CN102796743B

CN102796743B - 用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的IL-15和IL-15Rα基因

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Publication number: CN102796743B
Application number: CN201210119215.6A
Authority: CN
Inventors: 芭芭拉·K·费尔博尔; 乔治·N·巴甫拉吉斯
Original assignee: US Government
Current assignee: US Government
Priority date: 2006-01-13
Filing date: 2007-01-12
Publication date: 2015-11-18
Anticipated expiration: 2027-01-12
Also published as: NZ569541A; US20160102128A1; CN101374950A; CN101374950B; EP1984505A2; BRPI0707106A2; US10428133B2; CN102796743A; JP2009523420A; US20160096875A1; JP2016032473A; IL192730A0; US20090082299A1; EP2366787A3; JP2014113151A; JP6289099B2; CN105368841A; MX357691B; IL221384A0; US20200231643A1

Abstract

本发明提供用于提高白介素-15(IL-15)在哺乳动物细胞中表达的核酸。本发明还提供在哺乳动物细胞中表达IL-15的方法，通过用包括密码子优化的IL-15序列的核酸序列转染细胞。本发明还提供表达载体，以及IL-15和IL-15受体α组合(核酸和蛋白)，所述组合增加IL-15稳定性以及体外和体内的效力。本方法用于在对个体(例如哺乳动物、人)的DNA、RNA或者蛋白给药后增强IL-15的生物利用率和生物学功效。

Description

用于在哺乳动物细胞中表达的密码子优化的IL-15和IL-15Rα基因

相关专利申请的交叉引用

本申请要求享有2006年6月9日提交的美国临时专利申请60/812,566和2006年1月13日提交的美国临时专利申请60/758,819的权益，为所有目的其全部内容在此以参考的方式并入本文。

发明领域

本发明涉及哺乳动物细胞中提高的细胞因子表达，通过优化细胞因子基因表达的所有步骤。

发明背景

白介素-15(IL-15)是一种多效细胞因子，对先天性和获得性免疫系统非常重要(Diab，等人，Cytotherapy(2005)7：23-35)。IL-15促进中性粒细胞和巨噬细胞的活化，是树突状细胞(DC)、天然杀伤(NK)细胞、NKT细胞和CD8+T细胞(Id.)的发育和功能必不可少的。IL-15在淋巴和非淋巴隔室作用于细胞(VanBelle和Grooten，ArchImmunolTherExp(2005)53：115)。

基于其多种功能和动物模型中的相对安全性，发现了IL-15给药在治疗免疫缺陷中的用途，用于T细胞和NK细胞的体外扩增，和作为疫苗的佐剂，包括抗HIV疫苗(Diab，等人，上述；Ahmad，等人，CurrHIVRes(2005)3：261；AlpdoganandvandenBrink，TrendsImmunol(2005)26：56)。例如，已经发现外源IL-15给药显著增强感染人类免疫缺陷性病毒(HIV)的获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的免疫细胞功能(Ahmad，等人，上述；还可参见，Pett和Kelleher，ExpertRevAntiInfectTher(2003)1：83；和Ansari，等人，ImmunolRes(2004)29：1)。IL-15给药对淋巴组织生成的作用和免疫缺陷病症的治疗也在研究中(AlpdoganandvandenBrink，上述)。

来自数个研究者的结果已经表明IL-15受体α的天然可溶形式是IL-15的拮抗剂(参见，Mortier，等人，(2004)J.Immunol.173，1681-1688；Ruchatz，等人，(1998)J.Immunol.160，5654-566；和Smith，等人，(2000)J.Immunol.165，3444-3450)。相反，当通过柔性氨基酸连接区融合到IL-15时，IL-15受体α的sushi结构域已经被认为是IL-15功能的体外激动剂(JBiolChem.2006Jan20；281(3)：1612-9)。可溶性白介素-15受体α(IL-15Rα)-sushi是通过IL-15Rβ/γ的IL-15作用的选择性和有效的激动剂(参见，MortierE，等人，JBiolChem.2006281：1612)。

为了提供用于作为编码核酸或者蛋白给药的治疗性的单独的IL-15、或者与完整IL-15受体α或者可溶性IL-15受体α组合的IL-15，非常重要的是发展用于该细胞因子的有效表达载体和有效表达编码核酸序列。本发明涉及这种需要。

发明简述

本发明提供用于单独的白介素-15(IL-15)以及与完整IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)组合的白介素-15(IL-15)的高水平表达的核酸序列、表达载体和哺乳动物细胞。本发明还提供用于单独的白介素-15以及与完整IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)组合的白介素-15在哺乳动物细胞中高水平表达的方法。

在一个相关方面，本发明提供用于完整IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)高水平表达的核酸序列、表达载体和哺乳动物细胞。本发明还提供用于完整IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)高水平表达的方法。

一方面，本发明提供核酸序列，所述核酸序列编码与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％序列同一性的白介素-15(IL-15)蛋白，其中该核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的改变的核苷酸位置具有至少50％的差异。在一些实施方式中，核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图4和/或图6所标识的改变的密码子位置具有至少50％的差异。在一些实施方式中，改变的核苷酸和密码子位于成熟IL-15序列。天然哺乳动物IL-15可以是任何哺乳动物IL-15，包括人IL-15、灵长类动物IL-15、猪IL-15、小鼠IL-15，等等。

在一些实施方式中，编码IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的115个改变的核苷酸位置(阴影)具有至少大约55％(例如，59个核苷酸)、60％(例如，64个核苷酸)、65％(例如，70个核苷酸)、70％(例如，75个核苷酸)、75％(例如，81个核苷酸)、80％(例如，86个核苷酸)、85％(例如，91个核苷酸)、90％(例如，97个核苷酸)、95％(例如，109个核苷酸)的差异。在一些实施方式中，编码IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图4所标识的121个改变的密码子位置(阴影，加框或者下划线)具有至少大约55％(例如，66个密码子)、60％(例如，73个密码子)、65％(例如，78个密码子)、70％(例如，85个密码子)、75％(例如，91个密码子)、80％(例如，97个密码子)、85％(例如，103个密码子)、90％(例如，109个密码子)、95％(例如，115个密码子)的差异。

在一些实施方式中，改变的核苷酸和密码子位于成熟IL-15序列。例如，编码改进的IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图8所标识的成熟IL-15的78个改变的核苷酸位置(阴影)具有至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的差异。在另一个实施方式中，编码改进的IL-15的核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在图4所标识的成熟IL-15的84个改变的密码子位置(阴影，加框或者下划线)具有至少大约65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％的差异。

在一些实施方式中，核酸序列与编码天然IL-15的核酸序列在下列核苷酸位置不同：6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486，其中核苷酸位置如图8所鉴定的。

在一些实施方式中，核酸序列在下列核苷酸位置包括鸟嘌呤(g)或者胞嘧啶(c)核苷酸：6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486，其中核苷酸位置如图8所鉴定的。

密码子可以任何方式不同使得相同或者相似的(即，保守取代的)氨基酸被编码。在一些实施方式中，改变密码子以增加GC含量。在一些实施方式中，改进的IL-15核酸序列均包括占序列长度至少大约50％、55％、60％、65％、70％、75％或者更高的GC含量(例如，脱氧鸟苷和脱氧胞苷脱氧核糖核苷残基或者鸟苷和胞苷核糖核苷残基)。

编码IL-15的核酸与SEQIDNO：3、SEQIDNO：4和/或SEQIDNO：16的核酸具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性。在一些实施方式中，如图8(SEQIDNO：3或者SEQIDNO：4)或者图16(SEQIDNO：16)所标识的，编码IL-15的核酸序列不同于编码天然IL-15的核酸序列。

在一些实施方式中，编码IL-15信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替换为编码异源蛋白的信号肽(SIG)或者信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列。在一些实施方式中，编码IL-15信号肽的核酸序列被替换为编码异源蛋白信号肽的核酸序列。异源蛋白可以来自，例如，组织纤溶酶原活化因子(tPA)、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者免疫球蛋白(例如，IgE)。在一个实施方式中，编码IL-15信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列被替换为编码tPASIG-PRO的核酸序列，所述tPASIG-PRO与SEQIDNO：6、SEQIDNO：8、SEQIDNO：25或者SEQIDNO：27具有95％的序列同一性。在一些实施方式中，编码IL-15的核酸被可操作的连接到编码RNA输出元件的核酸，例如CTE或者RTEm26CTE。

在一些实施方式中，编码IL15Ra信号肽的核酸序列被替换为编码异源蛋白的信号肽(SIG)或者信号肽-前肽(SIG-PRO)的核酸序列。在一些实施方式中，编码IL15Ra信号肽的核酸序列被替换为编码异源蛋白信号肽的核酸序列。异源蛋白可以来自，例如，组织纤溶酶原活化因子(tPA)、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)或者免疫球蛋白(例如，IgE)。在一些实施方式中，编码IL15Ra的核酸被可操作的连接到编码RNA输出元件的核酸，例如CTE或者RTEm26CTE。

另一方面，本发明提供编码来自除了IL-15以外的蛋白的信号肽-前肽(SIG-PRO)序列的核酸序列，例如tPASIG-PRO序列、生长激素信号序列(SIG)、免疫球蛋白信号序列(SIG)，所述核酸序列可操作的连接到编码与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90％的序列同一性的IL-15蛋白的核酸，其中所述编码IL-15的核酸序列包括至少50％的GC含量。在一个实施方式中，SIG-PRO序列来自选自如下的蛋白：tPA、GM-CSF、生长激素和免疫球蛋白家族蛋白。在一个实施方式中，SIG-PRO序列编码tPASIG-PRO，所述tPASIG-PRO与SEQIDNO：6或者SEQIDNO：8具有至少95％的氨基酸序列同一性。在另一个实施方式中，SIG-PRO序列是tPASIG-PRO，其与SEQIDNO：5或者SEQIDNO：7具有至少95％的核酸序列同一性。其他实施方式如上所述。

另一方面，本发明包括包含本发明核酸序列的表达载体和哺乳动物细胞，包括如上所述的实施方式。

在一些实施方式中，编码IL-15和/或IL15Ra的核酸序列还包括用作疫苗佐剂的药物赋形剂。在一些实施方式中，编码IL-15和/或IL15Ra的核酸序列还包括用作免疫治疗因子的药物赋形剂，例如，在体外或者体内淋巴细胞数量的扩增中，所述淋巴细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞和NKT细胞。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于扩增表达IL-2/IL-15βγ受体的淋巴细胞群。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于扩增CD4+和/或CD8+T细胞。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列用于在抗原刺激后扩增双分泌IL-2和IFN-γ的多功能细胞(例如，多功能T细胞)的数量。

另一方面，本发明提供在哺乳动物细胞中表达IL-15的方法，该方法包括重组修饰哺乳动物细胞以表达编码IL-15蛋白的核酸，所述IL-15蛋白与天然哺乳动物IL-15蛋白具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，其中该核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图8所标识的核苷酸位置具有至少50％的不同。所述方法的实施方式如上所述用于核酸序列。

在相关方面，本发明部分基于以下发现：包括受体全部胞外结构域的完整IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra的可溶形式(IL15sRa)在体外和体内是IL-15的有效稳定剂。IL-15和IL15sRa复合物在循环中具有增强的稳定性，并具有增加的IL-15效力，这是通过包括天然杀伤(NK)细胞和T细胞的多个淋巴细胞亚群的扩增测定的。本发明提供在体外和体内增加IL-15效力的方法、表达载体和蛋白组合。这些方法可用于在给予个体(例如，哺乳动物、人)时增强IL-15的生物利用率、稳定性和效力，以及用于增强IL-15的生物学功效。

本发明提供用于IL-15与其受体IL-15受体α(IL15Ra)协同表达的表达载体。该载体通常包含一个拷贝的IL-15编码序列或/和一个拷贝的IL-15受体α(IL15Ra)(完整或者可溶的)。两个蛋白的表达比例可以调整为1∶1、1∶2或者1∶3，例如，通过利用不同的质粒DNA比例(w/w)或者通过选择不同表达强度的启动子。在一些实施方式中，IL-15细胞因子和IL-15受体α(IL15Ra)表达的摩尔比例为1∶3。

