CN103555734B - 人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法。具体而言，本发明的人白细胞介素-12的编码基因包含(a).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列；或者(b).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列。本发明的核苷酸序列能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中稳定高效表达，尤其是在无血清条件下稳定高效表达。
Description
本申请是分案申请，其原申请的中国国家申请号为201210345021.8，申请日为2012年9月17日，发明名称为“人白细胞介素-12的编码基因、真核宿主细胞和表达方法”。
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及人白细胞介素-12(IL-12)的编码基因、真核宿主细胞和表达方法，具体而言，本发明涉及对人白细胞介素-12的编码基因进行优化，从而能够使IL-12在真核宿主细胞，特别是中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)中稳定高效表达，尤其是在无血清条件下稳定高效表达。
背景技术
白细胞介素-12（IL-12）于1989年和1990由Trinchieri和Gately等发现，起初命名为NK细胞刺激因子（NKSF）和细胞毒淋巴细胞成熟因子（CLMF），1991年统一命名为白介素-12。
白细胞介素-12是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为35kDa（P35亚基），另一条为40kDa（P40亚基）。P35亚基由多种细胞产生，包括T、B淋巴细胞、NK细胞和大单核细胞等，而P40链主要由激活的单核细胞和B细胞产生，P35和P40单独存在时均无任何IL-12的生物活性。
IL-12具有调节和参与免疫应答细胞的活性，刺激NK细胞和T细胞产生干扰素-伽玛（IFN-γ），促进Th1细胞的分化，是连接固有免疫和获得性免疫的核心因子。同时，
IL-12可促进造血功能的恢复，用于机体造血功能的降低导致的疾病，如急性放射病、放射性治疗、化学治疗等。另外，IL-12还具有抗肿瘤，抗病毒的效果，具有良好的临床应用前景。
在目前报道的利用真核细胞表达产生重组IL-12的方法中，重组IL-12的表达强度仍不令人满意。
以下表1列出了现有技术相关技术的培养条件和最高产量。
表1现有技术的培养条件和最高产量
如能提高rhIL-12的表达量，会推动rhIL-12的产业化。
但是，现有技术，都是对P35、P40如何插入载体能够促进表达进行探索，未从基因序列的优化方面考虑。忽视了目前医药蛋白药物的宿主细胞是非人源的细胞，如鼠源的细胞，例如最为广泛使用的中国仓鼠卵巢细胞（CHO，Chinese Hamster OvaryCells）。人源IL-12的序列未必能最佳的利用鼠源细胞的蛋白表达系统。没有从基因序列的优化方面考虑。
虽然根据宿主细胞而优化待表达蛋白的基因序列的方法已有报道，例如，名称为“一种人白介素-10基因序列及含该基因序列的大肠杆菌”的中国专利申请公开102268407A，但是其提供的是一种能高效表达于微生物的人白细胞介素-10基因序列。目前尚没有人尝试优化人白介素-12的序列，使之适宜在真核细胞，特别是CHO细胞中的表达，尤其是在无血清条件下的表达。
发明内容
本发明的目的在于提供一种人白细胞介素-12的编码基因，其通过将人IL-12的基因序列优化而形成，适合在在真核细胞，特别是鼠源细胞（如CHO细胞）中表达，从而提高表达效率，增加蛋白的产量。
本发明的人白细胞介素-12的编码基因，包含
(a).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列；或者
(b).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列。
本发明的另一个目的在于提供一种表达人白细胞介素-12的真核宿主细胞，其包含
(a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列的第二表达载体；或者
(a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列的第二表达载体。
本发明的又一个目的在于提供一种人白细胞介素-12的表达方法，其特征在于，所述方法包括
(a).分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列的pCDNA3.1质粒；或者
