CN103940796A - 新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统。本发明包括激光器、单模光纤、准直透镜、扫描振镜、扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器；单模光纤、准直透镜、扫描振镜依次位于激光器出射光束的光轴之上,扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜依次位于经扫描振镜射出光束的光轴上；TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处；本发明在TIRF的基础上实现方便快捷、高分辨率和低噪声的显微实验观察。

Description

新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统

技术领域

本发明属于新型显微方式领域，尤其涉及一种新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统。

背景技术

全内反射荧光显微镜(total internal reflection fluorescencemicroscope，TIRFM)，利用光线全反射后在介质另一面产生衰逝波的特性，激发荧光分子以观察荧光标定样品的极薄区域，观测的动态范围通常在200nm以下。因为激发光呈指数衰减的特性，只有极靠近全反射面的样本区域会产生荧光反射，大大降低了背景光噪声干扰观测标本，能帮助研究者获得高质量的成像质量和可靠的观测数据。故此项技术广泛应用于细胞表面物质的动态观察。在生物应用中的入射光通常是激光和接口的玻璃盖玻片，盖玻片和贴壁细胞的膜之间的水溶液。

环状TIRF利用一个环状光圈形成TIRF照明成像，它的优势在于减少了干涉条纹，快速的多角度成像减少了3D成像以及单角度成像产生的色差，并提供了进行图像3D断层重建的可能。

EPI是垂直式荧光显微成像方式。

HILO(Highly inclined laminated optical)是在入射角将要进入TIRF时产生的，成像时噪声比例非常小，信噪比可以达到EPI的数倍，非常适合观察活细胞的活动，但是与TIRF相比很难测定成像的深度，无法进行定量分析。

目前市场上的商业全内反射荧光显微镜并不具备能自由切换角度和TIRF环大小的功能，也无法实现便捷的荧光成像模式转换。

发明内容

本发明提的目的是针对现有技术不足，提供一种新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案如下：

本发明包括激光器、单模光纤、准直透镜、扫描振镜、扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器；

单模光纤、准直透镜、扫描振镜依次位于激光器出射光束的光轴之上,扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜依次位于经扫描振镜射出光束的光轴上；TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；所述样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，所述探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处；

激光器发射的准直激光光束，首先被导入单模光纤，从单模光纤射出的激光光束，经过准直透镜完成准直；经过准直后的光束入射到扫面振镜中进行光路偏折，之后入射到扫描透镜进行聚焦；由扫描透镜射出的光束经过第一场镜扩束之后，平行射出分别经聚焦镜和二色镜的聚焦和反射后，光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台上的待测样品之上；待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜收集，先通过二色镜透射后再依次经过滤波片滤去杂散光，其次经第二场镜聚焦，最终被探测器采集，探测器记录此时的探测到的光强信号。

所述的光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台10的待测样品之上时，若入射光束的入射角θ大于临界角θ_c，则入射激光就会在样品接触面上发生全内反射，临界角θ_c计算公式如下：

θ_c＝sin^-1(n₁/n₃)

其中，n₁和n₃分别是光疏物质和光密物质的折射系数；

此时，在待测样品接触表面的另一侧会产生衰逝波，并随着离接触待测样品表面距离Z呈指数衰减；该衰逝场能够激发在表面附近的荧光基团同时也能避免更深处的荧光基团被激发；该无限宽光束的衰逝场强度的测量公式如下：

I(Z)＝I(O)e^-z/d           (2)

其中，

$d=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}}{(n_3^2{\sin }^2\mathrm{\θ}-n_1^2)}^{-1/2}---\left(3\right)$

λ₀是入射光束在真空中的波长；深度d不依赖于入射光的偏振并随着入射角θ增加而减小；被衰逝场激发的荧光基团所发出的荧光经过二色镜、滤镜、和透镜之后就能被探测器所检测到。

