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CN116694568A - 用于激活整体抗肿瘤免疫系统的培养基配方物及制备激动剂激活的整体免疫效应细胞的方法 - Google Patents

用于激活整体抗肿瘤免疫系统的培养基配方物及制备激动剂激活的整体免疫效应细胞的方法 Download PDF

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CN116694568A
CN116694568A CN202211690866.0A CN202211690866A CN116694568A CN 116694568 A CN116694568 A CN 116694568A CN 202211690866 A CN202211690866 A CN 202211690866A CN 116694568 A CN116694568 A CN 116694568A
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CN
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cell
tumor
wast
effector cells
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苏盛
黄劲松
于和鸣
宋亚丽
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Beijing Xibo Biomedical Technology Co ltd
Original Assignee
Beijing Xibo Biomedical Technology Co ltd
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Abstract

本发明提供了一种用于激活整体抗肿瘤免疫系统的培养基配方物，其包含PolyI：C、CpG ODN和膦抗原。还提供了一种制备激动剂激活的整体免疫效应细胞的方法，包括分离供者自体PBMC并使用PolyI：C、CpG ODN和膦抗原对其进行活化诱导，从而获得激活机体整体抗肿瘤免疫系统的激动剂激活的整体免疫效应细胞。所述激动剂激活的整体免疫效应细胞具有较强的IFN‑γ、颗粒酶B和穿孔素分泌能力，并且在体外和体内均表现出肿瘤细胞杀伤活性。

Description

用于激活整体抗肿瘤免疫系统的培养基配方物及制备激动剂 激活的整体免疫效应细胞的方法
分案声明
本申请是2022年3月2日提交的申请号为202210195028.X、发明名称为“用于激活整体抗肿瘤免疫系统的培养基配方物及制备激动剂激活的整体免疫效应细胞的方法”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及肿瘤的免疫疗法。具体而言，本发明涉及一种可用于治疗肿瘤的免疫细胞制剂。
背景技术
十多年来，肿瘤免疫疗法已取得迅猛的发展，研究人员研发出了一些创新性的免疫治疗方法，其中过继免疫细胞疗法包括嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法以及新生抗原肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)与细胞毒性T淋巴细胞(CTL)疗法；免疫检查点抑制剂疗法包括PD1/PDL1抑制剂疗法、CTLA-4抑制剂疗法等。这些治疗方法已在临床应用，解决了肿瘤治疗中的不少难题，但也显现了一些局限性。
