CN103388006B - 一种基因定点突变的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种基因定点突变的构建方法，确定大鼠目标基因组序列中可被人工改造CRISPR-Cas系统所识别的靶序列；构建能够识别并引导CAS蛋白至目标基因靶序列的引导RNA序列(guide？RNA，gRNA)；将上述gRNA序列与CAS蛋白编码核酸序列或者gRNA序列和体外表达的CAS蛋白混合物导入大鼠胚胎细胞。本发明无需构建同源重组打靶载体、无需进行ES打靶细胞筛选，突变体比例高，操作简便，可实现多位点同时敲除，能够大幅度降低实验成本和缩短实验周期。<pb pnum="1" />
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种在大鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法。
背景技术
大鼠在生理学，药理学，毒理学，营养学，行为学，免疫学以及肿瘤学领域作为动物模型已有超过150余年的历史。与小鼠类似，大鼠具有体型小，代际时间短，一胎多生，饲养成本低等优点。同时，大鼠相比小鼠有更大的体型，便于进行观察和手术操作；大鼠与人类的食谱较为接近，便于进行营养学方面的研究；大鼠对毒性物质较为敏感，适合用于药物毒理实验。目前每一种药物在上市前均需采用大鼠进行毒理学实验。由于内在遗传原因，大鼠疾病模型能更真实的再现一些人类疾病的症状。大鼠对环境有较强的探究欲以及较为复杂高级的神经活动，适合用于神经，认知和行为学研究。在PubMed收录的人类疾病的动物模型中，采用大鼠作为模型的数量占据第一位。
然而，随着1981年小鼠胚胎干细胞体外培养干性维持、以及在小鼠体外培养胚胎干细胞中进行基于同源重组的基因打靶的实现，使得对小鼠基因进行个性化定点修饰成为常规操作，科学界转而更多的采用小鼠研究同源人类基因的功能和构建人类疾病的模型。直到2008年才出现真正意义上的大鼠胚胎干细胞的分离与培养，以及进行嵌合体大鼠生殖系整合与传代的成功报道，尽管之后有人在大鼠胚胎干细胞中成功进行同源重组基因打靶，但由于其培养条件的复杂与苛刻，以及抗性筛选对干性维持的影响，在大鼠胚胎干细胞中进行基因打靶目前仍存在难度。与在小鼠中类似，在大鼠胚胎干细胞中进行基于同源重组的基因打靶必然受制于以下限制因素：1、打靶载体构建过程周期长且难度大。2、由于动物细胞内自发的同源重组发生率只有10-5-10-6，将打靶载体电转入大鼠胚胎干细胞之后，要花费大量时间和人力物力筛选发生目的同源重组的胚胎干细胞。3、ES细胞在体外培养过程中对培养条件要求苛刻，稍有不慎就会引起其不可逆的分化，而使其失去生殖系转移能力，不能在后续操作中产生突变子代。4、显微注射的ES细胞仅有一定的概率成功整合成为能够形成配子的生殖系细胞。5、要求ES细胞处于良好的生长及未分化的状态。6、如果已有现成的目的基因被靶向的ES细胞，但与欲研究的大鼠品系不同，则将需要花费大量的时间进行回交，以稀释ES细胞原有的遗传背景。
近年来发展起来的人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)技术在一定程度上解决了上述问题。ZFN是一种由靶向特定DNA序列的锌指蛋白和具有非特异性作用的FokI核酸内切酶切割结构域组成的重组蛋白。一对人工设计的，识别特定的DNA序列的ZFN与目标DNA序列(通常为相邻两段各18-24bp，间隔4-7bp)结合之后，它们的FokI核酸内切酶将形成二聚体，从而切割DNA双链，形成双链断裂(double strand break，DSB)。该损伤主要通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)以及高保真性的同源重组(homologous recombination，HR)进行修复。其中非同源末端连接通过造成目的基因的移码，可被用来对目的基因进行基因敲除。通过在受精卵阶段显微注射编码ZFN的DNA或相应mRNA，已实现对大鼠，小鼠，斑马鱼等模式生物的基因敲除。
尽管ZFN技术在基础研究和应用领域有着广阔的前景，然而根据需要构建对特定DNA序列有高度特异性和亲和力的ZFN工作量大、周期长、成功率低，已经成为阻碍该ZFN大规模应用的瓶颈。ZFN的DNA识别结构域由若干个锌指模块组成，每个锌指模块识别特定的3个连续碱基，因此相邻的3～6个锌指模块可识别DNA上连续的9～18bp个碱基。这种三连体识别模式意味着在可供靶向的DNA序列选择上灵活性更小。尽管已有数百种锌指模块，但是并没有涵盖所有可能的碱基排列组合。同时，由于相邻锌指模块间的相互作用会影响其碱基识别的特异性(context dependence)，ZFN在构建过程中要经过大量的优化才能实现对目的基因的特异性结合。除此之外，ZFN相对较低的DNA结合特异性，使得ZFN在细胞内的过表达会因脱靶效应(Off Target Effect)而造成较高的细胞毒性。
