CN108414442A - 适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统。本发明为光学电动显微镜安装了共聚焦扫描单元并引入了760‑900nm的近红外激光作为激发光源（如：793nm半导体激光器），激发生物标本中的荧光探针得到近红外二区的荧光信号，然后该荧光信号由光纤引出，并由对近红外二区（1000‑1700nm）光响应灵敏的光电倍增管（PMT）接收，实现对标本的探测、扫描和成像。本发明光路简单，可灵活装卸，便于改装，用途多样，相较于商用LSCM系统，其使用和维护成本更低。

Description

适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统

技术领域

本发明属于应用光学的显微生物成像领域，是在普通商用电动显微镜的基础上，添加共聚焦扫描单元，并以波长位于760-900nm的半导体激光器作为光源，搭建的一台适用于近红外二区荧光活体成像的激光扫描共聚焦显微系统。

背景技术

激光扫描共聚焦显微镜（Laser scanning confocal microscope简称LSCM）是光学显微镜、激光光源、扫描单元、光电探测器、数据采集单元和计算机单元相结合的新型高精度显微成像系统。它在研究和分析活细胞结构，分子、离子的实时动态变化过程，组织和细胞的光学连续切片和三维结构重建等方面的作用，是传统的光学显微镜所望尘莫及的。

LSCM采用单色激光作为光源,并附设小孔光阑——针孔(pinhole)，针孔与物面共轭，于是在物面上构造了聚焦于单个像素点的点光源，与光学显微镜的场光源相比，共聚焦显微镜的点光源具有光源方向性强、发散小、亮度高、高度的空间和时间相干性以及可平面偏振激发等独特的优点。LSCM除了在照明光源前有一个针孔(pinhole)外，在检测器前方也有一个针孔。光源针孔、物面上的某一像素点和检测针孔，三者相对于整个显微镜系统是两两共轭的，也就是物面上点光源激发出的光信号通过一系列的透镜最终可同时聚焦于光源针孔和检测针孔，也就是所谓的“共聚焦”。这样只有物面上点光源处激发出的光才可以通过探测器前面的针孔，而点光源空间以外激发出的光（被视为杂散光）都被挡在探测针孔以外而不能被探测器接收，从而实现了针对物面上某一特定的像素点（也就是点光源所聚焦的位置）的探测。振镜单元可以使激光按等时间间隔向X,Y两个方向偏转特定的角度，从而实现对样品的逐点扫描，其实质就是不断改变物面上点光源的位置，依次点亮不同的像素点，所以在不同时刻，通过检测针孔的光信号来自物面上不同的像素点，这些光信号由检测针孔后的光电探测器接收后，转变为电信号传输至计算机，成像软件根据不同时刻接收到的电信号区分不同像素点的光强，最终在屏幕上呈现为清晰的整幅物平面的二维图像。

此外，在轴向（垂直于物平面的方向），点光源可通过垂直移动物镜或载物台的位置聚焦于样品的不同深度。综上，点光源可通过对样品进行左右、上下的扫描来获得厚标本(可达400μm)不同层面的图像，亦可对细胞、组织厚片或活体样本进行类似CT断层扫描的无损伤性连续光学切片(optical sectioning)。连续光学切片经计算机三维重建的处理，能够从任意角度观察标本的三维剖面或整体结构。由此可见，扫描和检测装置是LSCM的重要组成部分，台阶扫描和光束扫描(或振镜扫描)是目前广泛应用的两类扫描装置，而检测器主要有光电倍增管(PMT)和雪崩二极管(APD)。在一台LSCM中，光源照射的方向、强度、时间,各种方式的扫描，光学器件如滤光片轮转换，检测器参数的调节，共聚焦针孔孔径大小的转换以及检测信号的放大、采集、转换、处理直至成像、输出等一系列复杂工作，都由计算机协调控制和完成。

由于LSCM能随时采集和记录检测信号，因此它能对活细胞进行实时动态检测。但是，传统的LSCM，基于可见光的激发和可见光的荧光发射。可见光的波长短，因此它们在生物组织中的散射较大，进而带来了光损耗大和激发光斑聚焦难这两个问题。因此，传统的LSCM探测深度都不大，只能观察细胞、薄的组织等生物样品，在活体成像中的应用非常少。

近红外二区一般是指1000-1700nm波段，波长位于近红外二区的光在生物组织中的散射较小，因此基于近红外二区的荧光生物成像具有成像深度大、空间分辨率高的优势。此外，生物组织在近红外二区波段的自发荧光相对较小，从而可以提高成像的信噪比。