在一个实施方式中，根据此处描述的本方法，至少一个IL-15细胞因子和IL-15受体α(IL15Ra)的核酸序列被改进。IL-15细胞因子和完整或者可溶的IL-15受体α(IL15Ra)的共表达增加从细胞表达和分泌的IL-15细胞因子和IL15Ra的量，与IL-15单独表达相比，尤其是与野生型IL-15序列相比，超过10倍、100倍、10,000倍、100,000倍、1,000,000倍或者更高。与单独的IL-15相比，使用这种载体增强IL-15和IL15ra的稳定性超过10倍、20倍、50倍、100倍、1000倍或者更高，并且在体内增加IL-15蛋白的稳态水平。与单独的IL-15相比，与IL15Ra共表达的IL-15的生物功能(例如，淋巴细胞扩增的活化和诱导，所述淋巴细胞包括B细胞、T细胞、天然杀伤(NK)细胞和NKT细胞)在体内也显著增强，超过10倍、15倍、20倍或者更高。这些载体可用于增加生物活性细胞因子在特定组织中的递送。发现IL-15和IL15Ra载体和蛋白在预防和治疗性疫苗接种、癌症免疫治疗或者任何用于增强淋巴细胞数量和功能的适应症和任何免疫缺陷状况中的用途。

一方面，本发明提供用于IL-15与完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra协同表达的表达载体。IL-15和完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra可以包含在相同的表达载体或者包含在多个表达载体中。在一些实施方式中，根据用于高效表达的本方法，至少一个IL-15和完整IL15Ra或者可溶性IL15Ra的编码核酸序列被改进。

本发明的一方面是提供的载体能够快速产生可溶性胞外IL15sRa的天然形式，当递送到哺乳动物细胞或者哺乳动物时所述载体表达IL-15和全长IL15Ra。因此，IL-15和IL15Ra的共递送和表达在细胞表面产生IL-15/IL-15R复合物以及IL-15/IL15sRa复合物，它们被释放到循环中，可以在远处组织中起作用。

另一方面，本发明提供编码完整IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)的改进的核酸序列，它们与天然哺乳动物IL-15受体α(IL15Ra)或者IL15Ra可溶形式(IL15sRa)的蛋白(参见，例如，NM_002189)具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％的序列同一性，其中该核酸序列与编码天然哺乳动物IL-15的核酸序列在图35-38所标识的改变的核苷酸位置具有至少50％的不同。

在一些实施方式中，IL15Ra(完整或者可溶形式的)的编码序列与图35-38中任意一个所示的核酸序列具有至少90％、95％、96％、97％、98％或者99％的序列同一性。在一个实施方式中，IL15Ra由图35-38中任意一个所示的核酸序列编码。在一个实施方式中，改进的IL15Ra(完整或者可溶的)编码核酸序列具有至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％或者85％的GC含量。

本发明还提供增加IL-15数量、稳定性和生物活性的方法。该方法可以在体外进行，通过在哺乳动物宿主细胞中共表达IL-15和IL15Ra或者IL15sRa。该方法可以在体内进行，通过给个体给予IL-15和IL-15受体α(完整或者可溶的)的组合，作为用于注射的蛋白或者作为在体内产生的DNA构建体(天然或者改进的)。根据此处描述的方法，可以改进IL-15和IL15Ra编码序列中的一个或者两个。

本发明还提供协同产生IL-15和IL-15可溶性受体α(IL15sRa)的宿主细胞和细胞系，或者协同产生IL-15以及可溶性和全长IL15Ra混合物的细胞系。

另一方面，本发明提供增强个体抗一种或者多种抗原的免疫应答的方法，通过给予本发明改进的单独的IL-15核酸或者与IL15Ra组合的IL-15核酸。IL15Ra可以是野生型或者改进的蛋白或者核酸形式。

另一方面，本发明提供扩增淋巴细胞数量的方法，例如，用于体内或者体外减轻免疫缺陷状况，通过给予本发明改进的IL-15核酸(单独的或者与IL15Ra组合)。IL15Ra可以是野生型或者改进的蛋白或者核酸形式。在一些实施方式中，淋巴细胞选自B细胞、T细胞、NK细胞和NKT细胞。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列促进表达IL-2/IL-15βγ受体的淋巴细胞群的扩增。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列刺激CD4+和/或CD8+T细胞的扩增。在一些实施方式中，IL-15和/或IL15Ra核酸序列在抗原刺激时诱导双分泌IL-2和IFN-γ的多功能细胞(例如，多功能T细胞)数量的扩增。

在一些实施方式中，通过注射和/或电穿孔给予DNA构建体中的一个或者两个。通过注射和电穿孔两种途径的给药可以在相同或者不同的位点同时或者连续进行。

定义

术语“天然哺乳动物白介素-15(IL-15)”是指来自哺乳动物种的IL-15的任何天然存在的白介素-15核酸和氨基酸序列。本领域技术人员清楚白介素-15核酸和氨基酸序列在基因数据库中已经公开提供，例如，在万维网ncbi.nlm.nih.gov上NationalCenterforBiotechnologicalInformation(国家生物技术信息中心)提供的GenBank。示例性的天然哺乳动物IL-15核酸或者氨基酸序列可以来自于，例如，人、灵长类动物、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、啮齿目、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠，等等。示例性天然哺乳动物IL-15核酸序列的登录号包括NM_172174(人；SEQIDNO：1)、NM_172175(人)、NM_000585(人)、U19843(恒河猴；SEQIDNO：14)、DQ021912(恒河猴)、AB000555(恒河猴)、NM_214390(猪)、DQ152967(绵羊)、NM_174090(牛)、NM_008357(小鼠)、NM_013129(鼠属)、DQ083522(水牛)、XM_844053(犬)、DQ157452(兔类)、和NM_001009207(猫)。示例性天然哺乳动物IL-15氨基酸序列的登录号包括NP_751914(人；SEQIDNO：2)、CAG46804(人)、CAG46777(人)、AAB60398(恒河猴；SEQIDNO：15)、AAY45895(恒河猴)、NP_999555(猪)、NP_776515(牛)、AAY83832(水牛)、ABB02300(绵羊)、XP_849146(犬)、NP_001009207(猫)、NP_037261(鼠属)、和NP_032383(小鼠)。

术语“白介素-15”或者“IL-15”是指与天然哺乳动物IL-15氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％序列同一性的多肽，或者编码这种多肽的核苷酸，是有生物学活性的，意思指突变的蛋白(“突变蛋白”)与天然IL-15蛋白在至少一种功能检测中具有功能性的相似(75％或者更高)。IL-15多肽的示例性功能检测包括T细胞的增殖(参见，例如，Montes，等人，ClinExpImmunol(2005)142：292)，以及NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的活化。用于特定免疫细胞亚群的分离和增殖检测(即，³H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入法)的方法是本领域公知的。细胞-介导的细胞毒性检测可用于测量NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞活化。细胞-介导的细胞毒性检测，包括同位素(⁵¹Cr)、染料(例如四唑、中性红)或者酶的释放，也是本领域公知的，可利用商品化供应的试剂盒(OxfordBiomedicalResearch，Oxford，M；Cambrex，Walkersville，MD；Invitrogen，Carlsbad，CA)。IL-15还显示抑制Fas介导的凋亡(参见，DemirciandLi，CellMolImmunol(2004)1：123)。凋亡检测，包括例如TUNEL检测和膜联蛋白V检测，是本领域公知的，可利用商品化供应的试剂盒(R&DSystems，Minneapolis，MN)。还可参见，Coligan，等人，CurrentMethodsinImmunology，1991-2006，JohnWiley&Sons。

术语“天然哺乳动物白介素-15受体α(IL15Ra)”是指来自哺乳动物种的IL-15受体α的任何天然存在的白介素-15受体α核酸和氨基酸序列。本领域技术人员清楚白介素-15受体α核酸和氨基酸序列在基因数据库中已经公开提供，例如，在万维网ncbi.nlm.nih.gov上国家生物技术信息中心提供的GenBank。示例性的天然哺乳动物IL-15受体α核酸或者氨基酸序列可以来自于，例如，人、灵长类动物、犬、猫、猪、马、牛、绵羊、啮齿目、小鼠、大鼠、仓鼠、豚鼠，等等。示例性天然哺乳动物IL-15核酸序列的登录号包括NM_002189(智人白介素15受体，α(IL15RA)，转录变异体1，mRNA)。

术语“白介素-15受体α”或者“IL15Ra”是指与天然哺乳动物IL15Ra氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或者99％序列同一性的多肽，或者编码这种多肽的核苷酸，是有生物学活性的，意思指突变的蛋白(“突变蛋白”)与天然IL15Ra蛋白在至少一种功能检测中具有功能性的相似(75％或者更高)。一种功能检测是与天然IL-15蛋白的特异结合。

术语“核酸”是指采用单-链或者双-链形式的脱氧核糖核酸或者核糖核苷酸和其聚合物。该术语包括包含已知核苷酸类似物或者修饰的骨架残基或者键的核酸，它们是合成的、天然存在的和非天然存在的，与参照核酸具有相似的结合性质，以类似于参照核苷酸的方式进行代谢。这种类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、磷酰胺脂、膦酸甲酯、手性-膦酸甲酯、2-O-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(PNA)。

除非另外指出，特定核酸序列还隐含的包括其保守修饰的变异体(例如，简并密码子取代)和互补序列，以及明确指定的序列。通过产生序列实现简并密码子取代，该序列中一个或者多个选择的(或者所有的)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等人，NucleicAcidRes.19：5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等人，Mol.Cell.Probes8：91-98(1994))。术语核酸可以与基因、cDNA、mRNA、寡核苷酸和多核苷酸互换使用。

天然存在氨基酸的简并密码子取代显示于表1。

表1

在两种或更多种核酸或者多肽序列的上下文中，术语“相同的”或者百分比“同一性”是指相同的或者具有氨基酸残基或者核苷酸特定百分比的两种或更多种序列或者子序列，它们是相同的(即，当用于比较窗口或者指定区域的最大对应的比较和比对时，在特定区域(例如SEQIDNOs：1-23中的任意一个)大约70％同一性，优选的75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者更高的同一性)，通过使用如下所述缺省参数的BLAST或者BLAST2.0序列比较算法、或者通过人工比对和目测检查进行测定(参见，例如NCBI网站等等)。然后这种序列被称为“基本上相同的”。该定义还指，或者能够用于，试验序列的互补物。该定义还包括有缺失和/或添加的序列，以及有取代的那些序列。如下所述，优选的算法能够解释缺口等等。优选的，同一性存在于至少长大约25、50、75、100、150、200个氨基酸或者核苷酸的区域中，常在长225、250、300、350、400、450、500个氨基酸或者核苷酸或者氨基酸或者核酸序列全长的区域。

对于序列比较，通常一个序列作为参照序列，试验序列与其比较(这里，完整的“天然哺乳动物”IL-15氨基酸或者核酸序列)。当使用序列比较算法时，试验和参照序列被输入电脑，指定子序列坐标，必要时，指定序列算法程序参数。优选的，可以使用缺省程序参数，或者可以指定替换参数。基于程序参数，序列比较算法然后计算试验序列相对于参照序列的百分比序列同一性。

适于确定百分比序列同一性和序列相似性的优选算法实例是BLAST算法，其分别在Altschul等人，Nuc.AcidsRes.25：3389-3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990)中被描述。国家生物技术信息中心在万维网ncbi.nlm.nih.gov/.上公开提供BLAST软件。可以使用缺省参数或者其他非缺省参数。BLASTN程序(用于核苷酸序列)使用以下缺省：字长(W)11、期望值(E)10、M＝5、N＝-4和两条链的比较。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用以下缺省：字长3、期望值(E)10、和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff&Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915(1989))比对(B)50、期望值(E)10、M＝5、N＝-4，和两条链的比较。

此处氨基酸可以用它们通常已知的3字母符号或者1字母符号表示，它们是IUPAC-IUBBiochemicalNomenclatureCommission(IUPAC-IUB生物化学命名委员会)推荐的。同样地，核苷酸可以用它们通常接受的单字母代码表示。

此处使用的“保守修饰的变异体”适用于氨基酸序列。技术人员清楚：在编码序列中改变、添加或者去除单个氨基酸或者小比例氨基酸的对核酸、肽、多肽或者蛋白序列的特定的取代、缺失或添加是“保守修饰的变异体”，其中改变导致用化学相似的氨基酸取代氨基酸。提供功能相似氨基酸的保守取代表是本领域公知的。这种保守修饰的变异体在本发明的多态性变异体、种间同系物和等位基因以外，但并不排除它们。

