JP6116884B2 - 改良Ｆｃ結合性タンパク質およびその製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）やＩｇＧの定常領域であるＦｃ領域と他のタンパク質とを融合させた融合タンパク質（以下、Ｆｃ融合タンパク質という）に対し親和性を有する、Ｆｃ結合性タンパク質に関するものである。より詳しくは、遺伝子工学的手法を用いてアルカリ安定性を向上させたＦｃ結合性タンパク質に関するものである。

ガンや感染症等の治療薬として免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）を主成分とする抗体医薬が注目を浴びている。ＩｇＧは、例えば、遺伝子工学の手法を用いて当該ＩｇＧを発現可能なＣｈｉｎｅｓｅ Ｈａｍｓｔｅｒ Ｏｖａｒｙ（ＣＨＯ）細胞を作製後、作製したＣＨＯ細胞を培養することにより細胞外にＩｇＧを分泌発現させ、その後、遠心分離による細胞除去工程、精密ろ過あるいは限外ろ過膜による清澄化工程、クロマトグラフィーによる精製工程を経て、工業的に製造されている。

クロマトグラフィーによる精製工程は、大きく分けて、清澄化された培養液中のＩｇＧを捕捉する捕捉段階と、捕捉したＩｇＧを高度に精製する精製段階とに区分することができる。捕捉段階では、培養液中のＩｇＧを高純度に精製するために、ＩｇＧのＦｃ領域と特異的に結合するアフィニティークロマトグラフィーが利用されている。

ＩｇＧのＦｃ領域と結合するタンパク質としてヒトＦｃγ受容体が知られている。ヒトＦｃγ受容体は、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂおよびＦｃγＲＩＩＩのサブクラスに分類することができ（非特許文献１）、中でもＦｃγＲＩは、抗原と結合していないＩｇＧに対しても高度な親和性を有している。

ヒトＦｃγＲＩは、シグナルペプチド領域、細胞外領域、細胞膜貫通領域および細胞内領域に大別され、ＩｇＧとの結合は、ＩｇＧのＦｃ領域とＦｃγＲＩの細胞外領域で起こる。その後両者の結合シグナルが細胞質へと伝達される。ヒトＦｃγＲＩの細胞外領域（以下、Ｆｃ結合性タンパク質という）のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は非特許文献２により明らかにされ、その後、遺伝子組換え技術により、動物細胞（非特許文献３）や大腸菌による発現例（特許文献１）が報告されている。

前述した通り、Ｆｃ結合性タンパク質はアフィニティークロマトグラフィーゲルのリガンドとして機能する十分な特性を備えている。しかしながらＦｃ結合性タンパク質は、ヒト生体内で機能するタンパク質であるため、細菌の細胞表層などの生体外に存在するタンパク質などに比べて、熱や極端なｐＨ変化などによりタンパク質変性が起こる傾向が強い。例えば、Ｆｃ結合性タンパク質をリガンドとして固定化したクロマトグラフィーゲルをアルカリ洗浄または再生した場合、当該リガンドが洗浄または再生に用いる高いｐＨの溶液（例えば水酸化ナトリウム水溶液）等にさらされることで、当該リガンドが有するＩｇＧ結合活性が失われることがある。そのため、Ｆｃ結合性タンパク質をアフィニティークロマトグラフィーゲルのリガンドとして使用するためには、アルカリに対する高い安定性が求められる。アルカリに対する安定性を向上させたＦｃ結合性タンパク質については特許文献２で開示しているが、安定性の面ではまだ十分とはいえなかった。

特表２００２−５３１０８６号公報 特開２０１１−２０６０４６号公報

Ｊ．Ｖ．Ｒａｖｅｔｃｈ等，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９，４５７，１９９１ Ｊ．Ｍ．Ａｌｌｅｎ等，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４３，３７８，１９８９ Ａ．Ｐａｅｔｚ等，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．，３３８，１８１１、２００５

本発明の目的は、特許文献２に開示のＦｃ結合性タンパク質よりも、アルカリに対してさらに高い安定性を有した、ＩｇＧおよびＦｃ融合タンパク質に対して良好な結合性を有するＦｃ結合性タンパク質、およびその製造方法を提供することにある。

本発明者らは鋭意検討した結果、Ｆｃ結合性タンパク質を構成するアミノ酸のうち特定の位置にあるアミノ酸を他の特定のアミノ酸に置換することにより、Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリに対する安定性がさらに向上することを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の第一の態様は、
配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において以下の（１）から（４２）のうち少なくともいずれか１つのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号１３の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２）配列番号１３の３８番目のプロリンがセリンに置換
（３）配列番号１３の５３番目のロイシンがグルタミンに置換
（４）配列番号１３の６２番目のグルタミン酸がバリンに置換
（５）配列番号１３の６３番目のバリンがアラニンまたはグルタミン酸に置換
（６）配列番号１３の６６番目のロイシンがグルタミンまたはプロリンに置換
（７）配列番号１３の６７番目のセリンがプロリンに置換
（８）配列番号１３の６９番目のアラニンがバリンまたはスレオニンに置換
（９）配列番号１３の７１番目のセリンがスレオニンまたはロイシンに置換
（１０）配列番号１３の７８番目のアスパラギン酸がグルタミン酸に置換
（１１）配列番号１３の８１番目のイソロイシンがバリンに置換
（１２）配列番号１３の８４番目のセリンがスレオニンに置換
（１３）配列番号１３の８８番目のフェニルアラニンがチロシンに置換
（１４）配列番号１３の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
（１５）配列番号１３の１１９番目のヒスチジンがグルタミンに置換
（１６）配列番号１３の１２７番目のバリンがアラニンに置換
（１７）配列番号１３の１４６番目のアルギニンがリジンに置換
（１８）配列番号１３の１４７番目のアスパラギン酸がアスパラギンに置換
（１９）配列番号１３の１５１番目のヒスチジンがチロシンに置換
（２０）配列番号１３の１７８番目のスレオニンがアラニンに置換
（２１）配列番号１３の１９１番目のアルギニンがリジンに置換
（２２）配列番号１３の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（２３）配列番号１３の２００番目のロイシンがメチオニンに置換
（２４）配列番号１３の２１３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２５）配列番号１３の２１６番目のバリンがアラニンに置換
（２６）配列番号１３の２２１番目のロイシンがアルギニンに置換
（２７）配列番号１３の２２９番目のセリンがアスパラギンに置換
（２８）配列番号１３の２３６番目のイソロイシンがリジンに置換
（２９）配列番号１３の２４４番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号１３の２５３番目のスレオニンがアラニンに置換
（３１）配列番号１３の２９０番目のアルギニンがグルタミンに置換
（３２）配列番号１３の２９３番目のリジンがアスパラギンに置換
（３３）配列番号１３の２９７番目のリジンがグルタミン酸に置換
（３４）配列番号１３の３０６番目のプロリンがスレオニンに置換
（３５）配列番号１３の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換
（３６）配列番号１３の４５番目のグルタミンがリジンに置換
（３７）配列番号１３の８２番目のグルタミンがプロリンに置換
（３８）配列番号１３の１７７番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（３９）配列番号１３の２１３番目のスレオニンがセリンに置換
（４０）配列番号１３の２４２番目のグルタミンがアルギニンに置換
（４１）配列番号１３の２５３番目のスレオニンがセリンに置換
（４２）配列番号１３の２７１番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
また本発明の第二の態様は、前記３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において、少なくとも以下の（Ａ）から（Ｃ）に記載のアミノ酸置換が生じている、前記第一の態様に記載のＦｃ結合性タンパク質である。
（Ａ）配列番号１３の６３番目のバリンがグルタミン酸に置換
（Ｂ）配列番号１３の６９番目のアラニンがバリンに置換
（Ｃ）配列番号１３の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
また本発明の第三の態様は、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２および配列番号７４のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含む、前記第二の態様に記載のＦｃ結合性タンパク質である。

また本発明の第四の態様は、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２および配列番号７４のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、前記第三の態様に記載のＦｃ結合性タンパク質である。

さらに本発明の第五の態様は、前記第一から第四の態様のいずれかに記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドである。

さらに本発明の第六の態様は、前記第五の態様に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクターである。

さらに本発明の第七の態様は、前記第六の態様に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体である。

また本発明の第八の態様は、宿主が大腸菌である、前記第七の態様に記載の形質転換体である。

さらに本発明の第九の態様は、前記第七または第八の態様に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産させ、得られた培養物から生産されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

Ｆｃ結合性タンパク質を含むヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩは図１に示す構成であり、Ｎ末端側から１５アミノ酸からなるシグナルペプチド領域（ＳＳ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち、１番目から１５番目までの領域）、２７７アミノ酸からなる細胞外領域（ＥＣ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち１６番目から２９２番目の領域）、２１アミノ酸からなる細胞膜貫通領域（ＴＭ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち２９３番目から３１３番目までの領域）、６１アミノ酸からなる細胞内領域（Ｃ、配列番号１に記載のアミノ酸配列のうち３１４番目から３７４番目までの領域）から構成される。