最近几年，近红外二区荧光生物成像技术得到了快速发展，在生物医学的研究中发挥了重要的作用。目前，近红外二区荧光宏观成像系统已经投入使用，通过引入在该波段有发光特性的材料，选择特定的激发光（一般是700-900nm的红外光）、分光器和铟镓砷（InGaAs）相机，可以实现生物标本（如小鼠）的近红外二区荧光宏观（全身）成像。此外，近红外二区荧光成像还可以和宽场显微成像技术相结合，得到近红外二区荧光显微成像系统，进而实现对活体生物样品高分辨、大深度、动态的实时观测。然而，目前关于近红外二区荧光显微三维生物成像的报道还非常少，究其原因，主要是因为没有商用的、且适合于近红外二区荧光活体成像的LSCM系统，因此，亟待开发这个新的光学成像仪器。

发明内容

本发明是在普通的光学电动显微镜的基础上改造的能适用于近红外二区荧光活体成像的激光扫描共聚焦显微(LSCM)系统。本发明为光学电动显微镜安装了共聚焦扫描单元并引入了760-900nm的近红外激光作为激发光源（如：793nm半导体激光器），激发生物标本中的荧光探针得到近红外二区的荧光信号，然后该荧光信号由光纤引出，并由对近红外二区（1000-1700nm）光响应灵敏的光电倍增管（PMT）接收，实现对标本的探测、扫描和成像。

本发明采用的技术方案是：

本发明包括760-900nm近红外激光光源、共聚焦扫描单元、1000-1700nm波段响应的光电倍增管、信号放大器、采集卡和计算机。

外置的近红外激发光通过单模光纤引入到共聚焦扫描单元，所述的共聚焦扫描单元中包含的光学元件有：光纤准直器、长通二向色镜、长通滤光片、振镜扫描单元和针孔转轮。激发光先经过光纤准直器，由光纤光转变为准直的空间光，再经长通二向色镜反射，进入振镜扫描单元，再通过安装在扫描头下方的扩束系统进行扩束，均匀地充满电动显微镜上的物镜的入瞳，并由入瞳进入物镜；出射的光由物镜聚焦后，用于激发标记在生物样本中的近红外二区荧光探针。

激发出的近红外二区荧光信号沿原光路返回并通过长通二向色镜，然后经过一块长通滤光片进一步滤除激发光，再经过透镜聚焦于由针孔转轮选定的某一孔径的针孔，荧光信号经过针孔后进入多模光纤，由空间光转为光纤光引出，并由对光电倍增管（PMT）接收。光电倍增管将光信号转换为电信号，经过信号放大器放大，再连接到数据采集卡，数据采集卡与计算机连接。。

本发明不受商用LSCM系统内置光源和分光器件的限制，可以针对所激发的近红外二区荧光探针的特性，选择合适波段的激光光源和分光器件，扫描单元处的激发光由光纤引入的，一般为连续（CW）激光光源。输出的荧光信号通过光纤传输到PMT，并产生相应的电信号，再经信号放大器放大后输送至数据采集卡，并由计算机处理、重构。相较于成熟的商用LSCM系统，该系统的操作更加灵活，具有更大的生物组织成像深度，更小的生物组织损伤，且系统工作稳定，性能可靠，成本更低。

本发明的有益效果：

第一，由于外置激光光源，外置PMT和可自主装分光器件的引入，这套自搭建的激光扫描共聚焦显微成像系统在激发光源和信号接收器件两大重要环节的选择上变得更加灵活，摆脱了传统商用LSCM系统激发光源选择有限和响应PMT单一的限制。

第二，由于使用了760-900nm近红外激光光源和近红外二区荧光探针，这套激光扫描共聚焦显微成像系统，相较于可见光激发和可见光波段荧光信号接收的传统商用LSCM系统，以及商用的双光子荧光显微镜，具有生物组织损伤更小和成像深度更深等优点，能在脑/神经科学、肿瘤学等方面的研究中发挥重要的作用。

第三，这套激光扫描共聚焦显微成像系统的光路简单，可灵活装卸，便于改装，用途多样，相较于商用LSCM系统，其使用和维护成本更低。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

图2为本发明的成像效果图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明作进一步说明。

如图1所示，基于商用光学电动显微镜搭建的适用于近红外二区荧光活体成像的激光扫描共聚焦显微系统包括760-900nm近红外激光光源（如：793nm半导体激光器）、共聚焦扫描单元、1000-1700nm波段响应灵敏的PMT、信号放大器、采集卡、计算机等。

