CN114126717A - 用于调整细胞表型的系统和方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种调整源细胞群的表型以呈现出期望表型的方法。该方法包括在培养箱中培养源细胞群，该培养箱被配置为调节氧气水平和总大气压水平的可变大气参数。
Description
交叉引用
本申请要求于2019年4月30日提交的第62/840,782号美国临时申请的优先权，该临时申请的全部内容通过引用方式并入本文。
背景技术
将细胞，如免疫系统细胞、肿瘤细胞和干细胞用于研究、诊断、药物筛选或治疗目的是一个令人感兴趣的领域，并且相应地，分离和扩增非常适用于这些目的的细胞群的方法可用于多种生物学应用。在某些情况下，由于发育或分化状态，或者由于许多环境因素的影响，特定类型的细胞可以呈现出多于一种的表型。
发明内容
在一些实施方案中，本发明提供了一种培养细胞以增强细胞毒性的方法，包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达发生改变，其中该细胞是外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞(pan T-cell)、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达发生改变；以及在培养之后，将细胞施用于受试者，其中该细胞是外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于确定抗癌剂效力的方法，该方法包括：(a)在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养选自于外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞中的细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达发生改变；以及在培养之后，(b)使肿瘤细胞与该细胞和抗癌剂接触；以及(c)在至少约5天后测量对肿瘤细胞的细胞毒性，从而确定抗癌剂对肿瘤细胞的效力。
在一些实施方案中，本发明提供了一种从泛T细胞源群中富集细胞亚群的方法，该方法包括在1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养该源群，其中该细胞亚群包含CD8+细胞或CD4+细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下IL-6和IFN-γ的表达相比，IL-6和IFN-γ的表达升高；以及在培养之后，将细胞施用于受试者，其中该细胞是泛T细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种调整源细胞群中至少一个子群的表型的方法，该方法包括：在细胞培养箱内的液体培养基中培养该源细胞群，该细胞培养箱被配置为能够独立于相应的环境大气条件而调节培养箱内的至少两个可变大气条件参数，其中可变大气参数中的两个是氧气水平和总大气压水平；调节培养箱内氧气水平和总大气压水平中的至少一个，使得氧气水平或总大气压水平中的至少一个不同于相应的环境水平；以及作为调节可变大气条件参数的结果，经孵育期将源群的表型参数的表达从第一表型驱动至第二表型，其中细胞子群的第一表型是在培养箱内的可变大气条件参数与环境大气条件基本相同的大气条件下会表达的表型，并且其中细胞子群的第二表型因暴露于由培养箱调节的可变大气条件而表达。
援引并入
本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请都通过引用方式并入于此，其程度如同指明每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地和各自地通过引用而并入。
附图说明
本发明的新颖性特征在所附权利要求中予以具体阐述。通过参考以下阐述其中采用了本发明原理的说明性实施方案的详细描述及附图，将会获得对本发明的特征和优点的更好理解，附图中：
图1A示出了在标准培养条件(STD)、高于大气压2PSI下15％O2(15％O2+2PSI)和大气压下15％O2(15％O2+0PSI)条件下，细胞因子的表达。
图1B示出了来自结果在图1A显示的同一研究的数据的柱状图，该柱状图显示了在标准培养条件(STD)、高于大气压2PSI下15％O2(15％O2+2PSI)和大气压下15％O2(15％O2+0PSI)条件下，IFN-γ、IL-6、IL-10、TGF-β-1和TNF-α的表达。
图2展示了在标准条件(STD)下培养，或在高于环境压力2PSI下1％O2下培养，对经纳武单抗(Nivo)或帕博利珠单抗(Pembro)处理的PBMC的肿瘤细胞杀伤效力的影响。
图3A展示了原代T细胞在不同氧气和压力条件下的生长曲线。所示条件为大气压下20％O2的标准条件、大气压下15％O2(15％O2+0PSI)、高于大气压2PSI下15％O2(15％O2+2PSI)、大气压下5％O2(5％O2+0PSI)、高于大气压2PSI下5％O2(5％O2+2PSI)、大气压下1％O2(1％O2+0PSI)和高于大气压2PSI下1％O2(1％O2+2PSI)。
图3B展示了依据图3A的生长曲线，原代T细胞在第14天时的总倍增。
图3C汇总了图3A和3B的倍数扩增数据。
图4A示出了在标准条件(STD)、大气压下15％O2(15％O2)、大气压下5％O2(5％O2)、大气压下1％O2(1％O2)、高于大气压2PSI下15％O2(15％O2+2PSI)、高于大气压2PSI下5％O2(5％O2+2PSI)和高于大气压2PSI下1％O2(1％O2+2PSI)下，T细胞中CD8和CD4表达的代表性流式细胞仪图。
图4B展示了在不同的氧气和压力条件下，第14天时CD8+细胞的相对存在(依据图4A的数据)。
图4C展示了在不同的氧气和压力条件下，第14天时CD4+细胞的相对存在(依据图4A的数据)。
图4D汇总了在不同的氧气和压力条件下，第14天时CD8+细胞的相对存在(依据图4B的数据)。
图4E汇总了在不同的氧气和压力条件下，第14天时CD4+细胞的相对存在(依据图4B的数据)。
图5A展示了相对于标准条件，在不同的氧气和压力条件下，T细胞中IL-10的表达水平。
图5B展示了相对于标准条件，在不同的氧气和压力条件下，T细胞中IL-6的表达水平。
图6A展示了在不同的氧气和压力条件下，T细胞中颗粒酶B(GZMB)的表达。
图6B展示了在不同的氧气和压力条件下，T细胞中穿孔素的表达。
图7展示了在不同的氧气和压力条件下，T细胞的大小(细胞体积)。
图8A展示了在不同的氧气和压力条件下，PD1的表达。
图8B展示了在不同的氧气和压力条件下，CTLA4的表达。
图9A展示了在不同的氧气和压力条件下，IFN-γ的表达。
图9B展示了在不同的氧气和压力条件下，IL-6的表达。
图9C展示了在不同的氧气和压力条件下，IL-10的表达。
图10A展示了在缺氧+高压条件下培养的细胞群与在标准培养条件下培养的细胞群中FOXP3+Treg细胞的相对频数。
图10B展示了在缺氧+高压条件下培养的细胞群与在标准培养条件下培养的细胞群中FOXP3+Treg细胞的相对分布的流式细胞仪分析。
图10C展示了在标准培养条件下培养的Treg细胞的侧向散射区域(SSC-A)与FOXP3+的流式细胞术分析。
图10D展示了在高压+缺氧条件(高于大气压2PSI下5％O2)下培养的Treg细胞的侧向散射区域(SSC-A)与FOXP3+的流式细胞术分析。
图10E展示了在缺氧+高压条件下与标准培养条件下FOXP3+细胞的相对百分比。
图11展示了细胞培养箱中气体条件的氧气水平参数(X轴)和压力水平参数(Y轴)的X-Y图形表示，其显示两个特定的氧气-压力(O-P)条件：O-P条件1和O-P条件2。
图12展示了细胞培养箱中气体条件的氧气水平参数(X轴)、压力水平参数(Y轴)和时间(Z轴)的X-Y-Z图形表示，其中在时间点1显示的O-P条件1和在时间点2显示的O-P条件2在从时间点1到时间点2的持续过程中发生变化。
图13A示出了相对于细胞培养参数度量的细胞双相频数分布曲线，其中细胞群从一个峰到另一个峰的移动或演变是由大气条件促进或驱动的。
图13B示出了相对于细胞培养参数度量的细胞频数分布曲线，其中，作为调节大气条件的结果，细胞群变得更加同质。
图13C示出了相对于细胞培养参数度量的细胞频数分布曲线，其中细胞群明显倾向于从中心中线向一个方向和/或另一个方向漂移，并且其中，通过对这种表型漂移被大气条件的优化调节而阻止。
图13D示出了一个双因素(氧气水平和压力水平)实验，旨在确定支持目标表型或期望表型的最佳大气条件。
图13E示出了对多因素实验(氧气水平、压力水平、生物活性剂)的分析，旨在优化大气条件，从而优化细胞群的表型表达，以便能够测量生物活性剂的效应。
图13F展示了为实现最高产物产量而优化的两阶段生产流程的示意图。
图14展示了方法流程图，其显示了调整源细胞群的表型的方法。
图15展示了方法流程图，其显示了提高细胞群内表型同质性的方法。
图16展示了方法流程图，其显示了稳定细胞群的表型的方法。
图17展示了方法流程图，其显示了确定有利于表达期望表型的大气参数值的方法。
图18展示了方法流程图，其显示了优化基于免疫细胞的细胞培养测定的方法，用于评估免疫细胞导向的生物活性剂。
图19展示了方法流程图，其显示了调整细胞培养群的表型表达的方法，以在生产环境中获得目标表型。
图20展示了方法流程图，其显示了调整细胞培养群的表型表达的方法，以获得最佳生产流程效率。
图21展示了方法流程图，其显示了通过调整细胞群的表型而制备的产物。
图22展示了方法流程图，其显示了体外测试抗癌药物对患者来源的癌细胞的效力的方法。
图23示出了基于本文所述方法分离和分析细胞的流程。
具体实施方式
本文公开的方法可以允许例如在模拟体内条件的条件下进行实验、药物筛选和患者治疗。药物发现过程中的早期测试可以在细胞系上进行，这些细胞系可能在很少反映体内环境的条件下维持和扩增一段时间，在某些情况下可以长达数年。容纳细胞系的常规细胞培养箱通常不能完全再现细胞的天然条件，并且在某些情况下，即使是微小的环境变化也会改变细胞中基因和蛋白质的表达。在某些情况下，这些由细胞培养条件诱导的基因和蛋白质表达特征的差异可能导致药物敏感性的改变。
本文描述的是在生理条件下用于培养细胞的方法。通过允许生成比使用常规技术和系统可能生成的更多的生理相关数据，此类方法可以有助于药物发现。在某些情况下，通过此类方法产生的数据可用于鉴定最佳候选药物，并将其推向临床试验。本文所述的方法可以允许在定制的条件下培养细胞，然后可以将其导入患者体内，例如，以提高共同施用药物的效力或增加细胞对患者体内肿瘤细胞的细胞毒性。
本文提供的方法可以包括在生理上的氧气和压力条件下培养细胞。重要的生物学特征，如缺氧和压力，在反映生理条件时可能是必不可少的。这些条件可以根据细胞类型或效用来定制。在一些实施方案中，此类方法可以更贴切地模拟细胞的天然微环境，并允许它们像细胞在体内一样发挥作用。在一些实施方案中，在使用本文提供的方法培养的细胞上测试化合物，可以使发现和开发流程变得更加高效和有效。
例如，可以使用本文提供的方法培养免疫细胞，如T细胞。例如，这种T细胞的活性可以超过使用常规方法培养的T细胞的活性，表明当注射到患者体内时，只有一小部分患者来源的T细胞可以发挥杀伤癌细胞的作用。例如，在传统培养箱中，T细胞活性会在生物生产过程中降低，从而降低T细胞的有效性。通过使用本文提供的方法培养这种细胞，这些方法可以保持T细胞的最佳适应性，这就可以使细胞在重新导入患者时更有效地杀伤癌细胞。
图23描绘了本文公开的方法。图23示出了根据本文公开的实施方案，用于采集和富集目标细胞亚群的流程100。该流程100可以包括从受试者105获得样品110；分离样品115的一种或多种组分以获得异质性细胞群；使异质性细胞群与基底120接触(例如，将异质性细胞群铺板到基底上)；在足以使目标细胞亚群生长的条件下，孵育异质性细胞群，其中，足以使目标细胞亚群生长的条件可以包括在装置130中用富集培养基125进行孵育；将样品孵育一段时间135，其中该时间135足以使细胞分裂发生。可以使用成像系统140(例如显微镜)来监测细胞。可以使用分析软件145处理来自成像系统监测的数据。分析软件145可以创建结果150的输出。细胞和/或结果150可用于疾病状况的诊断、预后或监测155，以指导受试者的治疗方案160，和/或用于研究或任何其它适当目的，例如治疗、诊断或治疗方案确定165。
气体或大气条件以及液体培养基中溶解的气体水平对于控制培养细胞表型的变化可能很重要。各种大气条件可以驱动表型变化或稳定特定表型。
关于干细胞和干细胞的治疗潜力，细胞谱系潜能状态的发展可以受到例如干细胞从多能性或几乎多能性状态趋向中间分化或完全分化状态的影响，或者备选地，将细胞谱系从分化状态驱动至多能性状态。体外条件，例如多种重新编程因子、诱导因子、生长因子和细胞因子中任何一种的存在，都可能促进细胞谱系表型朝着增加分化或(相反地)增加潜能水平的方向移动。
可以受本文公开的方法影响的细胞表型可包括例如细胞形态、尺寸、粘附特性、电学特性、代谢活动或迁移行为。在某些情况下，分化细胞状态之间的表型差异可能与潜能水平的差异有关，这可以表现为细胞基因组的信使RNA表达的差异，或从表达的RNA转录蛋白质的速率的差异。
物理因素，如基底的可用性或3D支架排列，可以对细胞表型表达产生重要影响。在一些实施方案中，这些物理因素可以表现为形态或功能上的差异。
此外，体内细胞的环境可能与传统细胞培养箱内的条件不同，其中，氧气水平和总气体压力水平基本上类似于环境条件(例如，体外条件)。相反，体内的局部解剖腔室或微环境(例如，肿瘤微环境)可以是缺氧的(氧气水平低于环境水平)或高压的(总大气压高于环境水平)。缺氧可能是一种大气影响因素，对特定类型的细胞有许多影响，这些影响是由缺氧诱导因子介导的。在某些情况下，总大气压对细胞的影响不如缺氧的影响好理解，至少部分原因是在体外环境中产生不同水平的氧气相对容易，但是几乎没有可用的培养箱选项可以可控地改变内部大气压。
培养细胞的方法
本文提供了培养细胞的方法。细胞可以在这样的氧气水平和总气体压力下培养(例如体外)，即该氧气水平和总气体压力可以反映身体中(例如体内)类似细胞的条件。在一些实施方案中，氧气水平或总气体压力可以是特定组织或器官、疾病状态或健康状态的氧气水平或总气体压力。在一些实施方案中，可以在其中培养细胞的氧气水平或总气体压力可以是血液、肿瘤或身体中的另一个腔室、组织或器官的氧气水平或总气体压力。
培养细胞的方法可以包括在细胞培养箱中孵育源细胞群，可以将该培养箱配置为运行控制大气条件的培养箱程序。在一些实施方案中，该程序可以控制可以优化目标表型表达的大气条件。这种程序可以包括针对(1)氧气水平和(2)总气体压力水平的设定点范围，并可以根据大气条件设定点范围调节培养箱内的氧气水平和总气体压力。可以根据所述大气条件设定点范围来培养细胞群，以产生表达期望表型的扩增的细胞群。在一些实施方案中，培养的细胞可以具有治疗或细胞毒性特性。
本文还提供了用于培养外周血单核细胞(PBMC)的方法，例如用于增强细胞毒性。在一些实施方案中，该方法可以包括培养从供体器官分离出的PBMC，至少直到相对于在PBMC的对照培养条件下细胞因子的表达，细胞因子的表达发生改变。
PBMC细胞可以属于免疫细胞的源群，例如来自受试者(例如，人类、患者或动物受试者)的PBMC群。PBMC可以是具有圆形细胞核的外周血细胞。在一些实施方案中，PBMC可以是淋巴细胞(例如，T细胞、B细胞或NK细胞)、单核细胞或树突状细胞。在一些实施方案中，培养之后，PBMC可以表现出细胞因子表达的增加或减少。在一些实施方案中，培养之后，PBMC可以表现出检测、结合或杀伤靶细胞(例如癌细胞)的能力增强。在一些实施方案中，这种检测、结合或杀伤靶细胞能力的增强可以通过治疗剂来加强或在与治疗剂结合时观察到。
在一些实施方案中，培养过程中的氧气水平可调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平。在一些实施方案中，总大气压可调节至相对于环境大气压的高压水平。在该方法的一些实施方案中，氧气水平可调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平，并且总大气压调节至相对于环境大气压的高压水平。在实施方案中，大气压和氧气水平彼此独立地进行调节，使得尽管总体上处于高压状态，但仍保持缺氧的氧气水平。
在一些实施方案中，PBMC可以在下列氧气水平下培养，即约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，PBMC可以在约1％至约15％的氧气下培养。
