JP2023535677A - 四面体抗体 - Google Patents

Abstract

本発明は、第１、第２、第３及び第４のドメインを含む四面体抗体であって、ａ）第１及び第２のドメインのそれぞれが、Ｆａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、ｂ）第１及び第２のドメインのそれぞれが、ｉ）ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、ｉｉ）ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖とを含み、ｃ）第１のドメインの第１のＮ末端と第２のドメインの第１のＮ末端とが非ペプチジル結合により相互に接続しており、非ペプチジル結合が、ｉ）共有結合、又はｉｉ）下記のペプチド：（１）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の二量体化ポリペプチドと、（２）ペプチド結合により連結している第２の二量体化ポリペプチドとの間の非共有結合である、四面体抗体を提供する。

Description

本出願は、2021年7月10日出願の米国仮特許出願第63/050,738号の利益を主張し、その内容は、これにより参照により本明細書に組み込まれる。

本出願全体を通じて、さまざまな公開資料が、括弧内に引用されるものを含め、引用されている。本発明が関係する技術分野、及び本発明と共に利用可能な技術分野における特徴について、その追加の説明を提供するために、本出願に記載される全ての公開資料の開示は、これにより参照により本明細書にそのまま組み込まれる。

配列表の参照
本出願には、サイズが１４．４メガバイトであり、ＭＳ－ウィンドウズ（登録商標）と互換性のあるオペレーティングシステムを有するＩＢＭ－ＰＣマシンのフォーマットで2021年7月12日に作成された、ファイルネーム「210712_91300-B-PCT_SequenceListing_DH.txt」中に存在するヌクレオチド配列が参照より組み込まれており、本出願の一部として2021年7月12日にファイルされたテキストファイル内に含まれる。

抗体は、２つの抗原結合（Ｆａｂ）ドメイン、及び１つのエフェクター細胞結合（Ｆｃ）ドメインからなるＹ字構造を含む脊椎動物タンパク質の多様なファミリーである。中央ヒンジ領域周辺のこれら３ドメインの配置は、平面三角形分子構造（中央の原子が三角形の各コーナーに位置する３つの周辺原子に結合している）ときわめて高い類似性を有する。結合ドメインのそのような平面コンフィギュレーションは、抗体がその正常な機能を実現するのに十分である。したがって、抗体及び抗体様分子を工学的に作り出す今日までの努力においても、抗体結合ドメインの天然の平面コンフィギュレーションが一般的に採用されている。しかしながら、工学操作された抗体及び抗体様分子の結合ドメインが複数の標的とエンゲージするように意図されるとき、結合ドメインによる複数標的と同時にエンゲージすることを可能にするのに、結合ドメインの平面コンフィギュレーションは理想的に適するものではない。

この発明は、第１、第２、第３及び第４のドメインを含む四面体抗体であって、
ａ）前記第１及び第２のドメインのそれぞれがＦａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、
ｂ）前記第１及び第２のドメインのそれぞれが、ｉ）前記ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、ｉｉ）前記ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖とを含み、
ｃ）前記第１のドメインの第１のＮ末端と前記第２のドメインの第１のＮ末端とが、非ペプチジル結合により相互に接続しており、前記非ペプチジル結合が、ｉ）共有結合であるか、又は、ｉｉ）（１）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の二量体化ポリペプチドと、（２）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第１のＮ末端に連結している第２の二量体化ポリペプチドとの間の非共有結合であり、前記第１及び第２の二量体化ポリペプチドが免疫グロブリンのポリペプチドではなく、
ｄ）前記第３のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第１のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
ｅ）前記第４のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第２のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第２の二量体化ポリペプチドの前記Ｎ末端に連結している、四面体抗体を提供する。

この発明は、第１、第２、第３、第４、第５及び第６のドメインを含む八面体抗体であって、
ａ）前記第１、第２及び第３のドメインのそれぞれが、Ｆａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、
ｂ）前記第１、第２及び第３のドメインのそれぞれが、ｉ）前記ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、ｉｉ）前記ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖とを含み、
ｃ）前記第１のドメインの第１のＮ末端、前記第２のドメインの第１のＮ末端、及び前記第３のドメインの第１のＮ末端が、非ペプチジル結合により相互に接続しており、前記非ペプチジル結合が、ｉ）分枝した共有結合であるか、又は、ｉｉ）（１）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の三量体化ポリペプチド、（２）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第１のＮ末端に連結している第２の三量体化ポリペプチド、及び、（３）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第３のドメインの前記第１のＮ末端に連結している第３の三量体化ポリペプチドとの間の非共有結合であり、前記第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドが免疫グロブリンのポリペプチドではなく、
ｄ）前記第４のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第１のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第１の三量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
ｅ）前記第５のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第２のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第２の三量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
ｆ）前記第６のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第３のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第３の三量体化ポリペプチドのＮ末端に連結している、八面体抗体も提供する。

