CN103282028A

CN103282028A - 制备含有微囊化益生菌的稳定软明胶胶囊剂的方法

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Publication number: CN103282028A
Application number: CN2011800490359A
Authority: CN
Inventors: C.瓦拉; R.博托拉米; G.罗西纳; K.赫尔森
Original assignee: RP Scherer Technologies LLC
Current assignee: RP Scherer Technologies LLC
Priority date: 2010-08-10
Filing date: 2011-08-08
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2031-08-08
Also published as: DK2603208T3; JP2013533313A; MX2013001528A; ES2500046T3; WO2012021432A2; KR20130099936A; CA2808610A1; CA2808610C; EP2603208B1; AU2011289592B2; BR112013003062A2; RU2013110321A; BR112013003062B1; WO2012021432A3; US20120039998A1; RU2593788C2; JP6214395B2; US9427012B2; MX340235B; EP2603208A2

Abstract

制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂，使得该软明胶胶囊剂在室温下稳定至少约24个月。

Description

制备含有微囊化益生菌的稳定软明胶胶囊剂的方法

本申请要求2010年8月10日提交的美国临时专利申请号61/372,350的权益，其整个公开内容通过引用结合到本文中。

技术领域

本发明涉及制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂的方法和按照该方法制备的产品。更具体地讲，本发明的产品在室温下稳定至少24个月。

背景

益生菌(Probiotics)是基于微生物的膳食辅助剂，其通过调节粘膜免疫和系统免疫以及改善肠功能和肠道微生物平衡，而有益地影响宿主生理(Naidu，A.S.等(1999)，Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB) (乳酸菌的益生菌谱). Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 39:3-126)。归因于这些益生菌的各种营养和治疗作用包括：调节免疫应答，降低血清胆固醇浓度，改善乳糖不耐受症状，提高对感染性肠疾病的抗性，缩短腹泻持续时间，降低血压，并且有助于预防结肠癌。

然而，为了发挥对宿主的这些有益作用，益生菌必须保持其存活力，并且大量到达大肠(Favaro-Trindade, C. S.等(2002), J Microencapsulation 19(4): 485-494))。有效的益生菌应能够在胃条件中存活，并通过附着于肠上皮而(至少短暂地)定居在肠中(Conway, P. (1996), Selection criteria for probiotic microorganisms(益生微生物的选择标准). Asia Pacific J. Clin. Nutr 5:10-14)。

乳酸菌或乳杆菌(Lactobacilli)是用于掺入乳制品例如酸奶、发酵乳和酸乳酒(kefir)中的最常用益生菌，其应用不断变得更为广泛。例如，目前它们以例如散剂、胶囊剂和片剂等膳食补充剂形式加入。双歧杆菌(Bifidobacteria)和链球菌(Streptococci)也是常用的益生微生物。乳酸杆菌一般需要在其复苏后保持益生功能活性(即肠粘附/滞留、细菌素/酶的产生)的有效递送系统(Salminen, S.等(1996), Clinical uses of probiotics for stabilizing the gut mucosal barrier: successful strains and future challenges (用于稳定肠粘膜屏障的益生菌的临床应用：成功的菌株与未来挑战). Antonie Van Leeuwenhoek 70:347-3581。此外，在制造有效的市售产品时，除了提高体内存活力和胃肠道存在时间以外，延长室温下的保存期限依然是一个挑战。虽然已表明益生菌的冷冻干燥是益生菌保存和递送的有效方法，但若干生理化学因素例如湿度、通气(氧气可用性)、加工(即搅动)和温度可损害细胞存活力，因此损害保存期限。

科学文献的证据表明，含有益生菌的产品的稳定性、存活力(即活的微生物含量)和品质存在问题。在一项有关酸奶的研究中，实验得到的证据是6种所测产品中3种不含活微生物的迹象，2个只含有低浓度。Shah (2000) Journal of Dairy Science，83(4)：894-907。还发表了有关含有分布在固体剂型(例如散剂、胶囊剂和片剂)中的益生菌的产品的类似报道。对益生菌的稳定性的主要挑战是水活性、加工的物理性应力和温度。应用保护措施例如包覆物也具有挑战，所述保护措施可在体内适当递送部位释放益生菌并允许益生菌定居。在最近发表的研究中证实了包覆型益生菌的合适递送和定居(Del Piano，M.等(2010), Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains (通过微囊化益生菌与相同的未包覆菌株相比较评价肠定居), Journal of Clinical Gastroenterology, 44 增刊1: S42-6。

油混悬液已被用来提高益生菌的存活力和保存期限。例如，美国专利申请公布号2004/0223956公开了含有悬浮于食用油的益生菌的组合物，并任选包封入两节(two piece)硬壳胶囊中。

另外，本领域技术人员已知尝试使用益生菌微球以提高存活力和保存期限。例如，美国专利申请公布号2005/0266069公开了含有益生菌微球的益生菌制剂，所述益生菌微球具有用包衣剂和增塑剂包覆的益生菌芯和纤维素赋形剂。

经验长期以来表明，药物或用于人或动物消费的其它制品可安全且方便地包装在硬或软明胶(软明胶胶囊)壳中。

填充式整体软胶囊(Filled one-piece soft capsules)或软明胶胶囊广为人知并已使用多年，用于各种目的，并且能够容纳液体填充材料。软明胶胶囊最常用来包封或容纳液体溶媒或载体中的消耗材料，例如维生素、矿物质、果实和植物提取物和药物。

将营养剂或药剂在液体载体中的溶液或分散体包封在软胶囊内提供相对其它剂型(例如压制片、包衣或未包衣固体片剂)或散装(bulk)液体制剂的许多优势。溶液或分散体的包封允许单位剂量的准确递送。软胶囊提供易于吞咽和无需调味、氧屏障良好(即通过胶囊壳的氧透性低)和窃启防护(tamper protection)的剂型。软胶囊剂比食品和液体产品(例如酸奶和牛奶)更易运输。