本発明のＦｃ結合性タンパク質における、アミノ酸置換の基準となるＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４（配列番号１３）は、特開２０１１−２０６０４６号公報で開示のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（配列番号２）のアミノ酸配列において、２９２番目のプロリンがリジンに、２９３番目のグルタミン酸がリジンに、２９７番目のグルタミンがリジンに、３０１番目のヒスチジンがリジンに、および３０４番目のプロリンがリジンにそれぞれアミノ酸置換したＦｃ結合性タンパク質である。なおＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃ（配列番号２）は、配列番号１に記載のヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列のうち１６番目から２８９番目までのアミノ酸配列（配列番号２においては３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列に相当）を含み、かつ、以下（１）から（６０）に示すアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質である。
（１）配列番号１の２０番目のスレオニンがプロリンに置換
（２）配列番号１の２５番目のスレオニンがリジンに置換
（３）配列番号１の３５番目のグルタミンがロイシンに置換
（４）配列番号１の３６番目のグルタミン酸がグリシンに置換
（５）配列番号１の３８番目のスレオニンがセリンに置換
（６）配列番号１の４１番目のロイシンがメチオニンに置換
（７）配列番号１の４２番目のヒスチジンがロイシンに置換
（８）配列番号１の４６番目のロイシンがプロリンに置換
（９）配列番号１の４９番目のプロリンがセリンに置換
（１０）配列番号１の５１番目のセリンがアラニンに置換
（１１）配列番号１の５２番目のセリンがグリシンに置換
（１２）配列番号１の５８番目のロイシンがアルギニンに置換
（１３）配列番号１の６０番目のグリシンがアスパラギン酸に置換
（１４）配列番号１の６３番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（１５）配列番号１の６５番目のスレオニンがアラニンに置換
（１６）配列番号１の６９番目のセリンがスレオニンに置換
（１７）配列番号１の７０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（１８）配列番号１の７１番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（１９）配列番号１の７３番目のスレオニンがアラニンに置換
（２０）配列番号１の７７番目のバリンがグルタミン酸に置換
（２１）配列番号１の７８番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（２２）配列番号１の９７番目のグルタミンがロイシンに置換
（２３）配列番号１の１００番目のイソロイシンがバリンに置換
（２４）配列番号１の１１１番目のセリンがアラニンに置換
（２５）配列番号１の１１４番目のフェニルアラニンがロイシンに置換
（２６）配列番号１の１１５番目のスレオニンがイソロイシンに置換
（２７）配列番号１の１２１番目のアラニンがバリンに置換
（２８）配列番号１の１２８番目のリジンがアルギニンに置換
（２９）配列番号１の１３３番目のチロシンがヒスチジンに置換
（３０）配列番号１の１３７番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（３１）配列番号１の１３９番目のアルギニンがヒスチジンに置換
（３２）配列番号１の１４９番目のトリプトファンがアルギニンに置換
（３３）配列番号１の１５１番目のセリンがスレオニンに置換
（３４）配列番号１の１５２番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（３５）配列番号１の１５６番目のロイシンがプロリンに置換
（３６）配列番号１の１５７番目のリジンがアルギニンに置換
（３７）配列番号１の１６０番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（３８）配列番号１の１６３番目のアスパラギンがセリンに置換
（３９）配列番号１の１６５番目のスレオニンがメチオニンに置換
（４０）配列番号１の１７３番目のリジンがアルギニンに置換
（４１）配列番号１の１８１番目のイソロイシンがスレオニンに置換
（４２）配列番号１の１８２番目のセリンがロイシンに置換
（４３）配列番号１の１８４番目のスレオニンがセリンに置換
（４４）配列番号１の１９５番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（４５）配列番号１の１９９番目のスレオニンがアラニンに置換
（４６）配列番号１の２０６番目のアスパラギンがスレオニンに置換
（４７）配列番号１の２０７番目のロイシンがプロリンに置換
（４８）配列番号１の２１３番目のグルタミン酸がバリンに置換
（４９）配列番号１の２１７番目のロイシンがグルタミンに置換
（５０）配列番号１の２１８番目のロイシンがイソロイシンに置換
（５１）配列番号１の２３０番目のチロシンがフェニルアラニンに置換
（５２）配列番号１の２３１番目のメチオニンがリジンに置換
（５３）配列番号１の２３３番目のセリンがグリシンに置換
（５４）配列番号１の２３４番目のリジンがグルタミン酸に置換
（５５）配列番号１の２４０番目のアスパラギンがアスパラギン酸に置換
（５６）配列番号１の２４９番目のスレオニンがアラニンに置換
（５７）配列番号１の２７０番目のロイシンがバリンに置換
（５８）配列番号１の２８３番目のロイシンがヒスチジンに置換
（５９）配列番号１の２８５番目のロイシンがグルタミンに置換
（６０）配列番号１の２８９番目のバリンがアスパラギン酸に置換
本発明のＦｃ結合性タンパク質は、前述した配列番号１３に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において少なくとも特定位置におけるアミノ酸置換が１つ以上生じている、Ｆｃ結合性タンパク質である。なお本発明のＦｃ結合性タンパク質は、配列番号１３に記載のＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４の３４番目から３０７番目まで（配列番号１においては１６番目から２８９番目まで）のアミノ酸配列に相当する領域を少なくとも含んでいればよく、細胞外領域（ＥＣ）のＮ末端側にあるシグナルペプチド領域（ＳＳ）のすべてまたは一部を含んでもよいし、細胞外領域のＣ末端側にある細胞膜貫通領域（ＴＭ）または細胞内領域（Ｃ）を含んでもよい。

前記特定位置におけるアミノ酸置換は、具体的には、配列番号１３に記載のアミノ酸配列において、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ（この表記は配列番号１３の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換されていることを示す、以下同様）、Ｐｒｏ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ５３Ｇｌｎ、Ｇｌｕ６２Ｖａｌ、Ｖａｌ６３Ａｌａ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ｌｅｕ６６Ｇｌｎ、Ｓｅｒ６７Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ａｌａ６９Ｔｈｒ、Ｓｅｒ７１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ａｓｐ７８Ｇｌｕ、Ｉｌｅ８１Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｐｈｅ８８Ｔｙｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｈｉｓ１１９Ｇｌｎ、Ｖａｌ１２７Ａｌａ、Ａｒｇ１４６Ｌｙｓ、Ａｓｐ１４７Ａｓｎ、Ｈｉｓ１５１Ｔｙｒ、Ｔｈｒ１７８Ａｌａ、Ａｒｇ１９１Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２００Ｍｅｔ、Ｔｈｒ２１３Ａｌａ、Ｖａｌ２１６Ａｌａ、Ｌｅｕ２２１Ａｒｇ、Ｓｅｒ２２９Ａｓｎ、Ｉｌｅ２３６Ｌｙｓ、Ｔｙｒ２４４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ２５３Ａｌａ、Ａｒｇ２９０Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ２９７Ｇｌｕ、Ｐｒｏ３０６Ｔｈｒ、Ｇｌｎ３４Ａｒｇ、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓ、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２５３ＳｅｒおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐである。なお前述した特定位置におけるアミノ酸置換のうち、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｈｉｓ１１９ＧｌｎおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのうちいずれか１つ以上のアミノ酸置換が生じると好ましい。また前述した特定位置におけるアミノ酸置換のうち、少なくともＶａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換が生じるとより好ましい。

本発明のＦｃ結合性タンパク質の一例として、
（ａ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＶａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号１８に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｂ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＶａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１ＬｅｕおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号２２に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｃ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５ＡｓｐおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号３０に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｄ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５ＡｓｐおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号３２に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｅ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｈｉｓ１１９ＧｌｎおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号３８に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｆ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号４５に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、（ｇ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号４９に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｈ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号５３に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｉ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号５７に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｊ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＧｌｎ３４Ａｒｇ、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇおよび Ｇｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号６１に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｋ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号６４に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｌ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇおよび Ｇｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号６８に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｍ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２５３Ｓｅｒおよび Ｇｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号７２に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
（ｎ）配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列においてＴｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２５３ＳｅｒおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換が生じている、Ｆｃ結合性タンパク質（配列番号７４に記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含むＦｃ結合性タンパク質）、
があげられる。