下列八组每组包含互相保守取代的氨基酸：

1)丙氨酸(A)，甘氨酸(G)；

2)天冬氨酸(D)，谷氨酸(E)；

3)天门冬酰胺(N)，谷氨酰胺(Q)；

4)精氨酸(R)，赖氨酸(K)；

5)异亮氨酸(I)，亮氨酸，甲硫氨酸(M)，缬氨酸(V)；

6)苯丙氨酸(F)，酪氨酸(Y)，色氨酸(W)；

7)丝氨酸(S)，苏氨酸(T)；和

8)半胱氨酸(C)，甲硫氨酸(M)(参见例如Creighton，Proteins(1984))。

术语“GC含量”是由脱氧鸟苷(G)和/或脱氧胞苷(C)脱氧核糖核苷酸或者鸟苷(G)和/或胞苷(C)核糖核苷酸残基组成的核酸序列的百分比。

术语“哺乳动物”或者“哺乳动物的”是指分类学分类上的哺乳纲的任何动物。哺乳动物可以指人或者非人灵长类动物。哺乳动物可以指家畜(包括例如，犬、猫)、啮齿目(包括兔类、小鼠、鼠属)、仓鼠亚科(仓鼠)，等等。哺乳动物可以指农业动物，包括例如，牛、绵羊、猪、马，等等。

术语“可操作的连接”是指第一核酸序列和第二核酸序列之间的功能键，这样的话第一和第二核酸序列转录成单个核酸序列。可操作连接的核酸序列无需物理上彼此邻近。术语“可操作的连接”还指核酸表达操纵序列(例如启动子，或者转录因子结合位点的排列)和可转录核酸序列之间的功能键，其中表达操纵序列指导与可转录序列对应的核酸的转录。

附图简述

图1显示改进人白介素-15(IL-15)编码序列的策略。IL-15多肽的区段1是指信号肽(氨基酸1-29)；区段2是指前肽(氨基酸30-47)；区段3是指成熟的IL-15(氨基酸47-115)。在IL-15opt1中，IL-15的编码序列具有更高的GC含量，潜在的剪接位点被改变。改变通常不影响编码效能。在IL-15opt2中，编码序列改进类似于IL-15opt1，但包括使用更“优选的”密码子，如美国专利5,786,464所定义。

图2显示野生型IL-15(wt)、IL-15opt1(opt1)和IL-15opt2(opt2)的AU-GC含量模式的比较。与野生型IL-15cDNA相比，IL-15opt1和IL-15opt2的GC含量具有显著的增加。

图3显示人野生型IL-15(SEQIDNO：1)和改进的IL-15opt1(opt)(SEQIDNO：3)核苷酸序列的比较。序列具有70.7％的序列同一性。

图4显示野生型人IL-15(顶部；SEQIDNO：1)和改进的IL-15opt1(底部；SEQIDNO：3)核苷酸序列之间核苷酸改变的比较。改进的人IL-15序列在总共162个密码子中的121个(75％)发生改变。与野生型人IL-15核苷酸序列相比，四十一(41)个密码子没有改变。加框密码子表示根据Seed的分类(美国专利5,786,464)改变为“更优选的”密码子(62个密码子)。下划线的密码子表示根据Seed的分类改变为“次优选的”密码子(10个密码子)，与Seed的方法相反。灰色高亮显示的密码子表示改变为“非优选的”密码子(49个密码子)，也与Seed的方法相反。

图5显示野生型IL-15(wt)(SEQIDNO：1)、IL-15opt1(opt)(SEQIDNO：3)和IL-15opt2(opt-2)(SEQIDNO：4)核酸序列的序列比对。野生型IL-15具有总共162个密码子。在IL-15opt1中，162个密码子中的121个被改变。在IL-15opt2中，162个密码子中的122个被改变。

图6显示野生型IL-15(wt；SEQIDNO：1)、IL-15opt1(opt；SEQIDNO：3)和IL-15opt2(opt-2；SEQIDNO：4)核酸序列的序列比对。编码序列的改进包括使用“优选”密码子或者“次优选”密码子的核苷酸改变，如美国专利5,786,464所定义。IL-15opt1具有72个优选的/次优选的密码子，IL-15opt2具有103个优选的/次优选的密码子。此外，IL-15编码序列的改进包括与美国专利5,786,464所定义方法相反的核苷酸改变。

图7显示具有改进的人IL-15编码序列的质粒在转染的哺乳动物细胞中表达人IL-15蛋白的水平增加。图示的是使用IL-15opt1或者IL-15opt2核酸序列的典型的实验，显示5倍增加。取7次实验的平均，与野生型人IL-15序列的表达相比，实现人IL-15蛋白生成的平均8倍增加。IL-15opt1和IL-15opt2之间没有IL-15蛋白生成的差异。这强调了我们的结论，即不是密码子使用而是RNA序列的改变导致提高的基因表达。

图8显示与野生型人IL-15(SEQIDNO：1)相比，IL-15opt1(SEQIDNO：3)和IL-15opt2(SEQIDNO：4)序列中核苷酸改变的常见位置(高亮显示)。指定的115个核苷酸(高亮显示)位置的改变足以提高人IL-15的mRNA和蛋白表达(与野生型人IL-15相比大概8倍增加)。

图9显示人IL-15信号和/或前肽的修饰导致IL-15的胞外积聚增加。

图10显示改进的与组织纤溶酶原活化因子(tPA)的信号肽和前肽融合的IL-15编码序列极大的提高IL-15在哺乳动物细胞中的生成。从IL-15opt-tPA2(其包含组织纤溶酶原活化因子信号肽和前肽序列)表达IL-15使哺乳动物细胞中的IL-15蛋白生成比改进的IL-15(opt)另外平均增加2.5倍(使用1-3个独立克隆的4次实验的平均)。具有不同替换结构域的其他变异体导致IL-15蛋白生成减少或者没有提高，所述其他变异体只有tPA信号肽(IL-15opt-tPA1)或tPA信号肽与IL-15前肽的组合(IL-15opt-tpA3)。

图11显示与野生型人IL-15(IL-15wt)和改进的IL-15(IL-15opt)相比，来自转染的人293和RD4细胞的IL-15-tPA2的表达提高。

图12显示tPA信号肽-IL-15结合处的改变以产生IL-15合适的N端。与野生型人IL-15(SEQIDNO：5和SEQIDNO：6)相比，IL-15opt-tPA2序列(SEQIDNO：37)在N端(SEQIDNO：38)具有弗林蛋白酶切割位点和4个额外的氨基酸(GARA；SEQIDNO：41)。IL-15opt-tPA5序列(SEQIDNO：39)在紧靠成熟IL-15(SEQIDNO：7和SEQIDNO：8)的N端(SEQIDNO：40)具有弗林蛋白酶切割位点序列(R-X-(K/R)-R)和2个额外氨基酸(GA)。IL15opt＝SEQIDNO：36。对从转染的293细胞的上清获得的IL-15蛋白进行测序，显示在紧靠成熟IL-15N端具有指定的额外氨基酸。

图13显示来自修饰的tPA融合蛋白、IL-15opt-tPA2(opt-tPA2)和IL-15opt-tPA5(opt-tPA5)的IL-15蛋白的相似生成。

图14显示人IL-15(h-IL15)(SEQIDNO：2)和恒河猴(Macacamulatta)IL-15(rh-IL15)(SEQIDNO：15)蛋白具有96％的同一性，相差6个氨基酸。定位诱变用于在人IL-15opt1编码核苷酸序列中引入指定的11核苷酸改变，产生恒河猴IL-15opt编码核苷酸序列。

图15显示人IL-15opt1(huIL-15opt)(SEQIDNO：3)和恒河猴IL-15opt(rhIL-15opt)(SEQIDNO：16)核苷酸序列的比较。在人IL-15opt1的489个核苷酸编码区域引入十一(11)个核苷酸改变。

图16显示恒河猴野生型IL-15(wt)(SEQIDNO：14)和恒河猴改进的IL-15(opt)(SEQIDNO：16)核苷酸序列的比较。核苷酸序列具有71.3％的同一性。

图17显示恒河猴IL-15编码序列的改进导致哺乳动物细胞中恒河猴IL-15的蛋白生成增加大约30倍。用tPA信号肽和前肽序列取代IL-15信号肽和前肽序列还导致进一步的3倍提高，显示两种方法的协同作用。

图18显示改进IL-15编码序列导致人和恒河猴IL-15蛋白生成的显著增加。最终表达的增加对人来说是大约20倍，对恒河猴IL-15来说是大约90-100倍。在人和恒河猴IL-15载体中，用tPA信号肽和前肽序列取代IL-15信号肽和前肽导致哺乳动物细胞中IL-15蛋白生成的另外大约3倍增加。

图19显示利用巨细胞病毒启动子(CMVhuIL-15opt)表达优化的人IL-15的表达载体的图示。

图20显示表达载体CMVhuIL-15(opt1)(SEQIDNO：13)的序列图谱。参见，对应于利用巨细胞病毒启动子(CMVrhIL-15opt)表达优化的恒河猴IL-15的表达载体的SEQIDNO：21。人IL-15＝SEQIDNO：2；卡那霉素标记物＝SEQIDNO：42。

图21显示具有组织纤溶酶原活化因子蛋白的信号肽和前肽序列的优化的人IL-15(huIL-15opt-tPA2)的图示。

图22显示huIL-15opt1-tPA2的核酸序列(SEQIDNO：9)和氨基酸序列(SEQIDNO：10)。参见，对应于具有组织纤溶酶原活化因子蛋白的信号肽和前肽序列的优化的恒河猴IL-15(rhIL-15opt-tPA2)的核酸和氨基酸序列的SEQIDNO：17和SEQIDNO：18。

图23显示具有组织纤溶酶原活化因子蛋白的修饰的信号肽和前肽序列的优化的人IL-15(huIL-15opt-tPA5)的图示。

图24显示huIL-15opt1-tPA5的核酸序列(SEQIDNO：11)和氨基酸序列(SEQIDNO：12)。参见，对应于具有组织纤溶酶原活化因子蛋白的信号肽和前肽序列的优化的恒河猴IL-15(rhIL-15opt-tPA2)的核酸和氨基酸序列的SEQIDNO：19和SEQIDNO：20。

图25显示野生型IL-15序列与RNA输出元件(包括CTE或者RTEm26CTE)的融合导致哺乳动物细胞中IL-15蛋白生成大约2倍的增加。

图26显示与野生型人IL-15可操作的连接到RNA输出元件CTE或者RTEm26CTE相比，改进人IL-15编码序列还使IL-15在人293细胞中的蛋白生成增加5倍，与野生型人IL-15相比，增加10倍。

图27显示与从RNA输出元件CTE或者RTEm26CTE生成的野生型人IL-15相比，改进人IL-15编码序列还使IL-15在293细胞中的蛋白生成增加至少2倍。

图28显示IL-15opt-tPA6和IL-15opt-tPA7中举例说明的tPA-IL-15融合的改变。IL-15opt-tPA6在紧靠成熟IL-15的N端(参见，SEQIDNOs：24和25)具有弗林蛋白酶切割位点序列(R-X-(K/R)-R)和3个额外氨基酸(GAR)。IL-15opt-tPA7在紧靠成熟IL-15的N端(参见，SEQIDNOs：26和27)具有弗林蛋白酶切割位点序列(R-X-(K/R)-R)和一个额外氨基酸(G)。对从转染293细胞的上清获得的IL-15蛋白进行测序，显示在紧靠成熟IL-15N端具有指定的额外氨基酸。肽＝SEQIDNOS：43-46。

图29显示与人IL-15opt-tPA2和人IL-15opt-tPA5相比，改进的人IL-15序列人IL-15opt-tPA6和人IL-15opt-tPA7显示相似的IL-15生成的增加水平。从转染的人293细胞测量由不同改进序列产生的蛋白水平。生成的IL-15蛋白在N端不同，在紧靠N端具有GARA、GAR、GA或者G。表达融合到成熟IL-15端的tPA信号的不同质粒显示相似的改进的IL-15生成水平。

图30显示与恒河猴IL-15opt-tPA2和恒河猴IL-15opt-tPA5相比，改进的恒河猴IL-15序列恒河猴IL-15opt-tPA6和恒河猴IL-15opt-tPA7显示相似的IL-15生成的增加水平。从转染的人293细胞测量由不同改进的序列生成的蛋白水平。数据类似于上文使用改进的人IL-15序列的那些数据。