図１は、ドメインＤ１、Ｄ２、Ｄ３、Ｄ４（Ａ～Ｄ）及びＤ５及びＤ６（Ｄ）の位置並びに共有結合（Ａ）及び非共有結合（Ｂ～Ｄ）の位置を示す四面体抗体の一般的な概略構造である。 図２は、図１Ａに示される共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、（Ａ）Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４は全て異なっている、（Ｂ）Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ３及びＤ４は同一である、（Ｃ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３及びＤ４は異なっている、（Ｄ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３及びＤ４は同一である。 図３は、図１Ｂに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、（Ａ）Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４は全て異なっている、（Ｂ）Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ３及びＤ４は同一である、（Ｃ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３及びＤ４は異なっている、（Ｄ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３及びＤ４は同一である。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｃ）ではヘテロ二量体対を、（Ｄ）ではホモ二量体対を形成する。 図４は、図１Ｃに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、（Ａ）Ｄ１、Ｄ２、Ｄ３及びＤ４は全て異なっており、（Ｂ）Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ３及びＤ４は同一である、（Ｃ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３及びＤ４は異なっている、（Ｄ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３及びＤ４は同一である。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｃ）ではヘテロ二量体対を、（Ｄ）ではホモ二量体対を形成する。 図５は、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ３～Ｄ６ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３～Ｄ６は全て異なっており、（Ｂ）Ｄ４及びＤ５は同一であり、Ｄ３及びＤ６は異なっている、（Ｃ）Ｄ４及びＤ６は同一であり、Ｄ３及びＤ５は異なっている、（Ｄ）Ｄ３及びＤ４は同一であり、Ｄ５及びＤ６は異なっている。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｄ）においてヘテロ二量体対を形成する。 図６は、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ３～Ｄ６ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３及びＤ６は同一であり、Ｄ４及びＤ６は同一である、（Ｂ）Ｄ３及びＤ５は同一であり、Ｄ４及びＤ５は同一である、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は同一であり、Ｄ５及びＤ６は同一である、（Ｄ）Ｄ３～Ｄ６は同一である。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｄ）においてヘテロ二量体対を形成する。 図７は、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ６ドメインは存在せず、Ｄ３～Ｄ５ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３～Ｄ５は全て異なっている、（Ｂ）Ｄ４及びＤ５は同一であり、Ｄ３は異なっている、（Ｃ）Ｄ３及びＤ５は同一であり、Ｄ４は異なっている、（Ｄ）Ｄ３～Ｄ５は全て同一である。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｄ）においてヘテロ二量体対を形成する。 図８Ａは、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３～Ｄ６ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第１の種類である、（Ｂ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第２の種類である、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の種類のものであり、Ｄ５及びＤ６は、第２の種類のものである、（Ｄ）Ｄ３及びＤ５は第１の種類のものであり、Ｄ４及びＤ６は、第２の種類のものである。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｄ）においてホモ二量体対を形成する。 図８Ｂは、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３～Ｄ６ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第１の種類である、（Ｂ）Ｄ３～Ｄ６全て同一の第２の種類である、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は第１の種類のものであり、Ｄ５及びＤ６は、第２の種類のものである、（Ｄ）Ｄ３及びＤ４は第２の種類のものであり、Ｄ５及びＤ６は第１の種類のものである。二量体化ポリペプチドの単一対は、（Ａ～Ｄ）においてホモ二量体対を形成する。 図９は、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３～Ｄ５ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第１の種類である、（Ｂ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第２の種類である、（Ｃ）Ｄ４及びＤ５は第１の種類のものであり、Ｄ３及びＤ６は第２の種類のものである、（Ｄ）Ｄ３及びＤ６は第１の種類のものであり、Ｄ４及びＤ５は第２の種類のものである。二量体化ポリペプチドの２つの対は各々、（Ａ～Ｄ）においてヘテロ二量体対を形成する。 図１０は、図１Ｄに示される非共有結合を有する四面体抗体の概略構造であり、（Ａ～Ｂ）Ｄ１及びＤ２は同一であり、Ｄ３～Ｄ５ドメインの間では、（Ａ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第１の種類であり、（Ｂ）Ｄ３～Ｄ６は全て同一の第２の種類である、（Ｃ～Ｄ）Ｄ１及びＤ２は異なっており、Ｄ３～Ｄ５ドメインの間では、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は第１の種類のものであり、Ｄ５及びＤ６は第２の種類のものである、（Ｄ）Ｄ３及びＤ５は第１の種類のものであり、Ｄ４及びＤ６は第２の種類のものである。二量体化ポリペプチドの２つの対は各々、（Ａ～Ｂ）においてホモ二量体対を形成する。二量体化ポリペプチドの２つの対は各々、（Ｃ～Ｄ）において別個のホモ二量体対を形成する。 図１１は、四面体抗体（Ａ）Ｒｃ６－Ｐ４－Ｒｃ６、（Ｂ）Ｒｃ６６ＳＩＤＥ－Ｐ４－Ｒｃ６６ＳＩＤＥ、（Ｃ）Ｒｃ６６ＳＩＤＥ－Ｐ１６－Ｒｃ６６ＳＩＤＥ、（Ｄ）Ｒｃ６６ＳＩＤＥ－Ｐ２８－Ｒｃ６６ＳＩＤＥ、（Ｅ）Ｂ１９ｃ６６－Ｐ４－Ｒｃ６ｍ、（Ｆ）Ｓｏｃ６６－Ｐ２８－６Ｅｃ６６、（Ｇ）ＨＡ９ｃ６６ＡＡＣ９－Ｐ４－ＨＡ９ｃ６６ＡＡＣ９及び（Ｈ）ＨＡ９ｃ６６ＡＡＣ９－Ｐ４－ＩＬ１５ｃ６ＡＡＣ９の概略構造である。 図１２は、四面体抗体Ｒｃ６－Ｐ４－Ｒｃ６の製造である。 図１３は、図１Ｂで示されるような非共有結合を有する四面体抗体の製造である。 図１４は、四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧの製造である。 図１５は、ＳＥ－ＨＰＬＣによる四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧの分析である。 図１６は、ＳＥ－ＨＰＬＣによる、種々のペプチドリンカー（Ｌ－１）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ、（Ｌ－１８５）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１８５－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１８５、（Ｌ－１９８）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１９８－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１９８、（Ｌ－２０８）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２０８－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２０８、（Ｌ－２１２）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５、（Ｌ－２３５）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５、（Ｌ－２４０）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２４０－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２４０を有する四面体抗体の分析である。 図１７は、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳによる四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧの分析である。 図１８は、四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ及びＡＣＥ単量体ＡＣＥ２ＲＱ６１５ｃ６０ＰＧの混合物の化学量論的結合分析である。 図１９は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の製造である。 図２０は、ＳＥ－ＨＰＬＣによる四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の分析である。 図２１は、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳによる四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の分析である。 図２２は、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳによる四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧの分析である。 図２３は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の不純物の化学量論的結合分析である。 図２４は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－７４０Ｆｃ－Ｇ９の混合物の化学量論的結合分析である。 図２５は、四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－７４０Ｆｃ－Ｇ９の混合物の化学量論的結合分析である。 図２６は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－６１５Ｆｃ－Ｇ９の混合物の化学量論的結合分析である。 図２７は、ＡＣＥ２四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧによる、並びにＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－６１５Ｆｃ－Ｇ９及びＡＣＥ２ＲＱ６１５ＦｃＰＧによるSARS-CoV-2－ＶＳＶ偽型ウイルス感染の阻害である。 図２８は、ＡＣＥ２四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧによる、並びにＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－７４０Ｆｃ－Ｇ９及びＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧによるSARS-CoV-2－ＶＳＶ偽型ウイルス感染の阻害である。 