类转录激活子核酸酶(Transcription Activator-Like Effector Nuclease，TALEN)是继ZFN之后出现的另一种基因组定点编辑技术。与ZFN类似，该技术将靶向特定DNA序列的TAL effectors与FokI核酸酶组成融合蛋白。一对人工设计的，识别特定的DNA序列的TALEN与目标DNA序列(通常为相邻两段各15-20bp，间隔15-20bp)结合之后，它们的FokI核酸内切酶将形成二聚体，从而切割DNA双链，形成双链断裂(double strand break，DSB)。该损伤主要通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)以及高保真性的同源重组(homologous recombination，HR)进行修复。其中非同源末端连接通过造成目的基因的移码，可被用来对目的基因进行基因敲除。通过在受精卵阶段显微注射编码ZFN的DNA或相应mRNA，已实现对大鼠，大鼠，斑马鱼等模式生物的基因敲除。
与ZFN不同的是TALE(TAL effectors)是由12个或以上特异性识别DNA的串联“蛋白模块”及其两侧的N-末端与C-末端序列组成。TAL effectors的DNA识别模块由34个氨基酸组成，每个TAL effectors的DNA识别模块与DNA结合的特异性是由第12位和第13位氨基酸残基决定的，被称作重复可变的di-residues(RVDs)位点。RVDs与A、G、C、T四种碱基有着恒定的对应关系，即NI识别A，NG识别T，HD识别C，NN识别G。因此，欲使TAL effectors识别并结合某一特定核酸序列，只须将TAL effectors的DNA识别模块按照目标DNA序列串联克隆即可。在实际操作中一般在目标基因中选择两处相邻(间隔15～20个碱基)的靶序列(一般十几个碱基)分别进行TAL effectors识别模块的构建。
相比ZFN，TALEN的DNA识别模块与单个碱基有着明确的一一对应关系，模块的排列组合方式不影响彼此的DNA识别与结合能力，从而成功解决了常规ZFN方法不能识别任意目标DNA序列，以及识别特性经常受上下游序列影响的问题，使得在TALEN的串联DNA识别模块的构建过程中免去了ZFN构建过程中相应的复杂而昂贵的优化筛选过程，便于常规实验室自己构建靶向目基因的TALEN。
然而TALEN的构建过程中需要将20个左右的高度重复的小片段DNA组装成2kb左右的大小，其过程仍然较为费时和繁琐，且有一定的不稳定因素存在。另外由于TALEN要求靶点5’端紧邻位点，以及靶点本身3’端碱基必须为T，加上TALEN靶点本身和间隔区域(Spacer)适宜长度的要求(15-20bp)，在实际操作中理想靶点的存在频率较低，在一定程度上限制了靶向位点选择的灵活性。
最近细菌和古细菌中一种用来抵御噬菌体和质粒等外源DNA片段入侵的获得性免疫机制得到了阐释。该系统由Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)和CRISPR-associated(CAS)基因组成。CRISPR系统的免疫干扰过程主要包括3个阶段：适应、表达和干扰。在适应阶段，CRISPR系统会将来自噬菌体或质粒的DNA短片段整合到前导序列和第一段重复序列之间，每一次整合都伴随着重复序列的复制，进而形成一个新的重复-间隔序列单元。在表达阶段，CRISPR基因座会被转录成一段CRISPR RNA(crRNA)前体(pre-crRNA)，该前体在Cas蛋白和tracrRNA的存在下会在重复序列处被进一步加工成小的crRNA。成熟的crRNA与Cas蛋白形成Cas/crRNA复合体。在干扰阶段，crRNA通过其与靶序列互补的区域引导Cas/crRNA复合体寻找靶点，并在靶点位置通过Cas蛋白的核酸酶活性造成靶点位置的双链DNA断裂，从而使靶标DNA失去原有功能。其中与靶点3′端紧邻的3个碱基必须是5′-NGG-3′的形式，从而构成Cas/crRNA复合体识别靶点所需的PAM(protospacer adjacent motif)结构。
Clustered regularly interspaced short palindromic repeats(CRISPR)系统分为I，II，III型三个家族，其中II型系统仅需要Cas9蛋白即可在反式编码小RNA(trans-encodedsmall RNA，tracrRNA)的协助下将pre-crRNA加工成与tracrRNA结合的成熟crRNA。因而获得了科研工作者较多的关注，并得到了最充分的研究。人们发现通过人工构建模拟crRNA：tracrRNA复合体的单链嵌合体引导RNA(guide RNA)，即可有效的介导Cas9蛋白对靶点的识别和切割，从而为在目标物种中利用CRISPR系统对目标DNA进行修饰提供了广阔的前景。
