CN103483353B

CN103483353B - 二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒及制备方法

Info

Publication number: CN103483353B
Application number: CN201210195057.2A
Authority: CN
Inventors: 赵锋; 栾瀚森; 王浩; 杨莉; 徐凤兰
Original assignee: Shanghai Modern Pharmaceutical Engineering Research Center Co Ltd
Current assignee: Shanghai Modern Pharmaceutical Engineering Research Center Co Ltd
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2012-06-13
Publication date: 2016-02-24
Anticipated expiration: 2032-06-13
Also published as: CN103483353A

Abstract

本发明公开了一种二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒及制备方法和装置，所述二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒，包括如下重量百分比的组分：二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物0.007～20%，可生物降解聚合物0～89.85%，添加剂0.07～95%，冻干支架剂，0.1-80%，纳米的平均直径10nm-800nm。本发明采用超声-静态混合装置用于制备纳米结晶及纳米粒的。本发明的二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒，具有显著的纳米粒表征特性，粒径60-300nm，Zeta电位在-30-20mv，可用于口服或静脉给药，生物利用度高，体内循环时间延长，开发该制剂具有广阔的前景。

Description

二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒及制备方法

技术领域

本发明涉及二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的制剂及制备方法。

技术背景

二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物，如CN101381371、US20100210856A1公开的6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯（以下简称ZL-004），由母核结构1,2-二硫杂环戊烯[4,3-b]吡咯-5(4H)-酮环修饰改造而成的化合物。由上海医药工业研究院王国平研究员自行合成，此类结构化合物已有专利报道，具有抗菌、抗肿瘤活性特点，如Webster等（wo2003/080624）、Stachel等（HelveticaChimicaActa2002,85,4453）、川田修司等（JP63-284181，JP11-279179）、Webster等（US6020360，WO99/12543）、Godfrey&Dell（GB2170498）的报导。

经非临床药理、毒理实验，ZL-004表现出较强的升高外周白细胞数量的特性。具有广阔的临床应用前景。

但由于ZL-004属于难溶性药物，在37℃水中溶解度只有90–120μg·mL^-1，甲醇中仅0.90-1.50mg·mL^-1，属于极微溶解物质。微观上，其难溶性使其无法以分子状态透过生物膜，分散于水溶性的循环系统，作用于生物靶细胞。宏观上，增加了口服、粘膜途径给药的难度，前期实验也证实其特殊物理性质限制药效的充分发挥，只有通过自身结构的修饰或是制剂方面的改变提高其靶细胞作用率。

鉴于其难溶性特点，要必要采用制剂学方法开发一种能提高其透过生物膜，提高化合物的活性作用效能的制剂，为今后研究提供方便。

发明内容

本发明的目的是提供二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒及制备方法，以克服现有技术存在的缺陷，进一步提高其作用效果和应用范围。

所述的二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒，包括如下重量百分比的组分：

所述纳米的平均直径10nm-800nm；

优选的，包括如下重量百分比的组分：

所述纳米的平均直径为90nm-180nm；

所述硫杂环戊烯并吡咯酮化合物为6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯；（简称ZL-004）

所述可生物降解聚合物包括聚乳酸、乳酸-羟基乙酸共聚物、乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物、乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇嵌段共聚物、甲基化聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物、聚己内酯或聚丙烯酰胺中的一种以上；

优选的为甲基化聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物；

优选的，甲基化聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中，单体摩尔比例的范围为50∶50-25∶75；

优选的，生物可降解聚合物的重均分子量为5,000-60,000道尔顿，其中，7,000-50,000道尔顿较为合适；

优选的，所述添加剂选自聚乙二醇硬脂酸酯或聚氧乙烯氢化蓖麻油；

所述冻干支架剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、海藻酸钠。

本发明的二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒制备方法，是采用如下的纳米粒制备装置实现的：

