CN102753577A

CN102753577A - 双特异性抗-vegf/抗-ang-2抗体

Info

Publication number: CN102753577A
Application number: CN2009801401641A
Authority: CN
Inventors: 莫妮卡·贝纳; 乌尔里希·布林克曼; 盖伊·乔治; 雷姆科·阿尔伯特·格里普; 萨拜因·伊姆霍夫-容; 阿妮塔·卡夫利; 休伯特·藤贝尔格; 克里斯蒂安·克莱因; 约尔格·托马斯·雷古拉; 沃尔夫冈·谢弗; 于尔根·迈克尔·尚策; 维尔纳·朔伊尔; 斯特凡·泽贝尔; 马库斯·托马斯
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 2008-10-08
Filing date: 2009-10-07
Publication date: 2012-10-24
Anticipated expiration: 2029-10-07
Also published as: US20170369566A1; AR073775A1; RU2014149553A; AU2009301431B2; JP2012504943A; KR20130118994A; ZA201102203B; IL211729A0; US20210047394A1; MA32712B1; NZ591602A; CO6351794A2; RU2640253C2; AU2009301431B8; KR101345522B1; AU2009301431A8; HRP20140376T1; EP2344537B1; CR20110166A; BRPI0919663A2

Abstract

本发明涉及针对人VEGF和针对人ANG-2的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物及其应用。

Description

双特异性抗-VEGF/抗-ANG-2抗体

本发明涉及针对人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)和针对人血管生成素-2(angiopoietin-2，ANG-2)的双特异性抗体，制备它们的方法，包含所述抗体的药物组合物，及其应用。

发明背景

血管发生参与各种病症的发病机理，所述疾病包括实体瘤、眼内新血管综合征如增殖性视网膜病或年龄相关的黄斑变性(AMD)、类风湿性关节炎和银屑病(Folkman，J.，等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)267(1992)10931-10934；Klagsbrun，M.，等，Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53(1991)217-239；和Garner，A.，Vascular diseases(血管疾病)，在：Pathobiology of ocular disease，A dynamic approach(眼科疾病，即动力学途径的病理学)，Garner，A.，和Klintworth，G.K，(编辑)第二版Marcel Dekker，纽约，(1994)，第1625-1710页)。在实体瘤的情形中，与正常细胞相比较，新血管生成允许所述肿瘤细胞获得生长优势和增殖自主性。因此，在乳腺癌以及在一些其它肿瘤中，已经观察到在肿瘤切片中的微脉管密度与患者存活之间的相关性(Weidner，N.，等，N.Engl.J.Med.(新英格兰医学杂志)324(1991)1-8；Horak，E.R.，等，Lancet 340(1992)1120-1124；和Macchiarini，P.，等，Lancet 340(1992)145-146)。

VEGF和抗VEGF抗体

人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No：105)在例如Leung，D.W.，等，Science(科学)246(1989)1306-9；Keck，PJ.，等，Science(科学)246(1989)1309-12和Connolly，D.T.，等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)264(1989)20017-24中描述。VEGF参与与肿瘤和眼内病症相关的正常和异常的血管发生与新血管生成的调控(Ferrara，N.，等，Endocr.Rev.(内分泌综述)18(1997)4-25；Berkman，R.A.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)91(1993)153-159；Brown，L.F.，等，Human Pathol.(人类病理学)26(1995)86-91；Brown，L.F.，等，Cancer Res.(癌症研究)53(1993)4727-4735；Mattern，J.，等，Brit.J.Cancer(英国癌症学杂志)73(1996)931-934；和Dvorak，H.，等，Am.J.Pathol.(美国病理学杂志)146(1995)1029-1039)。VEGF是同二聚体糖蛋白，已经从数种来源分离。VEGF对内皮细胞显示高度特异性的促有丝分裂活性。VEGF在胚胎血管发生和成人生命过程中血管发生的新血管形成中具有重要调节功能(Carmeliet，P.，等，Nature(自然)，380(1996)435-439；Ferrara，N.，等，Nature(自然)，380(1996)439-442；Ferrara和Davis-Smyth在Endocrine Rev.，18(1997)4-25中综述。VEGF发挥作用的重要性在以下研究中证实，这些研究显示单个VEGF等位基因的失活由于脉管系统不能发育而导致胚胎致死(Carmeliet，P.，等，Nature(自然)，380(1996)435-439；Ferrara，N.，等，Nature(自然)，380(1996)439-442。此外，VEGF对于单核细胞具有强烈的化学引诱物活性，能够诱导内皮细胞中纤溶酶原激活物和纤溶酶原激活物抑制剂，并也能够诱导微血管通透性。由于后一种活性，其有时被称为血管通透性因子(VPF)。VEGF的分离和性质已有综述；见Ferrara，N.，等，J.Cellular Biochem.(细胞生物化学杂志)，47(1991)211-218和Connolly，J.Cellular Biochem.(细胞生物化学杂志)，47(1991)219-223。单个VEGF基因的替代mRNA剪切产生五种同种型的VEGF。

抗VEGF中和抗体抑制各种人肿瘤细胞系在小鼠中的生长(Kim，I.，等，Nature(自然)362(1993)841-844；Warren，S.R.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)95(1995)1789-1797；Borgstrom，P.，等，Cancer Res.(癌症研究)56(1996)4032-4039；和Melnyk，O.，等，Cancer Res.(癌症研究)56(1996)921-924)。WO 94/10202，WO 98/45332，WO 2005/00900和WO 00/35956提及针对VEGF的抗体。人源化的单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab，以商标名阿瓦斯丁(Avastin)

出售)是一种用于肿瘤治疗的抗VEGF抗体WO 98/45331)。

雷珠单抗(Ranibizumab，商标名Lucentis

)是源自与贝伐单抗(阿瓦斯丁)相同母体鼠抗体的单克隆抗体片段。其比母体分子小得多，并且经亲和力成熟以提供对VEGF-A更强的结合(WO 98/45331)。其是抗-血管生成的，已经被批准用于治疗“湿”型年龄相关的黄斑变性(ARMD)，这是年龄相关的视觉丧失的一种常见形式。另一种抗-VEGF抗体是例如HuMabG6-31，其在例如US 2007/0141065中描述。

ANG-2和抗-ANG-2抗体

人血管生成素-2(ANG-2)(替代地缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ IDNo：106)在Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60和Cheung，A.H.，等，Genomics 48(1998)389-91中描述。发现血管生成素-1和-2(ANG-1(SEQ ID No：107)和ANG-2(SEQ ID No：106))是Ties的配体，Ties是选择性在血管内皮内表达的酪氨酸激酶家族。Yancopoulos，G.D.，等，Nature(自然)407(2000)242-48。现在有四种明确的血管生成素家族的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因位点的非常不同的对应物。Kim，I.，等，FEBS Let，443(1999)353-56；Kim，I.，等，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂而鉴定(对于ANG-1，见：Davis，S.，等，Cell 87(1996)1161-69；对于ANG-2，见：Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60)。所有已知血管生成素基本上都结合Tie2，且Ang-1和-2均以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2。Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60。显示Ang-1支持EC存活并促进内皮完整性，Davis，S.，等，Cell 87(1996)1161-69；Kwak，H.J.，等，FEBS Lett 448(1999)249-53；Suri，C.，等，Science(科学)282(1998)468-71；Thurston，G.，等，Science(科学)286(1999)2511-14；Thurston，G.，等，Nat.Med.6(2000)460-63，而ANG-2具有相反效应，在存活因子VEGF或碱性成纤维细胞生长因子不存在时促进血管去稳定和退化。Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60。然而，ANG-2功能的许多研究已经表明更复杂的情况。ANG-2可能是血管重塑的复杂调节因子，在血管萌芽和血管退化中均发挥作用。支持ANG-2的这种作用，表达分析揭示在成人血管生成萌芽环境中ANG-2和VEGF一起迅速诱导，而在血管退化环境中在不存在VEGF时ANG-2被诱导。Holash，J.，等，Science(科学)284(1999)1994-98；Holash，J.，等，Oncogene 18(1999)5356-62。与背景-依赖性作用相一致，ANG-2特异性结合相同的内皮-特异性受体Tie-2，Tie-2被Ang-1激活，但一旦激活具有背景-依赖性效应。Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60。

角膜血管生成测定已显示ANG-1和ANG-2均具有相似效应，与VEGF协同作用促进新血管的生长。Asahara，T.，等，Circ.Res.83(1998)233-40。体外高浓度ANG-2也可促进血管生成，这种观察提出了这样的可能性，即存在剂量-依赖性内皮反应。Kim，I.，等，Oncogene 19(2000)4549-52。高浓度ANG-2作为内皮细胞在血清饥饿凋亡中的凋亡存活因子起作用，这种凋亡经PI-3激酶和Akt途径激活Tie2。Kim，I.，等，Oncogene 19(2000)4549-52。

其它体外实验表明在持续暴露过程中，ANG-2的效应可从Tie2的拮抗剂进行性转变为其激活剂，且在更晚时间点，ANG-2可直接促进脉管的管形成和新血管稳定。Teichert-Kuliszewska，K.，等，Cardiovasc.Res.49(2001)659-70。另外，如果EC在纤维蛋白胶上培养，也观察到ANG-2激活Tie2，可能暗示ANG-2的作用依赖于EC分化状态。Teichert-Kuliszewska，K.，等，Cardiovasc.Res.49(2001)659-70。在三维胶原蛋白胶中培养的微血管EC中，ANG-2也能诱导Tie2激活并促进毛细血管样结构的形成。Mochizuki，Y.，等，J.Cell.Sci.115(2002)175-83。使用3-D球状共培养作为血管成熟的体外模型证明EC和间充质细胞的直接接触消除了对VEGF的反应性，而VEGF和ANG-2的存在诱导萌芽。Korff，T.，等，Faseb J.15(2001)447-57。Etoh，T.H.等证明组成型表达Tie2的EC中，在VEGF存在下ANG-2强烈地上调MMP-1，-9和u-PA的表达。Etoh，T.，等，Cancer Res.(癌症研究)61(2001)2145-53。通过体内瞳孔膜模型，Lobov，I.B.等显示存在内源VEGF时ANG-2促进毛细管直径的迅速增加、促进基底层重塑、内皮细胞的增殖和迁移，并刺激新血管的萌芽。Lobov，I.B.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)99(2002)11205-10。相反，没有内源VEGF时ANG-2促进内皮细胞死亡和血管退化。Lobov，I.B.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)99(2002)11205-10。相似地，通过体内肿瘤模型，Vajkoczy，P.，等证明多细胞凝集物通过血管原性萌芽起始脉管生长，该萌芽经过宿主和肿瘤内皮同时表达VEGFR-2和ANG-2发生。Vajkoczy，P.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)109(2002)777-85。这种模型说明生长中的肿瘤的建立的微血管具有连续重塑的特征，这推测由VEGF和ANG-2的表达介导。Vajkoczy，P.，等，J Clin.Invest.(临床研究杂志)09(2002)777-85。

Tie-2和血管生成素-1敲除小鼠的研究显示显示相似的表型并表明血管生成素-1刺激的Tie-2磷酸化介导了发育中血管的重塑和稳定，促进血管在血管生成过程中的成熟并维持内皮细胞-支持细胞粘附(Dumont，J.，等，Genes&Development(基因和发育)，8(1994)1897-1909；Sato，T.N.，Nature(自然)，376(1995)70-74；(Thurston，G.，等，Nature Medicine(自然医学)：6(2000)460-463)。认为血管生成素-1的作用在成人中是保守的，在成人中其广泛且组成型表达(Hanahan，D.，Science，277(1997)48-50；Zagzag，D.，等，Exp Neurology，159：391-400(1999))。相比之下，血管生成素-2的表达主要局限于血管重塑位点，人们认为在那里血管生成素-2阻断血管生成素-1的组成型稳定或成熟功能，允许血管恢复且保持在可塑状态，该状态对萌芽信号更有反应性(Hanahan，D.，1997；Holash，J.，等，Orzcogerze 18(199)5356-62；Maisonpierre，P.C.，1997)。在病理性血管生成中血管生成素-2表达的研究已经发现许多肿瘤类型显示血管中血管生成素-2的表达(Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60)。功能研究表明血管生成素-2参与肿瘤血管生成并且血管生成素-2过表达与小鼠异种移植模型中增加的肿瘤生长相关(Ahmad，S.A.，等，Cancer Res.(癌症研究)，61(2001)1255-1259)。其它研究已经将血管生成素-2过表达与肿瘤血管过度形成相关联(Etoh，T.，等，Cancer Res.(癌症研究)61(2001)2145-53；Tanaka，F.，等，Cancer Res.(癌症研究)62(2002)124-29)。

近年来已经提出将血管生成素-1，血管生成素-2和/或Tie-2作为可能的抗-癌治疗靶标。例如US 6,166,185，US 5,650,490和US 5,814,464中每个公开了抗-Tie-2配体和受体抗体。据报道使用可溶性Tie-2的研究降低了啮齿动物中肿瘤的数目和大小(Lin，1997；Lin 1998)。Siemester，G.，等Siemeister，G.，等，Cancer Res.(癌症研究)59(1999)3185-91产生了表达Tie-2胞外域的人黑色素瘤细胞系，将其注射到裸鼠中并报道了可溶性Tie-2导致肿瘤生长和肿瘤血管生成的显著抑制。考虑到血管生成素-1和血管生成素-2均结合Tie-2，从这些研究中尚不清楚血管生成素-1、血管生成素-2或Tie-2是否将是抗-癌治疗的有吸引力的靶标。然而，认为有效抗-血管生成素-2治疗在治疗疾病(如癌症)中有益，这些疾病中进展依赖于异常血管生成，其中阻断该过程可预防疾病的进展(Follunan，J.，NatureMedicine(自然医学)1(1995)27-31)。

此外，一些研究组已经报道结合血管生成素-2的抗体和肽的应用。见例如US 6166,185和US 2003/10124129，WO 03/030833，WO 2006/068953，WO 03/057134或US 2006/0122370。

血管生成素-2病灶性(focal)表达效应的研究已经显示拮抗血管生成素-1/Tie-2信号使紧密的脉管结构松弛由此将EC暴露于来自血管生成诱导剂(如VEGF)的激活信号(Hanahan，D.，Science，277(1997)48-50)。这种血管生成素-1的抑制导致的促-血管生成效应表明抗-血管生成素-1治疗将不是有效的抗-癌治疗。

发育过程中ANG-2在发生血管重塑的位点表达。Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60。在成人个体中，ANG-2表达限制在血管重塑位点以及高度血管化的肿瘤中，包括神经胶质瘤，Osada，H.，等，Int.J.Oncol.18(2001)305-09)；Koga，K.，等，Cancer Res.(癌症研究)61(2001)6248-54，肝细胞癌，Tanaka，S.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)103(1999)341-45，胃癌，Etoh，T.，等，Cancer Res.(癌症研究)61(2001)2145-53；Lee，J.H.，等，，Int.J.Oncol.18(2001)355-61，甲状腺瘤，Bunone，G.，等，Am JPathol 155(1999)1967-76，非-小细胞肺癌，Wong，M.P.，等，Lung Cancer 29(2000)11-22和结肠癌，Ahmad，S.A.，等，Cancer 92(2001)1138-43，和前列腺癌Wurmbach，J.H.，等，AntiCancer Res.20(2000)5217-20。发现一些肿瘤细胞表达ANG-2。例如，Tanaka，S.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)103(1999)341-45在人肝细胞癌(HCC)的12个样品的10个中检测到ANG-2 mRNA。Ellis研究组报道ANG-2在肿瘤上皮中广泛表达。Ahmad，S.A.，等，Cancer 92(2001)1138-43。其他研究者报道了相似的发现。Chen，L.，等，J.Tongji Med.Univ.21(2001)228-35。通过在存档的人乳腺癌样品中检测ANG-2 mRNA水平，Sfiligoi，C.，等，Int.J.Cancer(国际癌症杂志)103(2003)466-74报道ANG-2 mRNA与辅助淋巴结侵袭、短的无疾病时间和差的总体生存显著相关。Tanaka，F.，等，Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29综述了分别具有病理I-期至IIIA期非小细胞肺癌(NSCLC)的总共236个患者。使用免疫组织化学，他们发现16.9％的NSCLC患者是ANG-2阳性的。ANG-2阳性肿瘤的微血管密度比ANG-2阴性的微血管密度显著更高。ANG-2的这种血管生成效应仅在VEGF表达高的时候可见。此外，ANG-2的阳性表达是预测较差手术后生存的显著因子。Tanaka，F.，等，Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29。然而，他们没有发现Ang-1表达和微血管密度之间有显著相关性。Tanaka，F.，等，Cancer Res.(癌症研究)62(2002)7124-29。这些结果表明ANG-2是数种类型癌症预后不良患者的指示剂。

最近，使用ANG-2敲除小鼠模型，Yancopoulos研究组报道出生后血管生成中需要ANG-2。Gale，N.W.，等，Dev.Cell 3(2002)411-23。他们显示眼中玻璃样脉管系统的发育编程性退化在ANG-2敲除小鼠中没有发生，并且它们的视网膜血管没有从视网膜中央动脉萌发出来。Gale，N.W.，等，Dev.Cell 3(2002)411-23。他们还发现ANG-2缺失导致淋巴脉管系统的模式形成和功能的严重缺陷。Gale，N.W.，等，Dev.Cell 3(200)411-23。通过Ang-1的遗传拯救纠正了淋巴缺陷，但没有纠正血管生成缺陷。Gale，N.W.，等，Dev.Cell 3(2002)411-23。

Peters及其同事报道了可溶性Tie2当作为重组蛋白或在病毒表达载体中递送时，抑制小鼠模型中鼠乳腺癌(mammary carcinoma)和黑素瘤的体内生长。Lin，P.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)95(1998)8829-34；Lin，P.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)100(1997)2072-78。如此处理的肿瘤组织中血管密度大大降低。此外，可溶性Tie2阻断肿瘤细胞条件培养基刺激的大鼠角膜中的血管生成。Lin，P.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)100(1997)2072-78。另外，Isner及其小组证明向VEGF添加ANG-2比单独的VEGF显著促进更长且更多周围新血管生成。Asahara，T.，等，Circ.Res.83(1998)233-40。过量可溶性Tie2受体妨碍VEGF-诱导的新血管生成经ANG-2的调节。Asahara，T.，等，Circ.Res.83(1998)233-40。Siemeister，G.，等，Cancer Res.(癌症研究)59(1999)3185-91通过裸鼠异种移植显示在异种移植物中过表达Flt-1或Tie2的胞外配体-结合结构域导致途径的显著抑制不能被另一种补偿，表明应当认为VEGF受体途径和Tie2途径是两种独立的体内血管生成过程中必需的介质。Siemeister，G.，等，Cancer Res.(癌症研究)59：3(1999)3185-91。这一点被White，R.，R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院报)100(2003)5028-33更近的公开所证明。在他们的研究中，证明了特异性结合且抑制ANG-2的核酸酶-抗性RNA适体(aptamer)显著抑制大鼠角膜微袋(micropocket)血管生成模型中bFGF诱导的新血管形成。

双特异性抗体

最近已经开发了广泛多样的重组抗体形式，例如通过融合例如IgG抗体形式和单链结构域的四价双特异性抗体(见例如Coloma，M.J.，等，自然生物技术(Nature Biotech.)15(1997)159-163；WO 2001/077342和Morrison，S.L.等，自然生物技术(Nature Biotech.)25(2007)1233-1234)。

此外，开发了能够结合两种以上抗原的若干其他新型形式，其中抗体核心结构(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)不再保持诸如双抗体(diabodies)、三链抗体或四链抗体(tetrabodies)，微型抗体(minibodies)，若干单链形式(scFv，双-scFv)(Holliger P，等，Nature Biotech(自然生物技术)23(2005)1126-11362005；Fischer N.，和Léger，O.，病理学(Pathobiology)74(2007)3-14；Shen J，等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)318(2007)65-74；Wu，C.等，自然生物技术(Nature Biotech)25(2007)1290-1297)。

所有这样的形式使用接头将抗体核心(IgA，IgD，IgE，IgG或IgM)与其他结合蛋白(例如scFv)融合或融合例如两个Fab片段或scFv(Fischer N.，Léger O.，病理学(Pathobiology)74(2007)3-14)。人们可能一直希望保持效应子功能，诸如例如补体依赖性细胞毒性(CDC)或抗体依赖性细胞毒性(ADCC)，它们通过保持与天然存在的抗体的高度相似性而通过Fc受体结合来介导。

在WO 2007/024715中，报道了双重可变的结构域免疫球蛋白作为改造的多价和多特异性结合蛋白。在US 6,897,044中报道了具有生物活性的抗体二聚体的制备方法。在US 7,129,330中报道了具有至少四个彼此通过肽接头连接的可变结构域的多价F_V抗体构建体。在US 2005/0079170中报道了二聚体和多聚体抗原结合结构。在US 6,511,663中报道了三价或四价单特异性抗原结合蛋白，其包含通过连接结构彼此共价结合的三个或四个Fab片段，所述蛋白不是天然免疫球蛋白。在WO 2006/020258中报道了这样的四价双特异性抗体，其可以在原核细胞和真核细胞中有效表达，并且用于治疗和诊断方法中。在US 2005/0163782中报道了在包含两种类型的多肽二聚体的混合物中将通过至少一个链间二硫键连接的二聚体与不通过至少一个链间二硫键连接的二聚体分离或优先合成通过至少一个链间二硫键连接的二聚体的方法。在US 5,959,083中报道了双特异性四价受体。在WO 2001/077342中报道了具有三个或多个功能性抗原结合位点的改造的抗体。