益生菌可以无缝或软明胶胶囊剂市售得到。Bifa-15™ (Eden Foods，Inc.，Clinton，Mich.)是一种双歧杆菌的无缝微囊化递送系统，据称含有30亿个细菌。该胶囊剂与寡糖、甜味剂和香料混合，并以各自包装的单剂量铝管提供。将内容物倒入口中，条件是将胶囊剂整个吞咽，不咀嚼。Ultra-Dophilus™ (Nature's Plus，Melville，N.Y.)是常规尺寸的软明胶胶囊剂，含有20亿个有活力的冰冷干燥的嗜酸乳杆菌(L. acidophilus)。Probiotocs12Plus™是软胶囊剂，含有乳酸菌的12种菌株，其目的是在制备时有900个菌落形成单位的效能，且无需冷藏。虽然每种产品声称制备时的存活力，但无法保证将来在室温(例如22-25℃)下保存后仍可满足标签声明。在保持明胶胶囊剂中所包含的益生菌的存活力方面的类似问题，从专利文献来看同样是显然的。

本领域中含有益生菌的软明胶胶囊剂大部分是不成功的。软明胶胶囊制剂无法在设计的产品保存期限(通常2年)内保持所需存活力(常以菌落形成单位(CFU)测量)，尤其在室温下。益生菌的活力往往下降得太快以至于不成功。认为这部分是由于软明胶胶囊环境中高的水活性Aw (游离水)所致。这种Aw梯度与软明胶胶囊生产过程本身(特别是包封期间)有关。在此期间，存在于胶囊壳的某些水份移动到壳内的制剂中，在制剂中保持游离形式。在含有益生菌的制剂的情况下，游离水激活益生菌，使其在之后不久死亡。

另外，软明胶胶囊的制备过程挑战软明胶胶囊内益生菌的稳定性，因为它可使益生菌产生应激，即使是包衣的，从而降低存活力和稳定性。

因此，需要提供在室温下长期保存时产品中存活力和稳定性提高的益生菌，因为这仍旧挑战该产业。特别是存在对含有存活力提高和保存期限延长的益生菌的稳定软明胶胶囊剂的需要。

发明概述

本发明涉及制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一种包覆物的微囊化益生菌，所述包覆物包含至少一种熔点介于35℃至75℃之间的植物脂质；(b)将微囊化益生菌悬浮于悬浮制剂(suspending formulation)中以制备填充料(fill)；(c)在低强度和低温下混合填充料以制备混合的填充料；(d)减少混合的填充料中微囊化益生菌的附聚物以制备解附聚填充料；和(e)将解附聚填充料包封入软明胶胶囊中，其中保持微囊化益生菌包覆物的完整性。在一个优选的实施方案中，所述方法在控制氧气暴露的同时进行，而在又一个优选的实施方案中，含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂在室温下稳定至少约24个月。在某些实施方案中，通过在低于约33℃的温度下碾磨混合的填充料来减少微囊化益生菌的附聚物。在另一个优选的实施方案中，微囊化益生菌在包封后保持平均颗粒直径尺寸介于约150-约250微米之间，更优选约200微米，且各微囊化益生菌的颗粒直径尺寸小于约500微米。

在本发明的一个优选实施方案中，微囊化益生菌的包覆物含有选自以下的至少一种植物脂质：聚甘油脂、氢化棕榈脂、甘油硬脂酸二棕榈酸酯、聚甘油-6-二硬脂酸酯及其组合。在某些优选的实施方案中，悬浮制剂包含至少油、悬浮脂或乳化剂，或者至少一种油和至少一种选自悬浮脂、乳化剂及其组合的材料。

本发明方法中的混合优选在介于约15℃与约32℃之间的温度下和在小于约3000 rpm的强度下进行。

本发明还涉及按照以下方法制备的益生菌软明胶胶囊剂：(a)提供具有至少一种包覆物的微囊化益生菌，所述包覆物包含至少一种熔点介于约35℃与约75℃之间的植物脂质；(b)将微囊化益生菌悬浮于悬浮制剂中以制备填充料；(c)在低强度和低温下混合填充料以制备混合的填充料；(d)减少混合的填充料中微囊化益生菌的附聚物以制备解附聚填充料；和(e)将解附聚填充料包封入软胶囊中，其中保持微囊化益生菌包覆物的完整性。

在某些实施方案中，益生菌软明胶胶囊剂在控制氧暴露的同时按照所述方法制备，并在室温下稳定至少约24个月。

发明详述

本发明试图通过开发制备含有微囊化益生菌的稳定软明胶胶囊剂的方法以解决本领域的问题，所述方法提高益生菌的存活力。本发明人发现了用于制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂的本发明方法，所述方法在室温下保持更好的稳定性和约200微米的平均直径粒径，各微囊化益生菌的颗粒直径尺寸小于约500微米。

第一实施方案涉及制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂的方法，所述方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一种包覆物的微囊化益生菌，所述包覆物包含至少一种熔点介于约35℃与约75℃之间的植物脂质；(b)将微囊化益生菌悬浮于悬浮制剂中以制备填充料；(c)在低强度和低温下混合填充料以制备混合的填充料；(d)减少混合的填充料中微囊化益生菌的附聚物以制备解附聚填充料；和(e)将解附聚填充料包封入软胶囊中，其中保持微囊化益生菌包覆物的完整性。

本发明的第一个实施方案的方法包括提供具有至少一种包覆物的微囊化益生菌的步骤，所述包覆物包含至少一种熔点介于约35℃与约75℃之间的植物脂质。包覆益生菌的目的是排除益生菌与游离水之间接触，所述游离水从软明胶胶囊壳迁移到内部填充制剂中。益生菌可采用任何已知技术包覆，包括但不限于具有顶部和/或底部喷雾的流化床技术或基于pH诱导的絮凝的其它包覆技术。本文所用术语微囊化意指用组合物包覆。微囊化一般理解为包括包覆起始尺寸为小于约1微米-约200微米的颗粒。然而，任何适当厚度的包覆，优选每层介于约20至约25微米是合适的，只要包覆是均质和均匀的，没有任何空隙或孔穴，并形成合适的屏障层。对于本发明的目的，假定微囊化益生菌可通过获得市售可得的微囊化益生菌或通过用所述包覆物包覆益生菌来实现。