なお本発明のＦｃ結合性タンパク質を作製する際、特定のアミノ酸についてはＩｇＧ結合活性を有する限り、前述した特定位置におけるアミノ酸置換以外のアミノ酸置換を行なってもよい。一例として、アミノ酸間の物理的性質と化学的性質またはそのどちらかが類似したアミノ酸間で置換する保守的置換があげられ、保守的置換はＦｃ結合性タンパク質に限らず、一般にタンパク質の機能が維持されることが当業者において知られている。保守的置換の一例としては、グリシンとアラニン、アスパラギン酸とグルタミン酸、セリンとプロリンの対をそれぞれあげることができる（タンパク質の構造と機能，メディカル・サイエンス・インターナショナル社，９，２００５）。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、そのＮ末端側またはＣ末端側に、夾雑物質存在下の溶液から分離する際に有用なオリゴペプチドをさらに付加してもよい。前記オリゴペプチドとしては、ポリヒスチジン、ポリリジン、ポリアルギニン、ポリグルタミン酸、ポリアスパラギン酸等があげられる。また本発明のＦｃ結合性タンパク質をクロマトグラフィー用の支持体等の固相に固定化する際に有用な、システインを含むオリゴペプチド（例えば配列番号４１に記載のアミノ酸配列からなるオリゴペプチドやＣｙｓ−Ｇｌｙからなるジペプチド）を、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側にさらに付加してもよい。Ｆｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加するオリゴペプチドの長さは、本発明のＦｃ結合性タンパク質のＩｇＧ結合性やアルカリに対する安定性を損なわない限り制限はなく、１から１００アミノ酸、好ましくは２から５０アミノ酸、さらに好ましくは３から１０アミノ酸である。前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質に付加させる際は、前記オリゴペプチドをコードするポリヌクレオチドを作製後、当業者に周知の方法を用いて遺伝子工学的にＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に付加させてもよいし、化学的に合成した前記オリゴペプチドを本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側またはＣ末端側に化学的に結合させて付加させてもよい。さらに本発明のＦｃ結合性タンパク質のＮ末端側には、宿主での効率的な発現を促すためのシグナルペプチドを付加してもよい。宿主が大腸菌の場合における前記シグナルペプチドの例としては、ＰｅｌＢ（配列番号４０）、ＤｓｂＡ、ＭａｌＥ、ＴｏｒＴなどといったペリプラズムにタンパク質を分泌させるシグナルペプチドを例示することができる（特開２０１１−０９７８９８号公報）。

以下、本発明のＦｃ結合性タンパク質の製造方法について、本発明のＦｃ結合性タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチド（以下、本発明のポリヌクレオチドとする）の作製、本発明のポリヌクレオチドを用いての宿主への形質転換、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を用いた前記タンパク質の調製、の順に説明する。

本発明のポリヌクレオチドの作製方法の一例として、
（Ｉ）本発明のＦｃ結合性タンパク質のアミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換し、当該ヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを人工的に合成する方法や、
（ＩＩ）ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドを直接人工的に、またはヒトＦｃγＲＩのｃＤＮＡ等からＰＣＲ法といったＤＮＡ増幅法を用いて調製し、調製した当該ポリヌクレオチドを適当な方法で連結する方法、が例示できる。
前記（Ｉ）の方法において、アミノ酸配列からヌクレオチド配列に変換する際、形質転換させる宿主におけるコドンの使用頻度を考慮して変換するのが好ましい。一例として、宿主が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）の場合は、アルギニン（Ａｒｇ）ではＡＧＡ／ＡＧＧ／ＣＧＧ／ＣＧＡが、イソロイシン（Ｉｌｅ）ではＡＴＡが、ロイシン（Ｌｅｕ）ではＣＴＡが、グリシン（Ｇｌｙ）ではＧＧＡが、プロリン（Ｐｒｏ）ではＣＣＣが、それぞれ使用頻度が少ないため（いわゆるレアコドンであるため）、それらのコドンを避けるように変換すればよい。コドンの使用頻度の解析は公的データベース（例えば、かずさＤＮＡ研究所のホームページにあるＣｏｄｏｎ Ｕｓａｇｅ Ｄａｔａｂａｓｅなど）を利用することによっても可能である。

本発明のポリヌクレオチドへ変異を導入する場合、エラープローンＰＣＲ法を用いることができる。エラープローンＰＣＲ法における反応条件は、ヒトＦｃγＲＩ（またはＦｃ結合性タンパク質）をコードするポリヌクレオチドに所望の変異を導入できる条件であれば特に限定はなく、例えば、基質である４種類のデオキシヌクレオチド（ｄＡＴＰ／ｄＴＴＰ／ｄＣＴＰ／ｄＧＴＰ）の濃度を不均一にし、ＭｎＣｌ_２を０．０１から１０ｍＭ（好ましくは０．１から１ｍＭ）の濃度でＰＣＲ反応液に添加してＰＣＲを行なうことで、ポリヌクレオチドに変異を導入することができる。またエラープローンＰＣＲ法以外の変異導入方法としては、ヒトＦｃγＲＩの全体または部分配列を含むポリヌクレオチドに、変異原となる薬剤を接触・作用させたり、紫外線を照射したりして、ポリヌクレオチドに変異を導入して作製する方法があげられる。当該方法において変異原として使用する薬剤としては、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン等、当業者が通常用いる変異原性薬剤を用いればよい。

本発明のポリヌクレオチドを用いて宿主を形質転換するには、本発明のポリヌクレオチドそのものを用いて形質転換してもよいが、発現ベクター（例えば、原核細胞や真核細胞の形質転換に通常用いるバクテリオファージ、コスミドやプラスミド）中の適切な位置に本発明のポリヌクレオチドを挿入し、それを用いて形質転換したほうが、安定した形質転換が実施できる点で好ましい。なお、使用する発現ベクターは、形質転換する宿主内で安定に存在し複製できるものであれば特に制限はない。大腸菌を宿主とする場合の発現ベクターとしては、ｐＥＴ系発現ベクター、ｐＵＣ発現ベクター、ｐＴｒｃ発現ベクター、ｐＣＤＦ発現ベクター、ｐＢＢＲ発現ベクターが例示できる。なお前記適切な位置とは、発現ベクターの複製機能、所望の抗生物質マーカー、および伝達性に関わる領域を破壊しない位置を意味する。前記発現ベクターに本発明のポリヌクレオチドを挿入する際は、発現に必要なプロモータといった機能性ポリヌクレオチドに連結される状態で発現ベクターに挿入すると好ましい。当該プロモータの例として、宿主が大腸菌の場合は、ｔｒｐプロモータ、ｔａｃプロモータ、ｔｒｃプロモータ、ｌａｃプロモータ、Ｔ７プロモータ、ｒｅｃＡプロモータ、ｌｐｐプロモータ、さらにはλファージのλＰＬプロモータ、λＰＲプロモータがあげられる。

前記方法により作製した、本発明のポリヌクレオチドを挿入した発現ベクター（以下、本発明の発現ベクターとする）を用いて宿主を形質転換するには、当業者が通常用いる方法で行なえばよい。例えば、宿主としてＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ属に属する微生物（大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株、大腸菌Ｗ３１１０株等）を選択する場合には、公知の文献（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，２５６，１９９２）に記載の方法等により形質転換すればよい。前述した方法で形質転換して得られた形質転換体は、適切な方法でスクリーニングすることにより、本発明のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体（以下、本発明の形質転換体とする）を取得することができる。

本発明の形質転換体から本発明の発現ベクターを調製するには、アルカリ抽出法またはＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）等の市販の抽出キットを用いて調製すればよい。本発明の形質転換体をスクリーニングするには、例えば得られた形質転換体によって発現されるＦｃ結合性タンパク質に対するＩｇＧの結合活性を測定する方法があげられる。測定方法としては、例えばＩｇＧに対する結合活性をＥｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ Ａｓｓａｙ（以下、ＥＬＩＳＡと表記）法や表面プラズモン共鳴法などを用いて測定すればよい。結合活性の測定に使用するＩｇＧは、ヒトＩｇＧが好ましく、ヒトＩｇＧ１やヒトＩｇＧ３が特に好ましい。

本発明の形質転換体を用いて本発明のＦｃ結合性タンパク質を調製するには、本発明の形質転換体を培養することでＦｃ結合性タンパク質を生産させ、得られた培養混合物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収すればよい。なお本明細書において、培養混合物とは、培養された形質転換体の細胞自体や細胞分泌物のほか、培養に用いた培地等も含まれる。

本発明の形質転換体を培養する際は、当該形質転換体を宿主の培養に適した培地で培養すればよい。例えば宿主が大腸菌の場合は、必要な栄養源を補ったＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）培地が好ましい培地の一例としてあげられる。なお培地に本発明の発現ベクターに含まれる薬剤耐性遺伝子に対応した薬剤を添加して培養すると、本発明の発現ベクターの導入の有無による形質転換体の選択的増殖が可能となるため好ましい。例えば、当該発現ベクターがカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる場合は、培地にカナマイシンを添加すればよい。また培地には、炭素、窒素および無機塩供給源の他に、適当な栄養源を添加しても良く、所望により、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレートおよびジチオスレイトールからなる群から選択される一種類以上の還元剤を含んでもよい。さらに前記形質転換体から培養液へのタンパク質分泌を促すためにグリシンなどの試薬を培地に添加してもよい。グリシンを添加する場合、具体的には、宿主が大腸菌の場合、培地に対してグリシンを２％（ｗ／ｖ）以下で添加すればよい。培養温度は、当該技術分野において一般的な培養温度であればよい。例えば、宿主が大腸菌の場合、一般に１０℃から４０℃、好ましくは２５℃から３５℃、より好ましくは３０℃前後であり、発現させる本発明のＦｃ結合性タンパク質の特性により適宜選択すればよい。培地のｐＨは、当該技術分野において一般的な範囲の中から宿主の種類など諸条件に応じて適宜選択すればよく、例えば宿主が大腸菌の場合、ｐＨ６．８からｐＨ７．４の範囲が好ましく、ｐＨ７．０前後がさらに好ましい。なお本発明の発現ベクターに誘導性のプロモータを含んでいる場合は、本発明のＦｃ結合性タンパク質を含むポリペプチドが良好に発現できるような条件下で誘導剤を添加しタンパク質発現を誘導すればよい。好ましい誘導剤としてはｉｓｏｐｒｏｐｙｌ−β−Ｄ−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ）を例示できる。ＩＰＴＧの添加濃度は０．００５から１．０ｍＭの範囲から適宜選択すればよいが、０．０１から０．５ｍＭの範囲が好ましい。ＩＰＴＧ誘導に関する種々の条件は当該技術分野において周知の条件で行なえばよい。具体例として、宿主が大腸菌の場合、培養液の濁度（６００ｎｍにおける吸光度）が約０．５から１．０のときに適当量のＩＰＴＧを添加後、引き続き培養することで、本発明のＦｃ結合性タンパク質の発現を誘導することができる。