所述的纳米粒制备装置包括：水相储器、油相储器、超声发生仪、超声作用腔、机架、设有内构件的静态混合器、循环管、出液接受杯和搅拌器；

所述静态混合器通过固定架垂直的固定在所述机架上；

所述水相储器的出口通过水相管线相连通与所述超声作用腔相连通，所述油相储器的出口通过油相管线与所述超声作用腔相连通，所述超声发生仪的探头插在所述超声作用腔中；

所述超声发生仪用机械方式固定于机架上；

所述出液接受杯设置在所述静态混合器底部的出口的下方；

所述循环管一端插入所述的出液接受杯中，另一端通过输送设备与所述的水相储器相连通；

且本发明的方法包括如下步骤：

（1）将油相储器中的油相和水相储器中的水相同时送入所述超声作用腔，并启动超声发生仪，将超声波送入超声作用腔；

所述油相为含有硫杂环戊烯并吡咯酮化合物、生物可降解聚合物和添加剂的有机溶剂；

所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、碳原子1到4的醇类、N,N-二甲基酰胺或二甲基亚砜、二氧六环、乙腈等水溶性或二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基吡咯烷酮或苯甲醇等水略溶性溶剂；

所述水相为含有聚乙烯醇的水溶液；

在超声波和静态混合器中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器底部的出口流出，进入出液接受杯，将出液接受杯中的纳米级乳液送回水相储器，循环往复上述过程，直至纳米粒粒径达到要求；

（2）然后将出液接受杯中的物料，离心，收集固体物质，洗涤、加入冻干支架剂，冻干，获得所述的含有二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒；

在可生物降解聚合物的加入量为0mg的情况下，所获得的是含有6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒。

本发明的方法，与传统的制备纳米结晶、纳米粒的方法不同，传统的制备纳米结晶包括溶剂沉淀法、乳化-溶剂挥发法、盐析法、超临界流体技术、复乳法、界面缩聚法等制备方法。本发明采用超声-静态混合装置用于制备纳米结晶及纳米粒的。有关静态混合器制备纳米粒的专利US2011/0237748A1，其虽然使用静态混合器，油相中只能使用水溶性的有机溶剂，如丙酮、乙腈、四氢呋喃、N-甲基吡咯烷酮等，限制了水部分溶解有机溶剂的使用，如二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯等的应用，此类溶剂可增加非极性药物的溶解度、提高包封率、载药量。而本发明提供的超声-静态混合装置可在混合前将有机溶剂与水相乳化成极细液滴，在通过混合器后可得到高包封、粒径分布均一的纳米粒，易于放大量生产，可突破纳米粒制备瓶颈。

本发明的二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒，具有显著的纳米粒表征特性，粒径60-300nm，Zeta电位在-30-20mv，可用于口服或静脉给药，生物利用度高，体内循环时间延长，开发该制剂具有广阔的前景。

附图说明

图1为纳米粒制备装置结构示意图。

图2为实施例3的粒径分布图（数量径）。

图3为实施例3的粒径分布图（体积径）。

图4为体外释放试验。

图5为ZL-004的体内分析超高压液相色谱-双重四级杆质谱图典型质谱图。

图6为zl-004UPLC-MS/MS色谱图。

图7为静脉注射体内药动学行为。

图8为口服体内药动学行为。

具体实施方式

参见图1，本发明的纳米粒制备装置包括：水相储器1、油相储器2、超声发生仪6、超声作用腔9、机架4、设有内构件501的静态混合器5、循环管10、出液接受杯7、搅拌器8；

所述静态混合器5通过固定架401垂直的固定在所述机架4上；静态混合器5的高径比为50-80；

所述内构件501采用通用产品，如型号为SV、SL、SK、SX、SD等内构件，所述内构件的结构和相关参数，在《管道静态混合器手册》上有详细的描述，本发明不再赘述；

所述水相储器1的出口通过水相管线相连通与所述超声作用腔9相连通，所述油相储器2的出口通过油相管线与所述超声作用腔9相连通，所述超声发生仪6的探头601插在所述超声作用腔9中，优选的，所述水相管线上和油相管线设有输送设备11，如蠕动泵；