在WO 1997/001580中报道了多特异性和多价抗原结合多肽。WO 1992/004053报道了共轭对缀合物(homoconjugate)，其典型地由结合相同抗原决定簇的IgG类的单克隆抗体制备，通过合成交联共价连接。在WO 1991/06305中报道了对于抗原具有高亲和力的低聚单克隆抗体，其中分泌典型地是IgG类的低聚物，其具有两种以上的免疫球蛋白单体，所述免疫球蛋白单体缔合在一起形成四价或六价IgG分子。在US 6,350,860中报道了绵羊来源的抗体和改造的抗体构建体，其可以用于治疗其中干扰素γ活性是致病性的疾病。在US 2005/0100543中，报道了可靶向的构建体，所述构建体是双特异性抗体的多价载体，即可靶向的构建体的每个分子可以作为两种以上双特异性抗体的载体。在WO 1995/009917中报道遗传改造的双特异性四价抗体。在WO 2007/109254中，报道了由稳定的scFv组成或包含稳定的scFv的稳定的结合分子。

VEGF和ANG-2抑制剂的组合

WO 2007/068895涉及ANG-2拮抗剂和VEGF，KDR和/或FLTL拮抗剂的组合。WO 2007/089445涉及ANG-2和VEGF抑制剂的组合。

WO 2003/106501涉及结合血管生成素并含有多聚化结构域的融合蛋白。WO 2008/132568涉及结合血管生成素和VEGF的融合蛋白。

发明概述

本发明第一方面是特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体的特征在于：

i)所述抗原结合位点每个是一对抗体重链可变结构域和抗体轻链可变结构域；

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：94的CDR3区，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：18，或SEQ ID NO：95的CDR2区，和SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：19，或SEQ IDNO：96的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4，SEQ IDNO：12，SEQ ID NO：20，或SEQ ID NO：97的CDR3区，SEQ ID NO：5，SEQID NO：13，SEQ ID NO：21，或SEQ ID NO：98的CDR2区，和SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：22，或SEQ ID NO：99的CDR1区；

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：78，或SEQ ID NO：86的CDR3区，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：55，SEQID NO：63，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：79，或SEQ ID NO：87的CDR2区，和SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：64，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：80，或SEQ ID NO：88的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：28，具有突变T92L，H93Q和W94T的SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：57，SEQID NO：65，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：81，或SEQ ID NO：89的CDR3区，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：58，SEQID NO：66，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90的CDR2区，和SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：83，或SEQ ID NO：91的CDR1区。

在本发明的一个实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体的特征在于

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区，SEQ ID NO：2的CDR2区，和SEQ ID NO：3的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区，SEQID NO：5的CDR2区，和SEQ ID NO：6的CDR1区；

或所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：9的CDR3区，SEQ ID NO：10的CDR2区，和SEQ IDNO：11的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：12的CDR3区，SEQ ID NO：13的CDR2区，和SEQ ID NO：14的CDR1区；

或所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：17的CDR3区，SEQ ID NO：18的CDR2区，和SEQ IDNO：19的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：20的CDR3区，SEQ ID NO：21的CDR2区，和SEQ ID NO：22的CDR1区；和

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：25的CDR3区，SEQ ID NO：26的CDR2区，和SEQ IDNO：27的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：28或具有突变T92L，H93Q和W94T的SEQ ID NO：28的CDR3区，SEQ ID NO：29的CDR2区，和SEQ ID NO：30的CDR1区。

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：23，或SEQ ID NO：100作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：24，或SEQ ID NO：101作为轻链可变结构域，和

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：31，SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：68，SEQ IDNO：76，SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92作为重链可变结构域，和SEQ IDNO：32，具有突变T92L，H93Q和W94T的SEQ ID NO：32，SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：77，SEQ IDNO：85或SEQ ID NO：93作为轻链可变结构域。

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1，或SEQ ID NO：94的CDR3区，SEQ ID NO：2，或SEQ IDNO：95的CDR2区，和SEQ ID NO：3，或SEQ ID NO：96的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4，或SEQ ID NO：97的CDR3区，SEQID NO：5，或SEQ ID NO：98的CDR2区，和SEQ ID NO：6，或SEQ ID NO：99的CDR1区；

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：78，或SEQ ID NO：86的CDR3区，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：71，SEQID NO：79，或SEQ ID NO：87的CDR2区，和SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：80，或SEQ IDNO：88的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：49，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：81，或SEQ ID NO：89的CDR3区，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90的CDR2区，和SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：83，或SEQ ID NO：91的CDR1区。

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：100作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：101作为轻链可变结构域，和

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：76，SEQ IDNO：84或SEQ ID NO：92作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：53，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作为轻链可变结构域。

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区，SEQ ID NO：2的CDR2区，和SEQ ID NO：3的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区，SEQID NO：5的CDR2区，和SEQ ID NO：6的CDR1区；和

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：46的CDR3区，SEQ ID NO：47的CDR2区，和SEQ IDNO：48的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：49的CDR3区，SEQ ID NO：50的CDR2区，和SEQ ID NO：51的CDR1区。

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：8作为轻链可变结构域，和

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：52作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：53作为轻链可变结构域。

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：62，或SEQ ID NO：86的CDR3区，SEQ ID NO：63，或SEQ ID NO：87的CDR2区，和SEQ ID NO：64，或SEQ ID NO：88的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：65，或SEQ ID NO：89的CDR3区，SEQ ID NO：66，或SEQ ID NO：90的CDR2区，和SEQ ID NO：67，或SEQ ID NO：91的CDR1区。

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：68，或SEQ ID NO：92作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：69，或SEQ ID NO：93作为轻链可变结构域。

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：62的CDR3区，SEQ ID NO：63的CDR2区，和SEQ IDNO：64的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：65的CDR3区，SEQ ID NO：66的CDR2区，和SEQ ID NO：67的CDR1区。

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点包含SEQ ID NO：7作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：8作为轻链可变结构域；和

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：68作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：69作为轻链可变结构域。

所述双特异性抗体至少是二价的，并且可以是三价、四价或多价的。

优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价、三价或四价的。

本发明的另一方面是编码所述双特异性抗体的链的核酸分子。

本发明还提供含有根据本发明所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞表达所述核酸，和用于重组产生根据本发明所述抗体的含有这种载体的宿主细胞。

本发明还包括原核或者真核宿主细胞，其包含根据本发明的载体。

本发明还包括产生根据本发明所述的双特异性抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据本发明所述的核酸并从所述细胞或该细胞培养物上清液回收所述双特异性抗体。本发明还包括通过这种重组方法获得的抗体。

本发明的另一方面是包含所述双特异性抗体的药物组合物，所述组合物用于治疗癌症，所述双特异性抗体用于制备治疗癌症的药物的应用，通过向需要所述治疗的患者施用所述双特异性抗体来治疗患有癌症的患者的方法。

根据本发明所述的双特异性抗体对于需要VEGF和ANG-2靶向疗法的人患者显示益处。根据本发明所述的抗体具有新的和有创造性的性质，从而导致对于患有所述疾病的患者，尤其是患有癌症的患者的益处。令人惊讶地发现根据本发明所述的双特异性抗体与各自单特异性母体抗体的组合相比在肿瘤生长和/或抑制肿瘤血管生成中更有效。

发明详述

本发明一个实施方案是特异性结合人VEGF和人ANG-2的双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于：

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：62，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：78，或SEQ ID NO：86的CDR3区，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：55，SEQID NO：63，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：79，或SEQ ID NO：87的CDR2区，和SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：56，SFQ IDNO：64，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：80，或SEQ ID NO：88的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：28，具有突变T92L，H93Q和W94T的SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：57，SEQID NO：65，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：81，或SEQ ID NO：89的CDR3区，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：58，SEQID NO：66，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90的CDR2区，和SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：83，或SEQ ID NO：91的CDR1区。

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：54，SEQ ID NO：62，SEQID NO：70，SEQ ID NO：78，或SEQ ID NO：86的CDR3区，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：55，SEQ ID NO：63，SEQ ID NO：71，SEQ IDNO：79，或SEQ ID NO：87的CDR2区，和SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：56，SEQ ID NO：64，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：80，或SEQ IDNO：88的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：41，SEQ IDNO：49，SEQ ID NO：57，SEQ ID NO：65，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：81，或SEQ ID NO：89的CDR3区，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：58，SEQ ID NO：66，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90的CDR2区，和SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：59，SEQ ID NO：67，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：83，或SEQ ID NO：91的CDR1区。

ii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：52，SEQ ID NO：60，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：76，SEQ IDNO：84或SEQ ID NO：92作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：45，SEQ IDNO：53，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：85或SEQ ID NO：93作为轻链可变结构域。

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：78的CDR3区，SEQ ID NO：79的CDR2区，和SEQ IDNO：80的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：81的CDR3区，SEQ ID NO：82的CDR2区，和SEQ ID NO：83的CDR1区。

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包含SEQ ID NO：84作为重链可变结构域，和SEQ ID NO：85作为轻链可变结构域。

本发明另一个实施方案是特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体，其特征在于母体抗-ANG-2抗体不特异性结合人血管生成素1(ANG-1)。典型的特异性结合人ANG-2但不结合人ANG-1的母体抗体是例如Ang2s_R3_LC03，Ang2s_LC09，Ang2i_LC06，Ang2i_LC07，并且优选地是Ang2i_LC10或与Ang2s_R3_LC03，Ang2s_LC09，Ang2i_LC06，Ang2i_LC07，Ang2i_LC10结合相同表位的抗体，优选地抗体结合与Ang2i_LC06，或Ang2i_LC10相同的表位。因此在本发明的一个实施方案中，特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)但不结合人ANG-1(或其中母体抗-ANG-2抗体不特异性结合人血管生成素1(ANG-1))的双特异性抗体结合与Ang2s_R3_LC03，Ang2s_LC09，Ang2i_LC06，Ang2i_LC07，Ang2i_LC10相同的表位，优选地结合与Ang2i_LC06或Ang2i_LC10相同的表位。与特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)以及结合人ANG-1的双特异性抗体相比较，这种特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)但不结合人ANG-1(或其中母体抗-ANG-2抗体不特异性结合人血管生成素1(ANG-1))的双特异性抗体可具有改善的性质，如例如生物学或药理学活性，更低的毒性或药物代谢动力学谱。

因此一个优选的实施方案是特异性结合人VEGF和人ANG-2的双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于：该第二抗原结合位点不特异性结合人血管生成素1(ANG-1)。

本发明的一个实施方案是特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点，其特征在于：结合亲和力KD(对VEGF特异性的抗原结合位点)/KD(对ANG-2特异性的抗原结合位点)的比值是1.0-10.0，优选是1.5-8.0(在一个实施方案是5.0-8.0)且优选地绝对KD值在10^-8-10^-13mol/l的范围中。KD值通过在ANG-2/VEGF结合BIACORE中确定(见实施例2和图15A)。因为人VEGF和人ANG-2两种蛋白在人血清中均以大约相同的浓度以可溶性受体配体存在，通过双特异性抗体阻断所述两种受体配体在用这种双特异性抗体治疗癌症或血管疾病的过程中可产生在抗血管生成效应、肿瘤生长抑制或抵抗机制方面改善的性质，所述双特异性抗体的特征在于结合亲和力KD(对VEGF特异性的抗原结合位点)/KD(对ANG-2特异性的抗原结合位点)的比值是1.0-10.0，优选是1.5-8.0，并且在一个实施方案是5.0-8.0。优选地所述双特异性抗体的特征在于结合亲和力KD(对VEGF特异性的抗原结合位点)/KD(对ANG-2特异性的抗原结合位点)的比值是1.0-10.0，优选是1.5-8.0(在一个实施方案是5.0-8.0)，并且所述双特异性抗体包含SEQ ID NO：7的重链可变结构域和SEQ ID NO：8的轻链可变域作为特异性结合VEGF的第一抗原结合位点，和a)SEQ ID NO：52的重链可变结构域和SEQ ID NO：53的轻链可变结构域作为所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点，或者b)SEQ ID NO：84的重链可变结构域和SEQ ID NO：85的轻链可变结构域作为所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点。

用于本文时，“抗体”指包含抗原结合位点的结合蛋白。术语“结合位点”或“抗原结合位点”用于本文时，指配体实际上结合的抗体分子的区域。术语“抗原结合位点”包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)或VH/VL的对，并可源自完整抗体或抗体片段如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab或(Fab)₂。在本发明的一个实施方案中，每个抗原结合位点包含抗体重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，和优选地由抗体轻链可变结构域(VL)和抗体重链可变结构域(VH)组成的对形成。

特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)的抗原结合位点，并且特别是重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)可如下获得，a)来自已知抗-VEGF抗体，如Kim等，Nature(自然)362(1993)841-844；Warren，R.S.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)95(1995)1789-1797；Borgstrom，P.，等，Cancer Res.(癌症研究)56(1996)4032-4039；Melnyk，O.，等，CancerRes.(癌症研究)56(1996)921-924).WO 94/10202，WO 98/45332，WO 2005/00900，WO 00/35956和US 2007/0141065或b)来自通过其中使用人VEGF蛋白或核酸或其片段或通过噬菌体展示的从头(de novo)免疫法获得的新抗-VEGF抗体。

特异性结合人血管生成素-2(ANG-2)的抗原结合位点，特别是重链可变结构域(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)可如下获得，a)来自已知抗-ANG-2抗体，如WO 03/030833，WO 2006/068953，WO 2006/045049或US 6,166,185；或b)来自通过其中使用人ANG-2蛋白或核酸或其片段或通过噬菌体展示的从头免疫法获得的新抗-ANG-2抗体。

抗体特异性指抗体对于抗原的特定表位的选择性识别。天然抗体，例如是单特异性的。

根据本发明所述的“双特异性抗体”是具有两种不同的抗原结合特异性的抗体。如果抗体具有超过一种特异性，识别的表位可以与单抗原或一种以上的抗原相关。本发明的抗体特异于两种不同的抗原，即作为第一抗原的VEGF和作为第二抗原的ANG-2。

术语“单特异性”抗体，用于本文时指具有一个或多个分别结合于相同抗原的相同表位的结合位点的抗体。

术语“价”在本申请中使用时指结合位点在抗体分子上存在的具体数量。象这样，术语“二价”，“四价”，和“六价”指在抗体分子上分别存在两个结合位点，四个结合位点，和六个结合位点。根据本发明的双特异性抗体是至少“二价的”，并且可以是“三价”或“多价”的(例如(“四价”或六价)的)。优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价，三价或四价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是二价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的。在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的。

本发明的抗体具有两个以上的结合位点，并且是双特异性的。即，即使是在存在两个以上结合位点(即，抗体是三价或多价的)的情形中，所述抗体可以是双特异性的。本发明的双特异性抗体包括，例如多价单链抗体、双抗体和三链抗体，以及具有全长抗体的恒定结构域结构的抗体，另外的抗原结合位点(例如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域，Fab，或(Fab)2))通过一个或多个肽接头连接所述全长抗体的恒定结构域结构。所述抗体可以是来自单一物种的全长抗体，或可以是嵌合化或人源化的。对于具有超过两个抗原结合位点的抗体，一些结合位点可以是相同的，只要所述蛋白具有对于两个不同抗原的结合位点。即，当第一结合位点特异于VEGF时，第二结合位点特异于ANG-2，反之亦然。

人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)(SEQ ID No：105)在例如Leung，D.W.，等，Science(科学)246(1989)1306-9；Keck，P.J.，等，Science(科学)246(1989)1309-12和Connolly，D.T.，等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)264(1989)20017-24中描述。VEGF参与与肿瘤和眼内病症相关的正常和异常的血管发生与新血管生成的调控(Ferrara，N.，等，Endocr.Rev.(内分泌综述)18(1997)4-25；Berkman，R.A.，等，J.Clin.Invest.(临床研究杂志)91(1993)153-159；Brown，L.F.，等，HumanPathol.(人类病理学)26(1995)86-91；Brown，L.F.，等，Cancer Res.(癌症研究)53(1993)4727-4735；Mattern，J.，等，Brit.J.Cancer(英国癌症学杂志)73(1996)931-934；和Dvorak，H.，等，Am.J.Pathol.(美国病理学杂志)146(1995)1029-1039)。VEGF是同二聚体糖蛋白，已经从数种来源分离。VEGF对内皮细胞显示高度特异性的促有丝分裂活性。

人血管生成素-2(ANG-2)(替代地缩写为ANGPT2或ANG2)(SEQ IDNo：106)在Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60和Cheung，A.H.，等，Genomics 48(1998)389-91中描述。发现血管生成素-1和-2(ANG-1(SEQ ID No：107)和ANG-2(SEQ ID No：106))是Ties的配体，Ties是选择性在血管内皮内表达的酪氨酸激酶家族。Yancopoulos，G.D.，等，Nature(自然)407(2000)242-48。现在有四种明确的血管生成素家族的成员。血管生成素-3和-4(Ang-3和Ang-4)可代表小鼠和人中相同基因位点的非常不同的对应物。Kim，I.，等，FEBS Let，443(1999)353-56；Kim，I.，等，J Biol Chem 274(1999)26523-28。ANG-1和ANG-2最初在组织培养实验中分别作为激动剂和拮抗剂而鉴定(对于ANG-1，见：Davis，S.，等，Cell(细胞)87(1996)1161-69；对于ANG-2，见：Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60)。所有已知血管生成素基本上都结合Tie2，且Ang-1和-2均以3nM(Kd)的亲和力结合Tie2。Maisonpierre，P.C.，等，Science(科学)277(1997)55-60。

本发明的抗体的抗原结合位点可包含六个互补性决定区(CDRs)，其在不同程度上有助于结合位点对于抗原的亲和力。存在三个重链可变结构域CDRs(CDRH1，CDRH2和CDRH3)和三个轻链可变结构域CDRs(CDRL1，CDRL2和CDRL3)。CDR和构架区(FRs)的程度通过与氨基酸序列的汇编数据库进行比较来确定，所述氨基酸序列中那些区域根据序列之间的可变性来确定。此外，还包括在本发明范围内的是包含更少CDRs的功能性抗原结合位点(即，在结合特异性由三个、四个或五个CDRs决定的情形中)。例如，少于6个CDRs的完整组对于结合可能是足够的。在一些情形中，VH或VL结构域是足够的。

在某些实施方案中，本发明的抗体还包含一个或多个免疫球蛋白种类的免疫球蛋白恒定区。免疫球蛋白种类包括IgG，IgM，IgA，IgD，和IgE同种型，并且在IgG和IgA的情形中，包括它们的亚型。在优选的实施方案中，本发明的抗体具有IgG型抗体的恒定结构域结构，但是具有四个抗原结合位点。这是通过例如将两个特异性结合VEGF的完整抗原结合位点(例如，单链Fv)与特异性结合ANG-2的完整抗体的N端或C端重链或轻链进行连接来实现。备选地这是通过将两个特异性结合ANG-2的完整结合肽与特异性结合VEGF的全长抗体的C端重链融合实现。这四个抗原结合位点优选地对于两种不同结合特异性的每种包含两个抗原结合位点。

术语“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”用于本文中时，指单一氨基酸组成的抗体分子制剂。

术语“嵌合抗体”指一种抗体，其包括来自一种来源或物种的可变区，即结合区，以及源自不同来源或物种的恒定区的至少一部分，其通常通过重组DNA技术进行制备。优选包括鼠可变区和人恒定区的嵌合抗体。本发明涵盖的“嵌合抗体”的其它优选形式是这样的那些，其中恒定区已经被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。也将这种“嵌合”抗体称作“类别转换抗体”。嵌合抗体是被表达的免疫球蛋白基因的产物，该基因包括编码免疫球蛋白可变区的DNA区段和编码免疫球蛋白恒定区的DNA区段。制备嵌合抗体的方法包括目前在本领域众所周知的常规重组DNA和基因转染技术。见，例如，Morrison，S.L.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)81(1984)6851-6855；US 5,202,238和5,204,244。

术语“人源化抗体”指这样的抗体，其中的构架或“互补性决定区”(CDR)已经被修饰为包括与母体免疫球蛋白相比特异性不同的免疫球蛋白的CDR。在一个优选实施方案中，将鼠CDR移植到人抗体的构架区以制备“人源化抗体”。见例如，Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327；和Neuberger，M.S.，等，自然(Nature)314(1985)268-270。特别优选的CDRs对应于识别以上指出的关于嵌合抗体的抗原的那些代表性序列。本发明涵盖的“人源化抗体”的其它形式是这样的那些，其中恒定区已经另外被从初始抗体的恒定区开始进行修饰或改变以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或Fc受体(FcR)结合。