本発明の形質転換体を培養して得られた培養混合物から本発明のＦｃ結合性タンパク質を回収するには、当業者が通常用いる方法の中から適宜選択して用いればよい。まず前記培養混合物からの本発明のＦｃ結合性タンパク質の抽出は、発現の形態に応じて実施すればよい。培養上清に発現する場合は、菌体を遠心分離操作によって分離し、得られる培養上清からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。細胞内（原核生物においてはペリプラズムも含む）に発現する場合は、遠心分離操作により菌体を集めた後、酵素処理剤や界面活性剤等を添加することにより菌体を破砕し、菌体破砕液からＦｃ結合性タンパク質を抽出すればよい。前述した方法で得られた抽出物の中からＦｃ結合性タンパク質を分離精製するには、当該技術分野において公知の方法を用いればよく、その一例として、液体クロマトグラフィーを用いた分離精製があげられる。液体クロマトグラフィーとしては、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー等があり、これらのクロマトグラフィーを組み合わせて精製を行なうことで、本発明のＦｃ結合性タンパク質を高純度に調製することができる。

本発明のＦｃ結合性タンパク質は、野生型のヒトＦｃγＲＩや既知のＦｃ結合性タンパク質と比較し、アルカリに対する安定性が向上している。そのため、本発明のＦｃ結合性タンパク質はヒトＩｇＧといった抗体やＦｃ融合タンパク質を精製するためのアフィニティークロマトグラフィー用のリガンドとして好ましく用いることができる。

ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩの構成概略を示す図である。

以下、本発明の実施の形態について、実施例を用いて詳細に説明するが、本実施例は本発明の一形態を説明するためのものであり、本発明を限定するものではない。

実施例１ 発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６４の作製
（１）以下に示す方法で、ＰｅｌＢシグナルペプチド（アミノ酸配列：ＭＫＹＬＬＰＴＡＡＡＧＬＬＬＬＡＡＱＰＡＭＡ、配列番号４０）をコードするポリヌクレオチドを発現ベクターｐＴｒｃ９９ａ（ＧＥヘルスケア社製）に挿入することで、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを作製した。
（１−１）配列番号３（５’―ＣＡＴＧＡＡＡＴＡＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＡＣＣＧＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＴＣＴＧＣＴＧＣＴＣＣＴＣＧＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣ―３’）および配列番号４（５’―ＣＡＴＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＴＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＧＡＧＣＡＧＣＡＧＡＣＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＧＧＴＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＴＡＴＴＴ―３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを等量混合し、９５℃で５分間加熱後、１５℃になるまで１分間で１℃毎に温度を下げることで、二本鎖オリゴヌクレオチドＰｅｌＢｐ１を調製した。なお、ＰｅｌＢｐ１は使用時まで１５℃で保持した。
（１−２）（１−１）で調製したＰｅｌＢｐ１を、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩで消化した発現ベクターｐＴｒｃ９９ａに、ＤＮＡ Ｌｉｇａｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてライゲーションし、これを用いて大腸菌ＪＭ１０９株（タカラバイオ社製）を形質転換した。
（１−３）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌを抽出した。
（２）以下に示す方法で、特開２０１１−２０６０４６号公報で開示されているＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６０ｃ（配列番号２）に対して、２９２番目のプロリンをリジンに、２９３番目のグルタミン酸をリジンに、２９７番目のグルタミンをリジンに、３０１番目のヒスチジンをリジンに、３０４番目のプロリンをリジンに、それぞれアミノ酸置換し、かつそのＣ末端に配列番号４１に記載のアミノ酸配列（ＧＳＧＧＣＧ、以下これをシステインタグとする）を導入したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６４）をコードするポリヌクレオチドを調製した。
（２−１）配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報）を鋳型とし、配列番号５（５’−ＡＡＣＡＴＧＣＣＡＴＧＧＡＴＡＴＣＧＧＡＡＴＴＡＡＴＴＣＧＧＡＴＣＣＣＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＣＡＡ−３’）および配列番号６（５’−ＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＡＣＴＣＡＡＧＴＴＴＴＴＴＧＣＴＣＣＧＴＴＴＡＡＣＣＡＣＡＴＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表１に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃に１０秒間の第１ステップ、６０℃に５秒間の第２ステップ、および７２℃に１分間の第３ステップからなるサイクルを３０回繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６０ｃｐＫ５ｐ１と命名した。

（２−２）ＰＣＲ産物ｍ６０ｃｐＫ５ｐ１を鋳型とし、配列番号５および配列番号７（５’−ＴＴＣＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、６０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップからなるサイクルを３０回繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をＰＣＲ産物ｍ６０ｃｐＫ５ｐ２と命名した。

（２−３）ＰＣＲ産物ｍ６０ｃｐＫ５ｐ２をアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いてゲルより抽出することで精製した。
（２−４）精製したＰＣＲ産物ｍ６０ｃｐＫ５ｐ２を制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化した（１）で調製した発現ベクターｐＴｒｃｐｅｌにライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（２−５）得られた形質転換体を１００μｇ／ｍＬのカルベニシリン（タカラバイオ社製）を含むＬＢ培地にて培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、発現べクターを抽出した。得られた発現べクターに挿入されているＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ）のうち、４０番目のアラニンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域からなるＦｃ結合性タンパク質であって、２９２番目のプロリンがリジンに、２９３番目のグルタミン酸がリジンに、２９７番目のグルタミンがリジンに、３０１番目のヒスチジンがリジンに、３０４番目のプロリンがリジンにそれぞれアミノ酸置換がなされ、さらにＣ末端にシステインタグを挿入したＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧをコードするポリヌクレオチドである。ここで得られた発現ベクターをｐＴｒｃＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧと命名した。
（２−６）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６０ｃ（特開２０１１−２０６０４６号公報）を鋳型とし、配列番号８（５’−ＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ−３’）および配列番号９（５’−ＡＧＣＡＡＴＧＧＴＡＣＡＴＣＣＣＧＣＴＧＴＧＧＧＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６４ｐ１と命名した。

（２−７）（２−５）で得られた発現ベクターｐＴｒｃＦｃＲｍ６０ｃｐＫ５ＣＧを鋳型とし、配列番号１０（５’−ＴＣＣＣＡＣＡＧＣＧＧＧＡＴＧＴＡＣＣＡＴＴＧＣＴ−３’）および配列番号１１（５’−ＡＣＡＧＣＣＡＡＧＣＴＴＡＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＣＡＣＣＧＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６４ｐ２と命名した。
（２−８）ＰＣＲ産物ｍ６４ｐ１およびｍ６４ｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（２−９）精製したＰＣＲ産物ｍ６４ｐ１およびｍ６４ｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６４ｐ３と命名した。

（２−１０）ＰＣＲ産物ｍ６４ｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとしてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４をコードするポリヌクレオチドを得た。
（３）得られたＦｃＲｍ６４をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養後、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて、ＦｃＲｍ６４をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６４を抽出した。
（５）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６４のうち、ＦｃＲｍ６４をコードするポリヌクレオチドおよびその周辺の領域について、チェーンターミネータ法に基づくＢｉｇ Ｄｙｅ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ＦＳ ｒｅａｄ Ｒｅａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動ＤＮＡシークエンサーＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ３７００ ＤＮＡ ａｎａｌｙｚｅｒ（ＰＥアプライドバイオシステム社製）にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号８または配列番号１２（５’−ＴＡＴＧＣＴＡＧＴＴＡＴＴＧＣＴＣＡＧ−３’）に記載からなるオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６４により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１３に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１４に、それぞれ示す。なお配列番号１３において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号１３において、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。

実施例２ ＦｃＲｍ６４のランダム変異体ライブラリー作製
（１）エラープローンＰＣＲを用いて、実施例１で作製したＦｃ結合性タンパク質であるＦｃＲｍ６４をコードするポリヌクレオチドへランダムに変異を導入した。鋳型ＤＮＡとして実施例１に記載の発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６４を、ＰＣＲプライマーとして配列番号１５（５’−ＴＣＡＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＣＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴＧＡＴＴＡ−３’）および配列番号１１に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。