所述超声发生仪6为通用设备，可采用功率可调范围为30-200w的超声探头，探头为圆柱状，头部呈圆锥状（圆锥直径为0.5-2.0cm，长为0.5-2.0cm），用机械方式固定于机架4上；

所述出液接受杯7设置在所述静态混合器5底部的出口503的下方；

所述循环管10一端插入所述的出液接受杯7中，另一端通过输送设备与所述的水相储器1相连通；

优选的，还包括搅拌器8，所述出液接受杯7安置在所述搅拌器8上，所述搅拌器8优选磁力搅拌器；

且本发明的方法包括如下步骤：

（1）将油相储器2中的油相和水相储器1中的水相同时送入所述的超声作用腔9，并启动超声发生仪6，将超声波送入超声作用腔9；

所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、碳原子1到4的醇类、N,N-甲基酰胺或二甲基亚砜、二氧六环、乙腈等水溶性或二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基吡咯烷酮或苯甲醇等水略溶性溶剂；

所述油相中，硫杂环戊烯并吡咯酮化合物、生物可降解聚合物和添加剂的总的浓度为7.0～680克/升；

所述水相为含有聚乙烯醇的水溶液，其中：

聚乙烯醇的浓度为0.1-15克/升，以1.0～12克/升较为合适；

以有机溶剂和水的体积计，有机溶剂∶水＝1∶9.0～1∶480；

油相的速率为1.0-4.0ml·min^-1；水相的速率为150-350ml·min^-1；

以所述的有机溶剂计，油相的停留时间为20～70秒，优选27～66秒；

油相的停留时间与超声作用的效果有关，为控制指标，停留时间的定义如下：

T=(S1+S2)/υ，单位为秒；

其中：S1为静态混合器腔体的长度，单位为cm；S2为超声作用腔9长度，单位为cm；υ为物料的速率，单位为cm/秒；

以所述超声作用腔9体积为基准，超声波功率为4.0-235w·cm^-3；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器8的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液通过循环管11送回水相储器1，循环往复上述过程，直至纳米粒粒径达到要求；

（2）然后将出液接受杯7中的物料，在3-20℃、10000-50000rmp离心，收集固体物质，洗涤、加入冻干支架剂，冻干，获得所述的含有二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒。

实施例1

采用水溶性有机溶剂丙酮制备6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒；

处方：

ZL-00410mg

聚乙二醇硬脂酸酯100mg

甘露醇22mg

纳米结晶的平均粒径为95±8nm；

采用图1的装置，制备含有6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒；

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为60cm，内径为1.0cm，高径比为60；

超声作用腔9：直径：1.0cm；高度；6cm；高径比：6；体积：(1/2)²×3.14×10=0.785cm³；

超声波功率为：30w；以超声作用腔9上体积为基准，超声波功率为：38.22w·cm^-3；

内构件501型号为Sk型（长：40cm；内径：0.6cm）；

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚乙二醇硬脂酸酯溶于有机溶剂10ml丙酮中，溶解，获得油相；

将0.5克聚乙烯醇溶解在300ml水液中，为水相；

将所述的水相和油相分别置于水相储器1和油相储器2中，然后送入所述的静态混合器5的上端入口502，同时启动超声发生仪（6），将超声波送入的静态混合器5；

油相的速率为1.0ml·min^-1；水相的速率为150ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(60+6)/1.0=66秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述过程3次至直至纳米粒粒径达到95±8nm。

10℃、12000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入甘露醇，冻干，获得产品。

实施例2

采用水溶性有机溶剂乙腈制备6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒

处方2：

ZL-00440g

聚乙二醇硬脂酸酯400g

蔗糖220g

制得纳米结晶平均粒径为180±14nm；

制备方法：

采用图1的装置，制备含有6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒：

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为100cm，内径为2.0cm，高径比为50；

超声作用腔9：直径：1.5cm；高度；10cm；高径比：6.7；

超声波功率为：100w；以上述静态混合器5上端的体积为基准，超声波功率为：5.66w·cm^-3；

内构件501采用型号为SV型，（长：80cm；内径：1.8cm）

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚乙二醇硬脂酸酯溶于有机溶剂10升乙腈中，溶解，过滤，获得油相；