CAR-T疗法最大的不足之处是在治疗过程中会出现严重的毒副作用。目前已知的严重毒副作用是细胞因子释放综合征(CRS)，也称为细胞因子风暴，严重者会导致患者死亡。其次为神经毒性与脱靶效应。神经毒性会引起意识混乱、失语、脑水肿等临床症状，脱靶效应会误伤表达同样靶点抗原的正常组织细胞，进而引起正常组织损伤或免疫缺陷病，严重时也可引起死亡。CAR-T疗法的另一个不足之处是治疗效果尚待提高，它对淋巴细胞性白血病与淋巴瘤的短期疗效十分显著，但治疗后几个月或更长时间会出现复发。第三个不足之处是CAR-T疗法对实体瘤疗效不佳或没有治疗效果，原因是CAR-T难于进入实体瘤病灶内，浸润于肿瘤内部；即使其能浸润到实体瘤内部，也会面临肿瘤微环境的抑制，使T细胞不能发挥抗肿瘤作用。第四个不足是目前已获批的CAR-T产品均以自身T细胞为起始材料，难以产业化，并且产品价格高达几十万美元，不利于市场推广。
新生抗原是肿瘤细胞中的非同义突变经过转录翻译及加工得到的多肽。由于正常细胞中不会表达肿瘤抗原，新抗原特异性免疫反应不会经历中枢耐受机制和外周耐受机制，所以从理论上来说，新生抗原具有作为免疫疗法治疗靶点的应用价值。随着高通量基因测序技术的发展，全基因组与外显子测序技术可以帮助研究者获取基因组上的突变信息(包括点突变、插入性突变等)。如何从这些数据中快速准确的鉴定候选新抗原，并筛选出高免疫原性的新抗原是肿瘤免疫治疗领域一个亟待解决的问题。目前已有的工具方法如pVAC-seq、MuPeXI、neopepsee等在一定程度上解决了新抗原的鉴定问题，但对候选抗原的有效筛选和排序仍有不足。因此，目前在新抗原TIL或CTL制备的核心技术中，尚存在许多技术瓶颈，造成了靶抗原准确率低，导致新生抗原TIL及CTL疗法的临床疗效不令人满意，加上其制备周期长，成本高，绝大多数患者无法接受，因而这种抗肿瘤免疫细胞疗法未能在临床上广泛使用。
近年来，愈来愈多的临床医生应用免疫检查点抑制剂治疗各种肿瘤。就目前临床应用最广泛的免疫检查点来说，也还存在总体应答率低，以及治疗过程中出现不良反应与耐药等问题。例如PD-1抑制剂在未经选择实体瘤患者中，有效率只有10-30％，但如果以肿瘤基因负荷(TMB)作为免疫检查点抑制剂疗效相关的标志物选择治疗对象，则发现TMB高的有效率为62％，然而免疫检查点抑制剂疗效相关的标志物目前还在研究当中，其具体机制与预测的准确性有待大规模的前瞻性临床研究的验证。此外，免疫检查点抑制剂带来的免疫治疗相关不良反应可累及全身各个脏器，引起多个脏器损伤，而且长期使用免疫检查点抑制剂会产生获得性耐药。
2019年10月，Oliver Demaria等人在《自然(Nature)》上发表了一篇题目为“Harnessing innate immunity in cancer therapy”(利用固有免疫治疗肿瘤)的综述。在这个综述中，提出了目前肿瘤的免疫治疗已发生了重大的发展，但现有的治疗方法(如上文所述各种免疫疗法)均聚焦于MHC限制性特异性T细胞。虽然这些抗肿瘤疗法取得了相当大的成功，但只有部分病人对治疗有反应，总体治疗响应率较低。近年来，肿瘤免疫治疗的关注点已逐渐向固有免疫方向转移。
发明内容
本发明提出了以靶向固有免疫的模式识别受体(PRR)理论为基础，通过新的多种激动剂及免疫刺激剂联合应用，激活固有免疫，进而活化适应性免疫，导致整体免疫系统细胞的活化，从而达到杀伤与消除肿瘤的目的。
在本文中使用的术语“WAST”是英文“Whole Agonist Stimulation”的英文缩写，意指由激动剂激活的整体免疫反应。在本文中，当提及“WAST细胞”或“WAST效应细胞”时，意指本发明的激动剂激活的整体免疫效应细胞；当提及“WAST前体细胞”时，意指本发明的激动剂激活的整体免疫前体细胞。
第一方面，本发明提供了一种培养基配方物，其包含PolyI:C(聚肌胞苷酸)、CpGODN(即含有CpG基序的寡聚脱氧核苷酸)和膦抗原。
第二方面，本发明提供了一种制备激动剂激活的整体免疫效应细胞(即WAST效应细胞)的方法，所述方法包括：