任何益生菌都可用于本发明。益生菌可购自市售来源或按照已知方法培养(生长)。益生菌通常属于乳杆菌属(Lactobacillus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)、片球菌属(Pediococcus)、丙酸杆菌属(Propionibacterium)、明串珠菌属(Leuconostoc)和酵母属(Saccharomyces)。在乳杆菌属中，下列物种具有益生菌活性：嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌(L. crispatus)、加氏乳杆菌(L. gasseri)、德氏乳杆菌群(L. delbrueckii group)、唾液乳杆菌(L. salivarius)、干酪乳杆菌(L. casei)、类干酪乳杆菌(L. paracasei)、植物乳杆菌群(L. plantarum group)、鼠李糖乳杆菌(L. rhamnosu)、路氏乳杆菌(L. reuteri)、短乳杆菌(L. brevis)、布氏乳杆菌(L. buchneri)、发酵乳杆菌(L. fermentum)、食果糖乳杆菌(L. fructivorans)、瘤胃乳杆菌(L. ruminis)、清酒乳杆菌(L. sakei)和阴道乳杆菌(L. vaginalis)。在本发明的优选实施方案中，益生菌选自下列物种：嗜酸乳杆菌、卷曲乳杆菌、加氏乳杆菌、德氏乳杆菌群、唾液乳杆菌、干酪乳杆菌、类干酪乳杆菌、植物乳杆菌群、鼠李糖乳杆菌、路氏乳杆菌、短乳杆菌、布氏乳杆菌、发酵乳杆菌、青春双歧杆菌(B. adolescentis)、角双歧杆菌(B. angulatum)、双歧双歧杆菌(B. bifidum)、短双歧杆菌(B. breve)、链状双歧杆菌(B. catenulatum)、婴儿双歧杆菌(B. infantis)、动物双歧杆菌(B. animalis)、乳双歧杆菌(B. lactis)、长双歧杆菌(B. longum)、假小链双歧杆菌(B. pseudocatenulatum)、嗜热双歧杆菌(S. thermophilus)、酿酒酵母群(Sacch . cerevisiae group)及其组合。

在优选的实施方案中，用于本发明的益生菌由1和12种菌株、优选2-6种菌株、更优选3种菌株组成。益生菌可呈任何固体形式。优选其呈通过冻干或通过喷雾干燥制备的脱水粉末的形式。

包覆物包含至少一种植物脂质，其具有介于约35℃与约75℃之间的熔点，使得包覆物在制备含有微囊化细菌的软明胶胶囊剂的过程中、在产品保存期间、或在通过胃-十二指肠道(胃和十二指肠)迁移期间、或在胃的低pH中不融化、不软化或完整性不降解。理论上，软明胶胶囊剂将在人体中在胃内释放含有微囊化益生菌的填充料，然后其内容物被递送到肠道；益生菌当递送到具有从包覆物释放益生菌的合适pH的肠中时才被激活，然后可定居以对宿主提供最佳益处。在一个优选的实施方案中，植物脂质的熔点介于约45℃与约65℃之间，更优选介于约50℃与约60℃之间。在优选的实施方案中，植物脂质为聚甘油二硬脂酸酯(例如Plurol Stearique WL 1009)、棕榈酸硬脂酸甘油酯(例如Precirol Ato 5)、饱和脂肪酸(例如Revel C)、非月桂酸(lauric)来源的氢化植物脂和氢化棕榈脂、硬脂酸甘油酯及其组合。更优选植物脂质为聚甘油酯、氢化棕榈脂、甘油硬脂酸二棕榈酸酯或聚甘油-6-二硬脂酸酯CAS 61725-93-7 (亦称Plurol Stearique WL1009)或其组合。

任选益生菌可被包覆多于一层，即双层、三层等，每层是益生菌上单独且不同的包覆物，其中至少一层是上文列举脂质的一种或组合。在该实施方案中，将各包覆物依次施用到益生菌上。例如，可将双层包覆物施用到益生菌。多种包覆物可增加对益生菌的保护，使其与存在于软明胶胶囊内部的游离水隔开。2009年3月9日提交的待审意大利专利申请号RM2009A000104中进一步解释了双层包覆物，其通过引用结合到本文中。

本发明的第一实施方案的方法包括将微囊化益生菌悬浮于悬浮制剂中以制备填充料的步骤。本发明的悬浮制剂可通过本领域已知的任何技术制备。虽然不受某一理论的限制，但认为悬浮制剂有效地限制微囊化细菌与从软明胶胶囊壳进入内部环境的游离水之间的接触，从而导致益生菌的存活力和稳定性提高。可调节悬浮制剂至适当稠度以保持粉末悬浮，并确保均质混合物。本领域普通技术人员应容易了解所需稠度以及如何调节悬浮液的稠度。

在本发明的一个实施方案中，悬浮制剂至少包含油、悬浮脂或乳化剂。在又一个实施方案中，悬浮制剂包含至少一种油和至少一种选自悬浮脂、乳化剂及其组合的材料。在一个优选的实施方案中，悬浮制剂由至少一种油和至少一种悬浮脂组成；在另一个优选的实施方案中，悬浮制剂由至少一种油和至少一种乳化剂组成；在又一个优选的实施方案中，悬浮制剂包含各种油、悬浮脂和乳化剂的至少一种。在某些实施方案中，悬浮脂用作油的增稠剂，并用来确保混悬制剂的均质性。

