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CN103732245B - 用于含有消化酶的组合物的溶出度测试的方法 - Google Patents

用于含有消化酶的组合物的溶出度测试的方法 Download PDF

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CN103732245B CN201280040203.2A CN201280040203A CN103732245B CN 103732245 B CN103732245 B CN 103732245B CN 201280040203 A CN201280040203 A CN 201280040203A CN 103732245 B CN103732245 B CN 103732245B
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Abstract

本发明涉及一种用于通过荧光光谱法测量在溶出介质中从固体组合物释放的消化酶的量的方法。本发明还涉及一种用于测量包含胰脂肪酶的固体组合物的溶出度和耐胃液性两者的组合方法。

Description

用于含有消化酶的组合物的溶出度测试的方法
发明领域
本发明涉及一种用于通过荧光光谱法测量在溶出介质中从固体组合物释放的消化酶的量的方法。本发明还涉及一种用于测量包含胰脂肪酶的固体组合物的溶出度和耐胃液性（gastroresistance）两者的组合方法。
发明背景
一种固体药物组合物或剂型，如一种片剂或胶囊，总体上是由有效成分和赋形剂的混合物组成的。在口服给药之后，来自一种固体组合物形式的一种有效成分（药物）的吸附的可再现性取决于若干因素，如该药物从该组合物的释放以及在生理条件下该药物的溶出或溶解。由于该药物从该组合物的释放和该药物的溶出或溶解的关键性质，溶出度试验与药物的体内性能预测是高度相关的。药物审批机构如FDA和EMA经常需要药物公司测定任何新药物组合物的药物释放特征，以便得到批准。这些试验还可以被要求作为USP质量参数，以评估药物组合物的批次间质量，以便验收产品、免除生物等效性要求或支持针对除了推荐以外的生物等效性要求的请求。
已经开发了用于实施这些体外溶出度试验的各种方案，并且这些方案常规地应用于产品开发和质量控制两者。大多使用推荐的概略方法与设备来实施药物溶出度测试，如美国药典和欧洲药典，例如USP34<711>和EP7.2,2.9.3。典型地在此类试验中使用的溶出介质是例如水和缓冲液，如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。基于不同搅拌方法的不同类型的溶出度仪是可商购的，并且被这些概略方法所认可。这些溶出度仪包括：桨式、篮式、流通式以及往复式圆筒。虽然提取步骤（方案）和溶出度仪不同，所有的药物溶出度试验方法都涉及将该药物组合物或剂型放入置于一种溶出介质中，并且对该溶出介质施用某种搅拌，以便促进试验药物的崩解和溶出。
溶出介质以及用于确定在该溶出介质中的释放的药物的量的检测方法取决于（的选择是根据）该药物的化学性质，并且物理和稳定性考虑因素在做出这些适当选择中也是非常重要的。
包含在USP专论，胰脂肪酶延迟释放胶囊中的用于确定从药物口服剂型如胰脂肪酶延迟释放胶囊中释放消化酶的试验是基于对脂肪酶活性的特异性测量。这种方法需要的分析时间长，并且受到若干缺点的影响。主要缺点是在溶出介质中，更准确地说在肠级缓冲（pH6.0）溶出介质中的标记脂肪酶的不稳定性；需要确立脂肪酶降解的程度，并且然后将校正因子引入至溶出度计算中，以考虑在试验期间的脂肪酶活性损失。而且，该方法的复杂性（在试剂/底物制备和分析测定两者中）显著增加了结果的变异性，并且使实验室内/间结果的再现性恶化。而且，脂肪酶测定具有窄的线性范围（8-16USP单位/mL）：这代表显著的限制，因为测定仅仅覆盖范围在6,400与12,800USPUI/个胶囊之间的胶囊强度，并且因此不能进行单个单位测试方法。在当前方法中的长分析时间限制了使用它用于确定多点溶出特征曲线的可能性。
没有描述如何克服这些缺点以便用于确定消化酶从一种固体组合物的释放的方法/步骤。
可以向患有胰腺外分泌功能不全（EPI）的患者给予消化酶如胰脂肪酶和其他胰酶产品（PEP）；消化酶补充剂的给予允许患者更有效地消化他们的食物。
胰腺外分泌功能不全（EPI）（FDA估计超过200,000名美国人患有这种疾病）涉及一种生理失调，其中个体由于缺乏由他们的胰腺产生的消化酶而不能适当地消化食物。这种消化酶损失导致失调，如营养素的消化不良和吸收不良，这些失调导致营养不良和与之相关联的其他随之发生的所不希望的生理状况。这些失调对于患有囊性纤维化（CF）和其他损害胰腺外分泌功能的病症（如胰腺癌、胰腺切除术、以及胰腺炎）的那些患者是常见的。如果不治疗，饮养不良可能危及生命，特别是在婴儿和CF患者的情况下，并且失调能够导致生长受损、免疫应答受损以及预期寿命缩短。
可以给予消化酶如胰脂肪酶和其他胰酶产品（PEP）以至少部分地补救EPI。这些被给予的消化酶为患者能够更有效地消化他们的食物做好了准备。
胰酶（已经用于EPI的治疗中，以补偿丧失的消化功能）已经被使用了60年以上。它们的使用直到最近也不是对基于安全性和功效的药物审批、以及制造控制进行管理的主题性现代监管指引。最近，胰酶替代治疗已经成为US和欧洲监管机构倡议的主题，这些倡议要求已上市的胰酶产品通过当前的药物审批过程，以便仍然进行销售。胰脂酶（）、得每通（）和胰脂肪酶（）是成功通过由FDA设立的过程的三种产品，并且被批准在美国上市。在其他地区/国家，相似的倡议迄今仍然在继续或者尚未实行，各种胰酶产品仍然是可获得的。
已经开发了用于口服给药的含有消化酶（如胰脂肪酶）的胶囊。然而，如果患者不能吞咽这些胶囊，可以将每粒胶囊打开并且将内容物撒于少量食物（通常是一种软的酸性食物，如可商购的苹果酱）上，并且用勺子向患者口服给予。可替代地，针对婴儿和儿童，可以使用注射器装置对这样的药物进行口服给予，该注射器装置含有悬浮于由此易于给予的一种介质中的内容物。
这些胰脂肪酶产品通常被标记为含有脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶三种酶类，并且这些酶的水平或效能被列出。这些酶催化脂肪水解为甘油和脂肪酸，淀粉水解为糊精和糖，以及蛋白质水解为氨基酸和衍生的物质。然而，消化是一个涉及促成正确的消化功能的许多其他酶和底物并且产生全系列的消化产物的复杂过程。在胰脂肪酶中包含的其他酶包括胰蛋白酶、羧肽酶、弹性蛋白酶、磷脂酶以及除其他之外的胆固醇酯酶以及各种辅因子和辅酶。这些物质在胰腺中是自然产生的，并且也促成正确的消化功能。
典型地，胰脂肪酶是从猪胰腺制备的，虽然也能够使用其他来源，例如在U.S.6,051,220、U.S.2004/0057944、U.S.2001/0046493和WO2006044529中所说明的那些，出于所有目的将其中的每一篇文献通过引用以其全文结合在此。