图31显示人IL-15opt-tPA6的图示。

图32显示人IL-15opt1-tPA6的核酸序列(SEQIDNO：28)和氨基酸序列(SEQIDNO：29)。恒河猴IL-15opt-tPA6的核酸和氨基酸序列分别如SEQIDNOs：32和33所示。

图33显示人IL-15opt-tPA7的图示。

图34显示人IL-15opt1-tPA7的核酸序列(SEQIDNO：30)和氨基酸序列(SEQIDNO：31)。恒河猴IL-15opt-tPA7的核酸和氨基酸序列分别如SEQIDNOs：34和35所示。

图35显示改进的人IL-15受体α(IL15Ra)核酸序列(SEQIDNO：47)的核酸和编码的氨基酸序列(SEQIDNO：48)。

图36显示改进的人IL15Ra核酸序列(SEQIDNO：47)的核酸和编码的氨基酸序列(SEQIDNO：48)。

图37显示改进的人可溶性IL15Ra核酸序列(SEQIDNO：49)的核酸和编码的氨基酸序列(SEQIDNO：50)。

图38显示改进的人可溶性IL15Ra核酸序列(SEQIDNO：49)的核酸和编码的氨基酸序列(SEQIDNO：50)。

图39显示体外使用标准转染方法在人293细胞中共表达IL-15和IL-15受体α改进的序列导致测量到的总IL-15水平显著增加。通过Ca-PO₄共沉淀方法将100nghIL-15(天然(质粒AG32)或者使用tPA前导序列(质粒AG59))(单独的或者与ML15Ra(质粒AG79)组合)与100ngGFP和100ngSEAP一起转染293细胞。48小时后收集细胞，利用QuantikineHumanIL-15，RDsystems进行Elisa以定量培养基(外)和细胞中的IL-15。还给出总IL-15(胞外和胞内)。倍数表明IL-15增加的倍数。

图40显示体外使用标准转染方法在人293细胞中共表达IL-15和IL-15受体α改进的序列导致测量到的总IL-15水平显著增加。利用Superfect将100ng质粒hIL15-tPA6(单独的或者与hIL15受体α(质粒AG79)或者hIL15可溶性受体α(质粒AG98)组合)与100ngGFP和100ngSEAP质粒一起转染人293细胞，所述GFP和SEAP质粒作为转染对照。24和48小时后对培养基取样。48小时后收集细胞，利用QuantikineHumanIL-15(R&Dsystems)进行Elisa以测定IL-15水平。

图41显示当IL-15和IL-15受体DNA在尾静脉注射后被递送到小鼠组织并在其中表达时，肺部NK细胞水平的显著增加以及肺部CD3+CD49+细胞的增加。在分析文件中给出每10⁵个细胞的细胞数量。尾静脉注射后3天对组织进行分析。不同组的小鼠以流体力学法尾静脉注射下列DNA：

GFP，1μg表达绿色荧光蛋白的质粒(对照)；

IL15，1μg表达人IL-15的质粒，利用我们临时申请中描述的质粒hIL15tPA6

Ra，1μg表达人IL-15受体α的质粒

15+Ra2，2μg表达IL-15tPA6的质粒和2μg表达IL-15受体α的质粒

15+Ra1，1μg表达IL-15tPA6的质粒和1μg表达人IL-15受体α的质粒。

图42显示在单独的IL-15、IL-15+IL-15受体α或者IL-15+IL-15可溶性受体α的DNA注射后，小鼠肝脏中NK细胞和T细胞的增加。在分析文件中给出每10⁶个细胞的细胞数量。用胶原酶消化器官以获得单细胞悬浮液，所述器官来自用指定的IL-15tPA6和IL-15受体α质粒DNA注射的小鼠。细胞用抗CD3、CD4、CD8、CD49b、CD44和CD62L的抗体染色，通过流式细胞术分析。小鼠NK细胞被鉴定为CD3-CD49b+表型。IL-15与质粒IL-15tPA6一起注射。共转染IL-15+IL-15R、表达完整L15Ra的质粒。IL-15+IL-15sR、表达可溶性IL-15受体α的质粒与IL-15tPA6共转染。

图43显示脾中效应细胞的增加(左栏和右栏分别为总效应和CD8效应)。CD62L的缺失定义了一群具有效应表型的小鼠记忆T细胞。对来自小鼠的脾进行处理，所述小鼠被注射指定的IL-15和IL-15受体α质粒DNA，细胞用抗CD3、CD4、CD8、CD49b、CD44和CD62L的抗体染色，通过流式细胞术进行分析。

图44显示增加的IL-15水平导致增强的生物效应，所述增加的IL-15水平通过IL15Ra对IL-15的稳定来获得。图41显示的使用所有实验小鼠组的IL-15表达水平与生物效应相关。该图显示IL-15水平与NK细胞、CD3CD49细胞和T细胞水平的相关性，所述水平是DNA注射后3天在肺中测定的。这表明增加的IL-15水平导致诸如肺的外周组织中增强的生物效应，所述增加的IL-15水平通过IL15Ra对IL-15的稳定来获得。

图45显示IL15Ra稳定IL-15。A：在IL-15受体表达质粒IL15Ra或者IL15sRa存在或者缺失的条件下，用IL15tPA6(IL15t)转染的细胞的提取物和培养基中IL-15的测量(ELISA)。测定三份样品，条(bars)代表胞外(Extra)、胞内(Intra)和总IL-15产生的SD。B、C、D：转染后生成的IL-15的Western印迹分析。将三份转染物上样于12％NuPage丙烯酰胺凝胶。B，细胞抽提物；C，转染的293细胞的培养基；D是C的更高曝光以显示IL15t。电泳移动的蛋白被转移到尼龙膜上，通过多克隆抗人IL-15抗体(AF315，R&D，1∶3000稀释)和增强化学发光检测(ECL)显示IL-15。

图46显示IL-15与完整受体α的共转染导致大量结合在细胞表面的IL-15(与IL15Ra复合)，而与可溶性受体α的共转染不是这样。用藻红蛋白标记的抗IL-15抗体(R&D)表面染色后通过流式细胞术分析转染的细胞。转染的293细胞培养基中IL-15的相应水平显示于右边的表格(QuantikineElisa，R&D)。

图47显示IL-15共表达稳定IL15Ra。利用磷酸钙共沉淀法用50ngAG79hIL15Ra或者AG98IL15sRa(单独的或者与AG59hIL15tPA6组合)转染293细胞。72小时后收集细胞；通过凝胶电泳(10％NuPAGE凝胶)和western印迹分析培养基和细胞提取物的IL15Ra生成，所述western印迹使用山羊抗IL15Ra抗体(1∶3000稀释)和过氧化物酶-偶联的兔抗山羊IgG(1∶5000稀释)。全长糖基化的受体α迁移为59kDa条带，而受体α的可溶性胞外部分迁移为42kDa。1∶2和1∶4的样品稀释物按所示上样于顶部以定量生成的受体量。Mock表示只用对照质粒(GFP)转染的293细胞。

图48显示IL15Ra的N-糖基化模式。A：显示IL15Ra和IL15sRa的预测结构。标明不同的结构域。Nglyc表示潜在的N-糖基化位点。B、C：共表达导致更多表面全长受体的生成和更多的IL15sRa分泌到培养基中。共表达还从细胞释放更低糖基化的IL15sRa。这些结果与IL-15存在条件下IL15Ra在细胞表面的快速转运和切割吻合。此外，生成的IL15Ra总量的比较表明IL-15缺失条件下全长受体可能在内涵体途径中快速降解。IL-15缺失条件下，IL15sRa中大部分生成的IL15sRa仍然与细胞结合，迁移为约28kDa的条带，表明它不像全长IL15Ra一样在翻译后被快速加工或者降解。IL-15共表达增加分泌的IL15sRa，同时伴随胞内数量的减少。细胞结合的，1/110提取物上样；培养基，1/450上样。D是C的更高曝光以显示培养基中低水平的IL15sRa(通过单独的IL15Ra生成)。用(+)标明的道包含用N-糖苷酶F(NEB)处理的物质以鉴定生成的受体的N-糖基化程度。

图49A显示小鼠血浆中IL-15的生成，所述小鼠被注射了指定的不同DNA表达载体。与优化的载体(IL15t，IL15tPA6)相比，IL-15的野生型cDNA表达载体(IL15wt)的注射导致低水平表达，所述优化载体使体内血浆的IL-15增加约100倍。为测量野生型载体的IL-15，该实验中每只小鼠被注射1μgDNA。IL15Ra或者IL15sRa质粒对小鼠的共注射导致血浆IL-15水平额外约100倍的增加(10⁶-倍总增加)。有趣地，尽管利用表达IL15sRa的构建体IL-15的峰值产量是最高的，血浆水平反而降低得更快。因此与全长IL15Ra的共注射导致IL-15更加延长的血浆水平，与细胞表面更缓慢的切割和释放吻合。■IL-15野生型；△具有tPA6SIGPRO肽的改进的IL-15(IL15t，也称为IL15tPA6)；○IL15t和完整IL15Ra；◇IL15t和可溶性IL15Ra。

图49B显示当以1∶3比例(w/w)给予编码IL-15和ILRa的核酸载体时，IL-15的血浆浓度提高。对于每种质粒小鼠均被注射0.2μgDNA，除了15+Ra3组，它注射0.2IL-15质粒和0.6IL15Ra质粒。条显示SD。过量的全长受体导致IL-15在血浆中的停留延长，如第3天的高水平所示。因此，与sRa的共表达导致血浆IL-15的最高峰值，而与全长Ra的共表达导致更加延长的IL-15水平和可能的功能。这可能源于与受体结合的表面IL-15在sRa/IL-15复合物的切割和生成时更缓满的释放。这种复合物是有生物活性的，如共表达的IL-15/sRa的活性所示，其只生成可溶性复合物。△具有tPA6SIGPRO肽的改进的IL-15(IL15t)；○IL15t和完整IL15Ra(15+Ra)；●1∶3(w/w)比例的IL15t和完整IL15Ra(15+Ra3)；◇IL15t和可溶性IL15Ra(15+sRa)。

图50显示用指定的DNA进行DNA注射后3天肠系膜淋巴结和脾的大小。GFPDNA表达载体被用作阴性对照。与脾相比，单独的IL-15(IL15t)表达更显著增加肠系膜淋巴结的大小。这可能是IL15Ra在淋巴结中高表达的结果，所述淋巴结保留血浆IL-15。还给出第3天测量的血浆IL-15水平。

图51显示IL15Ra和IL15sRa是O-糖基化的。O-糖苷酶(Roche)的处理表明受体α的分泌形式是O-糖基化的。用O-糖苷酶(标为+的道)处理来自用指定构建体转染的293细胞的培养基并和未处理的物质(-)进行比较。

图52显示在以流体力学法DNA递送指定的质粒到小鼠尾静脉后3天，肺部NK细胞增加。不同组的小鼠被注射0.1μg表达IL-15tPA6、IL-15tPA6+IL15Ra(全长受体α)、IL-15tPA6+IL15sRa(可溶性受体α)的质粒。标为IL15t+Ra.3的组接受0.1μgIL-15tPA6和0.3μgIL15Ra质粒(1∶3(w/w)比例的IL-15和IL15Ra)。IL-15与受体DNA的这种比例(大约1∶3)显示有更多肺NK细胞的倾向。单独的IL-15和IL-15+sRa之间的差异是显著的(P＜0.01，单向方差分析，邓奈特(Dunnett)多次对比检验)。

图53显示在恒河猴肌肉注射DNA后的血浆IL-15浓度(pg/ml)。在指定的天数通过Elisa(Quantiglo，R&D)测量恒河猴血浆中IL-15的平均血浆值。如箭头所示，在第0、14和28天对每只恒河猴进行单次IM注射然后用Advisys系统(Woodlands，TX，advisys.net)进行电穿孔。显示接受IL-15/15受体α(IL15/Ra，圆圈)组合或者只接受IL-15表达载体(IL15，三角形)的3只恒河猴的平均值。结果显示IL15/15Ra载体组合显著增加IL-15的血浆水平，而单独的IL-15载体没有增加。