适用于本发明的油包括而不限于大豆油、芥花籽油(canola oil)、向日葵油、澳洲坚果油、花生油、葡萄籽油、南瓜籽油、亚麻籽油、亚麻仁油(flaxseed oil)、橄榄油、玉米油、红花油、芝麻油、松仁油、共轭亚油酸、扁桃油、桃仁油、杏仁油、胡桃油、菜籽油、覆盆子籽油、越橘籽油、酸果蔓籽油、石榴籽油和其它果实种子油、沙棘油、墨西哥油(chia oil)、紫苏油、二酰基甘油(diaglycerol (DAG) oil)、ω3的植物衍生的来源、二十碳五烯酸(EPA)的发酵来源、二十二碳六烯酸(DHA)的发酵来源、EPA、DHA和其它ω3的组合的发酵来源(包括鱼油和磷虾油)、γ-亚麻酸(GLA)和/或十八碳四烯酸(stearidonic acid，SA)的来源、分级分离的椰子油及其组合。DHA、EPA和ALA来源包括但不限于鱼油、酵母或其它微生物或单细胞源和植物油，主要为亚麻仁、大豆和芸苔(canola)。GLA源包括但不限于月见草油、黑加仑籽油(blackcurrent seed oil)、琉璃苣油和蓝蓟油。

适用于本发明的悬浮脂包括而不限于脂肪酸的甘油单酯、脂肪酸的甘油二酯、蜂蜡、单硬脂酸甘油酯、单/二油酸甘油酯、分级分离的棕榈油衍生物、氢化棕榈脂、氢化大豆油衍生物、植物脂、中链甘油三酯(MCT)及其组合。

适用于本发明的乳化剂包括而不限于卵磷脂、聚山梨醇酯、脱水山梨醇单油酸酯及其组合。

在某些实施方案中，填充料优选含有约0.5%-约50%重量的微囊化益生菌和约50%-约99.5%重量的悬浮制剂。

本发明的第一实施方案的方法包括在低强度和低温下混合填充料以制备混合的填充料的步骤。混合在低强度和低温下进行，以便不损害(即损坏)益生菌的包覆物的完整性以及益生菌的细胞完整性。保持包覆物的完整性和微囊化益生菌的粒径是通过本发明获得的益生菌的存活力和稳定性提高的关键方面。

可通过显微分析对益生菌细胞结构的完整性和益生菌包覆物的完整性进行分析，以确定它们是否保持完整且未损坏。完整细胞结构和包覆物的组合导致能够定居的有活力的益生菌。这种定居能力可通过总活菌计数(用cfu/g表示)来测量，并可通过处理后粪便细菌组成分析来证实。

本文所用“低强度”是指以小于约3000 rpm (约50 Hz)的速度混合。低强度还涉及刀片类型、混合器和混合筛的选择。优选选择这样的刀片类型、混合器和混合筛，以使对悬浮液的剪切应力减至最小，但还实现稳定的均质悬浮液，并降低附聚和粒径而又不引起益生菌上的包覆物受损。对于低强度和低剪切力，本领域普通技术人员能够容易地选择合适的刀片类型、混合器和混合筛。混合的强度和剪切力可通过本领域技术人员容易了解的因素组合来控制。适用于本发明的混合设备包括而不限于例如有或没有内置乳化/均质化设备的锚式搅拌器或静态反混合搅拌器(static contra mixing stirrer)和混合容器，包括配备合适刀片或混合筛的Becomixer、Skermann混合容器及Ross和Silverson混合器。本文所用“低温”是指低于约33℃的温度。保持温度低于约33℃，使得益生菌保持无活性，直到吞咽软明胶胶囊剂，且当递送到预定目的地时体温使益生菌激活，生存期才开始。保持低温将保持益生菌和包覆物的存活力和稳定性。优选进行混合的低温保持在约15℃与约32℃之间，更优选在约20℃与约30℃之间，最优选约25℃。

本发明的第一实施方案的方法包括减少混合的填充料中微囊化益生菌附聚物以制备解附聚填充料的步骤。“减少附聚物”部分是指减小颗粒的尺寸，将粘在一起的颗粒分开。解附聚填充料优选是解附聚的，使得微囊化益生菌大部分彼此分开。同样地，这种解附聚填充料更优选为所形成的具有受控粒径的均质和均匀的填充料制剂，其允许有良好品质的软明胶胶囊剂的有效包封和递送。微囊化益生菌的颗粒必须是解附聚的，并减小到合适的尺寸用于包封。解附聚可通过任何已知方法来实现，但必须以保持益生菌上的包覆物的完整性的方式进行，使得益生菌依旧受保护以防迁移到软明胶胶囊中的游离水，并可将有活力的益生菌递送到既定的人体部位。解附聚方法优选以保持益生菌细胞结构完整性的方式进行，使得它们贯穿制备过程、贮存和摄入而保持有活力，并在胃中适当释放和激活。

在某些实施方案中，减少附聚物通过碾磨进行。在优选的实施方案中，附聚物减少(优选碾磨)在约33℃以下温度下、优选在约25℃下进行。另外，该步骤优选在低湿度环境中进行，这优选是指湿度低于约20%，更优选低于约18%的湿度。在优选的实施方案中，附聚物减少(优选碾磨)将在之前步骤中附聚的颗粒分开，从而产生基本均质的填充料。

在某些实施方案中，使用3辊碾磨机实现碾磨，其间隙设置和速度受控以控制引入填充料的热量。本领域已知的任何其它设备、碾磨或以其它方式都可用于附聚物减少，只要温度、能量、氧和水进入同样受控，以控制引入填充料的热量。优选在碾磨期间完全避免水和氧进入。在某些实施方案中，减少附聚物是碾磨和脱气的多部分过程。脱气可在真空下进行，其抽出空气或气泡，并且真空可在氮气或任何合适的气体下中止以减少氧气暴露。在本文公开的全部加工步骤中，可采取行动以降低填充料通气和湿度，从而产生具有高均质性和稳定性的包封填充料。如果填充料中截留有空气，便可引起氧化问题、稳定性降低和包封问题。

减少附聚物是指使微囊化益生菌的平均颗粒直径标准化和/或使制备过程中形成的颗粒的附聚物解附聚。解附聚后平均颗粒直径尺寸可介于约150微米至约250微米之间，优选约200微米，其中各微囊化益生菌的颗粒直径尺寸优选小于约550微米、更优选小于约500微米，甚至更优选小于约400微米，最优选至少约90%颗粒的直径尺寸介于约350微米与50微米之间。