发明内容
本发明提供了一种基因定点突变的构建方法，包括以下步骤：
(1)在大鼠目标基因组序列中确定CRISPR-Cas系统所靶向的靶序列；
(2)设计、构建能够识别并引导CAS蛋白至目标基因靶序列的gRNA核酸序列；
(3)将所述gRNA核酸序列与编码CAS蛋白的核酸序列或蛋白质，导入所述大鼠胚胎细胞内。
具体地，上述步骤(1)中，从NCBI获取目标DNA序列，选定靶向序列的范围区间；在此区间按“GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG”(前20个碱基用来和靶点DNA的非编码链互补配对)查找非模板链中的符合靶向条件的序列；也可在候选靶向区域的反向互补序列中查找“CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCC”来寻找潜在靶点。
上述步骤(2)中，所述gRNA核酸序列能够和所述CAS蛋白特异性结合并将其靶向目标序列。即，引导RNA体外转录模板从5’到3’端依次由T7启动子序列，靶点特异性序列，以及gRNA骨架部分。根据目标靶点序列信息设计相应的引导RNA。
上述步骤(3)中，将所述gRNA核酸序列与所述编码的CAS蛋白核酸序列在体外分别转录为RNA并纯化，或，将所述gRNA核酸序列在体外转录为RNA后与体外表达的CAS蛋白混合。即，将gRNA和CAS蛋白编码核酸序列在体外转录为RNA，两者按一定比例混合后进行显微注射；或者，将gRNA转录为RNA，与体外表达并纯化后的CAS蛋白按一定比例混合，然后用于显微注射。
本发明中，所述CRISPR-Cas系统是指适合被人工改造的CRISPR-Cas系统、源于古细菌II型(CRISPR)-CRISPR-associated protein(Cas)系统的核酸酶体系，与ZFN和TALEN相比，该体系更简单、操作更方便。
本发明中，所述大鼠目标基因组序列包括编码基因的基因组序列、低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列、基因间的转录活跃序列或非转录序列。
本发明中，所述大鼠胚胎细胞包括大鼠单细胞受精卵或多细胞大鼠胚胎。例如，体外培养的大鼠单细胞受精卵、或体外培养的多细胞大鼠胚胎。
本发明中，所述步骤(3)是将所述引导RNA通过显微注射导入大鼠胚胎细胞。所述引导RNA可以通过人工合成，体外转录含有靶点序列的质粒或者PCR产物等方法获得。
本发明中，所述步骤(3)中，切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过非同源末端连接修复或通过同源重组修复。
本发明中，所述目标基因突变包括碱基插入、缺失、改变、移码突变或敲除。
本发明克服现有技术在构建基因敲除大鼠技术中存在的周期长，工作量大，难度高，效率低等不足，同时免去了构建以及优化筛选ZFN和TALEN串联碱基识别模块组合的过程，并且本发明可供靶向序列相对于ZFN或者TALEN有着更高的出现频率，从而为精确的基因组编辑提供了更多选择。本发明基因定点突变的快速高效的构建方法，通过在大鼠受精卵显微注射体外转录的引导RNA(guide RNA)核酸序列与CAS蛋白编码核酸序列，实现快速构建基因敲除大鼠。本发明方法利用RNA引导的核酸酶进行快速基因编辑，快速靶向并改变大鼠基因组DNA大鼠，实现快速高效的基因定点突变。本发明无需构建同源重组打靶载体、无需进行ES打靶细胞筛选，突变体比例高，操作简便，可实现多位点同时敲除，能够大幅度降低实验成本和缩短实验周期。
本发明中，大鼠胚胎细胞是指体外培养的大鼠胚胎细胞。本发明获得的大鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，CAS蛋白在gRNA的引导下靶向并切割目标基因组，切割后的基因组在非同源重组修复机制下进行修复，在此过程中可引入突变，从而筛选目标基因突变的大鼠。本发明获得的大鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达引导RNA与CAS蛋白并切割目标基因组，从而筛选目标基因突变的大鼠。与传统方法相比，本发明方法省略了体外进行ES细胞筛选的过程，整个操作过程只需直接将核酸导入胚胎中，不需要将ES细胞引入胚胎，避免了因ES细胞在体外培养时因培养条件不符合要求时导致的不可逆分化。与ZFN和TALEN相比，本发明免去了构建以及优化筛选ZFN和TALEN串联碱基识别模块组合的过程，并且本发明可供靶向序列相对于ZFN或者TALEN有着更高的出现频率，从而为精确的基因组编辑提供了更多的选择。利用本发明获得的大鼠胚胎细胞进一步得到的基因突变大鼠可用于生命科学领域基础研究和新药研发的临床前研究等。