将0.5千克聚乙烯醇溶解在95升水液中，为水相；

油相的速率为4.0ml·min^-1；水相的速率为350ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(100+10)/4.0=27.5秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述过程3次直至纳米粒粒径达到要求。10℃、12000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入蔗糖，冻干，获得产品。

实施例3

含采用水略溶性有机溶剂二氯甲烷制备6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒。

ZL-004150mg

聚氧乙烯氢化蓖麻油1500mg

海藻酸钠495mg

制得纳米结晶平均粒径为123±20nm；

制备方法：

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为60cm，内径为1.0cm，高径比为60，有效体积为；47.1cm^-3

超声作用腔9：直径：1.0cm；高度；6cm；高径比：6；体积：(1/2)²×3.14×10=0.785cm³

超声波功率为：200w；以超声作用腔9的体积为基准，超声波功率为：254.78w·cm^-3；

内构件501采用型号为Sk型，（长：40cm；内径：0.8cm）

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚氧乙烯氢化蓖麻油溶于22ml混合有机溶剂（二氯甲烷∶丙酮=10:1，体积比）中，溶解，过滤,获得油相;

将6克聚乙烯醇溶解在594ml水液中，为水相；

油相的速率为1.0ml·min^-1；水相的速率为150ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(60+6)/1.0=66秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述过程3次直至纳米粒粒径达到要求。10℃、12000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入海藻酸钠，冻干，获得产品。粒径分布图（数量径）见图2；粒径分布（体积径）见图3。

实施例4

含采用水略溶性有机溶剂乙酸乙酯制备6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒。

纳米结晶处方4：

制备方法：

采用图1的装置，制备含有4-N（2,4-甲氧基苯基）-6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的纳米结晶粒：

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为100cm，内径为2.0cm；

超声作用腔9：直径：1.5cm；高度；10cm；高径比：6.7；体积：(15/2)²×3.14×10=17.66cm³

超声波功率为：160w；以超声作用腔9体积为基准，超声波功率为：9.06w·cm^-3；

内构件501采用SL型（长：80cm；内径：1.8cm）。

将6-N-乙酯甲酸基-1,2-二硫杂环戊烯并吡咯酮和聚氧乙烯氢化蓖麻油溶于400ml混合有机溶剂（乙酸乙酯：丙酮=10:1）中，溶解，过滤，获得油相;

将120克聚乙烯醇溶解在11.88升水中，为水相；

油相的速率为3ml·min^-1；水相的速率为250ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(100+10)/3.0=36.67秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述过程3次直至纳米粒粒径达到要求。10℃、12000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入蔗糖冻干，获得产品。

实施例5

含采用水溶性有机溶剂四氢呋喃制备，6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的聚合物纳米粒。

聚合物纳米粒处方1：

MPEG-PLGA中，MPEG：LA：GA=10：67.5：22.5，重均分子量为50000道尔顿，纳米粒的平均粒径为97±7nm；

采用图1的装置，制备含有6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的聚合物纳米粒：

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为100cm，内径为1.25cm，高径比为80；

超声作用腔9：直径：1.25cm；高度；8cm；高径比：6.4；体积：(1.25/2)²×3.14×8=9.81cm³

超声波功率为：60w；以上述静态混合器5上端的体积为基准，超声波功率为：6.12w·cm^-3；

内构件501采用型号为Sk型（长：80cm；内径：1.10cm）

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚乙二醇硬脂酸酯溶于有机溶剂250ml四氢呋喃中，溶解，过滤，获得油相;