(1)培养外周血单个核细胞(PBMC)，得到贴壁细胞和非贴壁的悬浮细胞；收集贴壁细胞，经细胞因子诱导培养，获得非成熟树突状细胞；
(2)继续诱导培养步骤(1)中获得的非成熟树突状细胞，以获得成熟树突状细胞；
(3)将步骤(1)中得到的非贴壁的悬浮细胞在第一方面的培养基配方物中培养，得到激动剂激活的整体免疫前体细胞(即WAST前体细胞)；
(4)将步骤(2)制得的成熟树突状细胞与步骤(3)得到的激动剂激活的整体免疫前体细胞混合并培养，得到激动剂激活的整体免疫效应细胞。
第三方面，本发明提供了一种激动剂激活的整体免疫效应细胞(即WAST效应细胞)，其特征在于，所述激动剂激活的整体免疫效应细胞中总T淋巴细胞百分比大于90％。
第四方面，本发明提供了第三方面的激动剂激活的整体免疫效应细胞用于制备抗肿瘤细胞制剂的用途。
相比于现有的抗肿瘤免疫疗法，本发明具有以下优势：(1)WAST细胞制剂由具有多种不同杀伤机制的免疫细胞构成，其在临床上单独使用或与现有肿瘤治疗方法及药物联合应用，都会产生较高的有效性；(2)由于所用的多种激动剂与免疫刺激剂具有良好的安全性与有效性，所用的主要起始材料是患者自体PBMC或符合规定的冻存PBMC，所用的细胞培养及扩增试剂都符合GMP规定，因此WAST细胞制剂具有很好的安全性；(3)WAST细胞属于活化的免疫细胞，可以避免现有技术中使用各种T细胞的缺陷与不良反应；(4)WAST细胞是广谱肿瘤杀伤制剂，可广泛的用于多种实体肿瘤的治疗；(5)WAST细胞制剂不涉及基因改造、基因重组等复杂制备过程，制备周期短，安全性高，易于临床推广应用；(6)WAST细胞制剂可以与放疗、化疗、靶向治疗联合应用，通过协同作用增加其疗效；(7)TNM分期为I期或II期病例早期手术后加用WAST细胞制剂治疗，可减少复发率。
附图说明
图1概述了本发明的WAST细胞制剂的制备方法及其抗肿瘤机制。
图2表示诱导前后分泌颗粒酶B及穿孔素的细胞的比例，其中l表示分泌颗粒酶B的细胞，m表示分泌穿孔素的细胞，n表示同时分泌颗粒酶B和穿孔素的细胞；误差线是指各类细胞测量值的95％置信区间(CI)。
图3表示经激动剂和免疫刺激剂诱导前后各类细胞百分比的测量值。a：总T淋巴细胞百分比；b：辅助性T细胞百分比；c：杀伤性T细胞百分比；e：总B淋巴细胞百分比；f：NK细胞百分比；g：NKT细胞百分比；h：CD25+细胞百分比；i：单核细胞百分比；j：HLA-DR+细胞百分比；k：Vγ9δ2(CD4-CD8low-CD3+)百分比；误差线是指各类细胞测量值的95％置信区间(CI)。
具体实施方式
本发明提供了一种培养基配方物，其包含PolyI:C、CpG ODN和膦抗原。
优选地，所述培养基配方物还包含IL-2、IL-15、抗CD3抗体、抗CD28抗体，并且所述膦抗原是唑来膦酸；
更优选地，所述培养基配方物包含浓度为100-500IU/ml的IL-2，5-50ng/ml的IL-15，0.5-5μg/ml的抗CD3抗体，0.5-5μg/ml的抗CD28抗体，2-20μg/ml的PolyI:C，2-20μg/ml的CpG ODN，10-100μmol/L的唑来膦酸；
进一步优选地，所述培养基配方物包含浓度为300-500IU/ml的IL-2，10-50ng/ml的IL-15，1-3μg/ml的抗CD3抗体，1-3μg/ml的抗CD28抗体，5-15μg/ml的PolyI:C，5-15μg/ml的CpG ODN，10-75μmol/L的唑来膦酸；
最优选地，所述培养基配方物包含浓度为300IU/ml的IL-2，15ng/ml的IL-15，1μg/ml的抗-CD3单抗，1μg/ml的抗-CD28单抗，10μg/ml的PolyI:C，10μg/ml的CpG ODN，50μmol/L的唑来膦酸。
本发明还提供了一种制备激动剂激活的整体免疫效应细胞(即WAST效应细胞)的方法，所述方法包括：