胰酶在近中性和微碱性条件下表现出最佳活性。在胃条件下，胰酶可以失活，具有随之发生的在生物活性方面的丧失。因此，外源给予的酶通常受到保护而免于胃失活，并且在它们通过胃转运进入十二指肠期间仍然是完整的。因此，令人希望的是包被胰酶。胰脂肪酶对胃失活最敏感并且是在吸收不良治疗中的关键酶。典型地，对脂肪酶活性进行监测以确定含有脂肪酶的酶组合物的稳定性。出于所有目的，将授予Ortenzi等人的U.S.7,658,918以其全部内容通过引用以其全文明确地结合在此，该专利描述了稳定的消化酶组合物并解释了口服给予的某些颗粒药物被设计为穿过患者的胃并且其后在肠内释放。针对患者特别是婴儿和儿童的此类颗粒药物的适当剂量的给予应当尽可能准确。
遗憾的是，还未曾描述具有良好精确度和良好灵敏度的用于测量从固体药物组合物或剂型释放的消化酶的量的、并且准备在不同实验室中应用的方法。
发明概述
本发明涉及一种用于通过荧光光谱法测量在溶出介质中从固体组合物释放的消化酶的量的方法。本发明还涉及一种用于测量包含胰脂肪酶的固体组合物的溶出度和耐胃液性两者的组合方法。
附图简要说明
图1.胰脂肪酶珠粒（胰脂酶（）小片）的溶出特征曲线–蛋白酶测定（平均曲线）。
图2.胰脂肪酶珠粒（胰脂酶（）小片）的溶出特征曲线–脂肪酶测定（平均曲线）。
图3.胰脂肪酶珠粒（胰脂酶（）小片）的溶出特征曲线–通过荧光光谱法进行的总蛋白测定（平均曲线）。
图4a.胰脂肪酶珠粒（胰脂酶（）小片）的溶出特征曲线：酶特异性测量结果相对于对总蛋白含量的荧光法测定。
图4b.胰脂肪酶珠粒（胰脂酶（）小片）的溶出特征曲线：脂肪酶测定相对于对总蛋白含量的荧光法测定。
图4c.胰脂肪酶珠粒（胰脂酶（）小片）的溶出特征曲线：蛋白酶测定相对于对总蛋白含量的荧光法测定。
图5.胰脂肪酶组合物（胰脂酶（）和得每通（））的溶出特征曲线。
发明详细说明
本发明涉及一种用于通过荧光光谱法测量在一种溶出介质中从固体组合物释放的消化酶的量的方法。该量被测量为从该固体组合物或剂型或单个单位形式释放的消化酶的百分比。
在本发明方法的另一个实施例中，该固体组合物是一种包含胰脂肪酶的制剂，更具体地说，它是一种包含无药物活性的赋形剂的肠溶包衣的胰脂肪酶组合物。
在另一个实施例中，该方法包括以下步骤：(a)允许该固体胰脂肪酶组合物在一种溶出介质中释放这些消化酶，(b)读取荧光以测量在该介质中的消化酶的量。
在本发明的另一个实施例中，该溶出介质是水、HCl溶液、模拟胃液、缓冲溶液、模拟肠液、或包含至少一种表面活性剂的水溶液或缓冲溶液。
在另一个实施例中，该溶出介质由依次应用的至少两种介质组成。还可以用当前方法进行两阶段溶出度试验。该第一阶段是一个酸阶段，并且该溶出介质是一种含水介质，该含水介质具有酸性pH，如从大约1至大约4.5、或从大约1至大约2的范围的、或大约1.2的pH。该第二阶段在一种第二溶出介质中进行，该第二溶出介质是一种含水缓冲溶液，该含水缓冲溶液具有5以上、或在大约5.5与大约6.8之间、或大约6的pH。
在根据本发明的方法中，用于检测在溶出介质中从组合物释放的消化酶的技术是荧光光谱法。
分子具有被称为能级的不同状态。荧光光谱法主要与电子态和振动态相关联。通常，被检查的种类具有一种电子基态、以及一种更高能量的电子激发态。在这些电子态中的每一种之内有不同的振动态。在荧光光谱法中，该种类首先通过吸收光子而从它的电子基态激发为处于电子激发态的不同振动态之一。该分子然后再下降至该电子基态的不同振动级之一，从而在该过程中发射光子。由于分子可能下降到该基态中的几个振动级的任何一个，这些发射的光子将具有不同的能量，并且因此具有不同的频率。一种蛋白质的荧光响应是由于含有芳香族部分的氨基酸（色氨酸、酪氨酸或苯丙氨酸）的存在。通常，用280nm的激发波长获得一种蛋白质的荧光响应。在这些蛋白质中的大多数荧光发射是由于色氨酸残基的激发，酪氨酸和苯丙氨酸的贡献是次要的。
在此披露的荧光方法是基于对消化酶（胰脂肪酶，API）的总蛋白含量的测量，这些消化酶从包含所述酶的组合物或剂型释放到溶出介质中。在此使用的短语“总蛋白”等同于由该药物产品释放的所有蛋白质，即在该起始固体组合物中存在的所有蛋白质，如脂肪酶、蛋白酶以及淀粉酶。为了得到释放的API的直接值，优选地在这种方法中使用的标准品是用同一个批次的测试药物产品制备的，但是将它研磨并倒入相同的溶出介质中以获得100%API溶解。该测试批次的溶出度被测量为相对于该标准制剂的百分比分数。
本发明方法能够应用于可以包含无药物活性的赋形剂的胰脂肪酶固体组合物，如含有消化酶的任何适合的口服剂型。适合的剂型的非限制性实例包括片剂、胶囊、小药囊或单个单位。在一个具体实施例中，该剂型是一种胶囊。每个剂型含有API（药物）的消化酶珠粒（也被称作单位）。就本发明而言，这些消化酶珠粒是任何种类的颗粒。术语“珠粒”包括颗粒剂、颗粒、片剂、球、小片、微片、微粒、微球、小微球、微胶囊以及微丸。该珠粒可以是任何适合的粒度或形状，具体地具有大约50至大约5000μm的尺寸范围，更具体地，它们能够具有在大约2至大约5mm范围内的、或小于大约2mm（例如大约1-2mm）的标称（例如平均值）粒径。具有最小中值尺寸1.15mm的“小微球”、或者具有最大中值尺寸2.63mm的“微片”也适合于本方法。这些珠粒可以具有小于大约800μm，优选小于500μm，优选大约400μm至大约600μm或大约250μm至大约500μm的平均尺寸。这些珠粒可以具有不小于400μm的体积直径（d(v,0.1)，（定义为在该处体积分布的10%在这个值以下并且90%在这个值的以上的直径））以及不大于900μm的体积直径d(v,0.9)（定义为在该处体积分布的90%在这个值以下并且10%在这个值以上的直径）。
可以用一种肠溶层将适合于药物产品制备的所有这些消化酶珠粒（更具体地胰脂肪酶酶珠粒）包衣。在胰脂肪酶核心被一种肠溶包衣包围的实施例中，该包衣充当一种保护该药物免受胃的酸性环境并且实质上防止该药物在它达到小肠之前释放的屏障。肠溶包衣组合物与其他包衣组合物的适合组合能够用来提供对药物释放或治疗效果的所希望的控制类型。该肠溶包衣包括至少一种肠溶聚合物以及另外的赋形剂。短语“肠溶聚合物”表示一种保护这些消化酶免受胃内容物影响的聚合物，例如一种在酸性pH下稳定但是能够在更高pH下快速分解的聚合物，或者一种其水合或侵蚀速率足够慢以确保当它在胃中时胃内容物与这些消化酶的接触是相对次要的聚合物，与在胃肠道的其余部分相反。耐胃液聚合物的非限制性实例是邻苯二甲酸乙酸纤维素、羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯、羟丙基甲基纤维素乙酸琥珀酸酯、聚乙酸乙烯邻苯二甲酸酯、甲基丙烯酸的共聚物、甲基丙烯酸甲酯的酯以及虫胶。