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CN103038344A - Fc结合性蛋白质及其制造方法 - Google Patents

Fc结合性蛋白质及其制造方法 Download PDF

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CN103038344A
CN103038344A CN2011800235995A CN201180023599A CN103038344A CN 103038344 A CN103038344 A CN 103038344A CN 2011800235995 A CN2011800235995 A CN 2011800235995A CN 201180023599 A CN201180023599 A CN 201180023599A CN 103038344 A CN103038344 A CN 103038344A
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CN
China
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seq
replaced
binding proteins
serine
leucine
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CN2011800235995A
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畑山耕太
朝冈义晴
田中亨
井出辉彦
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Central Chemical Research Institute Of Public Welfare Foundation
Tosoh Corp
Original Assignee
Central Chemical Research Institute Of Public Welfare Foundation
Tosoh Corp
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Abstract

本发明提供与野生型相比对热、酸和/或碱的稳定性提高的Fc结合性蛋白质及其制造方法，此外，还提供将该蛋白质用作亲和色谱用配体，特异性地分离包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的方法。解决方法：通过将野生型人Fc受体的处于细胞外区域的1个以上的特定氨基酸残基取代成其他氨基酸残基，能够得到与野生型人Fc受体相比、对热、酸和/或碱的稳定性提高的Fc结合性蛋白质。本发明的Fc结合性蛋白质通过例如固定化于固相，作为亲和色谱用配体是有用的。此外，使用用包含编码本发明的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的表达载体转化的宿主，表达该蛋白质，则与使用野生型人Fc受体的情况相比，蛋白质的生产量提高。

Description

Fc结合性蛋白质及其制造方法
技术领域
本发明涉及对免疫球蛋白具有亲和性的Fc结合性蛋白质。更具体地，本发明涉及能够作为例如亲和色谱用免疫球蛋白亲和性配体使用的、与野生型相比显示高热稳定性等特性的Fc结合性蛋白质、该蛋白质的制造方法、和使用该蛋白质作为构成要素的、吸附例如免疫球蛋白的吸附材料。
背景技术
来自免疫球蛋白G(以下也称为IgG)的免疫信号通过抗原捕捉后的IgG与存在于免疫细胞表面的Fc受体结合而被传导。Fc受体是与IgG的Fc区域结合的一组蛋白质分子，各个分子种类具有属于免疫球蛋白超家族的Fc识别结构域，识别单一种类、或属于同一亚型的免疫球蛋白。由此确定各个免疫应答中哪种辅助细胞被动员(非专利文献1)。Fc受体还可以再分成亚型，作为针对IgG的受体，已经报告存在FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIII(非专利文献1)。这其中，FcγRI与IgG的结合亲和性高，其平衡解离常数(KD)为10-8M以下(非专利文献2)。
FcγRI大体分为信号肽区域、细胞外区域、跨细胞膜区域、和细胞质内区域，与IgG的结合发生在IgG的Fc区域和FcγRI的细胞外区域，然后两者结合的信号传导至细胞质内。FcγRI由与IgG的结合直接相关的α链、以及γ链这2种亚基构成，γ链通过位于跨细胞膜区域与细胞外区域的交界处的半胱氨酸介导的共价键形成同型二聚体(非专利文献1)。FcγRI的α链的氨基酸序列和基因碱基序列已由非专利文献3阐明，其后报告了通过基因重组技术以大肠杆菌(专利文献1)或动物细胞作为宿主细胞进行表达的例子(非专利文献4)。
如前述，构成FcγRI的细胞外区域的蛋白质(以下也称为Fc结合性蛋白质)基于高度的亲和性具有针对人抗体的良好的识别功能。在该高度的亲和性的基础上，对于Fc结合性蛋白质，已经报告了作为诊断试剂、抗体医药品的研究用工具或IgG等抗体医药品的制造步骤中利用的亲和色谱的配体加以应用的方法(专利文献1)。
Fc结合性蛋白质是以在人体内发挥功能的蛋白质作为起源的蛋白质，与细菌的细胞表层等生物体外存在的蛋白质相比，因热、极端pH变化等而引起蛋白质变性的倾向强。另一方面，在将Fc结合性蛋白质作为用于IgG制备的亲和色谱用配体使用的情况下，在使用固定化有该配体的凝胶对通过色谱操作吸附的IgG进行洗脱时，该配体有时会暴露于柠檬酸缓冲液等低pH的溶液，因而该Fc结合性蛋白质需要对酸的稳定性。此外，在对该凝胶进行洗涤或再生的情况下，该配体还有时会暴露于氢氧化钠溶液等高pH溶液，因而该Fc结合性蛋白质又需要对碱的稳定性。而且，考虑到该凝胶的长期保存，该Fc结合性蛋白质还需要对热的稳定性。
为了对蛋白质这样的生物体物质进行工业利用，有些情况下也需要通过对该生物体物质具有的天然结构进行改良，来重新制作在一定条件下稳定的物质。对于酶蛋白质等，已经报告了许多向其编码多核苷酸中人工导入突变，进行筛选后，取得获得了需要的性状的突变体的例子。然而，对于作为受体蛋白质的Fc结合性蛋白质，没有对热、酸或碱的稳定性提高的改良体的报告，迄今为止没有工业利用的例子。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：特表2002-531086号公报
非专利文献
非专利文献1：J.V.Ravetch等，Annu.Rev.Immunol.，9，457，1991
非专利文献2：Toshiyuki Takai，Jpn.J.Clin.Immunol.，28，318，2005
非专利文献3：J.M.Allen等，Science，243，378，1989
非专利文献4：A.Paetz等，Biochem.Biophys.Res.Commun.，338，1811，2005
非专利文献5：タンパク質の構造と機能，メデイカル·サイエンス·インタ一ナシヨナル社，9，2005
非专利文献6：Molecular Cloning，Cold Spring Horbor Laboratory，256，1992
发明内容
发明所要解决的问题
本发明提供与野生型的人Fc受体FcγRI相比，对热、酸和/或碱的稳定性提高了的Fc结合性蛋白质及其制造方法。此外，本发明还提供使用该蛋白质作为亲和色谱用配体，特异性地分离含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的方法。
解决问题的方法
本发明人对上述课题进行了深入研究，结果发现：确定Fc结合性蛋白质中涉及结构稳定性的氨基酸残基，将该氨基酸残基取代成其他氨基酸残基而得到的突变体具有对热、酸和/或碱的良好稳定性，且作为亲和色谱用配体是有用的，从而完成了本发明。
即，本申请包含以下的(A)~(K)记载的方案：
(A)一种Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的第16位至第289位的氨基酸，且该第16位至第289位的氨基酸序列中发生了以下(1)~(168)中的至少1个氨基酸取代：
(1)SEQ ID NO：1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸
(2)SEQ ID NO：1的第25位的苏氨酸被取代成赖氨酸
(3)SEQ ID NO：1的第38位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(4)SEQ ID NO：1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸
(5)SEQ ID NO：1的第62位的丙氨酸被取代成缬氨酸
(6)SEQ ID NO：1的第63位的苏氨酸被取代成异亮氨酸
(7)SEQ ID NO：1的第69位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸或苏氨酸
(8)SEQ ID NO：1的第71位的精氨酸被取代成组氨酸
(9)SEQ ID NO：1的第77位的缬氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸
(10)SEQ ID NO：1的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(11)SEQ ID NO：1的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸
(12)SEQ ID NO：1的第100位的异亮氨酸被取代成缬氨酸
(13)SEQ ID NO：1的第110位的丝氨酸被取代成天冬酰胺
(14)SEQ ID NO：1的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸
(15)SEQ ID NO：1的第125位的组氨酸被取代成精氨酸
(16)SEQ ID NO：1的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸
(17)SEQ ID NO：1的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸
(18)SEQ ID NO：1的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(19)SEQ ID NO：1的第160位的异亮氨酸被取代成甲硫氨酸
(20)SEQ ID NO：1的第163位的天冬酰胺被取代成丝氨酸
(21)SEQ ID NO：1的第195位的天冬酰胺被取代成苏氨酸
(22)SEQ ID NO：1的第199位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(23)SEQ ID NO：1的第206位的天冬酰胺被取代成赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸
(24)SEQ ID NO：1的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(25)SEQ ID NO：1的第218位的亮氨酸被取代成缬氨酸
(26)SEQ ID NO：1的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(27)SEQ ID NO：1的第248位的亮氨酸被取代成丝氨酸
(28)SEQ ID NO：1的第283位的亮氨酸被取代成组氨酸
(29)SEQ ID NO：1的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺
(30)SEQ ID NO：1的第17位的缬氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸
(31)SEQ ID NO：1的第19位的苏氨酸被取代成异亮氨酸
(32)SEQ ID NO：1的第20位的苏氨酸被取代成异亮氨酸
(33)SEQ ID NO：1的第25位的苏氨酸被取代成甲硫氨酸或精氨酸
(34)SEQ ID NO：1的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或赖氨酸
(35)SEQ ID NO：1的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸
(36)SEQ ID NO：1的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸
(37)SEQ ID NO：1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸
(38)SEQ ID NO：1的第42位的组氨酸被取代成亮氨酸
(39)SEQ ID NO：1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸
(40)SEQ ID NO：1的第45位的缬氨酸被取代成丙氨酸
(41)SEQ ID NO：1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或色氨酸
(42)SEQ ID NO：1的第47位的组氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺
(43)SEQ ID NO：1的第49位的脯氨酸被取代成丝氨酸或丙氨酸
(44)SEQ ID NO：1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸
(45)SEQ ID NO：1的第51位的丝氨酸被取代成丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸
(46)SEQ ID NO：1的第52位的丝氨酸被取代成甘氨酸
(47)SEQ ID NO：1的第53位的丝氨酸被取代成亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸
(48)SEQ ID NO：1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸
(49)SEQ ID NO：1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸
(50)SEQ ID NO：1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸
(51)SEQ ID NO：1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸
(52)SEQ ID NO：1的第61位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(53)SEQ ID NO：1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸
(54)SEQ ID NO：1的第63位的苏氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸
(55)SEQ ID NO：1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸
(56)SEQ ID NO：1的第65位的苏氨酸被取代成丙氨酸或缬氨酸
(57)SEQ ID NO：1的第66位的丝氨酸被取代成苏氨酸
(58)SEQ ID NO：1的第67位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(59)SEQ ID NO：1的第69位的丝氨酸被取代成丙氨酸
(60)SEQ ID NO：1的第70位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸
(61)SEQ ID NO：1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸
(62)SEQ ID NO：1的第73位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(63)SEQ ID NO：1的第74位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸
(64)SEQ ID NO：1的第76位的丝氨酸被取代成天冬酰胺
(65)SEQ ID NO：1的第77位的缬氨酸被取代成天冬氨酸或赖氨酸
(66)SEQ ID NO：1的第78位的天冬酰胺被取代成丝氨酸或甘氨酸
(67)SEQ ID NO：1的第80位的丝氨酸被取代成丙氨酸
(68)SEQ ID NO：1的第84位的精氨酸被取代成丝氨酸
(69)SEQ ID NO：1的第88位的甘氨酸被取代成丝氨酸
(70)SEQ ID NO：1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸
(71)SEQ ID NO：1的第90位的丝氨酸被取代成甘氨酸
(72)SEQ ID NO：1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸
(73)SEQ ID NO：1的第96位的异亮氨酸被取代成缬氨酸或赖氨酸
(74)SEQ ID NO：1的第97位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸或赖氨酸
(75)SEQ ID NO：1的第101位的组氨酸被取代成亮氨酸
(76)SEQ ID NO：1的第102位的精氨酸被取代成丝氨酸或亮氨酸
(77)SEQ ID NO：1的第103位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或丝氨酸
(78)SEQ ID NO：1的第111位的丝氨酸被取代成丙氨酸
(79)SEQ ID NO：1的第114位的苯丙氨酸被取代成丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸
(80)SEQ ID NO：1的第115位的苏氨酸被取代成异亮氨酸或苯丙氨酸
(81)SEQ ID NO：1的第118位的谷氨酸被取代成天冬氨酸
(82)SEQ ID NO：1的第121位的丙氨酸被取代成苏氨酸或缬氨酸
(83)SEQ ID NO：1的第128位的赖氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸
(84)SEQ ID NO：1的第129位的天冬氨酸被取代成甘氨酸
(85)SEQ ID NO：1的第131位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺
(86)SEQ ID NO：1的第133位的酪氨酸被取代成组氨酸或精氨酸
(87)SEQ ID NO：1的第134位的天冬酰胺被取代成丝氨酸
(88)SEQ ID NO：1的第137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸
(89)SEQ ID NO：1的第138位的酪氨酸被取代成组氨酸
(90)SEQ ID NO：1的第139位的精氨酸被取代成组氨酸
(91)SEQ ID NO：1的第140位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(92)SEQ ID NO：1的第141位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或缬氨酸
(93)SEQ ID NO：1的第142位的赖氨酸被取代成谷氨酸或精氨酸
(94)SEQ ID NO：1的第144位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸
(95)SEQ ID NO：1的第147位的苯丙氨酸被取代成丝氨酸
(96)SEQ ID NO：1的第148位的组氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺
(97)SEQ ID NO：1的第149位的色氨酸被取代成精氨酸
(98)SEQ ID NO：1的第151位的丝氨酸被取代成苏氨酸
(99)SEQ ID NO：1的第152位的天冬酰胺被取代成苏氨酸、异亮氨酸或脯氨酸
(100)SEQ ID NO：1的第154位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(101)SEQ ID NO：1的第156位的亮氨酸被取代成组氨酸
(102)SEQ ID NO：1的第157位的赖氨酸被取代成精氨酸
(103)SEQ ID NO：1的第159位的天冬酰胺被取代成苏氨酸或天冬氨酸
(104)SEQ ID NO：1的第160位的异亮氨酸被取代成苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸
(105)SEQ ID NO：1的第161位的丝氨酸被取代成苏氨酸
(106)SEQ ID NO：1的第165位的苏氨酸被取代成甲硫氨酸
(107)SEQ ID NO：1的第171位的甲硫氨酸被取代成苏氨酸
(108)SEQ ID NO：1的第173位的赖氨酸被取代成精氨酸
(109)SEQ ID NO：1的第174位的组氨酸被取代成谷氨酰胺
(110)SEQ ID NO：1的第177位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(111)SEQ ID NO：1的第181位的异亮氨酸被取代成苏氨酸
(112)SEQ ID NO：1的第182位的丝氨酸被取代成苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸或谷氨酸
(113)SEQ ID NO：1的第184位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(114)SEQ ID NO：1的第190位的脯氨酸被取代成丝氨酸
(115)SEQ ID NO：1的第193位的缬氨酸被取代成亮氨酸
(116)SEQ ID NO：1的第195位的天冬酰胺被取代成丙氨酸
(117)SEQ ID NO：1的第196位的丙氨酸被取代成丝氨酸
(118)SEQ ID NO：1的第198位的缬氨酸被取代成甘氨酸或甲硫氨酸
(119)SEQ ID NO：1的第199位的苏氨酸被取代成丙氨酸
(120)SEQ ID NO：1的第200位的丝氨酸被取代成甘氨酸或精氨酸
(121)SEQ ID NO：1的第202位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸
(122)SEQ ID NO：1的第203位的亮氨酸被取代成组氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸
(123)SEQ ID NO：1的第204位的谷氨酸被取代成缬氨酸
(124)SEQ ID NO：1的第207位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸
(125)SEQ ID NO：1的第209位的苏氨酸被取代成丙氨酸
(126)SEQ ID NO：1的第211位的丝氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸
(127)SEQ ID NO：1的第213位的谷氨酸被取代成缬氨酸或异亮氨酸
(128)SEQ ID NO：1的第215位的赖氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸
(129)SEQ ID NO：1的第217位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺
(130)SEQ ID NO：1的第218位的亮氨酸被取代成异亮氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸
(131)SEQ ID NO：1的第219位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或精氨酸
(132)SEQ ID NO：1的第223位的亮氨酸被取代成精氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸
(133)SEQ ID NO：1的第224位的谷氨酰胺被取代成精氨酸
(134)SEQ ID NO：1的第225位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺
(135)SEQ ID NO：1的第227位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸
(136)SEQ ID NO：1的第230位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸
(137)SEQ ID NO：1的第231位的甲硫氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸
(138)SEQ ID NO：1的第233位的丝氨酸被取代成甘氨酸或天冬酰胺
(139)SEQ ID NO：1的第234位的赖氨酸被取代成谷氨酸
(140)SEQ ID NO：1的第240位的天冬酰胺被取代成甘氨酸
(141)SEQ ID NO：1的第244位的谷氨酸被取代成缬氨酸
(142)SEQ ID NO：1的第245位的酪氨酸被取代成组氨酸或谷氨酸
(143)SEQ ID NO：1的第246位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或赖氨酸
(144)SEQ ID NO：1的第248位的亮氨酸被取代成异亮氨酸
(145)SEQ ID NO：1的第249位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(146)SEQ ID NO：1的第250位的丙氨酸被取代成缬氨酸
(147)SEQ ID NO：1的第251位的精氨酸被取代成丝氨酸
(148)SEQ ID NO：1的第252位的精氨酸被取代成组氨酸
(149)SEQ ID NO：1的第253位的谷氨酸被取代成甘氨酸
(150)SEQ ID NO：1的第257位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺
(151)SEQ ID NO：1的第261位的谷氨酸被取代成缬氨酸或丙氨酸
(152)SEQ ID NO：1的第262位的丙氨酸被取代成缬氨酸
(153)SEQ ID NO：1的第263位的丙氨酸被取代成丝氨酸
(154)SEQ ID NO：1的第264位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(155)SEQ ID NO：1的第265位的谷氨酸被取代成丙氨酸或甘氨酸
(156)SEQ ID NO：1的第268位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、异亮氨酸或苏氨酸
(157)SEQ ID NO：1的第270位的亮氨酸被取代成组氨酸、精氨酸或缬氨酸
(158)SEQ ID NO：1的第271位的赖氨酸被取代成精氨酸
(159)SEQ ID NO：1的第272位的精氨酸被取代成谷氨酰胺
(160)SEQ ID NO：1的第277位的谷氨酸被取代成缬氨酸
(161)SEQ ID NO：1的第279位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或组氨酸
(162)SEQ ID NO：1的第282位的甘氨酸被取代成天冬氨酸
(163)SEQ ID NO：1的第283位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(164)SEQ ID NO：1的第285位的亮氨酸被取代成精氨酸或组氨酸
(165)SEQ ID NO：1的第286位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸
(166)SEQ ID NO：1的第287位的苏氨酸被取代成异亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸或缬氨酸
(167)SEQ ID NO：1的第288位的脯氨酸被取代成丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸
(168)SEQ ID NO：1的第289位的缬氨酸被取代成丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
(B)(A)所述的Fc结合性蛋白质，其中，所述第16位至第289位的氨基酸序列中至少发生了所述(4)、(14)、(41)和(79)中的任一个所述的氨基酸取代。
(C)(B)所述的Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列中的第34位至第307位的氨基酸。
(D)(B)所述的Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列。
(E)编码(A)~(D)中的任一个所述的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
(F)包含(E)所述的多核苷酸的表达载体。
(G)用(F)所述的表达载体转化宿主而得到的转化体。
(H)(G)所述的转化体，其中，宿主是大肠杆菌。
(I)Fc结合性蛋白质的制造方法，其中，培养(G)或(H)所述的转化体来生产Fc结合性蛋白质，并从其培养物回收所产生的Fc结合性蛋白质。
(J)将(A)~(D)中的任一个所述的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到的、包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料。
(K)抗体纯化方法，其包括：(1)在将包含SEQ ID NO：114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到的、包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料中添加包含抗体的溶液，使该抗体吸附于该吸附材料的步骤；以及(2)使用pH3.0~4.5的缓冲液对吸附于所述吸附材料的所述抗体进行洗脱的步骤。
发明的效果
本发明的Fc结合性蛋白质是在野生型的人Fc受体FcγRI中将位于细胞外区域的1个以上特定氨基酸残基取代成其他氨基酸而成的蛋白质。与野生型的人FcγRI相比较，该蛋白质对热、酸和/或碱的稳定性提高。因而，通过将本发明的Fc结合性蛋白质用作亲和色谱用配体，能够稳定地对人IgG这样的抗体进行纯化。
此外，在通过对用包含编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸的表达载体转化宿主而得到的转化体进行培养，生产Fc结合性蛋白质，并从其培养物回收所产生的Fc结合性蛋白质的Fc结合性蛋白质的制造方法中，将本发明的Fc结合性蛋白质作为Fc结合性蛋白质使用，蛋白质生产性提高。因而，本发明在Fc结合性蛋白质在工业制造中也是有用的。
而且，与野生型的人FcγRI相比较，本发明的Fc结合性蛋白质对热、酸和/或碱的稳定性提高。因而，将本发明的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到的包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的吸附材料即使例如进行基于碱处理(例如100mM氢氧化钠水溶液)的再生处理，吸附性能也几乎不会劣化。因此，可以说本发明的吸附材料特别优选用于人IgG这样的抗体的大量纯化用途。
附图说明
[图1]显示人Fc受体FcγRI的结构的概略的图。
[图2]插入了编码人FcγRI的多核苷酸的质粒pUCFcR的结构概略图。
[图3]插入了编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR的制作概略图。
[图4]质粒pETMalE的结构概略图。
[图5]质粒pETFcR的结构概略图。
[图6]对用质粒pETFcR转化体表达的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性进行评价的图。
[图7]对Fc结合性蛋白质(FcRm4、FcRm6、FcRm8、FcRm19)的生产性进行评价的图。
[图8]对Fc结合性蛋白质(FcRm32)的生产性进行评价的图。
[图9]对Fc结合性蛋白质(FcRm32)的碱稳定性进行评价的图。
[图10]对Fc结合性蛋白质(FcRm36b)的生产性进行评价的图。
[图11]对Fc结合性蛋白质(FcRm36b)的碱稳定性进行评价的图。
[图12]对Fc结合性蛋白质(FcRm44)的生产性进行评价的图。
[图13]对Fc结合性蛋白质(FcRm44)的碱稳定性进行评价的图。
[图14]对Fc结合性蛋白质(FcRm48)的生产性进行评价的图。
[图15]对Fc结合性蛋白质(FcRm48)的碱稳定性进行评价的图。
[图16]对Fc结合性蛋白质(FcRm54b)的生产性进行评价的图。
[图17]对Fc结合性蛋白质(FcRm54b)的碱稳定性进行评价的图。
[图18]对Fc结合性蛋白质(FcRm56b)的生产性进行评价的图。
[图19]对Fc结合性蛋白质(FcRm56b)的碱稳定性进行评价的图。
[图20]对Fc结合性蛋白质(FcRm57b)的生产性进行评价的图。
[图21]对Fc结合性蛋白质(FcRm57b)的碱稳定性进行评价的图。
[图22]对Fc结合性蛋白质(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的生产性进行评价的图。
[图23]对Fc结合性蛋白质(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的碱稳定性进行评价的图。
[图24]对Fc结合性蛋白质的酸稳定性进行评价的图。
[图25]对Fc结合性蛋白质(FcRm19)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。
[图26]对Fc结合性蛋白质(FcRm32)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。
[图27]对Fc结合性蛋白质(FcRm36b)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。
[图28]对Fc结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。
[图29]对Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。
[图30]对Fc结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶的抗体洗脱性进行评价的图。
[图31]对Fc结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b、FcRm56b)固定化凝胶的碱稳定性进行评价的图。
[图32]对Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的重复稳定性进行评价的图。
发明的具体实施方式
以下，对本实施方式的Fc结合性蛋白质进行具体说明。
人Fc受体FcγRI的α链的结构示于图1。人Fc受体FcγRI的α链由下述区域构成：由N末端侧起15个氨基酸组成的信号肽区域(SS、SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第1位至第15位的区域)、由277个氨基酸组成的细胞外区域(EC、SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第16位至第292位的区域)、由21个氨基酸组成的跨细胞膜区域(TM、SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第293位至第313位的区域)、以及由61个氨基酸组成的细胞内区域(C、SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中第314位至第374位的区域)。
本实施方式的Fc结合性蛋白质包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中自第16位的谷氨酰胺至第292位的组氨酸的细胞外区域(图1的EC区域)中的至少自第16位的谷氨酰胺至第289位的缬氨酸的区域。此外，本实施方式的Fc结合性蛋白质可以包含处于EC区域的N末端侧的信号肽区域(图1的SS区域)的全部或一部分，也可以包含处于EC区域的C末端侧的跨膜区域(图1的TM区域)或细胞内区域(图1的C区域)。而且，本实施方式的Fc结合性蛋白质的N末端侧或C末端侧可以添加多组氨酸标签等用于进行纯化等的标签肽。
本实施方式的Fc结合性蛋白质是SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的处于作为细胞外区域(图1的EC区域)的一部分的第16位的谷氨酰胺~第289位的缬氨酸的区域中的氨基酸残基中的至少1个被取代成其他氨基酸残基而得到的多肽。通过该取代，与由SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列组成的野生型的人FcγRI相比，本实施方式的Fc结合性蛋白质的热稳定性、酸稳定性和/或碱稳定性显著提高，且作为亲和色谱用配体是有用的。例如，实施例中示例的Fc结合性蛋白质在43℃进行10分钟加热处理，或在70℃进行20分钟加热处理，或在pH3.0的酸条件下进行24小时处理，或在pH10的碱条件下53℃进行20分钟处理，仍保持着不低于未发生氨基酸取代的野生型的人FcγRI的抗体结合活性。
