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CN114134202B - 一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法 - Google Patents

一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法，该方法采用的试剂盒的干化学试纸条设有三层，为扩散层、滤血层、反应试剂层；所述扩散层采用丝网膜；所述滤血层采用不对称聚醚砜PES膜，用于过滤血细胞，可用于直接检测全血样本。本发明与磷钨酸镁沉淀法相比，本方法采用选择性抑制法，不需直接沉淀，选用特异性强的表面活性剂，对HDL－C选择性解离，对非HDL－C选择性抑制，为临床及时、快速、准确测定HDL－C提供基础；与传统干化学法测试相比，多种酶－无机杂化纳米花，检测样本可直接在纳米花表面进行原位反应，减少中间产物的扩散和分解，使检测结果更加灵敏、准确，本法准确度高，反应时间快，抗干扰力强。

Description

一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法
技术领域
本发明涉及高密度脂蛋白胆固醇技术领域，特别涉及一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法。
背景技术
高密度脂蛋白与胆固醇结合即高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），低密度脂蛋白与胆固醇结合形成低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）。HDL-C和它的主要蛋白载脂蛋白的降低与动脉粥样硬化性心血管疾病的发病率密切相关。HDL-C具有调节逆胆固醇转运，抗氧化，抗血栓形成，抗炎及影响血管内皮功能的作用，这些作用对冠心病的发生具有积极的影响。
目前研究己经证实，高密度脂蛋白胆固醇水平在一定程度上决定着动脉粥样硬化和冠心病发生的概率。美国国家胆固醇教育计划成人治疗专家组认为低HDL-C水平是诱发冠心病的独立危险因素，因此检测HDL-C的含量具有重要的临床意义。目前HDL-C含量测定在临床实验室中己常规化。美国胆固醇教育计划对（NCEP）对HDL-C测定的建议中指出HDL-C测定的准确性非常重要，因为①HDL-C在一个很狭的范围内与冠心病（CHD）呈负相关；②和其它脂类测定不同，CHD危险增高的界限是在HDL-C浓度范围的低端，测定的细小误差会产生相对大的影响。
HDL 能将外周组织如血管壁内胆固醇转运至肝脏进行分解代谢，即胆固醇逆转运，可减少胆固醇在血管壁的沉积，起到抗动脉粥样硬化作用。因为 HDL中胆固醇含量比较稳定，故目前多通过检测其所含胆固醇的量，间接了解血中HDL水平。HDL-C高低也明显受遗传因素影响。严重营养不良者，伴随血清 TC 明显降低，HDL-C 也低下。肥胖者HDL-C也多偏低。吸烟可使HDL-C 下降。糖尿病、肝炎和肝硬化等疾病状态可伴有低 HDL-C。高 TG 血症患者往往伴有低 HDL-C。而运动和少量饮酒会升高 HDL-C。大量的流行病学资料表明，血清HDL-C水平与 ASCVD 发病危险呈负相关。HDL-C检测方法有多种，包括超速离心法、电泳法、色谱法、沉淀法、匀相法等。目前液相检测HDL-C主要采用匀相法。
我国目前临床实验室直接测定HDL-C的方法可分为3代：
第1代是化学沉淀法，常用的沉淀剂为多聚阴离子如肝磷脂、硫酸葡聚糖或聚合物如聚乙二醇或去污剂与两价阳离子如（Mg2+、Ca2+）等一起作用。具体原理是沉淀试剂可以选择性的聚集带正电荷的含有apoB的脂蛋白，HDL溶解在溶液中。用离心法分离出非HDL的凝集物，对上清液的胆固醇分析就可以测定HDL-C。中华医学会检验分会推荐使用磷钨酸镁沉淀法作为测定高密度脂蛋白胆固醇的方法，以及作为脂蛋白和载脂蛋白检测的参考标准，它对于评价其他检测方法是一种有用和有效的标准。但检测结果存在一定的误差，主要是因为HDL根据是否含有apoE成分的可以分为两类，含有apoE成分的HDL所产生的HDL-C占总HDL-C的10%。沉淀法可以沉淀出含有apoE成分的HDL，但不含有apoE成分的HDL不会被沉淀，因此降低了HDL-C的浓度，同时它不能完全沉淀apoB的脂蛋白，以至于上清液存在一定的混浊，影响结果的精确性；同时样本用量大，易产生的环节误差多，尤其是标本需预先离心沉淀，无法实现整个检测过程的完全自动化，因而在一定程度上也限制了该方法的使用。