(1)培养外周血单个核细胞(PBMC)，得到贴壁细胞和非贴壁的悬浮细胞；收集贴壁细胞，经细胞因子诱导培养，获得非成熟树突状细胞；
(2)继续诱导培养步骤(1)中获得的非成熟树突状细胞，以获得成熟树突状细胞；
(3)将步骤(1)中得到的非贴壁的悬浮细胞在本发明的培养基配方物中培养，得到激动剂激活的整体免疫前体细胞(即WAST前体细胞)；
(4)将步骤(2)制得的成熟树突状细胞与步骤(3)得到的WAST前体细胞混合并培养，得到激动剂激活的整体免疫效应细胞。
在一个具体实施方案中，所述方法在步骤(1)之前还包括分离供者的外周抗凝血，并从中分离外周血单个核细胞(PBMC)的步骤。
所述供者是健康人或肿瘤患者。
在一个具体实施方案中，步骤(1)中的细胞因子为粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与白细胞介素-4(IL-4)。
在另一个具体实施方案中，步骤(2)中使用白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-33(IL-33)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)进行诱导培养。
本发明还提供了一种激动剂激活的整体免疫效应细胞(即WAST效应细胞)，其特征在于，所述WAST效应细胞中总T淋巴细胞百分比大于90％。
在一个具体实施方案中，所述WAST效应细胞中杀伤性T细胞百分比为45％-70％，NKT细胞百分比为7.5％-25％，Vγ9δ2细胞百分比为5％-50％。
特别地，所述WAST效应细胞中总T淋巴细胞百分比为99.01％、98.8％、98.78％、99.12％、96.98％、93.89％；
特别地，所述WAST效应细胞中杀伤性T细胞百分比为67.42％、47.34％、45.35％、48.31％、46.37％、69.07％；
特别地，所述WAST效应细胞中NKT细胞百分比为17.89％、19.92％、24.63％、10％、7.5％、10.55％；
特别地，所述WAST效应细胞中Vγ9δ2细胞百分比为38.39％、11.02％、12.08％、5.68％、47.57％、19.8％；
在又一个具体实施方案中，所述WAST效应细胞中分泌颗粒酶B的细胞的百分比为15％-55％，分泌穿孔素的细胞的百分比为15％-50％，同时分泌颗粒酶B和穿孔素的细胞的百分比为10％-45％。
特别地，所述WAST效应细胞中分泌颗粒酶B的细胞的百分比为24.95％、41.16％、25.92％、52.93％、15.62％、23.77％；
特别地，所述WAST效应细胞中分泌穿孔素的细胞的百分比为48.34％、39.07％、39.66％、48.72％、15.35％、20.1％；
特别地，所述WAST效应细胞中同时分泌颗粒酶B和穿孔素的细胞的百分比为21.35％、31.6％、21.25％、43.7％、10.8％、15.1％。
本发明还提供了所述WAST效应细胞用于制备抗肿瘤细胞制剂的用途。优选地，所述肿瘤为实体肿瘤；更优选地，所述实体肿瘤为肺癌、肝癌或乳腺癌。
在本发明中，将激动剂PolyI:C、CpG ODN和免疫刺激剂膦抗原联合使用。
以下结合以下实施例对本发明进行详细描述。下述实施例中的实验方法，未注明具体技术或条件者，则按照常规实验条件如《ATCC细胞培养手册》中所述条件，而在实施例中明确说明有试剂公司说明书时，则参考说明书所建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市场购买获得常规产品。