这些聚合物是可商购的，具有不同的商品名，如：纤维醋法酯（）（邻苯二甲酸乙酸纤维素）、尤特奇（）L100、S100、L30D、FS30D、L100-55（甲基丙烯酸的共聚物），（邻苯二甲酸乙酸纤维素）、（羟丙基甲基纤维素乙酸丁二酸酯）、（羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯）。优选地，该肠溶包衣包括：10wt%-20wt%的至少一种肠溶聚合物；其中每个所述wt%是基于包衣颗粒的总重量。该包衣可以进一步包含一种亲脂剂，如一种选自这些脂肪族羧酸和醇的C6-C30亲脂性低分子量分子，优选C14-C18羧酸或醇，如硬脂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻醇或硬脂醇。该包衣的其他任选的成分是增塑剂、抗粘剂（如滑石、硬脂酸镁、胶体二氧化硅及它们的组合；进一步任选低粘度乙基纤维素）。适合的增塑剂的非限制性实例包括甘油三乙酸酯、柠檬酸三丁酯、柠檬酸三乙酯、乙酰基柠檬酸三正丁酯、邻苯二甲酸二乙酯、癸二酸二丁酯、聚乙二醇、聚丙二醇、蓖麻油、乙酰化单甘油酯和甘油二酯、十六醇、肉豆蔻醇、以及它们的混合物。优选的增塑剂是一种非邻苯二甲酸酯增塑剂或其混合物。
然后这些包衣的稳定化消化酶颗粒可以被配制成胶囊。稳定化消化酶颗粒的一种具体剂型是填充有肠溶包衣的胰脂肪酶酶类珠粒的胶囊。含有肠溶包衣的胰脂肪酶酶类、包含羟丙基甲基纤维素、具有大约6wt%或以下的含水量的胶囊是一种剂型的具体实施例；更具体地，具有大约4wt%或以下的含水量；进一步具体地，具有大约2wt%或以下的含水量。
在此使用的术语“消化酶”表示在消化道中的将食物的组分分解使得它们能够被生物摄取或吸收的一种酶。消化酶的非限制性实例包括胰脂肪酶（也被称为胰酶）、脂肪酶、辅脂肪酶、胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、胰凝乳蛋白酶B、胰肽酶、羧肽酶A、羧肽酶B、甘油酯水解酶、磷脂酶、甾醇酯水解酶、弹性蛋白酶、激肽原酶、核糖核酸酶、脱氧核糖核酸酶、α-淀粉酶、木瓜蛋白酶、木瓜凝乳蛋白酶、麸质酶、菠萝蛋白酶、无花果蛋白酶、β-淀粉酶、纤维素酶、β-半乳糖苷酶、异麦芽糖酶、以及它们的混合物。它们是通过从胰脏或胰液中提取获得的，或人工制造的，或从不同于胰脏的来源（如从微生物、细菌、霉菌、真菌、植物或其他动物组织，经遗传修饰的微生物、真菌或植物）获得的。
术语“胰脂肪酶”或“胰脂肪酶酶类”或“胰酶”表示若干类型的酶的一种混合物，包括具有胰脏来源的淀粉酶、脂肪酶以及蛋白酶酶类，或它们的混合物。胰脂肪酶是可商购的，例如从诺德马克医药有限公司（NordmarkArzneimittelGmbH）、蛋白质科学实验室（ScientificProteinLaboratoriesLLC）或西格玛奥德里奇公司（SigmaAldrich）；并且可以使用来自猪、牛或其他哺乳动物来源的相似的提取物。商业胰脂肪酶制剂的实例包括Zenpep、Viokace、Ultrase、Creon、Pancreaze以及Panzytrat；更具体地，用于口服给药的Zenpep胶囊含有肠溶包衣珠粒（对于750、3,000、5,000USP脂肪酶单位为1.8-1.9mm，对于10,000、15,000、20,000、25,000和40,000USP脂肪酶单位为2.2-2.5mm）。
术语“脂肪酶”表示一种催化脂类水解为甘油和简单脂肪酸的酶。适合于本发明的脂肪酶的实例包括但不限于动物脂肪酶（例如猪脂肪酶）、细菌脂肪酶（例如假单胞菌脂肪酶和/或伯克霍尔德菌脂肪酶）、真菌脂肪酶、植物脂肪酶、重组脂肪酶（例如通过重组DNA技术由适合的宿主细胞产生的脂肪酶，该宿主细胞选自培养的微生物的任何一种、细菌、酵母菌、真菌、植物、昆虫或哺乳动物的宿主细胞；或包括与天然存在的序列同源或基本上一致的氨基酸序列的重组脂肪酶；由与编码天然存在的脂肪酶的核酸同源或基本上一致的核酸编码的脂肪酶，等等）、合成脂肪酶、化学改性的脂肪酶、及其混合物。术语“脂类”广义上包括天然存在的分子，这些天然存在的分子包括脂肪、蜡、甾醇、脂溶性维生素（如维生素A、D、E和K）、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、磷脂等。
术语“淀粉酶”是指分解淀粉的糖苷水解酶酶类，例如α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶、酸性α-葡糖苷酶（acidalfa-glucosidase）、唾液淀粉酶（例如唾液淀粉酶（ptyalin）），等等。适合用于本发明的淀粉酶包括但不限于动物淀粉酶、细菌淀粉酶、真菌淀粉酶（例如曲霉菌淀粉酶：例如米曲霉淀粉酶）、植物淀粉酶、重组淀粉酶（例如通过重组DNA技术由适合的宿主细胞产生的淀粉酶，该宿主细胞选自培养的微生物的任何一种、细菌、酵母菌、真菌、植物、昆虫或哺乳动物的宿主细胞；或包括与天然存在的序列同源或基本上一致的氨基酸序列的重组淀粉酶；由与编码天然存在的淀粉酶的核酸同源或基本上一致的核酸编码的淀粉酶，等等）、化学改性的淀粉酶、及其混合物。
蛋白酶通常是使蛋白质的氨基酸之间的肽键断裂的酶（例如蛋白酶、肽酶、蛋白水解酶）。通过它们的催化类型来鉴定蛋白酶，例如天冬氨酸肽酶、半胱氨酸（巯基）肽酶、金属肽酶、丝氨酸肽酶、苏氨酸肽酶、碱性或半碱性蛋白酶、中性以及催化机理未知的肽酶。适合用于本发明的蛋白酶的非限制性实例包括丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶（例如疟原虫天冬氨酸蛋白酶）、金属蛋白酶、以及谷氨酸蛋白酶。另外，适合用于本发明的蛋白酶包括但不限于动物蛋白酶、细菌蛋白酶、真菌蛋白酶（例如蜂蜜曲霉蛋白酶）、植物蛋白酶、重组蛋白酶（例如通过重组DNA技术由适合的宿主细胞产生的蛋白酶，该宿主细胞选自以下任何一项：培养的细菌、酵母菌、真菌、植物、昆虫或哺乳动物的宿主细胞；或包括与天然存在的序列同源或基本上一致的氨基酸序列的重组蛋白酶；由与编码天然存在的蛋白酶的核酸同源或基本上一致的核酸编码的蛋白酶，等等）、化学改性的蛋白酶、及其混合物。
在本发明中分析的这些组合物或口服剂型的胰脂肪酶酶类可以包含一种或多种脂肪酶（即，一种脂肪酶，或两种或更多种脂肪酶）、或一种或多种淀粉酶（即，一种淀粉酶，或两种或更多种淀粉酶）、或一种或多种蛋白酶（即，一种蛋白酶，或两种或更多种蛋白酶）、以及处于不同组合和比率的这些酶的混合物。