图54显示IL-15/15RaDNA载体的肌内注射导致血浆IL-15水平的增加。6只恒河猴在单个位点被肌内注射恒河猴IL-15/15RaDNA表达载体。第0和14天的两次DNA注射利用每种质粒的100μg(动物M100、M115、M120)或者250μg(动物M122、M125、M126)进行。使用恒定电流脉冲图形，在0.5安培、52毫秒脉冲长、80秒延迟时间的条件下，利用Advisys电穿孔系统将DNA(0.5ml)电穿孔进肌肉。结果显示在第一次接种期间，4/6恒河猴的血浆IL-15水平升高，第二次接种期间6/6恒河猴血浆IL-15水平升高。

图55显示两次免疫后第4、5、19和20天的IL-15血浆ELISA。用IL-15/15Ra一起进行DNA疫苗接种后测量恒河猴血浆中的IL-15浓度(pg/ml)。5只恒河猴(M529、M531、M579、M581、M583)在第0和15天进行电穿孔，在第4、5、19和20天获取血浆，通过IL-15ELISA进行分析。相同研究中的3只动物(M530、M573、M575；虚线)不进行免疫，用作对照。5只电穿孔动物中的4只显示血浆IL-15的显著增加，而1只动物(529M)不显示。

图56显示IL15/15Ra增强抗SIV的特异免疫应答，并且参与多功能抗原-特异细胞因子生成细胞(IFNγ和IL-2)和效应细胞的产生。(顶部3栏)：在分别用gag、env、nef、pol和tat的肽库体外刺激时，每百万淋巴细胞中的IFNγ生成细胞。在第0、4、8周3只恒河猴用编码SIV抗原、IL-15和IL15Ra的DNA载体混合物接种，如所示每2周分离和检测PBMC。(底部栏)：第11-21周(疗法结束后2周)每百万淋巴细胞中的SIV特异IL-2生成T细胞。分离PBMC，并在体外用对应于SIVmac239的gag、env、nef、tat或者pol蛋白的肽库进行刺激。第11周是第一次在这些恒河猴中检测到多功能的分泌IL-2的SIV特异细胞。这些动物参与先前的免疫治疗实验，但之前不具有IL-2生成细胞。

图57显示第三次疫苗接种后2周在接种DNA的恒河猴中存在循环的多功能中央记忆(CM)和效应记忆(EM)细胞。CM细胞被定义为CD28+CD45RA-。EM细胞是CD28-CD45RAlow/+。

图58显示协同表达IL-15和IL15Ra的构建体图谱。

图59显示协同表达IL-15tPA6和IL15Ra的构建体图谱。

图60显示协同表达IL-15tPA6和IL15sRa的构建体图谱。

详细说明

1.引言

发现细胞因子白介素-15以编码核酸或者蛋白的形式作为免疫细胞刺激剂(例如，淋巴细胞扩增和活化)和疫苗佐剂的用途。天然IL-15编码序列没有最优表达IL-15，这是因为若干不同的理由，包括RNA序列内的信号，例如嵌入编码序列内的潜在剪接位点和低稳定性的决定子(通常A/T或者AAJ富集的)序列。通过将IL-15序列的剪接位点和低稳定性序列减到最少，IL-15蛋白的表达与天然哺乳动物IL-15序列的表达相比可以增加差不多4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、30倍或者更高。用于该目的的一般方法已经建立，包括将若干编码mRNA的密码子变为编码相同氨基酸的可选择的密码子(参见，例如5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498，为了所有目的其中公开的内容在此完整以引用的方式并入本文)。这导致任何嵌入RNA的负作用信号的改变，但不改变生成的蛋白。

通过将天然IL-15信号肽和/或前肽序列与异源蛋白(包括例如，组织纤溶酶原活化因子、生长激素或者免疫球蛋白)的信号肽和/或前肽序列交换可以进一步增加IL-15蛋白在哺乳动物细胞中的生成。利用融合到异源信号肽和/或前肽的成熟IL-15的改进的编码序列，IL-15在哺乳动物细胞中的表达水平与野生型IL-15序列的表达相比可以增加20倍、40倍、50倍、70倍、90倍或者更高，与具有天然信号肽和/或前肽序列的改进的IL-15编码序列的表达相比额外增加2倍、3倍、4倍、5倍或者更高(参见图1)。

2.核酸序列

本发明改进的高表达IL-15核酸序列通常基于天然哺乳动物白介素-15编码序列作为模板。编码天然白介素-15的核酸序列可以非常方便的在公开可利用的数据库中发现，所述数据库包括世界范围内可利用的核苷酸、蛋白和科学数据库。

详细说明

1.引言

发现细胞因子白介素-15以编码核酸或者蛋白的形式作为免疫细胞刺激剂(例如，淋巴细胞扩增和活化)和疫苗佐剂的用途。天然IL-15编码序列没有最优表达IL-15，这是因为若干不同的理由，包括RNA序列内的信号，例如嵌入编码序列内的潜在剪接位点和低稳定性的决定子(通常A/T或者AAJ富集的)序列。通过将IL-15序列的剪接位点和低稳定性序列减到最少，IL-15蛋白的表达与天然哺乳动物IL-15序列的表达相比可以增加差不多4倍、5倍、6倍、8倍、10倍、15倍、20倍、30倍或者更高。用于该目的的一般方法已经建立，包括将若干编码mRNA的密码子变为编码相同氨基酸的可选择的密码子(参见，例如5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498，为了所有目的其中公开的内容在此以参考的方式完整并入本文)。这导致任何嵌入RNA的负作用信号的改变，但不改变生成的蛋白。

2.核酸序列

本发明改进的高表达IL-15核酸序列通常基于天然哺乳动物白介素-15编码序列作为模板。编码天然白介素-15的核酸序列可以非常方便的在公开可利用的数据库中发现，所述数据库包括国家生物技术信息中心在万维网ncbi.nlm.nih.gov上提供的核苷酸、蛋白和科学数据库。天然IL-15核酸序列可以方便的从许多哺乳动物组织中克隆，所述哺乳动物组织包括胎盘、骨骼肌、肾、肺、心脏和单核细胞/巨噬细胞(参见，Grabstein，等人，Science(1994)264：965)。用于所需免疫细胞群的分离和刺激的实验步骤是本领域公知的。参见，例如，CurrentProtocolsinImmunology(免疫学实验室指南)，Coligan，等人，eds.，1991-2006，JohnWiley&Sons。

根据同时调整影响mRNA运输、稳定性和表达的若干因素的方法对序列进行修饰。改变密码子以改变总的mRNAAT(AU)-含量、以将潜在剪接位点减到最少或者全部去除、以改变任何其他的抑制序列和已知对mRNA稳定性有负面影响的影响mRNA稳定性和加工的信号，例如连续的A或者T/U核苷酸、AATAAA、ATTTA和密切相关的变异序列。本申请中用于IL-15编码核酸序列的方法已经在美国专利6,794,498、6,414,132、6,291,664、5,972,596、和5,965,726中描述，为所有目的其中每个公开内容在此以引用的方式完整并入本文。

通常，编码IL-15序列的核苷酸碱基或者密码子的变化不改变包括IL-15蛋白的氨基酸序列，所述IL-15蛋白来自于天然IL-15蛋白。改变基于遗传密码的简并性，利用相同氨基酸的可选择的密码子，如上面表1所概述。在某些实施方式中，需要改变一种或者多种密码子以编码相似的氨基酸残基而不是相同的氨基酸残基。编码氨基酸残基的适用保守取代如上所述。

通常，在实现增强IL-15编码序列稳定性的本方法中，特定氨基酸的A/T相对更富集的密码子被替换为编码相同氨基酸的G/C相对更富集的密码子(参见，例如图2和4)。例如，由A/T相对更富集的密码子和G/C相对更富集的密码子编码的氨基酸如表2所示。

表2

根据引入改变的数量，本发明改进的IL-15和/或IL-15Ra核酸序列可以方便地作为全合成序列制备。用于构建编码蛋白的合成核酸序列或者合成基因序列的技术是本领域公知的。合成基因序列可以商业化购买自许多服务公司的任意一家，包括DNA2.0(MenloPark，CA)、Geneart(Toronto，Ontario，Canada)、CODAGenomics(Irvine，CA)、和GenScript，Corporation(Piscataway，NJ)。作为选择，密码子改变可以利用本领域公知的技术引入。还可以例如通过体外位点特异的诱变作用或者通过PCR或者通过本领域已知的适于特异改变核酸序列的任何其他遗传工程方法进行修饰。体外诱变实验步骤描述于，例如，InVitroMutagenesisProtocols(体外诱导突变实验手册)，Braman，ed.，2002，HumanaPress，和Sankaranarayanan，ProtocolsinMutagenesis(诱导突变实验手册)，2001，ElsevierScienceLtd。

通过改变整个天然IL-15和/或IL15Ra核酸序列的选择密码子、或者通过改变5′端、3′端或者中间子序列内的密码子，可以构建高水平表达的改进的IL-15和/或IL15Ra序列。没有必要每个密码子都被改变，但是足够数量的密码子被改变使得在相同条件下改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列的表达(即，转录和/或翻译)比天然IL-15和/或IL15Ra核酸序列的表达多至少约10％、25％、50％、75％、1倍、2倍、4倍、8倍、20倍、40倍、80倍或者更高。可以随时间或者在指定终点检测表达，使用本领域技术人员已知的技术，例如，使用凝胶电泳或者液相或者固相结合反应中的抗IL-15或者抗IL15Ra抗体(例如，ELISA、免疫组织化学)。白介素-15ELISA检测试剂盒由以下公司商品化供应，例如，RayBiotech，Norcross，GA；AntigenixAmerica，HuntingtonStation，NY；eBioscience，SanDiego，CA；Biosource(Invitrogen)，Camarillo，CA；R&DSystems(Minneapolis，MN)和PeproTech，RockyHill，NJ。

通常至少大约50％的图8所标识位置的改变的核苷酸或者密码子被变为另一种核苷酸或者密码子使得相同或者相似的氨基酸残基被编码。在其他实施方式中，至少大约60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、95％、97％、98％、99％的图8中所标识的改变的密码子被变为另一种核苷酸或者密码子使得相同或者相似的氨基酸残基被编码。

为了改进IL-15核酸序列，如图8所标识的可以改变的核苷酸位置是6、9、15、18、21、22、27、30、33、49、54、55、57、60、63、69、72、75、78、81、84、87、90、93、96、105、106、114、120、123、129、132、135、138、141、156、159、162、165、168、169、174、177、180、183、186、189、192、195、198、204、207、210、213、216、217、219、222、228、231、237、246、252、255、258、261、277、283、285、291、294、297、300、306、309、312、315、318、321、324、327、330、333、336、339、351、354、363、364、369、372、375、384、387、390、393、396、402、405、414、423、426、429、432、435、438、442、450、453、456、459、462、468、483和486。

当使用本方法时，与天然IL-15核酸序列相比，改进的IL-15核酸序列的GC含量通常增加。例如，改进的IL-15核酸序列的GC含量是至少大约50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％或者更高。

在一些实施方式中，天然IL-15信号肽(SIG)序列或者信号肽和前肽(SIG-PRO)序列被替换为异源蛋白(即，除IL-15以外的蛋白)的分泌SIG序列或者SIG-PRO序列(参见，例如，图9)。示例性的信号肽和前肽序列包括那些来自组织纤溶酶原活化因子(tPA)蛋白、生长激素、GM-CSF和免疫球蛋白的信号肽和前肽序列。组织纤溶酶原活化因子信号肽和前肽序列是本领域已知的(参见，Delogu，等人，InfectImmun(2002)70：292；GenBank登录号E08757)。生长激素信号肽和前肽序列也是本领域已知的(参见，Pecceu，等人，Gene(1991)97：253；GenBank登录号M35049和X02891)。免疫球蛋白信号肽和前肽序列，例如免疫球蛋白重链的信号肽和前肽序列，也是本领域已知的(参见，Lo，等人，ProteinEng.(1998)11：495和GenBank登录号Z75389和D14633)。信号肽-IL-15融合蛋白和SIG-PRO-IL-15融合蛋白可具有被位点特异性蛋白酶识别的切割序列，所述切割序列被掺入融合蛋白的1个或者多个位点，例如，紧挨在成熟IL-15的N端氨基酸残基之前。被位点特异性蛋白酶识别的大量切割序列是本领域已知的，包括那些弗林蛋白酶、凝血酶、肠激酶、因子Xa等等的切割序列。