用于本文时，术语“人抗体”意欲包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。人抗体是现有技术中公知的(van Dijk，M.A.，和van de Winkel，J.G.，当前化学生物学观点(Curr.Opin.Chem.Biol).5(2001)368-374)。人抗体还可以在转基因动物(例如小鼠)中产生，所述转基因动物在免疫时能够在缺乏内源免疫球蛋白生成的条件下产生人抗体的全部所有组成成分或选择部分(selection)。在所述种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击时产生人抗体(见例如Jakobovits，A.，等.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)90(1993)2551-2555；Jakobovits，A.，等.，Nature(自然)362(1993)255-258；Bruggemann，M.，等.，Year Immunol.(免疫学年度)7(1993)33-40)。人抗体还可以在噬菌体展示文库中产生(Hoogenboom，H.R.，和Winter，G.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)227(1992)381-388；Marks，J.D.，等.，J.Mol.Biol.(分子生物学杂志)222(1991)581-597)。Cole，A.等和Boemer，P.，等的技术也可以用于制备人单克隆抗体(Cole，A.，等.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy(单克隆抗体和癌症治疗)，Liss A.L.，p.77(1985)；和Boerner，P.，等.，J.Immunol.(免疫学杂志)147(1991)86-95)。如已经对按照本发明的嵌合和人源化抗体所提及地，术语“人抗体”用于本文中时还包括这样的抗体，其在恒定区内进行修饰以产生按照本发明的特性，特别是关于C1q结合和/或FcR结合，例如通过“类别转换”即改变或突变Fc部分(例如由IgG1到IgG4和/或IgG1/IgG4突变。)

用于本文时，术语“重组人抗体”意欲包括通过重组方法制备、表达、产生或分离的所有人抗体，诸如分离自宿主细胞，诸如NS0或CHO细胞的抗体或分离自人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)的抗体，或利用转染到宿主细胞中的重组表达载体表达的抗体。这种重组人抗体具有处于重排形式的可变区和恒定区。按照本发明的重组人抗体已经经历了体内体细胞高变。因此，重组抗体的VH和VL区域的氨基酸序列是尽管源自并涉及人种系VH和VL序列，但在体内可能不天然存在于人抗体种系所有组成成分中的序列。

“可变结构域”(轻链(VL)的可变结构域，重链(VH)的可变区)用于本文中时，表示直接参与抗体与抗原结合的每对轻链和重链对。可变人轻链和重链的结构域具有相同的一般结构且每个结构域包括4个构架(FR)区，所述构架区的序列普遍保守，其通过3个“高变区”(或互补性决定区，CDRs)相连接。构架区采用β-折叠构象且CDR可以形成连接β-折叠结构的环。每条链中的CDR通过构架区以其三维结构保持并与来自另一条链的CDR一起形成抗原结合位点。抗体重链和轻链CDR3区在按照本发明的抗体的结合特异性/亲和力方面发挥特别重要的作用并因此提供本发明的另一个目的。

用于本文时，术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括来自“互补性决定区”或“CDRs”的氨基酸残基。“构架”或“FR”区是除本文中定义的高变区残基之外的那些可变结构域区域。因此，抗体的轻链和重链从N端到C端包括结构域FR1，CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。各条链上的CDR通过所述构架氨基酸分开。特别地，重链的CDR3是最有助于抗原结合的区域。按照Kabat等，免疫目的的蛋白质序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，公众健康服务，国家健康研究所(Public Health Service，NationalInstitutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))的标准定义确定CDR和FR区域。

根据本发明所述的双特异性抗体还包括具有“保守序列修饰”的这些抗体(这是指双特异性抗体的“变体”)。这意味着不影响或改变根据本发明所述的抗体的上述特征的核苷酸和氨基酸序列修饰。可以通过本领域已知的标准技术引入修饰，如位点定向诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基取代的置换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已经在本领域中定义。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)，具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)，具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)，具有β支链侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，在双特异性<VEGF-ANG-2>抗体中的预测的非必需氨基酸残基可以优选地被来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基置换。因此，“变体”双特异性<VEGF-ANG-2>抗体在本文是指这样的分子，其氨基酸序列与“母体”双特异性<VEGF-ANG-2>抗体氨基酸序列的不同之处在于在母体抗体的一个或多个可变区或恒定区中至多10个，优选约2个到约5个添加、缺失和/或置换。氨基酸置换可以通过基于分子建模的诱变进行，如在Riechmann，L.，等，自然(Nature)332(1988)323-327和Queen，C.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)10029-10033中所述。根据本发明所述的“变体”双特异性<VEGF-ANG-2>抗体也包括这样的双特异性抗体形式，其中接头(如果存在)被修饰或被另一个接头替换。

用于本文时，术语“结合”或“特异性结合”指在体外测定法中，优选地在用纯化的野生型抗原的等离子测定(BIAcore，GE-Healthcare Uppsala，Sweden)(实施例2)中，抗体与抗原(人VEGF或人ANG-2)的表位的结合。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。结合或特异性结合意为10^-8mol/l以下，优选地10^-9M到10^-13mol/l的结合亲和力(K_D)。

抗体与FcγRIII的结合可以通过BIAcore测定法(GE-Healthcare，Uppsala，Sweden)进行研究。结合的亲和力由术语ka(来自抗体/抗原复合物的抗体的缔合的速率常数)，k_D(解离常数)和K_D(k_D/ka)定义。

用于本文时，术语“不结合ANG-1”或“不特异性结合ANG-1”表示在体外ANG-1结合ELISA测定法中抗体具有高于8000ng/ml的EC50值(根据实施例9)。

术语“表位”包括能够特异性结合抗体的任何多肽决定簇。在某些实施方案中，表位决定簇包括分子的化学活性表面分组(groupings)，诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基，在某些实施方案中，可以具有特定的三维结构特征，和/或特定的带电特性。表位是被抗体结合的抗原区域。

在某些实施方案中，当抗体在蛋白和/或大分子的复杂混合物中优选识别其靶抗原时，将该抗体称为与抗原特异性结合。

在本发明的一个实施方案中，所述双特异性抗体包含全长母体抗体作为支架。

术语“全长抗体”指由两条“全长抗体重链”和两条“全长抗体轻链”组成的抗体。“全长抗体重链”是这样的多肽，其在N端到C端方向由抗体重链可变结构域(VH)、抗体恒定重链结构域1(CH1)，抗体铰链区(HR)，抗体重链恒定结构域2(CH2)，和抗体重链恒定结构域3(CH3)组成，缩写为VH-CH1-HR-CH2-CH3；并且在IgE亚类的抗体的情形中，任选地还包括抗体重链恒定结构域4(CH4)。优选地，“全长抗体重链”是在N端到C端方向由VH，CH1，HR，CH2和CH3组成的多肽。“全长抗体轻链”是在N端到C端方向由抗体轻链可变结构域(VL)，和抗体轻链恒定结构域(CL)组成的多肽，缩写为VL-CL。所述抗体轻链恒定结构域(CL)可以是κ(kappa)或λ(lambda)。两条全长抗体链通过在CL结构域和CH1结构域之间的多肽间二硫键和全长抗体重链的铰链区之间的多肽间二硫键连接在一起。典型的全长抗体的实例是天然抗体如IgG(例如，IgG1和IgG2)，IgM，IgA，IgD，和IgE。根据本发明所述的全长抗体可以来自单一物种，例如人，或它们可以是嵌合的或人源化的抗体。根据本发明所述的全长抗体包含分别由VH和VL对形成的两个抗原结合位点，这两个抗原结合位点都特异性结合于相同的抗原。因此，包含第一抗原结合位点并且由两条抗体轻链和两条抗体重链组成的单特异性二价(＝全长)抗体是全长抗体。所述全长抗体的重链或轻链的C端指在所述重链或轻链的C端的最后的氨基酸。所述全长抗体的重链或轻链的N端指在所述重链或轻链的N端的最后的氨基酸。

对于根据本发明的特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体，双特异性抗体形式的优选实施方案是具有两种不同特异性的二价抗体，如例如a)在WO 2009/080251，WO 2009/080252或WO 2009/080253(结构域交换的抗体-见实施例13)中所述，或b)基于scFab-Fc融合抗体，其中一个单链Fab片段(最终经二硫化物稳定的)特异于VEGF，而另一个单链Fab片段(最终经二硫化物稳定的)特异于ANG-2(见实施例14)，或c)在Ridgway，J.B.，Protein Eng.9(1996)617-621；WO 96/027011；Merchant，A.M.，等，自然生物技术(Nature Biotech)16(1998)677-681；Atwell，S.，等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)270(1997)26-35和EP 1870459A1中所描述的。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：121，SEQ ID NO：122，SEQ ID NO：123和SEQ ID NO：124的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：125，SEQ ID NO：126，SEQ ID NO：127和SEQ ID NO：128的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：129，SEQ ID NO：130，SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：133和SEQ ID NO：134的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：135和SEQ ID NO：136的氨基酸序列或其变体。

这些氨基酸序列基于作为结合VEGF的第一抗原结合位点的SEQ IDNO：7的重链可变结构域，和SEQ ID NO：8的轻链可变结构域(来自贝伐单抗(阿瓦斯丁))，并且基于作为结合ANG-2的第二抗原结合位点的SEQID NO：52的重链可变结构域，和SEQ ID NO：53的轻链可变结构域(来自Ang2i_LC06)。

在一个实施方案中，所述双特异性抗体是三价的，使用例如基于特异性结合两种抗原VEGF或ANG-2之一的全长抗体的形式，仅在一条重链的一个C端，scFab片段融合在所述全长抗体上，所述scFab片段特异性结合于两种抗原VEGF或ANG-2的另一种上，包括凸起-进入-孔洞技术(knobs-into holes technology)，如在EP申请号09004909.9(见实施例11)中所述，或例如基于特异性结合两种抗原VEGF或ANG-2之一的全长抗体的形式，在一条重链的一个C端，所述全长抗体融合VH或VH-CH1片段，并且在第二重链的另一个C端融合VL或VL-CL片段，所述VL或VL-CL片段特异性结合两种抗原VEGF或ANG-2的另一种，包括凸起-进入-孔洞技术，如在EP申请号09005108.7中所述(见实施例12)。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：115，SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：118，SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120的氨基酸序列或其变体。

对于根据本发明的特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体的优选双特异性抗体形式是具有两种不同特异性的四价抗体(TvAb)，如例如在WO 2007/024715，或WO2007/109254或EP申请号09004909.9中所述。因此在一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，使用如例如在WO 2007/024715，或WO 2007/109254或EP申请号09004909.9中所述的形式(见实施例1或10)。

在本发明的一个实施方案中，双特异性四价抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06的特征在于包含SEQ ID NO：102的肽和SEQ ID NO：62的轻链或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：109和SEQ ID NO：110的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：111和SEQ ID NO：112的氨基酸序列或其变体。

在一个实施方案中，根据本发明的双特异性抗体特征在于包含SEQ IDNO：113和SEQ ID NO：114的氨基酸序列或其变体。

在本发明的一个实施方案中，双特异性四价抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC08的特征在于包含SEQ ID NO：103的肽和SEQ ID NO：62的轻链或其变体。

在根据本发明所述的抗体中的结合位点每个可以由两个可变结构域的对形成，即一个重链可变结构域和一个轻链可变结构域的一对形成。在抗体中的最小结合位点决定簇是重链CDR3区域。

在一个实施方案中，根据本发明所述的双特异性抗体是四价的。在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体具有下列特征：

-其由下列各项组成：

a)由两条全长抗体重链和两条全长抗体轻链组成的单特异性二价母体抗体，其中每条链仅包含一个可变结构域，

b)两个肽接头，

c)两种单特异性单价单链抗体，每种由抗体重链可变结构域，抗体轻链可变结构域和在所述抗体重链可变结构域和所述抗体轻链可变结构域之间的单链接头组成；

和优选地，所述单链抗体连接于单特异性二价抗体重链的相同末端(C端和N端)，或备选地连接于单特异性二价抗体轻链的相同末端(优选地C端)，和更优选地连接于单特异性二价抗体重链的相同末端(C端和N端)。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体是四价的，并且由下列各项组成：

a)全长抗体，其包含所述抗原结合位点并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；和

b)包含所述第二抗原结合位点的两个相同的单链Fab片段，

其中在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端或N端的肽连接体融合于在a)下的所述全长抗体。

a)全长抗体，其包含所述第二抗原结合位点并且由两条抗体重链和两条抗体轻链组成；和

b)包含所述第一抗原结合位点的两个相同的单链Fab片段，

优选地，在b)下的所述单链Fab片段通过在所述全长抗体的重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链或轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个重链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

在一个实施方案中，结合第二抗原的两个相同的单链Fab片段通过在所述全长抗体的每个轻链的C端的肽连接体融合于所述全长抗体。

包括单链Fab片段的此类实施方案在例如EP申请号09004909.9中更详细的描述，其通过引用并入本文。

术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。这些根据本发明所述的肽接头用于连接不同的抗原结合位点和/或最终包含不同的抗原结合位点的抗体片段(例如单链Fv，全长抗体，VH结构域和/或VL结构域，Fab，(Fab)2，Fc部分)从而在一起形成根据本发明所述的双特异性抗体。所述肽接头可以包含下列在表1中列出的氨基酸序列中的一个或多个以及另外任意选择的氨基酸。所述肽接头是具有至少5个氨基酸长度，优选地至少10个氨基酸长度，更优选地10-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。优选地，在b)下的所述肽接头是具有至少10个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3和n＝3，4，5或6)或(x＝4和n＝2，3，4或5)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2((G₄S)₂)。还可以将另外的G＝甘氨酸，例如GG，或GGG加入所述(GxS)n肽接头。

术语“单链接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成起源的。这些根据本发明所述的单链接头用于连接VH和VL结构域从而形成单链Fv。优选地，在c)下的所述单链接头是具有至少15个氨基酸长度，更优选地具有至少20个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述单链接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3和n＝4，5或6)或(x＝4和n＝3，4或5)，优选地x＝4，n＝4或5，更优选地x＝4，n＝4。

此外，所述单链(单链Fv)抗体优选地是二硫化物稳定的。这样的单链抗体的进一步的二硫化物稳定通过在单链抗体的可变结构域之间引入二硫键实现，并且例如在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.10(12)(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等，核酸药物和生物学(Nuclear Medicine&Biology)25(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene)18(1999)1711-1721中进行描述。

在二硫化物稳定的单链抗体的一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键独立于每种单链抗体选自：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100。

在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100之间。

在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链抗体的可变结构域之间的二硫键在重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43之间。

根据本发明所述的双特异性抗体的该四价实施方案的结构特异性结合VEGF和ANG-2，其中抗原A或B之一是VEGF，而另一个是ANG-2。所述结构基于特异性结合抗原A的全长抗体，特异性结合抗原B的两条(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’s通过肽接头连接于所述全长抗体，所述结构在图1和图2的示意图中例示。

在一个实施方案中，优选在单链抗体(单链Fv)的可变结构域VH和VL之间不存在所述任选的二硫化物稳定的所述单链(单链Fv)抗体。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于：在a)下的所述单特异性二价抗体部分特异性结合VEGF并且在c)下的所述两种单价单特异性单链抗体结合ANG-2。

在另一个实施方案中，所述四价双特异性抗体特征在于：在a)下的所述单特异性二价抗体部分特异性结合ANG-2并且在c)下的所述两种单价单特异性单链抗体结合VEGF。

“单链Fab片段”(见图11)是由抗体重链可变结构域(VH)，抗体恒定结构域1(CH1)，抗体轻链可变结构域(VL)，抗体轻链恒定结构域(CL)和接头组成的多肽，其中所述抗体结构域和所述接头从N端到C端方向具有下列顺序之一：a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL；和其中所述接头是至少30个氨基酸的多肽，优选地32-50个氨基酸的多肽。所述单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1和d)VL-CH1-接头-VH-CL，通过在CL结构域和CH1结构域之间的天然二硫键稳定。术语“N-端”指N端的最后氨基酸。术语“C-端”指C端的最后的氨基酸。

在优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头具有从N端到C端方向的下列顺序之一：

a)VH-CH1-接头-VL-CL，或b)VL-CL-接头-VH-CH1，更优选地VL-CL-接头-VH-CH1。

在另一个优选的实施方案中，在所述单链Fab片段中的所述抗体结构域和所述接头具有从N端到C端方向的下列顺序之一：

a)VH-CL-接头-VL-CH1或b)VL-CH1-接头-VH-CL。

术语“肽连接体”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，所述肽优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽连接体用于将单链Fab片段与全长抗体的C端或N端融合从而形成根据本发明所述的多特异性抗体。优选地，在b)下的所述肽连接体是具有至少5个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，优选地具有5-100个氨基酸长度的氨基酸序列的肽，更优选地具有10-50个氨基酸长度的氨基酸序列的肽。在一个实施方案中，所述肽连接体是(GxS)n或(GxS)nGm，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，和(x＝3，n＝3，4，5或6，和m＝0，1，2或3)或(x＝4，n＝2，3，4或5和m＝0，1，2或3)，优选地x＝4和n＝2或3，更优选地x＝4，n＝2。在一个实施方案中，所述肽连接体是(G₄S)₂。

术语“接头”用于本发明时指具有氨基酸序列的肽，其优选地是合成来源的。将根据本发明所述的这些肽用于连接a)VH-CH1与VL-CL，b)VL-CL与VH-CH1，c)VH-CL与VL-CH1或d)VL-CH1与VH-CL从而形成下列根据本发明所述的单链Fab片段a)VH-CH1-接头-VL-CL，b)VL-CL-接头-VH-CH1，c)VH-CL-接头-VL-CH1或d)VL-CH1-接头-VH-CL。在所述单链Fab片段中的所述接头是具有至少30个氨基酸长度的氨基酸序列，优选地具有32-50个氨基酸长度的氨基酸序列。在一个实施方案中，所述接头是(GxS)n，其中G＝甘氨酸，S＝丝氨酸，(x＝3，n＝8，9或10和m＝0，1，2或3)或(x＝4和n＝6，7或8和m＝0，1，2或3)，优选地其中x＝4，n＝6或7和m＝0，1，2或3，更优选地x＝4，n＝7和m＝2。在一个实施方案中，所述接头是(G₄S)₆G₂。

任选地在所述单链Fab片段中，除了在CL-结构域和CH1结构域之间的天然二硫键之外，还通过在下列位置之间引入二硫键来对抗体重链可变结构域(VH)和抗体轻链可变结构域(VL)进行二硫化物稳定：

i)重链可变结构域位置44到轻链可变结构域位置100，

ii)重链可变结构域位置105到轻链可变结构域位置43，或

iii)重链可变结构域位置101到轻链可变结构域位置100(总是根据Kabat的EU索引进行编号)。

单链Fab片段的这些另外的二硫化物稳定通过在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间引入二硫键来实现。引入非天然的二硫化物桥来稳定单链Fv的技术例如描述在WO 94/029350，Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.(1997)1453-59；Kobayashi，H.，等；核药物和生物学(NuclearMedicine&Biology)，卷25，(1998)387-393；或Schmidt，M.，等，原癌基因(Oncogene)(1999)18，1711-1721中。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置44和轻链可变结构域位置100之间。在一个实施方案中，包含在根据本发明所述的抗体中的单链Fab片段的可变结构域之间的任选的二硫键在重链可变结构域位置105和轻链可变结构域位置43之间(总是根据Kabat的EU索引编号)。

在一个实施方案中，优选在单链Fab片段的可变结构域VH和VL之间不具有所述任选的二硫化物稳定的单链Fab片段。

优选地，根据本发明所述的四价双特异性抗体的所述第二实施方案包含两个相同的单链Fab片段(优选地VL-CL-接头-VH-CH1)，所述单链Fab片段都融合于在a)下的所述全长抗体的两条重链的两个C端或融合于在a)下的所述全长抗体的两条轻链的两个C端。这样的融合导致形成两个相同的融合肽((i)重链和单链Fab片段或ii)轻链和单链Fab片段))，所述融合肽与i)全长抗体的轻链或重链共同表达从而提供根据本发明的双特异性抗体。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于所述恒定区是人来源的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG1亚类的，或是具有突变L234A和L235A的人IgG1亚类的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG2亚类的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG3亚类的。

在另一个实施方案中，所述双特异性抗体特征在于根据本发明所述的双特异性抗体的恒定区是人IgG4亚类的，或具有另外的突变S228P的人IgG4亚类的。

目前已经发现根据本发明所述的针对人VEGF和人ANG-2的双特异性抗体具有改善的特征，如生物学或药理学活性、药物代谢动力学性质或毒性。当与针对VEGF和ANG-2的单特异性母体抗体相比时，它们显示出增加的体内肿瘤生长抑制和/或肿瘤血管生成抑制(见实施例16、17和18：将不同双特异性<VEGF-ANG-2>抗体贝伐单抗-ANG2i-LC06与单特异性抗体单独的阿瓦斯丁(贝伐单抗)，单独的ANG2i-LC06或两者的组合相比较)。

另外，与将针对VEGF和ANG-2的两种相应单个单特异性抗体组合应用相比，更小的毒性副作用(其反应在体内应用过程中测试动物提高的体重以及测试动物更少的死亡)也代表了根据本发明所述双特异性抗体的优点。