所述的显微物镜为TIRF型显微物镜，其数值孔径NA＝1.45，探测器为CCD相机，能够进行信号采集。

所述的用于改变光束偏折方向的扫描振镜能够通过控制器调控其上所加载电压，改变样品表面照明光束入射角的大小，从而实现多角度TIRF；也能够通过控制器的调控实现环状TIRF照明；在环状TIRF情况下控制器对扫描振镜控制使得入射光环绕一圈时间恰好等于探测器的曝光时间，从而达到探测与扫描的时间上同步。

本发明有益效果如下：

(1)本发明能够在EPI、HILO和TIRF之间切换显微成像模式；

(2)环状TIRF的实现提高了成像质量，光源均一化利于观察细胞内部的微小结构；

(3)成像速度快，环状TIRF形成时间在10ms左右，不影响细胞观察；

(4)装置简单，操作方便。

综上，本发明在TIRF的基础上实现方便快捷、高分辨率和低噪声的显微实验观察，本发明具有成像速度快、装置简单、分辨率高可以很好的用于实际实验中。

附图说明

图1为本发明的示意图。

图2为本发明EPI、TIRF、HILO和环状TIRF不同成像模式之间的切换示意图；

图3为本发明TIRF和环状TIRF照明下的分辨率示意图；

图中，激光器1、单模光纤2、准直透镜3、扫描振镜4、扫描透镜5、第一场镜6、聚焦镜7、二色镜8、TIRF显微物镜9、样品台10、滤波片11、第二场镜12、探测器13。

具体实施方式

下面结合实施例和附图来详细说明本发明，但本发明并不仅限于此。

如图1所示，新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，包括激光器1、单模光纤2、准直透镜3、扫描振镜4、扫描透镜5、第一场镜6、聚焦镜7、二色镜8、TIRF显微物镜9、样品台10、滤波片11、第二场镜12、探测器13。

单模光纤2、准直透镜3、扫描振镜4依次位于激光器1出射光束的光轴之上,扫描透镜5、第一场镜6、聚焦镜7、二色镜8依次位于经扫描振镜4射出光束的光轴上。TIRF显微物镜9、样品台10依次位于二色镜8反射光束光轴上，滤波片11、第二场镜12、探测器13依次位于二色镜8透射光束光轴上；所述样品台10位于TIRF显微物镜9的焦平面处，所述探测器13的采集孔位于第二场镜12的焦平面处。

激光器1发射的准直激光光束，首先被导入单模光纤2，从单模光纤2射出的激光光束，经过准直透镜3完成准直；经过准直后的光束入射到扫面振镜4中进行光路偏折，之后入射到扫描透镜5进行聚焦。由扫描透镜5射出的光束经过第一场镜6扩束之后，平行射出经聚焦镜7和二色镜8聚焦和反射后，光束聚焦于TIRF显微物镜9并投射于样品台10上的待测样品之上。待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜9收集，先通过二色镜8透射后再依次经过滤波片11滤去杂散光，其次经第二场镜12聚焦，最终被探测器13采集，探测器13记录此时的探测到的光强信号。

所述的光束聚焦于TIRF显微物镜9并投射于样品台10上的待测样品之上时，入射激光的入射角θ大于临界角θ_c，则入射激光就会在样品接触面上发生全内反射(TIR)，θ_c计算公式如下：

θ_c＝sin^-1(n₁/n₃)

(这里的n₁和n₃分别是光疏物质和光密物质的折射系数)

这时在介质的接触表面另一侧会产生衰逝波，并随着离接触介质表面距离Z呈指数衰减。该区域能够激发在表面附近生的荧光基团同时也能避免更深处的荧光基团被激发。对于这个无限宽光束的衰逝场强度的测量(单位使用：能量/区域/s)公式为：

I(Z)＝I(O)e^-z/d         (2)

其中，

$d=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}}{(n_3^2{\sin }^2\mathrm{\θ}-n_1^2)}^{-1/2}---\left(3\right)$

λ₀是入射光线在真空中的波长。深度d不依赖于入射光的偏振并随着入射角θ增加而减小。这时被衰逝场激发的荧光基团所发出的荧光经过二色镜、滤镜、和透镜之后就能被探测器所检测到。