具体地，本实施方式的Fc结合性蛋白质包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中、至少第16位的谷氨酰胺至第289位的缬氨酸的区域的氨基酸序列。而且，该氨基酸序列是发生了Thr20Pro(该表示方式表示SEQ ID NO：1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸，以下相同)、Thr25Lys、Thr38Ala、Thr38Ser、Leu46Arg、Leu46Pro、Ala62Val、Thr63Ile、Ser69Phe、Ser69Thr、Arg71His、Val77Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Asp94Glu、Ile100Val、Ser110Asn、Phe114Leu、His125Arg、Leu131Arg、Leu131Pro、Trp149Leu、Leu156Pro、Ile160Met、Asn163Ser、Asn195Thr、Thr199Ser、Asn206Lys、Asn206Ser、Asn206Thr、Leu207Pro、Leu218Val、Asn240Asp、Leu248Ser、Leu283His、Leu285Gln、Val17Gly、Val17Glu、Thr19Ile、Thr20Ile、Thr25Met、Thr25Arg、Gln27Pro、Gln27Lys、Gln35Leu、Gln35Met、Gln35Arg、Glu36Gly、Leu41Met、His42Leu、Glu44Asp、Val45Ala、Leu46Ala、Leu46Asn、Leu46Asp、Leu46Gln、Leu46Gly、Leu46His、Leu46Lys、Leu46Ser、Leu46Trp、His47Gln、His47Leu、His47Asn、Pro49Ser、Pro49Ala、Gly50Arg、Gly50Glu、Ser51Ala、Ser51Thr、Ser51Leu、Ser51Pro、Ser51Val、Ser52Gly、Ser53Leu、Ser53Thr、Ser53Pro、Gln55Arg、Phe57Tyr、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr61Ala、Thr61Ser、Ala62Glu、Thr63Leu、Thr63Phe、Gln64Pro、Gln64His、Gln64Leu、Gln64Lys、Thr65Ala、Thr65Val、Ser66Thr、Thr67Ala、Thr67Ser、Ser69Ala、Tyr70His、Tyr70Phe、Arg71Tyr、Thr73Ala、Thr73Ser、Ser74Phe、Ser76Asn、Val77Asp、Val77Lys、Asn78Ser、Asn78Gly、Ser80Ala、Arg84Ser、Gly88Ser、Leu89Gln、Leu89Pro、Ser90Gly、Arg92Cys、Arg92Leu、Ile96Val、Ile96Lys、Gln97Leu、Gln97Lys、His101Leu、Arg102Ser、Arg102Leu、Gly103Asp、Gly103Ser、Ser111Ala、Phe114Ala、Phe114Ile、Phe114Met、Phe114Pro、Phe114Thr、Phe114Val、Thr115Ile、Thr115Phe、Glu118Asp、Ala121Thr、Ala121Val、Lys128Arg、Lys128Gly、Asp129Gly、Leu131Gln、Tyr133His、Tyr133Arg、Asn134Ser、Tyr137Phe、Tyr138His、Arg139His、Asn140Asp、Gly141Asp、Gly141Val、Lys142Glu、Lys142Arg、Phe144Ile、Phe147Ser、His148Arg、His148Gln、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Asn152Ile、Asn152Pro、Thr154Ser、Leu156His、Lys157Arg、Asn159Thr、Asn159Asp、Ile160Thr、Ile160Val、Ile160Leu、Ser161Thr、Thr165Met、Met171Thr、Lys173Arg、His174Gln、Thr177Ser、Ile181Thr、Ser182Thr、Ser182Leu、Ser182Val、Ser182Glu、Thr184Ser、Pro190Ser、Val193Leu、Asn195Ala、Ala196Ser、Val198Gly、Val198Met、Thr199Ala、Ser200Gly、Ser200Arg、Leu202Met、Leu203His、Leu203Gln、Leu203Tyr、Leu203Arg、Leu203Pro、Glu204Val、Leu207Gln、Leu207His、Leu207Arg、Thr209Ala、Ser211Arg、Ser211Gly、Glu213Val、Glu213Ile、Lys215Arg、Lys215Glu、Leu217Arg、Leu217Gln、Leu218Ile、Leu218Met、Leu218Lys、Gln219Pro、Gln219Arg、Leu223Arg、Leu223Gln、Leu223Met、Gln224Arg、Leu225Gln、Phe227Ile、Tyr230His、Tyr230Phe、Met231Lys、Met231Arg、Ser233Gly、Ser233Asn、Lys234Glu、Asn240Gly、Glu244Val、Tyr245His、Tyr245Glu、Gln246Arg、Gln246Lys、Leu248Ile、Thr249Ala、Thr249Ser、Ala250Val、Arg251Ser、Arg252His、Glu253Gly、Leu257Arg、Leu257Gln、Glu261Val、Glu261Ala、Ala262Val、Ala263Ser、Thr264Ser、Glu265Ala、Glu265Gly、Asn268Ser、Asn268Ile、Asn268Thr、Leu270His、Leu270Arg、Leu270Val、Lys271Arg、Arg272Gln、Glu277Val、Gln279Arg、Gln279His、Gly282Asp、Leu283Pro、Leu285Arg、Leu285His、Pro286Gln、Pro286Arg、Pro286Glu、Thr287Ile、Thr287Pro、Thr287Ala、Thr287Val、Pro288Ala、Pro288Ser、Pro288Thr、Val289Ala、Val289Asp、Val289Gly、Val289Leu和Val289Ile中的1个以上的任意取代的多肽。
此外，在上述取代中，若发生Thr20Pro、Thr25Lys、Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ile100Val、Phe114Leu、Ile160Met、Asn163Ser、Asn195Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His和Leu285Gln中的1个以上的任意取代，则热稳定性进一步提高，由此是优选的。
此外，在上述取代中，若发生Leu46Arg、Leu46Pro、Leu46Ala、Leu46Asn、Leu46Asp、Leu46Gln、Leu46Gly、Leu46His、Leu46Lys、Leu46S er、Leu46Trp、Phe114Leu、Phe114Ala、Phe114Ile、Phe114Met、Phe114Pro、Phe114Thr和Phe114Val中的1个以上的任意取代，则Fc结合性蛋白质对热、酸和碱的稳定性进一步提高，因此是优选的。
而且，在通过发生氨基酸取代来制作本实施方式的Fc结合性蛋白质时，对于特定的氨基酸位置，也可以取代成前述取代之外的氨基酸，只要具有抗体结合活性即可。作为其中的一例，可以列举出在两个氨基酸的物理性质和/或化学性质相似的氨基酸之间进行取代的保守取代。本领域技术人员知道，就保守取代而言，不仅仅限于Fc结合性蛋白质，蛋白质的功能在发生了取代者与未发生取代者之间普遍地能够得以维持。作为保守取代的一例，可以列举出甘氨酸和丙氨酸之间、天冬氨酸和谷氨酸之间、丝氨酸和脯氨酸之间、或谷氨酸和丙氨酸之间发生的取代(非专利文献5)。
本实施方式的Fc结合性蛋白质中，对于取代的氨基酸的数目没有特殊限制。作为一例，可以列举出以下所示的(a)~(n)的取代体。这些取代体中，(c)~(n)所示的取代体对热、酸和碱的稳定性进一步提高，因此是特别优选的。
(a)发生了Leu46Pro、Thr63Ile、Phe 114Leu和Asn240Asp的取代的4重取代体(包含SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)、
(b)发生了Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ile100Val、Phe114Leu和Asn240Asp的取代的6重取代体(包含SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)、
(c)发生了Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ile100Val、Phe114Leu、Ile160Met、Asn163Ser和Asn240Asp的取代的8重取代体(包含SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)、
(d)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ile100Val、Phe114Leu、Ile160Met、Asn163Ser、Asn195Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His和Leu285Gln的取代的19重取代体(包含SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质)、
(e)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Glu36Gly、Thr38Ser、Val45Ala、Leu46Pro、Pro49Ser、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ile100Val、Phe114Leu、Tyr133His、Arg139His、Trp149Arg、Leu156Pro、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Asn195Thr、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Met231Lys、Asn240Asp、Leu283His和Leu285Gln的取代的32重取代体(包含SEQ ID NO：114所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(f)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser52Gly、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ile100Val、Phe114Leu、Tyr133His、Arg139His、Trp149Arg、Asn152Thr、Leu156Pro、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Asn195Thr、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Met231Lys、Asn240Asp、Leu283His和Leu285Gln的取代的36重取代体(包含SEQ ID NO：118所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(g)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser52Gly、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile 100Val、Phe 114Leu、Lys128Arg、Tyr133His、Arg139His、Trp149Arg、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Asn195Thr、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的44重取代体(包含SEQ ID NO：130所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(h)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、Val45Ala、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Thr、Ser52Gly、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Phe114Leu、Lys128Arg、Leu131Gln、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的48重取代体(包含SEQ ID NO：134所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(i)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Phe114Leu、Ala121Val、Lys128Arg、Leu131Gln、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Thr199Ala、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Glu261Val、Leu270Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的54重取代体(包含SEQ ID NO：148所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(j)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Ser111Ala、Phe114Leu、Thr115Ile、Ala121Val、Lys128Arg、Leu131Gln、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Thr199Ala、Leu203His、Asn206Thr、Leu207Gln、Glu213Val、Leu218Ile、Met231Lys、Lys234Glu、Asn240A sp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的56重取代体(包含SEQ ID NO：154所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(k)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Ser111Ala、Phe114Leu、Thr115Ile、Ala121Val、Lys128Arg、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Thr199Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His和Leu285Gln的取代的57重取代体(包含SEQ ID NO：164所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(l)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Ser111Ala、Phe114Leu、Thr115Ile、Ala121Val、Lys128Arg、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Thr165Met、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Thr199Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu217Gln、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln和Val289Asp的取代的60重取代体(包含SEQ IDNO：174所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(m)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Ser111Ala、Phe114Leu、Thr115Ile、Glu118Asp、Ala121Val、Lys128Arg、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Thr165Met、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Thr199Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240A sp、Gln246Lys、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln和Val289Asp的取代的61重取代体(包含SEQ ID NO：170所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)、
(n)发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Gln35Leu、Glu36Gly、Thr38Ser、Leu41Met、His42Leu、Leu46Pro、Pro49Ser、Ser51Ala、Ser52Gly、Leu58Arg、Gly60Asp、Thr63Ile、Thr65Ala、Ser69Thr、Tyr70Phe、Arg71His、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Gln97Leu、Ile100Val、Ser111Ala、Phe114Leu、Thr115Ile、Glu118Asp、Ala121Val、Lys128Arg、Tyr133His、Tyr137Phe、Arg139His、Trp149Arg、Ser151Thr、Asn152Thr、Leu156Pro、Lys157Arg、Ile160Thr、Asn163Ser、Thr165Met、Lys173Arg、Ile181Thr、Ser182Leu、Thr184Ser、Asn195Thr、Thr199Ala、Asn206Thr、Leu207Pro、Glu213Val、Leu217Gln、Leu218Ile、Tyr230Phe、Met231Lys、Ser233Gly、Lys234Glu、Asn240Asp、Gln246Lys、Thr249Ala、Leu270Val、Leu283His、Leu285Gln和Val289Asp的取代的62重取代体(包含SEQ ID NO：176所示的氨基酸序列中第34位至第307位的氨基酸的Fc结合性蛋白质)。
作为具有编码本实施方式的Fc结合性蛋白质的核苷酸序列的多核苷酸(以下也简称为本实施方式的多核苷酸)的制作方法，可以列举出例如以下所示的(I)或(II)的方法。
(I)从本实施方式的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列转换成核苷酸序列，人工合成包含该核苷酸序列的多核苷酸的方法。
(II)直接人工制备、或者从人FcγRI的cDNA等出发通过PCR法等DNA扩增方法制备包含人FcγRI的全体或部分序列的多核苷酸，并采用适当方法将制备的该多核苷酸连接的方法。
而且，从氨基酸序列到核苷酸序列的转换优选在考虑转化的宿主中的密码子的使用频率的基础上进行。作为一例，在宿主为大肠杆菌(Escherichiacoli)的情况下，精氨酸(Arg)的AGA/AGG/CGG/CGA、异亮氨酸(Ile)的ATA、亮氨酸(Leu)的CTA、甘氨酸(Gly)的GGA、脯氨酸(Pro)的CCC各自的使用频率低(所谓的稀有密码子)，因此转换时避免这些密码子即可。密码子的使用频率的解析也可以利用公共数据库(例如，KAZUSA DNA研究所的主页上的密码子用法数据库等)。
在采用所述(II)的方法在本实施方式的多核苷酸中导入突变的情况下，作为DNA扩增方法，也可以采用所谓的易错PCR法。对易错PCR法中的反应条件没有特殊限制，只要是能够在编码人FcγRI的多核苷酸中导入希望的突变的条件即可。例如，通过使作为底物的4种脱氧核苷酸(dATP/dTTP/dCTP/dGTP)的浓度不均一，并在PCR反应液中添加0.01至10mM浓度(优选0.1至1mM)的MnCl2来进行PCR，能够在多核苷酸中导入突变。
而且，作为在本实施方式的多核苷酸中导入突变的方法，还可以列举出以下所示的(III)的方法。
(III)使包含人FcγRI的全体或部分序列的多核苷酸与作为突变原的药物接触、作用，或者对其照射紫外线，在多核苷酸中导入突变来进行制作的方法。
作为突变原的该药物，可以使用羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍、亚硝酸、亚硫酸、肼等本领域技术人员通常使用的突变原药物。
而且，在采用所述(I)、(II)或(III)的方法制作的本实施方式的多核苷酸的5’末端侧，可以添加编码信号肽的多核苷酸。在宿主为大肠杆菌的情况下，作为所述信号肽，可以列举出pelB、DsbA、MalE(SEQ ID NO：182)、TorT等使得蛋白质向周质中分泌的信号肽(日本特愿2009-256180号)。
在使用本实施方式的多核苷酸转化宿主的情况下，可以使用本实施方式的多核苷酸本身，而使用在合适位置插入了本实施方式的多核苷酸的表达载体(例如原核细胞、真核细胞的转化中通常使用的噬菌体、粘粒、质粒等)则更为优选。而且，对该表达载体没有特殊限制，能够在转化的宿主内稳定存在并复制即可。在以大肠杆菌作为宿主的情况下，可以示例出pET质粒载体、pUC质粒载体、pTrc质粒载体、pCDF质粒载体、pBBR质粒载体等。此外，所述合适的位置，是指不破坏涉及表达载体的复制功能、希望的抗生物质标记和传导性的区域的位置。在所述表达载体中插入本实施方式的多核苷酸时，优选以与表达所必要的启动子等功能性多核苷酸连接的状态插入表达载体。作为该启动子的例子，在宿主为大肠杆菌的情况下，可以示例出trp启动子、tac启动子、trc启动子、lac启动子、T7启动子、recA启动子、lpp启动子、以及λ噬菌体的λPL启动子、λPR启动子等。
为了用插入了采用所述方法制作的本实施方式的多核苷酸的表达载体转化宿主，可以采用本领域技术人员通常使用的方法进行。例如，在作为宿主选择属于埃希氏菌属的微生物(大肠杆菌JM109株、BL21(DE3)株等)的情况下，可以采用非专利文献6所述的方法等进行转化。通过采用合适的方法从采用这样的方法转化得到的转化体中进行筛选，可以获得表达对热、酸、碱的稳定性提高的本实施方式的Fc结合性蛋白质的转化体。为了从该转化体制备插入了本实施方式的多核苷酸的表达载体，可以使用碱抽提法、QIAprep Spin Miniprep kit(QIAGEN公司制造)等市售的抽提试剂盒来制备。为了筛选表达本实施方式的Fc结合性蛋白质的转化体，可以通过例如测定抗体对表达的Fc结合性蛋白质的结合活性来进行。抗体的结合活性可以采用ELISA法、表面等离子体共振法等测定例如对IgG的结合活性。结合活性的测定中使用的IgG优选人IgG，特别优选人IgG1。
作为本实施方式的Fc结合性蛋白质，可以通过对用含本实施方式的多核苷酸的表达载体转化得到的宿主(转化体)进行培养来制造。该Fc结合性蛋白质的制造方法具体包括：培养该转化体、从其培养物回收本实施方式的Fc结合性蛋白质。而且，本说明书中，培养物所指的概念除了经培养的转化体的细胞自身，还包括培养中使用的培养基等。回收可以通过例如从培养物抽提Fc结合性蛋白质来进行。本实施方式的Fc结合性蛋白质的制造方法中使用的转化体可以使用适合于对象宿主的培养的培养基进行培养，在宿主是大肠杆菌的情况下，作为优选的培养基的一例，可以列举出补加了必要营养源的LB(Luria-Bertani)培养基。而且，为了能够根据有无导入含本实施方式的多核苷酸的表达载体来选择性地进行转化体的增殖，优选在培养基中添加与该表达载体所含的药物抗性基因对应的药物来进行培养。例如，在该表达载体包含卡那霉素抗性基因的情况下，可以在培养基中添加卡那霉素。此外，培养基中除了碳、氮和无机盐供给源之外，还可以添加适当的营养源，视需要还可以包含选自由谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、硫代乙醇酸盐和二硫苏糖醇组成的组中的一种以上的还原剂。而且，还可以添加甘氨酸等促进从所述转化体向培养液的蛋白质分泌的试剂，具体地，在宿主是大肠杆菌的情况下，优选相对于培养基添加2%(w/v)以下的甘氨酸。
培养温度可以根据表达的Fc结合性蛋白质的特性来选择，在宿主是大肠杆菌的情况下，一般为10℃至40℃、优选25℃至35℃、更优选30℃左右。培养基的pH在宿主是大肠杆菌的情况下，为pH6.8至pH7.4，优选pH7.0左右。
在含本实施方式的多核苷酸的表达载体包含诱导性启动子的情况下，可以在能够良好表达含本实施方式的Fc结合性蛋白质的多肽的条件下进行诱导。作为诱导剂，可以示例出IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷)。在宿主是大肠杆菌的情况下，通过测定培养液的浊度(600nm的吸光度)，当其变成约0.5至1.0时添加适当量的IPTG，然后继续进行培养，可以诱导本实施方式的Fc结合性蛋白质的表达。IPTG的添加浓度可以在0.005至1.0mM的范围适宜选择，优选0.01至0.5mM的范围。IPTG诱导相关的各种条件可以采用该技术领域中公知的条件进行。
为了从本实施方式的转化体的培养液抽提Fc结合性蛋白质，可以根据表达的形式适宜选择抽提方法。在表达于培养上清的情况下，可以通过离心分离操作分离菌体，并从所得培养上清抽提Fc结合性蛋白质。另一方面，在表达于细胞内(对于原核生物还包括周质)的情况下，可以通过在离心分离操作收集菌体后，添加酶处理剂、表面活性剂等破碎菌体，来抽提Fc结合性蛋白质。为了从抽提出的蛋白质中分离纯化Fc结合性蛋白质，可以使用该技术领域中公知的方法。作为一例，可以列举出使用液相色谱的分离纯化。作为液相色谱，可以列举出离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、亲和色谱等。通过组合这些色谱进行纯化操作，能够高纯度地制备本实施方式的Fc结合性蛋白质。
本实施方式的Fc结合性蛋白质可以用作例如用于分离纯化包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的亲和色谱用配体。为了将本实施方式的Fc结合性蛋白质适用于所述色谱，可以以例如将本实施方式的Fc结合性蛋白质固定化于固相而成的、吸附包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质的吸附材料(以下也简称为本实施方式的吸附材料)的方式使用。
作为用于固定化本实施方式的Fc结合性蛋白质的固相，可以示例出包含亲水性乙烯基聚合物、二氧化硅、玻璃、Sepharose(注册商标)、琼脂糖、纤维素、羟基磷灰石、聚苯乙烯的物质等。而且，使固相的形态为空孔得到控制的形态、或膜的形态，则从分离能力变好的角度是优选的。为了将本实施方式的Fc结合性蛋白质固定化于固相，可以例如在固相表面导入环氧基、甲酰基、氨基、羧基等活性基团后，使本实施方式的Fc结合性蛋白质表面存在的氨基酸残基与导入该固相表面的活性基团共价结合。
作为使用本实施方式的吸附材料分离纯化的、包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质(以下也称为目的蛋白质)的一例，可以列举出包含IgG的恒定区域的蛋白质。作为其具体例，可以列举出IgG、IgG的Fc结合性蛋白质结合位点与其他蛋白质的融合蛋白质。而且，这里所说的IgG的恒定区域可以包含用例如木瓜蛋白酶等蛋白酶处理而从IgG产生的铰链、CH2和CH3结构域。作为使用本实施方式的吸附材料分离纯化的目的蛋白质的例子，可以列举出人IgG、人源化IgG、小鼠IgG、大鼠IgG、兔IgG、骆驼IgG等，特别优选人IgG或人源化IgG。使用本实施方式的吸附材料分离纯化的人IgG可以列举出人IgG1、人IgG2、人IgG3和人IgG4。作为使用本实施方式的吸附材料分离纯化的目的蛋白质的其他例子，可以列举出单克隆IgG抗体、多克隆IgG抗体、IgG片段等。
使用本实施方式的吸附材料的、抗体等目的蛋白质的分离纯化方法具备例如以下所示的(1)和(2)的步骤。
(1)在将本实施方式的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到的包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料中添加含目的蛋白质的溶液，使该目的蛋白质吸附于该吸附材料的步骤。
(2)使用合适的洗脱液洗脱吸附于吸附材料的目的蛋白质的步骤。
使用本实施方式的吸附材料分离纯化的抗体等目的蛋白质可以例如通过采用基因重组技术，在CHO细胞(中国仓鼠卵巢细胞)等动物细胞、昆虫细胞、大肠杆菌、芽孢杆菌属细菌等细菌、面包酵母、粟酒裂殖酵母等酵母、或米曲霉等丝状真菌等中表达来进行生产。而且，在希望将目的蛋白质以其表面必要存在糖链的形态进行生产的情况下，可以选择作为真核细胞的动物细胞、昆虫细胞、酵母或丝状真菌，更优选使用CHO细胞。作为包含使用本实施方式的吸附材料分离纯化的目的蛋白质的溶液的一例，可以列举出可表达目的蛋白质的宿主(动物细胞、昆虫细胞、细菌、酵母、丝状真菌等)的培养液、可表达目的蛋白质的植物的破碎液、牛等动物的乳。而且，上述例子中，对于培养液，可以包含可表达目的蛋白质的宿主，也可以通过合适的前处理除去该宿主。这里所说的合适的前处理，可以示例出离心分离操作、精密过滤膜、超滤膜，可以采用本领域技术人员公知的方法。
作为在本实施方式的吸附材料上吸附目的蛋白质的步骤的一例，可以列举出在使用了本实施方式的吸附材料的分离纯化用柱上，使用合适的送液系统，直接或以pH调整后的状态添加含目的蛋白质的溶液，吸附目的蛋白质的步骤。该分离纯化用柱可以通过例如在合适容量的空柱中充填本实施方式的吸附剂来制作。此外，送液系统可以使用例如液相色谱中使用的高压泵、蠕动泵。在对含目的蛋白质的溶液进行pH调整的情况下，对调整的pH没有特殊限制，只要是目的蛋白质不变性的条件即可，可以是中性、酸性、碱性。但是，在通常的目的蛋白质的情况下，优选将pH调整至3至10的范围，特别优选调整至pH4至pH8的范围。
在对本实施方式的吸附材料上吸附的目的蛋白质进行洗脱时，可以在所述吸附步骤后立即进行目的蛋白质的洗脱，优选经过在洗脱步骤前用合适的洗涤液除去杂蛋白质的洗涤步骤后再进行洗脱。作为该洗涤液，可以是调整至目的蛋白质不发生洗脱的条件的pH的缓冲液。作为用作洗涤液的缓冲液的构成要素的一例，可以列举出乙酸、柠檬酸、组氨酸、磷酸、硼酸、铵盐(例如乙酸铵、琥珀酸铵)、MES(2-吗啉乙磺酸一水合物)、MOPS(3-吗啉丙磺酸)、HEPES(2-[4-(2-羟乙基)-1-哌啶基]乙磺酸)、Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)和它们的组合。用作洗涤液的缓冲液的pH因目的蛋白质而异，一般优选pH为3至10的范围，特别优选pH4至pH8的范围。而且，用作洗涤液的缓冲液中视需要可以存在添加剂，可以列举出例如用于调整缓冲液离子强度的氯化钠、硫酸钠、氯化钾等盐、甘氨酸、组氨酸、精氨酸等氨基酸、尿素等离液剂、乙醇、甘露醇、甘油、苄醇等醇、蔗糖、麦芽糖、海藻糖、果糖等糖等。
在洗脱本实施方式的吸附材料上吸附的目的蛋白质的步骤中，使用合适的洗脱液使目的蛋白质从该吸附材料解离，回收到合适的容器中。作为该洗脱液，只要是是调整至目的蛋白质洗脱并且目的蛋白质不变性的条件的pH的缓冲液即可。用作洗脱液的缓冲液的pH因目的蛋白质而异，一般优选pH为2至11的范围，特别优选pH为2.5至pH6的范围。而且，在本实施方式的吸附材料为将由SEQ ID NO：114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列组成的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到的吸附材料的情况下，用作洗脱液的缓冲液的pH为3.0~4.5的范围。此外，用作洗脱液的缓冲液中视需要可以存在添加剂，可以列举出例如用于稳定化目的蛋白质的表面活性剂、盐、糖等。
通过将使用本实施方式的吸附材料分离纯化出的目的蛋白质提供给柱色谱，还可以纯化至更高纯度。作为可使用的色谱，可以示例出离子交换色谱、疏水性相互作用色谱、凝胶过滤色谱、羟基磷灰石色谱等。
实施例
以下列举出实施例对本发明进行更具体的说明，但本发明不受这些实施例的限定。
实施例1编码人Fc受体FcγRI的多核苷酸的克隆
(1)以SEQ ID NO：1所述的人Fc受体FcγRI的氨基酸序列为基础，对于细胞外区域、跨细胞膜区域和细胞内区域(第16位至第374位的区域)，使用大肠杆菌型的密码子进行了向核苷酸序列的转换。
(2)以所述核苷酸序列为基础，合成了用于制作编码人FcγRI的多核苷
酸的52种寡核苷酸。合成的寡核苷酸如SEQ ID NO：10至61所示。
(3)为了从(2)合成的寡核苷酸制作编码人FcγRI的多核苷酸的全长，进行了下述所示的2阶段PCR。
(3-1)第1阶段的PCR反应如下进行：使用表1所示的反应液，94℃、5分钟热处理后，以第1步94℃30秒、第2步62℃30秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行25个循环，最后72℃进行7分钟热处理。
[表1]
组成 体积
10×Pyrobest缓冲液(Takara Bio公司制) 5μl
2.5mM dNTPs 5μl
DNA混合物 1μl
5U/μl Pyrobest(Takara Bio公司制) 0.5μl
H2O 38.5μl
而且，表1所述的DNA混合物是指等量取所述52种50pmoL/μL的各合成寡核苷酸并进行混合而得到的溶液。
(3-2)2阶段目的PCR反应如下进行：使用表2所示的反应液，94℃5分钟热处理后，以第1步94℃30秒、第2步65℃30秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行25个循环，最后72℃进行7分钟热处理。
[表2]
组成 体积
10×Pyrobest缓冲液(Takara Bio公司制) 5μl
2.5mM dNTPs 5μl
10pmol/μl SEQ ID NO:61的寡核苷酸 2μl
10pmol/μl SEQ ID NO:10的寡核苷酸 2μl
第1步的PCR反应液 1μl
5U/μl Pyrobest(Takara Bio公司制) 0.5μl
H2O 34.5μl
而且，表2所示的组成中，模板使用了第1阶段的PCR反应液中所含的多核苷酸。此外，PCR引物使用了由SEQ ID NO：10
(5’-ATGTGGTTTCTGACCACGCTGTTGCTGTGGGTGCCGGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：61
(5’-GGTCGCGCCCTGCGGCTCCTTACGATGCAC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。反应结束后，用0.9%的琼脂糖电泳进行了确认，确认到了如设计大小(约1.1kbp)的DNA条带。
(4)抽提所述DNA条带(QIAquick凝胶提取试剂盒，QIAGEN公司制造)，将抽提出DNA的5’末端进行磷酸化(TaKaRa BKL试剂盒：TAKARABio公司制造)后，插入到用限制酶SmaI进行消化的pUC19质粒载体中。
(5)在包含(4)中制备的质粒载体和50μg/mL的羧苄青霉素的LB培养基中转化大肠杆菌JM109株(TAKARABio公司制造)。
(6)按常规方法从转化体抽提(QIAprep Spin小提试剂盒：QIAGEN公司制造)质粒，以此为pUCFcR。结构的概略如图2所示。
实施例2Fc结合性蛋白质的表达载体的制作
为了使Fc结合性蛋白质在大肠杆菌中表达，构建了利用MalE信号肽(氨基酸序列；MKIKTGARILALSALTTMMFSASALA、SEQ ID NO：182)的系统。制作步骤的概略如图3所示。
(1)为了制作编码MalE信号肽的多核苷酸，将以下所示的寡核苷酸采用PCR法进行了连接。
由SEQ ID NO：
62(5’-TATA[CATATG]AAAATAAAAACAGGTGCACGCATCC-3’；中括号内的碱基是限制酶NdeI位点)所示的序列组成的寡核苷酸。
由SEQ ID NO：
63(5’-GCATTAACGACGATGATGTTTTCCGCCTCGGCTCTCGCC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
由SEQ ID NO：
64(5’-ATCGTCGTTAATGCGGATAATGCGAGGATGCGTGCACCTG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
由SEQ ID NO：
65(5’-TTGTC[CCATGG]CTTCTTCGATTTTGGCGAGAGCCG-3’；中括号内的碱基是限制酶NcoI位点)所示的序列组成的寡核苷酸。
PCR反应如下进行：使用表3所示的反应液，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行5个循环。
[表3]
组成 浓度/体积
寡核苷酸 各2.5mM
2.5U/μl PrimeSTAR HS(Takara Bio公司制) 0.5μl
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio公司制) 10μl
2.5mM dNTPs 4μl
H2O 至50μl
(2)通过使用(1)中所得的PCR产物作为模板进行PCR反应，制作了编码MalE信号肽的多核苷酸。该PCR反应中，作为PCR引物使用了由SEQ IDNO：62所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：65所示的序列组成的寡核苷酸。此外，该PCR反应中，使用表4所示的反应液，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
[表4]
组成 体积
模板DNA 适量
10pmol/μl PCR引物 各2μl
2.5U/μl PrimeSTAR HS(Takara Bio公司制) 0.5μl
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio公司制) 10μl
dNTPs 4μl
H2O 至50μl
(3)将(2)中制作的编码MalE信号肽的多核苷酸用限制酶NdeI和NcoI消化。将其与用限制酶NdeI与NcoI消化的pET26b(+)质粒载体(Novagen公司制造)连接，采用热冲击法转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(4)将所得的转化体用含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。然后，通过从培养的转化体抽提质粒DNA，制备了质粒pETMalE。结构的概略如图4所示。
(5)通过使用实施例1中制作的pUCFcR(图2)作为模板进行PCR反应，制作了编码包含Fc结合性蛋白质的多肽的多核苷酸。该PCR反应中使用了以下所示的各寡核苷酸作为PCR引物。
由SEQ ID NO：
66(5’-TCAG[CCATGG]GACAAGTAGATACCACCAAAGCTGTGATTA-3’；中括号内是限制酶NcoI位点)所示的序列组成的寡核苷酸。
由SEQ ID NO：
67(5’-CC[AAGCTT]AATGATGATGATGATGATGGACCGGGGTCGGCAGTTGAAGACCCAG-3’；中括号内是限制酶HindIII位点)所示的序列组成的寡核苷酸。
此外，该PCR反应中如下进行：按照表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
(6)将(5)中所得的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)连接后，采用热冲击法转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(7)将所得的转化体用含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒DNA，制备了插入有编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR。其结构概略如图5所示。
实施例3核苷酸序列的解析
对于实施例1中制作的pUCFcR(图2)和实施例2中制作的pETFcR(图5)中插入的多核苷酸的序列，使用基于链终止法的Big Dye终止物循环测序FS阅读反应试剂盒(PE Applied Biosystems公司制造)进行循环测序反应，并使用全自动DNA测序仪ABI Prism 3700DNA分析仪(PE Applied Biosystems公司制造)进行了解析。而且，使用了由SEQ ID NO：68(5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69(5’-TATGCTAGTTATTGCTCAG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸作为测序用引物。
解析的结果确认了pUCFcR和pETFcR中插入的多核苷酸的序列和设计的一致。pUCFcR中插入的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：70所示，从所述多核苷酸翻译出的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：71所示。此外，pETFcR中插入的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：72所示，从所述多核苷酸翻译出的Fc结合性蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO：73所示。