其中，所述目标基因突变的大鼠是指通过选取目标基因发生突变的大鼠与野生型大鼠杂交，再选取上述杂交所得的同窝杂合子大鼠进行自交，然后从上述所得新生大鼠中筛选目标基因突变的纯合子大鼠。
本发明还提供一种按本发明基因定点突变的构建方法制备获得的大鼠胚胎细胞。
本发明还提供一种纯合子大鼠，是含有本发明基因定点突变的构建方法制备获得的大鼠胚胎细胞。即，将按本发明方法制备获得的大鼠胚胎细胞用于体外培养或直接植入母鼠，表达TALEN并切割目标基因组，筛选获得目标基因突变的大鼠；再将其与野生型大鼠杂交，再选取上述杂交所得的同窝杂合子大鼠进行自交，然后从上述所得新生大鼠中筛选目标基因突变的纯合子大鼠。
本发明采用RNA引导的核酸内切酶(RNA-guided endonucleases，RGENs)实现对目标基因序列的特异性切割。RGENs由嵌合型的引导RNA和Cas9蛋白组成，其中前者是将天然存在的II型CRISPR-Cas系统中的CRISPR RNAs(crRNAs)与trans-activating crRNA(tracrRNA)融合成一条单链引导RNA(gRNA)，从而与Cas9蛋白结合并引导后者对靶点DNA序列进行特异性的切割。切割将形成双链断裂(double strand break，DSB)，该损伤通过易错性的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)进行修复后，将有2/3的概率造成目的基因的移码，从而实现对目的基因的敲除。本发明中，例如，在大鼠胚胎中实施基因敲除方法，包括步骤如下：
(1)在目标大鼠基因N端编码序列中寻找合适的靶序列。
(2)按照上述靶序列通过重叠引物PCR的方法获得体外转录gRNA所需模板DNA。
(3)将上述模板DNA体外转录成RNA，并进行纯化。
(4)同时将编码Cas9蛋白的质粒线性化并进行体外转录。
(5)将上述两种RNA混合并显微注射入人工受精形成的大鼠受精卵。
进一步地，在本发明上述步骤之后，将上述受精卵植入假孕母鼠输卵管内；提取上述步骤所得子代大鼠的基因组DNA进行基因型鉴定；将目标基因发生移码突变的大鼠分别与野生型大鼠杂交；将上述杂交所得同窝的杂合子大鼠进行自交；鉴定上述自交所得大鼠的基因型，筛选目标基因移码突变的纯合子大鼠。
本发明的优点包括：在ZFN或TALEN介导的基因敲除技术中需要重复的酶切连接等方法构建长达几百或者上千碱基的表达质粒，与之相对本发明的gRNA载体构建过程极为简遍，可直接合成两条20-bp左右的含有靶点的互补寡核苷酸，退火后连入gRNA表达质粒。在可供靶向序列的选择上，ZFN一般需要从多个候选靶点出发进行优化筛选，TALEN的靶点选择也受到左右靶点0位必须都是碱基T，以及靶点最后一位是碱基T的限制。而CRISPR靶点选择的限制仅来自于与靶点3′端紧邻的3个碱基必须是5′-NGG-3′的形式，从而构成被Cas9本身识别的PAM(protospacer adjacent motif)结构。从而为在基因组上进行更为精确和灵活的编辑提供了可能。经过对显微注射所用RNA浓度的优化，本发明所得到的F0代大鼠的突变率可达到78％，显著高于采用ZFN或TALEN所能达到的突变率。通过一次注射一种以上的gRNA，本发明可实现一次对大鼠受精卵内的多个基因进行同时编辑。通过一次注射靶向两个相邻靶点的gRNA，本发明可实现对较大片段的基因组DNA进行删除。与传统的在大鼠胚胎干细胞内通过同源重组对目标基因进行敲除或改变相比，本发明避免周期长且难度大的打靶载体构建过程。其次，本发明中通过显微注射体外转录的引导RNA核酸序列与CAS蛋白编码核酸序列所得子代大鼠，如实施例所述，其中一条等位基因发生碱基缺失的概率高达86％。而现有技术及文献表明，通过大鼠胚胎干细胞内同源重组及后继筛选，发生定点敲除的概率不超过15-65％。筛选出的ES细胞还需经过胚胎显微注射而产生嵌合体大鼠。嵌合体大鼠如果发生生殖系转移(germline transmission)才有可能得到特定基因敲除的杂合子大鼠。而由于ES细胞在筛选过程中培养条件的变化而发生不可逆的分化，很可能突变的ES细胞分化的子代细胞不能进入生殖系而得不到敲除大鼠。本发明通过注射单细胞期的胚胎，不存在ES细胞分化的问题，因此通过重复实验是一般能够得到基因敲除的大鼠品系。本发明通过所实现的高突变效率，在节省实验时间以及人力物力的投入方面有很大的意义。而且，这种高突变效率也将有助于该技术在产卵较少、生长周期较长且单个动物经济价值高的大型动物中的应用。再次，本发明直接向人工受精的大鼠受精卵中显微注射体外转录的引导RNA核酸序列与CAS蛋白mRNA，避免了周期长、劳动量大、筛选发生目的同源重组大鼠胚胎干细胞的过程。另外，本发明中构建gRNA质粒并进行体外转录的环节只需要不到1周时间，从显微注射到鉴定出目标基因发生移码的杂合子大鼠只需要1个月左右，而传统的通过在大鼠胚胎干细胞内进行同源重组构建基因敲除大鼠的周期通常需要至少一年的时间。本发明方法极大缩短了实验周期，有利于研究的高效推进。