本发明的第一实施方案的方法包括将解附聚填充料包封入软明胶胶囊的步骤。软明胶胶囊中解附聚填充料的包封可采用本领域已知的任何方法或制备设备进行。例如，软明胶胶囊可采用旋转模包封机制造。另外，软明胶胶囊可由本领域已知的任何材料制造。作为非限制性实例，软明胶胶囊可采用标准旋转模包封技术并掺入用于可咀嚼或可吞咽目的的壳材料来制造，所述壳材料选自以下材料的共混物：包括但不限于明胶、甘油、天然或改性淀粉、山梨糖醇来源、水，VEGICAPS^™ SOFT技术采用精选的角叉菜胶、改性淀粉、甘油和/或山梨糖醇来源、水和磷酸钠。

在本发明第一实施方案的一个优选的实施方案中，所述方法在控制氧气暴露的同时进行。进行该方法以保护微囊化益生菌免受氧化，并提高益生菌的稳定性。控制氧气暴露可意味着采取不引入额外氧气的步骤、采取降低存在的氧气量的步骤和采取完全避免其中的氧气的步骤。控制暴露氧气的步骤对于本发明的每个过程步骤可能不同，或者对所有过程步骤都相同。控制氧气暴露容易了解，并且可通过本领域技术人员已知的任何方法进行。在某一优选实施方案中，每个过程步骤都在氮气(即连续的氮气层)下进行。

任选本发明第一实施方案的方法包括双重干燥填充的软明胶胶囊剂的步骤。采用双重干燥方法来控制干燥过程，使得软明胶胶囊不过度温热，且益生菌不被激活。在一个优选的实施方案中，进行双重干燥，其第一步为将软明胶胶囊剂置于具有强制通风的滚筒干燥机中。在更优选的实施方案中，将滚筒干燥机保持在约20℃的温度和约18%-约30%、优选约20%的湿度下。

在一个优选的实施方案中，进行双重干燥，其第二步为将软明胶胶囊剂在托盘、房间或烘箱中在约18℃-约25℃、优选约20℃的温度和通常介于约8%与约20%之间的受控相对湿度下干燥。

总的来说，本领域技术人员了解将软胶囊剂干燥到所需的硬度和壳含水量，特别与胶囊尺寸和填充料密度相适应。硬度可采用Bareiss硬度检测器测定，壳含水量可采用Karl Fisher滴定方法通过测量湿度来测定。

在本发明的第一实施方案中，保持微囊化益生菌的包覆物的完整性。在优选的实施方案中，减少混合填充料中微囊化益生菌颗粒的附聚而又不损害包覆物的完整性或包覆物内益生菌的细胞结构。重要的是保持包覆物的完整性，以防止益生菌与软明胶胶囊内的游离水接触，该接触导致存活力降低。保持包覆物的完整性是指包覆物在其任何位置上基本未磨损、破坏或变薄而使得益生菌可能与胶囊内的悬浮制剂直接接触。相比之下，损害包覆物的完整性是指包覆物以任何方式变薄、磨损、破裂或受损，使得益生菌可能与胶囊内的悬浮制剂直接接触。保持益生菌细胞结构的完整性是指未变形或破裂的细胞结构。相比之下，损害包覆物内益生菌细胞结构的完整性是指使细胞结构变形、破裂、擦伤或扭曲，使得细胞弱化。损害的细胞结构可产生在递送时不具有在肠中定居的能力的细胞。

在一个优选的实施方案中，微囊化软明胶胶囊剂在室温下稳定至少约24个月。胶囊剂的稳定性是指在一定时间后胶囊剂内益生菌的菌落形成单位(CFU)的保持。它还可指在其保存期限结束时符合产品标签上标出的益生菌活性(cfu/g)。在室温下约24个月后，稳定的软明胶胶囊剂保持活细胞总数为每胶囊剂初始输入值的至少约10%或以上，更优选每胶囊剂初始输入的至少约20%。在另一个实施方案中，在室温下约24个月后，稳定的软明胶胶囊剂保持活细胞总数介于每胶囊剂初始输入值的约10%与约95%之间，更优选介于每胶囊剂初始输入的约20%与约85%之间。每胶囊剂初始输入值优选介于约10亿-约30亿CFU，更优选约20亿CFU。

本文中，“室温”优选是指介于约15℃至约30℃、更优选约20℃到约25℃的温度，以及介于约20%与约75%、更优选约50%至约60%之间的湿度。在室温下的稳定性对消费者很重要并且本领域一般不提供，因为大多数产品必须保持冷藏以保持益生菌的存活力。

在某些优选的实施方案中，益生菌软明胶胶囊剂的包装提供针对水(湿度)、氧气、光和其它有毒影响的增强防护。这种包装支持和保护软明胶胶囊剂填充料中微囊化益生菌菌株和其它成分的稳定性。优选的包装包括但不限于具有合适屏障性质的泡罩包装(blister packaging)、带有或没有干燥器的塑料或金属容器和优选使用带有或没有干燥器的感应密封盖的玻璃罐。优选的泡罩包装可包括不同类型的三层泡罩膜，例如标准和高阻挡膜，包括例如三层Flexafarm Sbc (例如PVC 250my+PE 25my+PVDC 150g/mq sbc级)和Aquaba-PVC (例如PVC 250my+AQUABA 160 g/mq)、Aclar、Alu – Alu形式、在中心位置具有软性回火铝(soft tempered aluminium)的三层泡罩箔(OPA)、其它层PVC和聚酰胺及新一代多层泡罩组合的材料。优选的塑料容器可由任何合适的塑料制造，例如HDPE (高密度聚乙烯)、PP (聚丙烯)和PET (聚对苯二甲酸乙二醇酯)，而且还可包括集成的或独立的干燥剂和/或氧气吸收小包(absorber minipacks)或膜。优选的玻璃瓶可以是有色玻璃，可为感应密封的，具有塑料或金属盖和干燥器或氧气吸收设备(absorber provision)。优选的金属容器可包括铝罐、管或瓶，其可以是感应密封的，具有塑料或金属盖和/或具有干燥剂或氧气吸收设备。

