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CN103665141B - 与艰难梭菌细胞毒素b相互作用的蛋白 - Google Patents

与艰难梭菌细胞毒素b相互作用的蛋白 Download PDF

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CN103665141B CN201310752493.XA CN201310752493A CN103665141B CN 103665141 B CN103665141 B CN 103665141B CN 201310752493 A CN201310752493 A CN 201310752493A CN 103665141 B CN103665141 B CN 103665141B
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Abstract

本发明提供一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，或由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成的多肽。本发明首次发现CSPG4具有艰难梭菌细胞毒素B细胞受体的功能，抑制CSPG4的表达或功能可显著降低艰难梭菌细胞毒素B的毒性，为治疗艰难梭菌感染提供了新思路。

Description

与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白
技术领域
本发明涉及蛋白质工程领域，具体地说，涉及一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白。
背景技术
艰难梭菌（Clostridium difficile）是一种厌氧的革兰氏阳性菌，最早发现于1935年，直到1978年发现该菌与临床长期使用某些抗生素（氨苄青霉素、头孢霉素、红霉素、氯林可霉素等）引起的伪膜性肠炎有关，从而逐渐受到重视。目前，科学界已经公认艰难梭菌感染是临床上抗生素相关性腹泻（antibiotic-associated diarrhoea，AAD）以及假膜性肠炎（pseudomenbranous colitis，PMC）的主要病因。在2013年美国疾病预防与控制中心发布的文件中（ANTIBIOTICRESISTANCE THREATS in the United States,2013）指出，仅在美国一地，每年有超过25万人被艰难梭菌感染，其中14000人因此死亡。每年因治疗艰难梭菌感染所需花费超过10亿美元。
艰难梭菌通过分泌两种外毒素，肠毒素A和细胞毒素B来实现其致病性。其中，毒素B被认为是艰难梭菌感染过程中所必须的外毒素（Lyras,2009）。毒素B通过受体介导的内吞机制进入细胞（Florin,1983），进一步通过糖基转移酶活性使细胞内的GTPase失去活性，从而使肠细胞失去细胞骨架，细胞形态发生变化，肠细胞功能出现异常，引发强烈的腹泻。
由于艰难梭菌具有很强的耐药性，目前尚无一种非常有效的方法治疗艰难梭菌感染（Rupnik,2009）。目前，对于艰难梭菌感染的细胞机制所知甚少，特别是毒素蛋白入胞机制，所应用的宿主受体蛋白尚不清楚。
发明内容
本发明的目的是提供一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白。
为了实现本发明目的，本发明的一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQID No.1所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明的另一种与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的多肽CSPG4N1-640，其由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种抗艰难梭菌感染的药物，其有效成分为CSPG4或CSPG4N1-640。
本发明还提供一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂，所述试剂中含有CSPG4或CSPG4N1-640。
本发明还提供一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂盒，所述试剂盒中包括上述试剂。
本发明还提供CSPG4蛋白在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。
本发明还提供多肽CSPG4N1-640在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。
本发明还提供CSPG4基因打靶载体，其构建方法包括以下步骤：
1）基于TALEN基因敲除技术，采用ULtiMATE方法(Yang,2013)组装针对CSPG4编码序列5'-TCCAGCCCCCGGCCT-3'以及5'-CTGGCCAACATAGTC-3'的DNA识别区段，并最终克隆至pGL3-TALEN载体中；
2）基于CRISPR系统的基因敲除载体，以CSPG4编码序列5'-TTGGCCAGACTTGCATCCG-3'为靶序列，通过酶切，将U6启动子、靶序列和gRNA5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3'依次连接，并克隆至pGL3-basic载体中，即得CSPG4基因打靶载体。
本发明还提供含有上述打靶载体的宿主细胞，其为人或哺乳动物细胞。
本发明首次发现CSPG4是艰难梭菌细胞毒素B的细胞受体。对CSPG4表达抑制可以显著降低毒素B对细胞的毒性。考虑到毒素B在艰难梭菌感染中的不可或缺的作用，CSPG4将是治疗艰难梭菌感染的重要靶点。
CSPG4基因（GenBank：NM_001897）最初作为黑色素瘤的标志物被发现，截至目前，已发现CSPG4在正常组织的发育和功能上也发挥一定的作用。本发明首次发现CSPG4在艰难梭菌细胞毒素B在毒性作用中起到关键作用。抑制CSPG4表达能显著降低艰难梭菌细胞毒素B的毒性。
本发明通过构建全基因组shRNA文库结合高通量测序技术，经细胞毒素B筛选后，首次发现CSPG4在艰难梭菌细胞毒素B发挥毒性过程中起关键作用。通过TALEN以及CRISPR等基因敲除技术，在HeLa和HT29细胞中完全抑制CSPG4基因的表达，由此明显抑制了TcdB的毒性。同时，克隆并表达了CSPG4基因的N端肽段CSPG4N1-640，并证明该肽段能竞争性抑制毒素B的细胞毒性。
附图说明
图1为本发明实施例1中用70pg/mL TcdB处理8小时后，shRNA文库细胞中仍含有保持明显形态，即对TcdB不敏感的细胞。
图2为本发明实施例1中利用深度测序揭示出针对CSPG4的shRNA在抑制TcdB毒性上具有明显作用。