实施例4Fc结合性蛋白质的制备和抗体结合活性的测定
(1)将用pETFcR(图5)转化的大肠杆菌BL21(DE3)株用含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养(37℃18小时)，再将培养液接种于重新制备的添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基。
(2)在培养液的浊度(600nm中的吸光度)的值达到0.5时，将培养温度切换为20℃并培养30分钟后，在培养液中添加IPTG使得其为0.01mM，进行培养(20℃18小时)。
(3)培养结束后，通过离心分离操作收集菌体，使用BugBuster蛋白提取试剂盒(TAKARABio公司制造)从菌体制备了蛋白质。
(4)采用以下方法利用ELISA法评价了所得的制备蛋白质的抗体结合活性。
(4-1)将作为人抗体的γ球蛋白制剂(化学及血清疗法研究所制)以1μg/孔的浓度固定于96孔微平板的孔(4℃18小时)，固定化结束后，用StartingBlock封闭缓冲液(PIERCE公司制造)进行了封闭。
(4-2)用洗涤缓冲液(含0.2%(w/v)的Tween 20和150mM的NaCl的10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0))进行洗涤后，将制备的蛋白质抽提液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)适宜稀释，与固定化γ球蛋白进行了反应(30℃2小时)。
(4-3)反应结束后，用所述洗涤缓冲液再次洗涤，添加辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗His-Tag抗体试剂(BETHYL公司制造)。
(4-4)30℃2小时反应后，用所述洗涤缓冲液洗涤，添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制造)，测定了450nm的吸光度。
测定结果如图6所示。图中，X轴(横轴)表示样品的稀释倍率，Y轴(纵轴)表示450nm的吸光度(任意单位)。从吸光度的值可以确认抗体结合活性。如图6所示，从转化体所得的可溶性蛋白质抽提液的浓度越高(稀释倍率越小)，则吸光度的值越高。即，可以确认用作为重组质粒的pETFcR(图5)转化大肠杆菌而得到转化体表达Fc结合性蛋白质。
实施例5对Fc结合性蛋白质导入突变和文库的制作
(1)对于编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸部分，利用易错PCR随机地实施了突变导入。易错PCR反应中的反应液组成如表5所示。
[表5]
组成 浓度
模板DNA(pETFcR) 0.05ng/μl
PCR引物(SEQ ID NO:66) 0.4μM
PCR引物(SEQ ID NO:67) 0.4μM
MnCl2 0.4mM
dATP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dCTP 1mM
dTTP 1mM
缓冲液(将MnCl2制备为5mM) ×1
GoTaq聚合酶(Promega公司制) 0.05U/μl
H2O 至50μl
PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。通过所述易错PCR，对编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸良好地导入了突变，其平均突变导入率为0.14%。
(2)对(1)中所得的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应将其插入用同限制酶消化的实施例2中制作的pETMalE(图4)。
(3)反应结束后，将反应液用电穿孔法导入大肠杆菌JM109株，在含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中进行了培养(37℃18小时)。
培养后，平板上形成了约50000个菌落。从将这些菌落混合而得到的混合菌落抽提质粒DNA作为质粒文库。
实施例6稳定性提高的Fc结合性蛋白质的筛选
(1)使用实施例5中制作的质粒文库转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(2)将(1)中所得的转化体接种于含50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基(16g/L的胰蛋白胨、10g/L的酵母提取物、5g/L的NaCl)200μL中，使用96孔深孔平板，30℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将50μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步于20℃振荡培养过夜。
(4)培养后，将通过离心操作所得的培养上清用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍，采用实施例4(4)所述的ELISA法测定了抗体结合活性。此外，将所述培养上清43℃热处理10分钟后，同样采用ELISA法测定了抗体结合活性。对约2500株的转化体进行评价，能够从所述转化体得到表达与用pETFcR表达的Fc结合性蛋白质相比热稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体。
(5)从表达热稳定性或表达量提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备了质粒。对插入所得的质粒的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列进行解析，确定了氨基酸的突变位置。
核苷酸序列解析的结果表明：热稳定性或表达量提高的Fc结合性蛋白质中发生的氨基酸取代的取代位置如下。
具体地，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中发生了Thr20Pro、Thr25Lys、Thr38Ala、Thr38Ser、Leu46Arg、Leu46Pro、Ala62Val、Thr63Ile、Ser69Phe、Ser69Thr、Arg71His、Val77Ala、Val77Glu、Asn78Asp、Asp94Glu、Ile100Val、Ser110Asn、Phe114Leu、His125Arg、Leu131Arg、Leu131Pro、Trp149Leu、Leu156Pro、Ile160Met、Asn163Ser、Asn195Thr、Thr199Ser、Asn206Lys、Asn206Ser、Asn206Thr、Leu207Pro、Leu218Val、Asn240Asp、Leu248Ser、Leu283His、或Leu285Gln表示的取代。热处理后的抗体结合活性的残留率(残留活性)、氨基酸取代的解析结果如表6所示。由表6可知：通过对Fc结合性蛋白质进行氨基酸取代(突变)处理，Fc结合性蛋白质的热稳定性提高。
[表6]
Figure BDA00002388323000321
实施例7氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的制作
尝试了通过汇集实施例6中明确的参与Fc结合性蛋白质的结构稳定性提高的氨基酸取代，以期实现进一步的稳定性提高。取代氨基酸的汇集以PCR法为主进行，制作了以下4种Fc结合性蛋白质。
(a)4处氨基酸取代处理的FcRm4
(b)对FcRm4追加2处氨基酸取代，共计6处氨基酸取代处理的FcRm6
(c)对FcRm6追加2处氨基酸取代，共计8处氨基酸取代处理的FcRm8
(d)对FcRm8追加11处氨基酸取代，共计19处氨基酸取代处理的FcRm19
以下，对各Fc结合性蛋白质的制作方法进行具体说明。
(a)FcRm4
在实施例6中已明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了Leu46Pro、Thr63Ile、Phe114Leu和Asn240Asp，制作了将这些取代汇集于野生型的Fc结合性蛋白质(未发生氨基酸取代的Fc结合性蛋白质)的FcRm4。以Leu46Pro、Thr63Ile、Phe114Leu和Asn240Asp表示的氨基酸取代的汇集，是使用筛选取得的表达各氨基酸发生了取代的Fc结合性蛋白质的转化体中的、插入了pETFcR中的编码所述Fc结合性蛋白质的多核苷酸进行的。
(a-1)以筛选中取得的、包含编码发生了以Leu46Pro表示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的pETFcR质粒作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应中的引物使用了由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQID NO：74(5’-AGGAACCATTGGGTTGAACTTGACCCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
(a-2)以筛选中取得的、包含编码发生了Thr63Ile的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的pETFcR质粒作为模板，进行了PCR反应。该PCR反应如(a-1)那样进行，不同之处在于使用由SEQ ID NO：
75(5’-TGGGTCAAGTTCAACCCAATGGTTCCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：
76(5’-AGCAGCCAGCCACGATGAATTTCAAGTTGTATCGGATCGC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(a-3)以筛选中取得的、包含编码发生了Phe114Leu所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的pETFcR质粒作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应如(a-1)那样进行，不同之处在于使用由SEQ ID NO：
77(5’-GTGGCCTGAGCGGCCGTAGCGATCCGATACAACTTGAAAT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：
78(5’-CCGCGCAGGGTTTTGCTGCCCATATAGAACGAGAAATACA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(a-4)以筛选中取得的、包含编码发生了Asn240Asp的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的pETFcR质粒作为模板，进行了PCR反应。该PCR反应如(a-1)那样进行，不同之处在于使用由SEQ ID NO：
79(5’-CGTCCCGGCCTGCAGCTGTATTTCTCGTTCTATATGGGCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(a-5)对(a-1)、(a-2)、(a-3)和(a-4)中所得的4种PCR产物进行了纯化。将这些纯化后的PCR产物混合后，如下进行PCR反应：按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行5个循环；将PCR产物连接。
[表7]
组成 浓度/体积
PCR产物 各等mol
2.5U/μl PrimeSTAR HS(Takara Bio公司制) 0.5μl
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio公司制) 10μl
2.5mM dNTPs 4μl
H2O 至50μl
(a-6)以(a-5)中所得的PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，进行了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。由此制作了编码4处氨基酸取代处理的FcRm4的多核苷酸。
(a-7)将(a-6)中所得的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE连接，并用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(a-8)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。由培养的菌体(转化体)抽提质粒，从而得到了包含编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了4处氨基酸取代处理的多肽的FcRm4的多核苷酸的质粒pETFcRm4。
(a-9)采用如实施例3那样的方法，进行了pETFcRm4的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm4的氨基酸序列如SEQ IDNO：2所示，编码所述FcRm4的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：6所示。需要说明的是，SEQ ID NO：2中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm4的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，SEQ ID NO：2中，Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位的位置。
(b)FcRm6
从实施例6中已经明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ile100Val、Phe114Leu和Asn240Asp，制作了将这些取代汇集在野生型的Fc结合性蛋白质中的FcRm6。具体地，通过对制作的质粒pETFcRm4进行导致Thr38Ser的氨基酸取代的核苷酸序列取代和导致Ile100Val的氨基酸取代的核苷酸序列取代，将Thr38Ser和Ile100Val汇集在pETFcRm4中。导致Thr38Ser的氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ ID NO：
80(5’-TGCAACGTCACGGATTCTTCCTGGAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：81(5’-TTCCAGGAAGAATCCGTGACGTTGCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。此外，导致Ile100Val的氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ ID NO：
82(5’-CAGCCAGCCACGATGAACTTCAAGTT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：83(5’-AACTTGAAGTTCATCGTGGCTGGCTG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。
(b-1)以质粒pETFcRm4作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：80所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
(b-2)以质粒pETFcRm4作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应如(b-1)那样实施，不同之处在于使用由SEQ ID NO：81所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：82所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(b-3)以质粒pETFcRm4作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应如(b-1)那样实施，不同之处在于使用由SEQ ID NO：83所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(b-4)对(b-1)、(b-2)和(b-3)中所得的3种PCR产物进行了纯化。将这些纯化后的PCR产物混合后，如下进行PCR反应：按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环，连接PCR产物。
(b-5)以(b-4)中所得的PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。由此制作了编码6处氨基酸取代处理的FcRm6的多核苷酸。
(b-6)将(b-5)中所得的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(b-7)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了6处氨基酸取代处理的多肽的FcRm6的多核苷酸的质粒pETFcRm6。
(b-8)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm6的序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm6的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，编码所述FcRm6的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：7所示。需要说明的是，SEQ ID NO：3中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm6的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，SEQ ID NO：3中，Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Ile100Val的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位的位置。
(c)FcRm8
从实施例6中已经明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ile100Val、Phe114Leu、Ile160Met、Asn163Ser和Asn240Asp，制作了将这些取代汇集在野生型的Fc结合性蛋白质中的FcRm8。具体地，通过对制作的质粒pETFcRm6进行导致Ile160Met的氨基酸取代的核苷酸序列取代和导致Asn163Ser的氨基酸取代的核苷酸序列取代，将Ile160Met和Asn163Ser汇集在pETFcRm6中。导致Ile160Met和Asn163Ser的氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ IDNO：84(5’-TACGTCCCGCTGTGGGACATGTTCGTCTTCAGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：
85(5’-TCTGAAGACGAACATGTCCCACAGCGGGACGTA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。
(c-1)以质粒pETFcRm6作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：84所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
(c-2)以质粒pETFcRm6作为模板，以由SEQ ID NO：85所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，如(c-1)那样进行了PCR反应。
(c-3)对(c-1)和(c-2)的2种PCR产物进行了纯化。将这2种纯化的PCR产物混合后，如下进行PCR反应：按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环进行反应，连接PCR产物。
(c-4)以(c-3)中所得的PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。由此制作了编码8处氨基酸取代处理的FcRm8的多核苷酸。
(c-5)将(c-4)中所得的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的表达载体pETMalE连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(c-6)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了8处氨基酸取代处理的多肽的FcRm8的多核苷酸的质粒pETFcRm8。
(c-7)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm8的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm8的氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，编码的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：8所示。需要说明的是，SEQ ID NO：4中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm8的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，SEQ ID NO：4中，Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Ile100Val的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Ile160Met的甲硫氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位的位置。
(d)FcRm19
从实施例6中已经明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了Thr20Pro、Thr25Lys、Thr38Ser、Leu46Pro、Thr63Ile、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Ile100Val、Phe114Leu、Ile160Met、Asn163Ser、Asn195Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Asn240Asp、Leu283His和Leu285Gln，制作了将这些取代汇集在野生型的Fc结合性蛋白质中的FcRm19。
具体地，相对于前述制作的质粒pETFcRm8进行了导致Thr20Pro、Thr25Lys、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Asn195Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Leu283His和Leu285Gln的氨基酸取代的核苷酸序列取代。通过该核苷酸序列取代，将Thr20Pro、Thr25Lys、Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu、Asn78Asp、Asn195Thr、Asn206Thr、Leu207Pro、Leu283His和Leu285Gln汇集在pETFcRm8中。
而且，导致Thr20Pro和Thr25Lys这2个氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ ID NO：86(5’-TGCAGCTTAATCACAGCTTTGGGGGTAT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：
87(5’-ATACCCCCAAAGCTGTGATTAAGCTGCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。导致Ser69Thr、Arg71His、Val77Glu和Asn78Asp的这4个氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ ID NO：88
(5’-CGCTCGCGGAGGTAATGTGGTAAGTCGGGGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：89
(5’-ATTACCTCCGCGAGCGAAGACGATTCG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。导致Asn195Thr、Asn206Thr和Leu207Pro这3个氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ ID NO：90
(5’-TCAAGCAGCGGGCTTGTCACACTCGCAGTCAGCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：91
(5’-ACAAGCCCGCTGCTTGAAGGCACTCCGGTGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。导致Leu283His和Leu285Gln这2个氨基酸取代的核苷酸序列取代使用由SEQ ID NO：92
(5’-TCGGCTGTTGATGACCCAGCACTTGCAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：93(5’-TTGCAAGTGCTGGGTCATCAACAGCCGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸进行。
(d-1)以质粒pETFcRm8作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：86所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
(d-2)以质粒pETFcRm8作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应如(d-1)那样进行，不同之处在于使用了由SEQ ID NO：87所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：88所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(d-3)以质粒pETFcRm8作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应如(d-1)那样进行，不同之处在于使用了由SEQ ID NO：89所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：90所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(d-4)以质粒pETFcRm8作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应如(d-1)那样进行，不同之处在于使用了由SEQ ID NO：91所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：92所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。
(d-5)以质粒pETFcRm8作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应使用了由SEQ ID NO：93所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，如(d-1)那样进行了PCR反应。
(d-6)对(d-1)、(d-2)、(d-3)、(d-4)和(d-5)中得到的5种PCR产物进行了纯化。将这些纯化后的5种PCR产物混合后，如下进行PCR反应：按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，进行PCR反应，连接PCR产物。
(d-7)以(d-6)中所得的PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。由此制作了编码19处氨基酸取代处理的FcRm19的多核苷酸。
(d-8)将(d-7)中所得的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与作为用限制酶NcoI和HindIII消化的质粒DNA的pETMalE连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(d-9)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了19处氨基酸处理的多肽的FcRm19的多核苷酸的质粒pETFcRm19。
(d-10)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm19的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm19的氨基酸序列如SEQ IDNO：5所示，编码的多核苷酸的序列如SEQ ID NO：9所示。需要说明的是，SEQ ID NO：5中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm19的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，SEQ ID NO：5中，Thr20Pro的脯氨酸存在于第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Ile100Val的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Ile160Met的甲硫氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Pro的脯氨酸存在于第225位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例8汇集了氨基酸取代的Fc结合性蛋白质的生产性评价
(1)将实施例2和实施例7中制作的转化体分别接种于添加有50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基中，通过37℃振荡培养过夜进行了前培养。
(2)将前培养液接种于添加有50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基，37℃振荡培养。培养开始1.5小时后，将培养温度变更为20℃，振荡培养30分钟后，添加终浓度0.01mM的IPTG，继续20℃振荡培养过夜。
(3)从培养后的菌体抽提可溶性蛋白质，以已知浓度的人FcγRI作为对照，采用实施例4所述的ELISA法测定了抽提的Fc结合性蛋白质的蛋白浓度。
对于实施例2和实施例7中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的生产性，以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较，结果如图7所示。需要说明的是，图7中的FcR表示用实施例2的转化体表达的未发生氨基酸取代的(野生型的)Fc结合性蛋白质。与该Fc结合性蛋白质相比，作为使用实施例7中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm4、FcRm6、FcRm8、FcRm19均确认了高的生产性。由图7的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例9Fc结合性蛋白质的制备
(1)对于实施例2和实施例7中制作的转化体，采用如实施例8那样的方法进行了前培养。
(2)将前培养液接种于添加有50μg/mL的卡那霉素的2YT液体培养基中，37℃振荡培养。
(3)在培养液浊度(OD600)达到1.5至2.0时，冷却至15℃，添加0.1mM的IPTG后，15℃振荡培养过夜。
(4)培养结束后，将通过离心分离操作所得的各菌体分别悬浮于含150mM的NaCl和0.1mM的PMSF(苯基甲基磺酰氟)的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，一边冷却至6℃一边进行超声波破碎后，进行离心分离操作，回收了上清。
(5)从回收的上清按下述所示的方法纯化了Fc结合性蛋白质。
(5-1)在回收的上清中加入终浓度为10mM的咪唑，上样于预先用含150mM的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)平衡的镍螯合柱(His·BindResin：Novagen公司制造)。然后，用含150mM的NaCl的20mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)洗涤柱后，用含500mM咪唑的PBS(137mM的NaCl、8.10mM的磷酸氢二钠、2.68mM的氯化钾、1.47mM的磷酸氢钾)(pH7.0)洗脱Fc结合性蛋白质。
(5-2)将(5-1)中所得的、含Fc结合性蛋白质的洗脱液上样于预先用PBS(pH7.0)平衡的IgG Sepharose(注册商标)6Fast Flow(GE health care公司制造，以下称为FF)。然后，用PBS(pH7.0)洗涤FF后，用含150mM的NaCl和10%的甘油的20mM柠檬酸缓冲液(pH3.0)洗脱Fc结合性蛋白质。而且，洗脱时，洗脱到预先装入洗脱量的1/4量的浓度1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)的容器中。
实施例10Fc结合性蛋白质的热稳定性评价
对于各Fc结合性蛋白质的纯化溶液，用PBS(pH7.0)在4℃透析，使用DSC(Diffirential Scanning Calorimetry,差示扫描量热计)(VP毛细管DSC平台、日本SiberHegner公司制造)在升温速度60℃/小时的条件下进行了变性中点温度(Tm)的测定。其结果如表8所示。
[表8]
Fc结合性蛋白质 变性中点温度(Tm)(℃)
FcR 48.5
FcRm4 56.0
FcRm6 60.4
FcRm8 60.2
FcRm19 65.6
表8中，FcR表示利用实施例2中制作的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。与该Fc结合性蛋白质相比，作为使用实施例7中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm4、FcRm6、FcRm8、FcRm19的Tm均提高，可以确认热稳定性提高。此外，通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代，实现了提高Fc结合性蛋白质的热稳定性。
实施例11针对Fc结合性蛋白质(FcRm8)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对实施例7(c)中制作的编码FcRm8的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例7(c)所述的质粒pETFcRm8，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO：66所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：67所示的序列组成的寡核苷酸。
[表9]
组成 浓度
模板DNA 0.05ng/μl
各PCR引物 0.4μM
MnCl2 0.4mM
dATP 0.2mM
dGTP 0.2mM
dCTP 1mM
dTTP 1mM
缓冲液(将MnCl2制备为5mM) ×1
GoTaq聚合酶(Promega公司制) 0.05U/μl
H2O 至50μl
PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将(1)中所得的PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)中。
(3)反应结束后，采用电穿孔法用所得的连接产物转化大肠杆菌JM109株，在含50μg/mL卡那霉素的LB培养基中培养(37℃18小时)。培养后平板上形成了约4000个菌落。从将这些菌落混合而得到的混合菌落抽提质粒DNA，以此为FcRm8的随机突变质粒文库。
(4)使用(3)中制作的质粒文库转化大肠杆菌BL21(DE3)株，在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上形成了菌落。由此制作了FcRm8的随机突变转化体文库。
实施例12Fc结合性蛋白质(FcRm8)文库的筛选
(1)将实施例11中制作的FcRm8的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释10倍后，与0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.0)等量混合，53℃热处理20分钟后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行中和。
(4)对于从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，采用以下方法通过ELISA法测定了抗体结合活性。
(4-1)将作为人抗体的γ球蛋白制剂(化学及血清疗法研究所制)在96孔微孔板的孔中以1μg/孔的浓度进行了固定(4℃18小时)，固定化结束后，用含2%(w/v)脱脂乳的50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行了封闭。
(4-2)用洗涤缓冲液(含0.2%(w/v)的Tween 20和150mM的NaCl的10mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0))洗涤后，将制备的蛋白质抽提液用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)适宜稀释，使之与固定化γ球蛋白进行了反应(30℃1小时)。
(4-3)反应结束后，用所述洗涤缓冲液再次洗涤，添加了辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗His-Tag抗体试剂(BETHYL公司制造)。
(4-4)30℃1小时反应后，用所述洗涤缓冲液洗涤，添加TMB过氧化物酶底物(KPL公司制造)，测定了450nM的吸光度。
(5)通过用热处理(53℃20分钟)后的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未经热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(6)从表达与FcRm8相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备了质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm8相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
