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CN105891202B - 一种单组份tmb显色液及其制备方法 - Google Patents

一种单组份tmb显色液及其制备方法 Download PDF

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CN105891202B
CN105891202B CN201610391284.0A CN201610391284A CN105891202B CN 105891202 B CN105891202 B CN 105891202B CN 201610391284 A CN201610391284 A CN 201610391284A CN 105891202 B CN105891202 B CN 105891202B
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Abstract

本发明公开一种单组份TMB显色液，所述单组份TMB显色液包含TMB和L‑甲硫氨酸。本发明所述单组份TMB显色液添加了L‑甲硫氨酸作为抗氧化剂，可防止TMB的氧化，使本发明中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。同时，本发明还公开了所述单组份TMB显色液的制备方法。

Description

一种单组份TMB显色液及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种生物体外诊断试剂及其制备方法，尤其是一种TMB显色液及其制备方法。
背景技术
TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)是一种新型安全的色原试剂，作为过氧化物酶的新底物，在酶联免疫吸附检测(ELISA)中获得了广泛应用。底物产生一种可溶性淡蓝色的末端产物，可在370或630nm在分光光度计上读取。其适用于酶联免疫反应中的显色阶段的定量和定性分析。其检验的原理是：当标记在抗体或抗原上的酶与显色液中的TMB、双氧水等反应，加入终止液后溶液由无色变成黄色，黄色深浅反应ELISA体系中抗原抗体结合的多少，从而判断某种抗原或抗体的多少。在通过酶标仪测度吸光值，判断免疫反应的程度。
现有市售的酶联免疫试剂盒所采用TMB显色剂液分为两种，一种为双组份，分A液和B液，使用之前需要先混匀，由于在使用上易造成操作不方便，且混合后保存时间短等缺点，逐渐被第二种取代；第二种即为单组份TMB，操作方便，但目前市面上所使用的单组份TMB稳定性差，保存时间短，大部分的保存时间在3-6个月，且显色背景高，均一性不好。TMB为脂溶性化合物，难溶于水，且容易在空气环境中被氧化。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种TMB溶解度高、TMB溶液稳定性强、反应终止后结果能稳定保存一段时间、读数更加方便的单组份TMB显色液；同时，本发明还提供了所述单组份TMB显色液的制备方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种单组份TMB显色液，包含TMB，所述TMB显色液还包含L-甲硫氨酸。
TMB在显色反应中为供氢体，反应中除了在相关酶的催化下进行显色反应，容易被空气或溶液中存在的O2-和OH-氧化。本申请发明人在此基础上选择使用抗氧化剂阻止TMB的非酶氧化，在众多的抗氧化剂中，经过大量研究及试验发现，当选择L-甲硫氨酸作为TMB的抗氧化剂，不仅能够防止TMB被O2-和OH-氧化，而且能够提高TMB溶液的稳定性及检测的灵敏度。
作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.02～1g/L。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.1～0.3g/L。
作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含吐温80和羟丙基-β-环糊精。
本发明的单组份TMB显色液，通过引入吐温-80和羟丙基-β-环糊精助溶TMB，使本发明的单组份TMB显色液形成稳定的水溶液体系，同时羟丙基-β-环糊精有1个“内疏水、外亲水”的特殊立体环状结构，能够对脂溶性的TMB进行包合，从而提高TMB分子的水溶性、稳定性和抗氧化、抗光解能力，配合其它组分可使本发明在2-8℃下，能保存24个月。同时羟丙基-β-环糊精作为稳定剂，能使TMB显色液在强酸终止反应后，信号稳定时间更长。
作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。
作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述单组份TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L；所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-1g/L。
二甲基亚砜(DMSO)是一种含硫有机化合物，常温下为无色无臭的透明液体，是一种吸湿性的可燃液体。具有高极性、高沸点、热稳定性好、非质子、与水混溶的特性，能溶于乙醇、丙醇、苯和氯仿等大多数有机物，被誉为"万能溶剂"。采用磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液作为基础溶液，来溶解各物质成分。TMB在过氧化氢的存在下，被氧化成最终产物。
作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为10～20ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-0.4g/L。本发明人经过大量实验研究发现，各物质在此含量范围内，TMB显色液的各项性能达到最优。
作为本发明所述单组份TMB显色液的优选实施方式，所述TMB显色液的pH为2.5-4.8。作为本发明所述单组份TMB显色液的更优选实施方式，所述TMB显色液的pH为3.8-4.2。
同时，本发明还提供一种如上所述单组份TMB显色液的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用HCl调节pH至2.5～3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
(2)称取吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步骤(1)所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；
(3)称取TMB，加入DMSO，使之充分溶解；
(4)将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；
(5)在步骤(4)所得溶液的上液中加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解；
(6)用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容；
(7)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
作为本发明所述单组份TMB显色液的制备方法的优选实施方式，所述步骤(6)中用稀盐酸调节pH至3.8～4.2，然后再加纯水定容。