在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压约0磅力/平方英寸(PSI)、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI、高于大气压约1.5PSI、高于大气压约2PSI、高于大气压约2.5PSI或高于大气压约3PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压不超过约0.5PSI、高于大气压不超过约1PSI、高于大气压不超过约1.5PSI、高于大气压不超过约2PSI、高于大气压不超过约2.5PSI或高于大气压不超过约3PSI。在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压至少约0.5PSI、高于大气压至少约1PSI、高于大气压至少约1.5PSI、高于大气压至少约2PSI、高于大气压至少约2.5PSI或高于大气压至少约3PSI。在一些实施方案中，例如，PBMC可以在高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在高于大气压至少约1PSI的压力条件下培养。
在一些实施方案中，PBMC可以在给定的氧气水平和给定的压力条件下培养，例如上文提供的氧气水平和压力条件。在一些实施方案中，例如，PBMC可在约1％至约15％的氧气下培养，并且压力条件可以是高于大气压不超过约2PSI。在一些实施方案中，PBMC可在约15％的氧气和高于大气压不超过2PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在约1％至约15％的氧气和高于大气压至少约1PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在约15％的氧气和高于大气压约1PSI的压力条件下培养。
对照培养条件可以包括标准培养条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包括环境(例如室内或大气)氧气水平或压力条件。
对照培养条件可以包含下列氧气水平，即约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含下列氧气水平，即至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
对照培养条件可以包含下列压力条件，即高于大气压约0PSI、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，对照培养条件可以包含高于大气压约0PSI的压力条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含高于大气压不超过0.5PSI或高于大气压不超过1PSI的压力条件。
在一些实施方案中，对照培养条件可以包括给定氧气水平和给定压力条件的组合，例如上文提供的对照培养条件的氧气水平和压力条件。例如，在一些实施方案中，对照培养条件可以包含约18％的氧气和高于大气压0PSI的压力条件。
可以培养PBMC，至少直到相对于在PBMC的对照培养条件下细胞因子的表达，PBMC中细胞因子的表达发生改变。细胞因子可以是一种可在细胞信号传导中发挥作用的小型蛋白质。在一些实施方案中，细胞因子可以参与自分泌、旁分泌或内分泌信号传导通路。在一些实施方案中，细胞因子可以是免疫调节剂。细胞因子可以包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。细胞因子的示例可以包括，例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、CD40L(CD154)、淋巴毒素(LT、TNFβ)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、C-CSF、GM-CSF或M-CSF。在一些实施方案中，其它细胞因子的表达也会发生改变。在一些实施方案中，细胞因子可以是未分化细胞的标志物。在一些实施方案中，细胞因子可以是分化细胞的标志物。
细胞因子表达的改变可以包括表达的增加或减少。在一些实施方案中，与在对照培养条件下培养的细胞中相同细胞因子的表达相比，在培养的PBMC中细胞因子的表达可增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％。在一些实施方案中，与在对照培养条件下培养的细胞中相同细胞因子的表达相比，在培养的PBMC中细胞因子的表达可减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％。
在一些实施方案中，细胞因子表达的改变可以包括基因表达的改变，例如编码细胞因子的mRNA的表达的增加或减少。例如，mRNA表达的改变可包括DNA向mRNA转录的增加或减少。在某些情况下，mRNA表达的改变可包括编码细胞因子的mRNA的降解的增加或减少。
基因表达可以通过任何可接受的方法来测定。例如，可以使用ISH、FISH、RNA印迹、PCR、RT-PCR、q-PCR、p-RT-PCR或其它方法来测定基因表达。可以将RNA表达测定为绝对表达(例如，每个细胞的mRNA转录物的数量)或相对表达(例如，与同一细胞中管家基因的mRNA转录物的数量相比，mRNA转录物的数量；或与在对照条件下培养的细胞的相同mRNA转录物的数量相比，mRNA转录物的数量)。
在一些实施方案中，细胞因子表达的改变可以包括蛋白质表达的改变，例如产生的或检测到的细胞因子的增加或减少。例如，蛋白质表达的改变可以包括mRNA向蛋白质翻译的增加或减少。在某些情况下，蛋白质表达的改变可以包括蛋白质降解或失活的增加或减少。
蛋白质表达可以通过任何可接受的方法来测定。例如，可以通过免疫测定(例如，ELISA)、蛋白质印迹、斑点印迹、色谱法、分光光度法或其它方法来测定蛋白质表达。可以将蛋白质表达测定为绝对表达(例如，每个细胞的蛋白质分子的数量)或相对表达(例如，与同一细胞中管家蛋白的蛋白质分子的数量相比，蛋白质分子的数量；或与在对照条件下培养的细胞的相同蛋白质分子的数量相比，蛋白质分子的数量)。
在一些实施方案中，细胞因子可以是IL-10。在一些这样的实施方案中，可以降低IL-10的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是TNF-α。在一些这样的实施方案中，可以增加TNF-α的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是IL-6。在一些这样的实施方案中，可以降低IL-6的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以包含IFN-γ。在一些这样的实施方案中，可以降低IFN-γ的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是TGF-β1，并且可以增加TGF-β1的表达。
在一些实施方案中，例如，与在对照条件(如上文提供的对照条件)下培养的PBMC相比，PBMC的细胞毒性可以增加。在一些实施方案中，PBMC的细胞毒性可以包括PBMC识别、结合、中和或杀伤靶细胞的能力。PBMC的细胞毒性可以指的是PBMC识别、结合、中和或杀伤肿瘤细胞、转移性细胞、癌细胞、细菌细胞或其它类型细胞的能力。例如，PBMC可以对癌瘤细胞、肉瘤细胞、黑色素瘤细胞、淋巴瘤细胞或白血病细胞显示出细胞毒性。
在一些实施方案中，相对于PBMC的对照培养条件，PBMC的细胞毒性可增加至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％或任意两个前述值之间的范围。例如，在一些实施方案中，相对于PBMC的对照培养条件，PBMC的细胞毒性可增加约20％。
可以使用细胞毒性测定法来测定PBMC的细胞毒性。在一些实施方案中，细胞毒性测定法可以在体外进行。细胞毒性测定法可以包括将一个细胞或多个细胞暴露于如本文所述培养的PBMC，并检测暴露之后细胞是存活还是死亡。在一些实施方案中，可以通过测量分子跨越细胞膜进出细胞的运动来完成死亡细胞的检测。在一些实施方案中，死亡细胞的细胞膜可能会渗漏，并且无法修复。例如，在细胞周围的培养基中检测到细胞质标志物，可以表明细胞膜完整性的丧失，从而表明细胞死亡。这种标志物可以是天然存在的标志物，例如酶，或者可以是人工导入的标志物，例如在暴露于PBMC之前加载入细胞内的放射性或荧光标志物。
在一些实施方案中，细胞毒性可以在体内测定。例如，可以通过将PBMC注射到患有肿瘤的受试者中来测定细胞毒性，如人类受试者或动物受试者(例如，小鼠、仓鼠、大鼠、豚鼠、猴、猫、狗、兔或其它动物)。在一些这样的情况下，可以通过测量肿瘤团块的缩小、肿瘤细胞的减少或转移性细胞的减少来测定细胞毒性。
用于治疗肿瘤的方法
本文还提供了用于治疗受试者中肿瘤的方法。方法可以包括在上述条件下培养PBMC或本文公开的任何其它细胞。例如，方法可以包括在约1％至约15％的氧气水平和不超过约2PSI的压力条件下培养分离的PBMC，至少直到相对于在PBMC的对照培养条件下细胞因子的表达，细胞因子的表达发生改变。在一些实施方案中，该方法还可以包括向受试者施用PBMC。
在一些实施方案中，PBMC可以在下列氧气水平下培养，即约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，PBMC可以在约1％至约15％的氧气下培养。
在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压约0磅力/平方英寸(PSI)、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI、高于大气压约1.5PSI、高于大气压约2PSI、高于大气压约2.5PSI或高于大气压约3PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压不超过约0.5PSI、高于大气压不超过约1PSI、高于大气压不超过约1.5PSI、高于大气压不超过约2PSI、高于大气压不超过约2.5PSI或高于大气压不超过约3PSI。在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压至少约0.5PSI、高于大气压至少约1PSI、高于大气压至少约1.5PSI、高于大气压至少约2PSI、高于大气压至少约2.5PSI或高于大气压至少约3PSI。在一些实施方案中，例如，PBMC可以在高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在高于大气压至少约1PSI的压力条件下培养。
在一些实施方案中，PBMC可以在给定的氧气水平和给定的压力条件下培养，例如上文提供的氧气水平和压力条件。在一些实施方案中，例如，PBMC可在约1％至约15％的氧气下培养，并且压力条件可以是高于大气压不超过约2PSI。在一些实施方案中，PBMC可在约15％的氧气和高于大气压不超过2PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在约1％至约15％的氧气和高于大气压至少约1PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在约15％的氧气和高于大气压约1PSI的压力条件下培养。
对照培养条件可以包括标准培养条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包括环境(例如室内或大气)氧气水平或压力条件。
对照培养条件可以包含下列氧气水平，即约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含下列氧气水平，即至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
对照培养条件可以包含下列压力条件，即高于大气压约0PSI、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，对照培养条件可以包含高于大气压约0PSI的压力条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含高于大气压不超过0.5PSI或高于大气压不超过1PSI的压力条件。
在一些实施方案中，对照培养条件可以包括给定氧气水平和给定压力条件的组合，例如上文提供的对照培养条件的氧气水平和压力条件。例如，在一些实施方案中，对照培养条件可以包含约18％的氧气和高于大气压0PSI的压力条件。
可以培养PBMC，至少直到相对于在PBMC的对照培养条件下细胞因子的表达，PBMC中细胞因子的表达发生改变。细胞因子可以是一种可在细胞信号传导中发挥作用的小型蛋白质。在一些实施方案中，细胞因子可以参与自分泌、旁分泌或内分泌信号传导通路。在一些实施方案中，细胞因子可以是免疫调节剂。细胞因子可以包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。细胞因子的示例可以包括，例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、CD40L(CD154)、淋巴毒素(LT、TNFβ)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、C-CSF、GM-CSF或M-CSF。在一些实施方案中，其它细胞因子的表达也会发生改变。在一些实施方案中，细胞因子可以是未分化细胞的标志物。在一些实施方案中，细胞因子可以是分化细胞的标志物。在一些实施方案中，细胞因子的改变可以促进PBMC的细胞毒性增加。
细胞因子表达的改变可以包括表达的增加或减少。在一些实施方案中，与在对照培养条件下培养的细胞中相同细胞因子的表达相比，在培养的PBMC中细胞因子的表达可增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％。在一些实施方案中，与在对照培养条件下培养的细胞中相同细胞因子的表达相比，在培养的PBMC中细胞因子的表达可减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％。
在一些实施方案中，细胞因子表达的改变可以包括基因表达的改变，例如编码细胞因子的mRNA的表达的增加或减少。例如，mRNA表达的改变可包括DNA向mRNA转录的增加或减少。在某些情况下，mRNA表达的改变可包括编码细胞因子的mRNA的降解的增加或减少。
基因表达可以通过任何可接受的方法来测定。例如，可以使用ISH、FISH、RNA印迹、PCR、RT-PCR、q-PCR、p-RT-PCR或其它方法来测定基因表达。可以将RNA表达测定为绝对表达(例如，每个细胞的mRNA转录物的数量)或相对表达(例如，与同一细胞中管家基因的mRNA转录物的数量相比，mRNA转录物的数量；或与在对照条件下培养的细胞的相同mRNA转录物的数量相比，mRNA转录物的数量)。
在一些实施方案中，细胞因子表达的改变可以包括蛋白质表达的改变，例如产生的或检测到的细胞因子的增加或减少。例如，蛋白质表达的改变可以包括mRNA向蛋白质翻译的增加或减少。在某些情况下，蛋白质表达的改变可以包括蛋白质降解或失活的增加或减少。
蛋白质表达可以通过任何可接受的方法来测定。例如，可以通过免疫测定(例如，ELISA)、蛋白质印迹、斑点印迹、色谱法、分光光度法或其它方法来测定蛋白质表达。可以将蛋白质表达测定为绝对表达(例如，每个细胞的蛋白质分子的数量)或相对表达(例如，与同一细胞中管家蛋白的蛋白质分子的数量相比，蛋白质分子的数量；或与在对照条件下培养的细胞的相同蛋白质分子的数量相比，蛋白质分子的数量)。
在一些实施方案中，细胞因子可以是IL-10。在一些这样的实施方案中，可以降低IL-10的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是TNF-α。在一些这样的实施方案中，可以增加TNF-α的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是IL-6。在一些这样的实施方案中，可以降低IL-6的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以包含IFN-γ。在一些这样的实施方案中，可以降低IFN-γ的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是TGF-β1，并且可以增加TGF-β1的表达。
受试者可以是需要治疗肿瘤的受试者，例如患有肿瘤的受试者。在一些实施方案中，受试者可以是人类、小鼠、仓鼠、豚鼠、大鼠、兔、猫或狗。在一些实施方案中，受试者可能有单发肿瘤。在一些实施方案中，受试者可能还有转移。
