CN104342457A

CN104342457A - 一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法

Info

Publication number: CN104342457A
Application number: CN201410553171.7A
Authority: CN
Inventors: 陈勇龙; 黄华荣; 张遵义; 羊雪芹
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2014-10-17
Filing date: 2014-10-17
Publication date: 2015-02-11

Abstract

本发明公开了一种将外源基因定点整合到哺乳类动物靶标基因的方法，利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到靶标基因，特别是将Cre基因定点整合到小鼠Enpp1基因第一个外显子内，该技术不仅整合效率高(20％)；操作步骤简单，仅需构建一个外源基因载体；同时不存在位置效应影响。

Description

一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法

(一)技术领域

本发明属于基因工程领域，具体而言，主要涉及外源基因knock-in及过表达载体的构建方法以及依托CRISPR/Cas9技术可将该载体上的外源基因及过表达的目的基因整合到基因组特定位点。

(二)背景技术

近年来，我国医药行业发展很迅速，但是同时也存在着很多问题，例如研发基础薄弱、仿制国外专利泛滥、缺少自主知识产权等等，这些都严重制约着我国的医药行业发展。因此，增强我国的药品研发能力刻不容缓。药物研发过程就是疾病致病机理和药物靶标筛选的过程，筛选的过程大都借助于各类人类疾病的动物疾病模型，特别是与人亲缘关系较近的各类动物模型来分析疾病的发病机制和新型药物的研发。而转基因技术在构建动物模型方面是个很好的工具，可以将目的基因插入到基因组内，在体内正常发挥功能，这为研究疾病的分子机理提供了极其有用的工具。

传统的转基因研究中，将外源基因片段显微注射到受精卵，通过随机插入方式将外源基因整合到机体基因组上；但是随机插入方式会受到位置效应的影响以及载体自身大小限制，不能包含完整的调控原件往往使外源基因的表达水平较低，甚至不表达或异位表达。同时，由于外源基因的多拷贝随机插入到宿主基因组中，这种方式对宿主来说存在一定风险。这些弊端限制了转基因技术的发展。因此，需要一种能使外源基因高效表达，同时具有较高的安全性和可靠性的转基因技术。

为了高效的整合外源基因以及在宿主内正常表达，克服转入基因受到位置效应的影响，研究者们在载体上加入核基质附着元件、位点控制元件、绝缘子等元件以减弱位置效应的影响，但是由于基因表达调控的复杂性，位置效应仍存在影响；同时，外源基因在宿主基因组内仍是以随机方式整合，降低了转基因的安全性及可靠性，这些弊端仍是传统转基因研究急需解决的问题。基因打靶技术的出现克服了传统转基因的弊端，大大提高了转基因的可控性，该技术利用外源基因与基因组序列间的同源性进行同源重组来实现外源基因整合到宿主基因组内的一门技术，具有特异性强、可稳定遗传以及外源基因不受位置效应影响等优点。但是基因重组打靶技术面临重组效率低，构建步骤复杂，同时伴随不正常重组等缺点。因此，急需一种快速、高效、简单整合外源基因的方法。

目前，CRISPR/Cas9系统在基因组编辑方面有着很大的优势，不仅可以定点删除目的基因还可以定点整合目的基因。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种高效定点整合外源基因的方法，以提高外源基因在宿主内正常表达，同时具有安全可靠性，本发明利用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到靶标基因，特别是将Cre基因定点整合到小鼠Enpp1基因第一个外显子内，该技术不仅整合效率高(20％)；操作步骤简单，仅需构建一个外源基因载体；同时不存在位置效应影响。利用该技术进行转基因具有独特的优势具有高可控性和安全性，降低了转基因生物的风险。