在一个实施方式中，天然IL-15信号肽和前肽序列被替换为tPA的信号肽和前肽序列序列。在另一个实施方式中，tPASIG-PRO序列被改变以去除一个或者多个氨基酸残基和/或掺入蛋白酶切割位点(例如，凝血酶、肠激、，因子Xa)。参见，图12。

在一些实施方式中，天然IL15Ra信号肽(SIG)序列或者信号肽和前肽(SIG-PRO)序列被替换为异源蛋白(即，除IL15Ra以外的蛋白)的分泌SIG序列或者SIG-PRO序列。示例性的信号肽和前肽序列包括上述讨论的那些，例如，组织纤溶酶原活化因子(tPA)蛋白、GM-CSF、生长激素和免疫球蛋白。在一些实施方式中，IL15Ra核酸序列不编码免疫球蛋白序列，例如，可操作连接的Fc序列。

一旦已经构建了高水平表达的改进的IL-15核酸序列，它在经受进一步处理以便插入到一种或者多种表达载体前可以被克隆入克隆载体，例如TA克隆载体(Invitrogen，Carlsbad，CA)。改进的IL-15核酸序列的处理，包括重组修饰和纯化，可以使用本领域公知的步骤进行。这种步骤已经公开于，例如，SambrookandRussell，MolecularCloning：ALaboratoryManual(分子克隆：实验室手册)，2000，ColdSpringHarborLaboratoryPress和CurrentProtocolsinMolecularBiology(分子生物学现行规范)，Ausubel，等人，eds.，1987-2006，JohnWiley&Sons。

3.表达载体

从包含改进的IL-15和/或IL15Ra编码序列的表达载体可以重组表达IL-15和IL15Ra序列。可以改进IL-15和/或IL15Ra编码序列中的一个或者两个。本发明的表达载体具有表达盒，所述表达盒将在哺乳动物细胞中表达IL-15和IL15Ra中的一个或者两个。IL-15和IL15Ra可以表达自同一个载体或者多个载体。IL-15和IL15Ra可以表达自同一载体的一个或者多个表达盒(例如，具有内部核糖体进入位点的单个表达盒；或者使用两个启动子和两个polyA位点的双表达盒)。在每个表达盒内，编码IL-15和IL15Ra的序列被可操作的连接到表达调控序列。“可操作连接的”序列包括与感兴趣的核酸邻接的表达操纵序列和以反式作用或者间隔一段距离控制感兴趣的基因的表达操纵序列。表达操纵序列包括合适的转录起始、终止、启动子和增强子序列序列；有效的RNA加工信号例如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；促进RNA输出的序列(例如，组成性转运元件(CTE)，RNA转运元件(RTE)，或者其组合，包括RTEm26CTE)；增强翻译效率的序列(例如，Kozak共有序列)；增强蛋白稳定性的序列；和当需要时，增强蛋白分泌的序列。

任选地表达载体还具有用于表达选择性标记物的第3个独立的表达载体。选择性标记物是本领域公知的，可以包括，例如，对抗生素具有抗性的蛋白、荧光蛋白、抗体表位等等。示例性的对抗生素具有抗性的标记物包括编码β-内酰胺酶的序列(抗β-内酰胺，包括青霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素)，或者编码对四环素、氨基糖苷类(例如，卡那霉素，新霉素)抗性的序列等等。示例性的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和红色荧光蛋白。

一个或者多个表达盒中包括的一个或者多个启动子应当促进IL-15和/或IL15Ra多肽在哺乳动物细胞中的表达。一个或者多个启动子可以是病毒、组成性或者可诱导的天然哺乳动物肿瘤病毒，或者优选地在特定组织类型或者细胞类型(例如，“组织特异的”)中可调控IL-15和/或IL15Ra的转录。

“组成性”启动子是一种在大部分环境和发育条件下都具有活性的启动子。哺乳动物细胞中示例性的组成性启动子包括肿瘤病毒启动子(例如，猿巨细胞病毒(CMV)、人CMV、猴病毒40(SV40)、劳氏肉瘤病毒(RSV))、免疫球蛋白元件(例如，IgH)的启动子、“管家”基因(例如，β-肌动蛋白、二氢叶酸还原酶)的启动子。

在另一个实施方式中，需要可诱导的启动子。“可诱导的”启动子是一种在环境或者发育调控中具有活性的启动子。可诱导的启动子是被外源供给化合物调控的那些启动子，包括但不限于，锌-诱导的金属硫蛋白(MT)启动子；异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的启动子，地塞米松(Dex)诱导的小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)启动子；四环素-阻遏系统(Gossen等人，Proc.Natl.Acad.SciUSA，89：5547-5551(1992))；四环素诱导系统(Gossen等人，Science，268：1766-1769(1995)；还可参见Harvey等人，Curr.Opin.Chem.Biol.，2：512-518(1998))；RU486-诱导系统(Wang等人，Nat.Biotech.，15：239-243(1997)和Wang等人，GeneTher.，4：432-441(1997))；和雷帕霉素诱导系统(Magari等人J.Clin.Invest.，100：2865-2872(1997))。可用于本文的其他类型的可诱导启动子是那些通过特定生理状态，例如，温度、急性期，调控的或者只存在于复制细胞中的启动子。

在另一个实施方式中，可以使用哺乳动物IL-15的天然启动子。当期望改进的IL-15序列的表达模拟天然表达时，天然启动子可以是优选的。当改进的IL-15和/或IL15Ra的表达必须被暂时或者发育的调控、或者以组织特异方式调控、或者响应特异转录刺激时，可以使用天然启动子。在另一个实施方式中，其他天然表达控制元件，例如增强子元件、多腺苷酸化位点或者Kozak共有序列，也可用于模拟天然IL-15和/或IL15Ra的表达。

在另一个实施方式中，改进的IL-15和/或IL15Ra序列可以可操作的连接到组织特异启动子。例如，如果期望在淋巴细胞或者单核细胞中表达，应当分别使用在淋巴细胞或者单核细胞中有活性的启动子。已知许多组织的组织特异启动子的实例，包括肝(白蛋白，Miyatake等人，J.Virol.，71：5124-32(1997)；乙肝病毒核心启动子，Sandig等人，GeneTher.，3：1002-9(1996)；甲胎蛋白(AFP)，Arbuthnot等人，Hum.GeneTher.7：1503-14(1996))、骨(骨钙素，Stein等人，Mol.Biol.Rep.，24：185-96(1997)；骨唾液蛋白，Chen等人，J.BoneMiner.Res.，11：654-64(1996))、淋巴细胞(CD2，Hansal等人，J.Immunol.，161：1063-8(1998)；免疫球蛋白重链；T细胞受体α链)、神经元(神经元特异性烯醇酶(NSE)启动子，Andersen等人Cell.Mol.Neurobiol.，13：503-15(1993)；神经微丝轻链基因，Piccioli等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，88：5611-5(1991)；神经元特异性vgf基因，Piccioli等人，Neuron，15：373-84(1995))等等。

在一些实施方式中，改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列被可操作的连接到一种或者多种mRNA输出序列。示例性的mRNA输出元件包括组成性转运元件(CTE)，其对猿D型逆转录病毒未剪切的RNA的核-细胞质输出非常重要。另一个示例性的RNA输出元件包括RNA转运元件(RTE)，其存在于啮齿类动物池内A颗粒反转录因子的亚群中。CTE和RTE元件可以单独或者组合使用。在一个实施方式中，RTE是RTEm26(例如，SEQIDNO：22)。在一个实施方式中，RTEM26和CTE位于表达盒编码的转录产物的3′-未翻译区域。通常，RTE和CTE间隔100个核苷酸或者更少。在一些实施方式中，RTE和CTE间隔30个核苷酸或者更少。在一个实施方式中，RTE和CTE被包括在SEQIDNO：23所列的序列(RTEm26CTE)。用于进一步增加改进的IL-15序列表达的RNA转运元件描述于，例如，国际专利出版号WO04/113547，为所有目的其内容在此以参考的方式完整并入本文。

4.哺乳动物细胞

本发明的表达载体可以在哺乳动物宿主细胞中表达。宿主细胞可以位于宿主体内或者体外。例如，包含高水平表达IL-15和/或IL15Ra核酸序列的表达载体可以被转染入体外培养的哺乳动物宿主细胞，或者递送到哺乳动物宿主体内的哺乳动物宿主细胞。

可用于表达改进的IL-15和/或IL-15Ra核酸序列的示例性宿主细胞包括哺乳动物原代细胞和建立的哺乳动物细胞系，包括COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HEK293-T、RD和PCI2细胞。用于从高水平表达的改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列表达IL-15和/或IL15Ra蛋白的哺乳动物宿主细胞由例如，AmericanTypeTissueCollection(美国典型培养物保藏中心)(ATCC)，Manassas，VA，商品化供应。用于哺乳动物细胞体外培养的实验步骤也是本领域公知的。参见，例如，HandbookofIndustrialCellCulture：Mammalian，Microbial，andPlantCells(工业化细胞培养手册：哺乳动物、微生物和植物细胞)，Vinci，等人，eds.，2003，HumanaPress和MammalianCellCulture：EssentialTechniques(哺乳动物细胞培养：基本方法)，DoyleandGriffiths，eds.，1997，JohnWiley&Sons。

体外转染哺乳动物宿主细胞和表达重组核酸序列的实验步骤是本领域公知的。参见，例如，SambrookandRussell和Ausubel，等人，上述；GeneDeliverytoMammalianCells：NonviralGeneTransferTechniques(基因递送到哺乳动物细胞：非病毒基因转移技术)，MethodsinMolecularBiologyseries，Heiser，ed.，2003，HumanaPress和Makrides，GeneTransferandExpressioninMammalianCells(哺乳动物细胞中基因转移和表达)，NewComprehensiveBiochemistryseries，2003，ElsevierScience。重组载体可以瞬时或者稳定转染哺乳动物宿主细胞，所述哺乳动物宿主细胞被修饰以表达改进的IL-15核酸序列。改进的IL-15和/或IL15Ra序列可以是外遗传的或者染色体整合的。

5.改进的IL-15和/或IL15Ra序列的给药

高水平表达改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列适于单独给予个体，例如治疗免疫缺陷(例如，促进淋巴细胞的扩增，所述淋巴细胞包括B细胞，T细胞，NK细胞和NKT细胞)，或者作为与一种或者多种疫苗抗原共递送的佐剂。IL-15和/或IL15Ra用于免疫缺陷治疗和作为佐剂的用途是本领域已知的(参见，例如，Diab，等人，上述；Ahmad，等人，上述和AlpdoganandvandenBrink，上述)。

在一个实施方式中，高水平表达改的进IL-15和/或IL15Ra核酸序列与一种或者多种疫苗抗原共给药，其中至少改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列作为裸露DNA递送。一种或者多种抗原可以采用一种或者多种多肽抗原或者编码一种或者多种抗原的核酸形式递送。裸露DNA疫苗通常是本领域已知的；参见，Wolff等人，Science(1990)247：1465；Brower，NatureBiotechnology(1998)16：1304和Wolff等人，AdvGenet(2005)54：3。使用核酸作为DNA疫苗的方法对本领域普通技术人员来说是公知的。参见，DNAVaccines(DNA疫苗)，Ertl，ed.，2003，KluwerAcademicPub和DNAVaccines：MethodsandProtocols(DNA疫苗：方法和步骤)，LowrieandWhalen，eds.，1999，HumanaPress。该方法包括将编码一种或者多种抗原的核酸置于启动子控制之下以便在患者中表达。共给药高水平表达改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列还增强抗一种或者多种抗原的免疫应答。不受理论约束，在DNA疫苗编码的多肽表达后，诱导出细胞毒性T细胞、辅助T细胞和抗体，它们识别并破坏或者消除表达抗原的细胞或者病原体。

在一个实施方式中，IL-15和/或IL15Ra序列中的一个或者两个作为蛋白共给药。

本发明关注了在生理学可接受载体中包括改进的IL-15和/或IL15Ra氨基酸和核酸序列的组合物。尽管本领域普通技术人员已知的任意合适的载体均可用于本发明的药物组合物，但载体的类型将根据给药方式而不同。对于肠胃外给药，包括鼻内、真皮内、皮下或者肌内注射或者电穿孔，载体优选地包括水、盐水、和可选的醇、脂肪、聚合物、蜡、一种或者多种稳定氨基酸或者缓冲液。常规配制技术是本领域技术人员已知的(参见，例如，Remington：TheScienceandPracticeofPharmacy(雷明顿：药物科学与实践)(20thedition)，Gennaro，ed.，2000，LippincottWilliams&Wilkins；InjectableDispersedSystems：Formulation，ProcessingAndPerformance(可注射的分散系统：制剂、配制和性能)，Burgess，ed.，2005，CRCPress和PharmaceuticalFormulationDevelopmentofPeptidesandProteins(肽和蛋白的药物制剂开发)，Frkjr等人，eds.，2000，Taylor&Francis)。