(b)分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列的pCDNA3.1质粒
然后用步骤(a)或(b)中的pGN-35质粒和pCDNA3.1质粒共转染真核宿主细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，更优选为CHO-DG44或CHO-3E7细胞。
IL-12含有的p35和p40亚基经优化后，在CHO细胞中可获得稳定高效的表达，本发明人证明，人IL-12的p35和p40亚基的基因密码经优化后均比天然的人IL-12的基因表达量高。利用优化的本发明的序列(如3#序列)，我们已经获得高表达的稳定细胞株，在无血清的培养基内，稳定细胞株可以达到200mg/L，远远高于已有的报道。
附图说明
图1显示了表达载体pGN-35与pCDNA3.1的构建图谱。
图2显示了瞬时表达评估WB检测结果（上清液）。其中A：转染后72小时CHO-3E7细胞上清，非还原条件；B：转染后72小时CHO-3E7细胞上清，还原条件；C：转染后72小时CHO-DG44细胞上清，非还原条件；D：转染后72小时CHO-DG44细胞上清，还原条件；
缩写：P：IL-12蛋白，作为阳性对照（Genscript，产品货号Z02709）；NC：未转染细胞的培养基上清，作为阴性对照；M：标记(Marker)；1，2，3……9，10：分别转染了1至10号备选质粒的细胞上清液；
图3显示了瞬时表达评估WB检测结果（细胞裂解液）。其中A：转染后72小时CHO-3E7细胞裂解液体，非还原条件；B：转染后72小时CHO-DG44细胞上清，非还原条件；
缩写：NC：未转染细胞的细胞裂解液，作为阴性对照；M：标记(Marker)；1，2，3……9，10：分别转染了1至10号备选质粒的细胞裂解液
图4显示了Western-blot检测结果（非还原条件）。其中NC：未转染细胞的培养基上清，作为阴性对照；Native,#3,#9：分别转染了天然基因序列，#3备选基因序列和9号备选基因序列的细胞上清；
注：使用的一抗为抗p40抗体（IL-12antibody（p40），AbcamTM，货号：ab91216）。
具体实施方式
以下对本发明进行详细说明。
白细胞介素-12(IL-12)是一种70kDa的异二聚体，由两条共价连接的多肽链组成，一条为35kDa（P35亚基），另一条为40kDa（P40亚基）。IL-12的天然氨基酸序列见表2。
表2 IL-12氨基酸序列（含天然信号肽）
本发明人尝试用鼠源IgG信号肽代替天然信号肽来提高IL-12的表达（表3），并且使用OptimumGeneTM软件针对天然信号肽和鼠源IgG信号肽分别对编码IL-12氨基酸的DNA序列进行优化，优化的基因序列利用不同的信号肽（天然信号肽，或者鼠源信号肽）共计形成10组备选序列（表4）。
其中，1-5号备选序列来自含天然信号肽的IL-12重组蛋白氨基酸序列；6-10号备选序列来自含鼠源IgG信号肽的IL-12重组蛋白氨基酸序列。
表3 IL-12氨基酸序列（含鼠源IgG信号肽）
表4 优化后的10组备选DNA序列
经实验，本发明人发现表4中的含天然信号肽的备选序列3和含鼠源信号肽的备选序列9的表达量最高。
因此，本发明的一个目的提供一种人白细胞介素-12的编码基因，其包含
(a).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列；或者
(b).编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列。
所述互补核苷酸序列是与所指核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。
优选的是，所述人白细胞介素-12的编码基因包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9以及编码P40亚基的SEQ ID NO:10；或者包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21以及编码P40亚基的SEQ ID NO:22。
本发明的另一个目的是提供表达人白细胞介素-12的真核宿主细胞，其包含
(a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列的第二表达载体；或者
(a).具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列的第二表达载体。
本发明中，上述真核宿主细胞优选是目前医药蛋白药物领域常用的非人源的细胞，如非人哺乳动物细胞系。哺乳动物细胞在培养物中的繁殖是本领域熟知的。较佳的哺乳动物细胞是许多可购得的细胞系，包括但不限于，中国仓鼠卵巢细胞（CHO，Chinese Hamster Ovary Cells）、Vero细胞、海拉细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)等。本发明特别优选的细胞为鼠源的细胞，例如最为广泛使用的中国仓鼠卵巢细胞，更优选为CHO-DG44或CHO-3E7细胞。