本发明所述单组份TMB显色液，通过抗氧化剂L-甲硫氨酸的使用，可防止TMB的氧化，使本发明中的TMB能稳定保存24个月，同时，在终止反应后能稳定放置3小时以上，与现有TMB需在终止反应后30min内读数更加方便，更具灵活性。本发明所述单组份TMB显色液的制备方法，操作方便，能够快速高效制备得到本发明的单组份TMB显色液。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.1g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为4g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为2.5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.3g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为20ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.1mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1ml/L。
本实施例所述单组份TMB显色液采用以下方法制备而成：
(1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：将称量好的磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用HCl调节pH至2.5～3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
(2)将称量好的吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步骤(1)所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；
(3)将称量好的TMB，加入到量取好的DMSO中，使之充分溶解；
(4)将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；
(5)在步骤(4)所得溶液的上液中加入量取好的过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解；
(6)用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容至1000ml；
(7)过滤获得均一的溶液，即为本实施例所述一种单组份TMB显色液。
实施例2
本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.2g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为6g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为4g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.2g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为15ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.08mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.04mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.1ml/L。
本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
实施例3
本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.4g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为10g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为5g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.1g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为10ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.03mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.2ml/L。
本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
实施例4
本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.6g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为1g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为2g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为1g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为40ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.1mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.03mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.25ml/L。
本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
实施例5
本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.8g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为8g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为6g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.5g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为30ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.04mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.15ml/L。
本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
实施例6
本发明单组份TMB显色液的一种实施例，本实施例所述单组份TMB显色液包含以下成分：TMB、吐温80、羟丙基-β-环糊精、L-甲硫氨酸、DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸、过氧化氢；其中，所述TMB在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为1g/L，所述吐温80在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为15g/L，所述羟丙基-β-环糊精在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为9g/L，所述L-甲硫氨酸在所述单组份TMB显色液中的质量浓度为0.02g/L，所述DMSO在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为5ml/L，所述磷酸氢二钠在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.08mol/L，所述柠檬酸在所述单组份TMB显色液中的摩尔浓度为0.05mol/L，所述过氧化氢在所述单组份TMB显色液中的体积浓度为1.05ml/L。