从核苷酸序列解析的结果可知：与FcRm8相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中发生的氨基酸取代如下(但，存在于FcRm8中的除外)。
具体地，SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中，发生了Thr20Ile、Glu36Gly、Glu44Asp、Val45Ala、Pro49Ser、Gly60Asp、Thr63Leu、Thr65Ala、Ser66Thr、Ser69Thr、Thr73Ala、Val77Glu、Asn78Ser、Arg102Ser、His125Arg、Leu131Pro、Tyr133His、Arg139His、Lys142Glu、Phe147Ser、His148Arg、His148Gln、Trp149Arg、Asn152Ile、Asn152Thr、Leu156His、Leu156Pro、Ile160Thr、Ile160Val、Ile160Leu、Met171Thr、Lys173Arg、Ile181Thr、Leu203His、Asn206Ser、Leu207Gln、Gln219Pro、Leu225Gln、Met231Lys、Arg251Ser、Leu257Arg、Leu257Gln、Gly282Asp、Leu285Gln、Leu285Arg、或Val289Asp所示的取代。热处理后抗体结合活性的残留率(残留活性)、氨基酸取代的解析结果如表10所示。如表10所示可知：通过对FcRm8进一步进行氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表10]
氨基酸取代 残余活性(％) 氨基酸取代 残余活性(％)
Glu36Gly 66.4 Met171Thr 37.4
Glu44Asp 34.0 Leu203Pro 28.4
Pro49Ser 30.7 Leu203His 77.3
Ala62Val 27.5 Asn206Ser 33.8
Thr63Leu 54.7 Leu207Gln 37.8
Gln64Lys 24.0 Gln219Pro 40.3
Thr65Ala 55.9 Leu225Gln 45.5
Ser66Thr 30.8 Ser228Thr 28.7
Ser69Thr 49.5 Gln244Arg 28.8
Thr73Ala 41.7 Arg252His 24.8
Val77Glu 55.9 Leu257Arg 46.3
Ash78Ser 43.3 Leu257Gln 46.7
Arg102Ser 44.0 Pro274Gln 28.2
Val109Ala 16.8 Gly282Asp 40.3
Leu131Pro 40.1 Leu285Gln 70.2
Tyr133His 36.1 Leu285Arg 37.3
Ly5142Glu 39.2 Val289Asp 36.6
Phe147Ser 38.9 Thr20Ile，Met231Lys 56.1
His148Gln 44.2 Gly60Asp，Arg139His 59.7
Trp149Arg 63.9 His125Arg，Met171Thr 35.4
Asn152Ile 56.5 His148Arg，Arg251Ser 61.7
Leu156His 49.5 Trp149Arg，Asn152Thr 68.2
Leu155Pro 33.6 Ile181Thr，Leu285Gln 85.1
Ile160Thr 54.3 Val45Ala，Ile160Leu，Lys173Arg 98.9
Ile160Val 39.0 FcRm8 30.6
实施例13Fc结合性蛋白质(FcRm32)的制作
在实施例12中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了作为参与稳定性提高的氨基酸取代的Glu36Gly、Val45Ala、Pro49Ser、Gly60Asp、Thr65Ala、Tyr133His、Arg139His、Trp149Arg、Leu156Pro、Ile160Thr、Lys173Arg、Ile181Thr、Leu203His、Leu207Gln和Met231Lys，通过对实施例7(d)所述的FcRm19进一步汇集这些取代，制作了作为对于野生型Fc结合性蛋白质进行了32处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm32，以图进一步提高稳定性。而且，Glu36Gly、Val45Ala、Pro49Ser、Gly60Asp、Thr65Ala、Tyr133His、Arg139His、Trp149Arg、Leu156Pro、Ile160Thr、Lys173Arg、Ile181Thr、Leu203His、Leu207Gln和Met231Lys所示的氨基酸取代使用以下所示的寡核苷酸进行。
(i)Glu36Gly的氨基酸取代：由SEQ ID NO：94
(5’-ACGTCACGGATTCTCCCTGGAACACGCTCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：95
(5’-TGAGCGTGTTCCAGGGAGAATCCGTGACGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ii)Val45Ala的氨基酸取代：由SEQ ID NO：96
(5’-AGACAGATGCGGTGCTTCGCAGTGCAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：97(5’-TTGCACTGCGAAGCACCGCATCTGTCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iii)Pro49Ser的氨基酸取代：由SEQ ID NO:98
(5’-AACTTGACCCAGACAGATGCGGTACTT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO：99(5’-AAGTACCGCATCTGTCTGGGTCAAGTT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iv)Gly60Asp和Thr65Ala的氨基酸取代：由SEQ ID NO:100
(5’-GGGTGGAGGCCTGGATCGCGGTGTCATTCAGGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:101
(5’-TCCTGAATGACACCGCGATCCAGGCCTCCACCC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(v)Tyr133His和Arg139His的氨基酸取代：由SEQ ID NO:102
(5’-TTGTGGTAGTAAAGCACGTTGTGCACCAGCTT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:103
(5’-TGCACAACGTGCTTTACTACCACAACGGCAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(vi)Trp149Arg的氨基酸取代：由SEQ ID NO:104
(5’-AGGTTGGAGTTCCGGTGGAAGAACTTAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:105
(5’-TTAAGTTCTTCCACCGGAACTCCAACCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(viii)Leu156Pro和Ile160Thr的氨基酸取代：由SEQ ID NO:106
(5’-TGTGGGACGTGTTCGTCTTCGGAATGGTCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:107
(5’-TGACCATTCCGAAGACGAACACGTCCCACA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ix)Lys173Arg的氨基酸取代：由SEQ ID NO:108
(5’-TCCCGCCGACGTATAACGATGTCTGCCCAT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(x)Ile181Thr的氨基酸取代：由SEQ ID NO:109
(5’-ACATCGTTATACGTCGGCGGGAACCTCGGTCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(xi)Leu203His和Leu207Gln的氨基酸取代：由SEQ ID NO:110
(5’-AGGGTCACCTGAGTGCCTTCATGCAGCGG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:111
(5’-CCGCTGCATGAAGGCACTCAGGTGACCCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(xii)Met231Lys的氨基酸取代：由SEQ ID NO:112
(5’-CGCAGGGTTTTGCTGCCCTTATAGAACGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:113
(5’-TCGTTCTATAAGGGCAGCAAAACCCTGCG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例7(d)所述的质粒pETFcRm19作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:94所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p1。
(2)以实施例7(d)所述的质粒pETFcRm19作为模板，以由SEQ ID NO:95所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:106所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p2。
(3)以实施例7(d)所述的质粒pETFcRm19作为模板，以由SEQ ID NO:107所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:110所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p3。
(4)以实施例7(d)所述的质粒pETFcRm19作为模板，以由SEQ ID NO:111所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p4。
(5)对所述的m32p1、m32p2、m32p3和m32p4这4种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m32p1、m32p2、m32p3和m32p4混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。
(6)以(5)的PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p5。
(7)对所述的m32p5进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:98所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p6。
(8)对所述的m32p5进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:99所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:104所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p7。
(9)对所述的m32p5进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:105所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p8。
(10)对所述的m32p6、m32p7和m32p8这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m32p6、m32p7和m32p8混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p9。
(11)对所述的m32p9进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:100所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p10。
(12)对所述的m32p9进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:101所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:108所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p11。
(13)对所述的m32p9进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:109所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p12。
(14)对所述的m32p10、m32p11和m32p12这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m32p10、m32p11和m32p12混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p13。
(15)所述的m32p13进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:96所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p14。
(16)对所述的m32p13进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:97所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:102所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p15。
(17)对所述的m32p13进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:103所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:112所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p16。
(18)对所述的m32p13进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:113所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m32p17。
(19)对所述的m32p14、m32p15、m32p16和m32p17这4种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m32p14、m32p15、m32p16和m32p17混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。
(20)以(19)的PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。
(21)对(20)中所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了32处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm32的多核苷酸。
(22)将所述的编码FcRm32的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(23)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm32的多核苷酸的质粒pETFcRm32。
(24)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm32的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm32的氨基酸序列如SEQ IDNO:114所示，编码所述FcRm32的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:115所示。需要说明的是，SEQ ID NO:114中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm32的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:114中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Val45Ala的丙氨酸存在于第63位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Ile100Val的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Leu203His的组氨酸存在于第221位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Gln的谷氨酰胺存在于第225位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例14Fc结合性蛋白质(FcRm32)的生产性评价
(1)将实施例13中制作的转化体接种于添加了50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基，通过37℃振荡培养过夜，进行了前培养。
(2)将前培养液接种于添加了50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基，37℃振荡培养。培养开始1.5小时后将培养温度变更为20℃，30分钟振荡培养后，添加终浓度0.01mM的IPTG，继续20℃振荡培养过夜。
(3)培养结束后，通过离心分离操作收集菌体，使用BugBuster蛋白提取试剂盒(TAKARABio公司制造)从菌体制备了蛋白质。
(4)对于所得的制备蛋白质的抗体结合活性，通过采用实施例12(4)所述的ELISA法进行评价，测定了Fc结合性蛋白质的生产性。Fc结合性蛋白质的生产性以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行比较，结果如图8所示。需要说明的是，图8中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，FcRm19是用实施例7(d)的转化体表达的Fc结合性蛋白质。与这些Fc结合性蛋白质相比，作为用实施例13中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm32均确认了高的生产性。由图8的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例15Fc结合性蛋白质(FcRm32)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备Fc结合性蛋白质(FcRm19、FcRm32)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法进行了浓度测定。
(2)进行稀释，使得浓度测定后的蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置5分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法测定了碱处理、未处理样品的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的抗体结合活性除以未碱处理时的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图9所示。图9中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，FcRm19是用实施例7(d)的转化体表达的Fc结合性蛋白质。与这些Fc结合性蛋白质相比，可以确认使用实施例13中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm32对碱的稳定性比FcR、FcRm19高。由图9的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例16针对Fc结合性蛋白质(FcRm32)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对编码实施例13中制作的FcRm32的多核苷酸随机地导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例13所述的质粒pETFcRm32，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:66所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:67所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)对(1)中所得的PCR产物进行纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)中。
(3)反应结束后，使用所得的连接产物，采用电穿孔法转化大肠杆菌JM109株，在含50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中培养(37℃18小时)。培养后平板上形成了约19000个菌落。从将这些菌落混合而得到的混合菌落抽提质粒DNA，以此为FcRm32的随机突变质粒文库。
(4)使用(3)中制作的质粒文库，转化大肠杆菌BL21(DE3)株，在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上形成菌落。由此制作了FcRm32的随机突变转化体文库。
实施例17稳定性提高的Fc结合性蛋白质(FcRm32)文库的筛选
(1)将实施例16中制作的FcRm32的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释10倍，与0.1M的甘氨酸-氢氧化钠缓冲液(pH10.0)等量混合，70℃热处理20分钟后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行了中和。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，通过用热处理(70℃20分钟)后的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未热处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从表达与FcRm32相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm32相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置(但，存在于FcRm32中的除外)。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，发生了Gln27Pro、Gln35Leu、Leu41Met、Ser51Thr、Ser51Pro、Ser52Gly、Ser53Leu、Gly60Gly、Thr63Leu、Gln64Pro、Thr73Ser、Val77Asp、Ser80Ala、Leu89Gln、Arg92Cys、Gln97Leu、Asp129Gly、Leu131Gln、Leu131Pro、Tyr133Arg、Asn134Ser、Tyr138His、Phe144Ile、His148Arg、Asn152Thr、Lys157Arg、Ser182Thr、Val193Leu、Val198Gly、Ser200Gly、Ser200Arg、Leu207Pro、Leu207His、Ser211Arg、Leu223Arg、Asn240Gly、Gln246Arg、Ala250Val、Thr264Ser、Asn268Ser、Glu277Val、或Thr287Ile所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Gly60Gly)，表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸(下同)。热处理后的抗体结合活性的残留率(残留活性)、氨基酸取代的解析结果如表11所示。如表11所示可知：通过对FcRm32进行进一步氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表11]
Figure BDA00002388323000561
实施例18Fc结合性蛋白质(FcRm36b)的制作
从实施例17中已经明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了作为参与稳定性提高的氨基酸取代的Gln35Leu、Leu41Met、Ser52Gly和Asn152Thr，通过对实施例13所述的FcRm32进一步汇集这些取代，制作作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了36处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm36b，以图进一步提高稳定性。而且，为了Gln35Leu、Leu41Met和Ser52Gly所示的氨基酸取代，使用了由SEQ ID NO:116
(5’-ATGCGGTGCTTCGCAGTGCATCGTCACGGATTCTCCCAGGAACA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:117
(5’-GACGATGCACTGCGAAGCACCGCATCTGTCTGGGTCAGGTTCAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例13所述的质粒pETFcRm32作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:116所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m36bp1。
(2)以实施例17的筛选中取得的、包含编码作为Fc结合性蛋白质FcRm32中进一步发生了Asn152Thr所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。该PCR反应中，以由SEQ ID NO:117所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:92所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m36bp2。
(3)以实施例13所述的质粒pETFcRm32作为模板，以由SEQ ID NO:93所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m36bp3。
(4)对所述的m36bp1、m36bp2和m36bp3这3种PCR产物进行了纯化。将纯化的m36bp1、m36bp2和m36bp3混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了36处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm36b的多核苷酸。
(5)将所述的编码FcRm36b的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(6)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm36b的多核苷酸的质粒pETFcRm36b。
(7)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm36b的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm36b的氨基酸序列如SEQ IDNO:118所示，编码所述FcRm36b的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:119所示。需要说明的是，SEQ ID NO:118中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm36b的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:118中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、Val45Ala的丙氨酸存在于第63位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Ile100Val的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Leu203His的组氨酸存在于第221位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Gln的谷氨酰胺存在于第225位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例19Fc结合性蛋白质(FcRm36b)的生产性评价
采用如实施例14那样的方法制备了实施例18和实施例2中制作的转化体，将采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较。
结果如图10所示。需要说明的是，图10中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图10中的FcRm32是用实施例13的转化体表达的Fc结合性蛋白质。与这些Fc结合性蛋白质相比，作为用实施例18中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm36b可以确认高的生产性。由图10的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例20Fc结合性蛋白质(FcRm36b)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备Fc结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法进行了浓度测定。
(2)进行稀释使得进行了浓度测定后的蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置5分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)进行调整使pH回到中性区域，对于进行了(2)的碱处理的试样、和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性，采用实施例12(4)所述的ELISA法进行了测定。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未进行碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图11所示。图11中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图11中的FcRm32是用实施例13的转化体表达的Fc结合性蛋白质。与这些FcR、FcRm32相比，作为用实施例18中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm36b，可以确认对碱的稳定性高。由图11的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例21针对Fc结合性蛋白质(FcRm36b)的突变导入和文库的制作
(1)利用易错PCR，对实施例18中制作的编码FcRm36b的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA，使用了实施例18所述的质粒pETFcRm36b。此外，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:120
(5’-TCAGCCATGGGACAAGTAGATACCCCCAAAGCTGTGATTA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:121
(5’-CCAAGCTTAATGATGATGATGATGATGGACCGGGGTCGGCTGTTGATGACCCAG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将(1)中所得的PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE (图4)中。
(3)反应结束后，采用电穿孔法使用所得的连接产物转化大肠杆菌BL21(DE3)株，通过在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上形成菌落，制作了FcRm36b的随机突变转化体文库。
实施例22Fc结合性蛋白质(FcRm36b)文库的筛选
(1)将实施例21中制作的FcRm36b的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释5倍，与400mM的氢氧化钠水溶液等量混合，30℃碱处理60分钟后，使用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将pH调整回中性区域。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，通过用进行了(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从表达与FcRm36b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm36b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析的结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置(但，FcRm36b中存在的除外)总结如下。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，发生了Thr25Met、Gln35Met、His42Leu、Ser53Thr、Gln64His、Thr67Ala、Thr67Ser、Val77Lys、Leu89Pro、Ser90Gly、Gln97Leu、Gln97Lys、Arg102Leu、Gly103Asp、Thr115Ile、Glu118A sp、Lys128Arg、Asp129Gly、Leu131Gln、Tyr133Tyr、Lys142Arg、Asn152Pro、Lys157Arg、Ser182Thr、Ser182Leu、Thr199Ala、Leu203Leu、Glu213Val、Lys215Arg、Lys215Glu、Leu218Ile、Gln224Arg、Tyr230His、Ser233Gly、Lys234Glu、Glu244Val、Thr249Ala、Thr249Ser、Glu253Gly、Glu261Val、Ala262Val、Ala263Ser、Glu265Ala、Glu265Gly、Leu270His、Lys271Arg、Gln279Arg、Gln279His、Leu283Pro、Pro286Gln、Thr287Ile、Thr287Pro、Val289Ala、Val289Asp、或Val289Gly所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Tyr133Tyr)，表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸。氨基酸取代的解析结果如表12所示。如表12所示，可知通过对FcRm36b进行进一步的氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表12]
Figure BDA00002388323000611
实施例23Fc结合性蛋白质(FcRm44)的制作
从实施例22中已经明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了作为参与稳定性提高的氨基酸取代的Gln97Leu、Lys128Arg、Lys157Arg、Ser182Leu、Glu213Val、Leu218Ile、Thr249Ala和Glu261Val，将这些取代进一步汇集在实施例18所述的FcRm36b中，制作了相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了44处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm44，以图进一步提高稳定性。而且，Lys128Arg、Lys157Arg、Glu213Val、Leu218Ile和Thr249Ala所示的氨基酸取代使用以下所示的寡核苷酸进行。
(i)Lys 128Arg的氨基酸取代：由SEQ ID NO:122
(5’-CAGCTTATCTCTCCATGCGTGGCAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:123(5’-TTGCCACGCATGGAGAGATAAGCTG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ii)Lys157Arg的氨基酸取代：由SEQ ID NO:124
(5’-ACGTGTTCGTCCTCGGAATGGTCAGGGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:125(5’-ACCCTGACCATTCCGAGGACGAACACGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iii)Glu213Val和Leu218Ile的氨基酸取代：由SEQ ID NO:126
(5’-ACGCTGTATCAGCAGTTTGGTTACGCAGCTCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:127
(5’-TGAGCTGCGTAACCAAACTGCTGATACAGCGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iv)Thr249Ala的氨基酸取代：由SEQ ID NO:128