将0.6千克聚乙烯醇溶解在119.4升水中，获得水相；

油相的速率为4.0ml·min^-1；水相的速率为350ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(100+8)/4.0=27秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述3次至直至纳米粒粒径达到要求。10℃、12000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入甘露醇冻干，获得产品。

实施例6

含采用水溶性有机溶剂丙酮制备，6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的聚合物纳米粒。

聚合物纳米粒处方2：

MPEG-PLGA中，MPEG：LA：GA=20：40：40，重均分子量为7000道尔顿，纳米粒的平均粒径为139±23nm；

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为100cm，内径为1.25cm，高径比为80；

超声作用腔9：直径：1.25cm；高度；10cm；高径比：8；体积：(1.25/2)²×3.14×10=12.27cm³

超声波功率为：140w；以超声作用腔9体积为基准，超声波功率为：11.41w·cm^-3；

内构件501采用型号为Sk型（长：40cm；内径：0.6cm）

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚氧乙烯氢化蓖麻油溶于有机溶剂1000ml丙酮中，溶解，过滤，获得油相;

将0.6千克聚乙烯醇溶解在119.4升水中，为水相；

油相的速率为4.0ml·min^-1；水相的速率为150ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(100+10)/4.0=27.5秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述3次至直至纳米粒粒径达到要求。10℃、36000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入乳糖冻干，获得产品。

实施例7

含采用水略溶性有机溶剂二氯甲烷制备6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯的聚合物纳米粒。

聚合物纳米粒处方3：

MPEG-PLGA中，MPEG：LA：GA=10：45：45，重均分子量为24000道尔顿，纳米粒的平均粒径为157±23nm；

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为60cm，内径为0.75cm，高径比为80；

超声波功率为：110w；

超声作用腔9：直径：0.75cm；高度：6cm；高径比：8；体积：(0.75/2)²×3.14×6=0.84cm³

以上述静态混合器5上端的体积为基准，超声波功率为：130.95w·cm^-3；

内构件501采用型号为Sk型（长：40cm；内径：0.65cm）

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚乙二醇硬脂酸酯溶于22ml混合有机溶剂（二氯甲烷：N,N-二甲基吡咯烷酮=10:1）中，溶解，过滤，获得油相；

将6克聚乙烯醇溶解在594ml水液中为水相；

油相的速率为1.5ml·min^-1；水相的速率为150ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(60+6)/1.5=44秒；

在超声波和静态混合器5中内构件的共同作用下，油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器5底部的出口流出，进入出液接受杯7，在搅拌器的搅拌下，将出液接受杯7中的纳米级乳液送回水相储器1，循环往复上述过程3次直至纳米粒粒径达到要求。10℃、45000rpm离心分离，收集离心获得的固体，用双蒸水重新悬浮，反复三次，加入海藻酸钠，冻干，获得产品。

实施例8

MPEG-PLGA中，MPEG：LA：GA=10：45：45，重均分子量为12000道尔顿，纳米粒的平均粒径为139±23nm；

设备的结构特征：

静态混合器5：高度为100cm，内径为2.0cm，高径比为50；

超声作用腔9：直径：1.5cm；高度；10cm；高径比：6.7；体积：(1.5/2)²×3.14×10=17.66cm³

超声波功率为：132w，以上述静态混合器5上端的体积为基准，超声波功率为：7.47w·cm^-3；

内构件501采用型号为Sk型（长：40cm；内径：0.6cm）

将6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯和聚氧乙烯氢化蓖麻油溶于88ml混合有机溶剂（二氯甲烷：苯甲醇=10:1）中，溶解，有机膜过滤，获得油相；