本发明采用的技术方案是：

一种将外源基因定点整合到哺乳类动物靶标基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将外源基因扩增后连接至外源基因重组表达载体上，构建重组外源基因载体；(2)将靶标基因跟载体连接，构建重组靶标基因载体；(3)将重组外源基因载体与重组靶标基因载体分别经过AatII和SphI酶切、琼脂糖凝胶回收，获得外源基因-靶标基因片段；(4)以px330质粒(Addgene：42230)为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下进行PCR反应，将PCR反应产物与pGME-T载体连接，获得质粒pGEM-Cas9，再将质粒pGEM-Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；(5)根据靶标基因序列，人工合成含T7启动子序列的sgRNA，即片段T7-sgRNA，再将片段T7-sgRNA克隆到pGME-T载体，经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得T7-sgRNA-靶标基因mRNA；(6)将Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵(优选小鼠受精卵)，实现将外源基因定点整合到靶标基因的目的；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

进一步，所述每20μl混合液中Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段的浓度分别为50ng/μl、20ng/μl和10ng/μl。

进一步，所述外源基因为Cre基因。

进一步，所述靶标基因为小鼠Enpp1基因。

本发明还提供一种将外源基因Cre定点整合到小鼠靶标基因Enpp1的方法，所述方法为：(1)重组外源基因载体的构建：以GFP-Cre载体为模板，在引物pCre-F和引物pCre-R的作用下进行PCR反应，回收PCR扩增产物，克隆到pGME-T载体，获得重组外源基因载体pCre-Knockin，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

pCre-F:

5’-GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCCTATGTCCAATTTACTGACCGT-3’

pCre-R:5’-ATAAGAGAAGAGGGACAGCT-3’；

(2)重组靶标基因载体的构建：将小鼠Enpp1基因与载体pGEM-T连接，构建重组靶标基因载体pGEM-Enpp1，核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示；

(3)外源基因-靶标基因片段：将步骤(1)获得的重组外源基因载体pCre-Knockin和步骤(2)获得的重组靶标基因载体pGEM-Enpp1经酶切后连接，构建载体pCre-Enpp1，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；

(4)T7-sgRNA-Enpp1 mRNA：根据Enpp1的核苷酸序列，人工合成T7-sgRNA序列，序列为SEQ ID NO.6所示，将SEQ ID NO.6所示的T7-sgRNA序列克隆到pGME-T载体，获得质粒T7-sgRNA-Enpp1，将质粒进行线性化、体外转录获得T7-sgRNA-Enpp1 mRNA；

(5)以px330质粒为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下进行PCR反应，将PCR产物与pGME-T载体连接，获得质粒pGEM-Cas9，再将质粒pGEM-Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’；

(6)将T7-sgRNA-Enpp1 mRNA、Cas9 mRNA与载体pCre-Enpp1混合，然后注射小鼠受精卵，再将受精卵孵育，实现将外源基因Cre定点整合到小鼠Enpp1内的目的。

本发明提供的定点整合外源基因的方法，主要采用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到小鼠基因座上，使外源基因特异性表达。这是首次利用CRISPR/Cas9系统特异性的将外源基因Cre定点整合到小鼠Enpp1的第一个外显子内，Cre成功在小鼠体内表达。利用这种新的方法可克服传统转基因的随机整合问题，提高整合效率；同时构建步骤简单，使得转基因的生物的构建缩减至1周，也减少了昂贵的分子试剂。

根据本发明本发明所述采用CRISPR/cas9技术将外源基因定点整合到Enpp1基因的基因座上的方法，得到了一种根据上述方法构建的打靶载体，其具有如图1所示的Cre-Knock-in载体结构。可在小鼠体内高效表达cre蛋白(图10)。

本发明提供的定点整合外源基因的方法，主要采用CRISPR/Cas9系统将外源基因定点整合到小鼠、斑马鱼或猪等生物的靶标基因座上，使外源基因特异性表达。这是首次利用CRISPR/Cas9系统特异性的将外源基因定点整合到宿主基因组上，外源基因成功在宿主体内表达。利用这种新的方法可克服传统转基因的随机整合问题，提高整合效率；同时构建步骤简单，使得转基因的生物的构建缩减至1周，也减少了昂贵的分子试剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：