本发明通过在大鼠胚胎中进行靶向任意基因组DNA并使其发生改变从而快速构建基因敲除大鼠方法，通过向大鼠受精卵中直接引入识别并切割目标基因的显微注射体外转录的引导RNA核酸序列与CAS蛋白编码核酸序列，通过DNA双链断裂(double strand break，DSB)以及由此引起的非同源末端连接(Non-homologous end joining，NHEJ)修复来造成目标基因的移码，从而在大鼠胚胎细胞中实现快速高效的基因定点突变。利用本发明，进一步获得目标基因敲除的F0代杂合子或纯合子大鼠。本发明克服了通过向大鼠受精卵注射人工锌指核酸酶(Zinc Finger Nucleases，ZFN)不能识别任意目标DNA序列，且识别特性经常受上下游序列影响的问题，以及由此带来的ZFN构建过程中复杂而昂贵的优化筛选过程。克服了TALEN所模块组装过程中较为繁琐的拼接过程，以及TALEN靶点选择上灵活性有限的问题。与传统的通过在大鼠胚胎干细胞内用同源重组打靶载体对目标基因进行敲除相比，本发明具有无需构建同源重组打靶载体、无需进行ES打靶细胞筛选，突变体比例高，操作简便，实验成本和周期大大减少等优点。
附图说明
图1为CRISPR/Cas系统作用原理示意图。
图2为Cas9mRNA与引导RNA表达载体示意图。
图3为显微注射Cas9mRNA/MC4R-gRNA大鼠所得新生大鼠对应PCR产物T7E1酶切电泳图。
图4为显微注射Cas9mRNA/MC4R-gRNA所得新生大鼠碱基缺失情况示意图。
图5为12号首建大鼠所生F1代大鼠碱基缺失情况示意图。
图6为CAS核酸酶原核表达载体示意图。
图7为显微注射Cas9蛋白/MC4R-gRNA以及Cas9蛋白/MC3R-gRNA所得新生大鼠碱基缺失情况示意图。
具体实施方式
结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本实用新型中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。如按照Sambrook等人，分子克隆，实验室手册(New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)所记载人，或按照厂商的建议条件。
本发明在大鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，是一种进行靶向任意基因组DNA并使其发生改变的方法，该方法包括：向大鼠细胞中引入识别目标基因的guideRNA的编码核酸以及CRISPR/Cas9蛋白及的编码核酸、蛋白或人工修饰的病毒等生物活性物质，从而对目标基因组DNA序列进行识别和切割。然后，将细胞进行体外培养或者直接将其转入适宜的母鼠输卵管或者子宫中，使类转录激活子核酸酶表达并使得在切割位点附近的目标基因组DNA发生双联断裂，接着对该DNA断裂位点进行修复。
其中，修复方式包括：(a)非同源末端连接修复。非同源末端连接修复导致基因突变(碱基插入、缺失)被引入到目的基因组序列中。(b)同源重组修复。同源重组修复使供体外源DNA序列引入到目标基因组DNA序列中，导致内源目标基因序列的改变。
本发明在大鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建方法，包括如下步骤：
(1)构建NLS-hCas9-NLS体外转录载体
在载体上，通过与NLS-hCas9-NLS编码序列起始密码子重叠的NcoI限制性内切酶位点，引入SP6启动子及Kozak序列；合成单链寡核苷酸P1和P2；用PNK磷酸酶对上述单链寡核苷酸添加5’磷酸基团，并将其退火后与NcoI单酶切处理并去磷酸化的载体进行连接；选取SP6启动子插入方向正确的SP6-Cas9质粒；
其中，P1引物序列：CATGGATTTAGGTGACACTATAGAAGAGGCCGCCAC；
P2引物序列：CATGGTGGCGGCCTCTTCTATAGTGTCACCTAAATC；
(2)制备Cas9核酸酶mRNA
选取插入方向正确的SP6-Cas9质粒，用Cas9编码区下游的NotI内切酶进行线性化；用SP6mMESSAGEmMACHINE Kit试剂盒进行体外转录；
(3)确定Cas9靶位点
确定“GGCTGCTGCGGTTCCAGAGG”作为靶向序列；
(4)制备引导RNA体外转录模板
合成单链寡核苷酸P3，P4，P5，P6进行引物重叠PCR；
其中，
P3引物序列：GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTGCTGCGGTTCCAGAGGGTTTTAGAGCTAGAAAT；
P4引物序列：AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC；