将24克聚乙烯醇溶解在2.4升水中，为水相；

油相的速率为2ml·min^-1；水相的速率为200ml·min^-1；

油相停留时间：T=(S1+S2)/υ=(100+10)/2.0=55秒；

实施例9

体外释放试验：

纳米粒缓释的测定方法：

精密称取6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯原料药、zl-004纳米结晶及MPEG-PLGA纳米粒冻干粉，置透析袋中，并加入生理等渗磷酸盐缓冲液(pH6.8)(PBS的配制方法取磷酸二氢钾27.2g、叠氮化钠0.2g、十二烷基硫酸钠1g、氯化钠4.32g，氢氧化钠0.944g，加水溶解成1000mL，摇匀)形成胶体液，使ZL-004为1mg·mL^-1，取其中1.5mL置于透析袋中，排气后，扎紧端口，放于40ml磷酸盐缓冲液的具塞锥形瓶中。

将锥形瓶置于37℃恒温水浴震荡箱中，定时取样，每次取样后补同体积新鲜释放介质，样品采用HPLC-UV测定ZL-004的浓度，计算ZL-004纳米粒的释放量和释放速率。

试验结果见图4，由图4可见，ZL-004纳米粒在生理条件下释放慢，符合其体内长循环、达靶部位的缓慢释药的特性。

实施例10

6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯体内药动学研究：

取6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯（zl-004）原料药、实施例5的zl-004冻干粉、实施例2的ZL-004纳米结晶、实施例6的ZL-004聚合物纳米粒适量，用生理盐水复溶，使浓度为3mg·mL^-1（按ZL-004计算）。

SD大鼠15只，随机分为5组，按3mg·kg^-1的剂量分别给予第一组灌胃原料药、第二组灌胃ZL-004纳米结晶、第三组灌胃ZL-004纳米粒、第四组给予尾静脉注射ZL-004纳米结晶、第五组尾静脉注射ZL-004聚合物纳米粒。分别于给药前、后0.25、0.5、0.75、1、2、4、6、8、12、16、24、36、48小时眼静脉丛取血，于抗凝管中，离心取血浆立即-20℃保存，经提取后经UPLC-MS/MS测定。

结果：实施例5ZL-004的体内分析超高压液相色谱-双重四级杆质谱图典型质谱图见图5，色谱图见图6。药动曲线见图7、8，与原料药口服相比，经制备后的纳米结晶及纳米粒口服给药，均能显著提高C_max、AUC_0→t的值，生物利用度显著提高。而静脉给药后，与ZL-004纳米结晶相比，ZL-004聚合物纳米粒能提高AUC_0→t，降低C_max，延长MRT。

本发明的纳米粒后，口服能提高ZL-004生物利用度。静脉给药后，ZL-004聚合物纳米粒能延长体内循环时间。

UPLC-MS/MS方法：色谱柱：shim-packXR-ODSⅢ（1.6um），2.0mm×50mm;

流动相：甲醇-缓冲液（5mM乙酸铵，0.1%乙酸）；流速：0.3ml；柱温:40℃；进样：10ul；

梯度：

实施例11

升高外周白细胞实验研究：

对6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯（zl-004）的纳米结晶（实施例4）及mPEG-PLGA纳米粒（实施例8）的模型小鼠升高白细胞及相关细胞作用进行考察。通过环磷酰胺造模（造模依据：为外周白细胞数量低于3.0×10⁹），以ZL-004纳米结晶（实施例2）及ZL-004mPEG-PLGA纳米粒（实施例6）、市售制剂GM-CSF、未给药模型组及生理盐水组为研究组，以外周白细胞数量及骨髓细胞、单核细胞集落培养计数为指标来评价升白效果。实验组：取45只小鼠，随机分为5组，每组分别腹腔注射环磷酰胺（120mg/kg），每天一次，连续4天。后用血液分析仪测定各组小鼠白细胞总数，按造模依据确定入选小鼠。给药：ZL-004纳米结晶及mPEG-PLGA纳米粒按3mg/kg（以ZL-004计算）尾静脉注射；GM-CSF按25ug/kg皮下注射；每天一次，连续给药7天。与第1、4、7天每组取3只，眼眶取血0.5ml，经血液分析仪测定白细胞数量，后处死取股骨髓涂片，计算骨髓细胞及单核细胞的集落数量。结果表明：通过白细胞数量、骨髓细胞与单核细胞数量的变化为指标，与市售制剂GM-CSF相比，zl-004纳米结晶组、zl-004-MPEG-PLGA纳米粒组具有显著的升高白细胞功能。具体见表1、2。

表1zl-004不同制剂静脉给药后白细胞数量的变化（实施例11）

与环磷酰胺组比较,“*”p<0.05.