此外，根据本发明所述的双特异性抗体可以提供益处如减少的剂量和/或施用频率和伴随的费用节省。

术语“恒定区”用于本申请时指除了可变区之外的抗体的结构域的总合。恒定区不直接涉及抗原的结合，但是显示不同的效应子功能。取决于它们重链的恒定区的氨基酸序列，抗体被分为下述类别：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM，并且这些中的一些可以被进一步分为亚类如IgG1，IgG2，IgG3，和IgG4，IgA1和IgA2。对应于不同种类的抗体的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。可以在所有5种抗体种类中发现的轻链恒定区被称为κ(kappa)和λ(lambda)。

术语“来自人来源的恒定区”在本申请中使用时，指亚类IgG1，IgG2，IgG3，或IgG4的人抗体的恒定重链区和/或恒定轻链κ或λ区域。这样的恒定区是现有技术中公知的并且例如由Kabat，E.A.，描述(见例如Johnson，G.，和Wu，T.T.，核酸研究(Nucleic Acids Res.)28(2000)214-218；Kabat，E.A.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)72(1975)2785-2788)。

当IgG4亚类的抗体显示减少的Fc受体(FcγRIIIa)结合时，其它IgG亚类的抗体显示强烈的结合。然而，Pro238，Asp265，Asp270，Asn297(失去Fc糖)，Pro329，Leu234，Leu235，Gly236，Gly237，Ile253，Ser254，Lys288，Thr307，Gln311，Asn434，和His435是这样的残基，其如果改变的话，还提供减少的Fc受体结合(Shields，R.L.，等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(2001)6591-6604；Lund，J.，等，FASEB J.9(1995)115-119；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；EP 0 307 434)。

在一个实施方案中，根据本发明所述的抗体与IgG1抗体比较具有减少的FcR结合，并且所述单特异性二价(全长)母体抗体涉及IgG4亚类的FcR结合或具有突变S228，L234，L235和/或D265的IgG1或IgG2亚类的FcR结合，和/或包含PVA236突变。在一个实施方案中，在单特异性二价(全长)母体抗体中的突变是S228P，L234A，L235A，L235E和/或PVA236。在另一个实施方案中，在单特异性二价(全长)母体抗体中的突变在IgG4中是S228P，在IgG1中是L234A和L235A。恒定重链区在SEQ ID NO：35和36中显示。在一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是具有突变L234A和L235A的SEQ ID NO：35的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是具有突变S228P的SEQ ID NO：36的恒定重链区。在另一个实施方案中，单特异性二价(全长)母体抗体的恒定轻链区是SEQ ID NO：37的κ轻链区或SEQ IDNO：34的λ轻链区。优选的单特异性二价(全长)母体抗体的恒定重链区是SEQ ID NO：35或具有突变S228P的SEQ ID NO：36的恒定重链区。

抗体的恒定区直接涉及ADCC(抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用)和CDC(补体依赖的细胞毒性)。补体激活(CDC)由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的恒定区结合而起始。C1q与抗体的结合由在所谓的结合位点的定义的蛋白-蛋白相互作用所导致。这样的恒定区结合位点在现有技术中是已知的，并且例如由Lukas，T.J.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)127(1981)2555-2560；Brunhouse，R.，和Cebra，J.J.，分子免疫学(Mol.Immunol.)16(1979)907-917；Burton，D.R.，等，自然(Nature)288(1980)338-344；Thommesen，J.E.，等，分子免疫学(Mol.Immunol.)37(2000)995-1004；Idusogie，E.E.，等，免疫学杂志(J.Immunol.)164(2000)4178-4184；Hezareh，M.，等，病毒学杂志(J.Virol.)75(2001)12161-12168；Morgan，A.，等，免疫学(Immunology)86(1995)319-324；和EP 0 307 434所描述。所述恒定区结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。

术语“抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)”指在存在效应细胞时，由根据本发明的抗体裂解人靶细胞。ADCC优选地通过用根据本发明的抗体在存在效应细胞时处理表达CCR5的细胞的制备物进行测量，所述效应细胞如新鲜分离的PBMC或来自暗黄覆盖层的纯化的效应细胞，如单核细胞或天然杀伤(NK)细胞或永久生长的NK细胞系。

术语“补体依赖的细胞毒性(CDC)”指由补体因子C1q与大多数IgG抗体亚类的Fc部分结合而起始的过程。C1q与抗体的结合由在所述结合位点的限定的蛋白-蛋白相互作用所导致。这些Fc部分结合位点是现有技术已知的(见上)。这些Fc部分结合位点例如特征在于氨基酸L234，L235，D270，N297，E318，K320，K322，P331，和P329(根据Kabat的EU索引编号)。亚类IgG1，IgG2，和IgG3的抗体通常显示包括C1q和C3结合的补体激活，而IgG4不激活补体系统并且不结合C1q和/或C3。

根据本发明所述的抗体由重组方式产生。因此，本发明的一个方面是编码根据本发明所述的抗体的核酸，并且另一个方面是包含编码根据本发明所述的抗体的核酸的细胞。用于重组生产的方法是现有技术中广泛已知的并且包含在原核细胞和真核细胞中的蛋白表达，以及随后的抗体分离和通常纯化为药用纯度。对于将前述抗体在宿主细胞中的表达，将编码各个修饰的轻链和重链的核酸通过标准方法插入表达载体中。在适合的原核或真核宿主细胞如CHO细胞，NS0细胞，SP2/0细胞，HEK293细胞，COS细胞，PER.C6细胞，酵母，或大肠杆菌细胞中进行表达，并且将所述抗体从细胞(上清液或裂解后的细胞)中回收。用于重组生产抗体的一般方法是现有技术中公知的，并且例如在Makrides，S.C.，Protein Expr.Purif.17(1999)183-202；Geisse，S.，等，Protein Expr.Purif.8(1996)271-282；Kaufman，R.J.，分子生物技术(Mol.Biotechnol.)16(2000)151-161；Werner，R.G.，Drug Res.48(1998)870-880的综述文章中描述。

双特异性抗体适当地从培养基中通过常规免疫球蛋白纯化方法分离，所述纯化方法如，例如蛋白A-琼脂糖，羟基磷灰石层析法，凝胶电泳，透析或亲和层析法。编码所述单克隆抗体的DNA和RNA容易地使用常规方法进行分离和测序。杂交瘤细胞可以充当所述DNA和RNA的来源。一旦被分离，可以将DNA插入表达载体中，所述表达载体接着被转染到不另外产生免疫球蛋白的宿主细胞如HEK 293细胞，CHO细胞，或骨髓瘤细胞中，从而在宿主细胞中获得重组单克隆抗体的合成。

双特异性抗体的氨基酸序列变体(或突变体)通过将适合的核苷酸变化引入抗体DNA中，或通过核苷酸合成进行制备。然而，这样的修饰可以仅在例如如上述的非常有限的范围内进行。例如，修饰不改变上述提及的抗体特征如IgG同种型和抗原结合，但是可以提高重组生产的产率、蛋白稳定性或有利于纯化。

术语“宿主细胞”用于本申请时是指可以被改造从而产生根据本发明所述的抗体的细胞系统的任何种类。在一个实施方案中，将HEK293细胞和CHO细胞用作宿主细胞。用于本文时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括后代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试者细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移数。还理解所有的后代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异后代。

在NS0细胞中的表达记述在，例如，Barnes，L.M.，等.，细胞技术学(Cytotechnology)32(2000)109-123；Barnes，L.M.，等.，生物技术和生物工程(Biotech.Bioeng.)73(2001)261-270中。瞬时表达记述在，例如，Durocher，Y.，等.，核酸研究(Nucl.Acids.Res.)30(2002)E9中。可变结构域的克隆记述在Orlandi，R.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)86(1989)3833-3837；Carter，P.，等.，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)89(1992)4285-4289；和Norderhaug，L.，等.，免疫学方法杂志(J.Immunol.Method)204(1997)77-87中。优选的瞬时表达系统(HEK 293)记述在Schlaeger，E.-J.，和Christensen，K.，在细胞技术学(Cytotechnology)30(1999)71-83中和Schlaeger，E.-J.，在免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)194(1996)191-199中。

适合用于原核生物的控制序列，例如包括启动子，任选地操纵子序列，和核糖体结合位点。已知真核细胞利用启动子、增强子和多腺苷酸化信号。

当核酸在被置于与另一个核酸序列的功能关系中，是“可操作地连接的”。例如，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，条件是其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子与编码序列可操作地连接，条件是其影响序列的转录；或核糖体结合位点与编码序列可操作地连接，条件是其被定位为促进翻译。一般地，“可操作地连接的”意指被连接的DNA序列是连续的，且在分泌前导序列的情形中，是连续的且在可读框中。然而，增强子不必须是连续的。连接通过在方便的限制性位点处的连接来实现。如果所述位点不存在，则合成的寡核苷酸适体或接头根据常规实践使用。

通过标准技术，包括碱/SDS处理，CsCl分级(CsCl banding)，柱层析法，琼脂糖凝胶电泳，和其它本领域公知的技术，进行抗体的纯化从而消除细胞成分或其它污染物，例如其它细胞核酸或蛋白。见Ausubel，F.，等，编辑，现代分子生物学中的方法(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene Publishing和Wiley Interscience，New York(1987)。不同的方法是充分建立的并且广泛用于蛋白纯化，如用微生物蛋白进行的亲和层析法(例如，蛋白A或蛋白G亲和层析法)，离子交换层析法(例如阳离子交换(羧甲基树脂)，阴离子交换(氨基乙基树脂)和混合模式的交换)，亲硫吸附(例如，用β-巯基乙醇和其它SH配体)，疏水相互作用或芳香吸附层析法(例如用苯基-琼脂糖、氮杂-arenophilic树脂，或间氨基苯基硼酸)，金属螯合亲和层析法(例如用Ni(II)-和Cu(II)-亲和力材料)，大小排阻层析和电泳方法(如凝胶电泳，毛细管电泳)(Vijayalakshmi，M.，A.，应用生物化学生物技术(Appl.Biochem.Biotech).75(1998)93-102)。

本发明的一个方面是包含根据本发明所述的抗体的药物组合物。本发明的另一个方面是将根据本发明所述的抗体用于制备药物组合物的应用。本发明的另一个方面是用于制备包含根据本发明所述的抗体的药物组合物的方法。在另一个方面中，本发明提供包含与药用载体一起配制的根据本发明所述的抗体的组合物，例如药物组合物。

本发明的一个实施方案是用于治疗癌症的根据本发明所述的双特异性抗体。

本发明的另一个方面是用于治疗癌症的所述药物组合物。

本发明的另一个方面是根据本发明所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。

本发明的另一个方面是通过向需要所述治疗的患者施用根据本发明所述的抗体治疗遭受癌症的患者的方法。

用于本文时，“药物载体”包括生理相容的任何和所有的溶剂、分散介质、涂层、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗试剂和吸附延缓试剂等。优选地，所述载体适合用于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊或表皮施用(例如通过注射或输注)。

本发明的组合物可以通过多种本领域已知的方法施用。如技术人员清楚地，施用的路径和/或方式将根据需要的结果变化。为了通过某些施用路径施用本发明的化合物，可能需要用防止其失活的材料包被所述化合物，或使所述化合物与防止其失活的材料共同施用。例如，所述化合物可以在适合的载体中施用于受试者，所述载体例如是脂质体或稀释剂。药用稀释剂包括盐水和水性缓冲溶液。药物载体包括无菌水溶液或分散体和用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。这些介质和药剂用于药物活性物质是本领域已知的。

术语“肠胃外施用”和“肠胃外地施用”用于本文时意为除了肠和局部施用之外的施用方式，通常通过注射施用，并且包括，但不限于，静脉内、肌内、动脉内、鞘内、囊内、眼内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质下(subcuticular)、关节内、囊下、蛛网膜下、脊内、硬膜外和胸骨内注射和输注。

术语癌症用于本文时指增生性疾病，如淋巴瘤(lymphomas)，淋巴细胞性白血病(lymphocytic leukemias)，肺癌(lung cancer)，非小细胞肺(NSCL)癌(non small cell lung(NSCL)cancer)，支气管肺泡细胞肺癌(bronchioloalviolar cell lung cancer)，骨癌(bone cancer)，胰腺癌(pancreaticcancer)，皮肤癌(skin cancer)，头或颈癌(cancer of the head or neck)，皮肤或眼内黑素瘤(cutaneous or intraocular melanoma)，子宫癌(uterine cancer)，卵巢癌(ovarian cancer)，直肠癌(rectal cancer)，肛区癌(cancer of the analregion)，胃癌(stomach cancer)，胃癌(gastric cancer)，结肠癌(colon cancer)，乳腺癌(breast cancer)，子宫癌(uterine cancer)，输卵管癌(carcinoma of thefallopian tubes)，子宫内膜癌(carcinoma of the endometrium)，子宫颈癌(carcinoma of the cervix)，阴道癌(carcinoma of the vagina)，外阴癌(carcinoma of the vulva)，霍奇金病(Hodgkin′s Disease)，食管癌(cancer of theesophagus)，小肠癌(cancer of the small intestine)，内分泌系统癌(cancer ofthe endocrine system)，甲状腺癌(cancer of the thyroid gland)，甲状旁腺癌(cancer of the parathyroid gland)，肾上腺癌(cancer of the adrenal gland)，软组织肉瘤(sarcoma of soft tissue)，尿道癌(cancer of the urethra)，阴茎癌(cancer of the penis)，前列腺癌(prostate cancer)，膀胱癌(cancer of thebladder)，肾癌或输尿管癌(cancer of the kidney or ureter)，肾细胞癌(renal cellcarcinoma)，肾盂癌(carcinoma of the renal pelvis)，间皮瘤(mesothelioma)，肝细胞癌(hepatocellular cancer)，胆管癌(biliary cancer)，中枢神经系统(CNS)肿瘤(neoplasms of the central nervous system(CNS))，脊椎轴肿瘤(spinal axistumors)，脑干胶质瘤(brain stem glioma)，多形性成胶质细胞瘤(glioblastomamultiforme)，星形细胞瘤(astrocytomas)，神经鞘瘤(schwanomas)，室管膜瘤(ependymonas)，成髓细胞瘤(medulloblastomas)，脑膜瘤(meningiomas)，鳞状细胞癌(squamous cell carcinomas)，垂体腺瘤(pituitary adenoma)，和埃文斯肉瘤(Ewing’s sarcoma)，包括上述癌症任一的难治性形式，或一种或多种上述癌症的组合。

本发明的另一方面是作为抗-血管生成剂的根据本发明所述的双特异性抗体或所述药物组合物。这种抗-血管生成剂可用于治疗癌症(特别是实体瘤)和其它血管疾病。

本发明的一个实施方案是用于治疗血管疾病的根据本发明所述的双特异性抗体。

本发明的另一方面是用于治疗血管疾病的所述药物组合物。

本发明的另一方面是根据本发明所述的抗体在制备治疗血管疾病的药物中的应用。

本发明的另一方面是通过向需要这种治疗的患者使用根据本发明所述的抗体治疗患有血管疾病的患者的方法。

术语“血管疾病(vascular diseases)”包括癌症(Cancer)，炎症疾病(Inflammatory diseases)，动脉粥样硬化(Atherosclerosis)，缺血(Ischemia)，创伤(Trauma)，脓毒症(Sepsis)，COPD，哮喘(Asthma)，糖尿病(Diabetes)，AMD，视网膜病(Retinopathy)，中风(Stroke)，肥胖(Adipositas)，急性肺损伤(Acute lung injury)，出血(Hemorrhage)，血管渗漏(Vascular leak)例如细胞因子诱导的血管渗漏，变态反应(Allergy)，格雷夫斯病((Graves’Disease)，桥本自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto’s Autoimmune Thyroiditis)，特发性血小板减少性紫癜(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura)，巨细胞动脉炎(Giant Cell Arteritis)，类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis)，系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus(SLE))，狼疮性肾炎(Lupus Nephritis)，局限性回肠炎(Crohn’s Disease)，多发性硬化(Multiple Sclerosis)，溃疡性结肠炎(Ulcerative Colitis)，特别是实体瘤，眼内新血管综合征(intraocularneovascular syndrome)诸如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)或年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration(AMD))，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)。(Folkman，J.，等，J.Biol.Chem.(生物的化学杂志)267(1992)10931-10934；Klagsbrun，M.，等，Annu.Rev.Physiol.(物理学年度综述)53(1991)217-239；和Garner，A.，Vasculardiseases(血管疾病)，在：Pathobiology of ocular disease，A dynamicapproach(眼科疾病，即动力学途径的病理学)，Garner，A.，和Klintworth，G.K，(eds.)第二版Marcel Dekker，纽约，(1994)，第1625-1710页)。

这些组合物还可以包含辅药如防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。防止微生物的存在可以通过灭菌方法，见上文和通过包含各种抗细菌和抗真菌药剂，例如对羟基苯甲酸酯类、氯丁醇、苯酚、山梨酸等来确保。可能需要在组合物中包含等渗剂，如糖、氯化钠等。此外，可以通过包含延缓吸附的试剂如单硬脂酸铝和明胶来导致可注射药物形式的延长的吸收。

不管所选择的施用路径为何，可以以适合的水合形式使用的本发明的化合物，和/或本发明的药物组合物通过本领域技术人员已知的常规方式配制到药用剂型中。

在本发明的药物组合物中的活性成分的实际剂量水平可以变化从而获得这样的活性成分的量，其对于特定的患者、组合物和施用方式有效获得需要的治疗反应，而不会对于患者具有毒性。选定的剂量水平将取决于多种药物代谢动力学因素包括所用的本发明的特定组合物的活性、施用路径、施用时间、使用的特定化合物的排泄速率、治疗的延续时间、与所用的特定组合物组合使用的其它药物、化合物和/或材料、待治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗病史，以及医疗领域已知的类似因素。

所述组合物必需是无菌和可流动的，到所述组合物可通过注射器递送的程度。除了水之外，所述载体优选地是等渗缓冲的盐水溶液。

适当的流动性可以例如通过使用涂层如磷脂酰胆碱，在分散体的情形中通过维持需要的颗粒大小和通过使用表面活性剂来维持。在许多情形中，优选在所述组合物中包括等渗剂，例如，糖、多元醇如甘露醇或山梨醇，和氯化钠。

用于本文中时，表述“细胞”、“细胞系”和“细胞培养物”可交替使用，且全部这些名称都包括子代。因此，词语“转化体”和“转化的细胞”包括原代受试细胞和由其来源的培养物，而不考虑转移的次数。还理解所有的子代的DNA含量可能不精确一致，这归因于有意或无意的突变。包括在最初转化的细胞中筛选的具有相同功能或生物学活性的变异子代。在意指不同名称时，通过上下文其将是清楚的。

术语“转化”用于本文中时，指将载体/核酸转移到宿主细胞中的过程。如果将无难以克服的细胞壁屏障的细胞用作宿主细胞，则转染例如通过如Graham，F.L.，van der Eb.A.J.，Virology(病毒学)52(1978)546ff所述的磷酸钙沉淀法来进行。然而，还可以使用其他将DNA引入细胞的方法，诸如通过核注射或通过原生质体融合。如果使用原核细胞或包含实质细胞壁结构的细胞，例如一种转染方法是利用氯化钙的钙处理，如Cohen，S.N，等，PNAS(美国科学院院报).69(1972)2110-2114所述。

用于本文中时，“表达”指将核酸转录为mRNA的过程和/或将转录的mRNA(也称为转录物)随后翻译为肽、多肽或蛋白质的过程。转录物和被编码的多肽共同称为基因产物。如果多核苷酸源自基因组DNA，则在真核细胞中的表达可以包括mRNA的剪接。

“载体”是核酸分子，特别是自体复制的，其将插入的核酸分子转移到宿主细胞之中和/或之间。该术语包括主要功能为将DNA或RNA插入细胞(例如，染色体整合)的载体，主要功能是复制DNA或RNA的复制载体，和功能是转录和/或翻译DNA或RNA的表达载体。还包括提供多于一种上述功能的载体。

“表达载体”是多核苷酸，其在引入到合适的宿主细胞中时能够被转录和翻译为多肽。“表达系统”通常指包括表达载体的适当宿主细胞，所述表达载体可以起作用产生所需的表达产物。

氨基酸序列的描述

提供下面的实施例、序列表和附图帮助理解本发明，本发明的真实范围在所附的权利要求书中给出。要理解的是可以在不背离本发明精神的情况下在提出的方法中进行修改。

附图描述

图1A结合VEGF和ANG-2的根据本发明所述的双特异性抗体的一个四价实施方案的示意性结构，其中抗原A或B之一是VEGF，而另一个是ANG-2。所述结构基于结合抗原A的全长抗体，结合抗原B的两个(任选地二硫化物稳定的)单链Fv’s通过肽-接头连接于所述全长抗体。

图1B使用TvAb命名法所产生的双特异性四价抗体的图示(见实施例)——具有或不具有二硫化物稳定的scFv。

图2A二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>双特异性四价抗体(＝<VEGF-ANG-2>TvAb6；No.2331，见表3)图示。

图2B用于表达二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6的修饰的重链和轻链载体的质粒图。

图3纯化的二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6与“标准”人IgG1抗体G6-31(<VEGF>HuMab G6-31)相比在还原和非还原条件下的SDS-PAGE。

图4纯化的二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6与“标准”人IgG1抗体G6-31的大小排阻层析相比显示在纯化时二硫化物稳定的TvAb6不再形成凝聚物。