(5’-ACGACGCGCGGCTAAAATCTGATACT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:129(5’-AGTATCAGATTTTAGCCGCGCGTCGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以包含实施例22的筛选中取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm36b中进一步发生了Gln97Leu和Glu261Val所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:122所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p1。
(2)以包含实施例22的筛选中取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm36b中进一步发生了Gln97Leu和Glu261Val所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQ ID NO:123所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:128所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p2。
(3)以包含实施例22的筛选中取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm36b中进一步发生了Gln97Leu和Glu261Val所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。以由SEQ ID NO:129所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p3。
(4)将所述的m44p1、m44p2和m44p3这3种PCR产物进行纯化，将其混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p4。
(5)将所述的m44p4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:124所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p5。
(6)以包含实施例22的筛选中取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm36b中进一步发生了Ser182Leu和Glu213Val所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。以由SEQ ID NO:125所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:126所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p6。
(7)将所述的m44p4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:127所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m44p7。
(8)将所述的m44p5、m44p6和m44p7这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m44p5、m44p6和m44p7混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。将所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了44处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm44的多核苷酸。
(9)将所述的编码FcRm44的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(10)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm44的多核苷酸的质粒pETFcRm44。
(11)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm44的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm44的氨基酸序列如SEQ IDNO:130所示，编码所述FcRm44的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:131所示。需要说明的是，SEQ ID NO:130中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm44的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:130中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、Val45Ala的丙氨酸存在于第63位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Leu203His的组氨酸存在于第221位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Gln的谷氨酰胺存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Glu261VaL的缬氨酸存在于第279位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例24Fc结合性蛋白质(FcRm44)的生产性评价
按照如实施例14那样的方法制备了实施例23和实施例2中制作的转化体，将采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较。
结果如图12所示。需要说明的是，图12中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。与该野生型Fc结合性蛋白质相比，作为使用实施例23中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm44可以确认高的生产性。由图12的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例25Fc结合性蛋白质(FcRm44)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法，制备了Fc结合性蛋白质(FcRm36b、FcRm44)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释使得各Fc结合性蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置10分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法测定了经过(2)的碱处理的试样、和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未经碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图13所示。图13中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图13中的FcRm36b是用实施例18的转化体表达的Fc结合性蛋白质。可以确认，与这些Fc结合性蛋白质相比，使用实施例23中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm44对碱的稳定性高。由图13的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例26针对Fc结合性蛋白质(FcRm44)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对实施例23中制作的编码FcRm44的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例23所述的质粒pETFcRm44。此外，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:120所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:121所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将(1)中所得的PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)中。
(3)反应结束后，使用所得的连接产物采用电穿孔法转化大肠杆菌BL21(DE3)株，通过在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基上形成菌落，制作了FcRm44的随机突变转化体文库。
实施例27Fc结合性蛋白质(FcRm44)文库的筛选
(1)将实施例26中制作的FcRm44的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释5倍，与400mM的氢氧化钠水溶液等量混合，30℃碱处理120分钟后，使用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将pH调整回中性区域。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，通过用进行了(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从表达与FcRm44相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备质粒，对于所述质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm44相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析的结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置(但FcRm44中存在的除外)如下。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，发生了Val17Gly、Thr19Ile、Thr25Met、Thr25Arg、Gln35Met、Glu44Asp、Leu46Ser、His47Gln、His47Leu、Pro49Ala、Gly50Arg、Ser51Thr、Ser51Leu、Ser51Pro、Gln55Arg、Ala62Val、Gln64Leu、Ser69Ala、Thr73Ala、Asn78Gly、Ser80Ala、Gly88Ser、Ser90Gly、His101Leu、Gly103Ser、Ala121Thr、Ala121Val、Lys128Gly、Leu131Gln、Asn134Ser、Tyr137Phe、Ser151Thr、Asn159Thr、Thr165Met、Thr184Ser、Asn195Asn、Asn195Ala、Ala196Ser、Thr199Ser、Leu203Gln、Glu204Val、Ser211Gly、Gln219Arg、Gln224Arg、Phe227Ile、Ser233Asn、Lys234Glu、Gln246Arg、Leu248Ile、Arg252His、Leu257Gln、Asn268Ile、Gln279Arg、Gly282Asp、Pro286Arg、Thr287Pro、Thr287Ala、Thr287Val、Val289Ala、Val289Asp、或Val289Leu所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Asn195Asn)表示表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸。氨基酸取代的解析结果如表13所示。如表13所示，可知通过对FcRm44进行进一步的氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表13]
Figure BDA00002388323000681
实施例28Fc结合性蛋白质(FcRm48)的制作
从实施例27已经明确了参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代的中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Ser51Thr、Leu131Gln、Tyr137Phe和Thr184Ser，将这些取代进一步汇集在实施例23所述的FcRm44中，制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了48处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm48，以图进一步提高稳定性。而且，为了Leu131Gln的氨基酸取代，使用了由SEQ ID NO:132(5’-GTGCACCTGCTTATCTCTCCATGCGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:133(5’-ACGCATGGAGAGATAAGCAGGTGCAC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以包含在实施例27的筛选中取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm44中进一步发生了Ser51Thr、Tyr137Phe和Thr184Ser所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:132所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m48p1。
(2)以实施例27的筛选中取得的包含编码在Fc结合性蛋白质FcRm44中进一步发生了Ser51Thr、Tyr137Phe和Thr184Ser所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQ ID NO:133所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m48p2。
(3)将所述的m48p1和m48p2的2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m48p1和m48p2混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。将所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行48处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm48的多核苷酸。
(4)将所述的编码FcRm48的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(5)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm48的多核苷酸的质粒pETFcRm48。
(6)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm48的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm48的氨基酸序列如SEQ IDNO:134所示，编码所述FcRm48的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:135所示。需要说明的是，SEQ ID NO:134中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm48的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:134中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、Val45Ala的丙氨酸存在于第63位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Thr的苏氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Leu131Gln的谷氨酰胺存在于第149位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Leu203His的组氨酸存在于第221位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Gln的谷氨酰胺存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Glu261VaL的缬氨酸存在于第279位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例29Fc结合性蛋白质(FcRm48)的生产性评价
采用如实施例14那样的方法制备了实施例28和实施例2中制作的转化体，对于采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性，以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)进行了比较。
结果如图14所示。需要说明的是，图14中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。可以确认与该野生型Fc结合性蛋白质相比，使用实施例28中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm48的生产性高。由图14的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例30Fc结合性蛋白质(FcRm48)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备了Fc结合性蛋白质(FcRm44、FcRm48)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释，使得各Fc结合性蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置50分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法测定了进行了(2)的碱处理的试样、和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未经碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图15所示。图15中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图15中的FcRm44是用实施例23的转化体表达的Fc结合性蛋白质。可以确认与这些Fc结合性蛋白质相比，用实施例28中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm48对碱的稳定性高。由图15的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例31针对Fc结合性蛋白质(FcRm48)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对实施例28中制作的编码FcRm48的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例28所述的质粒pETFcRm48。此外，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:120所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:121所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将(1)中所得的PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)中。
(3)反应结束后，使用所得的连接产物采用电穿孔法转化大肠杆菌BL21(DE3)株，通过在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基形成菌落，制作了FcRm48的随机突变转化体文库。
实施例32稳定性提高的Fc结合性蛋白质(FcRm48)文库的筛选
(1)将实施例31中制作的FcRm48的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释5倍，与600mM的氢氧化钠水溶液等量混合，30℃碱处理120分钟后，使用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将pH调整回中性区域。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，用进行了(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从表达与FcRm48相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质转化体制备了质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm48相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析的结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置如下(但，FcRm48中存在的除外)。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，发生了Thr25Met、Gln35Arg、His42Leu、Val45Val、His47Asn、Ser51Ala、Ser53Pro、Gln64Lys、Arg71Tyr、Val77Val、Ile96Val、Ser151Thr、Asn159Asp、Thr199Ser、Thr199Ala、Leu207Arg、Thr209Ala、Glu213Ile、Lys215Glu、Leu223Arg、Leu223Gln、Lys234Glu、Asn240Gly、Glu261Ala、Asn268Thr、Leu270Arg、Leu270Val、Arg272Gln、Pro286Glu、Pro286Gln、Thr287Pro、Thr287Ser、Pro288Ala、Pro288Ser、Val289Ala、Val289A sp、或Val289Gly所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Val77Val)，表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸。氨基酸取代的解析结果如表14所示。如表14所示，可知通过对FcRm48进行进一步的氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表14]
Figure BDA00002388323000741
实施例33Fc结合性蛋白质(FcRm54b)的制作
从实施例32中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代His42Leu、Ser51Ala、Ser151Thr、Thr199Ala、Lys234Glu和Leu270Val。此外，实施例27中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Thr73Ala、Ala121Val。将选择的这些取代进一步汇集于实施例28所述的FcRm48中，并进一步进行将Val45Ala所示的氨基酸取代恢复为缬氨酸的取代，从而制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了54处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm54b，以图进一步提高稳定性。而且，His42Leu、Thr73Ala、Ala121Val、Ser151Thr、Lys234Glu、Leu270Val所示的氨基酸取代使用以下所示的寡核苷酸进行。
(i)His42Leu的氨基酸取代：由SEQ ID NO:136
(5’-CTTCGCAGAGCATCGTCACGGATTCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:137(5’-AGAATCCGTGACGATGCTCTGCGAAG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ii)Thr73Ala的氨基酸取代：由SEQ ID NO:138
(5’-TCGCTCGCGGAGGCAATGTGGTAAGT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:139(5’-ACTTACCACATTGCCTCCGCGAGCGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iii)Ala121Val的氨基酸取代：由SEQ ID NO:140
(5’-TGGCAACGTAATACAAGCGGTTCGCCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:141(5’-AGGCGAACCGCTTGTATTACGTTGCCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iv)Ser151Thr的氨基酸取代：由SEQ ID NO:142
(5’-TGGTCAGGGTTGTGTTCCGGTGGAAGAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:143
(5’-TTCTTCCACCGGAACACAACCCTGACCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(v)Lys234Glu的氨基酸取代：由SEQ ID NO:144
(5’-TCCGCGCAGGGTTTCGCTGCCCTTATA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:145(5’-TATAAGGGCAGCGAAACCCTGCGCGGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(vi)Leu270Val的氨基酸取代：由SEQ ID NO:146
(5’-TGGGCTCCGTTTAACCACATTGCCAT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:147(5’-ATGGCAATGTGGTTAAACGGAGCCCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以包含实施例32的筛选中取得的、编码Fc结合性蛋白质FcRm48中进一步发生了Ser51Ala和Thr199Ala所示的氨基酸取代、且Val45Ala所示的氨基酸取代恢复为缬氨酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:138所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp1。
(2)以包含实施例32的筛选中取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm48中进一步发生了Ser51Ala和Thr199Ala所示的氨基酸取代、且Val45Ala所示的氨基酸恢复为缬氨酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:139所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:140所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp2。
(3)以包含实施例32的筛选取得的、编码在Fc结合性蛋白质FcRm48中进一步发生了Ser51Ala和Thr199Ala所示的氨基酸取代、且Val45Ala所示的氨基酸取代恢复为缬氨酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:141所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp3。
(4)将所述的m54bp1、m54bp2和m54bp3这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m54bp1、m54bp2和m54bp3混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp4。
(5)所述的m54bp4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:142所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp5。
(6)将所述的m54bp4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:143所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:146所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp6。
(7)将所述的m54bp4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:147所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp7。
(8)将所述的m54bp5、m54bp6和m54bp7这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m54bp5、m54bp6和m54bp7混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ IDNO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp8。
(9)将所述的m54bp8进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:136所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp9。
(10)将所述的m54bp8进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:137所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:144所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp10。
(11)将所述的m54bp8进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:145所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m54bp11。
(12)将所述的m54bp9、m54bp10和m54bp11这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m54bp9、m54bp10和m54bp11混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。将所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了54处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm54b的多核苷酸。
(13)将所述的编码FcRm54b的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(14)将所得的转化体在添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基中进行培养，通过从菌体抽提质粒，得到了包含编码FcRm54b的多核苷酸的质粒pETFcRm54b。
(15)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm54b的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm54b的氨基酸序列如SEQ IDNO:148所示，编码所述FcRm54b的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:149所示。需要说明的是，SEQ ID NO:148中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm54b的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:148中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、His42Leu的亮氨酸存在于第60位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Ala的丙氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Thr73Ala的丙氨酸存在于第91位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Ala121VaL的缬氨酸存在于第139位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Leu131Gln的谷氨酰胺存在于第149位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Ser151Thr的苏氨酸存在于第169位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Thr199Ala的丙氨酸存在于第217位、Leu203His的组氨酸存在于第221位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Gln的谷氨酰胺存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Lys234Glu的谷氨酸存在于第252位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Glu261VaL的缬氨酸存在于第279位、Leu270VaL的缬氨酸存在于第288位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例34Fc结合性蛋白质(FcRm54b)的生产性评价
采用如实施例14那样的方法制备了实施例33和实施例2中制作的转化体，对于采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性，以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较。
结果如图16所示。需要说明的是，图16中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。可以确认与该野生型Fc结合性蛋白质相比，用实施例33中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm54b的生产性高。由图16的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例35Fc结合性蛋白质(FcRm54b)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备了Fc结合性蛋白质(FcRm48、FcRm54b)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释使得各Fc结合性蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置120分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定了进行了(2)的碱处理的试样、和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未经碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图17所示。图17中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图17中的FcRm48是用实施例28的转化体表达的Fc结合性蛋白质。可以确认与这些Fc结合性蛋白质相比，用实施例33中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm54b对碱的稳定性高。由图17的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例36针对Fc结合性蛋白质(FcRm54b)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对实施例33中制作的编码FcRm54b的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例33所述的质粒pETFcRm54b。此外，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:120所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:121所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将(1)中所得的PCR产物纯化后，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化，用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)。反应结束后，使用所得的连接产物采用电穿孔法转化大肠杆菌BL21(DE3)株，通过在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基形成菌落，制作了FcRm54b的随机突变转化体文库。
实施例37稳定性提高的Fc结合性蛋白质(FcRm54b)文库的筛选