通过注射，通常通过动脉内、静脉内、皮下或者肌内途径，裸露DNA可以在溶液中(例如，磷酸盐缓冲盐水溶液)递送。通常，对于典型的70公斤患者，裸露核酸组合物的剂量从大约10μg到10mg。对于正常健康的70kg患者，裸露核酸(通常是编码融合蛋白的DNA)的皮下或者肌内剂量范围从0.1mg到50mg。

可以给予DNA疫苗接种一次或者多次。在一些实施方式中，当需要诱导想要的应答时(例如，特异抗原应答或者免疫细胞的增殖)，改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列被给药不止一次，例如，2、3、4、5、6、7、8、10、15、20或者更多次。可以进行多次给药，例如，根据需要每两周一次、每周一次、每两月一次、每月一次、或者更频繁或者稍不频繁，使时段足以实现所需应答。

在一些实施方式中，通过基于脂质体的方法、电穿孔或者基因枪粒子加速给予改进的IL-15和/或IL15Ra核酸组合物。可以使用体内将DNA递送入细胞的递送装置(例如，“基因枪”)。这种装置是商品化供应的(例如，BioRad，Hercules，CA，ChironVaccines，Emeryville，CA)。还可以通过将DNA与阳离子络合把裸露DNA引入细胞，所述阳离子例如多聚赖氨酸，其被偶联到细胞表面受体的配体(参见，例如，Wu，G.andWu，C.H.(1988)J.Biol.Chem.263：14621；Wilson等人(1992)J.Biol.Chem.267：963-967和美国专利5,166,320、6,846,809、6,733,777、6,720,001、6,290,987)。用于递送裸露DNA到哺乳动物宿主细胞的脂质体制剂由例如，EncapsulaNanoSciences，Nashville，TN商品化供应。用于递送裸露DNA到哺乳动物宿主细胞的电穿孔装置由例如，InovioBiomedicalCorporation，SanDiego，CA商品化供应。

改进的IL-15和/或IL15Ra核酸疫苗组合物被给药于哺乳动物宿主。哺乳动物宿主通常是人或者灵长类动物。在一些实施方式中，哺乳动物宿主可以是家畜，例如，犬、猫、兔类、啮齿目、鼠属、仓鼠、小鼠。在其他实施方式中，哺乳动物宿主是农业动物，例如，牛、绵羊、猪、马等等。

6.在哺乳动物细胞中表达IL-15和/或IL15Ra的方法

本发明的方法用于在哺乳动物细胞中表达IL-15和/或IL15Ra，通过将重组载体引入细胞以表达此处描述的高水平改进的IL-15和/或IL15Ra核酸序列。修饰的哺乳动物细胞可以位于体外或者哺乳动物体内。

应了解此处描述的实施例和实施方式只是用于说明目的，根据其启示的不同改变或者变化是本领域技术人员能够想到的，包括在本申请的精神实质和范围内以及所附权利要求范围内。为所有目的，所有此处引用的出版物、专利和专利申请均以参考的方式完整并入本文。

实施例

下列实施例用于说明，但不是限制所要求保护的发明。

实施例1

在IL-15序列中引入核苷酸改变的策略是同时调整影响mRNA运输、稳定性和表达的若干因素。改变密码子以改变总的mRNAAT(AU)-含量或者去除RNA内任意其他抑制信号，例如所有潜在剪接位点(例如在网站例如fruitfly.org/seq_tools/splice.html或者sunl.softberry.com/berry.phtml上可以发现计算机程序预测的潜在剪接位点)，以及改变已知对mRNA有负面影响的序列，例如连续的A或者T/U核苷酸、AATAAA、ATTTA和密切相关的变异序列。通过用编码相同氨基酸的不同密码子取代密码子，选择的密码子可以是GC更富集的，或者具有足以改变RNA结构的不同序列。该方法已经在数个专利中描述，其中每一个均在此以参考的方式完整并入本文：美国专利5,965,726、5,972,596、6,174,666、6,291,664、6,414,132和6,794,498。

步骤

使用标准实验室技术产生、纯化和测序质粒DNA。利用钙共沉淀技术(293细胞)和对于RD4细胞使用SuperFectReagent实验步骤(Qiagen)，1微克(1μg)包含指定IL-15编码序列的质粒被转染入人293或者RD细胞，所述细胞在前一天以106细胞浓度种于60mm板。2-3天后，使用商品化试剂盒(R&Dsystem)测量胞内和胞外以及总的IL-15蛋白。因为人和恒河猴IL-15蛋白的高同源性，利用相同的商品化ELISA试剂盒测量它们的蛋白水平。不同实验的结果显示于图7、10、11、13、25、26和27。

实施例2

本发明证明IL-15受体α和IL-15受体α的可溶(胞外)部分(IL15sRa)的改进表达序列。这些改进序列增加IL-15受体α的蛋白表达，并提供一种在体内和体外进一步优化IL-15活性的方法。

结果

图39和40显示体外使用标准转染方法在人293细胞中共表达IL-15和IL-15受体α的优化序列导致测量到的总IL-15水平显著增加。这种增加是稳定IL-15分子的结果，通过结合完整IL-15受体α或者IL-15受体α的胞外部分。如果IL-15和受体通过两个不同的质粒表达或者通过单个质粒的两个不同启动子表达，结果是相似的。

图41显示当IL-15和IL-15受体DNA在尾静脉注射后被递送到小鼠组织并在其中表达时，肺部NK细胞水平的显著增加以及肺部CD3+CD49+细胞的增加。在分析文件中给出每10⁵个细胞的细胞数量。

图42显示在单独IL-15、IL-15+IL-15受体α或者IL-15+IL-15可溶性受体α的DNA注射后，小鼠肝脏中NK细胞和T细胞的增加。在分析文件中给出每10⁶个细胞的细胞数量。

图43显示脾中效应细胞的增加(分别为总效应和CD8效应)。CD62L的缺失定义了一群具有效应表型的小鼠记忆T细胞。

图44显示增加的IL-15水平导致增加的生物效应，所述增加的IL-15水平通过IL15Ra对IL-15的稳定来获得。

方法：

在培养细胞中表达

用0.1μg单独的人IL15tPA6OPT质粒或者与0.1μg表达人IL-15受体α全长形式(huIL15RaOPT)或者可溶形式(husIL15RaOPT)的RNA优化形式的质粒一起转染人293细胞。转染后第24和48小时取出培养基，第48小时收集细胞。在从细胞释放前利用Quantikine人IL-15免疫测定法(R&Dsystems)测量IL-15水平。

在小鼠中表达

通过肌内途径注入两个四头肌或者以流体力学法通过尾静脉向6周龄Balb/c小鼠注射DNA。对于流体力学法DNA递送，用溶于1.6ml无菌0.9％NaCl的1μg单独的人IL15-tPA6OPT质粒或者与1μg表达人IL-15受体α完整形式(huIL15RaOPT)或者可溶形式(husIL15RaOPT)的质粒一起通过尾静脉注射小鼠。3天后，处死小鼠，利用商品化的化学发光免疫测定法(Quantiglo，R&D)测量血浆中的IL-15水平。利用多色FACS测量肝、脾和肺中的IL-15生物活性。简单来说，细胞用下列组的偶联的大鼠抗-小鼠抗体进行离体染色：APCCy7-CD3、PerCP-CD4、PECy7-CD8、APC-CD44、FITC-CD49b和PE-CD62L、BD-Pharmingen，通过流式细胞术分析。小鼠NK细胞被鉴定为CD3-CD49b+表型。

实施例3

该实施例证明IL-15和IL-15受体α的相互稳定作用。数据证明IL-15和IL15Ra内源性组合生成使两个分子可以有效地结合成功能性分泌形式。

在IL-15存在的条件下，IL-15受体α被快速递送到细胞表面(参见，图46)，并且它还被快速切割(参见，图47)。因此，完整受体的表达导致快速成为可溶性受体/IL-15复合物，其被释放到循环中，并且可以在远处组织中起作用。

该实施例跟踪IL-15的体内生成，通过随时间测量血浆水平(参见，图49)。可溶性受体/IL-15基因组合产生血浆IL-15的锐峰值，其迅速降低，而完整受体/IL-15组合产生稍低的峰值但衰退没有那么快。这使不同制剂的递送具有或多或少延长的体内作用。

结果

单独用IL-15转染的细胞无效率地表达和分泌IL-15。此外，像许多细胞因子mRNA一样，IL-15mRNA是不稳定的，可以通过RNA/密码子优化进行改进。RNA/密码子优化可用于增加IL-15和IL15RamRNA的水平和表达。此外，IL-15的分泌性前肽可以与组织纤溶酶原活化因子(tPA)的分泌性前导肽、或者与其他分泌性肽例如IgE或者GM-CSF交换。这些改进导致表达的100倍增加，在标准表达载体中使用人CMV启动子和牛生长激素多腺苷酸化信号。

图45显示人293细胞转染后IL-15的体外表达。具有组织纤溶酶原活化因子(tPA)前体原前导序列的优化表达载体(IL15t，其表示IL15tPA6OPT)的使用在培养基(即，细胞外和胞内)中生成可轻易检测水平的IL-15。此外，IL-15与IL15Ra的共表达导致IL-15生成在胞内和细胞外的显著增加。与野生型cDNA相比，该表达水平大约高20倍。

IL-15与全长(即，完整)IL15Ra的共表达导致高水平的IL-15和IL15Ra分子定位于表达细胞的细胞表面(图46)，而IL-15与IL15Ra可溶性胞外部分(即，可溶性IL-15)的共表达导致复合物快速分泌到培养基中。通过ELISA测量，IL-15稳态水平总的增加，在IL15Ra存在的条件下是4倍，在IL15sRa存在的条件下是7倍(图45A)。

相反，共表达IL-15的存在还增加IL15Ra和IL15sRa的水平(图47)。利用IL-15存在或者缺失条件下用IL15Ra或者IL15sRa转染293细胞后的培养基和细胞提取物的不同稀释物进行的Western印迹分析显示IL-15存在条件下受体稳态水平3到8倍的增加。受体的增加大体上类似于上面测量的共表达时IL-15的增加。

在膜结合的完整IL15Ra表达后，在培养基中检测到大量可溶性胞外部分，与受体的快速切割和可溶形式的产生吻合。当共表达IL-15时，培养基中可溶性受体的水平升高(图47C)。IL15sRa的表达导致高水平约28kDa的受体胞内形式，以及另外的N-糖基化的约30kDa的形式(见下文)，所述约28kDa的受体胞内形式是转染的cDNA的主要转录产物，未进行任何糖基化。低水平的完全糖基化IL15sRa被发现是细胞结合的，而大部分分泌到培养基中。在共表达IL-15存在的条件下，胞内非糖基化形式显著降低，而糖基化形式，尤其是胞外的，则极大增加。这些结果符合以下结论，即IL-15与其受体α的早期胞内结合发生在这两个分子的生成和分泌期间。在IL-15缺失的条件下，IL15sRa仍然很大程度保留在胞内，它不被快速加工或者分泌。

IL-15和IL15Ra是糖基化分子，在SDS-PAGE凝胶中作为多重条带迁移。IL15Ra是N-和O-糖基化的(Dubois等人，1999JBiolChem274(38)：26978-84)，而IL-15是N-糖基化的。已有报道不同的IL15Ra蛋白产品源于39kDa前体的交替N-和O-糖基化(Dubois等人，1999)。用N-或者O-糖苷酶的处理显示大部分与细胞结合的IL15Ra受体被快速糖基化。相反，单独IL15sRa的表达显示大约28kDa的IL15sRa条带，这只见于胞内。在IL15存在的条件下，这条胞内条带随胞外糖基化形式的增加而显著降低。