表达载体通常是指能在所选宿主细胞中复制的质粒或其它核酸分子。该表达载体可以自主复制，或可通过本领域熟知的方法插入宿主细胞的基因组中而进行复制。
在本发明的一个实例中，具有编码P35亚基的核苷酸序列的第一表达载体为pGN-35质粒，具有编码P40亚基的核苷酸序列的第二表达载体为pCDNA3.1质粒。
本发明采用了双表达载体，其优点为，两个亚基所在的质粒含有不同的筛选基因，举例而言，编码P35的亚基所在的质粒可含有DHFR基因，在CHO-DG44细胞中可以用MTX加压扩增筛选P35表达的细胞，而编码P40的亚基所在的质粒含Neomycin基因，可以用Neomycin筛选P40表达的细胞。如果细胞同时表达P35与P40两个亚基，则能存活于双重筛选的条件下。本领域技术人员也可采用本领域技术人员所熟知的其他表达载体和筛选基因。
本发明的又一目的还提供了人白细胞介素-12的表达方法，其包括
(a).分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:9或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:10或其互补核苷酸序列的pCDNA3.1质粒；或者
(b)分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其互补核苷酸序列的pCDNA3.1质粒
然后用步骤(a)或(b)中的pGN-35质粒和pCDNA3.1质粒共转染真核宿主细胞，优选为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，更优选为CHO-DG44或CHO-3E7细胞。
转染是指将含有感兴趣的核酸的表达载体导入宿主细胞内。转染方法通常包括：电穿孔；采用氯化钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂质体转染；感染和其他方法(见Sambrook等人的《分子克隆实验指南》第2版，1989年)。本发明的一个实例中，转染方法是电穿孔或脂质体转染。
所获得的共转染真核宿主细胞尤其适合培养于无血清的培养基中。
在本发明中，IL-12含有的p35和p40亚基经优化后，在真核细胞，特别是CHO细胞中可获得稳定高效的表达，均比天然的人IL-12的基因表达量高。利用优化的本发明的序列，我们已经获得高表达的稳定细胞株，在无血清的培养基内，稳定细胞株可以达到200mg/L，远远高于已有的报道。
下面将结合实施例进一步详细描述本发明。
实施例
实施例1IL-12含有的p35和p40亚基基因序列的克隆与测序
使用UniProt数据库中的P35和P40天然氨基酸序列，根据方案设计中的10种备选基因，替换序列中的某些密码子。经基因测序，其结果与表4中预期序列一致。
实施例2质粒的构建与测定
将表4中优化的10组p35和p40亚基的基因序列分别克隆入pGN-35与pCDNA3.1（图1）表达质粒。考虑到p35亚基的表达量往往低于p40亚基，每对基因的p35亚基利用EcoR1和Xba1酶切位点克隆入pGN-35质粒，以便利用DHFR基因在MTX加压培养时伴随的基因扩增的功能，扩增p35亚基的基因。每对基因的p40亚基的序列利用EcoR1和Xba1酶切位点克隆入pCDNA3.1质粒，利用Neomycin抗药基因选择p40亚基表达的细胞。克隆完毕后进行序列分析，以确证序列的正确性。
实施例3rhIL-12蛋白的表达
将获得的含有p35及含有p40亚基表达质粒进行瞬时表达，以评估优化序列的效果。在瞬时表达评估试验中，选取了CHO-DG44和CHO-3E7两株宿主细胞。其中，CHO-DG44是构建工业生产级稳定细胞株所常用的宿主细胞，经过加压筛选可以得到高产量的稳定细胞系，但在用于瞬时表达时，其表达量往往不高。因而，试验同时使用了瞬时表达宿主细胞CHO-3E7来作为备选参照，以便弥补CHO-DG44在瞬时表达评估中的不足。
瞬时表达评估试验中，将10组备选质粒分别转染进CHO-DG44细胞和CHO-3E7细胞。具体操作如下：CHO-DG44和CHO-3E7细胞分别在Opti-CHO无血清培养基（Gibco,Cat#12681）培养。其中通过电穿孔法对CHO-DG44细胞进行转染，使用线性聚乙烯亚胺(PEI)对CHO-3E7细胞进行转染。转染后的工程细胞经过短时间培养后，用Western-blot和ELISA两种方法测定上清液中IL-12是否表达以及瞬时表达量。通过对IL-12瞬时表达量进行比较，挑选出瞬间表达量相对较高的IL-12的DNA序列和表达载体，用于后面的稳定细胞株建立。
