지 조성물과 연관된 기준 스펙트럼과 비교하는 것인 방법.
  2. 라만 분광법을 이용하여 세포 배양 배지에서의 특정한 성분의 변화율을 확인하고/거나 세포 배양 배지의 변화를 실시간으로 모니터링하는 방법으로서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것 ("수집된 스펙트럼")을 포함하며, 여기서 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 하나 이상의 성분 각각과 연관된 기준 스펙트럼과 비교하는 것인 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 기준 스펙트럼에는 분해가 없는 것인 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지의 라만 스펙트럼을 수집하는 것이 약 1 시간마다, 약 2 시간마다, 약 3 시간마다, 약 4 시간마다, 약 5 시간마다, 약 6 시간마다, 약 7 시간마다, 약 8 시간마다, 약 9 시간마다, 약 10 시간마다, 약 11 시간마다, 약 12 시간마다, 약 13 시간마다, 약 14 시간마다, 약 15 시간마다, 약 16 시간마다, 약 17 시간마다, 약 18 시간마다, 약 19 시간마다, 약 20 시간마다, 약 21 시간마다, 약 22 시간마다, 약 23 시간마다, 또는 약 24 시간마다 수행되는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, 라만 스펙트럼이 적어도 5개 데이터 포인트, 적어도 10개 데이터 포인트, 적어도 15개 데이터 포인트, 적어도 16개 데이터 포인트, 적어도 17개 데이터 포인트, 적어도 18개 데이터 포인트, 적어도 19개 데이터 포인트, 적어도 20개 데이터 포인트, 적어도 21개 데이터 포인트, 적어도 22개 데이터 포인트, 적어도 23개 데이터 포인트, 적어도 24개 데이터 포인트, 적어도 25개 데이터 포인트, 적어도 26개 데이터 포인트, 적어도 27개 데이터 포인트, 적어도 28개 데이터 포인트, 적어도 29개 데이터 포인트, 적어도 30개 데이터 포인트, 적어도 31개 데이터 포인트, 적어도 32개 데이터 포인트, 적어도 33개 데이터 포인트, 적어도 34개 데이터 포인트, 적어도 35개 데이터 포인트, 적어도 36개 데이터 포인트, 적어도 37개 데이터 포인트, 적어도 38개 데이터 포인트, 적어도 39개 데이터 포인트, 적어도 40개 데이터 포인트, 적어도 41개 데이터 포인트, 적어도 42개 데이터 포인트, 적어도 43개 데이터 포인트, 적어도 44개 데이터 포인트, 적어도 45개 데이터 포인트, 적어도 46개 데이터 포인트, 적어도 47개 데이터 포인트, 적어도 48개 데이터 포인트, 적어도 49개 데이터 포인트, 또는 적어도 50개 데이터 포인트의 평균인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 각각의 데이터 포인트가 10 초마다, 15 초마다, 20 초마다, 25 초마다, 30 초마다, 35 초마다, 40 초마다, 45 초마다, 50 초마다, 55 초마다, 또는 60 초마다 측정되는 것인 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 라만 스펙트럼이 다변량 분석에 의해 분석되는 것인 방법.
  8. 제7항에 있어서, 다변량 분석이 주성분 분석 (PCA)인 방법.
  9. 제7항에 있어서, PCA가 라만 스펙트럼에 대한 PC 점수를 생성하는 것인 방법.
  10. 제7항에 있어서, 다변량 분석이 부분 최소 제곱 분석 (PLS)이며, 여기서 분석은 보정 예측 모델을 생성하는 것인 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지의 수집된 스펙트럼을 비교하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  12. 제11항에 있어서, 비교하는 것이 수집된 스펙트럼의 PC 점수를 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 비교하는 것을 포함하는 것인 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 상이할 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서, 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수보다 높을 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서, 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수보다 낮을 때 세포 배양 배지가 분해된 것으로 결정하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  16. 제13항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 분해되고, 분해된 세포 배양 배지가 비-분해된 배지와 비교하여 배양물에서 복수개의 세포의 생존력을 약 1%만큼, 약 2%만큼, 약 3%만큼, 약 4%만큼, 약 5%만큼, 약 6%만큼, 약 7%만큼, 약 8%만큼, 약 9%만큼, 또는 약 10%만큼 감소시키는 것인 방법.
  17. 제13항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 분해되고, 분해된 세포 배양 배지가 비-분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 생존 세포 밀도를 약 1 x 106세포/mL만큼, 약 2 x 106세포/mL만큼, 약 3 x 106세포/mL만큼, 약 4 x 106세포/mL만큼, 약 5 x 106세포/mL만큼, 약 6 x 106세포/mL만큼, 약 7 x 106세포/mL만큼, 약 8 x 106세포/mL만큼, 약 9 x 106세포/mL만큼, 약 10 x 106세포/mL만큼, 약 11 x 106세포/mL만큼, 또는 약 12 x 106세포/mL만큼 감소시키는 것인 방법.