本发明实施例中所用的激动剂及免疫诱导试剂：(1)AIM-V细胞培养基，购自ThermoFisher公司；(2)人淋巴细胞分离管(即用型)，购自达科为公司；(3)IL-4、GM-CSF、TNF-α、IL-2、IL-15、IL-33、抗CD3单抗、抗CD28单抗，均购自Peprotech公司；(4)PolyI:C、CpG ODN(5’-tcgtcgttttcgcg-3’)，均购自InvivoGen公司；(5)唑来膦酸，购自国药集团。
实施例1提取和培养外周血单个核细胞(PBMC)
(1)分离捐赠的来自健康人的外周抗凝血50ml。在两支50ml分离管中各加入25ml外周血。
(2)离心管配平，以水平离心机1700rpm，慢升慢降速，室温离心20min。
(3)吸出最上层部分多余的血浆。用2ml无菌吸管轻轻吸出淋巴细胞层，移入新的50ml离心管中，将所有管中的淋巴细胞层吸入同一个50ml离心管中。加入0.9％无菌生理盐水至50ml，充分混匀。
(4)离心管配平，以水平离心机1700rpm，快升快降速，室温离心10min；取出试管，完全弃去上清液。
(5)从37℃培养箱中取出预热的AIM-V培养基，从中取5ml将细胞沉淀充分混匀，注意轻柔操作，避免产生气泡，随后加入AIM-V培养基至1×106细胞/ml细胞浓度，混匀细胞。
(6)将混匀的细胞悬液移入75cm2细胞培养瓶，轻轻晃动混匀，放置于37℃培养箱中培养。
实施例2树突状细胞(DC)的制备
(1)将实施例1中得到的PBMC以AIM-V培养基重悬，加入75cm2细胞培养瓶中，37℃，5％CO2培养。
(2)3小时后将培养瓶取出，轻轻晃动，吸出悬浮细胞。
(3)向培养瓶中加入含500IU/ml的IL-4、500IU/ml的GM-CSF的AIM-V培养基。
(4)分别在培养后第3天、第5天半量换液，加入新鲜含500IU/ml的IL-4、500IU/ml的GM-CSF的AIM-V培养基。
(5)培养第7天加入终浓度为10ng/ml的TNF-α、300IU/ml的IL-2、10ng/ml的IL-33的AIM-V细胞培养基。
(6)第8天收获成熟树突状细胞。
实施例3WAST效应细胞的制备
(1)通过实施例2步骤(2)得到悬浮细胞，将其重悬于AIM-V培养基中，调节细胞浓度至1×106个/ml，此悬液中富含T淋巴细胞。向该悬液中加入终浓度300IU/ml的IL-2，15ng/ml的IL-15，1μg/ml的抗CD3单抗，1μg/ml的抗CD28单抗，10μg/ml的PolyI:C，10μg/ml的CpG ODN，50μmol/L的唑来膦酸，37℃，5％CO2培养8天，每3天半量换液，以获得WAST前体细胞；
(2)第8天，将实施例2制备的成熟树突状细胞与WAST前体细胞按照成熟树突状细胞∶WAST前体细胞＝1∶10的比例混合后，继续培养2天；
(3)第10天收集细胞，即得WAST效应细胞。
实施例4WAST效应细胞表型分析
按照实施例1-3中所述的WAST效应细胞的制备方法，获得6例健康人的WAST效应细胞。用流式细胞仪进行细胞表型分析，测定使用本发明的培养基配方物诱导前后(诱导前：PBMC，分别用1至6表示；诱导后：WAST效应细胞，分别用1’至6’表示)各类细胞百分比的变化，结果如下表所示。
使用数据分析软件SPSS19.0对数据进行配对T检验统计学数据分析，所有检验均为双侧检验，检验水准α＝0.05。分析结果见图3。
从图3可见，诱导后获得的WAST效应细胞中与肿瘤杀伤相关的细胞的百分比均显著升高。以样品3为例：对于总T淋巴细胞百分比，诱导前为57.83％，诱导后为98.78％；对于杀伤性T细胞百分比，诱导前为13.97％，诱导后为45.35％；对于NKT细胞百分比，诱导前为2.54％，诱导后为24.63％；对于Vγ9δ2(CD4-CD8Low-CD3+)细胞百分比，诱导前为3.42％，诱导后为12.18％。这些细胞均为WAST效应细胞中的主要杀伤细胞，其在诱导后比例都有显著升高。
实施例5 WAST效应细胞的颗粒酶B(Granzyme B)和穿孔素(Perforin)分泌能力检测