図２９Ａは、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ３及びＤ４の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである。 図２９Ｂは、：ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ３及びＤ４の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５及びＤ６の各々は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである。 図２９Ｃは、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ３及びＤ４の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８の各々は、第２の標的に特異的に結合するドメインである。Ｄ７及びＤ８は各々、単鎖ＴＮＦＳＦ融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図２９Ｄは、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ３及びＤ４の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５及びＤ６の各々は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８の各々は、第３の標的に特異的に結合するドメインである。Ｄ７及びＤ８は、単鎖ＴＮＦＳＦ融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図３０Ａは、ホモ三量体非共有結合を形成する第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドを含む八面体抗体であり、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ４、Ｄ５及びＤ５の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである。 図３０Ｂは、ホモ三量体非共有結合を形成する第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドを含む八面体抗体であり、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７、Ｄ８及びＤ９の各々は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである。 図３０Ｃは、ホモ三量体非共有結合を形成する第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドを含む八面体抗体であり、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ１０、Ｄ１１及びＤ１２の各々は、第２の標的に特異的に結合する。Ｄ１０、Ｄ１１及びＤ１２は各々、単鎖ＴＮＦＳＦ融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図３０Ｄは、ホモ三量体非共有結合を形成する第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドを含む八面体抗体であり、Ｄ１、Ｄ２及びＤ３の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６の各々は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７、Ｄ８及びＤ９の各々は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり。Ｄ１０、Ｄ１１及びＤ１２の各々は、第３の標的に特異的に結合する。Ｄ１０、Ｄ１１及びＤ１２は各々、単鎖ＴＮＦＳＦ融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図３１は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合する（四価、単一特異性）、（Ｂ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（四価、２＋２二重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合する（四価、２＋２二重特異性）、（Ｄ）Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（四価、単一特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｂ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］及び（Ｄ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］を含む。 図３２は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合する（四価、２＋２二重特異性）、（Ｂ）Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する（四価、２＋２二重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（四価、２＋２二重特異性）、並びに（Ｄ）Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（四価、２＋２二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｂ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｃ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］並びに（Ｄ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］を含む。 図３３は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する（四価、３＋１二重特異性）、（Ｂ）Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（四価、３＋１二重特異性）、（Ｃ）Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する（四価、３＋１二重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（四価、３＋１二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｂ）５つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］及び第１のＬ３鎖［Ｄ６］、（Ｃ）７つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ３］、第２のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ４］及び第３のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ５］並びに（Ｄ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ３］、第２のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ４］、第３のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ５］及び第１のＬ３鎖［Ｄ６］を含む。 図３４は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する（三価、２＋１二重特異性）、（Ｂ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（三価、２＋１二重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する（三価、２＋１二重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（三価、２＋１二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］及び第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、（Ｂ）５つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］及び第１のＬ２鎖［Ｄ６］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）７つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］及び第１のＬ２鎖［Ｄ６］を含む。 図３５は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ５は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第３の標的に特異的に結合する（四価、２＋１＋１三重特異性）、（Ｂ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ５は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第３の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（四価、２＋１＋１三重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第３の標的に特異的に結合する（四価、２＋１＋１三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第３の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（四価、２＋１＋１三重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｂ）５つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］及び第１のＬ３鎖［Ｄ６］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）７つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＨ３鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］及び第１のＬ３鎖［Ｄ６］を含む。 図３６は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１はヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ２はＦａｂドメインであり、（Ａ）Ｄ２は、第１の標的に結合するＦａｂであり、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第２の標的に特異的に結合する（四価、３＋１二重特異性）、（Ｂ）Ｄ２は、第１の標的に結合するＦａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ５は、第３の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂである（四価、２＋１＋１三重特異性）、（Ｃ）Ｄ２は、第１の標的に結合するＦａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ５は、第３の標的に特異的に結合する（四価、２＋１＋１三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ２は、第１の標的に結合するＦａｂであり、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（四価、４＋１二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、（Ｂ）５つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］及び第１のＬ２鎖［Ｄ５］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］、（Ｄ）７つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ３］、第２のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ４］及び第３のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ５］を含む。 