施用可以包括以使组合物进入患者身体内的方式，向受试者提供一种或多种组合物(例如，包含PBMC的组合物，或PBMC组合物)。可以通过任何途径施用，包括但不限于局部性施用、区域性施用或全身性施用。施用可以是皮下、真皮内、静脉内、动脉内、腹膜内或肌内施用。
一些实施方案可以包括使用本文所述的PBMC来生产用于治疗本文所述的病况、疾病或病症的药物。可以根据需要治疗的受试者的身体特征来配制药物，并且可以根据肿瘤的分期配制成单一或多种制剂。可以将药物包装在带有合适标签的适当包装中，用于分发给医院和诊所，其中，该标签是针对治疗患有本文所述疾病的受试者的指示。可以将药物包装成单个或多个单位。组合物的剂量和施用说明书可包含在如下文所述的包装中。
在一些实施方案中，可以将PBMC与抗癌剂一起共同施用于受试者。在一些实施方案中，抗癌剂可以包括在临床上能有效减轻肿瘤负荷、预防或消除转移、杀伤肿瘤细胞或防止肿瘤细胞生长的药物。在一些实施方案中，抗癌剂可以是PD1抑制剂。PD1抑制剂的示例可以包括，例如，帕博利珠单抗或纳武单抗。
在一些实施方案中，可以将抗癌剂通过与PBMC组合物相同的途径共同施用。可以通过任何途径施用，包括但不限于局部性施用、区域性施用或全身性施用。施用可以是皮下、真皮内、静脉内、动脉内、腹膜内或肌内施用。
在一些实施方案中，可以将抗癌剂与PBMC组合物同时共同施用。在一些这样的实施方案中，抗癌剂可以包含在PBMC组合物中。
可以将抗癌剂在施用PBMC组合物之前共同施用。在一些实施方案中，可以在紧邻着施用PBMC组合物之前，施用抗癌剂。在一些实施方案中，可以将抗癌剂在下列时间施用，即PBMC组合物之前约1分钟、PBMC组合物之前约5分钟、PBMC组合物之前约15分钟、PBMC组合物之前约30分钟、PBMC组合物之前约1小时、PBMC组合物之前约6小时、PBMC组合物之前约12小时，或任意两个前述值之间的范围。
在一些实施方案中，可以将抗癌剂在施用PBMC组合物之后共同施用。在一些实施方案中，可以在紧接着施用PBMC组合物之后，施用抗癌剂。在一些实施方案中，可以将抗癌剂在下列时间施用，即PBMC组合物之后约1分钟、PBMC组合物之后约5分钟、PBMC组合物之后约15分钟、PBMC组合物之后约30分钟、PBMC组合物之后约1小时、PBMC组合物之后约6小时、PBMC组合物之后约12小时，或任意两个前述值之间的范围。
用于测定抗癌剂效力的方法
本文还提供了用于测定抗癌剂效力的方法。在一些实施方案中，用于测定抗癌剂效力的方法可以包括培养外周血单核细胞，直到相对于在PBMC的对照培养条件下细胞因子的表达，细胞因子的表达发生改变。
在一些实施方案中，培养过程中的氧气水平可调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平。在一些实施方案中，总大气压可调节至相对于环境大气压的高压水平。在该方法的一些实施方案中，氧气水平可调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平，并且总大气压调节至相对于环境大气压的高压水平。在实施方案中，大气压和氧气水平彼此独立地进行调节，使得尽管总体上处于高压状态，但仍保持缺氧的氧气水平。
在一些实施方案中，PBMC可以在下列氧气水平下培养，即约1％、约2％、约3％、约4％、约5％、约6％、约7％、约8％、约9％、约10％、约11％、约12％、约13％、约14％、约15％、约16％、约17％、约18％、约19％、约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，PBMC可以在约1％至约15％的氧气下培养。
在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压约0磅力/平方英寸(PSI)、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI、高于大气压约1.5PSI、高于大气压约2PSI、高于大气压约2.5PSI或高于大气压约3PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压不超过约0.5PSI、高于大气压不超过约1PSI、高于大气压不超过约1.5PSI、高于大气压不超过约2PSI、高于大气压不超过约2.5PSI或高于大气压不超过约3PSI。在一些实施方案中，PBMC可以在下列压力条件下培养，即高于大气压至少约0.5PSI、高于大气压至少约1PSI、高于大气压至少约1.5PSI、高于大气压至少约2PSI、高于大气压至少约2.5PSI或高于大气压至少约3PSI。在一些实施方案中，例如，PBMC可以在高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在高于大气压至少约1PSI的压力条件下培养。
在一些实施方案中，PBMC可以在给定的氧气水平和给定的压力条件下培养，例如上文提供的氧气水平和压力条件。在一些实施方案中，例如，PBMC可在约1％至约15％的氧气下培养，并且压力条件可以是高于大气压不超过约2PSI。在一些实施方案中，PBMC可在约15％的氧气和高于大气压不超过2PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在约1％至约15％的氧气和高于大气压至少约1PSI的压力条件下培养。在一些实施方案中，PBMC可以在约15％的氧气和高于大气压约1PSI的压力条件下培养。
对照培养条件可以包括标准培养条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包括环境(例如室内或大气)氧气水平或压力条件。
对照培养条件可以包含下列氧气水平，即约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含下列氧气水平，即至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
对照培养条件可以包含下列压力条件，即高于大气压约0PSI、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，对照培养条件可以包含高于大气压约0PSI的压力条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含高于大气压不超过0.5PSI或高于大气压不超过1PSI的压力条件。
在一些实施方案中，对照培养条件可以包括给定氧气水平和给定压力条件的组合，例如上文提供的对照培养条件的氧气水平和压力条件。例如，在一些实施方案中，对照培养条件可以包含约18％的氧气和高于大气压0PSI的压力条件。
可以培养PBMC，至少直到相对于在PBMC的对照培养条件下细胞因子的表达，PBMC中细胞因子的表达发生改变。细胞因子可以是一种可在细胞信号传导中发挥作用的小型蛋白质。在一些实施方案中，细胞因子可以参与自分泌、旁分泌或内分泌信号传导通路。在一些实施方案中，细胞因子可以是免疫调节剂。细胞因子可以包括趋化因子、干扰素、白细胞介素、淋巴因子或肿瘤坏死因子。细胞因子的示例可以包括，例如，IL-2、IL-4、IL-6、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-17、IL-21、CD40L(CD154)、淋巴毒素(LT、TNFβ)、干扰素-α、干扰素-β、干扰素-γ、C-CSF、GM-CSF或M-CSF。在一些实施方案中，其它细胞因子的表达也会发生改变。在一些实施方案中，细胞因子可以是未分化细胞的标志物。在一些实施方案中，细胞因子可以是分化细胞的标志物。
细胞因子表达的改变可以包括表达的增加或减少。在一些实施方案中，与在对照培养条件下培养的细胞中相同细胞因子的表达相比，在培养的PBMC中细胞因子的表达可增加至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％。在一些实施方案中，与在对照培养条件下培养的细胞中相同细胞因子的表达相比，在培养的PBMC中细胞因子的表达可减少至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约100％、至少约200％、至少约300％、至少约400％、至少约500％或至少约1000％。
在一些实施方案中，细胞因子表达的改变可以包括基因表达的改变，例如编码细胞因子的mRNA的表达的增加或减少。例如，mRNA表达的改变可包括DNA向mRNA转录的增加或减少。在某些情况下，mRNA表达的改变可包括编码细胞因子的mRNA的降解的增加或减少。
基因表达可以通过任何可接受的方法来测定。例如，可以使用ISH、FISH、RNA印迹、PCR、RT-PCR、q-PCR、p-RT-PCR或其它方法来测定基因表达。可以将RNA表达测定为绝对表达(例如，每个细胞的mRNA转录物的数量)或相对表达(例如，与同一细胞中管家基因的mRNA转录物的数量相比，mRNA转录物的数量；或与在对照条件下培养的细胞的相同mRNA转录物的数量相比，mRNA转录物的数量)。
在一些实施方案中，细胞因子表达的改变可以包括蛋白质表达的改变，例如产生的或检测到的细胞因子的增加或减少。例如，蛋白质表达的改变可以包括mRNA向蛋白质翻译的增加或减少。在某些情况下，蛋白质表达的改变可以包括蛋白质降解或失活的增加或减少。
蛋白质表达可以通过任何可接受的方法来测定。例如，可以通过免疫测定(例如，ELISA)、蛋白质印迹、斑点印迹、色谱法、分光光度法或其它方法来测定蛋白质表达。可以将蛋白质表达测定为绝对表达(例如，每个细胞的蛋白质分子的数量)或相对表达(例如，与同一细胞中管家蛋白的蛋白质分子的数量相比，蛋白质分子的数量；或与在对照条件下培养的细胞的相同蛋白质分子的数量相比，蛋白质分子的数量)。
在一些实施方案中，细胞因子可以是IL-10。在一些这样的实施方案中，可以降低IL-10的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是TNF-α。在一些这样的实施方案中，可以增加TNF-α的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是IL-6。在一些这样的实施方案中，可以降低IL-6的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以包含IFN-γ。在一些这样的实施方案中，可以降低IFN-γ的表达。在一些实施方案中，细胞因子可以是TGF-β1，并且可以增加TGF-β1的表达。
用于测定抗癌剂效力的方法还可以包括使肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂接触。
抗癌剂可以是可在治疗恶性或癌性疾病中有效的药剂，例如治疗剂。在一些实施方案中，抗癌剂可以有效治疗肿瘤，例如抑制肿瘤细胞生长或杀伤肿瘤细胞。抗癌剂的示例可以包括烷化剂、抗代谢物、天然产物、激素或其它药剂。在一些实施方案中，抗癌剂可以是一种化疗药物或化疗药物的组合。在一些实施方案中，抗癌剂可以包括在临床上能有效减轻肿瘤负荷、预防或消除转移、杀伤肿瘤细胞或防止肿瘤细胞生长的药物。在一些实施方案中，抗癌剂可以是PD1抑制剂。PD1抑制剂的示例可以包括，例如，帕博利珠单抗或纳武单抗。
在一些实施方案中，使肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂接触可以在体外进行。在一些这样的实施方案中，例如，可以在细胞培养基中，将肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂一起孵育。当单独应用抗癌剂时，可以按照治疗性浓度包含抗癌剂，或者当单独应用抗癌剂时，可以按照亚治疗性浓度包含抗癌剂。
PBMC和抗癌剂可以同时应用或顺次应用。在一些实施方案中，在抗癌剂之前，可以使PBMC接触肿瘤细胞。在一些实施方案中，在PBMC之前，可以使抗癌剂接触肿瘤细胞。
可以将肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂一起孵育一段时间。在一些实施方案中，可以将肿瘤细胞与PBMC一起孵育至少约1分钟、至少约5分钟、至少约15分钟、至少约30分钟、至少约1小时、至少约2小时、至少约3小时、至少约6小时或至少约12小时、至少约1天、至少约2天、至少约3天、至少约4天、至少约5天、至少约6天、至少约7天、至少约8天、至少约9天或至少约10天。在一些实施方案中，可以将肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂一起孵育不超过约1分钟、不超过约5分钟、不超过约15分钟、不超过约30分钟、不超过约1小时、不超过约2小时、不超过约3小时、不超过约6小时、不超过约12小时、不超过约1天、不超过约2天、不超过约3天、不超过约4天、不超过约5天、不超过约6天、不超过约7天、不超过约8天、不超过约9天或不超过约10天。在一些实施方案中，可以将肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂一起孵育约1分钟、约5分钟、约15分钟、约30分钟、约1小时、约2小时、约3小时、约6小时、约12小时、约1天、约2天、约3天、约4天、约5天、约6天、约7天、约8天、约9天、约10天，或任意两个前述值之间的范围。
作为对照，可以将额外的肿瘤细胞在没有抗癌剂的情况下与PBMC一起孵育、在没有PBMC的情况下与抗癌剂一起孵育，或者在没有抗癌剂也没有PBMC的情况下孵育。
可以分析肿瘤细胞或肿瘤细胞环境以测定细胞毒性。在一些实施方案中，例如，如上所述，可以分析细胞培养基以确定细胞质标志物的存在，这些标志物可以表明细胞膜完整性的丧失，从而表明细胞死亡。在一些实施方案中，细胞质标志物可以是天然存在的标志物，例如酶，或者可以是人工导入的标志物，例如在暴露于PBMC和/或抗癌剂之前加载入细胞内的放射性或荧光标志物。
在一些实施方案中，使肿瘤细胞与PBMC和抗癌剂接触可以在体内进行。在一些这样的实施方案中，可以将PBMC和抗癌剂施用于具有肿瘤细胞的受试者，例如患有肿瘤的受试者或患有转移的受试者。受试者可以是人类受试者或实验动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠、兔、狗或猫)。可以如上文所述将PBMC和抗癌剂施用于受试者。
用于测定抗癌剂效力的方法还可以包括测量对肿瘤细胞的细胞毒性，从而确定抗癌剂对肿瘤细胞的效力。在一些实施方案中，如上所述，细胞毒性可以在孵育一定时间后测量。例如，细胞毒性可以在至少约5天后测量。
在一些实施方案中，可以通过评估施用后受试者的肿瘤负荷来测量抗癌剂的细胞毒性。在一些实施方案中，在施用抗癌剂和PBMC之后，受试者的肿瘤可以缩小，肿瘤细胞死亡可以增加，或肿瘤细胞可以减少。
在一些实施方案中，当抗癌剂在对照条件下与肿瘤细胞接触时，相对于抗癌剂对肿瘤细胞的细胞毒性，伴有PBMC的抗癌剂的细胞毒性会增加。对照条件可以是体外条件(例如，培养条件)或体内条件(例如，在受试者中)。在一些实施方案中，当抗癌剂在对照培养条件下与肿瘤细胞接触时，相对于抗癌剂对肿瘤细胞的细胞毒性，细胞毒性可以增加至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％或至少约50％。
用于富集细胞亚群的方法
本文还提供了从源细胞群中富集细胞亚群的方法。在一些实施方案中，富集细胞亚群的方法可以包括在上文提供的条件下培养泛T细胞，其中细胞亚群包含CD8+细胞。
本文还提供了从源细胞群中富集细胞亚群的方法。在一些实施方案中，富集细胞亚群的方法可以包括在上文提供的条件下培养泛T细胞，其中细胞亚群包含CD4+细胞。
在一些实施方案中，例如，细胞亚群可以在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养。在一些这样的实施方案中，氧气水平可以是15％，并且压力条件可以是高于大气压2PSI。
用于增加细胞体积的方法
本文还提供了用于增加免疫细胞的细胞体积的方法。用于增加免疫细胞的细胞体积的方法可以包括培养免疫细胞，其中相对于在对照条件下培养的免疫细胞而言，免疫细胞的细胞体积增加。
在一些实施方案中，培养过程中的氧气水平可调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平。在一些实施方案中，总大气压可调节至相对于环境大气压的高压水平。在该方法的一些实施方案中，氧气水平可调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平，并且总大气压调节至相对于环境大气压的高压水平。在实施方案中，大气压和氧气水平彼此独立地进行调节，使得尽管总体上处于高压状态，但仍保持缺氧的氧气水平。