(1)利用CRISPR/Cas9系统的定点切割双链DNA的特性，可以使得目的基因在特定位点整合，克服了目的基因的随机整合问题以及多拷贝插入对邻近重要基因的表达影响(如插入引起的染色体不稳定、邻近基因功能失活、原癌基因的激活以及失活抑癌基因等)，提高了转基因的安全性、可控性。

(2)利用Enpp1内源性启动子指导外源基因的表达，可以实现外源基因的高效表达，同时减少了由于传统基因研究中调控元件不完整造成的异位表达，提高转基因的成功率。

(3)本发明两端同源序列仅需60bp就可实现将外源基因定点整合到宿主基因组内，因此该方法操作简单无需多步构建～5Kbp的同源臂，得到转基因体时间大大缩短。

(4)本次发明首次利用CRISPR/Cas9技术成功介导Cre基因定点插入Enpp1基因的第一个外显子，由此获得了表达Cre基因的转基因小鼠。与常规的通过同源重组技术获得克隆小鼠相比，利用CRISPR/cas9技术介导同源重组，在小鼠体内重组效率为20％，而常规的基因打靶效率仅为1％，其打靶效率提高了20倍，为定点转基因动物提供了极大的方便。

(四)附图说明

图1为定点整合外源基因的载体构建模式图。

图2为重组外源基因载体pCre-Knockin构建模式图。

图3为外源基因Cre扩增的凝胶电泳图，泳道pCre为Cre的PCR扩增产物，泳道M为Marke。

图4为靶标基因Enpp1扩增的凝胶电泳图，泳道Enpp1为靶标基因Enpp1的PCR扩增产物，泳道M为Marke。

图5为Cas9表达载体的凝胶电泳图，泳道Cas9为px330载体的PCR扩增产物，泳道M为Marke。

图6为Cas9mRNA体外转录产物的凝胶电泳图，泳道Cas9 IVT mrna为Cas9mRNA体外转录产物，泳道M为Marke。

图7为T7-sgRNA-Enpp1 mRNA体外转录产物的凝胶电泳图，泳道Cas9 IVT mrna为Cas9mRNA体外转录产物，泳道M为Marke。

图8为外源基因Cre整合到小鼠Enpp1基因组上构建的载体pCre-Enpp1的凝胶电泳图，泳道1～泳道8为8只小鼠的pCre检测电泳图，泳道M为Marke。

图9为T7-sgRNA的凝胶电泳图，泳道T7-sgRNA为T7-sgRNA的PCR扩增产物，泳道M为Marke。

图10为外源基因Cre在小鼠头面部的表达(箭头所示色彩部分)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

下述实施例中所用材料、试剂等，如无特别说明，均可从商业途径获得。

pGEM-T购自Promega公司，产品目录号A3600。LA Taq购自TAKARA，产品目录号RR02MA。

LB液体培养基组成为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，氯化钠10 g/L，溶剂为水，pH值7.4。

LB平板组成为：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L，氯化钠10 g/L，琼脂15 g/L，溶剂为水，pH值7.4。

实施例1

1、重组外源基因Cre载体的构建及制备，命名为：pCre-Knockin，序列如SEQ ID NO.1所示。

(1)pCre-Knockin重组表达载体构建模式图，如图2，ApaI、AatII、SphI、NcoI、SacII均为连接目的基因所设计的多克隆位点。

(2)设计引物

根据GFP-Cre载体序列设计一对引物，在正向引物前加入T2A序列(下划线部分)。

pCre-F(正向引物):

GAGGGCAGAGGAAGTCTTCTAACATGCGGTGACGTGGAGGAGAATCCCGGCCC TATGTCCAATTTACTGACCGT

pCre-R(反向引物):ATAAGAGAAGAGGGACAGCT

(3)重组外源基因Cre载体的制备及验证

1)重组外源基因Cre载体的获取：以GFP-Cre质粒作模板，在引物pCre-F和引物pCre-R的作用下进行PCR反应，反应结束后，对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳切胶回收，合成目的片段大小为1612bp(见图3所示)，即为重组外源基因载体pCre-Knockin。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