本实施例所述单组份TMB显色液采用如实施例1所述方法制备而成。
实施例7
本发明所述单组份TMB显色液和商品化TMB显色液的显色效果对比测试
本实施例分别设置对照组1～2、试验组1～6，所述对照组的TMB显色液采用商品化的TMB显色液，直接购买于市场(对照组1的TMB显色液购买自杭州联科生物技术股份有限公司，Substrate TMB；对照组2的TMB显色液购买自深圳欣博盛生物科技有限公司，显色底物(TMB))。所述试验组1～6的TMB显色液分别采用实施例1～6制备而成的TMB显色液。
采用如下具体实验方法进行本发明所述TMB显色液和对照组TMB显色液的显色效果对比测试：
(1)于空白测试板中加入100μL商品化的HRP(用0.01M PBS稀释成一定的浓度梯度)，同时设置未含HRP的空白对照组；
(2)各孔分别加入100μL对照组1～2、试验组1～6的TMB显色液，室温避光静置15min；
(3)各孔加入50μL终止液，轻微平行振荡30秒；
(4)于450nm波长处读取各孔OD值，结果如表1所示。
表1本发明所述TMB显色液和商品化TMB显色液各组的OD值
从以上结果可以看出，当HRP稀释比例相同时，对照组1～2和试验组1～6中各孔的OD值相当，由此可以看出，本发明所述的TMB显色液与商品化的TMB显色液的显色效果相当。
实施例8
本发明TMB显色液的稳定性试验
试验设置对照组1～3和试验组1～6，试验组1～6分别采用实施例1～6制备得到的TMB显色液，对照组1～3的显色液配方分别如下：
对照组1的TMB显色液除不含L-甲硫氨酸外，其余成分及含量均与本发明相同；
对照组2的TMB显色液除不含吐温80外，其余成分及含量均与本发明相同；
对照组3的TMB显色液除不含羟丙基-β-环糊精外，其余成分及含量均与本发明相同。
对照组1～3的TMB显色液均采用本发明的方法制备而成。
分别将对照组1～3和试验组1～6的TMB显色液在常温下放置1个月，然后观察各组TMB显色液的澄明度和颜色，结果如表2所示。
表2各组TMB显色液放置1个月后的澄明度和颜色
组别 澄明度 颜色
对照组1 澄清液体 淡蓝色
对照组2 有结晶析出 无色
对照组3 有结晶析出 无色
试验组1 澄清液体 无色
试验组2 澄清液体 无色
试验组3 澄清液体 无色
试验组4 澄清液体 无色
试验组5 澄清液体 无色
试验组6 澄清液体 无色
由表2可看出，L-甲硫氨酸的加入可有效防止TMB的非酶氧化，提高TMB溶液的稳定性。而只含有吐温80和羟丙基-β-环糊精中一种的对照组2和3，放置一个月后会有结晶析出，即对照组2和3的TMB显色液放置1个月后有TMB析出，而同时含有吐温80和羟丙基-β-环糊精的试验组和对照组1，放置1个月后液体仍然澄清无结晶，由此可证明，吐温80和羟丙基-β-环糊精的加入具有相互作用的协同作用，能够显著提高TMB的水溶性。
实施例9
本发明所述TMB显色液的显色信号稳定性测试。
试验设置对照组1～3和试验组1～6，对照组1～3和试验组1～6同实施例8。
测试方法为：
(1)于空白测试板中加入100μL商品化的HRP(用0.01M PBS稀释成一定的浓度梯度)，同时设置未含HRP的空白对照组；
(2)各孔分别加入100μL对照组1～2、试验组1～6的TMB显色液，室温避光静置15min；
(3)各孔加入50μL终止液终止反应后，于0h、0.5h、1h、2h、3h进行OD450检测，各孔每次的OD值如下表所示。
表3各组反应终止后随着放置时间的不同各组OD值的变化情况对比
由以上结果可知，对照组1～3的TMB显色液在反应终止后3h内OD值的变化率为50％～70％，试验组1～6的TMB显色液在反应终止后3h内OD值的变化率最大不超过7.50％，由此可以得出，本发明所述的单组份TMB显色液可以在反应后稳定保存3h，与现有TMB需要在反应终止后30min内读数更加方便，更具灵活性。
实施例10
本发明所述TMB显色液的稳定性测试。
本试验分为试验组1～6，六组试验组中的TMB显色液分别为实施例1～6中所述的TMB显色液。试验方法为将实施例1～6中所述的TMB显色液分别放置于2-8℃环境下，保存至0个月、6个月、12个月、18个月、24个月，然后按照实施例7中所述的方法进行试验。其中空白对照组为不含HRP的PBS为样本。各组的OD值测试结果表4所示。
表4本发明所述TMB显色液的稳定性测试
由以上结果可以看出，本发明所述的单组份TMB显色液放置至0个月、6个月、12个月、18个月、24个月后其数值变化率最大不超过7.0％，表明本发明所述的TMB显色液稳定性良好，可以在2-8℃下稳定保存24个月。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种单组份TMB显色液，包含TMB，其特征在于，所述单组份TMB显色液还包含L-甲硫氨酸、吐温80和羟丙基-β-环糊精,所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.02～1g/L，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为1～15g/L，所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2～9g/L；
所述TMB显色液还包含DMSO、磷酸氢二钠、柠檬酸和过氧化氢；所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为5～40ml/L；所述磷酸氢二钠在TMB显色液中的摩尔浓度为0.05-0.1mol/L；所述柠檬酸在TMB显色液中的摩尔浓度为0.03-0.05mol/L；所述过氧化氢在TMB显色液中的体积浓度为1-1.25ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-1g/L。
2.如权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述L-甲硫氨酸在TMB显色液中的质量浓度为0.1～0.3g/L。
3.如权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述吐温-80在TMB显色液中的质量浓度为4～10g/L；所述羟丙基-β-环糊精在TMB显色液中的质量浓度为2.5～5g/L。
4.如权利要求1所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述DMSO在TMB显色液中的体积浓度为10～20ml/L；所述TMB在所述TMB显色液中的质量浓度为0.1-0.4g/L。
5.如权利要求1～4任一项所述的单组份TMB显色液，其特征在于，所述TMB显色液的pH为2.5-4.8。
6.一种如权利要求1～5任一项所述单组份TMB显色液的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)配制磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液：称取磷酸氢二钠、柠檬酸溶于去离子水中，用HCl调节pH至2.5～3.0，即得磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
(2)称取吐温-80、羟丙基-β-环糊精和L-甲硫氨酸，边搅拌边将其加入到步骤(1)所得的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液中，将其溶解直到溶液不再含有微小颗粒；
(3)称取TMB，加入DMSO，使之充分溶解；
(4)将步骤(3)所得的溶液加入步骤(2)所得的溶液中，充分搅拌，直到溶液不再含有微小颗粒；
(5)在步骤(4)所得溶液中加入过氧化氢，边加入边搅拌，使之充分溶解；
(6)用稀盐酸调节pH至2.0-4.8，加纯水定容；
(7)过滤获得均一的溶液，即为单组份TMB显色液。
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