在一些实施方案中，例如，免疫细胞可以在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养。在一些这样的实施方案中，氧气水平可以是15％，并且压力条件可以是高于大气压2PSI。
在一些实施方案中，氧气水平可以是约1％、约2％、约3％、约4％、约5％，或者在任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，氧气水平可以是1％至约5％的氧气。
在一些实施方案中，免疫细胞可以是T细胞。在一些实施方案中，免疫细胞可以是B细胞。在一些实施方案中，免疫细胞可以是其它类型的细胞。
对照培养条件可以包括标准培养条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包括环境(例如室内或大气)氧气水平或压力条件。
对照培养条件可以包含下列氧气水平，即约15％、约16％、约17％、约18％、约19％或约20％，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含下列氧气水平，即至少约15％、至少约16％、至少约17％、至少约18％、至少约19％或至少约20％。
对照培养条件可以包含下列压力条件，即高于大气压约0PSI、高于大气压约0.5PSI、高于大气压约1PSI，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，例如，对照培养条件可以包含高于大气压约0PSI的压力条件。在一些实施方案中，对照培养条件可以包含高于大气压不超过0.5PSI或高于大气压不超过1PSI的压力条件。
在一些实施方案中，对照培养条件可以包括给定氧气水平和给定压力条件的组合，例如上文提供的对照培养条件的氧气水平和压力条件。例如，在一些实施方案中，对照培养条件可以包含约18％的氧气和高于大气压0PSI的压力条件。
在一些实施方案中，细胞体积可以增加至少10立方微米(μ3)、至少50μ3、至少100μ3、至少150μ3或至少200μ3，或任意两个前述值之间的范围。在一些实施方案中，细胞体积可以增加至少100μ3。
细胞群
源细胞群可以包括，例如免疫细胞、肿瘤细胞、非癌细胞和干细胞。免疫细胞群可以包括，例如单核细胞、巨噬细胞、抗原呈递细胞、树突状细胞、单核细胞、巨噬细胞、泛T细胞、T细胞、肿瘤浸润性T细胞、调节性T细胞、自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和B细胞。干细胞可以包括，例如，天然生成的干细胞或诱导性干细胞。干细胞群可以包括间充质干细胞，这些干细胞群包括任何祖细胞、未成熟和成熟亚群。
培养条件
如本文所述，氧气水平可以用浓度％值来表示，即，相对于给定体积内存在的所有气体而言，存在的氧气的相对量，而不考虑存在的所有气体的总大气压和。
除了调节氧气水平和总气体压力之外，通过大气手段调整表型的方法的一些实施方案可包括调节温度和调节pH值。以碳酸氢盐缓冲系统调节细胞培养基内的pH值，通常是通过调节内部大气中二氧化碳的浓度来实现的。细胞培养基内pH值的调节也可以通过使用其它缓冲系统来完成。
如本文所用的“本文所用，指的是高于环境大气压的压力(磅力/平方英寸)。
包含两个变量的术语O-P条件指的是由两个可变大气参数(氧气水平和总气体压力)的组合所定义的条件。分别定义每个参数的任何术语都可以用于标识O-P条件。例如，氧气水平可以根据浓度(总气体的相对％)或分压(每单位体积内氧气的绝对水平)来定义。通过一个具体示例，O-P条件可以表示为“件可的氧气–3PSI示。
潜能水平表型可以指的是从全能性到终末分化细胞范围内的表型谱。其它细胞潜能水平表型包括，例如，多能性、专能性、寡能性和单能性。
与细胞分化相关的应用
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数设置(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，以在一段时间内维持红细胞分化状态，且分化漂移最小。在一些实施方案中，氧气水平可以介于约1％至约15％之间。在一些实施方案中，压力条件可以不超过约2PSI。例如，红细胞可以来源于造血干细胞的分化。然后，分化的造血干细胞可以经过共同的髓系祖细胞阶段，然后进入巨核细胞–红系祖细胞阶段，最后进入红细胞阶段。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别有利于单核细胞分化为M1型极化巨噬细胞(相对于M2型极化巨噬细胞)的大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法。在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别有利于单核细胞向M1型极化巨噬细胞群分化的大气条件参数的方法。在一些实施方案中，氧气水平可以介于约1％至约15％之间。在一些实施方案中，压力条件可以不超过约2PSI。
细菌脂多糖以及细胞因子如GM-CSF或干扰素，可以使巨噬细胞发生M1型极化。巨噬细胞的M1型激活可引起表型变化，例如促炎细胞因子、活性氧簇和氮自由基的释放，并且M1型激活可以提高对靶细菌的攻击水平。
巨噬细胞可以通过造血干细胞的分化而衍生，并且可以经过共同的髓系祖细胞阶段、随后的粒细胞-巨噬细胞祖细胞状态，然后进入单核细胞阶段，最后到巨噬细胞阶段。
在该方法的一些实施方案中，氧气处于缺氧水平，而总大气压为高压。
在一些实施方案中，本公开提供了一种与环境大气条件相比，在最佳大气条件下提高从前脂肪细胞到小鼠成熟脂肪细胞的分化率的方法。在一些实施方案中，氧气处于缺氧水平，而总大气压为高压。在一些实施方案中，本公开提供了一种与标准或环境大气条件相比，在最佳大气条件下提高从iPSC到神经元的分化率的方法。在一些实施方案中，氧气处于缺氧水平，而总大气压为高压。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数对于驱动从iPSC向造血干细胞(HSC)群分化，然后向巨核细胞群分化是最佳的。例如，可以通过FACS分析来确定各种表型的存在。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于与在标准或环境条件下的培养相比，在最佳大气条件下提高从iSPC到心肌细胞的生长和分化的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数对于在前列腺癌细胞系PC-3中诱导缺氧诱导因子-1(HIF-1)而言是最佳的。在一些实施方案中，本公开提供了一种在有和没有增加的大气压下确定在例如前列腺癌细胞系中诱导HIF-1的诱导时间进程的方法。在环境大气压条件下，诱导时间进程可以在约24小时达到峰值，而在高于环境压力2PSI的情况下，HIF-1可以在6小时达到峰值。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于与在标准或环境条件下的培养相比，在最佳大气条件下改进来自活检的胰腺癌细胞类器官的发育的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数对于生成卵巢癌簇(肿瘤类器官)而言是最佳的。然后，这些肿瘤类器官可以用作例如测试化疗药物效力的底物。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别用于培养肿瘤活检样品的大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法。接着，由此产生的细胞群可以用作测试抗癌药物或候选药物的底物。例如，源于细胞系的结直肠癌细胞可以生长成球体，然后T细胞或NK细胞可以激活对结直肠癌细胞球体的杀伤作用，并且可以在最佳大气条件下观察这种杀伤作用。在另一个示例中，B16黑色素瘤细胞系可以生长成球体，并且可以观察CD8-脾细胞介导的杀伤作用。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数调整源自活检样品的非小细胞肺癌细胞(NSCLC)的体外生长速率。
在一些实施方案中，与环境条件相比，氧气处于缺氧水平，而总大气压为高压。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于确定从冷冻小瓶中解冻细胞的最佳大气条件的方法。在一些实施方案中，与在标准或环境条件下解冻的细胞相比，在最佳大气条件下髓系白血病(AML)癌细胞的解冻和随后的活力可以更高。
Treg细胞是一种特化的T细胞亚群，广泛地作用于抑制免疫应答，从而维持稳态和自身耐受。更具体而言，Treg抑制效应T细胞增殖和细胞因子产生，并在降低自体免疫反应性的可能性中发挥作用。T细胞衍生自起源于造血干细胞的分化路径，并经过共同的淋巴系祖细胞阶段，然后最终进入T细胞阶段。
可以观察到缺氧和高压条件对Treg细胞的其它表型效应。在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数支持调节性T细胞(Treg)以比在标准培养箱条件下培养的Treg更快的速度生长。在一些实施方案中，本公开提供了一种在多种大气条件下培养来自肾炎患者的调节性T细胞上的成熟标志物的方法，以了解在炎症性疾病过程中这些细胞中发生的变化，和/或引导将这些细胞用作测试治疗性候选药物的底物。
Treg细胞包括在用于免疫疗法的CAR-T细胞(嵌合抗原受体T细胞，T细胞指胸腺起源的淋巴细胞)的开发中。Treg细胞的病毒转导是赋予这些细胞嵌合抗原受体状态的一部分。在一些实施方案中，在缺氧和/或高压条件下，基因转染和病毒转导可能更加高效。
Treg细胞在其成熟过程中从初始状态发展到更特异性的抗原靶向状态。作为在转导过程中用于成为嵌合抗原装配的Treg细胞的原材料或底物，初始细胞(而不是已经指定抗原的细胞)可能是有利的。本文描述的培养条件可以将Treg细胞的发育或成熟状态稳定在其初始状态。在图13C中示意性地描绘了这种表型的稳定。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数对于维持T细胞功能而言是最佳的。T细胞耗竭会削弱T细胞的功能。T细胞耗竭涉及许多功能失调，包括由于细胞的长期抗原刺激而导致的效应功能的渐进性丧失，如在慢性感染或癌症长期存在期间可能在体内发生的情况。环境中的其它因素，如正常细胞因子谱的不平衡，也可能导致耗竭。T细胞耗竭会影响已从患者取出用于临床生产过程如产生CAR-T细胞的细胞，并且T细胞耗竭会在生产过程中持续或发生。因此，良好控制且一致的体外环境，包括大气变量，如氧气水平和总气体压力水平，可以促进未耗竭或已从耗竭中恢复的稳健的T细胞群的发展。在一些实施方案中，与环境条件相比，氧气处于缺氧水平，而总大气压为高压。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数对于自然杀伤细胞杀伤癌细胞是最佳的。NK92是一种来源于患有非霍奇金淋巴瘤的人类患者的自然杀伤细胞系，其是组成性激活的并且缺乏抑制性受体，使得NK92成为潜在的现成候选细胞疗法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种用于与在标准或环境条件下的培养相比，在最佳大气条件下的培养期间改进肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)表型的长期维持的方法。
在一些实施方案中，本公开提供了一种鉴别大气条件参数(例如氧气水平和总大气压水平)的方法，这些参数对于体外增殖嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)是最佳的。CAR-T细胞的嵌合细胞受体经过基因工程改造以与特异性抗原结合，例如在癌细胞表面表达的抗原，并且在T细胞遇到表达该抗原的癌细胞时激活T细胞。在评估这种CAR-T细胞的有效性方面，变量包括工程化受体识别靶抗原的有效性和激活T细胞的有效性。因此，筛选这些受体及其效力需要大量稳健且质量稳定的T细胞。
在一些实施方案中，与环境条件相比，氧气处于缺氧水平，而总大气压为高压。
药物组合物和给药
如本文所用的，“药学上可接受的载剂”或“药学上可接受的赋形剂”包括任何材料，当与活性成分结合时，该材料允许该成分保持生物学活性并且不与受试者的免疫系统发生反应。示例包括但不限于任何标准药学载剂，例如磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液如油/水乳液和各种类型的润湿剂。用于气雾剂或胃肠外施用的优选稀释剂是磷酸盐缓冲盐水或生理(0.9％)盐水。包含此类载剂的组合物通过众所周知的常规方法来配制(例如，参见Remington's Pharmaceutical Sciences,第18版,A.Gennaro编,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1990；和Remington,The Science and Practice of Pharmacy第20版.MackPublishing,2000)。
可接受的载剂、赋形剂或稳定剂在使用的剂量和浓度下对接受者无毒，并且可以包括：缓冲剂，如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；盐类，如氯化钠；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如，十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；苯扎氯铵、苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；烷基对羟基苯甲酸酯类，如甲基或丙基对羟基苯甲酸酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；以及间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或葡聚糖；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐反离子，如钠；金属络合物(如，锌-蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
拟用于体内施用的制剂可以进行灭菌。这可以通过例如滤过无菌过滤膜或任何其它本领域公认的灭菌方法来实现。通常将PBMC组合物置于具有无菌接入口的容器中，例如具有可经皮下注射针刺穿的塞子的静脉注射液袋或小瓶。其它用于灭菌和过滤的方法在本领域中是已知的，并且在本文中有所考虑。
在一些实施方案中，该组合物可以配制成不含热原，以使其对于向受试者施用是可接受的。测试组合物中的热原和制备不含热原的药物组合物对于本领域普通技术人员来说很好理解。
根据本发明的组合物可以是单位剂型，例如溶液剂或混悬剂、片剂、丸剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂或栓剂等，以用于静脉内、经口、胃肠外或直肠施用，或者通过吸入或吹入施用。
短语“药学上可接受的”指的是生理上可耐受的分子实体和组合物，当施用于受试者时，通常不会产生变态反应或类似的不良反应，例如胃部不适、头晕等。
当用于提及治疗性组合物或药物组合物时，“单位剂量”指的是适合作为用于人类的单一剂量的物理上不连续的单位，每个单位含有预定数量的活性物质，该数量经计算与所需稀释剂(即，载剂或媒介物)联合在一起产生期望的治疗效果。
该组合物可以以与剂型相适应的方式，并按照治疗有效量施用。拟施用的数量取决于接受治疗的受试者、受试者免疫系统利用活性成分的能力以及期望的结合能力的程度。需要施用的活性成分的精准量取决于从业人员的判断，并且对于每个个体都是特有的。此外，还考虑了足以维持血液中浓度的持续静脉内输注。
每当术语“不超过”、“小于”或者“小于或等于”位于两个或更多个数值的序列中的第一个数值之前时，术语“不超过”、“小于”或者“小于或等于”适用于该数值序列中的每个数值。例如，小于或等于3、2或1等同于小于或等于3、小于或等于2、或者小于或等于1。
如本文所用的术语“约”，一般指的是在特定用法的上下文中，大于或小于(一般规定数值2％、5％、10％、15％的范围。例如，“约10围将包括从8.5到11.5的范围。如本文所用的，当用于修饰数值或数值范围时，术语“约”和“近似”表示高于或低于该数值或范围最多约0.2％、约0.5％、约1％、约2％、约5％、约7.5％或约10％(或在约1％和10％之间的任何整数)的偏差仍处于所提及的数值或范围的预期含义内。