首先，外置的近红外激发光1通过一根单模光纤2被引入到共聚焦扫描单元，扫描单元中包含的光学元件有：光纤准直器3，立方体分束器（安装了一块980nm长通二向色镜5和一块1000nm长通滤光片6），振镜扫描单元4和针孔转轮15（Pinhole Wheel）。激发光先经过光纤准直器，由光纤光转变为准直的空间光，再经980nm长通（短反）二向色镜反射，进入振镜扫描单元，再通过安装在扫描头7下方的扫描透镜8（Scan lens）和镜筒透镜9（Tubelens）组成的扩束系统进行扩束，均匀地充满装在商用电动显微镜10上的物镜12的入瞳，并由入瞳进入物镜，出射的光由物镜聚焦后，用于激发标记在生物样本中的近红外二区荧光探针。激发出的近红外二区荧光信号沿原光路返回并通过980nm长通（短反）二向色镜，然后经过一块1000nm长通滤光片进一步滤除激发光，再经过透镜14聚焦于由针孔转轮选定的某一特定孔径的针孔（根据成像效果可选择不同大小的针孔），荧光信号经过针孔后进入多模光纤16，由空间光转为光纤光引出，并由对1000-1700nm波段荧光信号响应灵敏的光电倍增管17（PMT）接收。PMT将光信号转换为电信号，经过信号放大器18放大，再连接到数据采集卡，数据采集卡与计算机19连接，系统内的振镜扫描单元也与计算机连接，以实现信号扫描的同步，物镜的升降通过电动显微镜上的升降组件11，由计算机精确控制，以实现连续光学切片；通过调节XY平动载物台13，可以方便地选择需要成像的视场区域。通过这样一套系统，可以实现适用于近红外二区荧光活体成像的激光扫描共聚焦显微系统。

本实例中采用的近红外激光光源为半导体单纵模激光器，发射波长为793nm；物镜是奥林巴斯公司生产的型号为XLPLN25XWMP2的25倍浸水镜，工作距离为2mm，且在400nm～1600nm光波段具有良好的透过率；DM是截止波长为980nm的长通二向色镜；外置近红外响应PMT是滨松公司（Hamamatsu）生产的型号为H12397-75光电倍增管，可以响应1000nm～1700nm波段的光信号；信号放大器是滨松公司（Hamamatsu）生产的型号为C12419的放大器；近红外二区荧光探针为油性硫化铅（PbS）量子点，在793nm有吸收，荧光峰在1270nm左右，其成像效果如图2所示。

综上，本发明公开了一套适用于近红外二区荧光活体成像的激光扫描共聚焦显微系统。选择了传统商用LSCM系统不具备的760-900nm近红外激光作为光源，激发生物标本中的近红外二区荧光探针，近红外二区荧光通过光纤引出，并由对1000-1700nm近红外光响应灵敏的PMT进行接收并成像。这一套激光扫描共聚焦显微成像系统，相较于在可见光波段进行激发和接收的传统商用LSCM系统，以及商用的双光子荧光显微镜，由于本系统的激发波段位于近红外一区，荧光位于近红外二区，根据近红外生物组织窗口的相关理论(第一光学组织成像窗口（750~900nm）、第二光学组织成像窗口（1000~1400nm）和第三光学组织成像窗口（1500~1700nm）。这些波段的光对生物组织的穿透能力很强，是进行大深度生物成像的理想光源。)，故而具有生物组织损伤更小和成像深度更深等优点，且工作稳定，性能可靠，使用灵活，成本较低，能在未来脑/神经科学、肿瘤学等方面的研究中发挥重要的作用。

Claims (3)

1.适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统，包括760-900nm近红外激光光源、共聚焦扫描单元、1000-1700nm波段响应的光电倍增管、信号放大器、采集卡和计算机，其特征在于：

外置的近红外激发光通过单模光纤引入到共聚焦扫描单元，所述的共聚焦扫描单元中包含的光学元件有：光纤准直器、长通二向色镜、长通滤光片、振镜扫描单元和针孔转轮；激发光先经过光纤准直器，由光纤光转变为准直的空间光，再经长通二向色镜反射，进入振镜扫描单元，再通过安装在扫描头下方的扩束系统进行扩束，均匀地充满电动显微镜上的物镜的入瞳，并由入瞳进入物镜；出射的光由物镜聚焦后，用于激发标记在生物样本中的近红外二区荧光探针；

激发出的近红外二区荧光信号沿原光路返回并通过长通二向色镜，然后经过一块长通滤光片进一步滤除激发光，再经过透镜聚焦于由针孔转轮选定的某一孔径的针孔，荧光信号经过针孔后进入多模光纤，由空间光转为光纤光引出，并由对光电倍增管接收；光电倍增管将光信号转换为电信号，经过信号放大器放大，再连接到数据采集卡，数据采集卡与计算机连接。

2.根据权利要求1所述的适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统，其特征在于：所述的振镜扫描单元与计算机连接，以实现信号扫描的同步。

3.根据权利要求1或2所述的适用于近红外二区荧光活体成像的共聚焦显微系统，其特征在于：物镜的升降通过电动显微镜上的升降组件，由计算机精确控制，以实现连续光学切片。