  18. 제13항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 분해되고, 분해된 세포 배양 배지가 비-분해된 배지와 비교하여 배양물에서 세포의 항체 생산 역가를 약 0.1 g/L만큼, 약 0.2 g/L만큼, 약 0.3 g/L만큼, 약 0.4 g/L만큼, 약 0.5 g/L만큼, 약 0.6 g/L만큼, 약 0.7 g/L만큼, 약 0.8 g/L만큼, 약 0.9 g/L만큼, 약 1.0 g/L만큼, 약 1.1 g/L만큼, 약 1.2 g/L만큼, 약 1.3 g/L만큼, 약 1.4 g/L만큼, 약 1.5 g/L만큼, 약 1.6 g/L만큼, 약 1.7 g/L만큼, 약 1.8 g/L만큼, 약 1.9 g/L만큼, 약 2.0 g/L만큼, 약 2.1 g/L만큼, 약 2.2 g/L만큼, 약 2.3 g/L만큼, 약 2.4 g/L만큼, 약 2.5 g/L만큼, 약 2.6 g/L만큼, 약 2.7 g/L만큼, 약 2.8 g/L만큼, 약 2.9 g/L만큼, 또는 약 3.0 g/L만큼 감소시키는 것인 방법.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 기준 스펙트럼에 대한 마커가 세포 배양 배지에 첨가되는 것인 방법.
  20. 제19항에 있어서, 마커가 글루코스가 아닌 것인 방법.
  21. 제20항에 있어서, 마커가 락테이트가 아닌 것인 방법.
  22. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 아미노산 또는 비타민인 방법.
  23. 제22항에 있어서, 마커가 리신 (Lys), 아스파라긴 (Asn), 알라닌 (Ala), 아스파르트산 (Asp), 시스테인 (Cys), 글루탐산 (Glu), 글루타민 (Gln), 글리신 (Gly), 이소류신 (Ile), 류신 (Leu), 메티오닌 (Met), 페닐알라닌 (Phe), 프롤린 (Pro), 세린 (Ser), 트레오닌 (Thr), 트립토판 (Trp), 티로신 (Tyr), 또는 발린 (Val)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  24. 제23항에 있어서, 마커가 티로신인 방법.
  25. 제19항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 마커가 시아노코발라민 (B12), 엽산 (B9), 니아신아미드 (B3), 피리독살 HCl (B6(AL)), 및 피리독신 HCl (B6(INE))로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 라만 스펙트럼이 약 500 cm-1 내지 약 1700 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 1800 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 1900 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2000 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2100 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2200 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2300 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2400 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2500 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2600 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2700 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2800 cm-1, 약 500 cm-1 내지 약 2900 cm-1, 또는 약 500 cm-1 내지 약 3000 cm-1의 범위에서 측정되는 것인 방법.
  27. 제26항에 있어서, 라만 스펙트럼이 500 cm-1 내지 3000 cm-1의 범위에서 측정되는 것인 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 수집된 스펙트럼의 PC 점수가 기준 스펙트럼의 기준 PC 점수와 동일하거나 또는 약 10 이하만큼, 약 9 이하만큼, 약 8 이하만큼, 약 7 이하만큼, 약 6 이하만큼, 약 5 이하만큼, 약 4 이하만큼, 약 3 이하만큼, 약 2 이하만큼, 또는 약 1 이하만큼 유사할 때 세포 배양 배지가 안정한 것으로 결정하는 것을 포함하는 방법.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 세포 배양 배지가 약 8 일 동안, 약 9 일 동안, 약 10 일 동안, 약 11 일 동안, 약 12 일 동안, 약 15 일 동안, 약 16 일 동안, 약 17 일 동안, 약 18 일 동안, 약 19 일 동안, 약 20 일 동안, 약 21 일 동안, 약 22 일 동안, 약 23 일 동안, 약 24 일 동안, 약 25 일 동안, 약 26 일 동안, 약 27 일 동안, 약 28 일 동안, 약 29 일 동안, 약 30 일 동안, 약 1 개월 동안, 약 1.5 개월 동안, 약 40 일 동안, 약 50 일 동안, 약 60 일 동안, 약 2 개월 동안, 약 70 일 동안, 약 80 일 동안, 약 90 일 동안, 약 3 개월 동안, 약 100 일 동안, 약 110 일 동안, 약 120 일 동안, 약 4 개월 동안, 약 5 개월 동안, 또는 약 6 개월 동안의 보관을 위해 결정되는 것인 방법.
  30. 세포 배양 배지 중에 하나 이상의 성분의 혼합물을 포함하는 세포 배양 배지 샘플의 분광 조사를 위한 장치로서, 세포 배양 배지 샘플을 보유하기 위한 세포 배양 배지 샘플 홀더; 세포 배양 배지 샘플 홀더에 의해 보유된 세포 배양 배지 샘플을 조명하기 위한 레이저 공급원; 세포 배양 배지 샘플 홀더에 의해 보유된 세포 배양 배지 샘플에서 세포 배양 배지 중 하나 이상의 성분의 움직임을 검출하도록 위치된 입자 움직임 검출기; 및 레이저 공급원에 의한 조명으로부터 생성된 세포 배양 배지 샘플로부터의 스펙트럼을 수신하도록 위치된 스펙트럼 검출기를 포함하는 장치.
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