方法1400(图14)的实施方案包括在细胞培养箱内的培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱能够独立于相应的环境大气条件而调节培养箱内的至少两个可变大气条件参数，其中可变大气参数中的两个是氧气水平和总大气压水平1401；调节培养箱内氧气水平和总大气压水平中的至少一个，使得氧气水平或总大气压水平中的至少一个不同于相应的环境水平，其中如果氧气水平不同于相应的环境水平，则氧气水平被调节至缺氧水平，而其中如果总大气压不同于相应的环境水平，则总大气压被调节至高压水平1402；以及作为调节可变大气条件参数的结果，经孵育期将源群的表型参数的表达从第一表型驱动至第二表型，其中细胞子群的第一表型是在培养箱内的可变大气条件参数与环境大气条件基本相同的大气条件下会表达的表型，并且其中细胞子群的第二表型因暴露于由培养箱调节的可变大气条件而表达1403。
方法1500(图15)的实施方案包括在细胞培养箱内的液体培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱被配置为独立于任何相应的环境大气条件而调节培养箱内大气条件的两个或更多个可变参数，其中，源群的表型最初包括关于细胞培养性能的一个或多个参数的初始可变性水平1501；调节培养箱内大气条件的两个或更多个可变参数，使得可变参数中的至少一个不同于相应可变参数的环境水平1502；以及作为在调节的大气条件下培养源细胞群的结果，关于细胞培养性能的一个或多个参数的可变性水平降低，从而产生表型同质性水平高于源细胞群的后期细胞群1503。
方法1600(图16)的实施方案包括在细胞培养箱内的液体培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱被配置为调节培养箱内的大气参数，其中，该大气参数包含氧气水平和总气体压力水平1601；调节培养箱内的大气参数，使得大气参数中的至少一个不同于其环境水平1602；以及作为调节大气参数的结果，将细胞群稳定为第一表型，其中，第二表型是在培养箱内的可变大气参数与环境条件基本一致的大气条件下细胞群将漂移至的表型1603。
方法1700(图17)的实施方案包括将源细胞群分成包括至少第一和第二队列培养物的队列培养物1701；在多个大气条件下平行培养队列细胞培养物，该大气条件仅在氧气浓度和总气体压力中任何一项的变化方面有所不同1702；测量细胞培养性能参数，该参数指示每个队列培养物内的期望表型1703；以及根据队列培养物中细胞培养性能参数的结果，确定哪种氧气水平和哪种总气体压力水平对于具有期望表型的细胞群的生长而言是最佳的1704。
方法1800(图18)的实施方案包括将细胞的免疫细胞群分成多个队列细胞培养物1801；以及在多个大气条件下平行培养队列细胞培养物，该大气条件仅在氧气水平或总气体压力中任何一项的变化方面有所不同1802；以及测量细胞培养性能参数，该参数对每个队列培养物中免疫细胞导向的生物活性剂有响应1803；以及根据对队列培养物中细胞培养性能参数的测量，确定哪种氧气和总气体压力水平支持队列免疫细胞培养物中对生物活性剂的最大响应性1804。
方法1900(图19)的实施方案包括在覆盖的大气条件下，在液体培养基中扩增源自患者肿瘤的细胞群，该大气条件已知有利于生长来自类似该患者肿瘤的肿瘤的细胞，其中大气条件包含氧气的缺氧水平和总气体压力的高压水平，并且其中，扩增细胞群包括扩增至足以接种多个队列培养物的水平1901；将扩增的细胞群分成多个队列细胞培养物1902；在除了一种或多种抗癌剂的存在之外均相同的条件下，以及在已知或假定有利于表达对于测试抗癌剂效力而言最佳的细胞表型的大气条件下，平行培养队列细胞培养物，其中该大气条件包含氧气的缺氧水平和总气体压力的高压水平1903；测量每个队列培养物中受抗癌剂影响的细胞培养性能参数1904；以及根据对队列培养物中细胞培养性能参数的测量，预测一种或多种抗癌剂在治疗患者肿瘤中的效力1905。
方法2000(图20)的实施方案包括在细胞培养箱中孵育源细胞群，该细胞培养箱被配置为运行控制大气条件的培养箱程序，其中所述程序指导优化目标表型表达的大气条件，所述程序包括针对(1)氧气水平和(2)总气体压力水平的设定点范围2001；根据大气条件设定点范围调节培养箱内的氧气水平和总气体压力2002；以及根据所述大气条件设定点范围将细胞群培养足够的培养时间，以产生表达目标表型的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包括作为人类治疗剂的潜在用途2003。
方法2100(图21)的实施方案包括在细胞培养箱内的液体培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱被配置为运行第一和第二控制大气条件的程序，其中每个程序包括氧气水平和总气体压力水平的设定点范围，其中第一和第二大气条件程序彼此不同2101；以及在细胞培养时段(cell culture run)过程的第一阶段和第二阶段中调节培养箱内的氧气水平和总气体压力，其中，根据控制大气条件的程序运行第一阶段，该控制大气条件的程序被优化以支持包含表达目标表型的潜力的细胞群的扩增，并且其中，根据第二控制大气条件的程序运行第二阶段，该第二控制大气条件的程序被优化以支持目标表型的表达2102。
方法2200(图22)的实施方案包括在细胞培养箱内培养源细胞群，该细胞培养箱能够独立于任何相应的环境大气条件而调节培养箱内大气条件的至少两个可变参数，其中所述参数包含氧气水平和总气体压力水平2201；调节培养箱内大气条件的可变参数，使得它们中的至少一个不同于相应可变参数的环境水平2202；以及作为调节大气条件的结果，将子群体从第一表型驱动至第二表型，其中细胞子群的第一表型是在培养箱内的可变大气参数与环境条件基本相同的大气条件下会表达的表型，并且其中细胞子群的第二表型因暴露于培养箱内调节的大气条件而表达2203；以及收集产物，其中该产物是第二表型的细胞群，或者是由第二表型的细胞群制备的产物2204。
实施例
实施例1：缺氧和高压培养条件对细胞因子分泌的影响
从健康志愿者中分离出外周血单核细胞(PBMC)，并在不同的缺氧和高压条件下培养。在正常大气条件(环境条件)、缺氧+高压条件(高于环境条件2PSI，15％O2)和缺氧条件(环境压力，15％O2)下培养PBMC。所有PBMC都在含有IL-2(10ng/mL)的Immunocult-XF T细胞扩增培养基中培养，并在培养期开始时用抗CD3/CD28人类T-活化剂Dynabeads激活。收集细胞培养上清液，并使用人类细胞因子抗体阵列(Abcam，产品编号ab133997)进行分析。表1和表2示出了所用抗体阵列的图谱，表1显示了阵列中A-F列的细胞因子身份，而表2显示了G-L列。膜上的信号通过ECL检测试剂(GE Healthcare)来显影，并在MyECL成像系统(ThermoScientific)上成像。图1A示出了三种不同缺氧和高压条件下细胞因子阵列的图像，而图1B示出了从图1A的阵列中选定的细胞因子的汇总(表示为相对于标准大气条件的倍数变化)。
如图1A和图1B所示，分泌的IL-10水平在缺氧+高压条件下降低，但不受单独缺氧条件的影响。TNF-α的分泌水平在缺氧+高压条件下不受影响，但在缺氧条件下有所增加。分泌的IFN-γ和IL-6水平在不同的条件下显示出极小的变化，而分泌的TNF-α水平在缺氧以及缺氧+高压条件下都有所增加。
| A | B | C | D | E | F | |
| 1 | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | ENA-78 | GCSF |
| 2 | 阳性 | 阳性 | 阴性 | 阴性 | ENA-78 | GCSF |
| 3 | IL-2 | IL-3 | IL-4 | IL-5 | IL-6 | IL-7 |
| 4 | IL-2 | IL-3 | IL-4 | IL-5 | IL-6 | IL-7 |
| 5 | MCP-1 | MCP-2 | MCP-3 | MCSF | MDC | MIG |
| 6 | MCP-1 | MCP-2 | MCP-3 | MCSF | MDC | MIG |
| 7 | TNF-α | TNF-β | EGF | IGF-1 | 血管生成素 | 制瘤素M |
| 8 | TNF-α | TNF-β | EGF | IGF-1 | 血管生成素 | 制瘤素M |
表1：图1A中A-F列的细胞因子抗体阵列的细胞因子图谱
| G | H | I | J | K | L | |
| 1 | GM-CSF | GRO | GRO-α | I-309 | IL-1α | IL-1β |
| 2 | GM-CSF | GRO | GRO-α | I-309 | IL-1α | IL-1β |
| 3 | IL-8 | IL-10 | IL-12p40/p70 | IL-13 | IL-15 | IFN-γ |
| 4 | IL-8 | IL-10 | IL-12p40/p70 | IL-13 | IL-15 | IFN-γ |
| 5 | MIP-1δ | RANTES | SCF | SDF-1 | TARC | TGF-β1 |
| 6 | MIP-1δ | RANTES | SCF | SDF-1 | TARC | TGF-β1 |
| 7 | 血小板生成素 | VEGF | PDGF BB | 瘦素 | 阴性 | 阳性 |
| 8 | 血小板生成素 | VEGF | PDGF BB | 瘦素 | 阴性 | 阳性 |
表2：图1A中G-L列的细胞因子抗体阵列的细胞因子图谱
实施例2：缺氧和高压培养条件对PBMC的肿瘤杀伤活性及免疫疗法的效力的影响
从21名健康志愿者中分离出PBMC。以20:1的效应物与靶标的比例，将PBMC与靶肿瘤细胞(PC-3，一种前列腺癌细胞系)一起培养。将所有细胞在补充有10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养5天时间。PBMC未被IL-2激活。在5天期限结束时，通过CellTiterGlo测定法(Promega)测量细胞活力，并在技术上重复3次或4次。将21个PBMC分离物中的每一个与靶细胞在环境条件或缺氧+高压条件(1％O2，高于环境压力2PSI)下一起培养，并且使用或不使用抗PD-1抗体。所用的抗PD-1抗体是纳武单抗和帕博利珠单抗(10ug/mL)。21个不同PBMC分离物的平均结果显示在图2中，误差线代表平均值的标准误差，并且使用配对学生t检验来计算p值。
如图2所示，缺氧+高压条件对纳武单抗处理的效力没有明显影响，但在缺氧+高压条件下，帕博利珠单抗处理在激活PBMC杀伤肿瘤细胞方面更高效(p值为0.0037)。
在没有药物治疗的情况下，缺氧+高压条件显示出提高肿瘤细胞杀伤效力的趋势；然而，结果未达到统计学意义，这可能是由于供体之间的差异。
实施例3：缺氧和高压培养条件对T细胞扩增的影响
从4名健康志愿者中分离出PBMC。使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从PBMC中分离出T细胞，并在不同的氧气和压力条件下，在补充有10ng/mL IL-2的Immunocult-XF T细胞扩增培养基中培养。用抗CD3/CD28人类T-活化剂Dynabeads激活细胞。在第3、7、10和4天时对细胞进行计数。图3A示出了在标准大气条件(大气压下20％O2)、大气压下15％O2、高于大气压2PSI下15％O2、大气压下5％O2、高于大气压2PSI下5％O2、大气压下1％O2和高于大气压2PSI下1％O2下生长时，T细胞的生长曲线。图3B示出了在第14天时不同条件下T细胞倍数扩增的柱状图，而图3C以表格形式示出了相同的数据。如图3A-3C所示，与在标准条件下生长的T细胞的约71倍扩增相比，用高于大气压2PSI下15％O2培养的细胞生长最快，达到几乎97倍扩增。在每种不同的O2浓度下，高压条件下培养的细胞显示出更大的倍数扩增。
实施例4：缺氧和高压培养条件对CD4和CD8生物标志物表达的影响
为了评估缺氧和高压培养条件对T细胞表型的影响，将泛T细胞在不同条件下培养14天，并通过荧光辅助细胞分选(FACS)染色来评估CD4和CD8。将细胞在标准大气条件、大气压下15％O2、高于大气压2PSI下15％O2、大气压下5％O2、高于大气压2PSI下5％O2、大气压下1％O2和高于大气压2PSI下1％O2下培养。图4A示出了细胞分选实验的代表性图，其中CD8表达显示在纵轴上，而CD4表达显示在横轴上。CD4-CD8-、CD4+CD8-、CD4-CD8+和CD4+CD8+的细胞的百分比显示为所分析的泛T细胞总数(CD3+细胞)的百分比。如图4A所示，在高于大气压2PSI下15％O2条件下培养后，CD8+细胞的百分比增加，但在大气压下5％O2条件下和两种压力下1％O2条件下培养后，CD8+细胞的百分比下降。在15％和5％O2条件的高压条件下，CD4+细胞的百分比降低，但在1％O2的高压条件下，CD4+细胞的百分比增加。
图4B示出了CD8+细胞相对于CD3+泛T细胞总数的百分比；这个数据也总结在图4D中。图4C示出了CD4+细胞相对于CD3+泛T细胞总数的百分比；这个数据也总结在图4E中。如图4A、4B和4D所示，在高于大气压2PSI下15％O2下培养后，CD8+细胞的百分比增加，但在大气压下5％O2下和两种压力下1％O2下培养后，CD8+细胞的百分比下降。如图4A、4C和4E所示，在15％和5％O2的高压条件下，CD4+细胞的百分比降低，但在1％O2的高压条件下，CD4+细胞的百分比增加。
实施例5：缺氧和高压培养条件对细胞因子和细胞毒性基因的表达的影响
使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体PBMC中分离出泛T细胞，并在含有IL-2(10ng/mL)的Immunocult-XF T细胞扩增培养基中培养。使用抗CD3/CD28人类T-活化剂Dynabeads激活泛T细胞。将细胞在不同条件下培养3天。在第3天时收集细胞，使用Qiagen RNeasy plus Mini试剂盒分离出总RNA，并通过RT-qPCR分析细胞因子和细胞毒性基因的表达。IL-10的表达在15％O2+高压条件下，以及在大气压和高压下的5％O2下均受到抑制(图5A)。在大气压和高压下1％O2条件下，IL-10的表达均上调(图5A)。在大气压和高压下1％O2的缺氧条件下，IL-6的表达均上调(图5B)。在大气压时，无论是15％O2还是5％O2条件下，IL-6的表达都没有显著增加，但在高压条件时，在这两种O2水平下，IL-6的表达都有所增加(图5B)。
在大气压和高压下5％O2和1％O2的缺氧条件下，细胞毒性基因颗粒酶B和穿孔素的表达均上调，见图6A和6B。
实施例6：缺氧和高压培养条件对细胞大小的影响
使用人泛T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从健康供体PBMC中分离出泛T细胞。将泛T细胞培养在含有IL-2(10ng/mL)的Immunocult-XF培养基中，并在缺氧和高压培养条件下，使用抗CD3/CD28人类T-活化剂Dynabeads激活。培养7天后，通过Countess FL细胞计数仪测量细胞大小。在5％O2和1％O2的缺氧条件下生长的T细胞体积比在标准O2水平或15％O2水平下培养的细胞大(图7，n＝6名独特供体)。
实施例7：缺氧和高压培养条件对检查点基因表达的影响
将来自3名独特供体的泛T细胞在含有10ng/mL IL-2的Immunocult-XF培养基中扩增，并在不同的缺氧和高压培养条件下使用抗CD3/CD28人类T-活化剂Dynabeads进行激活。在第3天时收集细胞进行RNA分离。通过RT-qPCR分析检查点基因PD1和CTLA4的表达。如图8A所示，在大气压和高压的5％O2和1％O2下，PD1的表达都有所增加。如图8B所示，在15％O2+高压下，CTLA4的表达显著上调，而在高压的5％O2和1％O2下，CTLA4的表达有所下调。
实施例8：缺氧和高压培养条件对细胞因子表达的影响
分离出泛T细胞并在不同的缺氧和高压条件下培养7天。收集上清液，并使用流式微珠阵列术(CBA)人类Th1/Th2/Th17细胞因子试剂盒(BD Biosciences)评估IFN-γ、IL-6和IL-10的分泌。如图9A所示，在15％O2+高压下，IFN-γ的表达降低，而在5％O2+高压下，IFN-γ的表达升高，并且在大气压和高压的1％O2下，IFN-γ的表达均升高。如图9B所示，在大气压和高压的5％O2和1％O2下，IL-6的表达都有所增加。在大气压和高压的1％O2下，IL-10的表达都有所增加(图9C)。
实施例9：缺氧和高压培养条件对Treg细胞FOXP3表达的影响