在本发明的第二实施方案中，按照以下方法制造益生菌软明胶胶囊剂：(a)提供具有至少一种包覆物的微囊化益生菌，所述包覆物包含至少一种熔点介于约35℃与约75℃之间的植物脂质；(b)将微囊化益生菌悬浮于悬浮制剂中以制备填充料；(c)在低温和低压下混合填充料以制备混合的填充料；(d)减少混合的填充料中微囊化益生菌的附聚物以制备解附聚填充料；和(e)将解附聚填充料包封入软明胶胶囊中，其中保持微囊化益生菌包覆物的完整性。

有关加工步骤，即包覆、悬浮、混合、减少附聚物等的上述细节，对于本公开内容的第二实施方案与本公开内容的第一实施方案是相同的。同样地，有关第一实施方案的控制软明胶胶囊的氧气暴露和稳定性的上述细节与第二实施方案的相同。

本发明不限于任何特定的益生菌或悬浮制剂，而是解决(特别是在室温下)保持产品中的益生菌的存活力和稳定性的问题。下列实施例将在某些优选的实施方案中说明本发明的方法。权利要求书范围内的其它实施方案对于本领域技术人员而言是清楚明了的。

实施例 1

按照本发明制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂。按照意大利专利申请号RM2009A000104所述方法，用聚甘油二硬脂酸酯(Plurol Stearique WL1009)单层包覆植物乳杆菌LP01和短双歧杆菌BR03。对于悬浮制剂，将蜂蜡融于约65℃的大豆油中。然后将大豆卵磷脂加入混合物中，使混合制剂冷却至低于25℃或约25℃。使微囊化益生菌悬浮于冷却的大豆油、蜂蜡和大豆卵磷脂的悬浮制剂中，在30℃以下混合10分钟。下表1示出填充料中存在的各种成分的量。混合的填充料然后使用3辊碾磨机碾磨10分钟，保持温度低于30℃，并且在真空和氮气下使经碾磨的填充料通过间距为600微米的筛，以防止制剂氧化。

然后如下使用标准旋转模包封机，将碾磨的填充料包封入软明胶胶囊中：将碾磨的填充料和壳材料加载到与机器连接的各个接受器中。机器由熔融的壳材料制备两条固体条带，使之冷却，用MCT和卵磷脂的混合物润滑。将条带引导至两个旋转模的位置上，所述旋转模具有所需尺寸和形状的特定袋(pocket)以形成胶囊。相对的模持续反向旋转，然后在接触模的两条带之间形成密封，同时将填充材料注入如此形成的胶囊体内。最后，模的持续旋转从条带中切下新形成的胶囊。

随后将软明胶胶囊剂分成两批，使每批在两个步骤中干燥。首先，一批软明胶胶囊剂通过标准方法干燥，即置于约20% R.H.和20℃的滚筒干燥机中80分钟，干燥机具有强制通风，且空气取自外部环境。第二批软明胶胶囊剂通过较慢的方法干燥，即置于约20% R.H.和20℃的滚筒干燥机中122.5分钟，干燥机具有强制通风，空气取自外部环境。在第二步中，将每批软明胶胶囊剂置于托盘上，并堆叠在具有特定通风的干燥箱中，特定通风具有约20% R.H.和20℃的干燥和经调节的空气。将软胶囊明胶剂干燥至10 N的稳定硬度，使用Bareiss硬度检测器测量。

将每批制备的软明胶胶囊剂分成三组，其中一组贮存在有铝盖的深色玻璃瓶中，第二组贮存在三层泡罩袋中，第三组以“散装(bulk)”贮存中，意指将软明胶胶囊剂贮存在不通透的三层玻璃纸袋。将3组软明胶胶囊剂贮存在25℃下，贮存6个月后和18个月后评价参数，所述参数可靠地预测整个存放期菌株的后续稳定性。通过显微分析，对益生菌细胞结构和包覆物的完整性进行了分析。如果益生菌的细胞结构和包覆物保持完整，则有活力的益生菌能够定居。这种能力通过总活菌数(用cfu/g表示)测量，可在处理后通过粪便细菌组成分析来证实。制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂以提供在室温下保存期限为24个月的20亿CFU/胶囊(为两种菌株的总和)的目标。下表3示出所制备的软明胶胶囊剂的批次，表4和5示出稳定性评价的结果。

表 1

。

实施例 2

按照本发明制备含有微囊化益生菌的经碾磨的填充料。按照意大利专利申请号RM2009A000104所述方法，用聚甘油二硬脂酸酯(Plurol Stearique WL1009)单层包覆植物乳杆菌LP01和短双歧杆菌BR03。对于悬浮制剂，将大豆油加热至约65℃。然后将大豆卵磷脂和单硬脂酸甘油酯加入混合物中，使混合制剂冷却至低于25℃或约25℃。将微囊化益生菌悬浮于冷却的大豆油、单硬脂酸甘油酯和大豆卵磷脂的悬浮制剂中，在低于30℃混合10分钟。下表2示出填充料中存在的各种成分的量。然后使用3辊碾磨机将混合的填充料在低于30℃碾磨10分钟，并且在真空和氮气下使经碾磨的填充料通过间距为600微米的筛。

通过显微分析测试经碾磨的填充料内微囊化益生菌的初始稳定性以验证包覆物和益生菌细胞结构的完整性。包覆益生菌的数目计算为益生菌总数与未包覆益生菌数之差。这些试验结果显示与实施例1的经碾磨的填充料初始稳定性结果类似的初始稳定性，例如，益生菌的细胞结构或包覆物无显著损伤。因此，认为实施例2的经包封碾磨的填充料可具有与实施例1类似的结果。因此，实施例2不经包封，或进一步研究含有这类填充料的软明胶胶囊剂的稳定性。

表 2

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比较实施例 1

含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂按照实施例1的方法制备，不同之处在于将混合的填充料在不进行碾磨(附聚物减少)步骤的情况下进行包封。在不碾磨的情况下，所产生的软明胶胶囊剂品质较低，渗漏增加。可以其它方式增加另外的加工步骤以减少渗漏，但这些步骤可增加成本至商业上可能无法接受的数额。