（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４のランダム変異体ライブラリーを作製した。

実施例３ アルカリ安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質のスクリーニング（その１）
（１）実施例２で作製したＦｃＲｍ６４のランダム変異体ライブラリーを、５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む２ＹＴ液体培地（１６ｇ／ＬのＴｒｙｐｔｏｎｅ、１０ｇ／ＬのＹｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ、５ｇ／ＬのＮａＣｌ）２００μＬに接種し、９６穴ディープウェルプレートを用いて、３７℃で好気的に一晩振とう培養した。
（２）培養後、５０μＬの培養液を５００μＬの２ＹＴ液体培地（０．０５ｍＭのＩＰＴＧ、０．３％のグリシン、および５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含む）に植え継ぎ、９６穴ディープウェルプレートを用いて、さらに２０℃で好気的に一晩振とう培養した。
（３）培養後、遠心操作により得られる培養上清（当該上清には発現したＦｃ結合性タンパク質が含まれる）を４００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液と等量混合し、３７℃で１８０分間放置するアルカリ処理を行ない、処理後は１．２５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）をアルカリ処理液に対し４倍量添加することでｐＨを中性領域に戻した。なお対照（アルカリ処理を行なわない系）として、４００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の代わりに１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、前記アルカリ処理と同様の処理を行なった。
（４）アルカリ処理を行なったとき、およびアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を下記に示すＥＬＩＳＡ法を用いてそれぞれ測定し、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性をアルカリ処理を行わなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。
（４−１）ヒト抗体であるガンマグロブリン製剤（化学及血清療法研究所製）を、９６穴マイクロプレートのウェルに１μｇ／ｗｅｌｌの濃度で固定化し（４℃で１８時間）、固定化終了後、２％（ｗ／ｖ）のＳＫＩＭ ＭＩＬＫ（ＢＤ社製）を含んだ２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）によりブロッキングした。
（４−２）洗浄緩衝液（０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ２０と１５０ｍＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４））で洗浄後、調製したＦｃ結合性タンパク質を含む溶液を固定化ガンマグロブリンと反応させた（３０℃で１時間）。
（４−３）反応終了後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＡｎｔｉ−ＦｃγＲＩ抗体（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−４）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、５０ｎｇ／ｍＬに希釈したＨｏｒｓｅ ｒａｄｉｓｈ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ（ＨＲＰ）標識のＡｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ−ＩｇＧ抗体（ＢＥＴＨＹＬ社製）を１００μＬ／ｗｅｌｌで添加した。
（４−５）３０℃で１時間反応後、前記洗浄緩衝液で洗浄し、ＴＭＢ Ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＫＰＬ社製）を添加し４５０ｎｍの吸光度を測定した。
（５）（４）の測定を実施した約２７００株の形質転換体の中から、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４と比較しアルカリ安定性または発現量が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを得た。
（６）得られた発現ベクターのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、配列番号８または配列番号１２に記載の配列からなるシーケンスプライマーを用いて、実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析した。

（５）で選択した形質転換体が発現するＦｃ結合性タンパク質の、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表６に示す。配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域（ＦｃＲｍ６４の領域）を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までの領域において、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ（この表記は、配列番号１３の３７番目のスレオニンがイソロイシンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｐｒｏ３８Ｓｅｒ、Ｌｅｕ５３Ｇｌｎ、Ｇｌｕ６２Ｖａｌ、Ｖａｌ６３Ａｌａ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ｌｅｕ６６Ｇｌｎ、Ｓｅｒ６７Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ａｌａ６９Ｔｈｒ、Ｓｅｒ７１Ｔｈｒ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ａｓｐ７８Ｇｌｕ、Ｉｌｅ８１Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｐｈｅ８８Ｔｙｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｈｉｓ１１９Ｇｌｎ、Ｖａｌ１２７Ａｌａ、Ａｒｇ１４６Ｌｙｓ、Ａｓｐ１４７Ａｓｎ、Ｈｉｓ１５１Ｔｙｒ、Ｔｈｒ１７８Ａｌａ、Ａｒｇ１９１Ｌｙｓ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｌｅｕ２００Ｍｅｔ、Ｔｈｒ２１３Ａｌａ、Ｖａｌ２１６Ａｌａ、Ｌｅｕ２２１Ａｒｇ、Ｓｅｒ２２９Ａｓｎ、Ｉｌｅ２３６Ｌｙｓ、Ｔｙｒ２４４Ｈｉｓ、Ｔｈｒ２５３Ａｌａ、Ａｒｇ２９０Ｇｌｎ、Ｌｙｓ２９３Ａｓｎ、Ｌｙｓ２９７ＧｌｕまたはＰｒｏ３０６Ｔｈｒのいずれかのアミノ酸置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲｍ６４に対しアルカリ安定性が向上しているといえる。