通过磁珠富集Treg细胞，并在标准条件(STD)或缺氧+高压条件下培养14天。通过流式细胞术分析FOXP3+Treg细胞的百分比。如图10A和10B所示，当在缺氧+高压条件(高于大气压2PSI下5％O2)下培养时，更大百分比的Treg细胞表达FOXP3。图10C和10D分别示出了在标准条件以及缺氧+高压条件下生长的细胞的代表性散点图。
为了进一步评估缺氧+高压培养条件的影响，用磁珠富集Treg细胞，并在标准条件以及缺氧+高压条件下(高于大气压2PSI下15％O2，以及高于大气压2PSI下5％O2)培养12天。在第12天时，将细胞平均分成两部分，一部分在原始条件下培养，另一部分在高于大气压2PSI下1％O2条件下继续培养2天。在第14天时，通过流式细胞术分析FOXP3+阳性Treg细胞。如图10E所示，与标准条件相比，缺氧+高压条件产生了更多的FOXP3+Treg细胞，并且与原始条件相比，在缺氧加剧的条件下培养两天进一步增加了FOXP3+Treg细胞的比例。
虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施方案仅是以示例的方式提供。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的情况下，现在将会出现许多变型、改变和替换。应该理解的是，在实施本发明的过程中，可以采用本文描述的本发明实施方案的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构以及它们的等同形式。
实施方案
实施方案1.一种调整源细胞群中至少一个子群的表型的方法，该方法包括：在细胞培养箱内的液体培养基中培养该源细胞群，该细胞培养箱被配置为能够独立于相应的环境大气条件而调节培养箱内的至少两个可变大气条件参数，其中可变大气参数中的两个是氧气水平和总大气压水平；调节培养箱内氧气水平和总大气压水平中的至少一个，使得氧气水平或总大气压水平中的至少一个不同于相应的环境水平；以及作为调节可变大气条件参数的结果，经孵育期将源群的表型参数的表达从第一表型驱动至第二表型，其中细胞子群的第一表型是在培养箱内的可变大气条件参数与环境大气条件基本相同的大气条件下会表达的表型，并且其中细胞子群的第二表型因暴露于由培养箱调节的可变大气条件而表达。
实施方案2.实施方案1所述的方法，其中第一和第二表型包含体外细胞培养性能的一个或多个可观察参数的指标。
实施方案3.实施方案1-2中任一项所述的方法，其中细胞培养参数中的一个或多个参数选自于生长速率、细胞死亡率、可达到的细胞密度、细胞产物的产生速率(天然的或基于转染的)、细胞形态、细胞尺寸、细胞粘附特性、细胞电学特性、细胞代谢活动、细胞迁移行为、细胞活化状态、细胞分化状态、生物标志物显示、对转染的顺应性或抗性、对感染的易感性或抗性、对病毒转导的顺应性或抗性、对生物活性剂的响应性或抗性，或者细胞表型或功能的任何其它可观察的方面。
实施方案4.实施方案1-3中任一项所述的方法，其中第二表型适用于人类治疗性应用，所述应用可以选自于患者治疗、药物开发试验中的药物筛选和测试对候选药物的患者特异性敏感性。
实施方案5.实施方案1-4中任一项所述的方法，其中将培养箱内的氧气水平调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平。
实施方案6.实施方案1-5中任一项所述的方法，其中将总大气压调节至相对于环境大气压的高压水平。
实施方案7.实施方案1-6中任一项所述的方法，其中将氧气水平调节至相对于环境氧气水平的缺氧水平，并且其中将总大气压调节至相对于环境大气压的高压水平。
实施方案8.实施方案1-7中任一项所述的方法，其中将总大气压调节至高压水平，并且其中将氧气水平调节至缺氧水平，大气压和氧气水平彼此独立地进行调节，使得尽管总体上处于高压状态，但仍保持缺氧的氧气水平。
实施方案9.实施方案1-8中任一项所述的方法，其中氧气水平处于约0.1％至约20％的范围内。
实施方案10.实施方案1-9中任一项所述的方法，其中氧气水平处于约1％至约15％的范围内。
实施方案11.实施方案1-10中任一项所述的方法，其中氧气水平处于约2％至约10％的范围内。
实施方案12.实施方案1-11中任一项所述的方法，其中总大气气体压力高于环境大气压，高出的值在约0.1PSI至约10PSI的范围。
实施方案13.实施方案1-12中任一项所述的方法，其中总大气气体压力高于环境大气压，高出的值在约1PSI至约6PSI的范围。
实施方案14.实施方案1-13中任一项所述的方法，其中总大气气体压力高于环境大气压，高出的值在约2PSI至约5PSI的范围。
实施方案15.实施方案1-14中任一项所述的方法，其中大气条件的第三个可变参数包括二氧化碳水平或温度。
实施方案16.实施方案15所述的方法，其中温度范围介于约33℃和约40℃之间。
实施方案17.实施方案15所述的方法，其中大气中二氧化碳的水平对液体培养基的pH值产生影响，并且其中pH值包含另一个可变参数，该参数能够有助于将子群体驱动到第二表型。
实施方案18.实施方案1-17中任一项所述的方法，其中第一表型的子群体包括对两个或更多个可变大气参数的组合有响应的表型可塑性，所述可塑性支持第一表型向第二表型的驱动。
实施方案19.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中在没有同时存在的转染方法的情况下，将子群体从第一表型驱动至第二表型。
实施方案20.实施方案1-18中任一项所述的方法，其中与同时存在的转染方法相结合，将子群体从第一表型驱动至第二表型。
实施方案21.实施方案1-20中任一项所述的方法，其中第二表型的相对生长速率可以大于第一表型的相对生长速率、基本上等同于第二表型的相对生长速率或者小于第一表型的相对生长速率。
实施方案22.实施方案1-21中任一项所述的方法，其中调整源群中至少一个子群体的表型包括改变该子群体在源群中的相对存在。
实施方案23.实施方案22所述的方法，其中改变子群体在源群内的相对存在包括与源细胞群内的其它子群体相比，该子群体的净生长速率增加。
实施方案24.实施方案22所述的方法，其中改变子群体在源群内的相对存在包括将个体细胞从第一表型转换至第二表型。
实施方案25.实施方案1-24中任一项所述的方法，其中调整源群中至少一个子群体的表型包括驱动表型的改变，如果没有调节培养箱内两个或更多个大气条件变量，该改变不会发生。
实施方案26.实施方案1-24中任一项所述的方法，其中调整源群中至少一个子群体的表型包括加速表型的改变，如果没有调节培养箱内两个或更多个大气条件变量，该改变可能发生。
实施方案27.实施方案1-26中任一项所述的方法，其中大气条件的两个或更多个可变参数包括氧气水平和总大气压力，在细胞培养箱内培养细胞包括培养持续一个培养时段，在这段时间内氧气水平和总气体压力均基本恒定。
实施方案28.实施方案1-27中任一项所述的方法，其中大气条件的两个或更多个可变参数包括氧气水平和总大气压力，并且在细胞培养箱内培养细胞包括在培养时段中改变氧气水平或总气体压力中的至少一个。
实施方案29.实施方案28所述的方法，其中在培养期间改变总气体压力和至少一种单个气体中的至少一个包括在培养期间对总气体压力和至少一种单个气体的浓度中的任一个或多个进行提高或降低中的任一项。
实施方案30.实施方案28所述的方法，其中改变总气体压力和至少一种单个气体的浓度中的任一个或多个包括以斜坡函数的形式改变。
实施方案31.实施方案28所述的方法，其中改变总气体压力和至少一种单个气体的浓度中的任一个或多个包括以阶跃函数的形式改变。
实施方案32.实施方案31所述的方法，其中阶跃函数在运行时间内执行，该时间足以使液体细胞培养基中溶解的气体水平与该培养基所暴露于的大气条件达到平衡。
实施方案33.实施方案28所述的方法，其中改变总气体压力和至少一种单个气体的浓度中的任一个或多个包括在第一组气体条件下培养和在至少第二组气体条件下培养。
实施方案34.实施方案33所述的方法，其中在第一气体条件下培养和在至少第二气体条件下培养包括从第一条件移向至少第二条件再返回到第一条件，如此进行一次或多次。
实施方案35.实施方案28所述的方法，其中改变总气体压力和至少一种单个气体中的任一个或多个包括同步改变(a)总气体压力和(b)至少一种气体的浓度。
实施方案36.实施方案28所述的方法，其中改变总气体压力和至少一种单个气体中的任一个或多个包括异步改变(a)总气体压力和(b)至少一种气体的浓度。
实施方案37.实施方案1-36中任一项所述的方法，其中液体培养基包括一种或多种生物活性剂。
实施方案38.实施方案37所述的方法，其中生物活性剂包括核酸、肽、蛋白质或脂质中的任何一种。
实施方案39.实施方案37所述的方法，其中生物活性剂包括转录因子、细胞因子或生长因子中的任何一种。
实施方案40.实施方案1-39中任一项所述的方法，其中调节大气条件的两个或更多个可变参数包括使在气相顶部空间中的一种或多种单个气体与溶解在液体培养基中的一种或多种气体之间建立或接近平衡，其中该平衡在直接气体-液体界面处建立。
实施方案41.实施方案1-40中任一项所述的方法，其中源群包括选自于免疫细胞群、肿瘤细胞群和干细胞群的细胞群。
实施方案42.实施方案41所述的方法，其中源群是免疫细胞群，并且其中从第一表型到第二表型的表型转变是通过暴露于缺氧大气条件下而调整的，其中该缺氧条件包括介于约1％和约15％之间的氧气水平范围。
实施方案43.实施方案41所述的方法，其中源群是免疫细胞群，并且其中从第一表型到第二表型的表型转变是通过暴露于高压大气条件下而调整的，其中该高压条件包括高于环境大气压水平约2PSI的大气压范围。
实施方案44.实施方案41所述的方法，其中细胞群包括未经基因工程处理而衍生的细胞群。
实施方案45.实施方案41所述的方法，其中细胞群包括经过基因工程处理而衍生的细胞群。
实施方案46.实施方案41所述的方法，其中细胞群包括来源于任何健康供体个体或患者的细胞群，该患者患有与源细胞群相关的疾病或具有其病史。
实施方案47.实施方案41所述的方法，其中源群包括来自人类供体的淋巴细胞群。
实施方案48.实施方案41所述的方法，其中免疫细胞群包括人类免疫细胞群。
实施方案49.实施方案48所述的方法，其中驱动表型参数的表达包括免疫调节免疫系统中免疫细胞的免疫功能。
实施方案50.实施方案49所述的方法，其中免疫调节免疫细胞功能包括免疫细胞功能的激活。
实施方案51.实施方案49所述的方法，其中免疫调节免疫细胞功能包括免疫细胞功能的抑制。
实施方案52.实施方案41所述的方法，其中免疫细胞的源群包括来自人类供体的外周血单核细胞(PBMC)群。
实施方案53.实施方案52所述的方法，其中将PBMC群驱动至第二表型的可变大气参数包括约15％的氧气水平和高于环境水平约0PSI至约2PSI的总大气压。
实施方案54.实施方案52所述的方法，其中与第一表型相比，PBMC群的第二表型显示出IL-10分泌水平降低。
实施方案55.实施方案54所述的方法，其中将PBMC群驱动至第二表型的可变大气参数包括约15％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案56.实施方案52所述的方法，其中与第一表型相比，PBMC群的第二表型显示出TNF-表分泌水平增加。
实施方案57.实施方案56所述的方法，其中将PBMC群驱动至第二表型的可变大气参数包括约15％的氧气水平和高于环境水平约0PSI的总大气压。
实施方案58.实施方案52所述的方法，其中与第一表型相比，PBMC群的第二表型显示出用纳武单抗杀伤前列腺癌细胞的能力增强。
实施方案59.实施方案58所述的方法，其中将PBMC群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案60.实施方案52所述的方法，其中与第一表型相比，PBMC群的第二表型显示出用帕博利珠单抗杀伤前列腺癌细胞的能力增强。
实施方案61.实施方案60所述的方法，其中将PBMC群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案62.实施方案41所述的方法，其中免疫细胞的源群包括来自人类供体的泛T细胞群。
实施方案63.实施方案62所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％至约15％的氧气水平和高于环境水平约0PSI至约2PSI的总大气压。
实施方案64.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出生长速率增加。
实施方案65.实施方案64所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约15％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案66.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出最终细胞密度增加。
实施方案67.实施方案66所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约15％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案68.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出CD8+细胞与CD4+细胞的相对存在的转变。
实施方案69.实施方案68所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案70.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出细胞因子IL-6的表达升高。
实施方案71.实施方案70所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案72.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出细胞因子IL-10的表达升高。
实施方案73.实施方案72所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案74.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出细胞毒性基因GZMB的表达升高。
实施方案75.实施方案75所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案76.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出细胞毒性基因穿孔素的表达升高。
实施方案77.实施方案76所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案78.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出细胞体积增加。
实施方案79.实施方案78所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案80.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出检查点基因PD1的表达升高。
实施方案81.实施方案80所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约0PSI的总大气压。
实施方案82.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出检查点基因CTLA4的表达升高。
实施方案83.实施方案82所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约15％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案84.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出IFN-γ分泌水平增加。
实施方案85.实施方案84所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案86.实施方案62所述的方法，其中与第一表型相比，泛T细胞群的第二表型显示出IL-6分泌水平增加。
实施方案87.实施方案86所述的方法，其中将泛T细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案88.实施方案41所述的方法，其中免疫细胞的源群包括来自人类供体的Treg细胞群。