(1)将实施例36中制作的FcRm54b的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释5倍，与700mM的氢氧化钠水溶液等量混合，30℃碱处理120分钟后，使用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将pH调整回中性区域。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，用进行了(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从与表达FcRm54b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备了质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm54b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析的结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置总结如下(但，FcRm54b中存在的除外)。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中发生了Thr25Met、Gln35Gln、Leu41Leu、His47Gln、His47Asn、Ser53Pro、Phe57Tyr、Leu58Arg、Ala62Glu、Tyr70His、Arg92Leu、Ser111Ala、Thr115Ile、Glu118Asp、Tyr133Tyr、Gly141Asp、Gly141Val、Thr154Ser、Ser182Val、Thr184Thr、Pro190Ser、Leu202Met、Leu203Tyr、Leu207Pro、Glu213Glu、Leu217Arg、Leu218Met、Leu218Lys、Gln219Arg、Met231Arg、Glu244Val、Tyr245His、Leu248Ser、Glu261Glu、Ala263Ser、Pro286Gln、Thr287Ala、Pro288Thr、Val289Gly、Val289Asp、或Val289Leu所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Gln35Gln)，表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸。氨基酸取代的解析结果如表15所示。如表15所示，可知通过对FcRm54b进行进一步氨基酸残基的取代(突变)，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表15]
Figure BDA00002388323000821
实施例38Fc结合性蛋白质(FcRm56b)的制作
从实施例37中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Leu58Arg、Ser111Ala和Thr115Ile。将选择出的这些取代进一步汇集在实施例33所述的FcRm54b中，并进一步进行了将Glu261Val的氨基酸取代恢复为谷氨酰胺的取代，从而制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了56处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm56b，以图进一步提高稳定性。而且，为了产生Ser111Ala所示的取代以及将Glu261Val所示的氨基酸取代恢复为原来的谷氨酰胺(Glu)，使用了以下所示的寡核苷酸。
(i)Ser111Ala的氨基酸取代：由SEQ ID NO:150
(5’-AAACGCGGGCGCTAACCTGTAAAAGCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:151(5’-TGCTTTTACAGGTTAGCGCCCGCGTTT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ii)将Glu261Val的氨基酸取代恢复为原来的谷氨酰胺(Glu)：由SEQ IDNO:152(5’-TCGGTCGCCGCTTCACACCAGTACA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:153(5’-TGTACTGGTGTGAAGCGGCGACCGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例37的筛选取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm54b中进一步发生了Leu58Arg和Thr115Ile所示的取代Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:152所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m56bp1。
(2)以实施例37的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm54b中进一步发生了Leu58Arg和Thr115Ile所示的取代Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:153所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸的PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m56bp2。
(3)将所述的m56bp1和m56bp2这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m56bp1和m56bp2混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m56bp3。
(4)将所述的m56bp3进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:150所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m56bp4。
(5)将所述的m56bp3进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:151所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m56bp5。
(6)将所述的m56bp4和m56bp5这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m56bp4和m56bp5混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。将所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了56处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm56b的多核苷酸。
(7)将所述的编码FcRm56b的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(8)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm56b的多核苷酸的质粒pETFcRm56b。
(9)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm56b的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm56b的氨基酸序列如SEQ IDNO:154所示，所述编码FcRm56b的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:155所示。需要说明的是，SEQ ID NO:154中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm56b的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:154中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、His42Leu的亮氨酸存在于第60位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Ala的丙氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Leu58Arg的精氨酸存在于第76位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Thr73Ala的丙氨酸存在于第91位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Ser111Ala的丙氨酸存在于第129位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Thr115Ile的异亮氨酸存在于第133位、Ala121VaL的缬氨酸存在于第139位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Leu131Gln的谷氨酰胺存在于第149位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Ser151Thr的苏氨酸存在于第169位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Thr199Ala的丙氨酸存在于第217位、Leu203His的组氨酸存在于第221位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Gln的谷氨酰胺存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Lys234Glu的谷氨酸存在于第252位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Leu270VaL的缬氨酸存在于第288位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例39Fc结合性蛋白质(FcRm56b)的生产性评价
采用如实施例14那样的方法制备了实施例38和实施例2中制作的转化体，对于采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性，以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较。
结果如图18所示。需要说明的是，图18中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。与该野生型Fc结合性蛋白质相比，作为用实施例38中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质的FcRm56b，可以确认高的生产性。由图18的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例40Fc结合性蛋白质(FcRm56b)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备了Fc结合性蛋白质(FcRm54b、FcRm56b)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释使得各Fc结合性蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置180分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定了进行了(2)的碱处理的试样和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未经碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图19所示。图19中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图19中的FcRm54b是用实施例33的转化体表达的Fc结合性蛋白质。可以确认与这些Fc结合性蛋白质相比，用实施例38中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm56b对碱的稳定性高。由图19的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例41针对Fc结合性蛋白质(FcRm56b)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对实施例38中制作的编码FcRm56b的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例38所述的质粒pETFcRm56b。此外，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:120所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:121所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将所述PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)中。反应结束后，使用所得的连接产物采用电穿孔法转化大肠杆菌BL21(DE3)株，通过在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基形成菌落，制作了FcRm56b的随机突变转化体文库。
实施例42稳定性提高的Fc结合性蛋白质(FcRm56b)文库的筛选
(1)将实施例41中制作的FcRm56b的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释5倍，与800mM的氢氧化钠水溶液等量混合，30℃碱处理180分钟后，使用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将pH调整回中性区域。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，用进行了(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从表达与FcRm56b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备了质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm56b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析的结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置(但FcRm56b中存在的除外)如下。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，发生了Thr19Ile、Thr25Thr、Thr25Met、Thr38Ala、Ser53Thr、Thr61Ala、Thr63Phe、Tyr70Phe、Asn78Gly、Leu131Leu、Asn140Asp、Thr154Ser、Ser161Thr、Thr177Ser、Leu203Leu、Leu203Arg、Leu207Pro、Lys215Arg、Tyr230Phe、Ser233Gly、Asn268Ser、Leu283Leu、Leu285His、Pro286Ser、Thr287Pro、Val289Ala、Val289Asp、Val289Leu、或Val289Ile所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Thr25Thr)，表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸。氨基酸取代的解析结果如表16所示。如表16所示，可知通过对FcRm56b进行进一步的氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表16]
氨基酸取代 残余活性(％) 氨基酸取代 残余活性(％)
Thr19Ile 47.4 Thr287Pro 48.1
Thr25Thr 47.9 Thr287Asn 37.9
Thr38Ala 40.8 Val289Leu 47.7
Ser53Thr 41.1 Thr25Met，As n268Ser 44.6
Thr61Ser 38.1 Glu44Val，Thr67Ala 38.7
Thr63Phe 41.4 Tyr70Phe，Lys215Arg 58.8
Tyr70Phe 59.3 Ash78Gly，Val289Asp 43.6
His101Tyr 39.6 Leu131Leu，Leu203Leu 54.7
Asn140Asp 41.9 Thr154Ser，Ser233Gly 43.6
Leu203Arg 50.7 Ser161Thr，Val 289Asp 42.5
Leu207Pro 51.6 Thr177ser，Ash268Ser 41.2
Tyr230Phe 60.6 Leu203Arg，Ser233Gly 56.3
Ser233Gly 50.8 Pro286Ser，Val289Ala 42.3
Leu283Leu 42.5 Thr61Ala，Ash268ser，Val289Tle 42.3
Leu285His 46.7 FcRm56b 40.2
实施例43Fc结合性蛋白质(FcRm57b)的制作
从实施例42中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Tyr70Phe、Leu207Pro、Tyr230Phe和Ser233Gly，将这些取代进一步汇集在实施例38所述的FcRm56b中，并进一步进行了将Leu131Gln和Leu203His的氨基酸取代恢复为亮氨酸的取代，制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了57处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm57b。而且，Tyr70Phe、Leu207Pro、Tyr230Phe、Ser233Gly所示的氨基酸取代使用以下所示的寡核苷酸进行。(i)Tyr70Phe的氨基酸取代：由SEQ ID NO:156(5’-AGGCAATGTGGAAAGTCGGGGTGGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:157(5’-TCCACCCCGACTTTCCACATTGCCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ii)Leu207Pro的氨基酸取代：由SEQ ID NO:158(5’-AGCTCAGGGTCACCGGAGTGCCTTCA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:159(5’-TGAAGGCACTCCGGTGACCCTGAGCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iii)Tyr230Phe的氨基酸取代：由SEQ ID  NO:160(5’-GCCCTTAAAGAACGAGAAATACAGCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:161(5’-AGCTGTATTTCTCGTTCTTTAAGGGC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(iv)Ser233Gly的氨基酸取代：由SEQ ID NO:162(5’-TCCGCGCAGGGTTTCGCCGCCCTTA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:163(5’-TAAGGGCGGCGAAACCCTGCGCGGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例42的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm56b中将Leu131Gln和Leu203His的氨基酸取代分别恢复为亮氨酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:156所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp1。
(2)以实施例42的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm56b中的Leu131Gln和Leu203His的氨基酸取代分别恢复为亮氨酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用由SEQ ID NO:157所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:162所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp2。
(3)以实施例42的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm56b中的Leu131Gln和Leu203His的氨基酸取代分别恢复为亮氨酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:163所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp3。
(4)将所述的m57bp1、m57bp2和m57bp3这3种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m57bp1、m57bp2、和m57bp3混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp4。
(5)将所述的m57bp4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:158所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp5。
(6)将所述的m57bp4进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:159所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp6。
(7)将所述的m57bp5和m57bp6这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m57bp5和m57bp6混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp7。
(8)将所述的m57bp7进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:160所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp8。
(9)将所述的m57bp7进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:161所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m57bp9。
(10)将所述的m57bp8和m57bp9这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m57bp8和m57bp9混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。将所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了57处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm57b的多核苷酸。
(11)将所述的编码FcRm57b的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(12)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm57b的多核苷酸的质粒pETFcRm57b。
(13)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm57b的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm57b的氨基酸序列如SEQ IDNO:164所示，编码所述FcRm57b的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:165所示。需要说明的是，SEQ ID NO:164中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm57b的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:154中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、His42Leu的亮氨酸存在于第60位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Ala的丙氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Leu58Arg的精氨酸存在于第76位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Tyr70Phe的苯丙氨酸存在于第88位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Thr73Ala的丙氨酸存在于第91位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Ser111Ala的丙氨酸存在于第129位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Thr115Ile的异亮氨酸存在于第133位、Ala121VaL的缬氨酸存在于第139位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Ser151Thr的苏氨酸存在于第169位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Thr199Ala的丙氨酸存在于第217位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Pro的脯氨酸存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Tyr230Phe的苯丙氨酸存在于第248位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Ser233Gly的甘氨酸存在于第251位、Lys234Glu的谷氨酸存在于第252位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Leu270VaL的缬氨酸存在于第288位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位的位置。
实施例44Fc结合性蛋白质(FcRm57b)的生产性评价
采用如实施例14那样的方法制备了实施例43和实施例2中制作的转化体，对于采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性，以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较。
结果如图20所示。需要说明的是，图20中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。可以确认与该野生型Fc结合性蛋白质相比，用实施例43中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm57b的生产性高。由图20的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例45Fc结合性蛋白质(FcRm57b)的碱稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备了Fc结合性蛋白质(FcRm56b、FcRm57b)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释使得各Fc结合性蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置120分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法测定了进行了(2)的碱处理的试样、和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未经碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图21所示。图21中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图21中的FcRm56b是用实施例38的转化体表达的Fc结合性蛋白质。可以确认与这些Fc结合性蛋白质相比，用实施例43中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm57b对碱的稳定性高。由图21的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例46针对Fc结合性蛋白质(FcRm57b)的突变导入和文库的制作
(1)通过易错PCR，对实施例43中制作的编码FcRm57b的多核苷酸随机导入突变。易错PCR反应中的反应液组成如表9所示。需要说明的是，作为模板DNA使用了实施例43所述的质粒pETFcRm57b，作为PCR引物使用了由SEQ ID NO:120所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:121所示的序列组成的寡核苷酸。PCR反应如下进行：95℃2分钟热处理后，以第1步95℃30秒、第2步60℃30秒、第3步72℃90秒作为1个循环，将反应进行30个循环，最后72℃热处理7分钟。
(2)将所述PCR产物纯化后，用限制酶NcoI和HindIII消化，通过连接反应插入用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2中制作的质粒pETMalE(图4)中。
(3)反应结束后，使用所得的连接产物采用电穿孔法转化大肠杆菌BL21(DE3)株，通过在含50μg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基形成菌落，制作了FcRm57b的随机突变转化体文库。
实施例47稳定性提高的Fc结合性蛋白质(FcRm57b)文库的筛选
(1)将实施例46中制作的FcRm57b的随机突变转化体文库接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将5μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用纯水稀释5倍，与1000mM的氢氧化钠水溶液等量混合，30℃碱处理180分钟后，使用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)将pH调整回中性区域。
(4)采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定从约3000株转化体所得的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，用进行了(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性除以未进行(3)的碱处理时的Fc结合性蛋白质的抗体结合活性，计算出残留活性比例。
(5)从表达与FcRm57b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质的转化体制备了质粒。对于所得的质粒中插入的编码Fc结合性蛋白质的多核苷酸区域的序列，采用实施例3所述的方法进行解析，确定了与FcRm57b相比稳定性提高的Fc结合性蛋白质中存在的氨基酸的突变位置。
由核苷酸序列解析的结果可知：Fc结合性蛋白质的氨基酸的取代位置(但，FcRm57b中存在的除外)如下。
具体地，SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中，发生了Val17Glu、Gln27Lys、Leu41Leu、Gly50Glu、Ser51Val、Ser53Leu、Thr61Ser、Thr65Val、Ser74Phe、Ser76Asn、Arg84Ser、Gly88Ser、Leu89Pro、Ile96Lys、Thr115Phe、Glu118Asp、Asp129Gly、Gly141Asp、Asn159Asp、Thr165Met、Lys173Lys、His174Gln、Ser 182Glu、Val198Met、Leu202Met、Leu203Pro、Glu213Ile、Leu217Gln、Leu223Met、Tyr245Glu、Gln246Lys、Leu248Ile、Gln279Arg、Pro286Gln、Thr287Pro、Val289Ala、Val289Asp、或Val289Gly所示的取代。而且，所述取代中，示出的氨基酸未发生变化的(例如Leu41Leu)，表示发生取代(突变)后的氨基酸恢复为野生型的氨基酸。氨基酸取代的解析结果如表17所示。如表17所示，可知通过对FcRm57b进行进一步的氨基酸取代处理，Fc结合性蛋白质的稳定性提高。
[表17]
氨基酸取代 残余活性(％) 氨基酸取代 残余活性(％)
Val17Glu 63.2 Thr287Ser 60.1
Lys25Met 54.6 Thr287Pro 69.4
Leu41Leu 63.7 Val289Asp 69.6
Gln55Leu 58.6 Val289Gly 69.5
Phe57Leu 38.9 Lys25Met，Phe1441le 59.2
Ser74Phe 65.3 Lys25Met，Ala250Thr 56.9
Ser76Asn 65.3 Lru46Ser，Asp94Glu 59.5
Gly88Ser 69.9 Gl y50Glu，Thr65Val 62.7
Glu118Asp 71.0 Ser51Val，Leu203Pro 68.8
Lys157Lys 57.7 Arg84Ser，Gln279Arg 61.8
Thr165Met 75.5 Leu89Pro，Val 289Gly 71.3
Lys173Lys 71.8 Ile96Lys，Thr287Pro 62.8
His174Gln 63.1 Gly141Asp，Val198Met 64.5
Leu202Met 67.4 Ser182Glu，Glu213Ile 65.0
Ser211Gly 53.6 Leu217Gln，Val289Asp 75.5
Leu223Met 67.8 Gln27Lys，Thr115Phe，Asp129Gly 62.6
Tyr245Glu 63.7 Ser53Leu，Leu248Ile，Val289Ala 68.8
Gln246Lys 76.2 Thr61Ser，Asn159Asp，Val289Ala 67.1
Pro286Gln 66.5 FcRm57b 61.7
实施例48Fc结合性蛋白质(FcRm61)的制作
从实施例47中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Glu118Asp、Thr165Met、Gln246Lys和Val289Asp，将这些取代进一步汇集在实施例43所述的FcRm57b中，制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了61处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm61，以图进一步提高稳定性。而且，为了产生Glu118Asp和Gln246Lys所示的氨基酸取代，使用了以下所示的寡核苷酸。(i)Glu118Asp的氨基酸取代：由SEQ ID NO:166(5’-TACAAGCGGGTCGCCTTCGATTAAA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:167(5’-TTTAATCGAAGGCGACCCGCTTGTA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(ii)Gln246Lys的氨基酸取代：由SEQ ID NO:168(5’-GGCTAAAATCTTATACTCACTCGAG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:169(5’-CTCGAGTGAGTATAAGATTTTAGCC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例47的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm57b中进一步发生了Thr165Met所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:168所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m61p1。
(2)以实施例47的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm57b中进一步发生了Leu217Gln和Val289Asp所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:169所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m61p2。
(3)将所述的m61p1和m61p2这2种PCR产物进行纯化，将其混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由EQ ID NO：68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m61p3。
(4)将所述的m61p3进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:166所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m61p4。
(5)将所述的m61p3进行纯化，以此作为模板，以由SEQ ID NO:167所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m61p5。
(6)将所述的m61p4和m61p5这2种PCR产物进行纯化，将其混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了61处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm61的多核苷酸。
(7)将所述的编码FcRm61的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(8)将所得的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养，通过从菌体抽提质粒，得到了包含编码FcRm61的多核苷酸的质粒pETFcRm61。