表2不同制剂给药后骨髓细胞与单核细胞数量的变化（实施例11）

与环磷酰胺组比较,“*”p<0.05。

Claims

1.二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒，其特征在于，包括如下重量百分比的组分：

各个组分的百分比之和为100％；

所述的二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物为6-氨基-4-(2,4-二甲氧苯基)-4-氢[1,2]二硫杂环戊烯[4,3-b]-吡咯酮-甲酸乙酯；

所述纳米的平均直径10nm-800nm；

所述可生物降解聚合物为甲基化聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物或乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物，甲基化聚乙二醇-乙交酯-丙交酯共聚物中，单体摩尔比例的范围为50∶50-25∶75，甲基化聚乙二醇-乙交酯-丙交酯或乳酸-羟基乙酸-聚乙二醇共聚物的重均分子量均为5,000-60,000道尔顿；

所述添加剂选自聚乙二醇硬脂酸酯或聚氧乙烯氢化蓖麻油；

所述冻干支架剂选自甘露醇、蔗糖、乳糖、葡萄糖或海藻酸钠。

2.制备权利要求1所述的二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒制备方法，其特征在于，是采用如下的纳米粒制备装置实现的：

纳米粒制备装置包括水相储器(1)、油相储器(2)、超声发生仪(6)、超声作用腔(9)、机架(4)、设有内构件(501)的静态混合器(5)、循环管(10)、出液接受杯(7)、搅拌器(8)；

所述静态混合器(5)通过固定架(401)垂直的固定在所述机架(4)上；

所述水相储器(1)的出口通过水相管线相连通与所述超声作用腔(9)相连通，所述油相储器(2)的出口通过油相管线与所述超声作用腔(9)相连通，所述超声发生仪(6)的探头(601)插在所述超声作用腔(9)中；

所述超声发生仪(6)用机械方式固定于机架(4)上；

所述出液接受杯(7)设置在所述静态混合器(5)底部的出口(503)的下方；

所述循环管(10)一端插入所述的出液接受杯(7)中，另一端通过输送设备与所述的水相储器(1)相连通。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将油相储器(2)中的油相和水相储器(1)中的水相同时送入所述的超声作用腔(9)，并启动超声发生仪(6)；

所述水相为含有聚乙烯醇的水溶液；

油相和水相形成水包油的纳米级乳液，从静态混合器(5)底部的出口流出，进入出液接受杯(7)，在搅拌器(8)的搅拌下，将出液接受杯(7)中的纳米级乳液通过循环管(10)送回水相储器(1)，循环往复上述过程，直至纳米粒粒径达到要求；

(2)然后将出液接受杯(7)中的物料，在3-20℃、10000-50000rmp离心，收集固体物质，洗涤、加入冻干支架剂，冻干，获得所述的含有二硫杂环戊烯并吡咯酮化合物的纳米粒。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述有机溶剂选自四氢呋喃、丙酮、碳原子1到4的醇类、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜、二氧六环、乙腈、二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯、N,N-二甲基吡咯烷酮或苯甲醇。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述油相中，硫杂环戊烯并吡咯酮化合物、生物可降解聚合物和添加剂的总的浓度为7.0～680克/升。

6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，以有机溶剂和水的体积计，有机溶剂∶水＝1∶9.0～1∶480；

油相的速率为1.0-4.0ml·min^-1；水相的速率为150-350ml·min^-1；

以所述的有机溶剂计，油相的停留时间为20～70秒；

以所述超声作用腔9体积为基准，超声波功率为4.0-235w·cm^-3。