图5VEGF结合ELISA的结果和示意图。二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6结合VEGF与<VEGF>G6-31相当。<ANG-2>Mab536不结合VEGF。

图6A ANG-2结合ELISA的结果和示意图。二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6结合ANG-2与<ANG-2>Mab536相当。<VEGF>G6-31不结合ANG-2。

图6B通过表面等离子共振((surface plasmon resonance，Biacore)的ANG-2结合分析的示意图和结果。二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6以与<ANG-2>Mab536相当的亲和力结合ANG-2。

图7VEGF-ANG-2桥连ELISA的示意图和结果。二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6同时结合VEGF和ANG-2，而<VEGF>G6-31和<ANG-2>Mab536不能同时结合VEGF和ANG-2。

图8a在Scid beige小鼠分期皮下Colo205异种移植模型中，与<ANG-2>Mab536，<VEGF>G6-31以及Mab536和G6-31的组合相比，二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6的效应(研究ANG2_Pz_Colo205_003)。

图8b在Scid beige小鼠分期皮下Colo205异种移植模型中，与<ANG-2>Mab536，<VEGF>G6-31以及Mab536和G6-31的组合相比，二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6的效应(研究ANG2_Pz_Colo205_005)。

图9通过双特异性四价抗体<VEGF-ANG-2>TvAb6阻断VEGF-诱导的管形成——结果。

图10A+B通过b二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6阻断VEGF-诱导的管形成——定量分析。

图11通过表面等离子共振(Biacore)的VEGF结合分析的示意图。

图12两种<VEGF>抗体<VEGF-Ang-2>TvAb6和<VEGF>G6-31在Ka-Kd图表中的动力学特征。

图13表面等离子共振(Biacore)测定检测ANGPT2和VEGF与双特异性抗体同时结合的示意图。

图14表面等离子共振(Biacore)实验的结果显示TvAb6同时结合ANGPT2和VEGF。

图15A+B A)<VEGF-ANG-2>双特异性抗体的双特异性测定和同时Biacore结合测定的示意图。B)Biacore数据证明ANG-2和VEGF同时结合TvAb-2441-贝伐单抗_LC06。

图16A+B与抗-Ang2抗体<ANG-2>Ang2i_LC06和<ANG-2>Ang2k_LC08相比，双特异性抗体<VEGF-ANG-2>TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和<VEGF-ANG-2>TvAb-2441的Tie2磷酸化。

图17人血管生成素相互作用ELISA的图示。

图18<VEGF-ANG-2>TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和<VEGF-ANG-2>TvAb-2441-贝伐单抗-LC08和贝伐单抗的VEGF-诱导的HUVEC增殖。

图19在Calu3异种移植模型中通过标记的抗-CD31抗体和治疗过程中CD31信号的相对变化监测的双特异性抗体<VEGF-ANG-2>贝伐单抗-LC06抗体的体内抗-血管生成效应(与<ANG-2>ANG2i-LC06、以及<ANG-2>ANG2i-LC06和阿瓦斯丁(贝伐单抗)的组合相比较)。

实验方法

实施例

材料和一般方法

在Kabat，E.A.，等，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteins ofImmunological Interest)，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)中提供关于人免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列的一般信息。根据EU编号(Edelman，G.M.，等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)63(1969)78-85；Kabat，E.A.，等，免疫目的的蛋白序列(Sequences of Proteinsof Immunological Interest)，第5版，公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)对抗体链的氨基酸进行编号和参考。

重组DNA技术

将标准方法用于操作DNA，如在Sambrook，J.，等，分子克隆：实验室手册(Molecular cloning：A laboratory manual)；冷泉港实验室出版社(ColdSpring Harbor Laboratory Press)，冷泉港，纽约，1989中所述。根据生产商的说明书使用分子生物学试剂。

基因合成

需要的基因片段制备自通过化学合成制备的寡核苷酸。侧邻单限制性内切酶切割位点的基因片段通过包括PCR扩增的退火和寡核苷酸连接进行组装，并且将其随后通过指定的限制性酶切位点，例如KpnI/SacI或AscI/PacI克隆到基于pGA4克隆载体的pPCRScript(Stratagene)中。通过DNA测序证实亚克隆的基因片段的DNA序列。根据在Geneart(Regensburg，Germany)的指定说明对基因合成片段进行排序。合成编码Ang-2/VEGF双特异性抗体的轻链和重链的所用基因区段，这些基因区段具有编码导肽(MGWSCIILFLVATATGVHS)的5’末端DNA序列(该导肽靶向用于真核细胞中分泌的蛋白)和5’-BamHI和3’-XbaI限制性位点。设计了带有二硫化物稳定的“凸起-进入-孔洞”修饰的重链的DNA序列，其中S354C和T366W突变在“突起”重链中，并且Y349C，T366S，L368A和Y407V突变在“孔洞”重链中。

DNA序列确定

DNA序列通过在MediGenomix GmbH(Martinsried，Germany)或Sequiserve GmbH(Vaterstetten，Germany)进行的双链测序来确定DNA序列。

DNA和蛋白序列分析和序列数据处理

使用GCG′s(Genetics Computer组，Madison，Wisconsin)软件包10.2版本和Infomax′s Vector NT1 Advance suite版本8.0来用于序列产生、作图、分析、注释和举例说明。

表达载体(用于实施例1)

为了表达所述抗体，应用基于具有CMV-内含子A启动子的cDNA构造(organization)或基于具有CMV启动子(例如图2B)的基因组构造的用于在细胞中瞬时表达(例如在HEK293 EBNA或HEK293-F中)或稳定表达(例如在CHO细胞中)的表达质粒的变体。

除抗体表达盒以外，所述载体包括：

-复制起点，其容许该质粒在大肠杆菌中复制，和

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性。

抗体基因的转录单元由以下元件组成：

-5’末端处的独特限制位点

-来自人巨细胞病毒的立即早期增强子和启动子，

-在cDNA组构的情形中，随后是内含子A序列，

-人抗体基因的5’-非翻译区，

-免疫球蛋白重链信号序列，

-人抗体链(重链、修饰的重链或轻链)作为cDNA或作为具有免疫球蛋白外显子-内含子组构的基因组组构

-具有聚腺苷酸化信号序列的3’非翻译区，和

-3’末端处的独特限制位点。

如下所述的包括选定抗体重链序列和C端scFv融合体的融合基因通过PCR和/或基因合成产生并使用已知的重组方法和技术，通过在基因组重链载体中例如利用独特NsiI和EcoRI位点来连接相应的核酸区段来装配。亚克隆的核酸序列通过DNA测序来验证。为了瞬时且稳定转染，通过来自转化的大肠杆菌培养物的质粒制剂来制备更大量的质粒(Nucleobond AX，Macherey-Nagel)。

表达载体(用于实施例10-14)

使用由下述元件构成的表达载体：

-作为选择性标记的潮霉素抗性基因，

-EB病毒(Epstein-Barr virus，(EBV))的复制起点，oriP，

-载体pUC18的复制起点，其允许该质粒在大肠杆菌(E.coli)中复制

-β-内酰胺酶基因，其在大肠杆菌中赋予氨苄青霉素抗性，

-来自人巨细胞病毒(HCMV)的立即早期增强子和启动子，

-人1-免疫球蛋白多腺苷酸化(“poly A”)信号序列，和

-独特的BamHI和XbaI限制性位点。

如所描述的，通过基因合成制备免疫球蛋白融合基因，其包含重链或轻链构建体以及具有C端VH和VL结构域的“凸起-进入-孔洞”构建体，将该融合基因克隆进入pGA18(ampR)质粒。带有合成的DNA区段和Roche表达载体的pG18(ampR)质粒用BamHI和XbaI限制性酶(RocheMolecular Biochemicals)消化并进行琼脂糖凝胶电泳。然后将纯化的重链和轻链编码DNA区段连接到分离的Roche表达载体BamHI/XbaI片段，产生最终表达载体。最终表达载体转化到大肠杆菌细胞中，分离表达质粒DNA(Miniprep)并进行限制性酶分析和DNA测序。正确的克隆在150mlLB-Amp培养基中生长，再次分离质粒DNA(Maxiprep)并通过DNA测序确认序列完整性。

细胞培养技术

如在细胞生物学中的当前方法(Current Protocols in Cell Biology)(2000)，Bonifacino，J.S.，Dasso，M.，Harford，J.B.，Lippincott-Schwartz，J.和Yamada，K.M.(编辑)，John Wiley&Sons，Inc中所述使用标准细胞培养技术。

HEK293-F系统中的瞬时转染(用于实施例1)

通过利用HEK293-F系统(Invitrogen)按照制造商的说明瞬时转染两种质粒(分别编码重链或修饰的重链和相应的轻链)来生成抗体。简言之，用两种各自的表达质粒和293fectin或fectin(Invitrogen)的混合物来转染在摇瓶中或在搅拌发酵器中在无血清FreeStyle 293表达培养基(Invitrogen)中悬浮生长的HEK293-F(Invitrogen)。对于例如2L摇瓶(Corning)，以1.0E*6细胞/mL的密度接种600mL HEK293-F细胞并以120rpm，8％CO2温育。第二天，用ca.42mL的混合物，以ca.1.5E*6细胞/mL的细胞密度来转染细胞，所述混合物为A)具有600μg分别编码等摩尔比的重链或修饰的重链，和相应轻链的总质粒DNA(1μg/mL)的20mL Opti-MEM(Invitrogen)和B)20ml Opti-MEM+1.2mL 293fectin或fectin(2μl/mL)的混合物。在发酵过程中根据葡萄糖的消耗，添加葡萄糖溶液。在5-10天后收获包含分泌的抗体的上清液，并且直接由上清液纯化抗体或冷冻并保存上清液。

HEK293-F系统中的瞬时转染(用于实施例10-14)

根据生产商的说明书，使用FreeStyle^TM 293表达系统(Invitrogen，USA)通过人胚肾293-F细胞的瞬时转染来表达重组免疫球蛋白变体。简言之，将混悬液FreeStyle^TM 293-F细胞在FreeStyle^TM 293表达培养基中，在37℃/8％CO₂进行培养，并在转染当天将细胞以1-2x10⁶活细胞/ml的密度接种在新鲜的培养基中。使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg 1∶1摩尔比率的重链和轻链质粒DNA在Opti-MEMI培养基(Invitrogen，USA)中制备DNA-293fectin^TM复合物，最终转染体积为250ml。具有两条重链和一条轻链的“凸起-进入-孔洞”DNA-293fectin复合物如下制备，在Opti-MEM

I培养基(Invitrogen，USA)中使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg的1∶1∶2摩尔比的“凸起-进入-孔洞”重链1和2和轻链质粒DNA(对于250ml最终转染体积)制备。具有两条重链的“凸起-进入-孔洞”DNA-293fectin复合物如下制备，在Opti-MEM

I培养基(Invitrogen，USA)中使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg的1∶1摩尔比的“凸起-进入-孔洞”重链1和2DNA(对于250ml最终转染体积)制备。CrossMab DNA-293fectin复合物在Opti-MEM

I培养基(Invitrogen，USA)中使用325μl的293fectin^TM(Invitrogen，Germany)和250μg的1∶1∶1∶1摩尔比的“凸起-进入-孔洞”重链1和2和轻链质粒DNA(对于250ml最终转染体积)制备。在转染后7天，通过在14000g离心30分钟并通过无菌滤器(0.22μm)过滤收获包含抗体的细胞培养物上清液。将上清液贮存在-20℃直到纯化。

蛋白确定

使用基于根据Pace等，蛋白科学(Protein Science)，1995，4，2411-1423的氨基酸序列计算的摩尔消光系数通过确定280nm的光密度(OD)，来确定纯化的抗体和衍生物的蛋白浓度。

在上清液中的抗体浓度确定

抗体和衍生物在细胞培养物上清液中的浓度通过使用蛋白质A琼脂糖-珠(Roche(罗氏))的免疫沉淀法来评估。60μL蛋白质A琼脂糖珠在TBS-NP40(50mM Tris，pH 7.5，150mM NaCl，1％Nonidet-P40)洗涤三次。随后，将1-15mL细胞培养物上清液加样于在TBS-NP40中预平衡的蛋白质A琼脂糖珠。室温下温育1h后，将该珠在Ultrafree-MC-过滤柱(Amicon)上用0.5mL TBS-NP40洗涤1次，用0.5mL 2x磷酸盐缓冲液(2xPBS，Roche(罗氏))洗涤2次并用0.5mL 100mM Na-柠檬酸盐pH 5.0简单洗涤4次。通过添加35μl NuPAGELDS样品缓冲液(Invitrogen)洗脱结合的抗体。样品的一半分别与NuPAGE

样品还原剂混合或保持未还原，并在70℃加热10min。因此，将20μl应用于4-12％NuPAGE

Bis-Tris SDS-PAGE(Invitrogen)(具有MOPS缓冲液，以用于非还原的SDS-PAGE，和具有NuPAGE

抗氧化运行缓冲液添加剂的MES缓冲液(Invitrogen)，以用于还原的SDS-PAGE)并用考马斯蓝染色。

通过蛋白A-HPLC层析法测量细胞培养物上清液中的抗体和衍生物的浓度。简言之，将包含结合蛋白A的抗体和衍生物的细胞培养物上清液施加到HiTrap蛋白A柱(GE Healthcare)上，所述柱在50mM KH2PO4，300mM NaCl，pH 7.3中，并在Dionex HPLC系统上，用550mM乙酸，pH 2.5从基质中洗脱。通过UV吸光度并整合峰面积来量化洗脱的蛋白。将纯化的标准IgG1抗体用作标准。

备选地，抗体和衍生物在细胞培养物上清液中的浓度通过夹心式-IgG-ELISA来测量。简言之，StreptaWell高结合链霉亲和素(StreptaWellHigh Bind Strepatavidin)A-96孔微滴定板(Roche(罗氏))用100μL/孔生物素化的抗人IgG捕获分子F(ab’)2<h-Fcγ>BI(Dianova)，以0.1μg/mL在室温下包被1h或备选地在4℃包被过夜，并随后用200μL/孔PBS，0.05％吐温(PBST，Sigma(西格玛))洗涤3次。将100μL/孔包含各种抗体的细胞培养物上清液在PBS(Sigma(西格玛))中的稀释物系列加入到孔中并在微滴定板摇动器上，以室温温育1-2h。孔用200μL/孔的PBST洗涤三次并且用100μl浓度为0.1μg/mL的F(ab′)2<hFcγ>POD(Dianova)作为检测抗体，在微滴定板摇动器上，以室温检测结合的抗体1-2h。未结合的检测抗体用200μL/孔的PBST以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μLABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的测定。

蛋白质纯化

参考标准流程，从过滤的细胞培养物上清液中纯化蛋白。简言之，将抗体加样于蛋白质A琼脂糖柱(GE Healthcare(GE健康护理))并用PBS洗涤。在酸性pH进行抗体洗脱，并随后立即中和样品。在20mM组氨酸，140mM NaCl pH 6.0中，通过大小排阻层析法(Superdex 200，GE healthcare(GE健康护理))将聚集的蛋白质与单体抗体分开。将单体抗体级分合并，如果需要，利用例如MILLIPORE Amicon Ultra(30MWCO)离心浓缩器浓缩，在-80℃保存。提供部分样品进行随后的例如通过SDS-PAGE、大小排阻层析法、质谱法和内毒素测量(见图3和4)进行的蛋白质分析和分析表征。

SDS-PAGE

NuPAGE

预制凝胶系统(Invitrogen)按照制造商的说明来使用。具体地，使用4-20％NuPAGE

Novex

TRIS-甘氨酸预制(Pre-Cast)凝胶和Novex

TRIS-甘氨酸SDS运行缓冲液。(见例如图3)。样品的还原通过在运行凝胶前添加NuPAGE

样品还原剂完成。

分析大小排阻层析法

用于确定抗体聚集和低聚状态的大小排阻层析法是通过HPLC层析法来进行。简言之，将蛋白质A纯化抗体加样于安捷伦(Agilent)HPLC 1100系统上的300mM NaCl，50mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7.5中的TosohTSKgel G3000SW柱或Dionex HPLC-系统上的2x PBS中的Superdex 200柱(GE healthcare(GE健康护理))。洗脱的蛋白通过UV吸光度和峰面积的积分(integration)来量化。BioRad凝胶过滤标准151-1901起标准物的作用。(见例如图4)。

质谱法

交换型(crossover)抗体的总去糖基化质量通过电喷雾离子化质谱法(ESI-MS)来确定和验证。简言之，用处于100mM KH2PO4/K2HPO4，pH 7中的50mU N-糖苷酶F(PNGaseF，ProZyme)在37℃，以蛋白质浓度至多为2mg/ml来将100μg纯化的抗体去糖基化达12-24h，并随后通过SephadexG25柱(GE healthcare(GE健康护理))上的HPLC来脱盐。各种重链和轻链的质量在去糖基化和还原后通过ESI-MS来确定。简言之，处于115μl中的50μg抗体用60μl 1M TCEP和50μl 8M盐酸胍来温育并随后脱盐。总质量和还原的重链和轻链的质量通过在装配了NanoMate源的Q-Star EliteMS系统上进行ESI-MS来确定。

VEGF结合ELISA

四价抗体(TvAb)的结合性质在使用全长VEGF165-His蛋白(R&DSystems)的ELISA测定中评估(图5)。为了该目的，Falcon聚苯乙烯增透(clear enhanced)微量滴定板用100μl 2μg/mL重组人VEGF165(R&DSystems)在PBS中室温包被2h或在4℃包被过夜。用300μl PBST(0.2％Tween 20)洗涤孔三次并用200μl 2％BSA 0.1％Tween 20室温封闭30min并且随后用300μl PBST洗涤三次。将100μL/孔稀释物系列(40pM-0.01pM)的处于PBS(Sigma(西格玛))中的纯化的<VEGF-ANG-2>TvAb和作为参比的人抗-ANG-2抗体<ANG-2>抗体Mab536(Oliner等，Cancer Cell.(癌细胞)2004 Nov；6(5)：507-16，US 2006/0122370)和抗VEGF抗体<VEGF>抗体G6-31(Liang等，J Biol Chem.(生物化学杂志)2006 Jan 13；281(2)：951-61；US 2007/0141065)加入到孔中并在微滴定板摇动器上在室温下温育1h。该孔用300μl PBST(0.2％Tween 20)洗涤三次，并且结合的抗体用100μL/孔在2％BSA 0.1％Tween 20中的0.1μg/ml F(ab′)<hFcγ>POD(Immunoresearch)作为检测抗体在微滴定板摇动器上室温1h进行检测。未结合的检测抗体使用300μL/孔的PBST，以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μLABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的确定。

VEGF结合：通过表面等离子共振(Biacore)在37°动力学表征VEGF的结合

为进一步确证ELISA发现，使用表面等离子共振技术在Biacore T100仪器上对<VEGF>抗体G6-31或阿瓦斯丁和<VEGF-Ang-2>TvAb6或TvAb-2441-贝伐单抗-LC06或TvAb-2441-贝伐单抗-LC08与VEGF的结合根据下述方案定量分析，并使用T100软件包进行分析：简言之，<VEGF>抗体通过结合山羊抗-人IgG(JIR 109-005-098)在CM5-芯片上捕获。该捕获抗体通过胺偶联固定，使用下述标准胺偶联：HBS-N缓冲液作为运行缓冲液，活化通过EDC/NHS混合物来进行，目标是配体密度为700RU。捕获-抗体在偶联缓冲液NaAc，pH 5.0，c＝2μg/mL中稀释，最终仍然活化的羧基通过注射1M乙醇胺封闭。Mabs<VEGF>抗体的捕获在5μL/min的流速和c(Mabs<VEGF>)＝10nM(用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释)进行；应当达到约30RU的捕获水平。rhVEGF(rhVEGF，R&D-SystemsCat.-No，293-VE)用作分析物。VEGF结合<VEGF>抗体的动力学表征在37℃在作为运行缓冲液的PBS+0.005％(v/v)Tween20中进行。样品用50μL/min的流速注射并用300-0.29nM浓度系列的rhVEGF缔合80秒的时间，并且解离1200秒的时间。在每次分析物循环后用10mM对羟苯甘氨酸(Glycin)pH 1.5和60秒的接触时间进行自由捕获抗体表面的再生。使用通常的双参比法(对照参比：rhVEGF结合捕获分子山羊抗人IgG，测量流动细胞的空白，rhVEGF浓度“0”，模型：朗格缪尔结合(Langmuir binding)1∶1，(由于捕获分子的结合Rmax设定为局部(local))计算动力学常数。图11显示Biacore测定的示意图。