(9)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm61的核苷酸序列的解析。添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm61的氨基酸序列如SEQ ID NO:170所示，编码所述FcRm61的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:171所示。需要说明的是，SEQ ID NO:170中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm61的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:170中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、His42Leu的亮氨酸存在于第60位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Ala的丙氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Leu58Arg的精氨酸存在于第76位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Tyr70Phe的苯丙氨酸存在于第88位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Thr73Ala的丙氨酸存在于第91位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Ser111Ala的丙氨酸存在于第129位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Thr115Ile的异亮氨酸存在于第133位、Glu118Asp的天冬氨酸存在于第136位、Ala121VaL的缬氨酸存在于第139位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Ser151Thr的苏氨酸存在于第169位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Thr165Met的甲硫氨酸存在于第183位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Thr199Ala的丙氨酸存在于第217位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Pro的脯氨酸存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Tyr230Phe的苯丙氨酸存在于第248位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Ser233Gly的甘氨酸存在于第251位、Lys234Glu的谷氨酸存在于第252位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Gln246Lys的赖氨酸存在于第264位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Leu270VaL的缬氨酸存在于第288位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位、Val289Asp的天冬氨酸存在于第307位的位置。
实施例49Fc结合性蛋白质(FcRm60c)的制作
从实施例47中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Thr165Met、Leu217Gln和Val289Asp。将选择出的这些取代进一步汇集在实施例43所述的FcRm57b中，制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了60处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm60c，以图进一步提高稳定性。而且，为了Thr165Met的氨基酸取代，使用了由SEQ ID NO:172(5’-AGCAATGGTACATCCCGCTGTGGGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:173(5’-TCCCACAGCGGGATGTACCATTGCT-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例47的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm57b中进一步发生了Leu217Gln和Val289Asp的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，实施了PCR反应。以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:172所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m60cp1。
(2)以实施例47的筛选中取得的包含编码Fc结合性蛋白质FcRm57b中进一步发生了Leu217Gln和Val289Asp所示的取代的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒作为模板，以由SEQ ID NO:173所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m60cp2。
(3)将所述的m60cp1和m60cp2这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的m60cp1和m60cp2混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了60处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm60c的多核苷酸。
(4)将所述的编码FcRm60c的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(5)将所得的转化体用添加了50μg/mL的卡那霉素的LB培养基培养，通过从菌体抽提质粒，得到了包含编码FcRm60c的多核苷酸的质粒pETFcRm60c。
(6)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm60c的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm60c的氨基酸序列如SEQ IDNO:174所示，编码所述FcRm60c的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:175所示。需要说明的是，SEQ ID NO:174中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm60c的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:174中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、His42Leu的亮氨酸存在于第60位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Ala的丙氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Leu58Arg的精氨酸存在于第76位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Tyr70Phe的苯丙氨酸存在于第88位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Thr73Ala的丙氨酸存在于第91位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Ser111Ala的丙氨酸存在于第129位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Thr115Ile的异亮氨酸存在于第133位、Ala121VaL的缬氨酸存在于第139位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Ser151Thr的苏氨酸存在于第169位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Thr165Met的甲硫氨酸存在于第183位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Thr199Ala的丙氨酸存在于第217位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Pro的脯氨酸存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu217Gln的谷氨酰胺存在于第235位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Tyr230Phe的苯丙氨酸存在于第248位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Ser233Gly的甘氨酸存在于第251位、Lys234Glu的谷氨酸存在于第252位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Leu270VaL的缬氨酸存在于第288位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位、Val289Asp的天冬氨酸存在于第307位的位置。
实施例50Fc结合性蛋白质(FcRm62)的制作
从实施例47中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的稳定性提高的氨基酸取代中，选择了参与稳定性提高的氨基酸取代Glu118Asp、Thr165Met、Leu217Gln、Gln246Lys和Val289Asp。将选择出的这些取代进一步汇集在实施例43所述的FcRm57b中，制作了作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了62处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm62，以图进一步提高稳定性。而且，为了产生Glu118Asp所示的氨基酸取代，使用了由SEQ ID NO:167所示的序列组成的寡核苷酸。此外，为了产生Gln246Lys所示的氨基酸取代，使用了由SEQ ID NO:168所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例49的质粒pETFcRm60c作为模板，以由SEQ ID NO:167所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:168所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。以所得的PCR产物作为m62p1。
(2)对所述的m62p1的PCR产物进行纯化，将其与实施例48的m61p4和实施例48的m61p2的纯化后的各PCR产物混合后，按表7所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按表4所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步50℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物进行纯化，得到了编码作为相对于野生型Fc结合性蛋白质进行了62处氨基酸取代处理的Fc结合性蛋白质的FcRm62的多核苷酸。
(3)将所述的编码FcRm62的多核苷酸用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化大肠杆菌BL21(DE3)株。
(4)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。通过从培养的菌体(转化体)抽提质粒，得到了包含编码FcRm62的多核苷酸的质粒pETFcRm62。
(5)采用如实施例3那样的方法进行了pETFcRm62的核苷酸序列的解析。
添加了信号序列和多组氨酸标签的FcRm62的氨基酸序列如SEQ IDNO:176所示，所述编码FcRm62的多核苷酸的序列如SEQ ID NO:177所示。需要说明的是，SEQ ID NO:176中，第1位的甲硫氨酸至第26位的丙氨酸为MalE信号肽、第27位的赖氨酸至第33位的甘氨酸为接头肽、第34位的谷氨酰胺至第307位的缬氨酸为FcRm62的氨基酸序列、第308位至第313位的组氨酸为多组氨酸标签。此外，作为取代氨基酸的Thr20Pro的脯氨酸存在于SEQ ID NO:176中第38位、Thr25Lys的赖氨酸存在于第43位、Gln35Leu的亮氨酸存在于第53位、Glu36Gly的甘氨酸存在于第54位、Thr38Ser的丝氨酸存在于第56位、Leu41Met的甲硫氨酸存在于第59位、His42Leu的亮氨酸存在于第60位、Leu46Pro的脯氨酸存在于第64位、Pro49Ser的丝氨酸存在于第67位、Ser51Ala的丙氨酸存在于第69位、Ser52Gly的甘氨酸存在于第70位、Leu58Arg的精氨酸存在于第76位、Gly60Asp的天冬氨酸存在于第78位、Thr63Ile的异亮氨酸存在于第81位、Thr65Ala的丙氨酸存在于第83位、Ser69Thr的苏氨酸存在于第87位、Tyr70Phe的苯丙氨酸存在于第88位、Arg71His的组氨酸存在于第89位、Thr73Ala的丙氨酸存在于第91位、Val77Glu的谷氨酸存在于第95位、Asn78Asp的天冬氨酸存在于第96位、Gln97Leu的亮氨酸存在于第115位、Ile100VaL的缬氨酸存在于第118位、Ser111Ala的丙氨酸存在于第129位、Phe114Leu的亮氨酸存在于第132位、Thr115Ile的异亮氨酸存在于第133位、Glu118Asp的天冬氨酸存在于第136位、Ala121VaL的缬氨酸存在于第139位、Lys128Arg的精氨酸存在于第146位、Tyr133His的组氨酸存在于第151位、Tyr137Phe的苯丙氨酸存在于第155位、Arg139His的组氨酸存在于第157位、Trp149Arg的精氨酸存在于第167位、Ser151Thr的苏氨酸存在于第169位、Asn152Thr的苏氨酸存在于第170位、Leu156Pro的脯氨酸存在于第174位、Lys157Arg的精氨酸存在于第175位、Ile160Thr的苏氨酸存在于第178位、Asn163Ser的丝氨酸存在于第181位、Thr165Met的甲硫氨酸存在于第183位、Lys173Arg的精氨酸存在于第191位、Ile181Thr的苏氨酸存在于第199位、Ser182Leu的亮氨酸存在于第200位、Thr184Ser的丝氨酸存在于第202位、Asn195Thr的苏氨酸存在于第213位、Thr199Ala的丙氨酸存在于第217位、Asn206Thr的苏氨酸存在于第224位、Leu207Pro的脯氨酸存在于第225位、Glu213VaL的缬氨酸存在于第231位、Leu217Gln的谷氨酰胺存在于第235位、Leu218Ile的异亮氨酸存在于第236位、Tyr230Phe的苯丙氨酸存在于第248位、Met231Lys的赖氨酸存在于第249位、Ser233Gly的甘氨酸存在于第251位、Lys234Glu的谷氨酸存在于第252位、Asn240Asp的天冬氨酸存在于第258位、Gln246Lys的赖氨酸存在于第264位、Thr249Ala的丙氨酸存在于第267位、Leu270VaL的缬氨酸存在于第288位、Leu283His的组氨酸存在于第301位、Leu285Gln的谷氨酰胺存在于第303位、Val289Asp的天冬氨酸存在于第307位的位置。
实施例51Fc结合性蛋白质(FcRm61、FcRm60c、FcRm62)的生产性评价
采用如实施例14那样的方法制备了实施例48至50和实施例2中制作的转化体，对于采用实施例12(4)所述的ELISA法测定的Fc结合性蛋白质的生产性，以单位培养液浊度(600nm处的光密度、OD600)的生产量(mg/L-培养液/OD600)的形式进行了比较。
结果如图22所示。需要说明的是，图22中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。可以确认与该野生型Fc结合性蛋白质相比，用实施例48至50中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm61、FcRm60c和FcRm62的生产性高。由图22的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的生产性提高。
实施例52Fc结合性蛋白质(FcRm61、FcRm60c、FcRm62)的碱稳定性评价
(1)实施例14所述的方法制备了Fc结合性蛋白质(FcRm60c、FcRm61、FcRm62)和野生型Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释使得各Fc结合性蛋白质浓度为5μg/mL，向其中加入等量的600mM的氢氧化钠水溶液，25℃放置180分钟。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定了进行了(2)的碱处理的试样、和作为比较的未进行(2)的碱处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的碱处理后的试样的抗体结合活性除以测定的未经碱处理时的试样的抗体结合活性，计算出碱处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对碱的稳定性，结果如图23所示。图23中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图23中的FcRm57b是用实施例43的转化体表达的Fc结合性蛋白质。可以确认与这些FcR、FcRm57b相比，用实施例48至50中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质FcRm61、FcRm60c和FcRm62对碱的稳定性高。由图23的结果可知：通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)，Fc结合性蛋白质的碱稳定性提高。
实施例53Fc结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b、FcRm44、FcRm48、FcRm54b、FcRm56b、FcRm57b)的热稳定性评价
采用实施例9所述的方法制备了实施例13、18、23、28、33、38和43中制作的Fc结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b、FcRm44、FcRm48、FcRm54b、FcRm56b、FcRm57b)。对于制备的Fc结合性蛋白质，采用如实施例10那样的方法进行了变性中点温度(Tm)的测定。其结果如表18所示。
[表18]
Fc结合性蛋白质 变性中点温度(Tm)(℃)
FcR 48.5
FcRm32 73.0
FcRm36b 77.3
FcRm44 78.1
FcRm48 78.2
FcRm54b 80.0
FcRm56b 81.9
FcRm57b 79.4
表18中FcR表示用实施例2中制作的转化体表达的未发生氨基酸取代的Fc结合性蛋白质(Fc受体)。与该野生型Fc结合性蛋白质相比，实施例13、18、23、28、33、38和43中制作的Fc结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b、FcRm44、FcRm48、FcRm54b、FcRm56b、FcRm57b)的Tm均提高，可以确认热稳定性提高。
实施例54Fc结合性蛋白质(FcRm19、FcRm32、FcRm36b、FcRm44、FcRm48、FcRm54b、FcRm56b、FcRm57b、FcRm60c、FcRm61、FcRm62)的酸稳定性评价
(1)采用实施例14所述的方法制备了实施例2、7(d)、13、18、23、28、33、38、43、48、49和50中制作的野生型Fc结合性蛋白质或Fc结合性蛋白质，采用实施例12(4)所述的ELISA法，进行了浓度测定。
(2)进行稀释，使得各Fc结合性蛋白质浓度为2μg/mL，向其中加入等量的100mM柠檬酸缓冲液(pH3.0)，25℃放置24小时。
(3)放置后，用1M的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)调整pH回到中性区域，然后采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定了进行了(2)的酸处理的试样、和作为比较的未进行(2)的酸处理的试样的抗体结合活性。
(4)通过用测定的酸处理后的试样的抗体结合活性除以未进行酸处理时的试样的抗体结合活性，计算出酸处理的各Fc结合性蛋白质的残留活性比例。
比较了对酸的稳定性，结果如图24所示。图24中的FcR表示用实施例2的转化体表达的野生型Fc结合性蛋白质。此外，图24中的FcRm19、FcRm32、FcRm36b、FcRm44、FcRm48、FcRm54b、FcRm56b、FcRm57b、FcRm60c、FcRm61和FcRm62分别是用实施例7(d)、13、18、23、28、33、38、43、49、48和50中制作的转化体表达的Fc结合性蛋白质。与野生型Fc结合性蛋白质相比，这些Fc结合性蛋白质均可以确认对酸的稳定性高。
实施例55Leu46氨基酸取代Fc结合性蛋白质的制作
在实施例5中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高的氨基酸取代中，通过将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第46位的亮氨酸(Leu46)取代成脯氨酸(Pro)，热稳定性的提高特别显著(表6)。因而，为了重新评价取代第46位的亮氨酸的有用性，制作了包含编码将第46位的亮氨酸取代成其他氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒、及其转化体。而且，为了将第46位的亮氨酸取代成任意的氨基酸，使用了由SEQ ID NO:178
(5’-ACGTTGCACTGCGAAGTANNKCATCTGCCTGGG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:179
(5’-ACTTGACCCAGGCAGATGMNNTACTTCGCAGTG-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例2中制作的包含编码野生型Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR作为模板，实施了PCR反应。以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:179所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按照表19所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物为L46p1。
[表19]
组成 体积
模板DNA 适量
100pmol/μl PCR引物 各1μl
2.5U/μl PrimeSTAR HS(Takara Bio公司制) 0.5μl
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio公司制) 10μl
2.5mMdNTPs 4μl
H2O 至50μl
(2)以实施例2中制作的包含编码野生型Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR作为模板，实施了PCR反应。以由SEQ ID NO:178所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按照表19所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物为L46p2。
(3)将所述的L46p1和L46p2这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的L46p1和L46p2混合后，按照表20所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按照表19所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。这样得到了编码将野生型Fc结合性蛋白质的第46位的氨基酸取代成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。所得的PCR产物为L46p3。
[表20]
组成 浓度
DNA产物 各等mol
2.5U/μl PrimeSTAR HS(Takara Bio公司制) 0.5μl
5×PrimeSTAR缓冲液(Takara Bio公司制) 6μl
2.5mM dNTPs 2.4μl
H2O 至30μl
(4)将所述的L46p3进行纯化，用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE(图4)连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(5)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。从培养的菌体(转化体)抽提质粒，按照实施例3所述的方法进行了序列解析。其结果是，得到了表达第46位的亮氨酸(Leu)被取代成丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬酰胺(Asn)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酰胺(Gln)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、赖氨酸(Lys)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)或色氨酸(Trp)的Fc结合性蛋白质的转化体。
实施例56Leu46氨基酸取代Fc结合性蛋白质的活性评价
(1)将前述转化体接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将50μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍，采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定了抗体结合活性。
结果如表21所示。由表21可以确认：通过将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第46位的亮氨酸(Leu)取代成Ala、Arg、Asn、Asp、Gln、Gly、His、Lys、Pro、Ser或Trp，活性提高。优选取代成Asp、Pro、Ser，更优选取代成Pro。
[表21]
氨基酸取代 OD450nm
Ala 0.39
Arg 0.35
Asn 0.38
Asp 0.45
Gln 0.29
Gly 0.31
His 0.29
Ile 0.14
Lys 0.35
Pro 0.53
Ser 0.43
Trp 0.29
Leu 0.22
实施例57Phe114氨基酸取代Fc结合性蛋白质的制作
实施例5中已经明确的参与Fc结合性蛋白质的热稳定性提高的氨基酸取代中，通过将SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第114位的苯丙氨酸(Phe114)取代成亮氨酸(Leu)，热稳定性的提高特别显著(表6)。因而，为了重新评价对第114位的苯丙氨酸进行取代的有用性，制作了包含编码将第114位的苯丙氨酸取代成其他氨基酸的突变Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒、及其转化体。而且，为了将第114位的苯丙氨酸取代成任意氨基酸，使用了由SEQ ID NO:180
(5’-CAGGTTAGCTCCCGCGTTNNKACCGAAGGCGA-3’)所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:181
(5’-AAGCGGTTCGCCTTCGGTMNNAACGCGGGAGC-3’)所示的序列组成的寡核苷酸。
(1)以实施例2中制作的包含编码野生型Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:181所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按照表19所示的反应液组成，第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物为F114p1。
(2)以实施例2中制作的包含编码野生型Fc结合性蛋白质的多核苷酸的质粒pETFcR作为模板，实施了PCR反应。使用了由SEQ ID NO:180所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物。PCR反应如下进行：按照表19所示的反应液组成，第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。所得的PCR产物为F114p2。
(3)将所述的F114p1和F114p2这2种PCR产物进行了纯化。将纯化后的F114p1和F114p2混合后，按照表20所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将PCR反应进行5个循环来实施PCR反应，连接了PCR产物。以该PCR产物作为模板，以由SEQ ID NO:68所示的序列组成的寡核苷酸和由SEQ ID NO:69所示的序列组成的寡核苷酸作为PCR引物，实施了PCR反应。PCR反应如下进行：按照表19所示的反应液组成，以第1步98℃10秒、第2步55℃5秒、第3步72℃1分钟作为1个循环，将反应进行30个循环。这样得到了编码将野生型Fc结合性蛋白质的第114位的氨基酸取代成任意氨基酸的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。所得的PCR产物为F114p3。
(4)将所述的F114p3进行纯化，用限制酶NcoI和HindIII消化后，与用限制酶NcoI和HindIII消化的实施例2所述的表达载体pETMalE连接，用其转化了大肠杆菌BL21(DE3)株。
(5)将所得的转化体用添加有50μg/mL的卡那霉素的LB培养基进行培养。从培养的菌体(转化体)抽提质粒，按照实施例3所述的方法进行了序列解析。得到了表达第114位的苯丙氨酸(Phe)被取代成丙氨酸(Ala)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、半胱氨酸(Cys)、谷氨酰胺(Gln)、谷氨酸(Glu)、甘氨酸(Gly)、组氨酸(His)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、赖氨酸(Lys)、甲硫氨酸(Met)、脯氨酸(Pro)、丝氨酸(Ser)、苏氨酸(Thr)、色氨酸(Trp)、酪氨酸(Tyr)或缬氨酸(Val)的Fc结合性蛋白质的转化体。
实施例58Phe114氨基酸取代Fc结合性蛋白质的活性评价
(1)将所述转化体接种于含50μg/mL的卡那霉素的LB液体培养基200μL，使用96孔深孔平板，37℃振荡培养过夜。
(2)培养后，将50μL的培养液接种于500μL的2YT液体培养基(含0.05mM的IPTG、0.3%的甘氨酸、50μg/mL的卡那霉素)，使用96孔深孔平板，进一步20℃振荡培养过夜。
(3)培养后，将通过离心操作得到的培养上清用50mM的Tris-HCl缓冲液(pH8.0)稀释5倍，采用实施例12(4)所述的ELISA法，测定了抗体结合活性。
结果如表22所示。由表22可见：通过SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的第114位的苯丙氨酸(Phe)被取代成Ala、Ile、Leu、Met、Pro、Thr或Val，活性提高。优选取代成Ile、Leu、Met或Val，更优选取代成Ile、Leu或Val。
[表22]
氨基酸取代 OD450nm
Ala 0.19
Arg 0.08
Asp 0.05
Cys 0.05
Gln 0.13
Glu 0.09
Gly 0.06
His 0.06
Ile 0.87
Leu 0.50
Lys 0.07
Met 0.43
Pro 0.16
Ser 0.10
Thr 0.24
Trp 0.05
Tyr 0.08
Val 0.74
Phe 0.14
实施例59Fc结合性蛋白质(FcRm19)在凝胶上的固定化
(1)使用实施例7(d)中制作的转化体，采用实施例9所述的方法，制备了Fc结合性蛋白质FcRm19。
(2)将所得的6.9mg/mL的FcRm19溶液0.4mL与0.1mL的导入了环氧基的TOYOPEARL凝胶(东曹公司制造)混合，加入终浓度0.6M的磷酸钾缓冲液，20℃反应14小时。
(3)反应后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去反应残渣，使用20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶，制备了FcRm19固定化凝胶。
(4)采用Bradford法(蛋白测定试剂盒、Bio-Rad公司制造)对反应残渣的Fc结合性蛋白质的量进行了定量，通过除以上样的Fc结合性蛋白质的量，计算出固定化率。
结果可以确认：固定化率为83.3%、每1mL凝胶的FcRm19固定化量为23.0mg。
实施例60Fc结合性蛋白质(FcRm19)固定化凝胶的抗体吸附性评价
(1)对于实施例59中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm19)固定化凝胶0.1mL，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的10mg/mL的γ球蛋白制剂(化学及血清疗法研究所制，以下记作IgG)0.5mL，15℃振荡1小时。
(2)振荡后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去IgG溶液，用0.2mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(3)最后，使0.2mL的100mM的柠檬酸缓冲液(pH3.0)流过3次，洗脱凝胶上吸附的IgG。
通过280nM的吸光度测定(10mm池、1%的IgG溶液的吸光度按14计算)对洗脱的IgG进行了定量，结果为2.10mg。由此，可以确认实施例59中制备的FcRm19固定化凝胶每1mL凝胶的IgG吸附量为21.0mg。
实施例61Fc结合性蛋白质(FcRm19)固定化凝胶的抗体洗脱性评价
(1)将实施例59中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm19)固定化凝胶0.1mL充填至柱中，添加2mL的溶解在20mM的PBS(pH7.0)中的3mg/mL的IgG，使IgG吸附在凝胶上。
(2)将柱用20mM的PBS(pH7.0)充分洗涤后，使pH3.0至pH4.2的范围内的任意pH的100mM柠檬酸缓冲液2mL流过，洗脱IgG(此为洗脱液1)。
(3)最后，使pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液2mL流过，完全洗脱凝胶上吸附的IgG(此为洗脱液2)。
(4)按实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱液1和2中的IgG的定量，按照下述的式1求出了各pH的洗脱液中的IgG洗脱比例。
R=A÷(A+B)×100······(式1)
式1中，
R：IgG洗脱比例(%)
A：洗脱液1的IgG量
B：洗脱液2的IgG量
结果是，抗体洗脱比例在pH3.0时为99.1%、pH3.4时为87.4%、pH3.8时为51.3%、pH4.2时为22.0%。各pH中的抗体洗脱比例总结如图25所示。
实施例62Fc结合性蛋白质(FcRm32)在凝胶上的固定化
(1)使用实施例13中制作的转化体采用实施例9所述的方法制备了Fc结合性蛋白质FcRm32。
(2)将所得的8.1mg/mL的Fc结合性蛋白质(FcRm32)溶液0.3mL与0.1mL的导入了环氧基的TOYOPEARL凝胶(东曹公司制造)混合，加入终浓度1.0M的磷酸钾缓冲液，20℃反应14小时。
(3)反应后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去反应残渣，用20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶，制备了FcRm32固定化凝胶。
(4)采用Bradford法对反应残渣的FcRm32量进行了定量，通过除以上样的Fc结合性蛋白质的量，计算出固定化率。
结果可以确认：固定化率为79.3%、每1mL凝胶的FcRm32固定化量为19.3mg。
实施例63Fc结合性蛋白质(FcRm32)固定化凝胶的抗体吸附性评价
(1)对于实施例62中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm32)固定化凝胶0.1mL，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的10mg/mL的IgG0.5mL，15℃振荡1小时。
(2)振荡后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去IgG溶液，用0.2mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(3)最后，流过3次0.2mL的100mM的柠檬酸缓冲液(pH3.0)，洗脱凝胶上吸附的IgG。
采用实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱的IgG的定量，结果为1.98mg。由此可以确认，实施例62中制备的FcRm32固定化凝胶每1mL凝胶的IgG吸附量为19.8mg。
实施例64Fc结合性蛋白质(FcRm32)固定化凝胶的抗体洗脱性评价
(1)将实施例62中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm32)固定化凝胶0.1mL充填在柱中，通入2mL的溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的3mg/mL的IgG(化学及血清疗法研究所制)，使IgG吸附在凝胶上。
(2)将柱用20mM的PBS(pH7.0)充分洗涤后，流过pH3.0至pH4.2的范围内的任意pH的100mM柠檬酸缓冲液2mL，洗脱IgG(此为洗脱液1)。
(3)最后，使2mL pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液流过，完全洗脱凝胶上吸附的IgG(此为洗脱液2)。
(4)按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱液1和2中的IgG的定量，按照实施例61所述的式1，求出了各pH的洗脱液中的IgG洗脱比例。
结果是：抗体洗脱比例在pH3.0时为98.7%、pH3.4时为99.3%、pH3.8时为97.9%、pH4.2时为82.8%。与实施例59进行的FcRm19固定化凝胶的抗体洗脱性评价相比，可以确认更高pH的(更靠中性的)缓冲液中的IgG洗脱性大幅提高。与FcRm19固定化凝胶相比，各pH中的FcRm32固定化凝胶的抗体洗脱比例总结如图26所示。