第2代使用磁珠分离法，血清中加入试剂和磁珠等，在漩涡型混合器混合振荡后，转移到含有磁性的试管里，放于日立分析仪中，磁珠会与含有apoB的微粒结合，在磁场中会被磁性吸引而被分离，HDL-C留在上清液中用酶溶液即可检测。但磁珠法容易受到干扰从而影响其检测结果的精确度。磁珠法省去了离心步骤，但需特殊装置，该发明和试剂不适于推广应用，且其准确度不理想，因此其使用范围受到了限制。
第3代是匀相测定法，不需沉淀直接测定HDL-C的均相法，标本用量少，不需沉淀处理，可用于自动生化分析仪测定，因其简便、快速，减少预处理会降低成本，易于自动化，己引起国内外的关注并被广泛应用于临床常规分析，用于临床自动化测定，在准确度和精密度方面基本达到的分析目标，因此在短短的数年里迅速被临床实验室采用。
以上方法均需要配备大型生化仪器，更适用于大量样本的批量检测，且操作人员需经过专门的训练。但是越来越多的医护人员以及消费者倾向于使用更经济的和更简便的测量方法，另外，为了使此类测试对于消费者和医师而言更实用，用于测试的设备必须很小且可移动。作为这种需求的结果，开发配套仪器价格低，体积小，操作简便，可实现床边检测的试剂和配套仪器能更好的满足临床和用户需求。目前已有针对血脂测试的干化学商品试剂盒，但由于干化学试纸条中需要使用天然酶对脂蛋白进行催化反应，酶分子结构容易被降解，从而失去酶的催化活性。除此之外，天然酶催化反应实验结果重复性差、纯化过程复杂，也极大的限制了它的应用。
酶是化学反应中的生物催化剂，具有高催化效率，高选择性，底物特异性强，水溶性高，毒性小，反应条件温和以及来源广等优点而被广泛应用。一般来说，在温和的实验条件下，大多数酶都能进行特异性地催化反应。但大部分的酶的主要成分都是蛋白质，蛋白质很容易受高温、强酸或强碱条件，以及有机溶剂的影响。因此，在恶劣的条件下，酶分子结构容易被降解，从而失去酶的催化活性。除此之外，酶催化反应实验结果重复性差、纯化过程复杂，也极大的限制了它在催化和生物传感器等领域的应用。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法，克服现有技术中存在的测试时间较长、误差较大、测试方法繁琐以及检测灵敏度较低等问题，该试剂盒可以简便、快速、高灵敏地检测高密度脂蛋白胆固醇的浓度。该测定方法可以克服现有干化学商品试剂盒缺点的高密度脂蛋白胆固醇含量，采用该方法可以在干式生化分析仪上通过监测吸光度的变化进行全血、血清或血浆中高密度脂蛋白胆固醇含量测定。
为了实现上述目的，本发明提供一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法采用的试剂盒，该试剂盒的干化学试纸条设有三层，其中，
第一层：扩散层；
第二层：滤血层；
第三层：反应试剂层；
所述扩散层采用丝网膜；所述滤血层采用不对称聚醚砜PES膜，用于过滤血细胞，可用于直接检测全血样本。
优选地，所述反应试剂层包括：PIPES 缓冲液：100-200mmol/L、酶-Zn3(PO4)2纳米花1-4g/L、B-66 10-20g/L、F-88 10-20g/L、MADB 6.3g/L、4-AA 5.6g/L、亚铁氰化钾0.01g/L、表面活性剂1-10 ml/L、稳定剂 1-10 mmol/L，配制反应溶液，并均匀涂覆于反应膜表面，然后烘干，优选在37℃温度下烘干4小时。
优选地，所述PIPES 缓冲液的PH为7.0-8。
优选地，所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖中的一种。
优选地，所述酶-Zn3(PO4)2纳米花包括：选取
胆固醇酯酶 150-200KU/L、
胆固醇氧化酶 50-100KU/L、
过氧化物酶 100-200KU/L、
乙酸锌 0.03-0.08g/mL、
PBS缓冲溶液 100-200mmol/L，
然后搅拌一段时间后，通过离心得到，多酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花，再进行冻干收集。
优选地，所述PBS缓冲溶液的PH为7.0-8.0。
本发明还提供一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法，包括如下步骤：
步骤一、合成多种酶-Zn3(PO4)2纳米花：选取 Zn3(PO4)2·4H2O 为无机组分，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶为有机组分，在磷酸盐缓冲溶液（PBS）存在下，通过一步共沉淀法合成多种酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花，
首先，蛋白质分子与 Zn2+通过蛋白质骨架中的酰胺基团进行配位形成配合物；
接着，蛋白质和 Zn2+之间相互作用形成具有纳米级特征并且形状像花瓣的微米尺寸颗粒；