通过流式细胞术检测实施例4制备的WAST效应细胞分泌颗粒酶B、穿孔素的能力。下表说明诱导前后的细胞(诱导前：PBMC，分别用1至6表示；诱导后：WAST效应细胞，分别用1’至6’表示)分泌能力的变化。
使用数据分析软件SPSS19.0对数据进行配对T检验统计学数据分析，所有检验均为双侧检验，检验水准α＝0.05。分析结果见图2。
如图2所示，诱导后分泌颗粒酶B或穿孔素或同时分泌颗粒酶B和穿孔素的细胞数量显著增多，表明WAST效应细胞颗粒酶B、穿孔素分泌能力较PBMC更强。
实施例6WAST效应细胞对3种不同肿瘤细胞系的体外直接杀伤能力测定
在本实施例中，分别以3例外购PBMC(均购自上海妙顺生物技术公司)为起始材料，按照实施例2-3中的制备方法获得WAST效应细胞，将其分别为命名为WAST-121061203C、WAST-121030702C、WAST-121050801C。将这三种细胞作为效应细胞，以A549(人非小细胞肺癌)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)为靶细胞，效靶比分别为20∶1和30∶1，进行体外直接杀伤试验。
使用CCK8(细胞计数试剂盒(Cell Counting Kit)-8)检测释放法，检测WAST细胞对A549、MCF-7、HepG2的体外杀伤能力，该方法的具体操作方法如下：
(1)调整靶细胞浓度至5×104个/ml；
(2)分别设置以下对照组：空白对照组，每孔只加200μl AIM-V培养基；靶细胞对照组，不加效应细胞，向每孔加100μl AIM-V培养基，再加入100μl靶细胞；效应细胞对照组，不加靶细胞，向每孔加100μl AIM-V培养基，再加入100μl效应细胞；每组设定三个复孔，并且均在37℃，5％CO2培养24小时；
(3)对于实验组，将靶细胞按照100μl/孔转移至96孔板中，每组设定三个复孔，37℃，5％CO2培养24小时(此时靶细胞数量增加到10000个/孔)；然后向每个实验孔中加入效应细胞100μl，效应细胞∶靶细胞(即效靶比)分别为20∶1和30∶1；
(4)将上述对照组和实验组分别于37℃，5％CO2培养4-6小时；
(5)每孔加入10μl CCK8试剂，37℃培养2小时；
(6)酶标仪测定各孔吸光值OD450，取复孔平均值A计算杀伤活性，其计算公式为：
杀伤率(％)＝[1-(A实验组-A效应细胞对照组)/(A靶细胞对照组-A空白对照组)]×100％。
以下各表列出了分别以A549(人非小细胞肺癌)、MCF-7(人乳腺癌细胞)、HepG2(人肝癌细胞)作为靶细胞的体外杀伤试验中各对照组和实验组测定的吸光值OD450及计算的杀伤率。
WAST效应细胞对肺癌细胞系A549体外杀伤结果
WAST效应细胞对乳腺癌细胞系MCF-7体外杀伤结果
WAST效应细胞对肝癌细胞系HepG2体外杀伤结果
(1)WAST效应细胞对A549(人非小细胞肺癌)直接杀伤结果
WAST-121061203C在效靶比20∶1、30∶1时杀伤率分别为41.94％和53.18％；
WAST-121030702C在效靶比20∶1、30∶1时杀伤率分别为36.37％和47.36％；
WAST-121050801C在效靶比20∶1、30∶1为80.37％和96.33％。
(2)WAST效应细胞对MCF-7(人乳腺癌细胞)直接杀伤结果
WAST-121061203C在效靶比20∶1、30∶1时杀伤率分别为9.17％和17.20％；
WAST-121030702C在效靶比20∶1、30∶1时杀伤率分别为17.83％和32.67％；
WAST-121050801C在效靶比20∶1、30∶1为11.94％和20.82％。
(3)WAST效应细胞对HepG2(人肝癌细胞)直接杀伤结果
WAST-121061203C在效靶比20∶1、30∶1时杀伤率分别为17.81％和28.90％；