図３７は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１はヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ２はＦａｂドメインであり、（Ａ）Ｄ２は、第１の標的に結合する可変領域交換Ｆａｂであり、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第２の標的に特異的に結合する（四価、３＋１二重特異性）、（Ｂ）Ｄ２は、第１の標的に結合する可変領域交換Ｆａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ５は、第３の標的に特異的に結合するＦａｂである（四価、２＋１＋１三重特異性）、（Ｃ）Ｄ２は、第１の標的に結合する可変領域交換Ｆａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５は、第３の標的に特異的に結合する（四価、２＋１＋１三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ２は、第１の標的に結合する可変領域交換Ｆａｂであり、Ｄ３、Ｄ４及びＤ５は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（四価、３＋１二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、（Ｂ）５つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］及び第１のＬ２鎖［Ｄ５］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）７つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ３］、第２のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ４］及び第３のＬ１／Ｌ２鎖［Ｄ５］を含む。 図３８は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１はヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ２はＦａｂドメインであり、（Ａ）Ｄ２は、第１の標的に結合するＦａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する（三価、２＋１二重特異性）、（Ｂ）Ｄ２は、第１の標的に結合する可変領域交換Ｆａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する、（Ｃ）Ｄ２は、第１の標的に結合するＦａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインである（三価、２＋１二重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ２は、第１の標的に結合する可変領域交換Ｆａｂであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインである（三価、２＋１二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］及び第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、（Ｂ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］及び第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３］、第１のＨ１Ｆａｂ鎖［Ｄ２／Ｄ４］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］を含む。 図３９は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第２の標的に特異的に結合する（六価、４＋２二重特異性）、（Ｂ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（六価、２＋２＋２三重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（六価、２＋２＋２三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ３、Ｄ４、Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第２の標的に特異的に結合する（六価、４＋２二重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｂ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］を含む。Ｄ７及びＤ８は、第１及び第２のＨ１鎖のＣ末端（示されるように）又は第１及び第２のＨ２鎖のＣ末端で付着されてもよい。Ｄ７及びＤ８は、単鎖ＴＮＦＳＦリガンド融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図４０は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（六価、２＋２＋２三重特異性）、（Ｂ）Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（六価、２＋２＋２三重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ５及びＤ６は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（六価、２＋２＋２三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ５及びＤ６は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（六価、２＋２＋２三重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｂ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］及び第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、（Ｃ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］並びに（Ｄ）８つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ１／Ｄ５］、第２のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］、第１のＬ２鎖［Ｄ５］及び第２のＬ２鎖［Ｄ６］を含む。Ｄ７及びＤ８は、第１及び第２のＨ１鎖のＣ末端（示されるように）又は第１及び第２のＨ２鎖のＣ末端で付着されてもよい。Ｄ７及びＤ８は、単鎖ＴＮＦＳＦリガンド融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図４１は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１及びＤ２の各々は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、（Ａ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）、（Ｂ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合し、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）、（Ｃ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ３及びＤ４は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ６は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］及び第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、（Ｂ）５つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、Ｆｃ鎖［Ｄ１］及びＬ２鎖［Ｄ６］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）７つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］、第２のＬ１鎖［Ｄ４］及び第１のＬ２鎖［Ｄ６］。Ｄ７及びＤ８は、第１及び第２のＨ１鎖のＣ末端（示されるように）又は第１及び第２のＨ２鎖のＣ末端で付着されてもよい。Ｄ７及びＤ８は、単鎖ＴＮＦＳＦリガンド融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図４２は、ホモ二量体非共有結合を形成する第１及び第２の二量体化ポリペプチドを含む四面体抗体であり、Ｄ１はヘテロ二量体Ｆｃドメインであり、Ｄ２はＦａｂドメインであり、（Ａ）Ｄ２は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）、（Ｂ）Ｄ２は、第１の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合し、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）、（Ｃ）Ｄ２は、第１の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）並びに（Ｄ）Ｄ２は、第１の標的に特異的に結合する可変領域交換Ｆａｂドメインであり、Ｄ３及びＤ４は、第２の標的に特異的に結合するＦａｂドメインであり、Ｄ７及びＤ８は、第３の標的に特異的に結合する（五価、２＋２＋１三重特異性）。Ａ～Ｄの四面体抗体は、（Ａ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］及び第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、（Ｂ）４つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］及び第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、（Ｃ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］並びに（Ｄ）６つの鎖：第１のＨ１鎖［Ｄ１／Ｄ３／Ｄ７］、第２のＨ１鎖［Ｄ２／Ｄ４／Ｄ８］、第１のＨ２鎖［Ｄ２／Ｄ６］、第１のＦｃ鎖［Ｄ１］、第１のＦａｂ鎖［Ｄ２］、第１のＬ１鎖［Ｄ３］及び第２のＬ１鎖［Ｄ４］を含む。Ｄ７及びＤ８は、第１及び第２のＨ１鎖のＣ末端（示されるように）又は第１及び第２のＨ２鎖のＣ末端で付着されてもよい。Ｄ７及びＤ８は、単鎖ＴＮＦＳＦリガンド融合ポリペプチドとして表されているが、任意のドメインであってもよい。 図４３は、ＡＣＥ２四面体抗体である。ＡＣＥ２四面体抗体の４つの形態は、ｃ、ｄ、ｅ及びｆに示されている。各々は、ドメイン１～４及び二量体化ポリペプチドを含む。ａ及びｂにおける構造は、標準Ｆｃ二量体である。 図４４は、生ウイルスに対するＡＣＥ２四面体抗体の相対中和活性である。上の図：生のSARS-CoV-2ウイルスの中和を実証する。下の図：ＮＬ６３（αコロナウイルス）の中和を実証する。ＡＣＥ２スーパー二量体（６－０５ ＳＤ）は、ウイルスを、標準Ｆｃ融合タンパク質（ＡＣＥ２Ｆｃ６１５）よりもおよそ３桁の規模で良好に中和する。また、精製した二量体（６－０５ Ｄ）並びに二量体及びスーパー二量体の不純な混合物（６－０５ 不純）も示される。 図４５は、構築物１３－２１及び１３－２２の薬物動態曲線である。１３－２１は、ｗｔ ＡＣＥ２－Ｂ１３スーパーヘテロ二量体四面体抗体に相当する。１３－２２は、Ｈ３７８Ａ変異を有する変異体ＡＣＥ２－Ｂ１３スーパーヘテロ二量体四面体抗体に相当する。 図４６は、構築物１０－０５及び１３－２１の薬物動態曲線である。１０－０５は、ＡＣＥ２－ＡＣＥ２スーパーヘテロ二量体四面体抗体に相当する。１３－２１は、ｗｔ ＡＣＥ２－Ｂ１３スーパーヘテロ二量体四面体抗体に相当する。 図４７は、ＡＣＥ２コア二量体（１０－５９）、Ｂ－１３（１２－０９）及びＡＣＥ２－Ｂ－１３スーパー二量体（１５－１６）の相対中和活性である。 図４８Ａ～図４８Ｐでは、１２種の異なるバリアントウイルスに対する種々の抗体の相対中和活性が、ＡＣＥ２－Ｂ１３サイレントバージョン及びＡＣＥ２－Ｂ１３活性バージョン（菱形及び丸によって表される）に対して比較されている。 図４９は、ＰＢＳ対照（ＰＢＳ）、２５ｍｇ／ｋｇのＲＥＧＮ１０９３３及びＲＥＧ－ＣｏＶ－２カクテル（各２５ｍｇ／ｋｇのＲｅｇｅｎｅｒｏｎ抗体ＲＥＧＮ１０９３３及びＲＥＧ１０８９８７）及び２５ｍｇ／ｋｇのＦｃサイレントＡＣＥ２－Ｂ１３（ＨＢ１５１６）を用いて治療された、南アフリカSARS-CoV-2ウイルスに感染したハムスターの体重変化である。 図５０Ａ～図５０Ｃは、二重特異性抗体における正しい対合及び誤対合の定量化の相対である。主ピークは、正しく対合された分子を表す。矢印は、誤対合生成物が予測されるであろう位置を示す。主ピークは、脱グリコシル化手順後に残っている残存するＯ－グリカンによる２つのピークからなる。 図５１Ａ～図５１Ｃは、Ｎ４３９Ｋ及び南アフリカバリアントに対する種々の抗体の相対中和活性である。ＡＣＥ２スーパーヘテロ二量体（四角）は、表３６、３７及び３８に記載されている。