为了确定增加的表达是否导致更好的生物活性，在以流体力学法通过尾静脉注射进行DNA递送后在小鼠中表达IL-15和IL15Ra或者IL15sRaDNA分子。在这些实验中给小鼠给药0.1μg到2μgDNA，测量血浆中的IL-15水平。单次DNA注射后3天，处死小鼠，通过流式细胞术分析选定组织中的T细胞、NK细胞和其他淋巴细胞亚群的数量和表型。图52显示IL-15和受体α的共表达增加肺中NK细胞的数量。当注射更高摩尔比例(3∶1，0.1μgIL-15质粒和0.3μgIL15Ra质粒)表达受体的质粒时，这种增加是更显著的。IL-15受体α可溶部分的共表达导致肺NK细胞的显著增加。

实施例4

该实施例显示IL-15/IL-15Ra组合在恒河猴治疗性疫苗接种中的用途。IL-15/IL15Ra组合增加抗原特异性细胞，尤其是CD8效应细胞，以及抗原刺激时表达IL-2或者IL-2和IFNγ的细胞(即，多功能细胞，它们被认为对于有效疫苗接种非产重要)。

该实施例跟踪恒河猴血浆中的IL-15表达，显示IL-15/15Ra共表达实现恒河猴血浆中的可检测生成。对照实验显示与只接受IL-15DNA的动物相比，这种生成高得多。

3只恒河猴经受第二轮抗逆转录病毒治疗(“ART”)，并利用表达改进的IL-15和IL-15受体α(IL15Ra)的质粒进行DNA疫苗接种。使用下列质粒混合物通过电穿孔完成免疫：对每只动物进行两次0.5ml的注射。在2周间隔时分离外周血单核细胞(PBMC”)，使用10参数流式细胞术分析SIV-特异性细胞的数量。这允许对生成IFNg、IL-2或者TNFa的淋巴细胞的计数和表型分析，所述淋巴细胞响应对应于SIVmac259的gag、pol、env、nef和tat蛋白的肽库的刺激。

这种分析的结果(图56)显示SIV-特异性细胞因子生成细胞平均值和峰值应答的显著增加。在ART期间和DNA疫苗接种前，所有3只动物具有低水平的IFNg生成细胞。这是能够预期的，因为在所有3只动物中ART将SIV降低到不能检测的水平。疫苗接种时检测到SIV-特异性细胞的持久增加。更重要地，疫苗接种产生IL-2分泌细胞(图56)以及IFNg和IL-2双分泌细胞(即，多功能细胞)。这只发生在第三次DNA疫苗接种后，而在所有先前的测定中这些恒河猴在它们的外周血中没有任何多功能细胞因子分泌细胞。

3只已接种的恒河猴显示PBMC中SIV-特异性细胞因子-生成细胞数量的显著增加，所述细胞具有中央记忆(CM)或者效应记忆(EM)表型(图57)。用DNA的优化混合物疫苗接种时PBMC中效应细胞水平增加的表现与我们先前的经验相反，先前经验中DNA疫苗接种能够产生SIV-特异性中央记忆而不是效应记忆细胞。我们将其归于更优化的DNA疫苗混合物和IL15/IL15Ra细胞因子有效水平的存在。

给药编码IL-15的DNA而不共给药编码IL15Ra的DNA的恒河猴没有IL-2生成细胞。

概括来说，优化的DNA疫苗载体混合物以及包含优化水平的表达IL-15和IL15Ra的DNA导致外周血中检测到的抗原特异性细胞的显著增加。除了增加的细胞水平以外，通过我们的分析检测到重要的表型差异。显示疫苗产生的抗原特异性细胞包括IL-2生成以及IFNg和IL-2双生成细胞。除了中央记忆抗原特异性细胞以外，IL-15和IL15Ra疫苗接种产生具有效应表型的抗原特异性细胞。CD8+效应细胞预期有抗病毒感染细胞的活性，因此这些恒河猴在从ART释放时能更好的控制病毒。令人惊讶地，作为对DNA疫苗接种显著应答的结果，大约1-2％的循环淋巴细胞是SIV特异性的。这表明在优化条件下单独的DNA疫苗接种可以产生有效、各种各样、长久和多功能的抗原特异性细胞库。成功地给予多次(多达共8次)DNA疫苗接种，没有副作用。此外，重复给药导致多功能T细胞的生成。与先前的疫苗接种方案相比，这代表了显著的改进。

IL15/IL15Ra组合的DNA注射显示导致效应细胞的极大动员，这在它们前往外周位点的途中在PBMC中检测到。如果是这种情况，这些结果表明作为DNA或者蛋白的优化的IL15/IL15Ra组合在最佳时间间隔体内增强淋巴细胞动员和功能的有效性。IL-15的这种免疫治疗可用于增强治疗性疫苗接种的功效，还可用于在没有治疗性疫苗接种或者疫苗接种后长时间内增强抗病毒的免疫应答。这种治疗性疫苗接种中使用的DNA疫苗载体是由6个SIV抗原表达质粒和2个恒河猴IL-15/IL-15受体α表达质粒组成的混合物。LAMP-pol和LAMP-NTV质粒分别生成pol或者NefTatVif与人溶酶体结合膜蛋白的蛋白融合物。

2S-CATEgagDX

21S-MCP3p39gag

99S-Env

73S-MCP3-env

103S-LAMP-pol

147S-LAMP-NTV

恒河猴IL-15/IL-15受体α生成质粒：

AG65-rhIL15tPA6

AG120-rhIL15Ra

Claims

1.改进的白介素15受体α(IL-15Ra)多核苷酸，其编码IL-15Ra，其中所述IL-15Ra多核苷酸的序列是SEQIDNO:47所示的核酸序列或SEQIDNO:49所示的核酸序列。

2.如权利要求1所述的改进的IL-15Ra多核苷酸，其中所述IL-15Ra多核苷酸的序列是SEQIDNO:49所示的核酸序列。

3.如权利要求1所述的改进的IL-15Ra多核苷酸，其中所述IL-15Ra多核苷酸的序列是SEQIDNO:47所示的核酸序列。

4.包含权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸的表达载体。

5.如权利要求4所述的表达载体，还包含编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:3的编码成熟IL-15的区域。

6.如权利要求5所述的表达载体，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

7.如权利要求6所述的表达载体，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

8.如权利要求5所述的表达载体，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:3所示的序列。

9.如权利要求4所述的表达载体，还包含编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:4的编码成熟IL-15的区域。

10.如权利要求9所述的表达载体，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

11.如权利要求10所述的表达载体，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

12.如权利要求9所述的表达载体，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:4所示的序列。

13.如权利要求5-12中任一项所述的表达载体，其中使用不同的启动子表达IL-15Ra和IL-15。

14.如权利要求5-12中任一项所述的表达载体，其中所述表达载体包含在脂质体中。

15.包含权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸的体外宿主细胞。

16.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。

17.如权利要求15所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为人宿主细胞。

18.如权利要求16所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HEK293、RD或PC12细胞。

19.如权利要求18所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为HEK293细胞。

20.如权利要求15-19中任一项所述的宿主细胞，还包含编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:3的编码成熟IL-15的区域。

21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

22.如权利要求21所述的宿主细胞，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

23.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述IL-15多核苷酸的序列为SEQIDNO:3所示的序列。

24.如权利要求15-19中任一项所述的宿主细胞，还包含编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:4的编码成熟IL-15的区域。

25.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

26.如权利要求25所述的宿主细胞，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

27.如权利要求24所述的宿主细胞，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:4所示的序列。

28.包含权利要求5-13中任一项所述的表达载体的体外宿主细胞。

29.如权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为哺乳动物宿主细胞。

30.如权利要求28所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为人宿主细胞。

31.如权利要求29所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为COS、CHO、HeLa、NIH3T3、HEK293、RD或PC12细胞。

32.如权利要求31所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞为HEK293细胞。

33.产生IL-15Ra的方法，所述方法包括在表达IL-15Ra的条件下培养权利要求15-19中任一项所述的宿主细胞。

34.产生IL-15Ra和IL-15的方法，所述方法包括在表达IL-15Ra和IL-15的条件下培养权利要求20-32中任一项所述的宿主细胞。

35.如权利要求34所述的方法，其中IL-15和IL-15Ra表达的摩尔比例为1：2。

36.如权利要求34所述的方法，其中IL-15和IL-15Ra表达的摩尔比例为1：3。

37.如权利要求35或36所述的方法，其中所述细胞表达全长IL-15Ra或可溶性IL-15Ra。

38.如权利要求34所述的方法，还包括分离包含IL-15Ra和IL-15的复合物。

39.药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸和编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:3的编码成熟IL-15的区域。

40.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

41.如权利要求40所述的药物组合物，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

42.如权利要求39所述的药物组合物，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:3所示的序列。

43.药物组合物，包含权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸和编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:4的编码成熟IL-15的区域。

44.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

45.如权利要求44所述的药物组合物，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

46.如权利要求43所述的药物组合物，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:4所示的序列。

47.如权利要求39-46中任一项所述的药物组合物，其中所述IL-15Ra多核苷酸和IL-15多核苷酸包含在单一表达载体中。

48.如权利要求47所述的药物组合物，其中从所述单一表达载体、利用两个启动子表达IL-15Ra和IL-15。

49.如权利要求39-46中任一项所述的药物组合物，其中所述IL-15Ra多核苷酸和IL-15多核苷酸包含在分别的表达载体中。

50.药物组合物，包含权利要求20-32中任一项所述的宿主细胞。

51.权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸以及编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸在制备用于提高IL-15在个体中的体内稳定性和效力的药物中的用途，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:3的编码成熟IL-15的区域。

52.如权利要求51所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

53.如权利要求52所述的用途，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

54.如权利要求51所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:3所示的序列。

55.权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸以及编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸在制备用于提高IL-15在个体中的体内稳定性和效力的药物中的用途，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:4的编码成熟IL-15的区域。

56.如权利要求55所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

57.如权利要求56所述的用途，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

58.如权利要求55所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:4所示的序列。

59.如权利要求51-58中任一项所述的用途，其中所述个体患有癌症、需要预防或治疗性疫苗接种、或患有免疫缺陷。

60.如权利要求51、55或59中所述的用途，其中所述个体为人。

61.权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸以及编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸在制备用于扩增个体中的淋巴细胞的药物中的用途，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:3的编码成熟IL-15的区域。

62.如权利要求61所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

63.如权利要求62所述的用途，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

64.如权利要求61所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:3所示的序列。

65.权利要求1-3中任一项所述的改进的IL-15Ra多核苷酸以及编码成熟的人IL-15的IL-15多核苷酸在制备用于扩增个体中的淋巴细胞的药物中的用途，其中所述IL-15多核苷酸的编码成熟IL-15的区域是SEQIDNO:4的编码成熟IL-15的区域。

66.如权利要求65所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸编码与来自异源蛋白的信号肽或者信号肽-前肽连接的成熟IL-15。

67.如权利要求66所述的用途，其中所述异源蛋白选自组织纤溶酶原活化因子、生长激素、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子和免疫球蛋白。

68.如权利要求65所述的用途，其中所述IL-15多核苷酸的序列是SEQIDNO:4所示的序列。

69.如权利要求61-68中任一项所述的用途，其中所述个体患有癌症、需要预防或治疗性疫苗接种、或患有免疫缺陷。

70.如权利要求61、65或69所述的用途，其中所述个体是人。

71.权利要求5-13中任一项所述的表达载体在制备用于提高IL-15在个体中的体内稳定性和效力的药物中的用途。

72.如权利要求71所述的用途，其中所述个体患有癌症、需要预防或治疗性疫苗接种、或患有免疫缺陷。

73.如权利要求71或72所述的用途，其中所述个体是人。

74.权利要求5-13中任一项所述的表达载体在制备用于扩增个体中的淋巴细胞的药物中的用途。

75.如权利要求74所述的用途，其中所述个体患有癌症、需要预防或治疗性疫苗接种、或患有免疫缺陷。

76.如权利要求74或75所述的用途，其中所述个体是人。

77.权利要求20-32中任一项所述的宿主细胞在制备用于提高IL-15在个体中的体内稳定性和效力的药物中的用途。

78.如权利要求77所述的用途，其中所述个体患有癌症、需要预防或治疗性疫苗接种、或患有免疫缺陷。

79.如权利要求77或78所述的用途，其中所述个体是人。

80.权利要求20-32中任一项所述的宿主细胞在制备用于扩增个体中的淋巴细胞的药物中的用途。

81.如权利要求80所述的用途，其中所述个体患有癌症、需要预防或治疗性疫苗接种、或患有免疫缺陷。

82.如权利要求80或81所述的用途，其中所述个体是人。