显微物镜9为TIRF型显微物镜，其数值孔径NA＝1.45，探测器13为CCD相机，能够进行信号采集。

如图2所示，所述的用于改变光束偏折方向的扫描振镜4能够通过控制器调控其上所加载电压，改变样品表面照明光束入射角的大小，从而实现多角度TIRF，也可以通过控制器的调控实现环状TIRF照明从而达到消除干涉条纹，提高观测图像分辨率的目的，具体参看图3。其中，在环状TIRF情况下控制器对扫描振镜控制使得入射光环绕一圈时间恰好等于探测器的曝光时间，这样能达到探测与扫描的时间上同步。

实施例：

首先激光从Melles Griot公司生产激光器发出，经过单模光纤导入Thornlabs公司的准直透镜完成准直；经过准直后的光束入射到Thornlabs公司的扫描振镜系统中进行光路偏折，之后入射到Thornlabs公司的扫描透镜中进行聚焦。由扫描透镜射出的光束经过第一场镜扩束之后平行射出经Thornlabs公司的聚焦镜和二色镜聚焦和反射后，光束聚焦于OLYMPUS公司生产的TIRF显微镜的物镜上并投射于其样品台上。待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜收集，先通过二色镜再依次经过滤波片滤去杂散光，经过第二场镜聚焦，最终被Andor公司的EM-CCD探测器采集，EM-CCD探测器记录此时探测到的光强信号。

当一束光从光密介质进入光疏介质时，根据斯涅耳定律一部分光会发生折射，而一部分光会发生反射，当入射角度不断增大，折射角也会不断增大，当折射角刚好达到90度时，就发生了全反射现象。全反射发生后，折射光有一个临界状态沿着折射面传播，这部分光我们称之为隐失波，其能量在Z轴上呈现指数衰减。

TIRF具有Z轴方向上的超分辨率(30nm～100nm之间)，当发生全内反射(TIR)时，在介质的接触表面另一侧会产生衰逝波，例如在玻璃和水的接触面间，从法线向两边测量的入射角角度(这个角θ称为入射角)必须足够大让光束能够发生TIR而不是在界面上出现折射情况，这种情况下就要超过全内反射角临界角才行。TIR会在流体中产生一个和入射光线一样频率的倏逝场，并随着离接触介质表面距离Z呈指数衰减。该区域能够激发在表面附近生的荧光基团同时也能避免更深处的荧光基团被激发。

最简单的一种TIR情况就是一束笔直的入射光入射到了单一表面上。当一个透明光从光密介质3(例如玻璃)进入到一个光疏介质1(例如水)，当从法线向界面方向测量的入射角度大于全反射临界角的时候就会发生全反射。这个临界角θ_c计算公式如下：

θ_c＝sin^-1(n₁/n₃)        (1)

这里的n₁和n₃分别是光疏物质和光密物质的折射系数。n₁和n₃的比必须小于1才能发生全反射。当θ＜θ_c的时候，通过Snell公式可知大部分的光都经过一个折射角通过界面透射出去(同样是也是通过法线向界面方向测量的)。当θ＞θ_c的时候，所有的光线都会反射回光密介质中。但是一些入射能量会射穿过接触面并且沿着平行于入射层面的表面传播。这个场在光疏介质中，叫做‘衰逝场’(或者‘波’)，这样一个场就能够激发接触表面附近的荧光分子。

对于一个无限宽光束的衰逝场强度的测量(单位使用：能量/区域/s)伴随着距离表面的垂直距离Z呈指数衰减：

I(Z)＝I(O)e^-z/d            (2)

这里的

$d=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}}{(n_3^2{\sin }^2\mathrm{\θ}-n_1^2)}^{-1/2}---\left(3\right)$

λ₀是入射光线在真空中的波长。深度d不依赖于入射光的偏振并随着入射角θ增加而减小。除了当θ→θ_c(这里d→∞)d是约等于λ₀的或者更小一些。

所以，当处于TIRF状态时改变入射角的大小其衰逝场的深度会不同，则不断改变角度大小，就可以获得一系列不同深度的有关于细胞表面信息的图像，再对这些不同深度图像进行分析就可以获得细胞表面附近的三维信息。而当在TIRF情况下用环状照明取代传统单点照明可以明显的消除单点光源照明所产生的干涉条纹。