P5引物序列：GATCACTAATACGACTCAC；
P6引物序列：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC；
(5)以上述PCR产物为模板，进行体外转录，并与制备好的Cas9核酸酶mRNA混合；
将体外转录所得引导RNA以及Cas9mRNA混合，用TE稀释，使引导RNA终浓度为25ng/μl，Cas9mRNA终浓度为50ng/μl，注射入体外受精大鼠受精卵的原核部分，体外培养1-2小时。
本发明在大鼠胚胎细胞中基因定位突变的构建方法，包括基因突变或基因敲除，其步骤包括：
(1)在目标大鼠基因N端编码序列中寻找合适的靶序列。
(2)按照上述靶序列合成互补的两条单链寡核苷酸，退火连入gRNA表达载体。
(3)将上述表达载体线性化，体外转录成RNA，并进行纯化。
(4)同时将编码Cas9蛋白的质粒线性化并进行体外转录。
(5)将上述两种RNA混合并显微注射入人工受精形成的大鼠受精卵。
进一步地，将上述受精卵植入假孕母鼠输卵管内；提取上述步骤所得子代大鼠的基因组DNA进行基因型鉴定；将目标基因发生移码突变的大鼠分别与野生型大鼠杂交；将上述杂交所得同窝的杂合子大鼠进行自交；鉴定上述自交所得大鼠的基因型，筛选目标基因移码突变的纯合子大鼠。
本发明中，大鼠细胞是大鼠胚胎细胞。大鼠胚胎包括大鼠单细胞受精卵或多细胞大鼠胚胎。大鼠目标基因组序列为编码基因的基因组序列、低度重复序列、中度重复序列、高度重复序列、低拷贝序列、基因问的转录活跃序列或非转录序列。
实施例1通过在大鼠细胞中注射RNA构建Mc4r基因敲除大鼠
1、NLS-hCas9-NLS体外转录载体的构建
如图2所示，Cas9蛋白表达模块从5’端至3’端依次由SP6启动子序列，N端核定位信号(Nuclear localization sequence，NLS)，人源化的Cas9编码DNA序列，C端核定位信号，多聚腺苷酸(polyA)构成。具体构建策略为，在载体pX260(Addgene质粒#42229)的基础上，通过与NLS-hCas9-NLS编码序列起始密码子重叠的NcoI限制性内切酶位点，引入SP6启动子及Kozak序列。即合成单链寡核苷酸P1(SEQ ID NO.1)和P2(SEQ ID NO.2)，使用PNK磷酸酶对上述单链寡核苷酸添加5’磷酸基团，并将其退火后与NcoI单酶切处理并去磷酸化的pX260载体进行连接。挑取若干克隆，测序选取SP6启动子插入方向正确的质粒。
P1引物序列：CATGGATTTAGGTGACACTATAGAAGAGGCCGCCAC(SEQ ID NO.1)
P2引物序列：CATGGTGGCGGCCTCTTCTATAGTGTCACCTAAATC(SEQ ID NO.2)
2、Cas9核酸酶mRNA的制备
选取插入方向正确的SP6-Cas9质粒，使用Cas9编码区下游的NotI内切酶进行线性化。通过酚氯仿抽提回收线性化的SP6-Cas9片段，使用SP6mMESSAGEmMACHINE Kit试剂盒进行体外转录。将体外转录所得mRNA用试剂盒所提供的LiCl溶液进行沉淀，使用显微注射用TE重悬。
3、Cas9靶位点的预测
从NCBI获取目标DNA序列，在本实施例中为大鼠Mc4r的第一个外显子的CDS区域，将目标序列复制粘贴入Word文档，使用“查找”功能(Ctrl+F)，在查找内容文本框中输入“GG？？？？？？？？？？？？？？？？？？？GG”(前20个碱基用来和靶点DNA的非编码链互补配对)用来查找非模板链中的符合靶向条件的序列。上述碱基构成是由于T7启动子所转录的产物必须以“GG”起始才能被高效的转录。同时II型CRISPR系统则要求靶点3’端紧邻的原间隔序列相邻基序(proto-spacer-adjacent motifs，PAM)符合“NGG”的构成。根据同样的道理，也可在候选靶向区域的反向互补序列中查找“CC？？？？？？？？？？？？？？？？？？？CC”来寻找潜在靶点。最终选定“GGCTGCTGCGGTTCCAGAGG”作为靶向序列。
4、引导RNA体外转录模板的制备
如图2所示，引导RNA体外转录模板从5’到3’端依次由T7启动子序列，靶点特异性序列，以及引导RNA骨架部分。确定目标靶点之后，合成单链寡核苷酸P3(SEQ ID NO.3)，P4(SEQ ID NO.4)，其中单链寡核苷酸P3从5’到3’端依次含有T7启动子序列，靶点特异性序列，以及引导RNA骨架5’端部分碱基。单链寡核苷酸P4编码引导RNA骨架部分，其3’端与单链寡核苷酸P3的3’端互补。合成单链寡核苷酸P5，P6，分别与单链寡核苷酸P3，P4的5’端碱基序列相同。使用单链寡核苷酸P3，P4，P5，P6进行引物重叠PCR。通过酚氯仿抽提和异丙醇沉淀纯化PCR产物，用RNase Free ddH2O进行重悬，测量浓度。