実施例４ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５の作製
実施例３で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＧｌｕ９５Ａｓｐを選択し、それらのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５を作製した。
（１）実施例３で得られたアルカリ安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体のうち、ＦｃＲｍ６４に対してさらにＶａｌ６３ＧｌｕとＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を培養し、発現ベクターを調製した。
（２）以下に示すＰＣＲを実施し、Ａｌａ６９Ｖａｌのアミノ酸置換をさらに導入した。
（２−１）鋳型として（１）で調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号１６（５’−ＡＴＴＧＧＧＴＴＧＡＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６５ｐ１と命名した。
（２−２）鋳型として（１）で調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号１７（５’−ＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＡＴＣＡＡＣＣＣＡＡＴ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６５ｐ２と命名した。
（２−３）ＰＣＲ産物ｍ６５ｐ１およびｍ６５ｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（２−４）精製したＰＣＲ産物ｍ６５ｐ１およびｍ６５ｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６５ｐ３と命名した。
（２−５）ＰＣＲ産物ｍ６５ｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５をコードするポリヌクレオチドを得た。
（３）ＦｃＲｍ６５をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（４）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６５を得た。
（５）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６５のうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６５により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号１８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号１９に、それぞれ示す。なお配列番号１８において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５のアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号１８において、ＦｃＲｍ６５のアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５のアミノ酸配列（配列番号１８）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例５ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６の作製
実施例３で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１ＬｅｕおよびＧｌｕ９５Ａｓｐを選択し、それらのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６を作製した。
（１）実施例４（１）で調製した発現ベクターを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＳｅｒ７１Ｌｅｕのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型として実施例４（１）で調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号２０（５’−ＡＡＣＣＡＴＴＧＧＧＴＴＡＡＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＡＧＧＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６６ｐ１と命名した。
（１−２）鋳型として実施例４（１）で調製した発現ベクターを、ＰＣＲプライマーとして配列番号２１（５’−ＡＣＣＴＧＴＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＡＡＣＣＣＡＡＴＧＧＴＴ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６６ｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ６６ｐ１およびｍ６６ｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ６６ｐ１およびｍ６６ｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６６ｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ６６ｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６をコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ６６をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６６を得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６６のうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６６により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号２２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号２３に、それぞれ示す。なお配列番号２２において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６のアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号２２において、ＦｃＲｍ６６のアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６のアミノ酸配列（配列番号２２）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１８）と比較して、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１ＬｅｕおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例６ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６７の作製
実施例３で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｓｅｒ８４ＴｈｒおよびＴｈｒ１９９Ａｌａを選択し、それらのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６５（実施例４）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６７を作製した。
（１）実施例４（４）で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６５を鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｓｅｒ８４ＴｈｒおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号２４（５’−ＡＣＡＧＣＴＴＴＧＧＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＴＴＧＴＣＣＣＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６７ｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２５（５’−ＴＧＧＧＡＣＡＡＧＴＡＧＡＴＡＴＣＣＣＣＡＡＡＧＣＴＧＴ−３’）および配列番号２６（５’−ＴＧＧＡＡＡＧＴＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＴＧＧＡＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６７ｐ２と命名した。
（１−３）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２７（５’−ＡＴＣＣＡＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡＣＴＴＴＣＣＡ−３’）および配列番号２８（５’−ＴＴＴＧＡＣＧＧＡＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＣＣＣＧＣＣＧＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６７ｐ３と命名した。
（１−４）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６５を、ＰＣＲプライマーとして配列番号２９（５’−ＴＣＧＧＣＧＧＧＡＧＣＣＴＴＧＧＴＣＴＣＣＧＴＣＡＡＡ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６７ｐ４と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ６７ｐ１、ｍ６７ｐ２、ｍ６７ｐ３およびｍ６７ｐ４を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−６）精製したＰＣＲ産物ｍ６７ｐ１、ｍ６７ｐ２、ｍ６７ｐ３およびｍ６７ｐ４を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６７ｐ５と命名した。
（１−７）ＰＣＲ産物ｍ６７ｐ５を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６７をコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ６７をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６７をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６７を得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６７のうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６６により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３０に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３１に、それぞれ示す。なお配列番号３０において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６７のアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号３０において、ＦｃＲｍ６７のアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６７のアミノ酸配列（配列番号３０）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５ＡｓｐおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例７ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８の作製
実施例３で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｓｅｒ８４ＴｈｒおよびＴｈｒ１９９Ａｌａを選択し、それらのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６６（実施例５）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８を作製した。
（１）実施例５（３）で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６６を鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｓｅｒ８４ＴｈｒおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６６を用いた他は、実施例６（１−１）と同様のＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物はｍ６８ｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６６を用いた他は、実施例６（１−２）と同様のＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物はｍ６８ｐ２と命名した。
（１−３）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６６を用いた他は、実施例６（１−３）と同様のＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物はｍ６８ｐ３と命名した。
（１−４）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６６を用いた他は、実施例６（１−４）と同様のＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物はｍ６８ｐ４と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ６８ｐ１、ｍ６８ｐ２、ｍ６８ｐ３およびｍ６８ｐ４を、実施例６（１−５）と同様な方法で精製した。
（１−６）精製したＰＣＲ産物ｍ６８ｐ１、ｍ６８ｐ２、ｍ６８ｐ３およびｍ６８ｐ４を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ６８ｐ５と命名した。
（１−７）ＰＣＲ産物ｍ６８ｐ５を鋳型とした他は、実施例６（１−７）と同様のＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６８を得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６８のうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６８により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３３に、それぞれ示す。なお配列番号３２において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号３２において、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号３２）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５ＡｓｐおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例８ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０の作製
実施例３で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｅｕ６６ＰｒｏおよびＨｉｓ１１９Ｇｌｎを選択し、それらのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８（実施例７）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０を作製した。
（１）実施例７（３）で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６８を鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｌｅｕ６６ＰｒｏおよびＨｉｓ１１９Ｇｌｎのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６８を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号３４（５’−ＣＣＣＣＡＧＡＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＴＴＣＧＣＡＧＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６８を、ＰＣＲプライマーとして配列番号３５（５’−ＴＣＴＧＣＧＡＡＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＧＧＧ−３’）および配列番号３６（５’−ＡＧＣＣＡＧＣＣＡＣＧＴＴＧＡＡＣＴＴＣＡＡＧＴＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｐ２と命名した。
（１−３）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ６８を、ＰＣＲプライマーとして配列番号３７（５’−ＴＡＣＴＴＧＡＡＧＴＴＣＡＡＣＧＴＧＧＣＴＧＧＣＴ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｐ３と命名した。
（１−４）ＰＣＲ産物ｍ７０ｐ１、ｍ７０ｐ２およびｍ７０ｐ３を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−６）精製したＰＣＲ産物ｍ７０ｐ１、ｍ７０ｐ２およびｍ７０ｐ３を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｐ４と命名した。
（１−７）ＰＣＲ産物ｍ７０ｐ４を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０をコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７０をコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０を得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０のうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０により発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号３８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号３９に、それぞれ示す。なお配列番号３８において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０のアミノ酸配列、３０８番目のグリシンから３１４番目のグリシンまでがシステインタグである。なお配列番号３８において、ＦｃＲｍ７０のアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０のアミノ酸配列（配列番号３８）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｈｉｓ１１９ＧｌｎおよびＴｈｒ１９９Ａｌａのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例９ Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
（１）下記（Ｉ）から（ＩＸ）に記載のＦｃ結合性タンパク質を発現可能な形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２ＹＴ液体培地に接種し、３７℃で一晩、好気的に振とう培養することで前培養を行なった。
（Ｉ）ＦｃＲｍ６０ｃ（配列番号２）（特開２０１１−２０６０４６号公報）
（ＩＩ）ＦｃＲｍ６１（配列番号４２）（特開２０１１−２０６０４６号公報）
（ＩＩＩ）ＦｃＲｍ６２（配列番号４３）（特開２０１１−２０６０４６号公報）
（ＩＶ）ＦｃＲｍ６４（配列番号１３）（実施例１）
（Ｖ）ＦｃＲｍ６５（配列番号１８）（実施例４）
（ＶＩ）ＦｃＲｍ６６（配列番号２２）（実施例５）
（ＶＩＩ）ＦｃＲｍ６７（配列番号３０）（実施例６）
（ＶＩＩＩ）ＦｃＲｍ６８（配列番号３２）（実施例７）
（ＩＸ）ＦｃＲｍ７０（配列番号３８）（実施例８）
（２）５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加した２０ｍＬの２ＹＴ液体培地に前培養液を２００μＬ接種し、３７℃で好気的に振とう培養を行なった。
（３）培養開始１．５時間後、培養温度を２０℃に変更して３０分間振とう培養後、終濃度０．０１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加し、引き続き２０℃で一晩、好気的に振とう培養した。
（４）培養終了後、遠心分離により集菌し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（タカラバイオ社製）を用いてタンパク質抽出液を調製した。
（５）（４）で調製したタンパク質抽出液中のＦｃ結合性タンパク質の濃度を、実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いて抗体結合活性を測定し、既知濃度のＦｃ結合性タンパク質における値と比較して測定した。
（６）Ｆｃ結合性タンパク質としての濃度が０．５μｇ／ｍＬとなるように、（４）で調製したタンパク質抽出液を純水で希釈した後、等量の４００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液を加え、３０℃で１８０分間アルカリ処理を行なった。処理後は１．２５Ｍの塩化ナトリウムを含んだ１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．４）をアルカリ処理液に対し４倍量添加することでｐＨを中性領域に戻した。なお対照（アルカリ処理を行なわない系）として、４００ｍＭの水酸化ナトリウム水溶液の代わりに１５０ｍＭの塩化ナトリウムを含んだ２０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．０）を用いて、前記アルカリ処理と同様の処理を行なった。
（７）アルカリ処理を行なったとき、およびアルカリ処理を行なわなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性を実施例３（４）に記載のＥＬＩＳＡ法を用いてそれぞれ測定し、アルカリ処理を行なったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性をアルカリ処理を行わなかったときのＦｃ結合性タンパク質の抗体結合活性で除することで、残存活性割合を算出した。

各Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリに対する安定性を比較した結果を表７に示す。今回作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６４、ＦｃＲｍ６５、ＦｃＲｍ６６、ＦｃＲｍ６７、ＦｃＲｍ６８およびＦｃＲｍ７０）は、特開２０１１−２０６０４６号公報に開示のＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ６０ｃ、ＦｃＲｍ６１およびＦｃＲｍ６２）と比較し、いずれもアルカリ安定性が向上していることがわかる。さらに今回作製したＦｃ結合性タンパク質のうち、ＦｃＲｍ６５、ＦｃＲｍ６６、ＦｃＲｍ６７、ＦｃＲｍ６８およびＦｃＲｍ７０は、いずれもＦｃＲｍ６４と比較し、アルカリ安定性が向上していることがわかる。ＦｃＲｍ６５、ＦｃＲｍ６６、ＦｃＲｍ６７、ＦｃＲｍ６８およびＦｃＲｍ７０は、いずれもＶａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換を有している。すなわち配列番号１３に記載のアミノ酸配列（ＦｃＲｍ６４）のうち、３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において、少なくともＶａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９ＶａｌおよびＧｌｕ９５Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質は、特にアルカリに対する安定性に優れていることがわかる。なお今回作製したＦｃ結合性タンパク質の中では、ＦｃＲｍ６６とＦｃＲｍ６８が最も高いアルカリ安定性を有していた。

実施例１０ ＦｃＲｍ６８のランダム変異体ライブラリー作製
（１）鋳型ＤＮＡとして実施例７（３）に記載の発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ６８を、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号４４（５’−ＣＣＧＧＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴＣＴＴＣＴＧＴＴＧＴＴＴＡＣＣＣＡＧＴＡＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８のランダム変異体ライブラリーを作製した。

実施例１１ アルカリ安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質のスクリーニング（その２）
（１）実施例１０で作製したＦｃＲｍ６８のランダム変異体ライブラリーを、実施例３（１）から（２）に記載と同様な方法で培養を行なった。
（２）培養後、遠心操作により得られる培養上清（当該上清には発現したＦｃ結合性タンパク質が含まれる）を純水で２倍希釈した後、実施例３（３）に記載の方法でアルカリ処理を行ない、実施例３（４）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
（３）（２）の測定を実施した約２７００株の形質転換体の中から、ＦｃＲｍ６８と比較しアルカリ安定性または発現量が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを得た。
（４）得られた発現ベクターのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、配列番号８または配列番号１２に記載の配列からなるシーケンスプライマーを用いて、実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析した。

配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８に対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表８に示す。配列番号３２に記載のアミノ酸配列のうち、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域（ＦｃＲｍ６８の領域）を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までの領域において、Ｇｌｎ３４Ａｒｇ（この表記は、配列番号１３の３４番目のグルタミンがアルギニンに置換されていることを表す、以下同様）、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ｌｅｕ６６Ｇｌｎ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇまたはＧｌｕ２７１Ａｓｐのいずれかの置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲｍ６８に対しアルカリ安定性が向上しているといえる。