在有待通过本发明方法分析的这些组合物或剂型中的脂肪酶活性可以是从大约650至大约45,000IU（USP方法）、从大约675至大约825IU、从大约2,700至大约3,300IU、从大约4,500至大约5,500IU、从大约9,000至大约11,000IU、从大约13,500至大约16,500IU、从大约18,000至大约22,000IU、从大约22,500至大约27,500IU、从大约36,000至大约44,000IU以及其间所有的范围和子范围。脂肪酶活性可以是大约750、大约3,000、大约4,200、大约5,000、大约6,000、大约10,000、大约10,500、大约15,000、大约16,800、大约20,000、大约21,000、大约24,000、或大约25,000、或大约40,000IU（USP方法）或其倍数。在这些组合物或剂型中的淀粉酶活性可以是从大约1,600至大约6,575IU（USP方法）、从大约6,000至大约225,000IU，例如从大约6,400至大约26,300IU、从大约10,700至大约43,800IU、从大约21,500至大约87,500IU、从大约32,100至大约131,300IU、从大约42,900至大约175,000IU、从大约53,600至大约218,700IU以及其间所有的范围和子范围。在这些组合物或剂型中的蛋白酶活性可以是从大约1,250至大约3,850IU（USP方法）、从大约5,000至大约130,000IU，例如从大约5,000至大约15,400IU、从大约8,400至大约25,700IU、从大约16,800至大约51,300IU、从大约25,000至大约77,000IU、从大约33,500至大约102,600IU、从大约41,800至大约128,300IU以及其间所有的范围和子范围。组合的酶组合物包括以下各项：(A)脂肪酶活性的范围可以是从大约675至大约825IU，淀粉酶活性的范围可以是从大约1,600至大约6,575IU，并且蛋白酶活性的范围可以是从大约1,250至大约3,850IU（USP方法）；(B)脂肪酶活性的范围可以是从大约2,700至大约3,300IU，淀粉酶活性的范围可以是从大约6,400至大约26,300IU，并且蛋白酶活性的范围可以是从大约5,000至大约15,400IU（USP方法）；(C)脂肪酶活性的范围可以是从大约4,500至大约5,500IU，淀粉酶活性的范围可以是从大约10,700至大约43,800IU，并且蛋白酶活性的范围可以是从大约8,400至大约25,700IU（USP方法）；(D)脂肪酶活性的范围可以是从大约9,000至大约11,000IU，淀粉酶活性的范围可以是从大约21,500至大约87,500IU，并且蛋白酶活性的范围可以是从大约16,800至大约51,300IU（USP方法）；(E)脂肪酶活性的范围是从大约13,500至大约16,500IU，淀粉酶活性的范围是从大约32,100至大约131,300IU，并且蛋白酶活性的范围是从大约25,000至大约77,000IU（USP）；(F)脂肪酶活性的范围可以是从大约18,000至大约22,000IU，淀粉酶活性的范围可以是从大约42,900至大约175,000IU，并且蛋白酶活性的范围可以是从大约33,500至大约102,600IU（USP）；以及(G)脂肪酶活性的范围可以是从大约22,500至大约27,500IU，淀粉酶活性的范围可以是从大约53,600至大约218,700IU，并且蛋白酶活性的范围可以是从大约41,800至大约128,300IU（USP）。有待通过本发明方法分析的这些组合物或剂型中的脂肪酶活性的范围还可以是从大约5,000PhEur脂肪酶单位至大约40,000PhEur脂肪酶单位，它可以是大约5,000、或大约10,000、或大约15,000或大约20,000或大约30,000或大约40,000PhEur脂肪酶单位。
在本发明的另一个实施例中，含有以上列出的淀粉酶活性中的一部分的单个单位也能够用本步骤进行分析。
在本发明的另一个实施例中，含有以上列出的淀粉酶活性中的一部分的单个单位也能够用本方法进行分析。
在这些组合物或剂型中的淀粉酶/脂肪酶活性的比率的范围可以是从大约1至大约10，如从大约2.38至大约8.75（根据USP进行酶法测定）。这个比率的范围可以是从大约1至大约8，如从大约1.86至大约5.13（根据USP进行酶法测定），或该比率可以是大约1、大约2、大约3、大约4、大约5、大约6、大约7、大约8、大约9、或大约10。
该产品的无活性成分包括交联羧甲基纤维素钠、氢化蓖麻油、胶体二氧化硅、微晶纤维素、硬脂酸镁、羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯、滑石以及柠檬酸三乙酯。由于它们的高度稳定的配方，每剂阿帕泰丽斯制药有限公司（AptalisPharma）的制剂为患者和医师提供了一致量的主要胰酶：脂肪酶、蛋白酶和淀粉酶。能够将胶囊打开并且将内容物分开以便单独地逐步增加剂量。
在本发明的另一个实施例中，该方法包括以下步骤：(a)允许该固体胰脂肪酶组合物在该溶出介质中释放这些消化酶，(b)读取荧光以检测这些酶并且测量在该介质中的消化酶的量。使用在这些概略USP或EMA方法中说明的这些溶出设备或使用由本领域的专家已知并应用的所有这些设备和方案来进行该溶出度试验。该溶出介质选自适合于测试总蛋白溶出度的不同溶液，如水、HCl溶液、模拟胃液、缓冲溶液、模拟肠液、含有表面活性剂的水溶液或缓冲溶液。缓冲溶液可以是例如磷酸盐缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。
在一个具体实施例中，该溶出介质由依次使用（两个阶段）的至少两种溶出介质组成。该第一溶出介质是一种含水介质，该含水介质具有在大约1与4.5之间、特别是在大约1与大约2之间的酸性pH，更特别地处于大约1.2的pH下（酸阶段），并且该第二溶出介质是含水溶液，该含水溶液具有大约5.0以上、特别是在大约5.5与大约6.8之间的pH，更特别地处于大约6的pH下（缓冲肠阶段）。
在本发明的另一个实施例中，该第一溶出介质是一种具有大约1与大约4.5之间的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有大约5以上的pH的含水缓冲溶液。
在另一个实施例中，该第一溶出介质是一种具有大约1与大约4.5之间的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有大约5.5与大约6.8之间的pH的含水缓冲溶液。
在本发明的另一个实施例中，该第一溶出介质是一种具有大约1与大约2之间的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有大约5以上的pH的含水缓冲溶液。
在本发明的另一个实施例中，该第一溶出介质是一种具有大约1与大约2之间的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有大约5.5与大约6.8之间的pH的含水缓冲溶液。
在本发明的另一个实施例中，该第一溶出介质是一种具有大约1.2的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有大约6的pH的含水缓冲溶液。