P3引物序列(SEQ ID NO.3)：GATCACTAATACGACTCACTATAGGCTGCTGCGGTTCCAGAGGGTTTTAGAGCTAGAAAT
P4引物序列(SEQ ID NO.4)：AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAAC
P5引物序列：GATCACTAATACGACTCAC
P6引物序列：AAAAAAGCACCGACTCGGTGCC
5、Cas9核酸酶mRNA的制备
以上述PCR产物为模板，按照in vitro Transcription T7Kit(Takara#6140)试剂盒说明进行体外转录。酚氯仿抽提和异丙醇沉淀纯化转录产物，使用显微注射用TE重悬。
6、引导RNA以及Cas9mRNA的显微注射
将体外转录所得引导RNA以及Cas9mRNA混合并使用显微注射用TE稀释，使引导RNA终浓度为25ng/μl，Cas9mRNA终浓度为50ng/μl。使用显微注射仪器将上述mRNA溶液注射入体外受精大鼠受精卵的原核部分，构建形成特定的大鼠胚胎细胞(受精卵)，即完成本发明在大鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建。
以下用以鉴定是否成功实现本发明在大鼠胚胎细胞中基因定点突变构建方法。
(1)新生大鼠的基因型鉴定
将步骤6得到的大鼠胚胎细胞(受精卵)体外培养1-2小时后，将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管。新生大鼠出生1周后，剪取脚趾，抽提基因组DNA。在靶点上游设计PCR引物P7(SEQ ID NO.7)，下游设计PCR引物P8(SEQ ID NO.8)，以待鉴定大鼠基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR反应结束后对产物进行纯化，变性，缓慢退火，加入可识别并在非匹配的位点进行切割的T7Endonuclease I，进行琼脂凝胶电泳。图3为显微注射所得新生大鼠所对应PCR产物T7E1酶切电泳图。如图3所示，15只新生大鼠中共有13只在靶点位置带有突变。其中，
P7引物序列：TACTGTTTAGCAGGGTGATGACG(SEQ ID NO.7)
P8引物序列：GAAGAGACCAACAACTCCTTTGC(SEQ ID NO.8)
将第T7E1检测阳性大鼠PCR产物分别连入pMD18T载体，分别挑取若干克隆提取质粒并进行测序。图4为首建大鼠碱基缺失情况比对结果图。如图4所示，其中下划线部分为原间隔(protospacer)即靶点所在区域，后面的TGG为原间隔序列相邻基序(proto-spacer-adjacent motifs，PAM)。每段短线代表一个缺失的碱基。
(2)首建大鼠Mc4r基因突变的生殖系遗传
选取12号Mc4r基因突变首建大鼠，与野生型大鼠杂交，用上述方法鉴定新生大鼠的基因型。图5为12号首建大鼠所生F1代大鼠碱基缺失情况示意图。如图5所示，6只新生F1代大鼠中有3只小鼠携带突变。其中下划线部分为原间隔(protospacer)即靶点所在区域，后面TGG为原间隔序列相邻基序(proto-spacer-adjacent motifs，PAM)。每段短线代表一个缺失的碱基。证明Mc4r基因突变能稳定遗传。
实施例2通过在大鼠细胞中注射CAS蛋白和gRNA构建Mc3r/Mc4r基因敲除大鼠
1、CAS核酸酶原核表达载体PET-28a-H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS的构建
如图6所示，Cas9融合蛋白原核表达载体从5’端至3’端依次由T7启动子序列，His6Tag，3×Flag，N端核定位信号(Nuclear localization sequence，NLS1)，人源化的Cas9编码DNA序列，C端核定位信号NLS2构成。首先，在NLS-hCas9-NLS体外转录载体的基础上通过重叠PCR的方法引入His6和3×FLAG标签以及新的N端NcoI限制性酶切位点和C末端EcoRI限制性酶切位点。通过PET-28a上的NcoI和EcoRI酶切位点将新的H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS连接插入其中并通过NcoI酶切位点中内含的起始密码子作为蛋白表达的翻译起始位点。
P9引物序列：CCATGGACTATAAGGACCACGACGGAGACTACAAGGATCATGATATTGATTACAAAGAC
P10引物序列：GATATTGATTACAAAGACGATGACGATAAGATGGCCCCAAAGAAGAAGCGGAAGGTCGG
P11引物序列：GAAGAAGCGGAAGGTCGGTATCCACGGAGTCCCAGCAGCCGACAAGAAGTACAGCATCG