实施例65Fc结合性蛋白质(FcRm36b)在凝胶上的固定化
(1)使用实施例18中制作的转化体，按照实施例9所述的方法，制备了Fc结合性蛋白质FcRm36b。
(2)将所得的15.5mg/mL的FcRm36b溶液0.1mL与0.05mL的导入了环氧基的TOYOPEARL凝胶(东曹公司制造)混合，加入终浓度0.8M的磷酸钾缓冲液，35℃反应5小时。
(3)反应后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去反应残渣，用20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶，制备了FcRm36b固定化凝胶。
(4)采用Bradford法对反应残渣的Fc结合性蛋白质的量进行了定量，通过除以上样的Fc结合性蛋白质的量，计算出固定化率。
结果可以确认：固定化率为67.7%、每1mL凝胶的FcRm36b固定化量为21.0mg。
实施例66Fc结合性蛋白质(FcRm36b)固定化凝胶的抗体吸附性评价
(1)对于实施例65中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm36b)固定化凝胶0.05mL，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的10mg/mL的IgG 0.5mL，15℃振荡1小时。
(2)振荡后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去IgG溶液，用0.2mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(3)最后，使0.2mL的100mM的柠檬酸缓冲液(pH3.0)流过3次，洗脱凝胶上吸附的IgG。
采用实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱的IgG的定量，结果为1.44mg。由此可以确认，实施例65中制备的FcRm36b固定化凝胶每1mL凝胶的IgG吸附量为28.8mg。
实施例67Fc结合性蛋白质(FcRm36b)固定化凝胶的抗体洗脱性评价
(1)将实施例65中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm36b)固定化凝胶0.05mL充填在柱中，通入2mL的溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的3mg/mL的IgG(化学及血清疗法研究所制)，使IgG吸附在凝胶上。
(2)将柱用20mM的PBS(pH7.0)充分洗涤后，流过pH3.0至pH4.2的范围内的任意pH的100mM柠檬酸缓冲液2mL，洗脱IgG(此为洗脱液1)。
(3)最后，使2mL pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液流过，完全洗脱凝胶上吸附的IgG(此为洗脱液2)。
(4)按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱液1和2中的IgG的定量，按照实施例61所述的式1，求出了各pH的洗脱液中的IgG洗脱比例。
结果是：抗体洗脱比例在pH3.0时为99.5%、pH3.4时为99.4%、pH3.8时为92.2%、pH4.2时为64.0%。将该结果与实施例59中进行的FcRm19固定化凝胶的抗体洗脱性评价相比较，可以确认在更高pH的(更靠中性的)缓冲液中的IgG洗脱性大幅提高。与FcRm19固定化凝胶相比较的各pH中的FcRm36b固定化凝胶的抗体洗脱比例总结如图27所示。
实施例68Fc结合性蛋白质(FcRm48)在凝胶上的固定化
(1)按照实施例9所述的方法，使用实施例28中制作的转化体，制备了Fc结合性蛋白质FcRm48。
(2)将所得的8.8mg/mL的FcRm48溶液0.1mL与0.05mL的导入了环氧基的TOYOPEARL凝胶(东曹公司制造)混合，加入终浓度0.8M的磷酸钾缓冲液，35℃反应5小时。
(3)然后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去反应残渣，用20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶，制备了Fc结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶。
(4)采用Bradford法对反应残渣的Fc结合性蛋白质的量进行了定量，通过除以上样的Fc结合性蛋白质的量，计算出固定化率。
结果可以确认：固定化率为77.3%、每1mL凝胶的FcRm48固定化量为13.6mg。
实施例69Fc结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶的抗体吸附性评价
(1)对于实施例68中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶0.05mL，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0中的10mg/mL的IgG 0.5mL，15℃振荡1小时。
(2)然后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去IgG溶液，用0.2mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(3)最后，使0.2mL的100mM的柠檬酸缓冲液(pH3.0)流过3次，洗脱凝胶上吸附的IgG。
采用实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱的IgG的定量，结果为0.94mg。由此可以确认，实施例68中制备的FcRm48固定化凝胶每1mL凝胶的IgG吸附量为18.8mg。
实施例70Fc结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶的抗体洗脱性评价
(1)将实施例68中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm48)固定化凝胶0.05mL充填在柱中，通入2mL的溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的3mg/mL的IgG(化学及血清疗法研究所制)，使IgG吸附在凝胶上。
(2)将柱用20mM的PBS(pH7.0)充分洗涤后，使2mL pH3.0至pH4.2的范围内的任意pH的100mM柠檬酸缓冲液流过，洗脱IgG(此为洗脱液1)。
(3)最后，使2mL pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液流过，完全洗脱凝胶上吸附的IgG(此为洗脱液2)。
(4)按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱液1和2中的IgG的定量，按照实施例61所述的式1，求出了各pH的洗脱液中的IgG洗脱比例。
结果是，抗体洗脱比例在pH3.0时为99.2%、pH3.4时为100.0%、pH3.8时为98.2%、pH4.2时为81.9%。将该结果与实施例59中进行的FcRm19固定化凝胶的抗体洗脱性评价相比较，可以确认更高pH的(更靠中性的)缓冲液中的IgG洗脱性大幅提高。与FcRm19固定化凝胶相比较的各pH中的FcRm48固定化凝胶的抗体洗脱比例总结如图28所示。
实施例71Fc结合性蛋白质(FcRm56b)在凝胶上的固定化
(1)使用实施例38中制作的转化体，按照实施例9所述的方法，制备了Fc结合性蛋白质FcRm56b。
(2)所得的13.2mg/mL的FcRm56b溶液1.0mL与0.5mL的导入了环氧基的TOYOPEARL凝胶(东曹公司制造)混合，加入终浓度0.8M的磷酸钾缓冲液，35℃反应5小时。
(3)反应后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去反应残渣，用20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶，制备了Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶。
(4)采用Bradford法对反应残渣的Fc结合性蛋白质的量进行了定量，通过除以上样的Fc结合性蛋白质的量，计算出固定化率。
结果可以确认，固定化率为70.8%、每1mL凝胶的FcRm56b固定化量为18.7mg。
实施例72Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的抗体吸附性评价
(1)对于实施例71中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶0.5mL，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的10mg/mL的IgG 3.0mL，15℃振荡1小时。
(2)振荡后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去IgG溶液，用1.0mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(3)最后，流过1.0mL的100mM的柠檬酸缓冲液(pH3.0)3次，洗脱凝胶上吸附的IgG。
按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱的IgG的定量，结果为11.5mg。由此可以确认，实施例71中制备的FcRm56b固定化凝胶每1mL凝胶的IgG吸附量为23.0mg。
实施例73Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的抗体洗脱性评价
(1)将实施例71中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶0.1mL充填在柱中，通入2mL的溶解在20mM的PBS(pH7.0)中的3mg/mL的IgG(化学及血清疗法研究所制)，使IgG吸附在凝胶上。
(2)将柱用20mM的PBS(pH7.0)充分洗涤后，流过pH3.0至pH4.2的范围内的任意pH的100mM柠檬酸缓冲液2mL，洗脱IgG(此为洗脱液1)。
(3)最后，流过pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液2mL，完全洗脱凝胶上吸附的IgG(此为洗脱液2)。
(4)按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱液1和2中的IgG的定量，按照实施例61所述的式1，求出了各pH的洗脱液中的IgG洗脱比例。
结果是，抗体洗脱比例在pH3.0时为99.7%、pH3.4时为99.5%、pH3.8时为94.5%、pH4.2时为73.0%。将该结果与实施例59中进行的FcRm19固定化凝胶的抗体洗脱性评价相比较，可以确认更高pH的(更靠中性的)缓冲液中的IgG洗脱性大幅提高。与FcRm19固定化凝胶相比较的各pH中的FcRm56b固定化凝胶的抗体洗脱比例总结如图29所示。
实施例74Fc结合性蛋白质(FcRm57b)在凝胶上的固定化
(1)使用实施例43中制作的转化体，按照实施例9所述的方法，制备了Fc结合性蛋白质FcRm57b。
(2)将所得的8.9mg/mL的FcRm57b溶液1.0mL与0.4mL的导入了环氧基的TOYOPEARL凝胶(东曹公司制造)混合，加入终浓度0.8M的磷酸钾缓冲液，35℃反应5小时。
(3)反应后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去反应残渣，用20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶，制备了Fc结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶。
(4)采用Bradford法对反应残渣的Fc结合性蛋白质的量进行了定量，通过除以上样的Fc结合性蛋白质的量，计算出固定化率。
结果可以确认，固定化率为64.0%、每1mL凝胶的FcRm57b固定化量为14.2mg。
实施例75Fc结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶的抗体吸附性评价
(1)对于实施例74中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶0.4mL，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的10mg/mL的IgG 3.0mL，15℃振荡1小时。
(2)然后，通过滤膜过滤(孔大小：10μm)从凝胶除去IgG溶液，用1.0mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(3)最后，流过1.0mL的100mM的柠檬酸缓冲液(pH3.0)3次，洗脱凝胶上吸附的IgG。
采用实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱的IgG的定量，结果为6.67mg。由此可以确认，实施例74中制备的FcRm56b固定化凝胶每1mL凝胶的IgG吸附量为16.7mg。
实施例76Fc结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶的抗体洗脱性评价
(1)将实施例74中制备的Fc结合性蛋白质(FcRm57b)固定化凝胶0.1mL充填在柱中，通入2mL的溶解于20mM的PBS(pH7.0)中的3mg/mL的IgG(化学及血清疗法研究所制)，使IgG吸附在凝胶上。
(2)将柱用20mM的PBS(pH7.0)充分洗涤后，流过pH3.0至pH4.2的范围内的任意pH的100mM柠檬酸缓冲液2mL，洗脱IgG(此为洗脱液1)。
(3)最后，流过pH3.0的100mM柠檬酸缓冲液2mL，完全洗脱凝胶上吸附的IgG(此为洗脱液2)。
(4)按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱液1和2中的IgG的定量，按照实施例61所述的式1，求出了各pH的洗脱液中的IgG洗脱比例。
结果是，抗体洗脱比例在pH3.0时为99.3%、pH3.4时为99.6%、pH3.8时为90.2%、pH4.2时为66.2%。将该结果与实施例59进行的FcRm19固定化凝胶的抗体洗脱性评价相比较，可以确认更高pH的(更靠中性的)缓冲液中的IgG洗脱性大幅提高。与FcRm19固定化凝胶相比较的各pH中的FcRm57b固定化凝胶的抗体洗脱比例总结如图30所示。
实施例77Fc结合性蛋白质(FcRm32、FcRm36b、FcRm56b)固定化凝胶的碱稳定性评价
(1)将实施例62、实施例65和实施例71中制作的Fc结合性蛋白质固定化凝胶分别使用20mM的PBS(pH7.0)制备成20%浆料，在4根带滤膜的Spin柱(Micro Bio-Spin柱、Bio-Rad公司制造)中各注入50μL。
(2)对于(1)中制作的柱中的3根，通过滤膜过滤从凝胶浆料除去PBS，使用0.15mL的0.1M的氢氧化钠水溶液，洗涤凝胶1次后，再次添加0.15mL的氢氧化钠水溶液。
(3)将所述3根柱分别于20℃放置1小时、3小时、24小时后，用0.2mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤3次。
(4)对于所得的柱(碱处理时间：0小时、1小时、3小时、24小时)，添加溶解于20mM的PBS(pH7.0)的10mg/mL的IgG(化学及血清疗法研究所制)0.2mL后，15℃振荡1小时。
(5)振荡后，通过滤膜过滤从凝胶除去IgG溶液，用0.2mL的20mM的PBS(pH7.0)洗涤凝胶5次。
(6)最后，流过3次0.1mL的100mM柠檬酸缓冲液(pH3.0)，洗脱凝胶上吸附的IgG。
(7)按照实施例60所述的280nM的吸光度测定进行了洗脱的IgG的定量，计算出凝胶的IgG吸附量。
结果是，在将未碱处理的凝胶的IgG结合量作为100%活性的情况下，对于FcRm32固定化凝胶(实施例62)，1小时处理为63.6%、3小时处理为41.8%、24小时处理为18.2%。对于FcRm36b固定化凝胶(实施例65)，1小时处理为84.2%、3小时处理为60.4%、24小时处理为16.8%。对于FcRm56b固定化凝胶(实施例71)，1小时处理为96.8%、3小时处理为92.1%、24小时处理为61.9%。这样可以确认，通过汇集参与稳定性提高的氨基酸取代(突变)的Fc结合性蛋白质，碱稳定性提高。各Fc结合性蛋白质固定化凝胶的碱稳定性总结如图31所示。
实施例78Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶的重复稳定性评价
将实施例71中制作的Fc结合性蛋白质(FcRm56b)固定化凝胶0.2mL充填在柱中，按照表23所示的循环重复通入缓冲液。而且，在第1次、第30次、第50次、第70次、第90次、第110次、第130次和第150次，按照表24所示的循环通入缓冲液和IgG溶液，计算出柱的IgG吸附量。
[表23]
溶液名 通入液体量 流速
20mM PBS(pH7.2) 1.0mL 0.5mL/min
100mM柠檬酸缓冲液(pH 3.5) 2.0mL 0.5mL/min
20mM PBS(pH7.2) 1.0mL 0.5mL/min
100mM NaOH 3.0mL 0.2mL/min
H20 1.0mL 0.5mL/min
20mM PBS(pH7.2) 2.0mL 0.5mL/min
[表24]
Figure BDA00002388323001211
以第1次的IgG吸附量为100%，按时间测定柱的IgG吸附量的结果是：第30次为98.9%、第50次为94.7%、第70次为89.0%、第90次为84.9%、第110次为84.9%、第130次为80.2%、第150次为80.7%。
另一方面，作为比较例，使用实施例2中制作的转化体按实施例9所述的方法制备了野生型的Fc结合性蛋白质(FcR)，采用如实施例59那样的方法，将FcR固定化于0.2mL的凝胶后，充填在柱中。对于所述柱，以表24所示的循环重复通入缓冲液和IgG，确认了柱的IgG吸附量变化。以第1次的IgG吸附量为100%，按时间测定柱的IgG吸附量的结果是：第2次为60.0%、第3次降低至41.5%，这显示对FcR固定化凝胶而言，基于碱洗涤的凝胶的再生事实上是困难的。各Fc结合性蛋白质固定化凝胶对碱洗涤的重复稳定性总结如图32所示。
Figure IDA00002388323600011
Figure IDA00002388323600031
Figure IDA00002388323600041
Figure IDA00002388323600061
Figure IDA00002388323600071
Figure IDA00002388323600081
Figure IDA00002388323600091
Figure IDA00002388323600101
Figure IDA00002388323600131
Figure IDA00002388323600141
Figure IDA00002388323600171
Figure IDA00002388323600181
Figure IDA00002388323600191
Figure IDA00002388323600201
Figure IDA00002388323600211
Figure IDA00002388323600221
Figure IDA00002388323600241
Figure IDA00002388323600251
Figure IDA00002388323600261
Figure IDA00002388323600281
Figure IDA00002388323600291
Figure IDA00002388323600301
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Figure IDA00002388323600331
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Figure IDA00002388323600361
Figure IDA00002388323600371
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Figure IDA00002388323600401
Figure IDA00002388323600421
Figure IDA00002388323600431
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Figure IDA00002388323600491
Figure IDA00002388323600501
Figure IDA00002388323600511
Figure IDA00002388323600521
Figure IDA00002388323600541
Figure IDA00002388323600551

Claims (11)

1.一种Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列中的第16位至第289位的氨基酸序列，且该第16位至第289位的氨基酸序列中发生了以下(1)~(168)中的至少1个氨基酸取代：
(1)SEQ ID NO：1的第20位的苏氨酸被取代成脯氨酸
(2)SEQ ID NO：1的第25位的苏氨酸被取代成赖氨酸
(3)SEQ ID NO：1的第38位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(4)SEQ ID NO：1的第46位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸
(5)SEQ ID NO：1的第62位的丙氨酸被取代成缬氨酸
(6)SEQ ID NO：1的第63位的苏氨酸被取代成异亮氨酸
(7)SEQ ID NO：1的第69位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸或苏氨酸
(8)SEQ ID NO：1的第71位的精氨酸被取代成组氨酸
(9)SEQ ID NO：1的第77位的缬氨酸被取代成丙氨酸或谷氨酸
(10)SEQ ID NO：1的第78位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(11)SEQ ID NO：1的第94位的天冬氨酸被取代成谷氨酸
(12)SEQ ID NO：1的第100位的异亮氨酸被取代成缬氨酸
(13)SEQ ID NO：1的第110位的丝氨酸被取代成天冬酰胺
(14)SEQ ID NO：1的第114位的苯丙氨酸被取代成亮氨酸
(15)SEQ ID NO：1的第125位的组氨酸被取代成精氨酸
(16)SEQ ID NO：1的第131位的亮氨酸被取代成精氨酸或脯氨酸
(17)SEQ ID NO：1的第149位的色氨酸被取代成亮氨酸
(18)SEQ ID NO：1的第156位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(19)SEQ ID NO：1的第160位的异亮氨酸被取代成甲硫氨酸
(20)SEQ ID NO：1的第163位的天冬酰胺被取代成丝氨酸
(21)SEQ ID NO：1的第195位的天冬酰胺被取代成苏氨酸
(22)SEQ ID NO：1的第199位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(23)SEQ ID NO：1的第206位的天冬酰胺被取代成赖氨酸、丝氨酸或苏氨酸
(24)SEQ ID NO：1的第207位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(25)SEQ ID NO：1的第218位的亮氨酸被取代成缬氨酸
(26)SEQ ID NO：1的第240位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(27)SEQ ID NO：1的第248位的亮氨酸被取代成丝氨酸
(28)SEQ ID NO：1的第283位的亮氨酸被取代成组氨酸
(29)SEQ ID NO：1的第285位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺
(30)SEQ ID NO：1的第17位的缬氨酸被取代成甘氨酸或谷氨酸
(31)SEQ ID NO：1的第19位的苏氨酸为异亮氨酸
(32)SEQ ID NO：1的第20位的苏氨酸为异亮氨酸
(33)SEQ ID NO：1的第25位的苏氨酸为甲硫氨酸或精氨酸
(34)SEQ ID NO：1的第27位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或赖氨酸
(35)SEQ ID NO：1的第35位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸、甲硫氨酸或精氨酸
(36)SEQ ID NO：1的第36位的谷氨酸被取代成甘氨酸
(37)SEQ ID NO：1的第41位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸
(38)SEQ ID NO：1的第42位的组氨酸被取代成亮氨酸
(39)SEQ ID NO：1的第44位的谷氨酸被取代成天冬氨酸
(40)SEQ ID NO：1的第45位的缬氨酸被取代成丙氨酸
(41)SEQ ID NO：1的第46位的亮氨酸被取代成丙氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、丝氨酸或色氨酸
(42)SEQ ID NO：1的第47位的组氨酸被取代成谷氨酰胺、亮氨酸或天冬酰胺
(43)SEQ ID NO：1的第49位的脯氨酸被取代成丝氨酸或丙氨酸
(44)SEQ ID NO：1的第50位的甘氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸
(45)SEQ ID NO：1的第51位的丝氨酸被取代成丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、脯氨酸或缬氨酸
(46)SEQ ID NO：1的第52位的丝氨酸被取代成甘氨酸
(47)SEQ ID NO：1的第53位的丝氨酸被取代成亮氨酸、苏氨酸或脯氨酸
(48)SEQ ID NO：1的第55位的谷氨酰胺被取代成精氨酸
(49)SEQ ID NO：1的第57位的苯丙氨酸被取代成酪氨酸
(50)SEQ ID NO：1的第58位的亮氨酸被取代成精氨酸
(51)SEQ ID NO：1的第60位的甘氨酸被取代成天冬氨酸
(52)SEQ ID NO：1的第61位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(53)SEQ ID NO：1的第62位的丙氨酸被取代成谷氨酸
(54)SEQ ID NO：1的第63位的苏氨酸被取代成亮氨酸、苯丙氨酸
(55)SEQ ID NO：1的第64位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸、组氨酸、亮氨酸、赖氨酸
(56)SEQ ID NO：1的第65位的苏氨酸被取代成丙氨酸或缬氨酸
(57)SEQ ID NO：1的第66位的丝氨酸被取代成苏氨酸
(58)SEQ ID NO：1的第67位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(59)SEQ ID NO：1的第69位的丝氨酸被取代成丙氨酸
(60)SEQ ID NO：1的第70位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸
(61)SEQ ID NO：1的第71位的精氨酸被取代成酪氨酸
(62)SEQ ID NO：1的第73位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(63)SEQ ID NO：1的第74位的丝氨酸被取代成苯丙氨酸
(64)SEQ ID NO：1的第76位的丝氨酸被取代成天冬酰胺
(65)SEQ ID NO：1的第77位的缬氨酸被取代成天冬氨酸或赖氨酸
(66)SEQ ID NO：1的第78位的天冬酰胺被取代成丝氨酸或甘氨酸
(67)SEQ ID NO：1的第80位的丝氨酸被取代成丙氨酸
(68)SEQ ID NO：1的第84位的精氨酸被取代成丝氨酸
(69)SEQ ID NO：1的第88位的甘氨酸被取代成丝氨酸
(70)SEQ ID NO：1的第89位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺或脯氨酸
(71)SEQ ID NO：1的第90位的丝氨酸被取代成甘氨酸
(72)SEQ ID NO：1的第92位的精氨酸被取代成半胱氨酸或亮氨酸
(73)SEQ ID NO：1的第96位的异亮氨酸被取代成缬氨酸或赖氨酸
(74)SEQ ID NO：1的第97位的谷氨酰胺被取代成亮氨酸或赖氨酸
(75)SEQ ID NO：1的第101位的组氨酸被取代成亮氨酸
(76)SEQ ID NO：1的第102位的精氨酸被取代成丝氨酸或亮氨酸
(77)SEQ ID NO：1的第103位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或丝氨酸
(78)SEQ ID NO：1的第111位的丝氨酸被取代成丙氨酸
(79)SEQ ID NO：1的第114位的苯丙氨酸被取代成丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苏氨酸或缬氨酸
(80)SEQ ID NO：1的第115位的苏氨酸被取代成异亮氨酸或苯丙氨酸
(81)SEQ ID NO：1的第118位的谷氨酸被取代成天冬氨酸
(82)SEQ ID NO：1的第121位的丙氨酸被取代成苏氨酸或缬氨酸
(83)SEQ ID NO：1的第128位的赖氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸
(84)SEQ ID NO：1的第129位的天冬氨酸被取代成甘氨酸
(85)SEQ ID NO：1的第131位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺
(86)SEQ ID NO：1的第133位的酪氨酸被取代成组氨酸或精氨酸
(87)SEQ ID NO：1的第134位的天冬酰胺被取代成丝氨酸
(88)SEQ ID NO：1的第137位的酪氨酸被取代成苯丙氨酸
(89)SEQ ID NO：1的第138位的酪氨酸被取代成组氨酸
(90)SEQ ID NO：1的第139位的精氨酸被取代成组氨酸
(91)SEQ ID NO：1的第140位的天冬酰胺被取代成天冬氨酸
(92)SEQ ID NO：1的第141位的甘氨酸被取代成天冬氨酸或缬氨酸
(93)SEQ ID NO：1的第142位的赖氨酸被取代成谷氨酸或精氨酸
(94)SEQ ID NO：1的第144位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸
(95)SEQ ID NO：1的第147位的苯丙氨酸被取代成丝氨酸
(96)SEQ ID NO：1的第148位的组氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺
(97)SEQ ID NO：1的第149位的色氨酸被取代成精氨酸
(98)SEQ ID NO：1的第151位的丝氨酸被取代成苏氨酸
(99)SEQ ID NO：1的第152位的天冬酰胺被取代成苏氨酸、异亮氨酸或脯氨酸
(100)SEQ ID NO：1的第154位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(101)SEQ ID NO：1的第156位的亮氨酸被取代成组氨酸
(102)SEQ ID NO：1的第157位的赖氨酸被取代成精氨酸
(103)SEQ ID NO：1的第159位的天冬酰胺被取代成苏氨酸或天冬氨酸
(104)SEQ ID NO：1的第160位的异亮氨酸被取代成苏氨酸、缬氨酸或亮氨酸
(105)SEQ ID NO：1的第161位的丝氨酸被取代成苏氨酸
(106)SEQ ID NO：1的第165位的苏氨酸被取代成甲硫氨酸
(107)SEQ ID NO：1的第171位的甲硫氨酸被取代成苏氨酸
(108)SEQ ID NO：1的第173位的赖氨酸被取代成精氨酸
(109)SEQ ID NO：1的第174位的组氨酸被取代成谷氨酰胺
(110)SEQ ID NO：1的第177位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(111)SEQ ID NO：1的第181位的异亮氨酸被取代成苏氨酸
(112)SEQ ID NO：1的第182位的丝氨酸被取代成苏氨酸、亮氨酸、缬氨酸或谷氨酸
(113)SEQ ID NO：1的第184位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(114)SEQ ID NO：1的第190位的脯氨酸被取代成丝氨酸
(115)SEQ ID NO：1的第193位的缬氨酸被取代成亮氨酸
(116)SEQ ID NO：1的第195位的天冬酰胺被取代成丙氨酸
(117)SEQ ID NO：1的第196位的丙氨酸被取代成丝氨酸
(118)SEQ ID NO：1的第198位的缬氨酸被取代成甘氨酸或甲硫氨酸
(119)SEQ ID NO：1的第199位的苏氨酸被取代成丙氨酸
(120)SEQ ID NO：1的第200位的丝氨酸被取代成甘氨酸或精氨酸
(121)SEQ ID NO：1的第202位的亮氨酸被取代成甲硫氨酸
(122)SEQ ID NO：1的第203位的亮氨酸被取代成组氨酸、谷氨酰胺、酪氨酸、精氨酸、脯氨酸
(123)SEQ ID NO：1的第204位的谷氨酸被取代成缬氨酸
(124)SEQ ID NO：1的第207位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺、组氨酸或精氨酸
(125)SEQ ID NO：1的第209位的苏氨酸被取代成丙氨酸
(126)SEQ ID NO：1的第211位的丝氨酸被取代成精氨酸或甘氨酸
(127)SEQ ID NO：1的第213位的谷氨酸被取代成缬氨酸或异亮氨酸
(128)SEQ ID NO：1的第215位的赖氨酸被取代成精氨酸或谷氨酸
(129)SEQ ID NO：1的第217位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺
(130)SEQ ID NO：1的第218位的亮氨酸被取代成异亮氨酸、甲硫氨酸或赖氨酸
(131)SEQ ID NO：1的第219位的谷氨酰胺被取代成脯氨酸或精氨酸
(132)SEQ ID NO：1的第223位的亮氨酸被取代成精氨酸、谷氨酰胺或甲硫氨酸
(133)SEQ ID NO：1的第224位的谷氨酰胺被取代成精氨酸
(134)SEQ ID NO：1的第225位的亮氨酸被取代成谷氨酰胺
(135)SEQ ID NO：1的第227位的苯丙氨酸被取代成异亮氨酸
(136)SEQ ID NO：1的第230位的酪氨酸被取代成组氨酸或苯丙氨酸
(137)SEQ ID NO：1的第231位的甲硫氨酸被取代成赖氨酸或精氨酸
(138)SEQ ID NO：1的第233位的丝氨酸被取代成甘氨酸或天冬酰胺
(139)SEQ ID NO：1的第234位的赖氨酸被取代成谷氨酸
(140)SEQ ID NO：1的第240位的天冬酰胺被取代成甘氨酸
(141)SEQ ID NO：1的第244位的谷氨酸被取代成缬氨酸
(142)SEQ ID NO：1的第245位的酪氨酸被取代成组氨酸或谷氨酸
(143)SEQ ID NO：1的第246位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或赖氨酸
(144)SEQ ID NO：1的第248位的亮氨酸被取代成异亮氨酸
(145)SEQ ID NO：1的第249位的苏氨酸被取代成丙氨酸或丝氨酸
(146)SEQ ID NO：1的第250位的丙氨酸被取代成缬氨酸
(147)SEQ ID NO：1的第251位的精氨酸被取代成丝氨酸
(148)SEQ ID NO：1的第252位的精氨酸被取代成组氨酸
(149)SEQ ID NO：1的第253位的谷氨酸被取代成甘氨酸
(150)SEQ ID NO：1的第257位的亮氨酸被取代成精氨酸或谷氨酰胺
(151)SEQ ID NO：1的第261位的谷氨酸被取代成缬氨酸或丙氨酸
(152)SEQ ID NO：1的第262位的丙氨酸被取代成缬氨酸
(153)SEQ ID NO：1的第263位的丙氨酸被取代成丝氨酸
(154)SEQ ID NO：1的第264位的苏氨酸被取代成丝氨酸
(155)SEQ ID NO：1的第265位的谷氨酸被取代成丙氨酸或甘氨酸
(156)SEQ ID NO：1的第268位的天冬酰胺被取代成丝氨酸、异亮氨酸或苏氨酸
(157)SEQ ID NO：1的第270位的亮氨酸被取代成组氨酸、精氨酸或缬氨酸
(158)SEQ ID NO：1的第271位的赖氨酸被取代成精氨酸
(159)SEQ ID NO：1的第272位的精氨酸被取代成谷氨酰胺
(160)SEQ ID NO：1的第277位的谷氨酸被取代成缬氨酸
(161)SEQ ID NO：1的第279位的谷氨酰胺被取代成精氨酸或组氨酸
(162)SEQ ID NO：1的第282位的甘氨酸被取代成天冬氨酸
(163)SEQ ID NO：1的第283位的亮氨酸被取代成脯氨酸
(164)SEQ ID NO：1的第285位的亮氨酸被取代成精氨酸或组氨酸
(165)SEQ ID NO：1的第286位的脯氨酸被取代成谷氨酰胺、精氨酸或谷氨酸
(166)SEQ ID NO：1的第287位的苏氨酸被取代成异亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸或缬氨酸
(167)SEQ ID NO：1的第288位的脯氨酸被取代成丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸
(168)SEQ ID NO：1的第289位的缬氨酸被取代成丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、亮氨酸或异亮氨酸。
2.根据权利要求1所述的Fc结合性蛋白质，其中，所述第16位至第289位的氨基酸序列中至少发生了所述(4)、(14)、(41)和(79)中的任一个氨基酸取代。
3.根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列中的第34位至第307位的氨基酸序列。
4.根据权利要求2所述的Fc结合性蛋白质，其包含SEQ ID NO：2、3、4、5、114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列。
5.编码权利要求1~4中的任一项所述的Fc结合性蛋白质的多核苷酸。
6.包含权利要求5所述的多核苷酸的表达载体。
7.用权利要求6所述的表达载体转化宿主而得到的转化体。
8.根据权利要求7所述的转化体，其中，所述宿主为大肠杆菌。
9.一种Fc结合性蛋白质的制造方法，其包括：
通过培养权利要求7或8所述的转化体生产Fc结合性蛋白质，并从其培养物回收生产的Fc结合性蛋白质。
10.包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料，其通过将权利要求1~4中任一项所述的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到。
11.一种抗体纯化方法，其包括：
(1)在包含Fc结合性蛋白质结合位点的蛋白质吸附材料中添加包含抗体的溶液，使该抗体吸附在该吸附材料上的步骤，其中，所述蛋白质吸附材料是将包含SEQ ID NO：114、118、130、134、148、154、164、170、174和176中的任一个所示的氨基酸序列的Fc结合性蛋白质固定化于固相而得到的；以及
(2)使用pH3.0~4.5的缓冲液洗脱吸附于所述吸附材料的所述抗体的步骤。
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