CN102818768A - 一种多功能生物医学显微镜 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种包含激光扫描共聚焦成像、荧光成像和光学相干层析成像的多功能生物医学显微镜，它由光源组件、二维扫描组件、变倍物镜组件、共焦信号探测组件、干涉臂组件和干涉信号探测组件构成。该发明提出的一种多功能生物医学显微镜，通过引入可见光光源照明样品得到样品的共聚焦图像，通过引入荧光光源照明样品得到样品的荧光图像，通过引入宽带低相干近红外激光光源照明样品得到样品的光学相干层析图像，实现了一种多功能生物医学显微镜，以获取透明或非透明样品微观尺度上的三维组织结构图像。
Description
技术领域
本发明涉及一种多功能生物医学显微镜，特别是一种用于生物医学组织成像，且能获得共聚焦图像、荧光图像和光学相干层析图像的多功能生物医学显微镜。
背景技术
共聚焦显微技术(Confocal Microscopy)的概念首先由美国的Minsky在20世纪50年代末提出来(Marvin Minsky.“Memo iron inventing confocal scanning microscope”，Scanning，1988，128-138)，随后P.Davidovits，A.F.Slomba和C.J.R.Sheppard等多位学者对共焦成像进行了更细致的研究。激光共聚焦显微系统，特别是结合荧光探针探测技术的共聚焦荧光显微系统，由于探测针孔和较短波长激光的采用使得系统具有较高的横向分辨率(约100nm)和纵向分辨率(约50nm)，广泛用于生物医学组织的检测，可以得到其内部的结构图像，还可以对活体细胞进行观察，获取活细胞内的信息，并对获得的信息进行定量分析。但是，一方面，探测针孔排除杂散光的同时也限制了信号光的探测，另一方面，短波长激光的穿透特性不如长波长，致使共聚焦显微镜的纵向测量范围偏低，仅200-500um。
David Huang等于1991年提出光学相干层析技术(Optical Coherence Tomography，简称OCT)，并采用该技术成功地对人眼视网膜的显微结构和冠状动脉成像(D.Huang，E.A.Swanson，et al.“Optical coherence tomography”，Science，1991，254：1178-1181)。其后David Huang等在OCT技术的发展上做了较多研究(Huang D et al.Laser Surg Med 1991，11：5)。光学相干层析技术由于采用了干涉探测技术，大大提高了系统的信噪比水平，其探测深度可达2-3mm，比共聚焦显微镜大一个数量级。但是，低相干光源的有限带宽限制了其纵向分辨率，同时长波长激光的采用也降低了系统的横向分辨率。
综上所述可知，现有的激光共聚焦显微技术的可探测深度较小，而光学相干层析成像技术又存在分辨率不高的缺点，二者都亟待改进。
对比国际国内在共聚焦显微成像和光学相干层析成像领域的技术成果，本发明在此基础上，提出一种新的激光共聚焦显微系统和基于光学相干层析成像的多功能生物医学显微镜装置，引入多个光源组件照明待测样品，实现对待测样品的激光共聚焦成像，荧光成像和光学相干层析成像。
发明内容
本发明的技术解决问题：
1)克服单一激光共聚焦显微镜层析深度较浅的缺点；2)克服单一光学 相干层析系统横向和轴向分辨率较低的缺点。
本发明的技术解决方案：
一种多功能生物医学显微镜，由光源组件、二维扫描组件、变倍物镜组件、共焦信号探测组件、干涉臂组件和干涉信号探测组件构成。利用光源组件之可见光作为照明光源，通过二维扫描组件和变倍物镜组件后照明待观测样品表面，从样品表面反射回来的信号光被共焦信号探测组件接收，获取样品的面扫描图像，通过对样品的轴向移动可获得样品的各深度的层切图像，各深度的层切图像经重建后得到样品的三维图像；从光源组件之荧光光源发出的光信号照明待观测样品，可以得到样品各深度的层切图像和三维荧光图像；从光源组件之宽带近红外光源发出的信号光照明待观测样品，由干涉信号探测组件接收后可以得到样品的光学相干层析图像。