2)pCre基因重组T载体构建：取1μl步骤1)获得的PCR产物与pGEM-T载体在室温(25℃)放置1h进行连接，获得连接液。

连接体系为：

3)重组质粒的获取：取连接液2μl转化50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击60s，冰浴2min后加入500μl LB液体培养基，置于37℃、200rpm摇床1h，取200μl培养液涂布于含终浓度50mg/ml的X-gal+终浓度24mg/ml IPTG+终浓度100mg/ml Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜。挑取白斑，接种于5ml含Amp⁺(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜，抽取质粒，测序结果表明步骤1)获得的重组外源基因载体pCre-Knockin核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示。

2、重组靶标基因载体的构建，命名为pGEM-Enpp1，序列如SEQ ID NO.2。

(1)设计引物

根据GeneBank：NC_000076.6序列设计引物，并在引物Enpp1-F前加上酶切位点AatII(下划线部分)，在引物Enpp1-R前加上酶切位点SphI(下划线部分)。

Enpp1-F：5’-GACGTCCACGGGTCAGCGGGAAACGGTC-3’

Enpp1-R：5’-GCATGCCAGCGACAGCACTTTGTAGGTGT-3’

(2)PCR扩增

以小鼠胚胎干细胞DNA(酚氯仿抽提)为模板，在引物Enpp1-F和引物Enpp1-R的作用下进行PCR反应，对PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，获得目的片段大小为160bp，见图4所示。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

(3)PCR扩增产物的验证

取1μl步骤(2)PCR扩增产物与pGEM-T载体在室温(25℃)放置1h进行连接。

连接体系：

取连接液2μl转化50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击60s，冰浴2min后加入500μl LB液体培养基，置于37℃、200rpm摇床1h，取200μl培养液涂布于含终浓度50mg/ml的X-gal+终浓度24mg/ml IPTG+终浓度100mg/ml Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜。挑取白斑，接种于5ml含Amp⁺(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜，抽取质粒，测序结果表明重组靶标基因载体pGEM-Enpp1构建成功。

3、Enpp1/Cre重组表达载体的构建与制备，命名为pCre-Enpp1，序列如SEQ ID NO.3。

(1)线性化pCre-Knockin载体

取2μg步骤1制备的pCre-Knockin载体，用AatII和SphI酶切，37℃水浴过夜，具体酶切体系如下：

用酶切产物回收试剂盒回收线性化的pCre-Knockin。

(2)Enpp1片段获得

取20μg步骤2制备的重组靶标基因载体pGEM-Enpp1，用AatII和SphI酶切，37℃水浴过夜，具体酶切体系如下：

配置2％的agarose进行凝胶电泳，切胶回收153bp目标条带，即为片段Enpp1。

(3)将步骤(2)片段Enpp1连接到线性化的pCre-Knockin载体上，16℃过夜连接，具体连接体系如下：

取连接液2μl转化50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击60s，冰浴2min后加入500μl LB液体培养基，置于37℃、200rpm摇床1h，取200μl培养液涂布于含终浓度50mg/ml的X-gal+终浓度24mg/ml IPTG+终浓度100mg/ml Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜。挑取白斑，接种于5ml含Amp⁺(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜，抽取质粒，测序结果表明重组靶标基因载体pCre-Enpp1构建成功。

4、体外Cas9表达载体的构建与制备，命名为pGEM-Cas9，序列如SEQ ID NO.4。

(1)引物设计

以px330(Addgene:42330)序列为模板，设计引物Cas9-F(下划线部分为T7启动子序列)和引物Cas9-R。

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

(2)PCR扩增

以px330为模板，在引物Cas9-F和引物Cas9-R的作用下进行PCR反应，扩增产物进行凝胶电泳分析，获得目的片段大小为5309bp，图5所示。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

(3)