图3为本发明实施例2中野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa（CSPG4-/-）以及CSPG4过表达型HeLa（CSPG4-/-/CSPG4）在TcdB处理下，细胞形态变化情况；其中，a.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa（CSPG4-/-）以及CSPG4过表达型HeLa（CSPG4-/-/CSPG4）在0.1ng/mL TcdB处理八小时后的形态变化情况；b.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa（CSPG4-/-）以及CSPG4过表达型HeLa（CSPG4-/-/CSPG4）在不同浓度TcdB处理时形态变化情况。
图4为本发明实施例2中野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa（CSPG4-/-）以及CSPG4过表达型HeLa（CSPG4-/-/CSPG4）在高浓度TcdB处理下，细胞死亡情况。
图5为本发明实施例3中通过Western Blot确定CSPG4表达量与细胞膜内TcdB量的关系；其中，a.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa（CSPG4-/-）以及CSPG4过表达型HeLa（CSPG4-/-/CSPG4）CSPG4表达量与细胞表面结合TcdB的量；b.野生型HeLa、CSPG4基因敲除型HeLa（CSPG4-/-）以及CSPG4过表达型HeLa（CSPG4-/-/CSPG4）细胞中CSPG4表达量与细胞膜结构上TcdB的结合量。
图6为本发明实施例4中SDS-PAGE电泳后，利用考马斯亮蓝染色鉴定CSPG4N1-640的表达纯化情况。
图7为本发明实施例4中Pull-down检测证明TcdB与CSPG4N1-640存在直接的相互作用。ANTXR1N-Fc为阴性对照。
图8为本发明实施例5中使用ImageXpress Micro XL WidefieldHigh Content Screening System观察CSPG4N1-640能够竞争性抑制TcdB的毒性。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
实施例1全基因组shRNA文库筛选
shRNA文库购自Open-biosystem，共65000条shRNA，针对人类的20000个基因。通过慢病毒系统将该文库构建于HeLa细胞中。使用含70pg/mL TcdB的培养基培养2×106个HeLa细胞，8小时后，使用移液器除去被TcdB侵染的细胞，并更换为正常的培养基培养3天。重复操作6次后，收集对TcdB具有抗性的HeLa细胞（图1），利用引物（5'-ACGTCGAGGTGCCCGAAGGA-3'和5'-TACATCTGTGGCTTCACTA-3'）进行PCR扩增，进一步通过深度测序确定针对CSPG4的shRNA能够抑制TcdB的毒性（图2）。
实施例2CSPG4基因敲除
针对CSPG4基因的TALENs序列如下：5'-TCCAGCCCCCGGCCT-3'(TALENL)，5'-CTGGCCAACATAGTC-3'(TALENR)。针对CSPG4基因的CRISPR系统中所使用的靶序列为：5'-TTGGCCAGACTTGCATCCG-3'，gRNA序列为：5'-GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT-3'。
将TALENs或CRISPR系统质粒转染进细胞后，选取单克隆，并通过Western Blot确定CSPG4基因敲除的细胞。获得CSPG4基因敲除细胞系后，对比野生型HeLa细胞，以及CSPG4过表达型Hela细胞，使用TcdB处理，并通过细胞形状（图3）及细胞死亡（图4）等表型来评价TcdB的毒性。
实施例3CSPG4表达量直接影响TcdB与细胞表面的结合
将上述CSPG4基因敲除的HeLa细胞和通过慢病毒侵染获得的CSPG4过表达HeLa细胞同步培养后，用含10μg/mL TcdB的培养基在4℃培养一小时。进一步使用PBS清洗5遍，洗去未与细胞表面结合的TcdB。裂解细胞后，通过Western Blot确定CSPG4表达量与细胞表面结合TcdB量的关系。同时，用含10μg/mL TcdB的培养基在37℃培养半小时后，使用FractionPREPTM Cell Fraction Kit分离细胞膜结构，通过Western Blot确定CSPG4表达量与细胞膜内TcdB量的关系（图5）。
实施例4CSPG4蛋白N端肽段直接与TcdB相互作用
编码CSPG4N端前640氨基酸多肽的DNA序列克隆自CSPG4cDNA，装载于pIRES2-Fc-eGFP载体上，转染细胞后能够产生分泌型CSPG4N1-640Fc-tag融合蛋白以及绿色荧光蛋白。该质粒转染至CHO细胞后，利用流式细胞仪分离出表达绿色荧光蛋白的细胞，这些细胞继续培养后，收集培养基，利用HitrapProteinG柱子（GE）分离纯化的的得到CSPG4N1-640多肽（图6）。
将上述得到的CSPG4N1-640与TcdB在PBS中4℃孵育过夜，然后分别使用ProteinA或Ni-NTA Superflow(QiaGen，30450)吸附CSPG4N1-640或TcdB，用PBS洗三次后，通过Western Blot分析两者之间的相互作用（图7）。
实施例5CSPG4蛋白N端肽段竞争性抑制TcdB的细胞毒性
将纯化好的CSPG4N1-640（10μg/mL）与TcdB（100pg/mL）在4℃共同孵育1个小时后加入到HeLa细胞中。使用ImageXpress MicroXL Widefield High Content Screening System通过观测细胞形态变化来评价TcdB的毒性（图8）。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
参考文献
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Claims (7)

1.与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的蛋白在制备抗艰难梭菌感染药物、艰难梭菌诊断试剂或艰难梭菌诊断试剂盒中的用途，其特征在于，其为硫酸软骨素蛋白多糖CSPG4，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
2.与艰难梭菌细胞毒素B相互作用的多肽，其特征在于，其由CSPG4蛋白N端640个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
3.一种抗艰难梭菌感染的药物，其特征在于，其有效成分为权利要求1所述蛋白或权利要求2所述多肽。
4.一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂，其特征在于，所述试剂中含有权利要求1所述蛋白或权利要求2所述多肽。
5.一种用于诊断艰难梭菌感染的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求4所述试剂。
6.CSPG4蛋白在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用，所述CSPG4蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.1或SEQ ID No.2所示。
7.权利要求2所述多肽在制备抗艰难梭菌感染药物及诊断试剂中的应用。
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