随后将软明胶胶囊剂分成两批，将各部分在两个步骤中干燥。首先，一批软明胶胶囊剂通过标准方法干燥，即置于约20% R.H.和20℃的滚筒干燥机中48分钟，干燥机具有强制通风，且空气取自外部环境。第二批软明胶胶囊剂通过较慢的方法干燥，即置于约20% R.H.和20℃的滚筒干燥机中122.5分钟，干燥机具有强制通风，且空气取自外部环境。在第二步中，将每批的软明胶胶囊剂置于托盘上，并堆叠在具有特定通风的干燥箱中，特定通风具有干燥和经调节的空气。将软明胶胶囊剂干燥至9 N的稳定硬度，使用Bareiss硬度检测器测量。

将每批制备的软明胶胶囊剂分成三组，其中一组贮存在有铝盖的深色玻璃瓶中，第二组贮存在三层泡罩袋中，第三组以“散装”贮存。将3组软明胶胶囊剂贮存在25℃下，贮存6个月和18个月后评价参数，所述参数可靠地预测整个存放期菌株的后续稳定性。通过显微分析，测试益生菌细胞结构和包覆物的完整性。包覆益生菌的数目计算为益生菌总数与未包覆益生菌数目之差。如果益生菌的细胞结构和包覆物保持完整，则有活力的益生菌能够定居。

制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂，以提供在室温下保存期限为24个月时20亿CFU/胶囊(为两种菌株的总和)的目标。下表3示出所制备的软明胶胶囊剂的批次，表4和5分别示出6个月和18个月后稳定性评价的结果。

表 3

表 4

*实际贮存持续时间为209天。

表 5

*实际贮存持续时间为560天。

表4中所示6个月后和表5中所示18月后的稳定性数据说明，碾磨后软明胶胶囊剂中的益生菌的稳定性一般比未碾磨样品中的益生菌高，且碾磨对稳定性的影响比干燥类型大。每种所选择的包装类型提供针对氧化和对稳定性的其它可能有害作用的合适防护。表4还显示在6个月时保持高百分比的包覆细胞(>90%)。同样地，表5显示所测试的各包装类型在18个月时保持高百分比的包覆细胞(>88%)。这就表明甚至在18个月后，存在的有活力的细胞仍非常健壮。

此外，上述结果表明与无碾磨的制备方法相比，本发明的碾磨并未对益生菌上的包覆物造成更多损坏(比较实施例1)。因为碾磨是制备商业上可接受的软明胶胶囊剂的方法中的重要步骤，例如维持合理成本，减少渗漏等，所以不损坏益生菌上的包覆物的碾磨是本发明的重要益处。

实施例 3

按照实施例1的方法制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂，但在整批放大(full batch scale up)的基础上。使用大规模混合设备将软明胶胶囊混合。对填充材料进行真空除气，在氮气下中止真空。该过程有利于避免最终产品中的截留气体(主要为氧气)，这进而意味着包封后任何潜在残余氧气的氧化减少。另外，该过程有助于确保胶囊间剂量含量的一致性。然后将这种填充材料包封，并采用标准方法干燥，即将软明胶胶囊剂置于约20% R.H.和20℃的滚筒干燥机中135分钟，干燥机具有强制通风，且空气取自外部环境。在第二干燥步骤中，将每批的软明胶胶囊剂置于托盘上，并堆叠在具有特定通风的干燥箱中，特定通风具有干燥和经调节的空气。将软明胶胶囊剂干燥至9 N的稳定硬度(使用Bareiss硬度检测器测量)和小于20% ERH (平衡相对湿度)。

将经干燥的软明胶胶囊剂分成3组，其中一组贮存在有铝盖的深色玻璃瓶中，第二组贮存在三层泡罩袋中，第三组贮存在塑料Duma容器中。将3组软明胶胶囊剂贮存在25℃下3个月，并评价参数以评估其健壮性。通过显微分析，测试益生菌细胞结构和包覆物的完整性。包覆益生菌的数目计算为益生菌总数与未包覆益生菌数之差。如果益生菌的细胞结构和包覆物保持完整，则有活力的益生菌能够定居。制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂以提供在室温下保存期限为24个月时20亿CFU/胶囊(为两种菌株的总和)的目标。

表6显示实施例3的加工、干燥和包装。为了测试实施例3的批次的健壮性，在大规模批次的制备过程中以及贮存1个月和3个月后采集样品以表明通过精细加工(表7)和通过选择性包装(表8)获得的提高的稳定性。小心控制并监测温度和混合速度。

表 6

表 7

表 8

**实际贮存持续时间为87天。

表8说明，在整批放大后，在贮存1个月和3个月后保持80%以上的包覆细胞。在将实施例1贮存后剩余的包覆细胞的百分比(见表4和5)与实施例3贮存后剩余的包覆细胞的百分比比较时，总是认为在将所述方法放大时百分比有某种减少。此处得到的结果是阳性的，因为在贮存3个月后仍保持80%以上(表8)。因此，整批放大并未显著负面影响益生菌的存活力。

实施例 4

按照实施例3的方法制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂，不同之处在于将3组(其中一组贮存在有铝盖的深色玻璃瓶中、第二组贮存在三层泡罩袋中、第三组贮存在塑料Duma容器中)各自再分成3个亚组，其中1个亚组贮存在25℃下3个月，第2亚组贮存在30℃下3个月，第3亚组贮存在33℃下3个月。

表 9

表 10

表9和表10示出贮存期间的温度影响益生菌菌株的存活力，例如，33℃和33℃以上温度对益生菌菌株的存活力有明显的影响，但是不影响包覆物效率(%)。因此，需要小心控制贮存期间的温度和能量参数。由此可理解的是，在其它加工步骤(例如碾磨)期间，温度也影响菌株的存活力，应小心控制以保持在33℃以下。例如，表7显示在整批放大期间，填充料的温度不超过25℃，该受控参数有利于益生菌菌株更长期的稳定性。