本发明的原理：本发明的主要原理包括共聚焦光学成像理论、荧光成像技术和光学相干层析成像技术。
本发明与现有技术相比有如下优点：本发明通过联合激光共聚焦成像技术和光学相干层析技术，采用同一装置实现对待测样品的激光共聚焦成像、荧光共聚焦成像和光学相干层析成像，可克服单一激光共聚焦显微镜层析深度较浅和单一光学相干层析系统横向和轴向分辨率较低的缺点。
附图说明
图1为多功能生物医学显微镜的结构示意图。
图2为本发明所述系统的元器件明细表。
具体实施方式
根据说明书附图1，对如何具体实施本发明提出的生物医学显微镜的功能，详细介绍如下：
1、由光源组件之可见光光源(1)所产生的照明光束通过多路光纤耦合器(4)的两路输出端中的一路进入光纤耦合镜头(5)，并依次经过反射镜(6)反射和分光镜(7)分光后进入二维扫描组件(8，9)。从二维扫描组件(8，9)出射的照明激光束再依次经过反射镜(10)反射、变倍物镜组件(11-13)聚焦后照明待测样品(14)。
2、光源组件之可见光光源(1)通常情况下为半导体激光器，用于产生可见光波段的激光束，典型中心波长在405nm左右，该波段下在样品上可以形成更小的光斑从而获得更高的光学系统分辨率。
3、多路光纤耦合器(4)包含多个输入端和两个输出端，它将多路输入的激光按照一定的能量比例分配到耦合器的两个输出端输出。同时，当回波信号光自其两输出端的任意一端输入时，耦合器的各输入端也将反向输出一定能量比例分配的回波激光。
4、光纤耦合镜头(5)可以是一个消色差或者消球差的双胶合透镜，也可以是一个消球差的非球面透镜，它对光纤耦合器(4)输出端出射的激光进行准直。采用不同焦距长度的耦合镜头(4)可以得到光束直径不同的准直激光束。
5、分光镜(7)可以是平板型、立方型或薄膜型的分光镜，它通过玻璃表面的光学薄膜实现分光功能，将45度角入射的光束按照一定的透射反射功率比进行分光。具体实施中，分光镜(7)也可以是固定在转轮上的、包含二向色分光镜一组分光镜。二向色分光镜具有根据入射光束波长不同决定光束反射或透射的特性。据此特性，通过转轮选择需要的二向色分光镜，使荧光激发光在二向色分光镜处反射实现对样品的照明，使回波荧光在二向色分光镜处透射实现对荧光的探测。
6、二维扫描组件(8，9)包括两个相互独立且正交的光学扫描振镜。照明光束经过横向扫描振镜(8)的扫描后，在待测样品表面(14)形成一条聚焦激光扫描线，即实现对待测样品(14)的线状照明，再经过纵向扫描振镜(9)扫描，在待测样品表面(14)形成一个聚焦激光扫描面，即实现对待测样品(14)的面照明。
7、变倍物镜组件(11-13)包括透镜1(11)、透镜2(12)和变倍物镜(13)。透镜1(11)典型情况下是一个平场远心扫描透镜，它将平行光束会聚，在二维扫描组件(8，9)的扫描作用下，在透镜1(11)的焦平面获得一个面的聚焦激光。透镜3(13)为远场色差校正物镜，它具有较高的数值孔径和放大倍数，一方面可以在样品上获得尽可能小的光斑，另一方面又尽可能多地收集样品产生的反射光。透镜2(12)为转接透镜，它将透镜1(11)会聚后的光束再准直，从而匹配到远场色差校正的变倍物镜(13)。变倍物镜(13)也可以是一组不同数值孔径和放大倍数的透镜组，具体实施本专利时，通过旋转变倍物镜组可以选择需要的变倍物镜(13)，以获得不同的放大倍率和成像视场。
8、变倍物镜组件(11-13)焦平面上反射和散射产生的信号光沿照明光路反向返回并经分光镜(7)透射分光后，由共焦信号探测组件(15-17)接收。通过二维扫描组件(8，9)的横向和纵向扫描获得待测样品(14)在变倍物镜组件(11-13)焦平面的层切图像。再结合待测样品(14)相对于变倍物镜组件(11-13)的轴向运动得到待测样品(14)不同深度的层切图像，经计算机三维重构后可获得待测样品(14)的共聚焦三维层切图像。
9、共焦信号探测组件(15-17)包括聚光透镜(15)、针孔(16)和点探测器(17)。其中聚光透镜(15)将回波光束聚焦，而位于聚光透镜(15)的焦平面上的针孔(16)用于排除待测样品上非变倍物镜组件(11-13)焦点处的横向和轴向杂光的干扰，构成共焦成像系统，点探测器(17)将光信号转换为电压信号以供计算机采集和处理，以获得待测样品处激光聚焦点的反射和散射特性。