其中，CHO-3E7细胞用Polyethylenimine‘’MAX’’linear,MW25kDa(40kDanominal),3mg/mL,pH7.0(Polysciences Inc.cat#24765-2).转染24小时前，将CHO-3E7细胞稀释至0.5x106cells/mL。转染时的细胞浓度应为1.5to2.0x106cells/mL。分出17ml的细胞至新的培养瓶，将1.47mL转染培养基(FreeStyleTMCHO medium)在37℃预热，加入30μg DNA质粒（30μL），轻微震荡混匀。90μL LPEI MAX溶液与1.41mL转染液混匀，总体积为1.5mL。将1.5mL LPEIMAX溶液与含有质粒的转染液轻微震荡混匀4秒钟，室温下放置8-10分钟。然后，将此3mL混合液加入17mL细胞内，与细胞充分混匀，置於120rpm的水平摇床培养(5%CO2,37℃).CHO-DG44细胞用电转染的方法。在CD OptiCHO培养基中，10x107细胞置于电转染管内，将40μg质粒DNA与100μl ddH2O混匀。Gene PulserXcell电穿孔仪的冲击电压设在300V。在电转染管内加入100微升的（40微克）质粒，700微升细胞（107cells），总体积800微升。电转染后立即将细胞转移至10毫升培养皿。
以上细胞均培养在37摄氏度，5%CO2细胞培养箱。72小时后收取上清进行ELISA（见表5）和Western Blot（见图2，A、B、C、D）检测，同时收取细胞，裂解后进行Western Blot（见图3中的A、B）检测。
表5 瞬时表达评估ELISA检测结果
上述ELISA和WB结果显示，IL-12在上述两个CHO表达系统内都有表达。ELISA检测结果较高的备选组在WB检测结果中信号也相对较强，表明ELISA和WB检测结果基本上是一致的。含天然信号肽的备选序列（3号和4号），在CHO-DG44宿主细胞中得到了较高的表达；而含鼠源信号肽的备选序列（9号和7号）在CHO-3E7宿主细胞中得到了较高的表达。
根据以上结果，综合考虑两个细胞株的表达效果，含天然信号肽的备选序列3号和含鼠源信号肽的9号的表达量最高。
实施例4天然人IL-12基因序列与优化的人IL-12基因序列蛋白表达量的比较
将人IL-12的p35和p40亚基的天然基因序列（表六）分别克隆入pGN-35与pCDNA3.1，测序保证序列的正确。
表6 天然IL-12重组蛋白DNA序列
瞬时表达评估试验中，将天然IL-12基因序列、3号备选基因序列和9号备选基因序列分别转染进CHO-DG44细胞和CHO-3E7细胞，细胞培养的条件与质粒转染的方法同实施例3。72小时后收取上清进行ELISA（表七）和Western Blot检测（图4）。
| CHO-DG44细胞 | CHO-3E7细胞 | |
| 天然基因序列 | 163.86 | 308.85 |
| 3号备选基因序列 | 303.65 | 1404.87 |
| 9号备选基因序列 | 588.70 | 3276.57 |
表7 ELISA检测结果(μg/L)
上述Western-blot和ELISA结果显示，IL-12天然基因序列在CHO-DG44和CHO-3E7两个宿主细胞内都有表达。但在两个表达系统内，天然基因序列的表达量都是最低的，其次是3号备选基因序列，而9号备选基因序列最高。
实施例5.DNA序列3号在稳定细胞株可以有超过200mg/L的人重组IL-12的表达
通过电穿孔法将3号序列对CHO-DG44细胞进行转染。72小时后，将转染后的细胞按每孔200个细胞的密度接种于96孔细胞培养皿内。细胞的培养基内加入200μg/ml的G418及50nM的MTX对细胞进行筛选。对生存的细胞用Dot Blot及ELISA进行筛选。MTX的加压筛选从50nM，200nM至500nM。500nM加压筛选后的阳性克隆进行亚克隆。在200nM至500nM加压水平下，部分克隆的细胞表达的结果见ELISA结果表八。由表八中的数据，根据3号序列得到的稳定细胞克隆有多个达到200mg/L以上。证实，优化后的序列在CHO细胞的表达比已有的用天然序列表达的报道更为优越。这个稳定细胞克隆的表达结果也证实，不同序列在瞬时转染表达量的高低与稳定细胞克隆的结果是吻合的。即在瞬时表达时表达量高的序列在稳定细胞克隆筛选后的表达量也是高的。
表八 亚克隆筛选后，部分细胞克隆ELISA检测结果
| 克隆号 | 表达量(mg/L) | 克隆号 | 表达量(mg/L) |
| 41 | 170.02 | 163 | 129.97 |
| 52 | 120.35 | 165 | 94.70 |
| 61 | 180.37 | 170 | 72.55 |
| 79 | 98.15 | 344 | 76.55 |
| 83 | 71.56 | 640 | 185.00 |
| 84 | 137.42 | 652 | 210.69 |
| 135 | 118.53 | 717 | 108.91 |
| 141 | 113.06 | 763 | 102.07 |