根据所采集的数据，整批放大的结果(实施例3)证实本公开内容的软明胶胶囊剂制备方法的优良稳健性。总之，益生菌菌株的稳定性与包覆物的完整性明确相关，正如温度对菌株稳定性影响的研究所证实的一样(实施例4)。温度升高时，未包覆细胞降解，而在37℃下1个月后，剩余的活菌株几乎全是包覆的(>90%)。设计包覆物以将益生菌菌株递送至肠中，并允许其定居体温下的肠中。温度和湿度提高可在其到达既定定居部位前，过早激活益生菌菌株，这可导致不能在目标部位定居，继而导致不能向体内递送既定益处。

总之，根据对所采集数据的整体分析，看来按照本公开内容加工的令人满意的量的益生菌可在整个保存期限保持活力。可从该数据认为，可在到期时仍保持至少20亿CFU/胶囊的活细胞总数(各菌株10亿)。未包覆细菌量1/5的微囊化益生菌的浓度能够以相同有效性定居人肠中。另外，在将微囊化益生菌递送到肠的既定定居部位时，它们的定居可能性是未包覆益生菌的5倍。参见Del Piano，M.等(2010)，Evaluation of the intestinal colonization by microencapsulated probiotic bacteria in comparison to the same uncoated strains (通过微囊化益生菌与相同的未包覆菌株相比较评价肠定居), Journal of Clinical Gastroenterology, 44 Supp.1: S42-6。

因此，本发明方法有多个优势。所得含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂具有预料不到的稳定性(例如CFU)和用于将益生菌更好地递送到人消化系统的包覆益生菌数目。

本文公开的优选实施方案的许多改变、修改和变化对本领域技术人员而言是显然的，且预计和考虑它们全部落入所要求保护的发明的精神和范围内。例如，虽然详细地描述了具体的实施方案，但本领域技术人员应了解，可对前述实施方案和变化进行修饰以加入各种类型的取代、额外的或备选的材料。因此，即使本文仅描述了本发明的少量变化，但是要理解这类另外的修改和变化及其等同内容均落入随附权利要求书限定的本发明的精神和范围内。本文引述的所有专利申请、专利和其它出版物均通过引用以其整体结合。

Claims

1. 制备含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂的方法，所述方法包括以下步骤：

(a) 提供具有至少一种包覆物的微囊化益生菌，所述包覆物包含至少一种熔点介于约35℃与约75℃之间的植物脂质；

(b) 将所述微囊化益生菌悬浮于悬浮制剂中以制备填充料；

(c) 在低强度和低温下混合填充料以制备混合的填充料；

(d) 减少所述混合的填充料中微囊化益生菌的附聚物以制备解附聚填充料；和

(e) 将所述解附聚填充料包封在软明胶胶囊中，

其中保持所述微囊化益生菌的包覆物的完整性。

2. 权利要求1的方法，其中所述方法在控制氧气暴露的同时进行。

3. 权利要求2的方法，其中所述含有微囊化益生菌的软明胶胶囊剂在室温下稳定至少约24个月。

4. 权利要求1的方法，其中通过在低于约33℃的温度下碾磨所述混合的填充料来减少微囊化益生菌的附聚物。

5. 权利要求1的方法，其中包封后的微囊化益生菌保持平均颗粒直径尺寸介于约150至约250微米之间，且小于约550微米。

6. 权利要求5的方法，其中包封后的微囊化益生菌保持平均颗粒直径尺寸约200微米，且各微囊化益生菌的颗粒直径尺寸小于约500微米。

7. 权利要求1的方法，其中所述至少一种植物脂质选自聚甘油酯、氢化棕榈脂、甘油硬脂酸二棕榈酸酯、聚甘油-6-二硬脂酸酯及其组合。

8. 权利要求1的方法，其中所述悬浮制剂至少包含油、悬浮脂或乳化剂。

9. 权利要求8的方法，其中所述悬浮制剂包含至少一种油和至少一种选自悬浮脂、乳化剂及其组合的材料。

10. 权利要求8的方法，其中所述至少一种油选自大豆油、芥花籽油、向日葵油、澳洲坚果油、花生油、葡萄籽油、南瓜籽油、亚麻籽油、亚麻仁油、橄榄油、玉米油、红花油、芝麻油、松仁油、共轭亚油酸、扁桃油、桃仁油、杏仁油、胡桃油、菜籽油、覆盆子籽油、越橘籽油、酸果蔓籽油、石榴籽油和其它果实种子油、沙棘油、墨西哥油、紫苏油、二酰基甘油、植物衍生来源的ω3、二十碳五烯酸的发酵来源、二十二碳六烯酸的发酵来源、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸和其它ω3的组合的发酵来源、γ-亚麻酸和/或十八碳四烯酸的来源、分级分离的椰子油及其组合。

11. 权利要求8的方法，其中所述悬浮脂选自脂肪酸的甘油单酯、脂肪酸的甘油二酯、蜂蜡、单硬脂酸甘油酯、单/二油酸甘油酯、分级分离的棕榈油衍生物、氢化棕榈脂、氢化大豆油衍生物、植物脂、中链甘油三酯及其组合。

12. 权利要求8的方法，其中所述乳化剂选自卵磷脂、聚山梨醇酯、脱水山梨醇单油酸酯及其组合。

13. 权利要求1的方法，其中所述混合在介于约15℃与约32℃之间的温度下和在小于约3000 rpm的强度下进行。

14. 权利要求1的方法，其中所述附聚物的减少在保持温度低于约33℃和低湿度环境下进行，得到解附聚填充料。

15. 权利要求1的方法，所述方法还包括以下步骤：

(f) 将填充的软明胶胶囊剂双重干燥。

16. 权利要求15的方法，其中所述双重干燥由以下组成：将胶囊剂在强制通风的滚筒干燥机中干燥，接着将堆叠在干燥箱内托盘上的胶囊剂干燥，其中温度为约18℃-约25℃，相对湿度为约8%-约20%。

17. 按照权利要求1的方法制备的益生菌软明胶胶囊剂。

18. 权利要求17的益生菌软明胶胶囊剂，其中所述方法在控制氧气暴露的同时进行。

19. 权利要求18的益生菌软明胶胶囊剂，其中所述软明胶胶囊剂在室温下稳定至少约24个月。