発明の詳細な説明
四面体抗体
本発明は、第１、第２、第３及び第４のドメインを含む四面体抗体であって、
ａ．第１及び第２のドメインのそれぞれがＦａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、
ｂ．第１及び第２のドメインのそれぞれが、ｉ．ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、ｉｉ．ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖と
を含み、
ｃ．第１のドメインの第１のＮ末端と第２のドメインの第１のＮ末端とが、非ペプチジル結合により相互に接続しており、非ペプチジル結合が、ｉ．共有結合であるか、又は、ｉｉ．１．ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の二量体化ポリペプチドと、２．ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第２のドメインの第１のＮ末端に連結している第２の二量体化ポリペプチドとの間の非共有結合であり、第１及び第２の二量体化ポリペプチドが免疫グロブリンのポリペプチドではなく、
ｄ．第３のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ．第１のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ．第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
ｅ．第４のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ．第２のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ．第２の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結している、四面体抗体を提供する。

本発明の複数の態様では、
ａ．第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ第２のドメインがＦａｂドメインであるか、
ｂ．第１及び第２のドメインがＦｃドメインであるか、
ｃ．第１及び第２のドメインがＦａｂドメインであるか、
ｄ．第３及び第４のドメインがＦａｂドメインであるか、
ｅ．第３及び／又は第４のドメインが、（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインからなる群より選択されるか、
ｆ．第３のドメインが、（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの群から選択され、かつ第４のドメインがＦａｂであるか、
ｇ．第３のドメインがＩＬ－１５であるか、
ｈ．第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ第４のドメインがＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインであるか、
ｉ．第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ第４のドメインがＦａｂであるか、
ｊ．第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）であるか、
ｋ．第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ第３及び第４のドメインが（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインからなる群より選択されるか、
ｌ．第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、第３のドメインが（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインからなる群から選択され、かつ第４のドメインがＦａｂであるか、
ｍ．第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ第３及び第４のドメインがＦａｂドメインであるか、
ｎ．第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）であるか、
ｏ．第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ第２、第３及び第４のドメインがＦａｂドメインであるか、
ｐ．第１のドメインがＦｃドメインであり、第２のドメインがＦａｂドメインであり、第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ第４のドメインがＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインであるか、あるいは
ｑ．第１のドメインがＦｃドメインであり、第２のドメインがＦａｂドメインであり、第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ第４のドメインがＦａｂである。