10、聚光透镜(15)是一个双胶合或非球面透镜，它对分光镜(7)透射的回波信号光束进行聚焦。针孔(16)的大小约为激光在样品处形成弥散光斑的大小，此时系统可以获得较高的信噪比水平。而点探测器(17)通常是一个带有低噪声放大器的光电倍增管(PMT)或雪崩光电二极管(APD)，以低噪声引入条件下实现对回波信号的探测和放大。
11、由光源组件之荧光光源(2)所产生的荧光激发激光通过多路光纤耦合器(4)两路输出端中的一路进入光纤耦合镜头(5)，并经反射镜(6)、分光镜(7)反射后进入二维扫描组件(8，9)。从二维扫描组件(8，9)出射的照明激光束依次经过反射镜(10)反射、变倍物镜组件(11-13)聚焦后照明待测样品(14)。
12、荧光激发激光经过横向扫描振镜(8)的扫描后实现对待测样品(14)的线状照明，再经过纵向扫描振镜(9)的扫描，实现对待测样品(14)的面照明。
13、光源组件之荧光光源(2)通常包含数个不同波长的激光器，它们的类型可以是半导体激光器、固体激光器、气体激光器等，它们输出的典型波长有405nm、488nm等。通过外部电路控制激光器可以选择不同的波长或者波长组合实现对待测样品荧光激发的激光照明。
14、变倍物镜组件(11-13)焦平面上的激发光与样品中的荧光探针作用产生荧光(或者样品中没有荧光探针，但在适当波长的激光激发下，也有荧光产生，即自发荧光)，沿照明光路反向返回并经分光镜(7)透射分光后，由共焦信号探测组件(15-17)接收。通过二维扫描组件(8，9)的横向和纵向扫描获得待测样品(14)在变倍物镜组件(11-13)焦平面的层切图像。再结合待测样品(14)的轴向运动得到待测样品(14)不同深度的层切图像，经三维重构后可获得待测样品(14)的三维荧光图像。
15、由光源组件之宽带低相干近红外激光光源(3)所产生的宽带低相干激光通过多路光纤耦合器(4)两路输出中的一路宽带低相干激光作为参考光束进入干涉臂组件(22-25)，经过光纤耦合镜头(22)、反射镜系统(23)和色散匹配液体(24)，后由反射镜(25)反射，并沿原光路返回多路光纤耦合器(4)。
16、光纤耦合透镜(22)与光纤耦合镜头(5)类似，可以是一个消色差或者消球差的双胶合透镜，也可以是一个消球差的非球面透镜，它对光纤耦合器(4)输出端出射的激光进行准直。采用不同焦距长度的耦合镜头(4)可以得到光束直径不同的准直激光束。
17、反射镜系统(23)由按照如图所示位置放置的四块反射镜组成，其中上面两面反射镜与下面两面反射镜的距离可以调节，从而可以改变干涉臂组件(22-25)的光程。色散匹配液(24)为一种化学药品，主要用来对参考臂的光束进行色散，以期匹配从样品臂返回信号光的色散特征。
18、多路光纤耦合器(4)两路输出端中的另一路宽带低相干激光作为照明光束经光纤耦合镜头(5)准直，并经反射镜(6)、分光镜(7)反射后进入二维扫描组件(8，9)。从二维扫描组件(8，9)出射的照明激光束依次经过反射镜(10)反射、变倍物镜组件(11-13)聚焦后实现对待测样品(14)的照明。
19、变倍物镜组件(11-13)焦平面上反射和散射产生的信号光沿照明光路反向返回多路光纤耦合器(4)，与干涉臂组件(22-25)返回的宽带低相 干参考激光干涉叠加后进入干涉信号探测组件(18-21)。参考臂组件(22-25)通过调整反射镜系统(23)的纵向间隔以匹配从参考臂反射回信号光与从样品比返回的信号光之间的光程。色散匹配液(24)对参考臂的光束进行色散以匹配从参考臂反射回来的信号光与从样品臂返回的信号光之间的色散特性。
20、干涉信号探测组件(18-21)包括耦合透镜(18)、衍射光栅(19)、聚焦透镜(20)和线阵探测器(21)。耦合透镜(18)对干涉臂组件(22-25)返回的参考激光和待测样品上返回的回波信号光进行准直，衍射光栅(19)对光信号根据不同的波长在不同的方向上色散，色散后的光束再经过聚光透镜(20)聚焦后被线阵CCD(21)接收。基于光源组件之宽带低相干近红外激光光源(3)所产生激光的低相干特性，将光源组件对线阵CCD(21)接收到的序列光信号进行频谱分析(即傅里叶变换)，得到待测样品(14)内不同深度层的各个波段的反射特性。结合二维扫描组件(8，9)的二维扫描，完成对待测样品(14)三维图像提取。