实施方案89.实施方案88所述的方法，其中与第一表型相比，Treg细胞群的第二表型显示出FOXP3的表达率升高。
实施方案90.实施方案89所述的方法，其中将Treg细胞群驱动至第二表型的可变大气参数包括约1％至约5％之间的氧气水平和高于环境水平约2PSI的总大气压。
实施方案91.实施方案41所述的方法，其中免疫细胞群包括造血干细胞和子代谱系群。
实施方案92.实施方案91所述的方法，其中子代免疫细胞谱系群选自于共同的淋巴系祖细胞群和共同的髓系祖细胞群。
实施方案93.实施方案92所述的方法，其中共同的淋巴系祖细胞群选自于B细胞、自然杀伤(NK)细胞、T细胞和树突状细胞群。
实施方案94.实施方案92所述的方法，其中共同的髓系祖细胞群选自于粒细胞-巨噬细胞祖细胞和巨核细胞-红系祖细胞群。
实施方案95.实施方案94所述的方法，其中粒细胞-巨噬细胞祖细胞群选自于单核细胞和成髓细胞群。
实施方案96.实施方案95所述的方法，其中单核细胞群选自于单核细胞来源的树突状细胞和巨噬细胞。
实施方案97.实施方案95所述的方法，其中成髓细胞群选自于嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞群。
实施方案98.实施方案94所述的方法，其中巨核细胞-红系祖细胞群选自于红细胞和巨核细胞群。
实施方案99.实施方案41所述的方法，其中肿瘤细胞群来源于癌症，该癌症选自于卵巢癌、急性髓系白血病、胰腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、结直肠肿瘤、前列腺癌、肝癌、间皮瘤和黑色素瘤。
实施方案100.实施方案41所述的方法，其中干细胞群包含间充质干细胞，所述干细胞包括祖细胞、未成熟和成熟亚群。
实施方案101.实施方案1-100中任一项所述的方法，其中第二表型的细胞群是该方法的目标产物，并且其中调节大气条件的两个或更多个可变参数包括选择有利于目标产物表达的两个或更多个可变参数的值。
实施方案102.实施方案101所述的方法，其中条件的选择基于来自先前的细胞群示例的实验数据，该细胞群是与在该方法的实施过程中所使用的源群具有相同或相似类型的细胞群。
实施方案103.实施方案101所述的方法，其中第二表型是期望的，因为它表现出任何一种或多种细胞培养性能参数，所述参数选自于细胞生长速率、细胞死亡率、可达到的细胞密度、细胞产物的产生速率(天然的或基于转染的)、细胞形态、细胞尺寸、细胞粘附特性、细胞电学特性、细胞代谢活动、细胞迁移行为、细胞活化状态、细胞分化状态、生物标志物显示、对转染的顺应性或抗性、对感染的易感性或抗性、对病毒转导的顺应性或抗性、对生物活性剂的响应性或抗性，或者细胞表型或功能的任何其它可观察的方面。
实施方案104.实施方案103所述的方法，其中细胞活化状态包括免疫细胞活化状态，并且其中驱动表型参数的表达包括向相对较高的免疫细胞运转状态的驱动或向相对抑制的免疫细胞运转状态的驱动中的任何一种。
实施方案105.实施方案1-104中任一项所述的方法，还包括将第二表型的细胞群通过进一步培养来扩增。
实施方案106.实施方案1-105中任一项所述的方法，其中特定的第二表型是期望的，并且其中已经确定了一组有利于表达期望的第二表型的两个或更多个独立调节的大气条件参数，该方法还包括通过在这两个或更多个独立调节的大气条件下培养第二表型的细胞来扩增表达第二表型的培养的细胞子群。
实施方案107.实施方案106所述的方法，还包括确定有利于表达期望的第二表型的两个或更多个独立调节的大气条件参数的值，该方法包括：将源细胞群分成包括至少第一和第二队列培养物的队列培养物；测量细胞培养性能参数，该参数指示每个队列培养物内的期望表型；以及根据队列培养物中细胞培养性能参数的结果，确定大气条件中哪些变化对于具有期望表型的细胞群的生长而言是最佳的。
实施方案108.实施方案1-107中任一项所述的方法，其中第二表型的细胞子群被引导至以药物或候选药物测试形式进行进一步培养。
实施方案109.一种提高源自初始源细胞群的细胞群的表型的表型同质性的方法，该方法包括：在细胞培养箱内的液体培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱被配置为独立于任何相应的环境大气条件而调节培养箱内大气条件的两个或更多个可变参数，其中，源群的表型最初包括关于细胞培养性能的一个或多个参数的初始可变性水平；调节培养箱内大气条件的两个或更多个可变参数，使得可变参数中的至少一个不同于相应可变参数的环境水平；以及作为在调节的大气条件下培养源细胞群的结果，关于细胞培养性能的一个或多个参数的可变性水平降低，从而产生表型同质性水平高于源细胞群的后期细胞群。
实施方案110.实施方案109所述的方法，还包括将后期细胞群用作测试药物或候选药物的效力的底物。
实施方案111.实施方案110所述的方法，其中药物或候选药物被认为可能对后期细胞群具有细胞毒性。
实施方案112.实施方案1110所述的方法，其中药物或候选药物被认为可能对后期细胞群具有支持作用。
实施方案113.一种稳定源细胞群的至少一个子群体的表型的方法，该方法包括：在细胞培养箱内的液体培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱被配置为调节培养箱内的大气参数，其中，该大气参数包含氧气水平和总气体压力水平；调节培养箱内的大气参数，使得大气参数中的至少一个不同于其环境水平；以及作为调节大气参数的结果，将细胞群稳定为第一表型，其中，第二表型是在培养箱内的可变大气参数与环境条件基本一致的大气条件下细胞群将漂移至的表型。
实施方案114.实施方案113所述的方法，其中源群包括选自于免疫细胞、肿瘤细胞和干细胞的细胞群。
实施方案115.实施方案113所述的方法，其中作为暴露于培养箱内调节的大气条件的结果，第一表型继续表达持续细胞培养时段，并且其中如果培养箱内的可变大气参数与环境条件基本一致，则第二表型将会表达。
实施方案116.一种在覆盖于液体细胞培养基上的大气中确定共同有利于在该培养基中培养的源细胞群表达期望表型的氧气水平值和总气体压力值的方法，该方法包括：将源细胞群分成包括至少第一和第二队列培养物的队列培养物；在多个大气条件下平行培养队列细胞培养物，该大气条件仅在氧气浓度和总气体压力中任何一项的变化方面有所不同；测量细胞培养性能参数，该参数指示每个队列培养物内的期望表型；以及根据队列培养物中细胞培养性能参数的结果，确定哪种氧气水平和哪种总气体压力水平对于具有期望表型的细胞群的生长而言是最佳的。
实施方案117.实施方案116所述的方法，还包括，在启动该方法之前，确定反映在细胞培养性能的一个或多个参数中的期望表型的特征。
实施方案118.实施方案116所述的方法，其中细胞培养性能参数选自于生长速率、细胞死亡率、可达到的细胞密度、细胞产物的产生速率(天然的或基于转染的)、细胞形态、细胞尺寸、细胞粘附特性、细胞电学特性、细胞代谢活动、细胞迁移行为、细胞活化状态、细胞分化状态、生物标志物显示、对转染的顺应性或抗性、对感染的易感性或抗性、对病毒转导的顺应性或抗性、对生物活性剂的响应性或抗性，或者细胞表型或功能的任何其它可观察的方面。
实施方案119.实施方案116所述的方法，其中源群包括选自于免疫细胞、肿瘤细胞和干细胞的细胞群。
实施方案120.一种确定细胞培养箱内有利于免疫细胞群表型的表达的氧气水平和总气体压力水平的方法，该表型对生物活性剂的存在作出最佳响应，该方法包括：将免疫细胞群分成多个队列细胞培养物；在多个大气条件下平行培养队列细胞培养物，该大气条件仅在氧气水平或总气体压力中任何一项的变化方面有所不同；测量细胞培养性能参数，该参数对每个队列培养物中免疫细胞导向的生物活性剂有响应；以及根据对队列培养物中细胞培养性能参数的测量，确定哪种氧气和总气体压力水平支持队列免疫细胞培养物中对生物活性剂的最大响应性。
实施方案121.实施方案120所述的方法，其中细胞培养性能参数包含下列中的任何一项或多项，即生长速率、细胞死亡率、可达到的细胞密度、细胞产物的产生速率(天然的或基于转染的)、细胞形态、细胞尺寸、细胞粘附特性、细胞电学特性、细胞代谢活动、细胞迁移行为、细胞活化状态、细胞分化状态、生物标志物显示、对转染的顺应性或抗性、对感染的易感性或抗性、对病毒转导的顺应性或抗性、对生物活性剂的响应性或抗性，或者细胞表型或功能的任何其它可观察的方面。
实施方案122.实施方案121所述的方法，其中生物活性剂的效应提高了细胞培养性能参数响应的幅度。
实施方案123.实施方案121所述的方法，其中生物活性剂的效应降低了细胞培养性能参数响应的幅度。
实施方案124.一种测试抗癌剂对患者来源的癌细胞的效力的方法，包括：在覆盖的大气条件下，在液体培养基中扩增源自患者肿瘤的细胞群，该大气条件已知或假定有利于生长来自类似该患者肿瘤的肿瘤的细胞，其中大气条件包含氧气的缺氧水平和总气体压力的高压水平，并且其中，扩增细胞群包括扩增至足以接种多个队列培养物的水平；将扩增的细胞群分成多个队列细胞培养物；在除了一种或多种抗癌剂的存在之外均相同的条件下，以及在已知或假定有利于表达对于测试抗癌剂效力而言最佳的细胞表型的大气条件下，平行培养队列细胞培养物，其中该大气条件包含氧气的缺氧水平和总气体压力的高压水平；测量每个队列培养物中受抗癌剂影响的细胞培养性能参数；以及根据对队列培养物中细胞培养性能参数的测量，预测一种或多种抗癌剂在治疗患者肿瘤中的效力。
实施方案125.实施方案124所述的方法，其中抗癌剂包含在用于临床用途的制剂中。
实施方案126.实施方案125所述的方法，其中制剂包含一种或多种其它抗癌剂。
实施方案127.一种调整细胞培养群的表型表达以获得目标表型的方法，该方法包括：在细胞培养箱中孵育源细胞群，该细胞培养箱被配置为运行控制大气条件的培养箱程序，其中所述程序指导优化目标表型表达的大气条件，所述程序包括针对(1)氧气水平和(2)总气体压力水平的设定点范围；根据大气条件设定点范围调节培养箱内的氧气水平和总气体压力；以及根据所述大气条件设定点范围将细胞群培养足够的培养时间，以产生表达目标表型的扩增的细胞群，其中扩增的细胞群包括作为人类治疗剂的潜在用途。
实施方案128.实施方案127所述的方法，其中扩增的细胞群还包括在由下列组成的组中的任何一种或多种应用中的潜在用途，即研究模型、用于药物或候选药物开发的药物筛选模型或用于测试药物或候选药物效力的患者特异性模型。
实施方案129.实施方案127所述的方法，其中在根据有利于目标表型的大气条件模块来调节培养箱内的氧气水平和总气体压力之前，该方法还包括通过实验确定有利于目标表型的氧气水平和总气体压力条件。
实施方案130.实施方案129所述的方法，其中有利于目标表型的氧气水平和总气体压力条件是基于来自与源群相同类型的细胞群的先前示例的任何实验数据或来自与源群相似的细胞群的先前示例的数据。
实施方案131.实施方案127所述的方法，其中培养源细胞群包括在临床生产条件下的培养。
实施方案132.实施方案127所述的方法，还包括将表达目标表型的扩增细胞群包装在适合临床应用的包装中。
实施方案133.一种调整细胞培养群的表型表达以获得最佳生产流程效率的方法，该方法包括：在细胞培养箱内的液体培养基中培养源细胞群，该细胞培养箱被配置为运行第一和第二控制大气条件的模块，其中每个模块包括氧气水平和总气体压力水平的设定点范围，其中第一和第二大气条件模块彼此不同；以及在细胞培养时段过程的第一阶段和第二阶段中调节培养箱内的氧气水平和总气体压力，其中，根据控制大气条件的模块运行第一阶段，该控制大气条件的模块被优化以支持包含表达目标表型的潜力的细胞群的扩增，并且其中，根据第二控制大气条件的模块运行第二阶段，该第二控制大气条件的模块被优化以支持目标表型的表达。
实施方案134.根据实施方案133所述的调整细胞培养群的表型表达的方法，其中细胞培养时段的第一阶段中氧气水平的设定点范围高于细胞培养时段的第二阶段中的氧气水平。
实施方案135.根据实施方案133所述的调整细胞培养群的表型表达的方法，其中该方法的产物包括细胞群，所述细胞群包括作为人类治疗剂的潜在用途。
实施方案136.根据实施方案133所述的调整细胞培养群的表型表达的方法，其中该方法的产物包括基于细胞的产物，该产物包括作为人类治疗剂的潜在用途。
实施方案137.一种通过调整源细胞群的至少一个子群体的表型而制备的产物，该方法包括：在细胞培养箱内培养源细胞群，该细胞培养箱能够独立于任何相应的环境大气条件而调节培养箱内大气条件的至少两个可变参数，其中所述参数包含氧气水平和总气体压力水平；调节培养箱内大气条件的可变参数，使得它们中的至少一个不同于相应可变参数的环境水平；以及作为调节大气条件的结果，将子群体从第一表型驱动至第二表型，其中细胞子群的第一表型是在培养箱内的可变大气参数与环境条件基本相同的大气条件下会表达的表型，并且其中细胞子群的第二表型因暴露于培养箱内调节的大气条件而表达；以及收集产物，其中该产物是第二表型的细胞群，或者是由第二表型的细胞群制备的产物。
实施方案138.实施方案137所述的产物，其中该产物包括第二表型产物的细胞子群，并且适合用于临床治疗。
实施方案139.实施方案137所述的产物，其中该产物包括由第二表型的细胞子群产生的生化产物，其中该生化产物适用于临床治疗。
在一些实施方案中，本发明提供了一种培养细胞以增强细胞毒性的方法，包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达发生改变，其中该细胞是外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，氧气为约15％。在一些实施方案中，压力条件为高于大气压至少约1PSI。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达增加。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达降低。在一些实施方案中，细胞是PBMC。在一些实施方案中，细胞因子是IL-10，并且IL-10的表达降低。在一些实施方案中，细胞因子是TNF-α，并且TNF-α的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达降低。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是TGF-β1，并且TGF-β1的表达升高。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下PBMC的细胞毒性相比，PBMC的细胞毒性增加了至少约20％。在一些实施方案中，细胞是泛T细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下泛T细胞的细胞毒性相比，泛T细胞的细胞毒性增加了至少约20％。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下细胞毒性基因的表达相比，细胞毒性基因的表达发生改变。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞毒性基因的表达相比，细胞毒性基因的表达升高。在一些实施方案中，细胞毒性基因是GZMB。在一些实施方案中，细胞毒性基因是穿孔素。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下检查点基因的表达相比，检查点基因的表达发生改变。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下检查点基因的表达相比，检查点基因的表达升高。在一些实施方案中，检查点基因是PD1。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达发生改变；以及在培养之后，将该细胞施用于受试者，其中该细胞是外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，氧气为约15％。在一些实施方案中，压力条件为高于大气压至少约1PSI。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达增加。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达降低。在一些实施方案中，细胞是PBMC。在一些实施方案中，细胞因子是IL-10，并且IL-10的表达降低。在一些实施方案中，细胞因子是TNF-α，并且TNF-α的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达降低。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是TGF-β1，并且TGF-β1的表达升高。在一些实施方案中，细胞是泛T细胞。