本発明の複数の態様では、第１のドメインの第１のＮ末端と第２のドメインの第１のＮ末端との間のペプチジル結合は共有結合である。

本発明の複数の態様では、共有結合は、構造：

（ここで、
ａ．Ｘ_ａは、
ｉ．ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、
ｉｉ．ピリダジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造
からなる群から選択される化学構造であり、
ｂ．Ｒ_ａは、結合であるか、又は、Ｘ_ａを第１のドメインの第１のＮ末端と結びつける化学構造であり、
ｃ．Ｒ_ｂは、結合であるか、又は、Ｘ_ａを第２のドメインの第１のＮ末端と結びつける化学構造である）
を含む。

本発明の複数の態様では、Ｘ_ａは、構造

（ここで、Ｒ_ｃは、Ｈ、アルキル若しくはアリール、又はその互変異性体である）を含む。

本発明の複数の態様では、共有結合は、構造

（ここで、Ｒ_ｃは、Ｈ、アルキル若しくはアリール、又はその互変異性体である）を含む。

本発明の複数の態様では、Ｒ_ａ及びＲ_ｂは、独立して、結合、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上の数の部分の鎖を含むか若しくはそれからなる化学構造であり、各部分は、独立して、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、

（ここで、Ｘ_１はＣＨ又はＮであり、Ｘ_２はＣＨ_２又はカルボニル基であり、Ｒ_５はアリール又はアルキル基であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは

（ｙ＝１～１００、ｚ＝１～１０）である）、からなる群から選択される。

本発明の複数の態様では、Ｒ_ａ及び／又はＲ_ｂは、それぞれ独立して、
ａ．［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含むか；
ｂ．ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、又は多糖類基を含むか；
ｃ．Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基を含むか；
ｄ．スクシンイミドを含むか；
ｅ．アミンを含むか；
ｆ．スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、又はアジポイルを含むか；
ｇ．マロニルを含むか；
ｈ．アミノ酸を含むか；
ｉ．システインを含むか；
ｊ．リシンを含むか；
ｋ．［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
からなる群から選択される３つの部分の鎖からなるか、
ｌ．［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
からなる群から選択される４つの部分の鎖からなるか、
ｍ．［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
からなる群から選択される５つの部分の鎖からなるか；
ｎ．リシンに結合した［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含むか；
ｏ．スクシンイミド基に結合したＣ_１～Ｃ_４アシル基を含むか；
ｐ．Ｃ_１～Ｃ_４アシルに結合したリシンを含むか、
ｑ．グルタリルに結合した［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含むか；
ｒ．［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、アミノ酸、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
（ここで、Ｘ_１はＣＨ又はＮであり、Ｘ_２はＣＨ_２又はカルボニル基であり、Ｒ_５はアリール又はアルキル基であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、
であり、ｙ＝１～１００であり、ｚ＝１～１０である）
からなる群から選択される、３、４又は５つの部分の鎖からなるか；
ｓ．結合であるか；
ｔ．システインであるか；
ｕ．直鎖状構造を有するか；あるいは
ｖ．分枝した構造を有するか；
ｗ．構造：
を有するか、
ｘ．
（ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
であるか；
ｙ．
（ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０、又は１～５０であり、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０であり、ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
であるか；
ｚ．
（ここで、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０であり、ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０、又は１～５０である）
であるか；あるいは
ａａ．

（ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
である。

本発明の複数の態様では、Ｒ_ａ及び／又はＲ_ｂは、部分
（ここで、Ｘ_１はＣＨ又はＮであり、Ｘ_２はＣＨ_２又はカルボニル基である）
を含む。

本発明の複数の態様では、非ペプチジル結合は、第１のドメインの第１のＮ末端に連結した第１の二量体化ポリペプチドと、第２のドメインの第１のＮ末端に連結した第２の二量体化ポリペプチドとの間の非共有結合である。

本発明の複数の態様では、第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、
ａ．ロイシンジッパードメイン、
ｂ．コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）、及び
ｃ．コレクトリンドメイン（ＣＤ）
からなる群より選択される。

本発明の複数の態様では、
ａ．第１の二量体化ポリペプチドは第２の二量体化ポリペプチドと同一であり、及び
ｂ．二量体化ポリペプチドはホモ二量体を形成する。

本発明の複数の態様では、
ａ．第１の二量体化ポリペプチドは第２の二量体化ポリペプチドとは異なり、及び
ｂ．第１と第２の二量体化ポリペプチドとはヘテロ二量体を形成する。

本発明のこれらの態様の一部において、第１及び第２の二量体化ポリペプチドが相互に存在するとき、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％未満のホモ二量体を形成する。

本発明の複数の態様では、
ａ．第３及び第４のドメインは、それぞれＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）であり、かつ
ｂ．第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、それぞれＡＣＥ２コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）である。

本発明の複数の態様では、第１及び第２のドメインはＦｃドメインである。

本発明の複数の態様では、
ａ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第３のドメインは第１の種類のＦａｂドメインであるか、
ｂ．第１のドメイン及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第３及び第４のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｃ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２及び第３のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、又は
ｄ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第３及び第４のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択される。

本発明の複数の態様では、
四面体抗体は第５のドメインを更に含み、第５のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ａ．第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端、
ｂ．第１のドメインの第２のＮ末端、又は
ｃ．第３の二量体化ポリペプチドのＮ末端であって、第３の二量体化ポリペプチドが、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第１のドメインの第２のＮ末端と連結しているＮ末端
と連結している。