取1μl步骤(2)PCR产物与pGEM-T连接，室温放置1h，连接体系如下：

取连接液2μl转化50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击60s，冰浴2min后加入500μl LB液体培养基，置于37℃、200rpm摇床1h，取200μl培养液涂布于含终浓度50mg/ml的X-gal+终浓度24mg/ml IPTG+终浓度100mg/ml Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜。挑取白斑，接种于5ml含Amp⁺(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜，抽取质粒，测序结果表明pGEM-Cas9表达载体构建成功。

(4)线性化pGEM-Cas9载体

反应体系如下，37℃过夜：

(5)体外转录Cas9

取1μg线性化的pGEM-Cas9载体利用体外转录试剂盒(ambion AM1340)进行体外转录，37℃反应3h，获得pGEM-Cas9载体体外转录物，具体转录体系如下：

(6)利用RNA纯化试剂盒(ambion AM1908)纯化体外转录的Cas9 mRNA，具体纯化体系如下：

纯化液过RNA纯化试剂盒(ambion AM1908)吸附柱，12000rpm，30s，70％酒精洗两次，最后用80μl无RNase水洗脱，收集液进行凝胶电泳分析，如图6，获得Cas9 mRNA。

5、体外转录sgRNA骨架编码序列的载体构建与制备，命名pGEM-sgRNA，序列如SEQ ID NO.5。

人工合成带有T7启动子的sgRNA骨架序列(即T7-sgRNA核酸片段)，将人工合成的T7-sgRNA核酸片段克隆到pGEM-T载体上。具体如下：

(1)设计引物

sgRNA-F(下划线为T7启动子)：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGGTGGAAAGGACGAAACACCGGGTCTTCGAGAAGACCT-3’

sgRNA-R：5’-AAAAGCACCGACTCGGTGCC-3’

(2)PCR扩增

以px330为模板，在引物sgRNA-F和引物sgRNA-R的作用下进行PCR反应，PCR扩增产物进行凝胶电泳分析，获得目的片段大小为120bp，如图9。

PCR反应体系为：

PCR反应条件为：

(3)取1μl步骤(2)PCR扩增产物与pGEM-T连接，室温放置1h。

取连接液2μl转化50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击60s，冰浴2min后加入500μl LB液体培养基，置于37℃、200rpm摇床1h，取200μl培养液涂布于含终浓度50mg/ml的X-gal+终浓度24mg/ml IPTG+终浓度100mg/ml Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜。挑取白斑，接种于5ml含Amp⁺(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜，抽取质粒，测序结果表明pGEM-sgRNA构建成功，备用。在T7和sgRNA序列之间含有两个BbsI酶切位点，可以将针对某个基因的识别序列插入到两个酶切位点之间。

实施例2

1)针对Enpp1基因设计Enpp1的sgRNA，序列如SEQ ID NO.6；在sgRNA5’端加BbsI酶切位点，如下(下划线酶切位点)。

sgRNA-Enpp1-F:CACCGGGCTTCGCTGCTCGCGCCCA

sgRNA-Enpp1-R:AAACTGGGCGCGAGCAGCGAAGCCC

变性，退火反应体系如下：

在PCR仪中反应体系如下：37℃30min；95℃5min；95-25℃,5℃/min。

将变性退火后，将获得的产物sgRNA-Enpp1连接到pGEM-sgRNA载体(序列如SEQ ID NO.5所示)，25℃连接反应1h，反应结束后，取连接液2μl转化50μl大肠杆菌DH5α感受态细胞，冰浴30min，42℃热击60s，冰浴2min后加入500μl LB液体培养基，置于37℃、200rpm摇床1h，取200μl培养液涂布于含终浓度50mg/ml的X-gal+终浓度24mg/ml IPTG+终浓度100mg/ml Amp⁺的LB平板，37℃培养过夜。挑取白斑，接种于5ml含Amp⁺(100mg/ml)的LB液体培养基中，37℃、200rpm摇床过夜，抽取质粒，获得质粒T7-sgRNA-Enpp1。

连接反应体系如下:

2)线性化质粒T7-sgRNA-Enpp1反应体系如下：

再用苯酚-氯仿纯化DNA。

3)体外转录T7-sgRNA-Enpp1

取1μg线性化的T7-sgRNA-Enpp1质粒，利用体外转录试剂盒(ambion AM1340)进行体外转录，37℃反应3h，具体体系如下：

4)利用RNA纯化试剂盒(ambion AM1908)提取体外转录T7-sgRNA-Enpp1质粒的mRNA，具体体系如下：

过RNA纯化试剂盒(ambion AM1908)洗脱柱，12000rpm，30s，70％酒精洗两次，最后用无RNase水洗脱，琼脂糖凝胶电泳分析，如图9，备用。

5)转基因小鼠制备

CRISPR/Cas9注射小鼠体系如下：

sgRNA-Enpp1 mRNA 20ng/μl

Cas9 mRNA 50ng/μl

pCre-Enpp1 10ng/μl

混合总体积：20μl

注射：

利用Eppendorf 2xTransferMan NK2显微注射仪吸取2μl上述混合液，注射60～80个受精卵。

小鼠出生5天后，分别取8只，剪取小鼠指甲抽取基因组DNA。PCR鉴定Cre基因，如图8。胚胎期13.5天，Cre基因在小鼠头面部的表达，见图10所示(箭头所示色彩部分)。

Claims

1.一种将外源基因定点整合到靶标基因的方法，其特征在于所述方法为：(1)将外源基因扩增后连接至外源基因重组表达载体上，构建重组外源基因载体；(2)将靶标基因跟载体连接，构建重组靶标基因载体；(3)将重组外源基因载体与重组靶标基因载体分别经过AatII和SphI酶切、琼脂糖凝胶回收，获得外源基因-靶标基因片段；(4)以px330质粒为模板，在含T7启动子序列的引物Cas9-F和引物Cas9-R作用下进行PCR反应，将PCR反应产物与pGME-T载体连接，获得质粒pGEM-Cas9，再将质粒pGEM-Cas9经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得Cas9mRNA；(5)根据靶标基因序列，人工合成含T7启动子序列的sgRNA，即片段T7-sgRNA，再将片段T7-sgRNA克隆到pGME-T载体，经线性化、体外转录及RNA纯化试剂盒回收，获得T7-sgRNA-靶标基因mRNA；(6)将Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段混合成混合液，注射哺乳类动物受精卵，实现将外源基因定点整合到靶标基因的目的；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述每20μl混合液中Cas9mRNA、T7-sgRNA-靶标基因mRNA和外源基因-靶标基因片段的浓度分别为50ng/μl、20ng/μl和10ng/μl。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述外源基因为Cre基因。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述靶标基因为小鼠Enpp1基因。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述哺乳类动物受精卵为小鼠受精卵。

6.如权利要求3～5之一所述的方法，其特征在于所述方法为：(1)重组外源基因载体的构建：以GFP-Cre载体为模板，在引物pCre-F和引物pCre-R的作用下进行PCR反应，回收PCR扩增产物，克隆到pGME-T载体，获得重组外源基因载体pCre-Knockin，核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示；

pCre-F:

pCre-R:5’-ATAAGAGAAGAGGGACAGCT-3’；

(4)T7-sgRNA-Enpp1mRNA：根据Enpp1的核苷酸序列，人工合成T7-sgRNA序列，序列为SEQ ID NO.6所示，将SEQ ID NO.6所示的T7-sgRNA序列克隆到pGME-T载体，获得质粒T7-sgRNA-Enpp1，将质粒T7-sgRNA-Enpp1进行线性化、体外转录获得T7-sgRNA-Enpp1mRNA；

Cas9-F：

5’-TTAATACGACTCACTATAGGATGGACTATAAGGACCACGAC-3’

Cas9-R：5’-GCGAGCTCTAGGAATTCTTAC-3’；

(6)将T7-sgRNA-Enpp1mRNA、Cas9mRNA与载体pCre-Enpp1混合，然后注射小鼠受精卵，再将受精卵孵育，实现将外源基因Cre定点整合到小鼠Enpp1内的目的。