WAST-121030702C在效靶比20∶1、30∶1时杀伤率分别为19.33％和31.98％；
WAST-121050801C在效靶比20∶1、30∶1分别为25.51％和44.24％。
上述三种WAST效应细胞对3种不同肿瘤细胞系的体外直接杀伤结果均表现出针对肿瘤细胞有体外杀伤效果，证明了WAST效应细胞的抗肿瘤活性。
实施例7 WAST细胞在小鼠体内杀伤实体肿瘤的药效实验(以非小细胞肺癌荷瘤模型为例)
本实施例中使用CDX肺癌A549荷瘤小鼠模型——NPI免疫缺陷小鼠(本试验委托北京艾德摩生物技术有限公司实施)，周龄为6-8周，体重为20-30g。待小鼠体内肿瘤长至80-150mm3时，按时间点分组分次经尾静脉及瘤内瘤周注射人WAST细胞，观察肿瘤生长情况并测量肿瘤大小。
具体操作方法如下：
(1)将实施例6中的WAST效应细胞WAST-121030702C，悬浮于生理盐水中备用；
(2)WAST效应细胞注射频率为每周1次，持续3周，以首次注射为第0天，分别在第0天(D0)、第7天(D7)、第14天(D14)进行WAST效应细胞注射，共进行3次；实验分为3组，分别为：生理盐水组，瘤内瘤周注射组(I.T.)(该组注射WAST-121030702C细胞)、静脉注射组(I.V.)(该组注射WAST-121030702C细胞)，每组3只CDX荷瘤小鼠；
(3)确定WAST细胞的注射剂量：以60kg的成人为基准，WAST细胞在临床预期使用剂量为5×108-5×109个细胞(即0.8×107-0.8×108个细胞/kg)。以CDX小鼠体重30g为基准，以其通常最大耐受剂量1×107个细胞(该剂量是目前细胞产品的小鼠动物试验中使用的最高剂量)为高剂量组；
(4)注射剂量：生理盐水组，每只小鼠注射生理盐水200μl；瘤内瘤周注射组，每只小鼠每次注射1×107个细胞；静脉注射组，每只小鼠每次注射1×107个细胞；
完成3次注射后，第25天对小鼠荷瘤体积进行测量。使用卡尺测量肿瘤的长径及短径，肿瘤的体积(TV)计算公式为：TV＝0.5a×b2(a＝长径长度，b＝短径长度)。3组小鼠肿瘤体积测量结果如下：
项目 生理盐水组 瘤内瘤周注射组 静脉注射组
肿瘤平均体积(mm3) 363.14 275.30 248.80
中位体积(mm3) 418.01 311.22 248.80
由上表可知，连续注射WAST效应细胞后，第25天对小鼠荷瘤体积进行测量，瘤内瘤周注射组及静脉注射组小鼠肿瘤平均体积均小于生理盐水组。
另外，第17天经流式细胞仪对小鼠外周血进行免疫细胞表型流式检测，其中对小鼠外周血CD8+CD69+流式细胞检测结果如下：
项目 生理盐水组 瘤内瘤周注射组 静脉注射组
CD8+CD69+百分比(％) 0 11.92 74.11
第17天小鼠外周血免疫细胞表型流式检测结果显示，静脉注射组CD8+CD69+百分比为74.11％，而生理盐水组CD8+CD69+百分比为0％，瘤内瘤周注射组CD8+CD69+百分比为11.92％。因给药途径不同，静脉注射组与瘤内瘤周注射组免疫细胞被激活的状态存在差异。
结论：WAST效应细胞在静脉注射组及瘤内瘤周注射组小鼠体内均被激活，3次WAST效应细胞注射后，从上述结果分析可得出，不管是瘤内瘤周注射还是静脉注射WAST效应细胞均能起到抑制肿瘤的作用。
实施例8 B-NDG小鼠静脉注射WAST效应细胞制剂单次给药毒性动物试验
试验目的
WAST细胞制剂是未经修饰的免疫细胞，临床用于治疗实体肿瘤，给药途径为静脉输注。本实验通过WAST细胞制剂经静脉单次给予B-NDG小鼠后观察14天，观察WAST细胞制剂可能引起的毒性反应的性质、程度和可逆性，推测毒性靶器官靶组织，为临床的安全性提供参考信息。本实验的承接单位为：国科赛赋河北医药有限公司(GLP)。