P12引物序列：GGCAAAAAAGAAAAAGTAAGAATTCCTA
2、Cas9核酸酶的表达纯化
构建并鉴定好的PET-28a-H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS质粒转染Rosseta DE3宿主感受态细胞。24℃活化细胞至OD值为0.8～1.0后加入IPTG诱导，使IPTG终浓度为0.1mM，16℃诱导17个小时。超声破碎细胞后收集上清液并用镍柱纯化、备用。
3、Cas9靶位点的预测
同实施例1，最终选定“GGCTGCTGCGGTTCCAGAGG”作为Mc4r的靶向序列，选定“GGGCTGCAGGGTGCTGGGAG”作为Mc4r的靶向序列。
4、引导RNA体外转录模板的制备
同实施例1。
5、引导RNA以及Cas9蛋白的显微注射
将体外转录所得引导RNA以及原核表达的Cas9蛋白混合并使用显微注射用TE稀释，使引导RNA终浓度为12.5ng/μl，Cas9蛋白终浓度为5ng/μl。使用显微注射仪器将上述mRNA溶液注射入体外受精大鼠受精卵的原核部分，构建形成特定的大鼠胚胎细胞(受精卵)，即完成本发明在大鼠胚胎细胞中基因定点突变的构建。
以下用以鉴定是否成功实现本发明在大鼠胚胎细胞中基因定点突变构建方法。
(1)新生大鼠的基因型鉴定
同实施例1。将步骤6得到的大鼠胚胎细胞(受精卵)体外培养1-2小时后，将存活的受精卵移植入假孕母鼠的输卵管。5只新生大鼠中共有3只在靶点位置带有突变，其中2只发生双基因同时突变。
其中Mc4r鉴定用PCR引物为：P7引物序列：TACTGTTTAGCAGGGTGATGACG
P8引物序列：GAAGAGACCAACAACTCCTTTGC
Mc3r鉴定用PCR引物为：P13引物序列AATCTAGACTGGACAGCATCCAC
P14引物序列TGATAACCACGATCATGATGGTC
将第T7E1检测阳性大鼠PCR产物分别连入pMD18T载体，分别挑取若干克隆提取质粒并进行测序。图7为首建大鼠碱基缺失情况比对结果图。如图7所示，其中下划线部分为原间隔(protospacer)即靶点所在区域，后面的TGG为原间隔序列相邻基序(proto-spacer-adjacent motifs，PAM)。每段短线代表一个缺失的碱基。
Claims (6)
1.一种对大鼠胚胎细胞中进行基因定点突变的构建方法，其特征在于，包括：
(1)在大鼠目标基因组序列中确定CRISPR-Cas系统所靶向的靶序列；
(2)设计、构建能够识别并引导CAS9重组蛋白至目标基因靶序列的gRNA核酸序列；
(3)将所述gRNA核酸序列与CAS9重组蛋白质混合后，通过显微注射导入所述大鼠胚胎细胞核内；其中，
所述步骤(1)中，在候选靶向区域中按“GGNNNNNNNNNNNNNNNNNNNGG”查找非模板链中的靶序列；或在候选靶向区域的反向互补序列中按“CCNNNNNNNNNNNNNNNNNNNCC”查找靶序列；
所述步骤(2)中，所述gRNA核酸序列能够和所述CAS蛋白特异性结合并将其靶向目标序列；
所述步骤(3)中，预先将所述gRNA核酸序列在体外转录为RNA并纯化。
2.如权利要求1的方法，其中通过CAS核酸酶原核表达载体PET-28a-H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS来制备所述的CAS9重组蛋白质，其中所述H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS是从5’端至3’端依次由T7启动子序列、His6Tag、3×Flag、N端核定位信号NLS1、人源化的Cas9编码DNA序列、C端核定位信号NLS2构成，并通过PET-28a上的NcoI和EcoRI酶切位点将该H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS连接插入其中并通过NcoI酶切位点中内含的起始密码子作为蛋白表达的翻译起始位点，从而得到所述CAS核酸酶原核表达载体PET-28a-H6-3FLAG-NLS-CAS9-NLS。
3.如权利要求1的方法，其中所述定点突变的基因是Mc3r或Mc4r基因。
4.如权利要求1-3之任一项所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，切割目标基因组所形成的DNA断裂位点通过易错性非同源末端连接修复或通过同源重组修复。
5.如权利要求1-3之任一项所述的方法，其特征在于，所述目标基因的突变为碱基插入、缺失、改变、移码突变或敲除。
6.如权利要求1-3之任一项所述的方法，其特征在于，所述大鼠胚胎细胞为大鼠单细胞受精卵或多细胞大鼠胚胎。
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