ANG-2结合ELISA

四价抗体(TvAb)的结合性质在使用全长血管生成素-2-His蛋白(R&DSystems)的ELISA测定中评估(图6a)。为了该目的，Falcon聚苯乙烯增透微量滴定板用100μl 1μg/mL重组人血管生成素-2(R&D Systems，无载体)在PBS中室温包被2h或在4℃包被过夜。用300μl PBST(0.2％Tween 20)洗涤孔三次并用200μl 2％BSA 0.1％Tween 20室温封闭30min并且随后用300μl PBST洗涤三次。将100μL/孔稀释物系列(40pM-0.01pM)的处于PBS(Sigma(西格玛))中的纯化的<VEGF-ANG-2>TvAb和作为参比的<ANG-2>抗体Mab536和<VEGF>抗体G6-31加入到孔中并在微滴定板摇动器上在室温下温育1h。该孔用300μl PBST(0.2％Tween 20)洗涤三次，并且结合的抗体用100μL/孔在2％BSA 0.1％Tween 20中的0.1μg/ml F(ab′)<hk>POD(Biozol Cat.No.206005)作为检测抗体在微滴定板摇动器上室温1h进行检测。未结合的检测抗体使用300μL/孔的PBST，以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的确定。

与ANG-1和ANG-2结合的比较(ANG-1和ANG-2结合ELISA)

抗体的结合性质在使用全长血管生成素-2-His蛋白(R&D Systems#623-AN/CF或内部生产的材料)或血管生成素-1-His(R&D systems#923-AN)的ELISA测定中评估。因此，96孔板(Falcon聚苯乙烯增透微量滴定板或Nunc Maxisorb)用100μl 1μg/mL重组人血管生成素-1或血管生成素-2(无载体)在PBS(Sigma)中室温包被2h或在4℃包被过夜。用300μlPBST(0.2％Tween 20)洗涤孔三次并用200μl 2％BSA 0.1％Tween 20室温封闭30min并且随后用300μl PBST洗涤三次。将100μL/孔稀释系列(40pM-0.01pM)的处于PBS中的纯化的测试抗体加入到孔中并在微滴定板摇动器上在室温下温育1h。该孔用300μl PBST(0.2％Tween 20)洗涤三次，并且结合的抗体用100μL/孔在2％BSA 0.1％Tween 20中的0.1μg/mlF(ab′)<hk>POD(Biozol Cat.No.206005)作为检测抗体在微滴定板摇动器上室温1h进行检测。未结合的检测抗体使用300μL/孔的PBST，以三次洗掉，并且结合的检测抗体通过添加100μL ABTS/孔来检测。在TecanFluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的确定。

ANG-2结合BIACORE

抗体与抗原(例如人ANG-2)的结合通过利用BIACORE T100仪器(GEhealthcare Biosciences AB，Uppsala，瑞典)的表面等离子共振来研究。简言之，为了亲和力测量，山羊<hIgG-Fcgamma>多克隆抗体通过胺偶联固定在CM5芯片上用于呈递针对人ANG-2的抗体(图6)。结合在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，ph 7.4)中，25℃测量。将纯化的ANG-2-His(R&D系统或内部纯化的)以6.25nM和200nM之间的不同浓度加入到溶液中。缔合通过ANG-2-注射3分钟来测量；解离通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3分钟来测量且KD值利用1∶1朗缪尔结合模型(Langmuir binding model)来评估。由于ANG-2制剂的异质性，不能观察到1∶1的结合；因此KD值仅是相对评估。从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore T100评估软件版本1.1.1来分析传感图(sensorgrams)和用于计算亲和力数据。备选地，Ang-2以捕获水平2000-1700RU通过经胺偶联(无BSA)固定在CM5芯片上的五组氨酸抗体(无BSA的5-His-Ab，Qiagen No.34660)捕获(见下文)。

抑制huANG-2与Tie-2的结合(ELISA)

相互作用ELISA在384孔微量滴定板(MicroCoat，DE，Cat.No.464718)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。用0.5μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems，英国，Cat.No.313-TI)包被ELISA板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2％吐温-20和2％BSA(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE)的PBS封闭孔1小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.2μg/ml人血管生成素-2(huAngiopoietin-2，R&D Systems(R&D系统)，UK，Cat.No.623-AN)一起在RT下温育1小时。洗涤后，添加0.5μg/ml生物素化的抗-血管生成素-2克隆BAM0981(R&D Systems(R&D系统)，UK)和1∶3000稀释的链霉亲和素HRP(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，Cat.No.11089153001)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，缓冲液#204 530 001，片剂#11 112 422 001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。

ANG-2-VEGF桥连ELISA

四价抗体(TvAb)的结合特性在使用固定的全长VEGF165-His蛋白(R&D Systems(R&D系统))和人ANG-2-His蛋白(R&D Systems(R&D系统))的ELISA测定中进行，以检测结合的双特异性抗体(图7)。只有双特异性<VEGF-ANG-2>TvAb能够同时结合VEGF和ANG-2并由此桥连这两种抗原，而单特异性“标准”IgG1抗体应该不能够同时结合VEGF和ANG-2(图7)。

为了该目的，将Falcon聚苯乙烯透明强化微量滴定板用处于PBS中的100μl 2μg/mL重组人VEGF165(R&D Systems(R&D系统))在室温下包被2小时或在4℃包被过夜。孔用300μl PBST(0.2％吐温20)洗涤3次，并用200μl 2％BSA 0，1％吐温20在室温下封闭30分钟，并随后用300μlPBST洗涤3次。将100μL/孔稀释物系列((40pM-0.01pM))的处于PBS(Sigma(西格玛))中的纯化的<VEGF-ANG-2>TvAb和作为参比的<ANG-2>抗体Mab536和VEGF＞抗体G6-31加入到孔中并在微量滴定板摇动器上在室温下温育1小时。该孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并且结合的抗体通过添加处于PBS中的100μl 0.5μg/ml人ANG-2-His(R&D Systems(R&D系统))来检测。该孔用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3次，并且结合的ANG-2用100μl 0.5μg/mL<ANG-2>mIgG1-生物素抗体(BAM0981，R&D Systems(R&D系统))在室温下检测1小时。未结合的检测抗体使用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤三次洗掉，并且结合的抗体通过添加以1∶4稀释在封闭缓冲液中的100μl 1∶2000链霉亲和素-POD缀合物(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，Cat.No.11089153)，在室温下检测1小时。未结合的链霉亲和素-POD缀合物用300μl PBST(0，2％吐温20)洗涤3-6次洗掉，并且结合的链霉亲和素-POD缀合物通过添加100μLABTS/孔来检测。在Tecan Fluor分光计上，以405nm的测量波长(参比波长492nm)来进行吸光度的确定。

通过Biacore证明双特异性四价抗体<VEGF-Ang-2>TvAb6与VEGF-A和Ang-2的同时结合

为进一步确证来自于桥连ELISA的数据，使用表面等离子共振技术在Biacore T100仪器上根据下述方案建立另外的测定来确认对VEGF和Ang-2的同时结合，并使用T100软件包(T100对照，版本2.01，T100评估，版本2.01，T100动力学总结(Kinetics Summary)，版本1.01)进行分析：Ang-2以捕获水平2000-1700RU在PBS，0.005％(v/v)Tween20运行缓冲液中通过五组氨酸抗体(PentaHisAntibody，无BSA的5-His-Ab，Qiagen No.34660)捕获，该抗体经胺偶联(无BSA)固定在CM5芯片上。在偶联过程中，HBS-N缓冲液作为运行缓冲液，活化通过EDC/NHS混合物来进行。5-His-Ab无BSA的捕获-抗体在偶联缓冲液NaAc，pH 4.5，c＝30μg/mL中稀释，最终仍然活化的羧基通过注射1M乙醇胺封闭；测试了5000和17000RU的配体密度。500nM浓度的Ang-2用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释以5μL/min的流速被5-His-Ab捕获。其后，<Ang-2，VEGF>双特异性抗体与Ang-2和VEGF的结合通过与rhVEGF一起温育并形成夹心复合物(sandwich complex)来证明。为此，双特异性<VEGF-Ang-2>TvAb6以50μL/min的流速和的100nM浓度(用运行缓冲液+1mg/mL BSA稀释)与Ang-2结合，并且通过与以50μL/min的流速和150nM的VEGF浓度的VEGF(rhVEGF，R&D-Systems Cat.-No，293-VE)在PBS+0.005％(v/v)Tween20运行缓冲液中一起温育来检测同时结合。缔合时间120秒，解离时间1200秒。在每次循环后用50μL/min的流速以2x10mM对羟苯甘氨酸(Glycin)pH 2.0和60秒的接触时间进行再生。传感图利用常规双参照(对照参比：双特异性抗体和rhVEGF与捕获分子5-His-Ab的结合)来校正。关于每种Ab的空白使用rhVEGF浓度“0”来测量。Biacore测定图显示在图13中。备选的Biacore测定形式显示于图15中。

HEK293-Tie2细胞系的产生

为确定血管生成素-2抗体干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化和ANGPT2与Tie2在细胞上的结合，产生了重组HEK293-Tie细胞系。简言之，基于pcDNA3的质粒(RB22-pcDNA3 Topo hTie2)，其编码在CMV启动子控制下的全长人Tie2(SEQ ID 108)和新霉素抗性标记，该质粒使用Fugene(Roche Applied Science)作为转染试剂转染到HEK293细胞(ATCC)中，并在DMEM 10％FCS，500μg/ml G418中选择抗性细胞。单个克隆通过克隆量筒(cylinder)分离，并随后通过FACS分析Tie2的表达。克隆22被鉴定为具有高且稳定Tie2表达的克隆(即使在没有G418时)(HEK293-Tie2克隆22)。HEK293-Tie2克隆22随后用于细胞测定：ANGPT2诱导的Tie2磷酸化和ANGPT2细胞配体结合测定。

ANGPT2诱导Tie2磷酸化测定

根据下述测定原则测量ANGPT2抗体对ANGPT2诱导的Tie2磷酸化的抑制。HEK293-Tie2克隆22在不存在或存在ANGPT2抗体时用ANGPT2刺激5分钟并且P-Tie2通过夹心ELISA定量。简言之，每孔2x10⁵HEK293-Tie2克隆22细胞在聚-D-赖氨酸包被的96孔微量滴定板上于100μl DMEM，10％FCS，500μg/ml遗传霉素(Geneticin)中培养过夜。第二天在微量滴定板中制备一排滴定ANGPT2抗体(4-倍浓缩，75μl终体积/孔，两份)并与75μl的ANGPT2(R&D systems#623-AN]稀释物(3.2μg/ml作为4-倍浓缩液)混合。抗体和ANGPT2在室温预温育15分钟。添加100μl混合物到HEK293-Tie2克隆22细胞(与1mM NaV3O4，Sigma#S6508预温育5分钟)中并在37℃温育5分钟。随后，用每孔200μl冰冷PBS+1mMNaV3O4洗涤细胞，并通过在冰上每孔添加120μl裂解缓冲液(20mM Tris，pH 8.0，137mM NaCl，1％NP-40，10％丙三醇，2mM EDTA，1mM NaV3O4，1mM PMSF和10μg/ml抑肽酶)裂解细胞。细胞在微量滴定板摇动器上4℃裂解30分钟，并且100μl裂解物直接转移到p-Tie2 ELISA微量滴定板(R&D Systems，R&D#DY990)中，不进行在先离心和不进行总蛋白测量。P-Tie2的量根据制造商说明书定量，且抑制的IC50值使用用于Excel的XLfit4分析插件(plug-in)(剂量-反应单点(dose-response one site)，模式205)测量。IC50值可在实验内比较但可以在实验与实验之间变化。

VEGF诱导的HUVEC增殖测定

选择VEGF诱导的HUVEC(人脐静脉内皮细胞，Promocell#C-12200)增殖用来测量VEGF抗体的细胞功能。简言之，每96孔5000HUVEC细胞(低传代数目，≤5代)在100μl饥饿培养基(EBM-2内皮基础培养基2，Promocell#C-22211，0.5％FCS，青霉素/链霉素)中于胶原I-包被的BDBiocoat胶原I 96-孔微量滴定板(BD#354407/35640)中温育过夜。不同浓度的抗体与rhVEGF(30ng1/ml终浓度，BD#354107)混合并在室温预温育15分钟。随后，将该混合物添加到HUVEC细胞中并将它们在37℃，5％CO2中温育72小时。在分析当天板平衡到室温30分钟，并且使用CellTiter-GloTM发光细胞活力测定试剂盒(Promega，#G7571/2/3)根据手册测量细胞活力/增殖。发光在分光光度计中测量。

四价双特异性和四价单特异性抗体的设计

根据本发明所述的结合VEGF(VEGF-A)和ANG-2(血管生成素-2)的双特异性抗体包含结合于VEGF的第一抗原结合位点和结合于ANG-2的第二抗原结合位点。可以使用例如SEQ ID NO：23的重链可变结构域，和SEQ ID NO：24的轻链可变结构域作为结合VEGF的第一抗原结合位点，所述重链可变结构域和轻链可变结构域都来自人噬菌体展示来源的抗-VEGF抗体G6-31，其在Liang，W.C.，等，J Biol Chem.281(2)(2006)951-61和在US 2007/0141065中详细描述。备选地，例如特异性结合VEGF的第二抗原结合位点包括SEQ ID NO：7，或SEQ ID NO：100的重链可变结构域和SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：101的轻链可变结构域，它们来自于抗-VEGF抗体<VEGF>贝伐单抗和<VEGF>B20-4.1，优选来自于<VEGF>贝伐单抗。

可以使用SEQ ID NO：31的重链可变结构域，和SEQ ID NO：32或具有突变T92L，H93Q和W94T(Kabat编号)的SEQ ID NO：32的轻链可变结构域作为第二抗原结合位点，所述重链可变结构域和轻链可变结构域都来自人抗-ANG-2抗体<ANG-2>Mab536，其在Oliner，J.，等，Cancer Cell.6(5)(2004)507-16和在US 2006/0122370中详细描述。备选地，例如特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点包括SEQ ID NO：44，SEQ ID NO：52，SEQID NO：60，SEQ ID NO：68，SEQ ID NO：76，SEQ ID NO：84或SEQ ID NO：92的重链可变结构域，和SEQ ID NO：45，SEQ ID NO：53，SEQ ID NO：61，SEQ ID NO：69，SEQ ID NO：77，SEQ ID NO：85，SEQ ID NO：93的轻链可变结构域，它们来自于抗-ANG-2抗体<ANG-2>Ang2s_R3_LC03，<ANG-2>Ang2i_LC06，<ANG-2>Ang2i_LC07，<ANG-2>Ang2k_LC08，<ANG-2>Ang2s_LC09，<ANG-2>Ang2i_LC10，或<ANG-2>Ang2k_LC11，优选来自于<ANG-2>Ang2i_LC06，或<ANG-2>Ang2k_LC08。

为了产生组合两种抗体特征的试剂，构建新的四价双特异性抗体来源的蛋白实体。在这些分子中，一种抗体的重组单链结合分子通过重组蛋白融合技术连接于另一种抗体，其保留全长IgG1的形式。该第二抗体具有需要的第二结合特异性。

通过基因合成和重组分子生物学技术，将各自抗体的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)通过甘氨酸丝氨酸(G4S)3或(G4S)4单链接头连接从而提供单链Fv(scFv)，其使用(G)6-或(G4S)3-接头连接于另一抗体重链的C端。

此外，将半胱氨酸残基引入结合ANG-2或VEGF的scFv的VH(包括Kabat位置44)和VL(包括Kabat位置100)结构域，如前所述(例如WO 94/029350；Reiter，Y.，等，自然生物技术(Nature biotechnology)(1996)1239-1245；Young，N.M.，等，FEBS Letters(1995)135-139；或Rajagopal，V.，et al，蛋白工程(Protein Engineering)(1997)1453-59)。

将所有这些分子进行重组产生、纯化和表征并评估蛋白表达、稳定性和生物学活性。

在表3中提供用于产生四价、双特异性<VEGF-ANG-2>，<ANG-2-VEGF>抗体和四价单特异性<ANG-2>抗体的双特异性抗体设计的总结。对于该研究，我们使用术语‘TvAb’来描述各种四价蛋白实体。

为获得双特异性四价抗体<VEGF-ANG-2>TvAb5和TvAb6，将结合血管生成素-2的单链Fv(scFv)(衍生自SEQ ID NO：31的重链可变结构域(VH)，和具有突变T92L，H93Q和W94T突变的SEQ ID NO：32的轻链可变结构域(VL)，其衍生自人抗-ANG-2抗体<ANG-2>Mab536)融合到如下序列上，该序列对应于SEQ ID NO：23的人抗-VEGF抗体<VEGF>G6-31的重链载体的C端，并与基于SEQ ID NO：24的各自轻链表达载体一起共表达。将设计形式的表示显示在图1B中并在表3中列举。

为获得双特异性四价抗体TvAb9和TvAb15，将结合VEGF的单链Fv(scFv)(衍生自SEQ ID NO：23的重链可变结构域(VH)，和SEQ ID NO：24的轻链可变结构域(VL)，其衍生自人抗-VEGF抗体<VEGF>G6-31)融合到如下序列上，该序列对应于SEQ ID NO：31的人抗-ANG-2抗体<ANG-2>Mab536的重链载体的C端，并与基于SEQ ID NO：32的各自轻链表达载体一起共表达。将设计形式的表示显示在图1B中并在表3中列举。

表3-具有C端scFv连接物的不同的双特异性四价抗体形式和相应的TvAb-命名法。表中“-”意指“不存在”。

TvAb形式基于，例如

a)aa)人抗-VEGF抗体<VEGF>G6-31和ab)结合血管生成素-2的两个单链Fv(scFv)(衍生自SEQ ID NO：31的重链可变结构域(VH)，和具有突变T92L，H93Q和W94T的SEQ ID NO：32的轻链可变结构域(VL))，其连接到抗-VEGF抗体<VEGF>G6-31的重链(SEQ ID NO：23)的C-端；或

b)ba)人抗-ANG-2抗体<ANG-2>Mab536和bb)结合VEGF的两个单链Fv(scFv)(衍生自SEQ ID NO：23的重链可变结构域(VH)，和SEQID NO：24的轻链可变结构域(VL))，其连接到抗-ANG-2抗体<ANG-2>Mab536的重链(SEQ ID NO：31)的C-端；或

c)ca)人抗-VEGF抗体<VEGF>贝伐单抗(阿瓦斯丁)和cb)结合血管生成素-2的两个单链Fv(scFv)(衍生自SEQ ID NO：52或SEQ ID NO：68的重链可变结构域(VH)，和SEQ ID NO：53或SEQ ID NO：69的轻链可变结构域(VL))，其连接到抗-VEGF抗体<VEGF>贝伐单抗(阿瓦斯丁)重链的C-端(所产生的融合肽序列是SEQ ID NO：102或SEQ ID NO：103，其与贝伐单抗轻链SEQ ID NO：104一起共表达。(备选地结合血管生成素-2的两个单链Fv(scFv)也可连接到轻链的C-端或重链的N-端)。

替代单独两个单链Fv(scFv)，也可使用单链Fab片段，如上所述(使用肽连接体用于融合到C末端或N-末端)，在EP申请号09004909.9和在实施例10中描述。

实施例1

双特异性四价抗体的表达和纯化

<VEGF-ANG-2>TvAb5，TvAb6，TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08

将相应的四价双特异性抗体TvAb5和TvAb6的轻链和重链构建在如上文描述的基因组表达载体中。将这些质粒在大肠杆菌中扩增，纯化，并随后转染从而在HEK293-F细胞(使用Invitrogen’s FreeStyle 293系统)中进行重组蛋白的瞬时表达。7天后，收获、过滤HEK 293-F细胞上清液，并通过蛋白A和大小排阻层析法纯化该双特异性抗体。通过在非还原和还原条件下的SDS-PAGE和分析大小排阻层析法证实所有的双特异性抗体构建体的均一性。在还原条件下(图3)，携带C端scFv融合物的<VEGF-ANG-2>TvAb6的多肽重链在SDS-PAGE上显示ca.75kDa的表观分子大小(类似于计算的分子量)。质谱确认了所纯化抗体构建体的身份。通过蛋白A HPLC分析所有的构建体的表达水平，其类似于‘标准’IgGs的表达产率。蛋白产率是每升细胞培养物上清液获得达到150mg的TvAb6<VEGF-ANG-2>(通过蛋白A HPLC确定)。

纯化的非二硫化物稳定的在重链C端融合scFv的构建体TvAb5的大小排阻层析分析显示，在通过大小排阻层析纯化单体抗体后与‘标准’IgGs比较显示增加的再凝聚倾向(所谓的“菊花链(daisy chain)”现象)。这种发现得到其它实例的支持(Rajagopal，V.，等，Prot.Engin.(1997)1453-1459；Kobayashi，H.，et al，Nucl Med Biol.(1998)387-393或Schmidt，M.，et al，Oncogene(1999)18，1711-1721)，这些实例显示包含未由VH和VL之间的链间二硫化物稳定的scFvs的分子表现出增加的凝聚倾向和降低的产率。为了解决这些双特异性抗体聚集的问题，使用所述scFv结构部分的二硫化物稳定。对此，我们在指定位置(位置VH44/VL100，根据Kabat编号方案)引入scFv的VH和VL内的单半胱氨酸置换。这些突变能够形成VH和VL之间稳定的链间二硫化物，这又稳定得到的二硫化物稳定的scFv组件。将VH44/VL100二硫化物在TvAb6<VEGF-ANG-2>中Fv的C端引入scFvs产生稳定的四价抗体，其在纯化后不再显示凝聚倾向并保持单体状态(图4)。此外，在例如体外和体内应用的浓度3mg/kg经反复冻融循环TvAb6<VEGF-ANG-2>没有显示凝聚倾向的增加。