在一个另外的实施例中，该方法包括以下步骤：a)在该第一溶出介质中添加固体胰脂肪酶组合物（酸阶段），b)将该悬浮液转移至该第二溶出介质中（肠阶段），c)允许这些消化酶释放，d)对溶出介质的等分试样取样，e)在346nm处读取荧光，d)计算释放的消化酶的量。如在这些实例中所报道进行计算。
当将溶出度试验应用到一种药物产品时，USP要求计算“Q”值。这些Q值与这些所标记的效能相关，并且当前的验收标准被确定为脂肪酶标记活性的75%。
本发明的荧光方法，即使对于酶活性测量不是特异性的，也显示出与酶溶出特征曲线的全相关，因而证明了总蛋白释放与酶释放严格相关。因此，就本方法而言，可以按以下方式计算“Q”值：在用荧光测量的溶出方法中的“Q”值：
其中：溶出度%为释放的API的%，如在分析步骤中指示进行计算；批次脂肪酶测定是该批次脂肪酶活性；标记的脂肪酶活性：在该药物产品标签中指示的脂肪酶活性。
当实施胰脂肪酶组合物的缓冲肠阶段溶出度试验时，虽然在此披露的荧光方法显示出与酶活性测量的全相关，并且因此被建议作为取代脂肪酶活性酶试验的方法，这种方法不能检测在酸阶段的溶出期间出现的任何耐胃液性问题，由于它是脂肪酶测定，因此总蛋白荧光测量不受酸渗透过膜的影响。在酸液渗透过保护膜的情况下，脂肪酶活性强烈降低。在该缓冲肠阶段的溶出结束时，当前的USP试验（脂肪酶活性测量）累积了在具有脂肪酶溶出和降解现象的酸阶段的潜在弱耐胃液性作用，这在缓冲肠阶段出现。
因此，本发明的另一个实施例是一种用于通过与耐胃液试验相组合的荧光光谱法测量在溶出介质中从固体胰脂肪酶组合物释放的消化酶的量（%）的方法，其中该耐胃液性是通过在酸性介质暴露（酸阶段）之后通过特异性脂肪酶测定方法确定该产品的残留脂肪酶活性来测量的。在这个实施例中，这两种试验（溶出FL试验和耐胃液性GR试验）能够以各自的顺序进行。
FL试验：该溶出度试验以两个阶段进行（酸阶段和肠阶段）。在该第一酸阶段中，溶出介质是一种含水介质，该含水介质具有在大约1与大约4.5之间的酸性pH，优选在大约1与大约2之间的pH，优选大约1.2的pH（酸阶段）；在该第二肠阶段中，该溶出介质是含水缓冲溶液，该含水缓冲溶液具有大约5以上的pH，优选在大约5.5与大约6.8之间的pH，优选大约6的pH（缓冲肠阶段）。该耐胃液试验在含水介质中进行，该含水介质具有在大约1与大约4.5之间的酸性pH，优选在大约1与大约2之间的pH，优选大约1.2的pH。该荧光试验测量在该肠阶段结束时释放的消化酶（API或药物）；对于验收标准而言，可以通过批次释放的脂肪酶活性/标记的脂肪酶活性的比率来计算该Q值。
GR试验：该耐胃液试验是在该溶出度试验的酸阶段的条件下进行（该溶出介质是一种含水溶液，该含水溶液具有在大约1与大约4.5之间的酸性pH，具体地处于在大约1与大约2之间的pH，更具体地处于在大约1.2的pH）的，其中%耐胃液性是通过确定在暴露于酸性介质之后的该产品的残留脂肪酶活性而测量的，关于脂肪酶测定方法的验收标准将是在USP中针对延迟释放剂型的酸阶段指示的那些。
根据前述说明和实验部分，可以看出本荧光分析方法提供了若干重要的优点。
本发明提供了一种简单且快速的程序，因为试剂制备所需要的时间显著减少，并且在酶测定中不要求特殊的分析性专门知识。因此，分析转移是非常容易的。该提议的方法与脂肪酶测定相比是更容易且更快速进行的，并且试剂制备所需要的时间显著减少。
标记（总蛋白）在该溶出介质中是稳定的，并且因此在计算中不需要用于补偿降解的校正因子（如在脂肪酶测定方法中所需要的）。事实上，在该荧光测量中测定的标记（总蛋白）在37℃在pH6的肠阶段介质缓冲液中30min之后显示出小于3%的降解，而用当前方法测量的脂肪酶酶活性在37℃在pH6的肠阶段介质缓冲液中显示出大约11%的降解。
这种新的方法也是精确的并且具有良好的灵敏度，使得定量限/线性范围也适合于单个单位测试。与脂肪酶酶测定相比，该荧光方法在工作浓度方面展现出更好的性能特征，该工作浓度是0.3脂肪酶USP单位≈3μg胰脂肪酶/mL；该工作浓度为脂肪酶测定的工作浓度的大约1/50；该线性范围是工作浓度的10%-200%；该精确度不大于2.0%，无论是对重复性和中间精确度而言（如在六个不同批号的胰脂肪酶制剂的溶出结果中测量的）。
而且，用这样的方法能够获得测试多点（>3）溶出特征曲线。
在该实验部分中还显示，在使用三种测量方法获得的溶出特征曲线的比较的基础上，该发明的总蛋白含量检测的非特异性荧光程序在性能方面与基于蛋白酶活性和基于脂肪酶活性的两种酶特异性测定（当前的概略方法）是等效的。
应当理解的是，前述一般性说明和之后的详细说明两者对于本发明都是示例性的，而不是限制性的。
实例
设备、材料和方法
设备：LS50B荧光光谱仪（珀金埃尔默公司（PerkinElmer））、LS55荧光光谱仪（珀金埃尔默公司）、Lambda20UV-VIS光谱仪（珀金埃尔默公司）、786Titrando电位滴定系统（万通公司（Metrohm））、VK-7025溶出浴（万科公司（Vankel））、Premier5100溶出浴（迪斯泰克公司（Distek））、USP装置1-篮法（针对酸阶段）；USP装置2-桨法（针对肠阶段）。
用于溶出度试验的试剂。酸阶段介质（pH1.2）：将2.00g的氯化钠置于800mL纯净水中，并且搅拌直到完全溶解。添加7mL37%HCl并且混合。用1NHCl或1NNaOH调节该溶液的pH至1.20±0.05。用纯净水稀释至1000mL；检查pH，并且如果需要的话，用1NHCl或1NNaOH调节至1.20±0.05。
用于溶出度试验的试剂。肠阶段介质（pH6.0）：将9.20g的磷酸二氢钾和2.00g的氯化钠置于800mL纯净水中，并且搅拌直到完全溶解。用1NNaOH调节该溶液的pH至6.00±0.05。用纯净水稀释至1000mL；检查pH，并且如果需要的话，用1NHCl或1NNaOH调节至6.00±0.05。
使用肠溶包衣的胰脂肪酶珠粒（胰脂肪酶小片（MT）或微片（MCT））来进行所有实例，这些肠溶包衣的胰脂肪酶珠粒是用肠溶聚合物羟丙甲纤维素邻苯二甲酸酯（HP55）包衣的胰脂肪酶原料和赋形剂（例如，交联羧甲基纤维素钠、氢化蓖麻油、胶体二氧化硅、微晶纤维素和硬脂酸镁）的共混物；这些MT和MCT包含在HPMC胶囊中并且在名称下销售。熟练的技术人员将认识到，替代的肠溶聚合物和赋形剂可以用于肠溶包衣的胰脂肪酶珠粒中。
脂肪分解活性的测量是使用基于脂肪酶测定的概略程序（描述于胰脂肪酶USP专论中）进行的，该测量是通过氢离子浓度稳定法（pH-statmethod）基于形成自使用的底物（橄榄油）中的酯化脂肪酸的水解的游离脂肪酸的滴定进行的。它基于以下原理：脂肪酶催化甘油三酯的水解，导致游离脂肪酸（FFA）的形成。根据时间的形成的FFA的滴定为确定脂肪酶的酶活性做好了准备，可以按照以下单位表示脂肪酶的酶活性：1U=1μmole每分钟形成的FFA。当pH值相比于固定值变化时，通过提供NaOH（滴定剂）添加的实验系统来维持稳定的pH值（氢离子浓度稳定法）而发生反应。根据时间添加的滴定剂的量相应于通过脂肪酶作用于甘油三酯形成的FAA的量。假如使用一种适量的底物并且在其中酶稳定的实验条件下，可以获得根据时间的FFA形成的一种线性动力学。曲线斜率{添加的滴定剂=f（体积（mL）/时间（分钟））}给出了脂肪酶的酶活性。