最后，通过各向异性生长形成完全的杂化纳米花，在该生长过程中，蛋白质诱导Zn3(PO4)2晶体的成核形成花瓣，并且蛋白质就像“胶水”一样将纳米颗粒和花瓣自组装结合在一起；
步骤二、然后进行显色反应：形成的多种酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花的酶活性位点在纳米材料中彼此紧密接近，使反应能够在原位进行进行级联反应；样本中的分析物与多种酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花进行反应，用胆固醇酯酶催化使胆固醇酯形成游离胆固醇和脂肪酸，游离胆固醇在胆固醇氧化酶作用下氧化成胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢与无色染剂在过氧化物酶的作用下，生成有色染料；
步骤三、测定高密度脂蛋白胆固醇的浓度：显色反应产生的醌亚胺在500nm~600nm的波长处有吸收峰，在500nm~600nm的波长处测得的吸光度数值的变化与颜色深浅成比例，在通过仪器反射光光度测定法进行测定，确定高密度脂蛋白胆固醇的浓度。
采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：1、与液相生化反应相比，由于本法采用干化学方法，配备的仪器体积小，操作简便，检测时间短，无需专业检验人员就可操作，更好的满足临床客户需求。
2、与磷钨酸镁沉淀法相比，本方法采用选择性抑制法，不需直接沉淀，选用特异性强的表面活性剂，对HDL-C选择性解离，对非HDL-C选择性抑制，为临床及时、快速、准确测定HDL-C提供基础。
3、与传统干化学法测试相比，本方法采用自组装方法合成多种酶-无机杂化纳米花，检测样本可直接在纳米花表面进行原位反应，减少中间产物的扩散和分解，使检测结果更加灵敏、准确，本法准确度高，反应时间快，抗干扰力强。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明进一步说明。
本发明提供一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法采用的试剂盒，该试剂盒的干化学试纸条设有三层，其中，
第一层：扩散层；
第二层：滤血层；
第三层：反应试剂层；
所述扩散层采用丝网膜；所述滤血层采用不对称聚醚砜PES膜，用于过滤血细胞，可用于直接检测全血样本。
所述反应试剂层包括：PIPES 缓冲液：100-200mmol/L、、酶-Zn3(PO4)2纳米花1-4g/L、B-66 10-20g/L、F-88 10-20g/L、MADB 6.3g/L、4-AA 5.6g/L、亚铁氰化钾0.01g/L、表面活性剂1-10 ml/L、稳定剂 1-10 mmol/L，配制反应溶液，并均匀涂覆于反应膜表面，在37℃烘4小时。
所述PIPES 缓冲液的PH为7.0-8。
所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖中的一种。
所述酶-Zn3(PO4)2纳米花包括：选取
胆固醇酯酶 150-200KU/L、
胆固醇氧化酶 50-100KU/L、
过氧化物酶 100-200KU/L、
乙酸锌 0.03-0.08g/mL、
PBS 缓冲溶液 100-200mmol/L，
然后搅拌3小时后，通过离心得到多酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花，再进行冻干收集。
所述PBS 缓冲溶液的PH为7.0-8。
本发明还提供一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的方法，包括如下步骤：
步骤一、合成多种酶-Zn3(PO4)2纳米花：选取 Zn3(PO4)2·4H2O 为无机组分，胆固醇酯酶、胆固醇氧化酶、过氧化物酶为有机组分，在磷酸盐缓冲溶液（PBS）存在下，通过一步共沉淀法合成多种酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花，
首先，蛋白质分子与 Zn2+通过蛋白质骨架中的酰胺基团进行配位形成配合物，并且这些配合物成为 Zn3(PO4)2初级晶体的成核位点；
接着，蛋白质和 Zn2+之间相互作用形成具有纳米级特征并且形状像花瓣的微米尺寸颗粒；
最后，通过各向异性生长形成完全的杂化纳米花，在该生长过程中，蛋白质诱导Zn3(PO4)2晶体的成核形成花瓣，并且蛋白质就像“胶水”一样将纳米颗粒和花瓣自组装结合在一起；
步骤二、然后进行显色反应：形成的多种酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花的酶活性位点在纳米材料中彼此紧密接近，使反应能够在原位进行进行级联反应；样本中的分析物与多种酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花进行反应，用胆固醇酯酶催化使胆固醇酯形成游离胆固醇和脂肪酸，游离胆固醇在胆固醇氧化酶作用下氧化成胆甾烯酮和过氧化氢，过氧化氢与无色染剂在过氧化物酶的作用下，生成有色染料；