在一些实施方案中，细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下细胞的细胞毒性相比，细胞的细胞毒性增加了至少约20％。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下细胞毒性基因的表达相比，细胞毒性基因的表达发生改变。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞毒性基因的表达相比，细胞毒性基因的表达升高。在一些实施方案中，其中细胞毒性基因是GZMB。在一些实施方案中，细胞毒性基因是穿孔素。在一些实施方案中，与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下检查点基因的表达相比，检查点基因的表达发生改变。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下检查点基因的表达相比，检查点基因的表达升高。在一些实施方案中，检查点基因是PD1。在一些实施方案中，将细胞与抗癌剂一起共同施用于受试者。在一些实施方案中，细胞是PBMC。在一些实施方案中，抗癌剂是PD1抑制剂。在一些实施方案中，抗癌剂是帕博利珠单抗。在一些实施方案中，抗癌剂是纳武单抗。在一些实施方案中，肿瘤包括前列腺癌细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种用于确定抗癌剂效力的方法，该方法包括：(a)在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养选自于外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞中的细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达发生改变；以及在培养之后，(b)使肿瘤细胞与该细胞和抗癌剂接触；以及(c)在至少约5天后测量对肿瘤细胞的细胞毒性，从而确定抗癌剂对肿瘤细胞的效力。在一些实施方案中，氧气为约15％。在一些实施方案中，压力条件为高于大气压至少约1PSI。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达增加。在一些实施方案中，与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，细胞因子的表达降低。在一些实施方案中，细胞是PBMC。在一些实施方案中，细胞因子是IL-10，并且IL-10的表达降低。在一些实施方案中，细胞因子是TNF-α，并且TNF-α的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达降低。在一些实施方案中，细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。在一些实施方案中，细胞因子是TGF-β1，并且TGF-β1的表达升高。在一些实施方案中，抗癌剂是PD1抑制剂。在一些实施方案中，抗癌剂是帕博利珠单抗。在一些实施方案中，抗癌剂是纳武单抗。在一些实施方案中，肿瘤细胞是前列腺肿瘤细胞。
在一些实施方案中，本发明提供了一种从泛T细胞源群中富集细胞亚群的方法，该方法包括在1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养该源群，其中该细胞亚群包含CD8+细胞或CD4+细胞。在一些实施方案中，细胞亚群包含CD8+细胞。在一些实施方案中，氧气为约15％，并且压力条件为高于大气压约2PSI。在一些实施方案中，细胞亚群包含CD4+细胞。在一些实施方案中，氧气为约1％，并且压力条件为高于大气压约2PSI。
在一些实施方案中，本发明提供了一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，该方法包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下IL-6和IFN-γ的表达相比，IL-6和IFN-γ的表达升高；以及在培养之后，将细胞施用于受试者，其中该细胞是泛T细胞。
Claims (73)
1.一种培养细胞以增强细胞毒性的方法，包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养所述细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达发生改变，其中所述细胞是外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述氧气是约15％。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述压力条件是高于大气压至少约1PSI。
4.如权利要求1所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达增加。
5.如权利要求1所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达降低。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是PBMC。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子是IL-10，并且IL-10的表达降低。
8.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子是TNF-α，并且TNF-α的表达升高。
9.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达降低。
10.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。
11.如权利要求6所述的方法，其中所述细胞因子是TGF-β1，并且TGF-β1的表达升高。
12.如权利要求6所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下所述PBMC的细胞毒性相比，所述PBMC的细胞毒性增加了至少约20％。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述细胞是泛T细胞。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达升高。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。
16.如权利要求13所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下所述泛T细胞的细胞毒性相比，所述泛T细胞的细胞毒性增加了至少约20％。
17.如权利要求13所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下细胞毒性基因的表达相比，所述细胞毒性基因的表达发生改变。
18.如权利要求17所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞毒性基因的表达相比，所述细胞毒性基因的表达升高。
19.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞毒性基因是GZMB。
20.如权利要求18所述的方法，其中所述细胞毒性基因是穿孔素。
21.如权利要求13所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下检查点基因的表达相比，所述检查点基因的表达发生改变。
22.如权利要求21所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述检查点基因的表达相比，所述检查点基因的表达升高。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述检查点基因是PD1。
24.一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，所述方法包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达发生改变；以及在所述培养之后，将所述细胞施用于所述受试者，其中所述细胞是外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其中所述氧气是约15％。
26.如权利要求24所述的方法，其中所述压力条件是高于大气压至少约1PSI。
27.如权利要求24所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达增加。
28.如权利要求24所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达降低。
29.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是PBMC。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞因子是IL-10，并且IL-10的表达降低。
31.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞因子是TNF-α，并且TNF-α的表达升高。
32.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达降低。
33.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。
34.如权利要求29所述的方法，其中所述细胞因子是TGF-β1，并且TGF-β1的表达升高。
35.如权利要求24所述的方法，其中所述细胞是泛T细胞。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达升高。
37.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。
38.如权利要求24所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下所述细胞的细胞毒性相比，所述细胞的细胞毒性增加了至少约20％。
39.如权利要求35所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下细胞毒性基因的表达相比，所述细胞毒性基因的表达发生改变。
40.如权利要求39所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞毒性基因的表达相比，所述细胞毒性基因的表达升高。
41.如权利要求39所述的方法，其中所述细胞毒性基因是GZMB。
42.如权利要求39所述的方法，其中所述细胞毒性基因是穿孔素。
43.如权利要求35所述的方法，其中与在18％的氧气和高于大气压0PSI的对照培养条件下检查点基因的表达相比，所述检查点基因的表达发生改变。
44.如权利要求43所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述检查点基因的表达相比，所述检查点基因的表达升高。
45.如权利要求44所述的方法，其中所述检查点基因是PD1。
46.如权利要求24所述的方法，其中将所述细胞与抗癌剂一起共同施用于所述受试者。
47.如权利要求46所述的方法，其中所述细胞是PBMC。
48.如权利要求47所述的方法，其中所述抗癌剂是PD1抑制剂。
49.如权利要求47所述的方法，其中所述抗癌剂是帕博利珠单抗。
50.如权利要求47所述的方法，其中所述抗癌剂是纳武单抗。
51.如权利要求47所述的方法，其中所述肿瘤包含前列腺癌细胞。
52.一种用于确定抗癌剂效力的方法，所述方法包括：
(a)在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养选自于外周血单核细胞(PBMC)、泛T细胞、调节性T细胞(Treg)或自然杀伤(NK)细胞中的细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达发生改变；以及在所述培养之后，
(b)使肿瘤细胞与所述细胞和所述抗癌剂接触；以及
(c)在至少约5天后测量对所述肿瘤细胞的细胞毒性，从而确定所述抗癌剂对所述肿瘤细胞的效力。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述氧气是约15％。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述压力条件是高于大气压至少约1PSI。
55.如权利要求52所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达增加。
56.如权利要求52所述的方法，其中与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的所述培养条件下所述细胞因子的表达相比，所述细胞因子的表达降低。
57.如权利要求52所述的方法，其中所述细胞是PBMC。
58.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞因子是IL-10，并且IL-10的表达降低。
59.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞因子是TNF-α，并且TNF-α的表达升高。
60.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞因子是IL-6，并且IL-6的表达降低。
61.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞因子是IFN-γ，并且IFN-γ的表达升高。
62.如权利要求57所述的方法，其中所述细胞因子是TGF-β1，并且TGF-β1的表达升高。
63.如权利要求52所述的方法，其中所述抗癌剂是PD1抑制剂。
64.如权利要求52所述的方法，其中所述抗癌剂是帕博利珠单抗。
65.如权利要求52所述的方法，其中所述抗癌剂是纳武单抗。
66.如权利要求52所述的方法，其中所述肿瘤细胞是前列腺肿瘤细胞。
67.一种从泛T细胞源群中富集细胞亚群的方法，所述方法包括在1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养所述源群，其中所述细胞亚群包含CD8+细胞或CD4+细胞。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述细胞亚群包含CD8+细胞。
69.如权利要求68所述的方法，其中所述氧气是约15％，并且所述压力条件为高于大气压约2PSI。
70.如权利要求67所述的方法，其中所述细胞亚群包含CD4+细胞。
71.如权利要求70所述的方法，其中所述氧气是约1％，并且所述压力条件为高于大气压约2PSI。
72.一种在有需要的受试者中治疗肿瘤的方法，所述方法包括在约1％至约15％的氧气和高于大气压不超过约2PSI的压力条件下培养细胞，至少直到与在约18％的氧气和高于大气压0PSI的培养条件下IL-6和IFN-γ的表达相比，IL-6和IFN-γ的表达升高；以及在所述培养之后，将所述细胞施用于所述受试者，其中所述细胞是泛T细胞。
73.一种调整源细胞群中至少一个子群的表型的方法，所述方法包括：在细胞培养箱内培养所述源细胞群，所述细胞培养箱被配置为能够独立于相应的环境大气条件而调节所述培养箱内的至少两个可变大气条件参数，其中所述可变大气参数中的两个是氧气水平和总大气压水平；调节所述培养箱内所述氧气水平和所述总大气压水平中的至少一个，使得所述氧气水平或所述总大气压水平中的至少一个不同于相应的环境水平；以及作为调节所述可变大气条件参数的结果，经孵育期将所述源群的表型参数的表达从第一表型驱动至第二表型，其中所述细胞子群的所述第一表型是在所述培养箱内的所述可变大气条件参数与环境大气条件基本相同的大气条件下会表达的表型，并且其中所述细胞子群的所述第二表型因暴露于由所述培养箱调节的所述可变大气条件而表达。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication | ||
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Application publication date: 20220301 |