| 151 | 167.22 | 773 | 135.95 |
| 158 | 145.89 | 842 | 100.28 |
| NC | R |
表八 亚克隆筛选后，部分细胞克隆ELISA检测结果
实施例6天然人IL-12基因序列与优化后人IL-12基因序列的比较
1天然人IL-12的p35基因序列与优化后3#序列中的p35亚基的基因序列比较（上行是天然序列，下行是优化后的3#序列的p35亚基序列）
.2天然人IL-12的p40基因序列与优化后3#序列中的p40亚基的基因序列比较
（上行是天然序列，下行是优化后的3#序列的p40亚基序列）
3.天然人IL-12的p35基因序列与优化后9#序列中的p35亚基的基因序列比较（上行是天然序列，下行是优化后的9#序列的p35亚基序列，黄色标示的密码前是鼠源IgG信号肽的序列）
4.天然人IL-12的p40基因序列与优化后9#序列中的p40亚基的基因序列比较（上行是天然序列，下行是优化后的9#序列的p40亚基序列，黄色标示的密码前是鼠源IgG信号肽的序列）
IL-12含有的p35和p40亚基经优化后，在CHO细胞中可获得稳定高效的表达，3号优化基因序列（含天然信号肽）经表达后，在CHO-DG44细胞内，表达量为天然基因的2倍；9号优化基因序列（含鼠源信号肽）经表达后，表达量为天然基因的3倍。在CHO-3E7细胞中，3号优化基因序列表达量为天然基因的4倍；9号优化基因序列（含鼠源信号肽）经表达后，表达量为天然基因的10.6倍。这些数据证明，人IL-12的p35和p40亚基的基因密码经优化后均比天然的人IL-12的基因表达量高。利用优化的3#序列，我们已经获得高表达的稳定细胞株，在无血清的培养基内，可以达到200mg/L远远高于已有的报道。
Claims (11)
1.人白细胞介素-12的编码基因，其特征在于，所述编码基因由以下序列组成：
编码人白细胞介素-12的P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其完全互补核苷酸序列以及编码人白细胞介素-12的P40亚基的SEQ ID NO:22或其完全互补核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因由编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21以及编码P40亚基的SEQ ID NO:22组成。
3.一种表达人白细胞介素-12的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含：
具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其完全互补核苷酸序列的第一表达载体和具有编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其完全互补核苷酸序列的第二表达载体。
4.如权利要求3所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞包含具有编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21的第一表达载体和具有编码P40亚基的SEQ ID NO:22的第二表达载体。
5.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
6.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述真核宿主细胞为CHO-DG44或CHO-3E7细胞。
7.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述第一表达载体为pGN-35质粒。
8.如权利要求3或4所述的真核宿主细胞，其特征在于，所述第二表达载体为pCDNA3.1质粒。
9.一种人白细胞介素-12的表达方法，其特征在于，所述方法包括：
分别构建包含编码P35亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:21或其完全互补核苷酸序列的pGN-35质粒和包含编码P40亚基的核苷酸序列SEQ ID NO:22或其完全互补核苷酸序列的pCDNA3.1质粒；
然后用所述pGN-35质粒和所述pCDNA3.1质粒共转染真核宿主细胞。
10.如权利要求9所述的表达方法，其特征在于，所述真核宿主细胞为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
11.如权利要求9所述的表达方法，其特征在于，所述真核宿主细胞为CHO-DG44或CHO-3E7细胞。
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