本实验使用SPF级B-DNG小鼠(购自百奥赛图江苏基因生物技术有限责任公司)。雌鼠体重为18.84g-22.01g，雄鼠体重为26.14g-28.89g，同性别小鼠个体体重在平均体重±20％范围内。分组给药时小鼠约7周龄。
剂量设计
本次试验采用最大给药量法，WAST效应细胞为上述WAST-121030702C，WAST效应细胞的低、高剂量组给药浓度分别设计为1×107细胞/ml、4.25×107细胞/ml，给药体积为20ml/kg体重，给药剂量分别为2×108细胞/kg体重、8.5×108细胞/kg体重，约为临床人用剂量的2.4-10倍。溶剂对照组给予等剂量的细胞冷藏保护预混液(购自南京三生生物技术股份有限公司，主要成分：右旋糖酐、葡萄糖、工艺用水)。
实验方法
将90只B-DNG小鼠随机分为3组，每组30只，雌雄各半：溶剂对照组、WAST效应细胞低剂量组(2×108细胞/kg)、WAST效应细胞高剂量组(8.5×108细胞/kg)。各组给药体积为均20ml/kg。对于WAST效应细胞低剂量组，经尾静脉注射给予1×107细胞/ml；对于WAST效应细胞高剂量组，经尾静脉注射给予4.25×107细胞/ml；溶剂对照组经尾静脉注射给予等体积的细胞保护液。给药当天为实验的第1天(即D1)。
给药后，每天观察各组小鼠的一般状态，分别测定体重、摄食量；D15时观察期结束，对各组小鼠称重后实施安乐死，并进行血液学、血凝、血液生化检测、大体解剖观察及主要脏器称重，对大体解剖发现的异常脏器进行组织病理学检查。
结果
在本试验条件下，B-DNG小鼠单次静脉注射WAST效应细胞，停药恢复14天。试验期间，各组小鼠一般状态、体重、摄食量均未见与注射WAST效应细胞相关的明显异常改变。未见动物死亡和严重毒性反应。小鼠对WAST效应细胞的最大耐受剂量(MTD)为8.5×108细胞/kg。
实施例9WAST细胞制剂对肿瘤患者的临床初步预试
为了观察WAST细胞制剂在治疗肿瘤中的安全性及其可能的有效性，在下述条件下：1、动物试验证实安全；2、患者志愿请求做WAST细胞制剂治疗；3、不收取治疗费。
对下列5例肿瘤患者进行1-2个疗程WAST效应细胞治疗。5例患者的临床病理诊断及TNM分期如下：
病例序号 临床级病理诊断 TNM分期
第1例 颅鼻眶沟通恶性肿 IV期B
第2例 HBV相关肝细胞癌 III期A
第3例 HBV相关肝细胞癌 III期B
第4例 乳腺癌手术治疗后 III期B
第5例 乳腺癌手术治疗后 IV期B
具体治疗过程如下：
(1)分离上述5例患者的外周抗凝血，并根据实施例1-3所述，制备各患者的WAST效应细胞，保存备用。
(2)向各患者给予制备得到的各自的WAST效应细胞。
在治疗过程中通过静脉回输给予各患者各自的WAST效应细胞，给药剂量为5×108-5×109个细胞，连续给予3-6次WAST效应细胞。在治疗过程中没有观察到任何不良反应。所有病例观察6-12个月均显示病情稳定，并且肿瘤缩小、癌细胞减少或转移癌数量减少，生活质量上调。目前临床研究仍在进行中。

Claims (6)

1.一种WAST效应细胞，其特征在于，所述WAST效应细胞中总T淋巴细胞百分比大于90％。
2.权利要求1的WAST效应细胞，其中所述WAST效应细胞中杀伤性T细胞百分比为45％-70％，NKT细胞百分比为7.5％-25％，Vγ9δ2细胞百分比为5％-50％。
3.权利要求1或2的WAST效应细胞，其中所述WAST效应细胞中分泌颗粒酶B的细胞的百分比为15％-55％，分泌穿孔素的细胞的百分比为15％-50％，同时分泌颗粒酶B和穿孔素的细胞的百分比为10％-45％。
4.权利要求1-3中任一项所述的WAST效应细胞用于制备抗肿瘤细胞制剂的用途。
5.权利要求4的用途，其中所述肿瘤为实体肿瘤。
6.权利要求5的用途，其中所述实体肿瘤为肺癌、肝癌或乳腺癌。
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