步骤三、测定高密度脂蛋白胆固醇的浓度：显色反应产生的醌亚胺在500nm~600nm的波长处有吸收峰，在500nm~600nm的波长处测得的吸光度数值的变化与颜色深浅成比例，在通过仪器反射光光度测定法进行测定，确定高密度脂蛋白胆固醇的浓度。
本发明在所筛选的多种表面活性剂中，发现F-68对LDL具有较好的选择性抑制解离效果，B-66对HDL具有较好的选择性解离效果。
Figure 604763DEST_PATH_IMAGE001
当使用酶作为杂化纳米花的蛋白质组分时，与游离酶相比，它表现出增强的酶活性和稳定性。该方法固定化酶具有纳米材料的纳米级结构以及高比表面积，有利于在酶催化反应中减少酶和和底物的传质限制，保持了酶的催化活性以及增强了酶的稳定性，是一种不同于传统的“纳米酶”的纳米生物催化剂，该方法与传统的两步法相比，检测分析物原位进行反应，减少了中间产物的扩散和分解，从而使检测结果更加灵敏、准确。
用以上配方制作的干式试纸条在干式生化分析仪上测试内部参考品，对试剂的性能指标进行评价：
1、准确度：
取参考品2#和5#，用干式生化分析仪对两个参考品分别重复测定3次，分别计算两种不同浓度标本的测定相对偏差B，相对偏差均应≤ 10％，如下表1：
表1
Figure 538215DEST_PATH_IMAGE002
由上表1可知相对偏差均在-10%～10%范围内，试剂盒的准确度满足要求。
2、CV：
取参考品3#，4#作为样本，每个浓度样本需测10次，分别计算平均值、标准偏差和变异系数，测定结果应≤ 10％，如下表2：
表2
Figure 645849DEST_PATH_IMAGE003
由上述表2可知CV均≤ 10％，试剂盒的准确度满足要求。
3、线性：
用接近线性区间下限的低浓度样本（L）稀释接近线性区间上限的高浓度样本（H），混合成6个稀释浓度（Xi），将每一浓度的样本重复检测3次，计算平均值。以稀释浓度（X）为自变量，以检测结果浓度均值（Y）为因变量进行直线拟合，求出线性回归方程。计算线性回归的相关系数（r）， r≥0.9900，如下表3：
表3
Figure 854107DEST_PATH_IMAGE004
由上述表3可知线性相关系数r≥0.9900，符合性能要求。
由上述表1至表3可知：本试剂盒性能评估实验结果表明，本产品的精密度准确度和线性范围评估实验均达到了设计的要求，能够满足临床实际需要。
采用本发明的技术方案，具有以下有益效果：1、与液相生化反应相比，由于本法采用干化学方法，配备的仪器体积小，操作简便，检测时间短，无需专业检验人员就可操作，更好的满足临床客户需求。
2、与磷钨酸镁沉淀法相比，本方法采用选择性抑制法，不需直接沉淀，选用特异性强的表面活性剂，对HDL-C选择性解离，对非HDL-C选择性抑制，为临床及时、快速、准确测定HDL-C提供基础。
3、与传统干化学法测试相比，本方法采用自组装方法合成多种酶-无机杂化纳米花，检测样本可直接在纳米花表面进行原位反应，减少中间产物的扩散和分解，使检测结果更加灵敏、准确，本法准确度高，反应时间快，抗干扰力强。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (1)

1.一种无机杂化纳米花进行高密度脂蛋白胆固醇测定的试剂盒，其特征在于，该试剂盒的干化学试纸条设有三层，其中，
第一层：扩散层；
第二层：滤血层；
第三层：反应试剂层；
所述扩散层采用丝网膜；所述滤血层采用不对称聚醚砜PES膜，用于过滤血细胞，可用于直接检测全血样本；
所述反应试剂层的制备：PIPES 缓冲液：100-200mmol/L、酶-Zn3(PO4)2纳米花1-4g/L、B-66 10-20g/L、F-88 10-20g/L、MADB 6.3g/L、4-AA 5.6g/L、亚铁氰化钾0.01g/L、表面活性剂1-10 ml/L、稳定剂 1-10 mmol/L，配制反应溶液，并均匀涂覆于反应膜表面，然后烘干；
所述酶-Zn3(PO4)2纳米花的制备：选取
胆固醇酯酶 150-200KU/L、
胆固醇氧化酶 50-100KU/L、
过氧化物酶 100-200KU/L、
乙酸锌 0.03-0.08g/mL、
PBS缓冲溶液 100-200mmol/L，
然后搅拌一段时间后，通过离心得到，多酶-Zn3(PO4)2杂化纳米花，再进行冻干收集；
所述PIPES 缓冲液的PH为7.0-8；
所述稳定剂选自蔗糖、海藻糖中的一种。
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