蛋白水解活性的测量是根据胰脂肪酶USP专论中描述的方法概略进行的。
实例1药物产品的标准溶液的制备
该标准溶液用被分析的该剂型中存在的相同批号的药物产品制备。将等效于7,000USP脂肪酶单位的一个量的胰脂肪酶珠粒（小片或微片）准确称量到一个研钵中。添加5-6ml的肠阶段介质，并且研磨直到获得该产品的完全分散。将悬浮液转移至500mL容量瓶中。用几mL的肠阶段介质将该研钵冲洗2-3次，并且将该液体转移至该500mL容量瓶中。将肠阶段介质添加至该容量瓶中，直到最终总量500mL，并且将该混合物搅拌10分钟。将从该溶出介质中取样的等分试样用肠阶段介质进一步以1:50稀释。随着这种稀释，API的终浓度为大约0.3USP脂肪酶单位（大约3μg胰脂肪酶/mL）。这最后的稀释是仅仅在终点的溶出度试验中以及在多点溶出度试验（溶出特征曲线）中进行的。
实例2.溶出度试验
将800mL的酸阶段介质添加在每个配备有篮装置的溶出浴的容器中；将该溶出介质在37℃平衡。称量等效于11,200USP脂肪酶单位（14USP脂肪酶单位/mL）的一个量的胰脂肪酶珠粒（Zenpep小片或微片），并且以这种方式制备六个独立的样品并且将其置于篮中。该装置以100rpm运行。在1小时之后，从该介质移开这些篮，用几毫升的水冲洗，并且将每个篮的内容物转移到相应的容器中，该容器含有在37℃的配备有桨叶装置的溶出浴的800mL的肠阶段介质。该装置以100rpm运行。在30min之后，对来自每个容器的溶出介质的等分试样取样，用于测量释放的API。在溶出特征曲线的确定中，在10、12、15、18、30min处对在肠阶段中的溶出介质的2.5mL等分试样取样；在该试验过程中没有进行介质更换，在计算中通过以下校正因子将体积损失考虑在内。
表1用于计算溶出特征曲线的校正因子（FC）
实例3.通过荧光光谱法确定在该溶出度试验中释放的消化酶（API，活性成分）（总蛋白测定）
将如在实例2中所述从每个篮中取样的溶出介质的每个等分试样用肠阶段介质以1:50稀释。用以下操作参数在该荧光光谱仪中读取稀释的溶液：1cm光程的石英比色皿；激发波长：280nm；发射波长（测量）：346nm，激发狭缝：6.0。在终点的标记（API=胰脂肪酶；100%
针对如在实例1中所述的用相同批号的药物产品制备的一种标以下公式完成计算。
对于溶出试验–多点（溶出特征曲线），用以下公式完成计算：
其中：ESMP是减去空白的样品的荧光读数（在346nm发射）；ESTD是减去空白的标准品的荧光读数（在346nm发射）；WSMP是样品重量（mg）；WSTD是标准品重量（mg）；VSMP是样品的稀释体积（mL）；VSTD是标准
实例4.通过荧光光谱法的总蛋白测定的验证研究
在该溶出度试验中，通过以下这些参数评价从胰脂肪酶组合物（制剂）释放的API中的总蛋白含量的荧光测定的性能特征：特异性、线性、准确度、精确度、定量限、样品和标准溶液的稳定性、在标准溶液制剂中的提取完全性的证明，并且将结果总结在表2中。
表2.荧光方法的验证数据
关于获得的这些验证数据，在这里显示的是，用于确定在胰脂肪酶剂型（制剂）的溶出度试验中的总蛋白含量的所提议的荧光方法适合于预期的用途。
实例5.关于三种测量方法的胰脂肪酶珠粒（小片）的溶出特征曲线：根据荧光光谱法（非特异性测定）的总蛋白含量，根据蛋白酶测定（酶特异性测定）的蛋白水解活性，以及根据脂肪酶测定（酶特异性测定）的脂肪分解活性
通过在以下时间点进行2.5mL等分试样的取样，根据以上所述方法（参见实例2）进行该溶出度试验：10、12、15、18和30min。在该试验期间没有进行介质更换。根据用于通过f2试验证明溶出度特征曲线的相似性的SUPAC法（行业指南：“SUPACMR：缓释固体口服剂型。放大和批准后变更：化学、制造和控制，体外溶出度测试以及体内生物等效性文件”药物评价和研究中心（CDER），1997年九月）（GuidanceforIndustry“SUPACMR:Modifiedreleasesolidoraldosageforms.Scale-upandpostapprovalchanges:chemistry,manufacturing,andcontrols,invitrodissolutiontesting,andinvivobioequivalencedocumentation”CenterforDrugEvaluationandResearch(CDER),September1997）进行这三种方法的比较；为了产生针对这三种测量方法中的每一种的所需数量的数据，对十二个独立样品（样品=等效于11200UI的胰脂肪酶珠粒小片的量）进行了分析，分成每次运行三个样品的组，总共运行四次。
实例5.1根据蛋白酶测定的胰脂肪酶珠粒（小片）的溶出特征曲线
在每个测试时间点的单独的溶出度值以及总平均值总结在表3
中；该平均曲线显示在图1中。
表3.溶出特征曲线数据（蛋白酶测定）
实例5.2.根据脂肪酶测定的胰脂肪酶珠粒（小片）的溶出特征曲线
在每个测试时间点的单独的溶出度值以及总平均值总结在表4中；该平均曲线显示在图2中。校正因子1.125被使用于该计算中，以补偿在该溶出度试验期间的脂肪酶降解。
表4.溶出特征曲线数据（脂肪酶测定）
实例5.3根据总蛋白含量的荧光测定的胰脂肪酶珠粒（小片）的溶出特征曲线
在每个测试时间点的单独的溶出度值以及总平均值总结在表5中；该平均曲线显示在图3中。
表5.溶出特征曲线数据（通过荧光光谱法的总蛋白测定）
实例5.4用这三种测量方法获得的溶出特征曲线的比较
用这三种测定方法在每个时间点测量的胰脂肪酶珠粒（小片）的平均溶出度数据总结在表6中。
表6.用脂肪酶测定、蛋白酶测定以及总蛋白的荧光测定获得的胰脂肪酶珠粒（小片）的平均溶出度数据
这三种溶出特征曲线显示出几乎完全的重叠，如在图4a-c的图解比较中展示的；尤其是，脂肪酶测定和荧光测定平均曲线是完全重叠的，而蛋白酶平均曲线仅仅在终点（显示出>100%的值）是不同的。并且，在这三种测量方法之中，每个系列的数据的CV是相当相似的，其中通过荧光测定展现出较低的值。
用来在变更之后和之前对药物产品的性能的等效性进行评价的SUPAC方法（对产品的溶出特征曲线进行相似性检验f2来比较）被用来证明用于在制剂的溶出度试验中的总蛋白荧光测定的提议的新方法与当前所使用的方法（脂肪酶测定）以及与其他酶特异性测量（蛋白酶测定）的等效性。