スクリーニングで得られたＦｃＲｍ６８変異体のうち、ＦｃＲｍ６８のアミノ酸配列（配列番号３２）と比較して、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲｍ７０ｂと命名し、当該Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂと命名した。ＦｃＲｍ７０ｂのアミノ酸配列を配列番号４５に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号４６に、それぞれ示す。なお配列番号４５において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｂのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでのジペプチドがダイレクトシステインタグである（以下、Ｃｙｓ−Ｇｌｙのジペプチドタグをダイレクトシステインタグとする）。また配列番号４５において、ＦｃＲｍ７０ｂのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｂのアミノ酸配列（配列番号４５）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例１２ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃの作製
実施例１１で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒを選択し、そのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｂ（実施例１１）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃを作製した。
（１）実施例１１で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号４７（５’−ＴＴＧＣＣＡＣＡＣＴＣＧＣＡＧＡＣＡＧＣＡＣＧＧＧＣ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｃｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号４８（５’−ＧＣＣＣＧＴＧＣＴＧＴＣＴＧＣＧＡＧＴＧＴＧＧＣＡＡ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｃｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ７０ｃｐ１およびｍ７０ｃｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ７０ｃｐ１およびｍ７０ｃｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７０ｃｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ７０ｃｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７０ｃをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０ｃを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０ｃのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０ｃにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号４９に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５０に、それぞれ示す。なお配列番号４９において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また配列番号４９において、ＦｃＲｍ７０ｃのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃのアミノ酸配列（配列番号４９）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例１３ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａの作製
実施例１１で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏを選択し、そのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｂ（実施例１１）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａを作製した。
（１）実施例１１で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号５１（５’−ＴＴＡＡＴＣＣＴＡＣＣＣＣＡＧＡＣＧＧＧＴＧＣＧＧＴＴＣＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７１ａｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７０ｂを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５２（５’−ＡＧＡＡＣＣＧＣＡＣＣＣＧＴＣＴＧＧＧＧＴＡＧＧＡＴＴＡＡ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７１ａｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ７１ａｐ１およびｍ７１ａｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ７１ａｐ１およびｍ７１ａｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７１ａｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ７１ａｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７１ａをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ａを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ａのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ａにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５３に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５４に、それぞれ示す。なお配列番号５３において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また、配列番号５３において、ＦｃＲｍ７１ａのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａのアミノ酸配列（配列番号５３）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例１４ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａの作製
実施例１１で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓを選択し、そのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ａ（実施例１３）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａを作製した。
（１）実施例１３（３）で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ａを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ａを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号５５（５’−ＡＣＣＣＡＣＧＧＴＧＧＴＴＴＣＡＧＣＴＴＡＡＴＣＡＣＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ａｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ａを、ＰＣＲプライマーとして配列番号５６（５’−ＴＧＴＧＡＴＴＡＡＧＣＴＧＡＡＡＣＣＡＣＣＧＴＧＧＧＴ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ａｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ７２ａｐ１およびｍ７２ａｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ７２ａｐ１およびｍ７２ａｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ａｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ７２ａｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７２ａをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ａを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ａのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ａにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号５７に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号５８に、それぞれ示す。なお配列番号５７において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また、配列番号５７において、ＦｃＲｍ７２ａのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａのアミノ酸配列（配列番号５７）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例１５ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ａの作製
実施例１１で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ３４Ａｒｇを選択し、そのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ａ（実施例１４）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ａを作製した。
（１）実施例１４（３）で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ａを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｇｌｎ３４Ａｒｇのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７２ａを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号５９（５’−ＡＴＡＴＣＴＡＣＴＣＧＴＣＣＣＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＣＣＧＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７３ａｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７２ａを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６０（５’−ＴＣＧＧＣＴＣＴＣＧＣＣＡＴＧＧＧＡＣＧＡＧＴＡＧＡＴＡＴ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７３ａｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ７３ａｐ１およびｍ７３ａｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ７３ａｐ１およびｍ７３ａｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７３ａｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ７３ａｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ａをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７３ａをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ａをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７３ａを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７３ａのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７３ａにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６１に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６２に、それぞれ示す。なお配列番号６１において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ａのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また、配列番号６１において、ＦｃＲｍ７３ａのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ａのアミノ酸配列（配列番号６１）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｇｌｎ３４Ａｒｇ、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｇｌｎ４５Ｌｙｓ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ｌｅｕ６６Ｐｒｏ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例１６ Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
下記（Ｉ）、（ＶＩＩＩ）および（Ｘ）から（ＸＩＶ）に記載のＦｃ結合性タンパク質をそれぞれ発現可能な形質転換体を用いて、実施例９に記載の方法と同様の方法で、Ｆｃ結合性タンパク質の調製、アルカリ処理および残存活性割合の算出を行なうことにより、各Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性の評価を行なった。
（Ｉ）ＦｃＲｍ６４（配列番号１３）（実施例１）
（ＶＩＩＩ）ＦｃＲｍ６８（配列番号３２）（実施例７）
（Ｘ）ＦｃＲｍ７０ｂ（配列番号４５）（実施例１１）
（ＸＩ）ＦｃＲｍ７０ｃ（配列番号４９）（実施例１２）
（ＸＩＩ）ＦｃＲｍ７１ａ（配列番号５３）（実施例１３）
（ＸＩＩＩ）ＦｃＲｍ７２ａ（配列番号５７）（実施例１４）
（ＸＩＶ）ＦｃＲｍ７３ａ（配列番号６１）（実施例１５）
各Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリに対する安定性を比較した結果を表９に示す。実施例１１から１５で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ７０ｂ、ＦｃＲｍ７０ｃ、ＦｃＲｍ７１ａ、ＦｃＲｍ７２ａおよびＦｃＲｍ７３ａ）は、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４（実施例１）と比較し、いずれもアルカリ安定性が向上していることがわかる。さらに実施例１１から１５で作製したＦｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８（実施例７）と比較しても、いずれもアルカリ安定性が向上していることがわかる。

実施例１７ ＦｃＲｍ７０ｃのランダム変異体ライブラリー作製
（１）鋳型ＤＮＡとして実施例１２（３）に記載の発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７０ｃを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号６３（５’−ＣＣＡＡＧＣＴＴＡＧＣＣＧＣＡＧＴＣＣＧＧＧＧＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをそれぞれ用いた。エラープローンＰＣＲは、表５に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を９５℃で２分間熱処理し、９５℃で３０秒間の第１ステップ、６０℃で３０秒間の第２ステップ、７２℃で９０秒間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返し、最後に７２℃で７分間熱処理することで実施した。
（２）得られたＰＣＲ産物を精製後、制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化し、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いてエレクトロポレーション法により大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを含むＬＢ寒天培地でコロニー形成させることで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃのランダム変異体ライブラリーを作製した。

実施例１８ アルカリ安定性が向上したＦｃ結合性タンパク質のスクリーニング（その３）
（１）実施例１７で作製したＦｃＲｍ７０ｃのランダム変異体ライブラリーを、実施例３（１）から（２）に記載と同様の方法で培養を行なった。
（２）培養後、遠心操作により得られる培養上清（当該上清には発現したＦｃ結合性タンパク質が含まれる）を純水で４倍希釈した後、実施例３（３）に記載の方法でアルカリ処理を行ない、実施例３（４）に記載の方法でＦｃ結合性タンパク質の残存活性割合を算出した。
（３）（２）の測定を実施した約２７００株の形質転換体の中から、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃと比較しアルカリ安定性または発現量が向上したＦｃ結合性タンパク質を発現する形質転換体を選択した。前記選択した形質転換体を培養し、ＱＩＡｐｒｅｐ Ｓｐｉｎ Ｍｉｎｉｐｒｅｐ Ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて発現ベクターを得た。
（４）得られた発現ベクターのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列を、配列番号８または配列番号１２に記載の配列からなるシーケンスプライマーを用いて、実施例１（５）に記載の方法によりヌクレオチド配列を解析した。

配列解析の結果、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７０ｃに対するアミノ酸置換位置およびアルカリ処理後の残存活性（％）をまとめたものを表１０に示す。配列番号４９に記載のアミノ酸配列のうち、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域（ＦｃＲｍ７０ｃの領域）を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までの領域において、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏ（この表記は、配列番号１３の８２番目のグルタミンがプロリンに置換されていることを表す、以下同様）、Ａｓｎ１７７ＡｓｐまたはＴｈｒ２５３Ｓｅｒのいずれかの置換が少なくとも１つ生じているＦｃ結合性タンパク質は、ＦｃＲｍ７０ｃに対しアルカリ安定性が向上しているといえる。