本発明の複数の態様では、
ａ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第５のドメインは第１の種類のＦａｂドメインであるか、
ｂ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第３及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｃ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第４及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｄ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第３、第４、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｅ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｆ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第３、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｇ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第４、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、又は
ｈ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第３、第４、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、第３の種類のＦａｂドメイン、及び第４の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択される。

本発明の複数の態様では、四面体抗体は第５及び／又は第６のドメインを更に含み、
ａ．第５のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端、
ｉｉ．第１のドメインの第２のＮ末端、又は
ｉｉｉ．第３の二量体化ポリペプチドのＮ末端であって、第３の二量体化ポリペプチドが、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第１のドメインの第２のＮ末端に連結しているＮ末端
に連結しており、
ｂ．第６のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第２の二量体化ポリペプチドのＮ末端、
ｉｉ．第２のドメインの第２のＮ末端、又は
ｉｉｉ．第４の二量体化ポリペプチドのＮ末端であって、第４の二量体化ポリペプチドが、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第２のドメインの第２のＮ末端に連結しているＮ末端
に連結している。

本発明の複数の態様では、
ａ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第５のドメインは第１の種類のＦａｂドメインであるか、
ｂ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第３及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｃ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第４及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｄ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、かつ第３、第４、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｅ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｆ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第３、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、
ｇ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第４、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択されるか、又は
ｈ．第１のドメインはＦｃドメインであり、かつ第２、第３、第４、及び第５のドメインは、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、第３の種類のＦａｂドメイン、及び第４の種類のＦａｂドメインからなる群から独立に選択される。

本発明の複数の態様では、四面体抗体は第７及び／又は第８のドメインを更に含み、
ａ．第７のドメインは、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第１のドメインの第１のＣ末端、又は
ｉｉ．第１のドメインの第２のＣ末端
に連結しており、
ｂ．第８のドメインは、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第２のドメインの第１のＣ末端、又は
ｉｉ．第２のドメインの第２のＣ末端
に連結している。

本発明の複数の態様では、
ａ．第３、第４、第５、及び第６のドメインは、それぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、かつ二量体化ポリペプチドは、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤであるか、
ｂ．第３及び第４のドメインは、それぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、第５及び第６のドメインはそれぞれＦａｂドメインであり、かつ二量体化ポリペプチドは、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤであるか、
ｃ．第３及び第４のドメインは、それぞれＦａｂドメインであり、第５及び第６のドメインは、それぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、かつ二量体化ポリペプチドは、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤであるか、又は
ｄ．第１及び第２のドメインはＦｃドメインであり、第３及び第４のドメインはＡＣＥ２ ＰＤであり、第５及び第６のドメインはＦａｂドメインであり、二量体化ポリペプチドは、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤであり、かつ第１及び第２のドメインは、ペプチドリンカーを介してその各二量体化ポリペプチドとそれぞれ結びついており、
好ましくは、そのようなドメイン及びリンカーは、
ｉ．Ｆｃドメインが、
１．ヘテロ二量体であり、
２．ＩｇＧ１ Ｆｃドメインであり、
３．ＦｃドメインがＦｃγ受容体結合活性を欠くように発現停止変異を含み、好ましくはそのような変異は下記の変異：Ｐ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＰＧＬＡＬＡ）の組合せであり、
４．ＦｃＲｎ活性を増強させる変異を含み、好ましくはそのような変異は四面体抗体の半減期を延長し、好ましくは、前記変異は、下記の変異：Ｌ３０９Ｄ／Ｑ３１１Ｈ／Ｎ４３４Ｓ（ＤＨＳ）の組合せであり、
５．そのプロテインＡ結合部位を切断する変異を含み、好ましくはそのような変異はＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＨＹ／ＲＦ）である、
という特徴のうちの１つ以上又は全てにより特徴付けられ、
ｉｉ．ＡＣＥ２ペプチダーゼドメインが、そのアンジオテンシン変換酵素活性をブロックする変異を含み、好ましくはそのような変異はＨ３７８Ａ変異であり、
ｉｉｉ．Ｆａｂドメインは、マウス可変領域を含むキメラＦａｂドメインであり、
ｉｖ．ペプチドリンカーは、それぞれ、２３アミノ酸長であり、かつＴＮＦ受容体のストーク領域に由来し、好ましくは、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ受容体１Ｂであり、更により好ましくは、ペプチドリンカーは配列番号４４６８で表されるアミノ酸配列から構成され、
ｖ．そのようなドメイン及びペプチドリンカーが３つの異なる種類のポリペプチド鎖により形成され、より好ましくは３つの異なる種類のポリペプチド鎖がＨ１、Ｌ２、及びＨ２で表され、Ｈ１鎖が配列番号５２２で表されるアミノ酸配列を含み、Ｌ２鎖が配列番号４６５で表されるアミノ酸配列を含み、及びＨ２鎖が配列番号５３４で表されるアミノ酸配列を含む
という特徴のうちの１つ以上又は全てにより特徴付けられる。

本発明の複数の態様では、
ａ．第３及び第４のドメインはそれぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、
ｂ．第５のドメインが存在する場合、それはそのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して第３の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、第３の二量体化ポリペプチドは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して第１のドメインの第２のＮ末端に連結しており、
ｃ．第６のドメインが存在する場合、それはそのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して第４の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、第４の二量体化ポリペプチドは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して第２のドメインの第２のＮ末端に連結しており、並びに
ｄ．第１、第２、第３及び第４の二量体化ポリペプチドは、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤである。