为了对溶出特征曲线应用该相似性检验f2，FDA指南（行业指南“SUPACMR：缓释固体口服剂型，放大和批准后变更：化学、生产和控制，体外溶出度测试以及体内生物等效性文档”药物评价和研究中心（CDER），1997年九月；行业指南-立即释放固体口服剂型的溶出度测试，药物评价和研究中心（CDER），1997年八月）（GuidanceforIndustry“SUPACMR:Modifiedreleasesolidoraldosageforms.Scale-upandpostapprovalchanges:chemistry,manufacturing,andcontrols,invitrodissolutiontesting,andinvivobioequivalencedocumentation”CenterforDrugEvaluationandResearch(CDER),September1997;GuidanceforIndustry-dissolutiontestingofImmediateReleaseSolidOralDosageForms,CenterforDrugEvaluationandResearch(CDER),August1997）指示了应当满足的一些条件：
a.使用在每个时间间隔来自两种曲线的平均溶出度值（n=12），
b.仅一种测量被应该考虑超出85%溶出点，
c.在这些溶出特征曲线之间，在任何取样时间点的平均差应当不大于15%，
d.为了允许使用平均值数据，在较早时间点的变异系数百分比应当不大于20%，并且在其他时间点应当不大于10%。
在本溶出度数据中满足了要求a、b和c，然而，对于评价的所有这些测量方法而言，在前三个时间点（10、12、15min）观察到大于允许的那些值（d）的CV值。观察到的这些时间点的高可变性可以用被分析物在第一取样时间（10min）的非常低的浓度以及用该制剂在窄范围的经过时间（对于在12分钟和15分钟的另外的时间点）中的内在可变性来解释，考虑到在这些溶出度试验条件下该制剂的100%释放是在一个非常短的时间（30分钟）内获得的。
基于以上考虑因素，不管怎样应用f2检验，假定在这三种测量方法中观察到的相似的可变性没有显著改变获得的显示出完全重叠的这些平均曲线。然后，通过考虑最后三个时间点（15-18-30min）作出进一步评价，以便证实即使用完全满足SUPAC要求的数据，该f2检验是否将会通过。
实例5.4.1.比较：荧光测定含量相对于脂肪酶测定
当考虑所有时间点时，用于荧光测定相对于脂肪酶测定（参照）的溶出特征曲线的f2检验显示出在这两种曲线之间的87.4%的相似性，而当对最后三个时间点作出计算时，相似性为83.3%。
实例5.4.2.比较：总蛋白含量的荧光测定相对于蛋白酶测定
当考虑所有时间点时，用于荧光测定相对于蛋白酶测定（参照）的溶出特征曲线的f2检验显示出在这两种曲线之间的72.3%的相似性，而当对最后三个时间点作出计算时，相似性为68.6%。通常，大于50（50-100）的f2值确保了这两种曲线的同一性或等效性，并且因此确保了该试验的性能的同一性或等效性。根据在通过f2检验的溶出特征曲线的比较中获得的这些结果，因此有可能阐明的是，在胰脂肪酶制剂（制剂）的溶出度试验中的API释放的测量中，总蛋白含量的荧光测定在所有方面都等效于酶特异性方法。
实例6.验证数据的比较
为了完成在新的荧光试验与已知的公认的脂肪酶活性酶测定（USP方法）之间的比较，表7被包括在内。
表7验证数据的比较
(a)：针对脂肪酶测定的目标浓度=12个脂肪酶单位/mL；(b):针对FL测定的目标浓度=0.3个脂肪酶单位/mL（3μgDS/mL）；(c):1个批号的DP，六个独立样品/运行；(d):6个批号的DP，对于每个批号的六个独立样品/运行
实例7.通过荧光光谱法的对于胰脂肪酶珠粒的溶出度试验。
还用在市场上存在的具有名称并具有不同剂量强度的其他胰脂肪酶制剂进行了如在以上这些实例中所述的荧光方法。这些结果与针对作为销售的胰脂肪酶珠粒获得的结果进行比较，并且报告在图5中。在行为上的这些差异与这些制剂的不同强度以及这两种制剂（，）的颗粒的不同表面积是一致的。两种珠粒尺寸被用于不同的强度，较小的珠粒（大约1.8mm的平均直径）（显示出更快速的溶出特征曲线）被用来填充5,000UI胶囊，而较大的珠（大约2.4平均直径）被用来填充20,000UI胶囊。珠粒为大约1mm平均直径，但是比珠粒显著地更加不规则，因而提供了比更快速的溶出特征曲线，但是批次之间的再现性较小（所有强度使用相同的颗粒剂）。
实例8.与耐胃液性试验相组合的溶出度试验：FL-试验加GR-试验
FL-试验：用荧光测量的溶出度试验
将800mL的酸阶段介质放置在配备有篮装置的溶出浴的每个容器（USP装置1-篮）中；将该溶出介质在37℃（酸阶段）平衡。称量与11,200个USP脂肪酶单位相应的一个量的胰脂肪酶珠粒（10个胶囊的小片或微片），并且转移至装置1的每个篮中。该装置以100rpm运行。在1小时之后，从该介质移开这些篮，用几毫升的水冲洗，并且将每个篮的内容物转移至溶出容器中，这些溶出容器含有在37℃的配备有桨叶装置（USP装置2）的溶出浴的800mL的肠阶段介质。该装置以100rpm运行。在30min之后，将测试溶液的一个10mL部分移出，转移至一个试管，并且在室温平衡，用肠阶段介质作做出进一步稀释，以获得适当的浓度（大约0.3USP单位/mL）。将这些溶液储存在冰/水浴中并且在读数之前手动振摇。用以下这些操作参数在该荧光光谱仪中读取稀释的溶液：1-cm光程的石英比色皿；激发波长：=280nm；发射波长（测量）=346nm；激发狭缝：=6.0。
在稀释的试验溶液中的标记（API=胰脂肪酶；100%释放）的目标浓度是0.3USP脂肪酶单位/mL。
如在实例1中所述制备了标准溶液并且将其在搅拌下储存于冰/水浴中直到进行读数。
该药物从该胰脂肪酶固体组合物释放的量计算如下。
针对散装的小片/微片进行计算。
针对胶囊进行计算。
其中：LC是该样品的荧光读数（在346nm发射）；LS：标准品的荧光读数（在346nm发射）；PS是标准品重量（mg）；PC是样品重量（mg）；US是标准品的效能（脂肪酶USP单位/mg，批次脂肪酶测定）；PM是胶囊内容物的平均重量（mg/胶囊）；UL是在单独的剂量单位中标记的脂肪酶含量（USP单位/胶囊）；VC是样品的稀释体积（mL）；VS是标准品的稀释体积（mL）。
GR试验：耐胃液性试验（用脂肪酶测定）
将800mL的酸性介质放置在配备有篮装置的溶出浴的每个容器（USP装置1-篮）中，并且然后将该溶出介质在37℃平衡。称量与11,200USP脂肪酶单位相应的一个量的胰脂肪酶珠粒（10个胶囊的小片或微片），并且将其转移至装置1的每个篮中。该装置以100rpm运行。在1小时之后，从该介质移开这些篮，并且通过将这些篮短暂（持续大约5秒钟）浸入一个含有900mL的处于4℃的冷纯净水的1,000mL烧杯中冲洗这些样品，并且将这个过程重复三次，无需更换冲洗介质。将每个篮的内容物定量转移至一个陶瓷研钵，添加5-6mL的冷纯净水。研磨该样品进行直到获得它的完全分散，定量收集至一个200mL容量瓶中，并且冲洗该研钵孔。将这个操作重复2-3次。添加纯净水至最终的总体积。用冷纯净水进行进一步稀释以获得适当的浓度（大约14USP单位/mL，该浓度为假定该产品的100%耐胃液性的可用的理论最大浓度）。该样品溶液是在滴定之前即刻制备的并且在搅拌下将其保持在冰/水浴中。