EPI是标准荧光显微镜工作模式，激发光线从物镜方向垂直射入穿过样本使荧光基团激发，在TIRF显微镜中当入射光线在物镜中心垂直射入时即为EPI模式，此时视野范围很广阔观察深度深。

HILO是当入射角处于次临界角范围内时(即入射角在零度和全反射角之间时)在接触界面上会同时发生折射与反射两种情况，调整不同的入射角则反射和折射光束所成角度以及能量随之变化，这样可以得到具有深度照明能力的低背景散射的图像。HILO的信噪比比EPI高4到8倍。

Claims (4)

1.新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于包括激光器、单模光纤、准直透镜、扫描振镜、扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜、TIRF显微物镜、样品台、滤波片、第二场镜、探测器；

单模光纤、准直透镜、扫描振镜依次位于激光器出射光束的光轴之上,扫描透镜、第一场镜、聚焦镜、二色镜依次位于经扫描振镜射出光束的光轴上；TIRF显微物镜、样品台依次位于二色镜反射光束光轴上，滤波片、第二场镜、探测器依次位于二色镜透射光束光轴上；所述样品台位于TIRF显微物镜的焦平面处，所述探测器的采集孔位于第二场镜的焦平面处；

激光器发射的准直激光光束，首先被导入单模光纤，从单模光纤射出的激光光束，经过准直透镜完成准直；经过准直后的光束入射到扫描振镜中进行光路偏折，之后入射到扫描透镜进行聚焦；由扫描透镜射出的光束经过第一场镜扩束之后，平行射出分别经聚焦镜和二色镜的聚焦和反射后，光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台上的待测样品之上；待测样品所发射的信号光被TIRF显微物镜收集，先通过二色镜透射后再依次经过滤波片滤去杂散光，其次经第二场镜聚焦，最终被探测器采集，探测器记录此时的探测到的光强信号。

2.如权利要求1所述的新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于：

所述的光束聚焦于TIRF显微物镜并投射于样品台10的待测样品之上时，若入射光束的入射角θ大于临界角θ_c，则入射激光就会在样品接触面上发生全内反射，临界角θ_c计算公式如下：

θ_c＝sin^-1(n₁/n₃)

其中，n₁和n₃分别是光疏物质和光密物质的折射系数；

此时，在待测样品接触表面的另一侧会产生衰逝波，并随着离接触待测样品表面距离Z呈指数衰减；该衰逝场能够激发在表面附近的荧光基团同时也能避免更深处的荧光基团被激发；该无限宽光束的衰逝场强度的测量公式如下：

I(Z)＝I(O)e^-z/d      (2)

其中，

$d=\frac{{\mathrm{\λ}}_0}{4\mathrm{\π}}{(n_3^2{\sin }^2\mathrm{\θ}-n_1^2)}^{-1/2}---\left(3\right)$

λ₀是入射光束在真空中的波长；深度d不依赖于入射光的偏振并随着入射角θ增加而减小；被衰逝场激发的荧光基团所发出的荧光经过二色镜、滤镜和透镜之后就能被探测器所检测到。

3.如权利要求1所述的新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于：

所述的显微物镜为TIRF型显微物镜，其数值孔径NA＝1.45，探测器为CCD相机，能够进行信号采集。

4.如权利要求1所述的新型多角度多模式快速切换环状光学照明显微成像系统，其特征在于：

所述的用于改变光束偏折方向的扫描振镜能够通过控制器调控其上所加载电压，改变样品表面照明光束入射角的大小，从而实现多角度TIRF；也能够通过控制器的调控实现环状TIRF照明；在环状TIRF情况下控制器对扫描振镜控制使得入射光环绕一圈时间恰好等于探测器的曝光时间，从而达到探测与扫描的时间上同步。