21、根据具体实施步骤1-10，本发明所述的基于光学相干层析和激光共聚焦成像的多功能生物医学显微镜，可以在探测器终端得到待测样品的共焦三维图像；根据具体实施步骤11-14，本发明所述的基于光学相干层析和激光共聚焦成像的多功能生物医学显微镜，可以在探测器终端得到待测样品的荧光共焦三维图像；根据具体实施步骤15-20，本发明所述的基于光学相干层析和激光共聚焦成像的多功能生物医学显微镜，可以在探测器终端得到待测样品的光学相干层析图像。
经过上述过程，即可对待测样品(14)实现高分辨率的三维共焦图像、三维荧光图像和光学相干层析图像的提取功能。
需要说明的是，尽管本发明的较佳实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
Claims (5)
1.一种包含激光扫描共聚焦成像、荧光成像和光学相干层析成像的多功能生物医学显微镜，由光源组件、二维扫描组件、变倍物镜组件、共焦信号探测组件、干涉臂组件和干涉信号探测组件构成。该发明提出的一种多功能生物医学显微镜，利用光源组件之可见光作为照明光源，通过二维扫描组件和变倍物镜组件后照明待观测样品表面，从样品表面反射回来的信号光由共焦信号探测组件接收，获取样品的面扫描图像，通过对样品的轴向移动可获得样品各深度的层切图像，各深度的层切图像经重建后得到样品的三维共聚焦图像；从光源组件之荧光光源发出的光信号照明待观测样品，得到样品各深度的层切图像和三维荧光图像；从光源组件之宽带低相干近红外光源发出的信号光照明待测样品，由干涉信号探测组件接收后可以得到样品的光学相干层析图像，该发明通过引入可见光光源照明样品得到样品的共聚焦图像，通过引入荧光光源照明样品得到样品的荧光图像，通过引入宽带低相干激光光源照明样品得到样品的光学相干层析图像，实现了一种功能生物医学显微镜，获取透明或非透明样品微观尺度上的三维组织结构图像。
2.根据权利要求1所述多功能生物医学显微镜，其特征在于：所述光源组件包含可见光光源、荧光光源和宽带低相干近红外光源，可见光光源作为信标光源照明样品并获取样品的共聚焦图像，荧光激光光源照明样品，获取样品荧光图像，近红外宽带激光光源照明样品表面，利用干涉信号探测组件获取样品光学相干层析图像。
3.根据权利要求1所述多功能生物医学显微镜，其特征在于：所述激光参考臂组件包含耦合透镜、反射镜、色散匹配液体和参考光反射镜，所述色散匹配液为一种化学药品，主要用来对参考臂的光束进行色散，以期匹配从样品臂返回信号光的色散特征，所述参考臂组件通过调整参考反射镜的位置来改变从参考臂反射回信号光的光程差。
4.根据权利要求1所述多功能生物医学显微镜，其特征在于：所述二维扫描组件包含横向振镜和纵向振镜，横向振镜与纵向振镜的扫描平面互相正交，横向振镜高速扫描，其典型扫描频率在8kHz，纵向振镜低速扫描，其典型扫描频率为20Hz，通过两面振镜的同步扫描，完成对待测样品的面扫描。
5.根据权利要求1所述多功能生物医学显微镜，其特征在于：所述变倍物镜组件，包含透镜1实现信标光扫描，包含透镜2实现信标光耦合，包含变倍物镜实现对待测样品的聚光观测，所述变倍物镜为高倍短焦物镜，其典型焦距为10mm。
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Addressee: Suzhou Microclear Medical Instruments Co., Ltd. Document name: Decision of Rejection |
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Application publication date: 20121212 |