该标准溶液制备如下：准确称量与6,000USP单位相应的一个量的USP胰酶脂肪酶RS或胰脂肪酶工作标准品，并且添加至一个陶瓷研钵中，添加大约5-6mL的纯净水，随后进行研磨。将该液体从该研钵倒入一个500-mL容量瓶中，并且也冲洗该研钵。将这种操作重复2-3次。添加纯净水至最终的总体积。该标准溶液是在滴定之前即刻制备的并且在搅拌下将其保持在冰/水浴中。
该标准溶液的终浓度是大约12.0USP单位脂肪酶/mL。
对于该脂肪酶测定：将30mL的底物乳液（在37℃±0.1℃）倒在滴定计的夹套容器中，并且通过磁力搅拌器进行搅拌，将温度维持在37℃±0.1℃。添加0.1NNaOH以便电位滴定地将pH调节到9.20-9.23。添加1.0mL的样品或标准溶液，随后添加0.1NNaOH持续5分钟，以将pH维持在9.0。
用以下公式进行计算：
其中：VMC是由该样品每min消耗的0.1NNaOH的体积（mL/min）；AVMS是由标准品每min消耗的0.1NNaOH的平均体积（mL/min）；PC是样品重量（mg），PS是标准品的重量（mg）；DC是样品的稀释物（mL）；DS是标准品的稀释物（mL）；US是标准品的效能（脂肪酶USP单位/mg）；UC是批次脂肪酶测定（USP脂肪酶单位/mg）。
根据USP<711>溶出-延迟释放形式（酸阶段）验收表3的验收标准是：
1级验收标准：针对每个单独的单位的GR%应当大于或等于90%；
2级验收标准：这12个单位（处于1级的6个单位，处于2级的6个单位）的GR的平均值不小于90%，并且没有单独的单位低于75%；
3级验收标准：这24个单位（处于1级的6个单位，处于2级的6个单位，处于3级的12个单位）的GR的平均值不小于90%，并且没有单独的单位低于75%。
基于所有以上报道的数据和考虑因素，在胰脂肪酶珠粒的溶出度测试中作为释放的消化酶的标记的总蛋白含量的荧光测量是当前接受的基于脂肪酶活性测定的概略测量方法的一种可靠的和有利的替代方案。

Claims (25)

1.一种用于测量在一种溶出介质中从一种固体胰脂肪酶组合物释放的消化酶的量的方法，包括使用荧光光谱法用于测量在该溶出介质中从该固体胰脂肪酶组合物释放的消化酶的量。
2.如权利要求1所述的方法，其中该固体胰脂肪酶组合物是一种肠溶胰脂肪酶组合物。
3.如权利要求1所述的方法，其中该溶出介质是水、HCl溶液、模拟胃液、缓冲溶液、模拟肠液、含有至少一种表面活性剂的水溶液。
4.如权利要求3所述的方法，其中该溶出介质是含有至少一种表面活性剂的缓冲溶液。
5.如权利要求3所述的方法，包括以下步骤：(a)允许该固体胰脂肪酶组合物在该溶出介质中释放这些消化酶，b)读取荧光以测量在该溶出介质中的消化酶的量。
6.如权利要求3所述的方法，其中该溶出介质由依次应用的至少两种溶出介质组成。
7.如权利要求6所述的方法，包括以下步骤：a)将该固体胰脂肪酶组合物添加到一种第一溶出介质中，b)将悬浮液转移至一种第二溶出介质中，c)允许这些消化酶释放，d)对溶出介质的等分试样取样，e)在346nm处读取荧光，d)计算释放的消化酶的量。
8.如权利要求7所述的方法，其中该第一溶出介质是一种具有在1与4.5之间的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有5以上的pH的含水缓冲溶液。
9.如权利要求7所述的方法，其中该第一溶出介质是一种具有在1与2之间的pH的含水介质。
10.如权利要求7所述的方法，其中该第二溶出介质是具有在5.5与6.8之间的pH的含水缓冲溶液。
11.如权利要求7所述的方法，其中该第一溶出介质是一种具有1.2的pH的含水介质，并且该第二溶出介质是具有6的pH的含水缓冲溶液。
12.如权利要求1所述的方法，其中该固体胰脂肪酶组合物包含总共750、3,000、4,200、5,000、6,000、10,000、10,500、15,000、16,800、20,000、21,000、24,000、或25,000、或40,000USP脂肪酶单位或其倍数，或5,000、或10,000、或15,000或20,000或30,000、或40,000PhEur脂肪酶单位或其倍数。
13.如权利要求8所述的方法，所述方法与耐胃液试验相组合，其中该固体胰脂肪酶组合物在具有1与4.5之间的pH的含水介质中的残留脂肪酶活性是通过特异性脂肪酶测定方法测量的。
14.如权利要求8所述的方法，所述方法与耐胃液试验相组合，其中该固体胰脂肪酶组合物在具有1与2之间的pH的含水介质中的残留脂肪酶活性是通过特异性脂肪酶测定方法测量的。
15.如权利要求8所述的方法，所述方法与耐胃液试验相组合，其中该固体胰脂肪酶组合物在具有1.2的pH的含水介质中的残留脂肪酶活性是通过特异性脂肪酶测定方法测量的。
16.一种用于与耐胃液试验相组合的通过荧光光谱法测量在溶出介质中从一种固体胰脂肪酶组合物释放的消化酶的量的方法，其中通过荧光光谱法测量在溶出介质中从该固体胰脂肪酶组合物释放的消化酶的量是在该耐胃液试验之前或之后进行的且该耐胃液试验是通过特异性脂肪酶测定方法确定该固体胰脂肪酶组合物在具有1与4.5之间的pH的含水介质中的残留脂肪酶活性来进行的。
17.如权利要求16所述的方法，其中该含水介质具有在1与2之间的pH。
18.如权利要求16所述的方法，其中该含水介质具有1.2的pH。
19.如权利要求16所述的方法，其中通过荧光光谱法测量在溶出介质中从该固体胰脂肪酶组合物释放的消化酶的量是在由依次使用的至少两种溶出介质组成的溶出介质中进行的。
20.如权利要求19所述的方法，其中第一溶出介质是一种具有在1与4.5之间的酸性pH的含水介质。
21.如权利要求20所述的方法，其中该第一溶出介质是一种具有在1与2之间的pH的含水介质。
22.如权利要求19所述的方法，其中第二溶出介质是具有5以上的pH的含水缓冲溶液。
23.如权利要求22所述的方法，其中该第二溶出介质是具有在5.5与6.8之间的pH的含水溶液。
24.如权利要求19所述的方法，其中第一溶出介质是一种具有1.2的pH的含水介质，并且第二溶出介质是具有6的pH的含水缓冲溶液。
25.如权利要求16所述的方法，其中该固体胰脂肪酶组合物包含总共750、3,000、4,200、5,000、6,000、10,000、10,500、15,000、16,800、20,000、21,000、24,000、25,000、或40,000USP脂肪酶单位或其倍数，或5,000、或10,000、或15,000或20,000或30,000、或40,000PhEur脂肪酶单位或其倍数。
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