スクリーニングから得られた、ＦｃＲｍ７０ｃ変異体のうち、ＦｃＲｍ７０ｃのアミノ酸配列（配列番号４９）と比較して、Ａｓｎ１７７Ａｓｐのアミノ酸置換が生じたＦｃ結合性タンパク質をＦｃＲｍ７１ｃと命名し、当該Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターをｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃと命名した。ＦｃＲｍ７１ｃのアミノ酸配列を配列番号６４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６５に、それぞれ示す。なお配列番号６４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ｃのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また配列番号６４において、ＦｃＲｍ７１ｃのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ｃのアミノ酸配列（配列番号６４）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例１９ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃの作製
実施例１８で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏを選択し、そのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ｃ（実施例１８）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃを作製した。
（１）実施例１８で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号６６（５’−ＴＣＧＧＧＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＧＧＡＴＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＴ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ｃｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６７（５’−ＡＡＴＧＡＣＡＣＣＧＣＧＡＴＣＣＣＧＧＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＡ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ｃｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ７２ｃｐ１およびｍ７２ｃｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ７２ｃｐ１およびｍ７２ｃｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ｃｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ７２ｃｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７２ｃをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ｃを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ｃのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ｃにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号６８に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号６９に、それぞれ示す。なお配列番号６８において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また、配列番号６８において、ＦｃＲｍ７２ｃのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｃのアミノ酸配列（配列番号６８）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２ＡｒｇおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例２０ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｄの作製
実施例１８で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｔｈｒ２５３Ｓｅｒを選択し、そのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ｃ（実施例１８）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｄを作製した。
（１）実施例１８で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｔｈｒ２５３Ｓｅｒのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを、ＰＣＲプライマーとして配列番号８および配列番号７０（５’−ＴＣＣＧＣＧＣＡＧＧＧＡＴＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＡＡＡ−３’）に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ｄｐ１と命名した。
（１−２）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを、ＰＣＲプライマーとして配列番号７１（５’−ＴＴＴＡＡＧＧＧＣＧＧＣＧＡＡＴＣＣＣＴＧＣＧＣＧＧＡ−３’）および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ｄｐ２と命名した。
（１−３）ＰＣＲ産物ｍ７２ｄｐ１およびｍ７２ｄｐ２を、それぞれアガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−４）精製したＰＣＲ産物ｍ７２ｄｐ１およびｍ７２ｄｐ２を混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７２ｄｐ３と命名した。
（１−５）ＰＣＲ産物ｍ７２ｄｐ３を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｄをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７２ｄをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｄをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ｄを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ｄのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７２ｄにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７２に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７３に、それぞれ示す。なお配列番号７２において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｄのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また、配列番号７２において、ＦｃＲｍ７２ｄのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７２ｄのアミノ酸配列（配列番号７２）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２５３ＳｅｒおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例２１ Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ｂの作製
実施例１８で判明した、アルカリ安定性の向上に関与するアミノ酸置換の中から、Ｇｌｎ８２ＰｒｏおよびＴｈｒ２５３Ｓｅｒを選択し、それらのアミノ酸置換をＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７１ｃ（実施例１８）に対して行なうことで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ｂを作製した。
（１）実施例１８で調製した発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを鋳型として以下に示すＰＣＲを実施することで、Ｇｌｎ８２ＰｒｏおよびＴｈｒ２５３Ｓｅｒのアミノ酸置換をさらに導入した。
（１−１）鋳型としてｐＥＴＦｃＲｍ７１ｃを、ＰＣＲプライマーとして配列番号６７および配列番号７０に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドを、それぞれ用いてＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７３ｂｐ１と命名した。
（１−２）ＰＣＲ産物ｍ７３ｂｐ１を、アガロースゲルを用いて電気泳動後、目的のＰＣＲ産物を含むゲル部分を切り出し、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｇｅｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（キアゲン社製）を用いて抽出することで精製した。
（１−３）精製したＰＣＲ産物ｍ７３ｂｐ１を、実施例１９（１−１）で調製したＰＣＲ産物ｍ７２ｃｐ１および実施例２０（１−２）で調製したＰＣＲ産物ｍ７２ｄｐ２とともに混合後、表４に示す組成の反応液を調製し、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５５℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を５サイクル繰り返すことでＰＣＲを実施した。得られたＰＣＲ産物をｍ７３ｂｐ２と命名した。
（１−４）ＰＣＲ産物ｍ７３ｂｐ２を鋳型とし、配列番号８および配列番号１２に記載の配列からなるオリゴヌクレオチドをＰＣＲプライマーとして、ＰＣＲを実施した。ＰＣＲは、表３に示す組成の反応液を調製後、当該反応液を、９８℃で１０秒間の第１ステップ、５０℃で５秒間の第２ステップ、７２℃で１分間の第３ステップを１サイクルとする反応を３０サイクル繰り返すことで実施した。得られたＰＣＲ産物を精製することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ｂをコードするポリヌクレオチドを得た。
（２）ＦｃＲｍ７３ｂをコードするポリヌクレオチドを制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化後、あらかじめ制限酵素ＮｃｏＩとＨｉｎｄＩＩＩで消化した発現ベクターｐＥＴＭａｌＥ（特開２０１１−２０６０４６号公報）にライゲーションし、これを用いて大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換した。
（３）得られた形質転換体を５０μｇ／ｍＬのカナマイシンを添加したＬＢ培地で培養し、発現ベクターを抽出することで、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ｂをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７３ｂを得た。
（４）発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７３ｂのうち、Ｆｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド領域の配列の解析を、実施例１（５）と同様の方法により行なった。

発現ベクターｐＥＴＦｃＲｍ７３ｂにより発現されるポリペプチドのアミノ酸配列を配列番号７４に、当該ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列を配列番号７５に、それぞれ示す。なお配列番号７４において、１番目のメチオニンから２６番目のアラニンまでがＭａｌＥシグナルペプチド、２７番目のリジンから３３番目のグリシンまでがリンカーペプチド、３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までがＦｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ｂのアミノ酸配列、３０８番目のシステインから３０９番目のグリシンまでがダイレクトシステインタグである。また、配列番号７４において、ＦｃＲｍ７３ｂのアミノ酸配列（３４番目のグルタミンから３０７番目のアスパラギン酸までの領域）は、ヒトＦｃ受容体ＦｃγＲＩのアミノ酸配列（配列番号１）では１６番目のグルタミンから２８９番目のバリンまでの領域に相当する。Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ７３ｂのアミノ酸配列（配列番号７４）は、ＦｃＲｍ６４のアミノ酸配列（配列番号１３）と比較して、Ｔｈｒ３７Ｉｌｅ、Ｖａｌ６３Ｇｌｕ、Ａｌａ６９Ｖａｌ、Ｓｅｒ７１Ｌｅｕ、Ｇｌｎ８２Ｐｒｏ、Ｓｅｒ８４Ｔｈｒ、Ｇｌｕ９５Ａｓｐ、Ａｓｎ１７７Ａｓｐ、Ｔｈｒ１９９Ａｌａ、Ｔｈｒ２１３Ｓｅｒ、Ｇｌｎ２４２Ａｒｇ、Ｔｈｒ２５３ＳｅｒおよびＧｌｕ２７１Ａｓｐのアミノ酸置換がさらに生じている。

実施例２２ Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性評価
下記（Ｉ）、（ＶＩＩＩ）、（ＸＩ）および（ＸＶ）から（ＸＶＩＩ）に記載のＦｃ結合性タンパク質をそれぞれ発現可能な形質転換体を用いて、実施例９に記載の方法と同様の方法で、Ｆｃ結合性タンパク質の調製、アルカリ処理および残存活性割合の算出を行なうことにより、各Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリ安定性の評価を行なった。
（Ｉ）ＦｃＲｍ６４（配列番号１３）（実施例１）
（ＶＩＩＩ）ＦｃＲｍ６８（配列番号３２）（実施例７）
（ＸＩ）ＦｃＲｍ７０ｃ（配列番号４９）（実施例１２）
（ＸＶ）ＦｃＲｍ７２ｃ（配列番号６８）（実施例１９）
（ＸＶＩ）ＦｃＲｍ７２ｄ（配列番号７２）（実施例２０）
（ＸＶＩＩ）ＦｃＲｍ７３ｂ（配列番号７４）（実施例２１）
各Ｆｃ結合性タンパク質のアルカリに対する安定性を比較した結果を表１１に示す。実施例１９から２１で作製したＦｃ結合性タンパク質（ＦｃＲｍ７２ｃ、ＦｃＲｍ７２ｄおよびＦｃＲｍ７３ｂ）は、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６４（実施例１）と比較し、いずれもアルカリ安定性が向上していることがわかる。さらに実施例１９から２１で作製したＦｃ結合性タンパク質は、Ｆｃ結合性タンパク質ＦｃＲｍ６８（実施例７）やＦｃＲｍ７０ｃ（実施例１２）と比較しても、いずれもアルカリ安定性が向上していることがわかる。

本発明のＦｃ結合性タンパク質はアルカリ安定性に優れており、ＩｇＧやＦｃ融合タンパク質の精製のためのアフィニティークロマトグラフィー用リガンドとして有用である。

Claims (7)

1. 配列番号１３に記載のアミノ酸配列のうち３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含み、かつ当該３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列において少なくとも以下の（Ａ）から（Ｃ）に記載のアミノ酸置換が生じており、
   （Ａ）配列番号１３の６３番目のバリンがグルタミン酸に置換
   （Ｂ）配列番号１３の６９番目のアラニンがバリンに置換
   （Ｃ）配列番号１３の９５番目のグルタミン酸がアスパラギン酸に置換
   かつ、配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２および配列番号７４のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列における３４番目から３０７番目までのアミノ酸配列を含む、Ｆｃ結合性タンパク質。
2. 配列番号１８、配列番号２２、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３８、配列番号４５、配列番号４９、配列番号５３、配列番号５７、配列番号６１、配列番号６４、配列番号６８、配列番号７２および配列番号７４のうちいずれか１つに記載のアミノ酸配列からなる、請求項１に記載のＦｃ結合性タンパク質。
3. 請求項１または２に記載のＦｃ結合性タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
4. 請求項３に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
5. 請求項４に記載の発現ベクターで宿主を形質転換して得られる形質転換体。
6. 宿主が大腸菌である、請求項５に記載の形質転換体。
7. 請求項５または６に記載の形質転換体を培養することによりＦｃ結合性タンパク質を生産させ、得られた培養物から生産されたＦｃ結合性タンパク質を回収する、Ｆｃ結合性タンパク質の製造方法。

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