制备表3中所描述的所有其它TvAb分子(例如TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08)并根据所描述程序类似地进行分析表征。

实施例2

双特异性四价抗体<VEGF-ANG-2>TvAb6，TvAb-2441-贝伐单抗-LC06 和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08对VEGF-A和ANG-2的同时结合

不同双特异性抗体形式的IgG-组件中保留的scFv组件的结合和Fvs的结合与该结合组件和双特异性抗体所来自的“野生型”IgGs的结合相比较。这些分析通过进行生化结合ELISA和通过使用表面等离子共振(Biacore)在等摩尔浓度进行。

对于<VEGF-ANG-2>TvAb6，通过如上所述的VEGF结合ELISA显示其在0.625pM的等摩尔浓度与其母体抗体G6-31相当的结合VEGF(图5)。该发现是可以预期的，因为TvAb的Fv区与G6-31的相同。<VEGF-ANG-2>TvAb6和<VEGF>G6-31之间微弱的差异是由于蛋白浓度的小的差异和C端scFv结合<hFc>-POD检测抗体的轻度立体干扰，可通过如用于ANG-2结合ELISA中一样应用<hk>POD(Biozol Cat.No.206005)检测抗体来克服。

使用Biacore这些发现被使用经典浓度系列在37℃中确认(图11)。这些数据显示快的4.7-4.8E+6 1/(Ms)的K结合率k(a)，用最高浓度的VEGF达到饱和。解离率达到技术规格的局限(即5xE-6(s/s)，可能是由于在这种条件下仍有由于二聚体分析物rhVEGF的二价结合(亲和效应)，尽管使用了非常低的配体密度产生最终10-15RU的VEGF-反应。然而，不同<VEGF>抗体的动力学常数可通过这种方法比较，并且在该方法的误差内，在四价双特异性抗体<VEGF-Ang-2>TvAb6和最初的抗体<VEGF>G6-31可检测的动力学常数中没有显著差异。通过这种方法在这些条件下<VEGF-Ang-2>TvAb6和<VEGF>G6-31的动力学常数实际上是相同的。因此，可得出结论TvAb6完全保留了其VEGF结合性质。表4显示各自的动力学常数，图12显示两种<VEGF>抗体<VEGF-Ang-2>TvAb6和<VEGF>G6-31在Ka-Kd图表中的动力学特征。

表14：<VEGF-Ang-2>TvAb6和<VEGF>G6-31的动力学性质

在37℃测量	Ka	kd	t1/2	KD
					抗体	[1/(Ms)]	[1/s]	[min]	[M]
<VEGF>G6-31	4.83E+06	9.33E-06	1237.8	1.93E-12
					<VEGF-Ang-2>TvAb6	4.72E+06	7.24E-06	1596.7	1.53E-12

在另一个实验中，如上所述通过使用<hk>-POD检测抗体(Biozol商品号206005)的ANG-2结合ELISA显示在0.039pM的等摩尔浓度<VEGF-ANG-2>TvAb6以与Mab536相当的方式结合ANG-2(图6A)。这显示TvAb6的scFv组件保留了其在TvAb构建体中的结合性质。

为进一步确认这种发现，<ANG-2>Mab536和<VEGF-ANG-2>TvAb6通过次级抗体固定在BiacoreCM5芯片上并测量与人ANG-2的结合动力学。由于ANG-2制剂的异质性不能观察到1∶1结合；因此KD值仅是相对估算。Biacore分析显示<VEGF-ANG-2>TvAb6对于ANG-2具有4.4nM的估算的KD值。相比之下，Mab536具有1.6nM的估算的KD值。在该方法的误差内，未观察到<ANG-2>Mab536和<VEGF-ANG-2>TvAb6之间在结合方式和亲和力方面的差异(图6B)。因此，可得出结论TvAb6的scFv组件完全保留了其在TvAb构建体中的结合性质。

为证明<VEGF-ANG-2>TvAb6能够同时结合VEGF和ANG-2，使用了如上所述的桥连ELISA测定和Biacore测定。

通过使用如上所述的VEGF-ANG-2-桥连ELISA显示，仅<VEGF-ANG-2>TvAb6能够以0.625pM的等摩尔浓度同时结合VEGF和ANG-2，而单特异性“标准”IgG1抗体<ANG-2>Mab536和<VEGF>G6-31不能同时结合VEGF和ANG-2(图7)。

图14显示来自Biacore测定的各自的数据。对于四价双特异性抗体<VEGF-Ang-2>TvAb6可以显示对两种抗原Ang-2和VEGF的同时结合。阴性对照如所预期的：单特异性抗体<Ang-2>Mab536显示仅结合Ang-2，但不结合VEGF。单特异性抗体<VEGF>G6-31显示结合VEGF但根本不结合Ang-2(数据未显示)。从四价双特异性抗体<VEGF-Ang-2>TvAb6结合Ang-2包被表面和随后结合二聚体VEGF结合的相对反应单位(relativeresponse units)，可以计算化学计量学范围在1∶1至1∶1.4。总之，通过应用所述的ELISA和Biacore测定显示仅<VEGF-Ang-2>TvAb6能够同时结合VEGF和Ang-2，而单特异性“标准”IgG1抗体<Ang-2>Mab536和<VEGFYG6-31不能同时结合VEGF和Ang-2(图15)。

使用构建体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08在类似的Biacore测定中获得了相似的结果，显示于图15A中。抗体与抗原(例如人ANG-2和VEGF)的结合通过表面等离子共振使用BIACORET100仪器(GE Healthcare Biosciences AB，Uppsala，Sweden)进行研究。简言之，对于亲和力测量，山羊<hIgG-Fc□>多克隆抗体通过胺偶联固定在CM4芯片上用于展示针对人ANG-2和VEGF的双特异性抗体。结合在HBS缓冲液(HBS-P(10mM HEPES，150mM NaCl，0.005％Tween 20，ph 7.4)，25℃中测量。纯化的ANG-2-His(R&D systems或内部纯化的)以溶液中6.25nM和200nM之间的多种浓度添加。通过ANG-2-注射3分钟测量缔合；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3分钟测量解离，并且使用1∶1朗格缪尔(Langmuir)结合模型估算KD值。由于ANG-2制剂的异质性不能观察到1∶1结合；因此KD值仅是相对估算。

VEGF(R&D systems)以溶液中6.25nM和200nM之间的多种浓度添加。通过VEGF-注射3分钟测量缔合；通过用HBS缓冲液洗涤芯片表面3分钟测量解离，并且使用1∶1朗格缪尔(Langmuir)结合模型估算KD值。

注射结合配偶体的顺序可以改变，先是VEGF然后是Ang2或反之亦然。

从样品曲线中减去阴性对照数据(例如缓冲液曲线)，以用于校正系统固有的基线漂移和用于噪音信号的降低。使用Biacore T100评估软件版本1.1.1来分析传感图(sensorgrams)和用于计算亲和力数据。

抗体	亲和力hAng-2	亲和力hVEGF

TvAb-2441-贝伐单抗-LC06	2.3nM	0.35nM
			TvAb-2441-贝伐单抗-LC08	0.7nM	0.34nM
G6-31	--	＜0.1nM
			MAb536	3nM	--
贝伐单抗	--	0.59nM

最后，TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08的同时结合可通过与ANGPT2和VEGF以连续的方式温育来显示。如图15B中所示，ANGPT2和VEGF可同时结合双特异性抗体。

实施例3

在Scid beige小鼠分期皮下Colo205异种移植模型中，与<ANG-2>Mab536， <VEGF>G6-31以及Mab536和G6-31的组合相比较，二硫化物稳定的双特异性四价抗体<VEGF-ANG-2>TvAb6的体内效应

在雌性Scid beige小鼠两个分期皮下Colo205异种移植模型研究(Ang2_PZ_Colo205_003和Ang2_PZ_Colo205_005)中，不同剂量的纯化的二硫化物稳定的<VEGF-ANG-2>TvAb6(n00.2331见表3)与抗体<ANG-2>Mab536，<VEGF>G6-31以及<ANG-2>Mab536和<VEGF>G6-31的组合相比较。

抗体：<ANG-2>Mab536作为冷冻的母液(c＝4.5mg/mL)，<VEGF>G6-31作为冷冻的母液(c＝0.6mg/mL)和<VEGF-ANG-2>TvAb6作为冷冻的母液(c＝0.5mg/mL)在20mM组氨酸，140mM NaCl，pH 6.0中提供。需要时在注射前抗体溶液在PBS中从母液适当稀释，PBS用作赋形剂。

细胞系和培养条件：Colo205人结肠直肠癌细胞最初从ATCC获得，扩增后保藏在Roche Penzberg内部细胞库中。肿瘤细胞系在补充了10％胎牛血清(PAA Laboratories，Austria)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(PAA，Laboratories，Austria)中，在37℃于水饱和大气中在5％CO₂中常规地培养。传代2-5用于移植。

动物：雌性SCID beige小鼠；4-5周龄到达(购自Charles River Germany)时根据确定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约10周。

监测：每日管控(control)动物的临床症状并检测副作用。对于监测整个实验中记录动物的体重并在分期后用测径器测量肿瘤体积。

肿瘤细胞注射：注射当天，离心Colo205细胞，洗涤一次并在PBS中重悬浮。再次用PBS洗涤后细胞浓缩物和细胞大小使用细胞计数器和分析系统(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量。对于Colo205细胞的注射，最终滴度调整为5.0x10E7细胞/ml，活力ca.90％。随后对应于每只动物2.5*10⁶细胞的100μl这种悬浮物s.c.注射到小鼠的右腹。

动物处理在随机化的天数、细胞移植后16天(研究Ang2_PZ_Colo205_003)和细胞移植后14天(研究Ang2_PZ_Colo205_005)在平均肿瘤体积分别是100mm3或150mm3时开始。

研究Ang2_PZ_Colo205_003直至74天的给药方案(见图8A)：

在研究Ang2_PZ_Colo205_003中，<VEGF-ANG-2>TvAb6在等摩尔比方面错误地给予了不足量(underdosed)。在研究Ang2_PZ_Colo205_005中调整了<VEGF-ANG-2>TvAb6的剂量从而动物接受等摩尔比的ANG-2和VEGF结合位点的<VEGF-ANG-2>TvAb6以及<VEGF>G6-31和<ANG-2>Mab536的组合。

肿瘤生长抑制直至第74天(见图8a)。Ang2_PZ_Colo205_003研究：

剂量为7mg/kg的<VEFG-ANG-2>TvAb6显示出与5mg/kg的<VEGF>G6-31和6mg/kg的<ANG-2>Mab536的组合、以及剂量为6mg/kg的作为单剂的<VEGF>G6-31相当的效应(图8A)，并且比剂量为6mg/kg的作为单剂的<ANG-2>Mab536更好。由于皮下Colo205模型对阻断人以及鼠VEGF的<VEGF>G6-31抗体非常有反应性，导致几乎完全的肿瘤生长抑制，因此在所选的实验条件下<VEGF-ANG-2>TvAb6不能与作为单剂的G6-31(6mg/kg)区分，而<VEGF-ANG-2>TvAb6在清楚地更低的累积剂量(与<ANG-2>Mab536和<VEGF>G6-31的组合＝40+48＝88mg/kg抗体相比较，<VEGF-ANG-2>TvAb6＝56mg/kg抗体)显示与<ANG-2>Mab536和<VEGF>G6-31的组合的相当的抑制。

直至第63天研究Ang2_PZ_Colo205_005的剂量方案：

直至第63天研究Ang2_PZ_Colo205_005肿瘤生长抑制：

剂量为4mg/kg的<VEGF-ANG-2>TvAb6显示出与每种为3mg/kg的<VEGF>G6-31和<ANG-2>Mab536的组合相当的效应，并且比剂量为3mg/kg的单剂<VEGF>G6-31和单剂<ANG-2>Mab536更好(图8B)。这是第一个这样的实例，其显示更低剂量(关于总抗体浓度-该组合的累积剂量是21+21＝42mg/kg相对于28mg/kg的双特异性抗体TvAb6)靶向VEGF和ANG-2的双特异性抗体可产生强烈的抗-肿瘤效应，该效应与阻断VEGF和ANG-2的各自单剂的组合相当并优于每种单剂。

实施例4

阻断VEGF-诱导的管形成(tube formation)

为确认双特异性四价<VEGF-ANG-2>TvAb6中保留了抗-VEGF相关的活性，在VEGF诱导的管形成测定AngioKit TCS CellWorks(CellSystems)中显示，<VEGF-ANG-2>TvAb6介导的管形成剂量依赖性抑制与单特异性抗体<VEGF>G6-31相当。根据下述程序进行AngioKit TCS CellWorks测定：在第1，4，7和9天每次抗体处理前用2ng/ml的VEGF刺激细胞。通过在第11天用CD31-PE抗体(BD Pharmingen#555446)染色内皮细胞显示血管(Vascular tubes)。以4x放大率拍摄照片并使用MetaMorph(MolecularDevices)中的血管生成管形成应用组件(Angiogenesis Tube FormationApplication Module)定量分析管长度的数值和分支点数目。重复计算数值和标准差并且每个样品分析4张照片。图9显示各自的结果，并且图10A和B显示定量分析的结果。血管生成素-2对管形成没有影响，因此在本测定中未研究ANG-2的抑制。数据显示在抑制VEGF刺激的管形成中，双特异性<VEGF-ANG-2>TvAb6和单特异性<VEGF>G6-31抗体同样有效。

实施例5

Tie2磷酸化

为了确认双特异性四价<VEGF-ANGPT2>抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08中保留了抗-ANGPT2相关的活性，在如上所述的ANGPT2刺激的Tie2磷酸化测定中显示，TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08以与其母体克隆LC06和LC08相当的方式干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化。

在第一个实验中，双特异性抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08两者均显示剂量依赖性干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化，其IC50值与母体克隆LC06和LC08的相当(如图16A中所示)。TvAb-2441-贝伐单抗-LC06干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约721ng/ml，而LC06干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约508ng/ml。TvAb-2441-贝伐单抗-LC08干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约364ng/ml，而LC08干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约499ng/ml。

在第二个实验中，双特异性抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08两者均显示剂量依赖性干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化，其IC50值与母体克隆LC06和LC08的相当(如图16B中所示)。TvAb-2441-贝伐单抗-LC06干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约488ng/ml，而LC06干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约424ng/ml。TvAb-2441-贝伐单抗-LC08干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约490ng/ml，而LC08干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化的IC50值约399ng/ml。

总之，这些数据显示在本细胞测定的误差内，双特异性四价<VEGF-ANGPT2>抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08以与它们的母体克隆LC06和LC08相当的方式干扰ANGPT2刺激的Tie2磷酸化。

实施例6

抑制huANG-2与Tie-2的结合(ELISA)

相互作用ELISA在384孔微量滴定板(MicroCoat，DE，Cat.No.464718)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。用0.5μg/ml Tie-2蛋白(R&D Systems，英国，Cat.No.313-TI)包被ELISA板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2％吐温-20和2％BSA的PBS(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE)封闭孔1小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.2μg/ml人血管生成素-2(huAngiopoietin-2，R&D Systems(R&D系统)，UK，Cat.No.623-AN)一起在RT下温育1小时。洗涤后，添加0.5μg/ml生物素化的抗-血管生成素-2克隆BAM0981(R&D Systems(R&D系统)，UK)和1∶3000稀释的链霉亲和素HRP(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，Cat.No.11089153001)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，缓冲液#204 530 001，片剂#11 112 422 001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。

Ang2相互作用ELISA总结数据：

实施例7

抑制hVEGF与hVEGF受体的结合(ELISA)

测试在384孔微量滴定板(MicroCoat，DE，Cat.No.464718)上，在RT下进行。每次温育步骤后，用PBST洗涤板3次。开始时，用0.5μg/mlhVEGF-R蛋白(R&D Systems，英国，Cat.No.321-FL)包被板至少2小时(h)。其后，用增补了0.2％吐温-20和2％BSA的PBS(Roche DiagnosticsGmbH(罗氏诊断GmbH)，DE)封闭孔1小时。纯化的抗体在PBS中的稀释物与0.15μg/ml huVEGF 121(R&D Systems(R&D系统)，UK，Cat.No.298-VS)一起在RT下温育1小时。洗涤后，添加0.5μg/ml抗VEGF克隆Mab923(R&D Systems(R&D系统)，UK)和1∶2000辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的F(ab′)2抗小鼠IgG(GE Healthcare，UK，Cat.No.NA9310V)的混合物1小时。其后，用PBST洗涤板6次。在RT下，用新鲜制备的ABTS试剂(Roche Diagnostics GmbH(罗氏诊断GmbH)，DE，缓冲液#204 530 001，片剂#11 112 422 001)对该板进行显色30分钟。在405nm处测量吸光度。

VEGF相互作用ELISA总结数据：

实施例8

HUVEC增殖

为确认双特异性四价<VEGF-ANG2>抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08中保留了抗-VEGF相关活性，在如上所述的VEGF诱导的HUVEC增殖测定中显示，TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08以与它们的母体克隆LC06和LC08相当的方式干扰VEGF-诱导的HUVEC增殖。

图18显示TvAb-2441-贝伐单抗-LC06和TvAb-2441-贝伐单抗-LC08的确以与母体抗体贝伐单抗相当的浓度依赖性方式干扰VEGF-诱导的HUVEC增殖。

实施例9

人ANG-1和人ANG-2的ELISA结合测定

母体<ANG-2>抗体Ang2i-LC06，Ang2i-LC07和Ang2k-LC08与人ANG-1和人ANG-2的结合在ANG-1或ANG-2结合ELISA中测量，如上文所述(见与ANG-1和ANG-2结合的比较(ANG-1和ANG-2结合ELISA))。简言之，该ELISA-型测定是基于在微量滴定板中固定人野生型血管生成素-1或-2。针对固定的ANG-1或ANG-2的抗体的结合通过带有POD缀合物的<人Fc>(抗-IgG)抗体测量。<ANG-2>抗体的系列稀释物允许测量EC₅₀浓度。使用人抗-ANG-2抗体<ANG-2>抗体Mab536(Oliner等，CancerCell.2004 Nov；6(5)：507-16，US 2006/0122370)作为参比。测量的EC50浓度总结在下表中。

所有抗体特异性结合ANG-2。MAb536和Ang2k-LC08也显示对ANG-1的特异性结合，而Ang2i-LC06和Ang2i-LC07不特异性结合ANG-1，因为它们具有高于8000ng/ml(检测限)的EC50-值。

实施例10

双特异性、四价单链Fab<VEGF-ANG-2>抗体分子scFAb-阿瓦斯丁 -LC06-2620，scFab-阿瓦斯丁-Ang2i-LC06-2640和scFab-阿瓦斯丁 -Ang2i-LC06-2641的表达和纯化

类似于实施例1中描述的程序和上述的材料和方法，表达和纯化双特异性、四价单链Fab<VEGF-ANG-2>抗体分子scFAb-阿瓦斯丁-LC06-2620，scFab-阿瓦斯丁-LC06-2640和scFab-阿瓦斯丁-LC06-2641，所有三种都是基于<VEGF>贝伐单抗和<ANG-2>Ang2i-LC06。如上述实施例所述测量结合亲和力和其它性质。这些双特异性抗体的有关(可能修饰的)轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：109-110(scFAb-阿瓦斯丁-LC06-2620)，在SEQ ID NO：111-112(scFAb-阿瓦斯丁-LC06-2640)和在SEQ ID NO：113-114(scFAb-阿瓦斯丁-LC06-2641)中给出。

实施例11

双特异性、三价单链Fab<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁 -LC06-KiH-C-scFab的表达和纯化

类似于实施例1中描述的程序和上述的材料和方法，表达和纯化双特异性、三价单链Fab<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁-LC06-KiH-C-scFab(基于<VEGF>贝伐单抗和<ANG-2>Ang2i-LC06)。如上述实施例所述测量结合亲和力和其它性质。这种双特异性抗体的有关(可能修饰的)轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：115-117(阿瓦斯丁-LC06-KiH-C-scFab)中给出。

实施例12

双特异性、三价<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁-LC06-C-Fab-6CSS的表达和纯化

类似于实施例1中描述的程序和上述的材料和方法(也见，表达和纯化双特异性、三价<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁-LC06-C-Fab-6CSS(基于<VEGF>贝伐单抗和<ANG-2>Ang2i-LC06)。如上述实施例所述测量结合亲和力和其它性质。这种形式的双特异性、三价抗体分子一般在EP申请号09005108.7中描述。这种双特异性<VEGF-ANG-2>抗体的有关(可能修饰的)轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：118-120(阿瓦斯丁-LC06-C-Fab-6CSS)中给出。

实施例13

双特异性、二价结构域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁 -LC06-CH1-CL，阿瓦斯丁-LC06-VH-VL和阿瓦斯丁-LC06-VH-VL-SS的表达和纯化

类似于实施例1中描述的程序和上述的材料和方法，表达和纯化基于<VEGF>贝伐单抗和<ANG-2>Ang2i-LC06的双特异性、二价结构域交换的<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁-LC06-CH1-CL(如WO 2009/080253中所述进行CH-CL交换)、阿瓦斯丁-LC06-VH-VL(如WO 2009/080252中所述进行VH-VL交换)和阿瓦斯丁-LC06-VH-VL-SS(如WO 2009/080252中所述进行VH-VL交换并额外引入VH44 VL100二硫化物桥)。如上述实施例所述测量结合亲和力和其它性质。这些双特异性抗体的有关(可能修饰的)轻链和重链氨基酸序列在SEQ ID NO：121-124(阿瓦斯丁-LC06-CH1-CL)，在SEQ ID NO：125-128(阿瓦斯丁-LC06-VH-VL)和在SEQ ID NO：129-132(阿瓦斯丁-LC06-VH-VL-SS)中给出。

实施例14

双特异性、二价ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁 -LC06-N-scFab和阿瓦斯丁-LC06-N-scFabSS的表达和纯化

类似于实施例1中描述的程序和上述的材料和方法，表达和纯化双特异性、二价ScFab-Fc融合<VEGF-ANG-2>抗体分子阿瓦斯丁-LC06-N-scFab和阿瓦斯丁-LC06-N-scFabSS(基于<VEGF>贝伐单抗和<ANG-2>Ang2i-LC06)。如上述实施例所述测量结合亲和力和其它性质。这些双特异性抗体的有关修饰的重链氨基酸序列在SEQ ID NO：133-134(阿瓦斯丁-LC06-N-scFab)，和在SEQ ID NO：135-136(阿瓦斯丁-LC06-N-scFabSS)中给出。

实施例15

实施例10至14的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体分子抑制hVEGF结合 hVEGF受体(ELISA)，阻断VEGF-诱导的管形成，抑制huANG-2结合Tie-2 (ELISA)，Tie2磷酸化和HUVEC增殖

实施例10至14的双特异性<VEGF-ANG-2>抗体分子抑制hVEGF结合hVEGF受体(ELISA)，阻断VEGF-诱导的管形成，抑制huANG-2结合Tie-2(ELISA)，Tie2磷酸化和HUVEC增殖可类似地根据材料和方法以及上述实施例4至9中描述的程序测量。

实施例16

在Scid beige小鼠难治性Colo205异种移植模型(在对贝伐单抗(阿瓦斯丁) 处理抵抗后)中，与<ANG-2>ANG2i-LC06、以及<ANG-2>ANG2i-LC06 和阿瓦斯丁的组合相比较，双特异性抗体<VEGF-ANG-2>的体内效应

细胞系和培养条件：

Colo205人结肠直肠癌细胞最初从ATCC获得，扩增后保藏在RochePenzberg内部细胞库中。肿瘤细胞系在补充了10％胎牛血清(PAALaboratories，Austria)和2mM L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养基(PAA，Laboratories，Austria)中，在37℃于水饱和大气中在5％CO₂中常规地培养。传代2-5用于移植。

动物：

雌性SCID beige小鼠；4-5周龄到达(购自Charles River Germanyd)时根据确定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约10周。

肿瘤细胞注射：

注射当天，从培养瓶(Greiner)中收获肿瘤细胞(胰蛋白酶-EDTA)并转移到50ml培养基中，洗涤一次并在PBS中重悬浮。用PBS再次洗涤步骤和过滤(细胞滤过器；Falcon100μm)后调整终细胞滴度至2.5x10⁷/ml。肿瘤细胞悬浮物用移液器小心混合以避免细胞聚集。此后，细胞悬浮物使用宽针(wide needle，1.10x40mm)装入1.0ml结核菌素注射器(BraunMelsungen)；对于注射，改变针的大小(0.45x25mm)并且每次注射使用新的针。麻醉如下进行，对小动物使用带有预温育室(聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃(plexiglas))的Stephens吸入装置、个体小鼠鼻罩(nose-mask)(silicon)并使用不燃烧或爆炸的麻醉化合物异氟烷(cp-pharma)在闭式循环系统中进行。注射前两天将动物刮毛，对于细胞注射，用解剖镊子小心的提起麻醉动物的皮肤在动物的右腹皮下注射100μl细胞悬液(＝2.5x10⁶细胞)。

动物的处理

预处理：

细胞移植后14天开始动物处理(研究Ang2_PZ_Colo205_008)，平均肿瘤体积分别是100mm³至150mm³。在5周的时间期间每周一次用阿瓦斯丁(10mg/kg)处理小鼠。

二次处理：

其后为了二次处理对小鼠进行随机化并分为四组(每组10只小鼠)。在二次处理开始时(第51天)肿瘤体积范围在336至341mm³。小鼠用下表所示的不同化合物每周一次i.p.进行处理。

监测：

为了动物的健康状况，每周2x管控动物。细胞注射后每周2x记录体重。肿瘤大小在分期当天(on the staging day)和随后在整个处理期间每周2次通过测径器进行测量。肿瘤体积根据NCI方法(肿瘤重量＝1/2ab²，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长径和短径)计算。终止标准是临界肿瘤团块(达到1.7g或

)，体重减轻大于基线的20％，动物的肿瘤溃疡或不良的一般状况。

结果：基于第91天的中值(以百分比表示)的肿瘤生长抑制

结果显示，在Scid beige小鼠贝伐单抗(阿瓦斯丁)-抵抗性异种移植肿瘤模型Colo205中，与单特异性抗体ANG2i-LC06单独或ANG2i-LC06和阿瓦斯丁组合处理相比较，双特异性<VEGF-ANG-2>抗体TvAb-2441-贝伐单抗-LC06显示更高的肿瘤生长抑制(在更低的剂量)。

实施例17

在s.c.Calu-3 NSCLC异种移植中肿瘤血管生成的体内抑制

-使用标记的抗-CD31经非-侵入的体内血管生成成像检测

细胞系和培养条件：

这种人肺腺癌癌细胞系从患有肺癌的白人男性建立。细胞从Roche，Kamakura获得并在内部(in house)传代用于工作细胞库。肿瘤细胞系在补充了10％胎牛血清(PAN Biotech，Germany)和2mM L-谷氨酰胺(PANBiotech，Germany)的RPMI 1640培养基(PAN Biotech，Germany)中，在37℃于水饱和大气中在5％CO₂中常规地培养。用胰蛋白酶/EDTA 1x(PAN)每周分离一次进行培养物传代。

动物：

雌性BALB/c裸鼠；4-5周龄到达(购自Charles River Germanyd)时根据确定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约10周。

肿瘤细胞注射：

注射当天，从培养瓶(Greiner)中收获肿瘤细胞(胰蛋白酶-EDTA)并转移到50ml培养基中，洗涤一次并在PBS中重悬浮。用PBS再次洗涤步骤和过滤(细胞滤过器；Falcon100μm)后调整终细胞滴度至5.0x10⁷/ml。肿瘤细胞悬浮物用移液器小心混合以避免细胞聚集。此后，细胞悬浮物使用宽针(wide needle，1.10x40mm)装入1.0ml结核菌素注射器(BraunMelsungen)；对于注射，改变针的大小(0.45x25mm)并且每次注射使用新的针。麻醉如下进行，对小动物使用带有预温育室(聚甲基丙烯酸甲酯有机玻璃(plexiglas))的Stephens吸入装置、个体小鼠鼻罩(nose-mask)(silicon)并使用不燃烧或爆炸的麻醉化合物异氟烷(cp-pharma)在闭式循环系统中进行。注射前两天将动物刮毛，对于细胞注射，用解剖镊子小心的提起麻醉动物的皮肤在动物的右腹皮下注射100μl细胞悬液(＝5.0x10⁶细胞)。

动物的处理

在研究第35天，根据它们的体重和肿瘤大小将小鼠随机化成统计学良好的分布组。对于治疗性抗体的处理，每组由10只小鼠组成，并在6周的时间期间每周一次i.p.应用治疗性抗体处理。(见图19)。

组1：赋形剂(奥马珠单抗(Xolair))10mg/kg

组2：阿瓦斯丁10mg/kg

组3：单特异性<VEGF>阿瓦斯丁10mg/kg+单特异性<ANG-2>Ang2i-LC0610mg/kg的组合(＝阿瓦斯丁/Ang2i-LC06)

组4：双特异性<VEGF-ANG-2>抗体2441-阿瓦斯丁-scFv-LC06 13.3mg/kg

监测：

为了动物的健康状况，每周2x管控动物。细胞注射后每周2x记录体重。肿瘤大小在分期当天(on the staging day)和随后在整个处理期间每周2次通过测径器进行测量。肿瘤体积根据NCI方法(肿瘤重量＝1/2ab²，其中“a”和“b”分别是肿瘤的长径和短径)计算。终止标准是临界肿瘤团块(达到1.7g或)，体重减轻大于基线的20％，动物的肿瘤溃疡或不良的一般状况。

用标记的抗-CD 31抗体对血管和血管生成进行监测

初步研究揭示抗-CD31抗体是肿瘤血管成像的最佳试剂。该试剂靶向小鼠内皮CD31受体并以低信号-背景比值显示单个血管。因此，抗-CD31抗体成像代表肿瘤血管成像的可行方式。选择每个治疗组的三只小鼠并用50μg/小鼠的用有机荧光基团Alexa610共价标记的抗-CD3抗体在第35，49和79天i.v.注射。在吸入麻醉下每次应用标记的抗体后24小时进行近红外成像。通过使用图像比较工具MAESTRO系统显示肿瘤血管的增加或减少。在对照单克隆抗体奥马珠单抗(Xolair)和治疗性抗体阿瓦斯丁的处理下，在第35天至第79天观察到肿瘤血管的增加。相反，阿瓦斯丁+Ang2i-LC06和2441-阿瓦斯丁-scFv-LC06的组合处理显示肿瘤脉管系统的降低(图19)。

肿瘤区通过手工画图测量面积进行定量并且信号强度以强度值(总信号/暴露时间)进行评估。从第35至49天和从第49至79天CD31信号的平均变化在图19中作图。从第35至49天所有处理组揭示肿瘤脉管系统的增加。尽管在组1(奥马珠单抗(Xolair))和组2(阿瓦斯丁)中CD31肿瘤信号稳定地加速增加，在组3(阿瓦斯丁+<ANG-2>Ang2i-LC06组合)和组4(双特异性<VEGF-ANG-2>抗体2441-阿瓦斯丁-scFv-LC06)中肿瘤脉管系统显著减少，组4清楚地显示最明显的抗血管生成效应(图19)。

在最后体内成像研究后，立即移出肿瘤(第79天)，在福尔马林中固定并植入石蜡中进行离体(ex vivo)研究。在用对照单克隆抗体奥马珠单抗(Xolair)处理的肿瘤中荧光显微镜显示许多界限清楚的毛细血管。在阿瓦斯丁处理的小鼠中观察到数个肿瘤血管。相比之下，处理组3和4与处理组1和2相比在肿瘤中具有显著更少的且更不清楚的血管，而组4显示最清楚的效应。组4揭示更低的微血管密度，毛细血干一般更小且无组织(unstructured)并且与组1，2和3相比它们显示更弱的抗-CD31荧光信号。组织化学HE-染色显示组4双特异性抗体的处理组中瘤内坏死区达到所有区的90％，其比其它处理组显著更高(数据未显示)。

实施例18

在Scid beige小鼠分期皮下Colo205异种移植模型中双特异性抗体 <VEGF-ANG-2>的体内效应和与母体单特异性抗体(单独或组合)的比较

细胞系和培养条件：

动物：

雌性SCID beige小鼠；4-5周龄到达(购自Charles River Germany)时根据确定指南(GV-Solas；Felasa；TierschG)维持在无特异病原体、每日12h光/12h暗循环条件。实验研究方案经地方政府评阅且批准。到达后动物维持在动物实验室的检疫部一周以适应新环境和用于观察。定期进行连续健康监测。无限制提供饮食(Provimi Kliba 3337)和水(酸化的pH 2.5-3)。研究开始时鼠龄是大约10周。

肿瘤细胞注射：

注射当天，离心Colo205细胞，洗涤一次并在PBS中重悬浮。再次用PBS洗涤后细胞浓缩物和细胞大小使用细胞计数器和分析系统(Vi-CELL，Beckman Coulter)测量。对于Colo205细胞的注射，最终滴度调整为5.0x10E7细胞/ml，活力ca.90％。随后对应于每只动物2.5*10⁶细胞的100μl这种悬浮物s.c.注射到小鼠的右腹。

动物处理在随机化的天数、细胞移植后16天(研究Ang2_PZ_Colo205_009)在平均肿瘤体积分别是100mm3时开始。

研究Ang2_PZ_Colo205_009的剂量方案：

监测：

结果：

基于第61天的中值(以百分比表示)的肿瘤生长抑制(TGI)

结果显示，在Scid beige小鼠异种移植肿瘤模型Colo205中，与单特异性抗体ANG2i-LC06和阿瓦斯丁单独或ANG2i-LC06和阿瓦斯丁的组合的处理相比，所有三种双特异性<VEGF-ANG-2>阿瓦斯丁(贝伐单抗)-ANG2i-LC06抗体(都是基于贝伐单抗序列SEQ ID No：7和8以及基于ANG2i-LC06序列SEQ ID No：52和53)显示更高的肿瘤生长抑制。

实施例19

双特异性<VEGF-ANG-2>抗体分子scFAb-阿瓦斯丁-LC10-2620，scFab-阿瓦斯丁-LC10-2640和scFab-阿瓦斯丁-LC10-2641，阿瓦斯丁 -LC10-KiH-C-scFab，阿瓦斯丁-LC10-C-Fab-6CSS，阿瓦斯丁 -LC10-CH1-CL，阿瓦斯丁-LC10-VH-VL和阿瓦斯丁-LC10-VH-VL-SS，阿瓦斯丁-LC10-N-scFab和阿瓦斯丁-LC10-N-scFabSS的表达和纯化以及性质

通过将Ang2i-LC06的VH和VL结构域(SEQ ID No：52和53)替换为Ang2i-LC10相应的VH和VL结构域(SEQ ID No：84和85)，并使用如实施例10至14中所述的类似程序和序列(除了这种替换之外)，表达和纯化了双特异性<VEGF-ANG-2>抗体分子scFAb-阿瓦斯丁-LC10-2620，scFab-阿瓦斯丁-LC10-2640和scFab-阿瓦斯丁-LC10-2641，阿瓦斯丁-LC10-KiH-C-scFab，阿瓦斯丁-LC10-C-Fab-6CSS，阿瓦斯丁-LC10-CH1-CL，阿瓦斯丁-LC10-VH-VL和阿瓦斯丁-LC10-VH-VL-SS，阿瓦斯丁-LC10-N-scFab和阿瓦斯丁-LC10-N-scFabSS，它们都是基于<VEGF>贝伐单抗和<ANG-2>Ang2i-LC10。

结合亲和力和其它体外性质如上述实施例所述进行确定。

实施例20

双特异性抗体<VEGF-ANG-2>分子scFAb-阿瓦斯丁-LC10-2620，scFab-阿瓦斯丁-LC10-2640和scFab-阿瓦斯丁-LC10-2641，阿瓦斯丁 -LC10-KiH-C-scFab，阿瓦斯丁-LC10-C-Fab-6CSS，阿瓦斯丁 -LC10-CH1-CL，阿瓦斯丁-LC10-VH-VL和阿瓦斯丁-LC10-VH-VL-SS，阿瓦斯丁-LC10-N-scFab和阿瓦斯丁-LC10-N-scFabSS的体内效应。

双特异性抗体<VEGF-ANG-2>分子scFAb-阿瓦斯丁-LC10-2620，scFab-阿瓦斯丁-LC10-2640和scFab-阿瓦斯丁-LC10-2641，阿瓦斯丁-LC10-KiH-C-scFab，阿瓦斯丁-LC10-C-Fab-6CSS，阿瓦斯丁-LC10-CH1-CL，阿瓦斯丁-LC10-VH-VL和阿瓦斯丁-LC10-VH-VL-SS，阿瓦斯丁-LC10-N-scFab和阿瓦斯丁-LC10-N-scFabSS的体内效应根据上述对应实施例类似地确定。

Claims

1.特异性结合人血管内皮生长因子(VEGF)和人血管生成素-2(ANG-2)的双特异性抗体，其包含特异性结合人VEGF的第一抗原结合位点和特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点。

2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其特征在于：

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：94的CDR3区，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：18或SEQ ID NO：95的CDR2区，和SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：11，SEQ ID NO：19或SEQ ID NO：96的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：20或SEQ ID NO：97的CDR3区，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：21或SEQ ID NO：98的CDR2区，和SEQ ID NO：6，SEQ IDNO：14，SEQ ID NO：22或SEQ ID NO：99的CDR1区；

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：25，SEQ ID NO：38，SEQ ID NO：46，SEQ ID NO：54，SEQID NO：62，SEQ ID NO：70，SEQ ID NO：78或SEQ ID NO：86的CDR3区，SEQ ID NO：26，SEQ ID NO：39，SEQ ID NO：47，SEQ ID NO：55，SEQID NO：63，SEQ ID NO：71，SEQ ID NO：79或SEQ ID NO：87的CDR2区，和SEQ ID NO：27，SEQ ID NO：40，SEQ ID NO：48，SEQ ID NO：56，SEQ IDNO：64，SEQ ID NO：72，SEQ ID NO：80或SEQ ID NO：88的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：28，具有突变T92L，H93Q和W94T的SEQ ID NO：28，SEQ ID NO：41，SEQ ID NO：49，SEQ ID NO：57，SEQID NO：65，SEQ ID NO：73，SEQ ID NO：81或SEQ ID NO：89的CDR3区，SEQ ID NO：29，SEQ ID NO：42，SEQ ID NO：50，SEQ ID NO：58，SEQID NO：66，SEQ ID NO：74，SEQ ID NO：82或SEQ ID NO：90的CDR2区，和SEQ ID NO：30，SEQ ID NO：43，SEQ ID NO：51，SEQ ID NO：59，SEQ IDNO：67，SEQ ID NO：75，SEQ ID NO：83或SEQ ID NO：91的CDR1区。

3.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于：

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：46的CDR3区，SEQ ID NO：47的CDR2区，和SEQ ID NO：48的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：49的CDR3区，SEQ ID NO：50的CDR2区，和SEQ ID NO：51的CDR1区。

4.根据权利要求3所述的双特异性抗体，其特征在于：

5.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于：

ii)所述特异性结合VEGF的第一抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：1的CDR3区，SEQ ID NO：2的CDR2区，SEQ ID NO：3的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：4的CDR3区，SEQ IDNO：5的CDR2区，和SEQ ID NO：6的CDR1区；

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：62的CDR3区，SEQ ID NO：63的CDR2区，SEQ ID NO：64的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：65的CDR3区，SEQID NO：66的CDR2区，和SEQ ID NO：67的CDR1区。

6.根据权利要求5所述的双特异性抗体，其特征在于：

7.根据权利要求2所述的双特异性抗体，其特征在于：

iii)所述特异性结合ANG-2的第二抗原结合位点在重链可变结构域中包含SEQ ID NO：78的CDR3区，SEQ ID NO：79的CDR2区，和SEQ ID NO：80的CDR1区，并且在轻链可变结构域中包含SEQ ID NO：81的CDR3区，SEQ ID NO：82的CDR2区，和SEQ ID NO：83的CDR1区。

8.根据权利要求7所述的双特异性抗体，其特征在于：

9.根据权利要求1至8中任意一项所述的双特异性抗体，其特征在于：

结合亲和力KD(对VEGF特异性的抗原结合位点)/KD(对ANG-2特异性的抗原结合位点)的比值是1.0-10.0。

10.根据权利要求1至9中任意一项所述的双特异性抗体，其特征在于该特异性结合人ANG-2的第二抗原结合位点不特异性结合人血管生成素1(ANG-1)。

11.根据权利要求1至10中任意一项所述的双特异性抗体，其特征在于所述抗体是二价的、三价的或四价的。

12.药物组合物，其包含根据权利要求1-11所述的抗体。

13.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗癌症。

14.根据权利要求12所述的药物组合物，用于治疗血管疾病。

15.根据权利要求1至10中任意一项所述的双特异性抗体，用于治疗癌症。

16.根据权利要求1至10中任意一项所述的抗体用于制备治疗癌症的药物的应用。

17.治疗患有癌症的患者的方法，其通过向需要这种治疗的患者施用根据权利要求1至10中任意一项所述的抗体进行。

19.根据权利要求1至10中任意一项所述的双特异性抗体，用于治疗血管疾病。

20.根据权利要求1至10中任意一项所述的抗体用于制备治疗血管疾病的药物的应用。

21.治疗患有血管疾病的患者的方法，其通过向需要这种治疗的患者施用根据权利要求1至10中任意一项所述的抗体进行。

22.编码根据权利要求1至10所述的双特异性抗体的核酸。

23.含有根据权利要求22所述核酸的表达载体，其能够在原核或真核宿主细胞中表达所述核酸。

24.包含根据权利要求23的载体的原核或真核宿主细胞。

25.产生根据权利要求1至10所述的双特异性抗体的方法，其特征在于在原核或真核宿主细胞中表达根据权利要求22所述的核酸并从所述细胞或该细胞培养物上清液回收所述双特异性抗体。

26.通过权利要求25的重组方法获得的抗体。