本発明の複数の態様では、ＡＣＥ２ ＰＤは、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸１８～６１５又はその一部分を含むか又はそれからなる。

本発明の複数の態様では、ＡＣＥ２ ＣＬＤは、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸６１６～７４０又はその一部分を含むか又はそれからなる。

本発明の複数の態様では、ＡＣＥ２ ＰＤは触媒的に活性である。

本発明の複数の態様では、ＡＣＥ２ ＰＤは触媒的に不活性である。

本発明の複数の態様では、ＡＣＥ２ ＰＤは、Ｒ２７３Ｑ又はＨ３７８Ａ変異を含む。

本発明の複数の態様では、ＦｃドメインはＦｃγ受容体結合活性を欠く。

本発明の複数の態様では、Ｆｃドメインは、Ｐ３２９Ｇ変異、Ｌ２３４Ａ変異、及びＬ２３５Ａ変異（ＰＧＬＡＬＡ）を含む。

本発明の複数の態様では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎ活性及び／又は半減期を強化する変異を含む。本発明の複数の態様では、そのような変異は、下記の変異：
ａ．Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ（ＹＴＥ）、
ｂ．Ｌ３０９Ｄ／Ｑ３１１Ｈ／Ｎ４３４Ｓ（ＤＨＳ）、又は
ｃ．Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ（ＬＳ）
の組合せのいずれかより選択される。

本発明の複数の態様では、Ｆｃドメインは、そのプロテインＡ結合部位を切断する変異を含み、好ましくはそのような変異は、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＨＹ／ＲＦ）である。

本発明の複数の態様では、Ｆａｂドメインは、マウス可変領域を含むキメラＦａｂドメインである。

本発明の複数の態様では、
ａ．第５のドメイン、第３の二量体化ポリペプチド、及び第１のドメインの第２のポリペプチド鎖は、連続したアミノ酸のストレッチであり、
ｂ．第３のドメイン、第１の二量体化ポリペプチド、及び第１のドメインの第１のポリペプチド鎖は、連続したアミノ酸のストレッチであり、
ｃ．第４のドメイン、第２の二量体化ポリペプチド、及び第２のドメインの第１のポリペプチド鎖は、連続したアミノ酸のストレッチであり、並びに
ｄ．第６のドメイン、第４の二量体化ポリペプチド、及び第２のドメインの第２のポリペプチド鎖は、連続したアミノ酸ストレッチであり、
連続したアミノ酸の各ストレッチは、配列番号７４～１１９からなる群から選択されるアミノ酸の配列からなる。

八面体抗体
本発明は、第１、第２、第３、第４、第５、及び第６のドメインを含む八面体抗体であって、
ａ．第１、第２、及び第３のドメインのそれぞれは、Ｆａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、
ｂ．第１、第２、及び第３のドメインのそれぞれは、
ｉ．ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、
ｉｉ．ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖と
を含み、
ｃ．第１のドメインの第１のＮ末端、第２のドメインの第１のＮ末端、及び第３のドメインの第１のＮ末端は、非ペプチジル結合により相互に接続しており、非ペプチジル結合は、
ｉ．分枝した共有結合であるか、又は
ｉｉ．
１．ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の三量体化ポリペプチド、
２．ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第２のドメインの第１のＮ末端に連結している第２の三量体化ポリペプチド、及び
３．ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第３のドメインの第１のＮ末端に連結している第３の三量体化ポリペプチド
の間の非共有結合であり、第１、第２、及び第３の三量体化ポリペプチドは免疫グロブリンのポリペプチドではなく、
ｄ．第４のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第１のドメインの第２のＮ末端、又は
ｉｉ．第１の三量体化ポリペプチドのＮ末端
に連結しており、
ｅ．第５のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第２のドメインの第２のＮ末端、又は
ｉｉ．第２の三量体化ポリペプチドのＮ末端
に連結しており、並びに
ｆ．第６のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第３のドメインの第２のＮ末端、又は
ｉｉ．第３の三量体化ポリペプチドのＮ末端
に連結している、
八面体抗体も提供する。

本発明の八面体抗体の複数の態様では、非ペプチジル結合は、第１のドメインの第１のＮ末端に連結した第１の三量体化ポリペプチド、第２のドメインの第１のＮ末端に連結した第２の三量体化ポリペプチド、及び第３のドメインの第１のＮ末端に連結した第３の三量体化ポリペプチドの間の非共有結合であり、第１、第２、及び第３の三量体化ポリペプチドは、ＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバーであるＯＸ４０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ４、ＣＤ４０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ５、ＦＡＳＬ／ＴＮＦＬＳＦ６、ＣＤ７０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ７、ＣＤ３０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ８、４－１ＢＢＬ／ＴＮＦＬＳＦ９、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＬＳＦ１０、ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦＬＳＦ１１、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＬＳＦ１２、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＬＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＬＳＦ１３Ｂ、ＬＩＧＴ／ＴＮＦＬＳＦ１４、ＶＥＧＩ／ＴＮＦＬＳＦ１５、ＧＩＴＲＬ／ＴＮＦＬＳＦ１８、エクトジスプラシンＡＴＮＦＬＳＦ１９、ＴＮＦ／ＴＮＦＬＳＦ２、リンホトキシンα／ＴＮＦＬＳＦ１、及びリンホトキシンβ／ＴＮＦＬＳＦ３からなる群より選択される。

本発明の複数の態様では、八面体抗体は第７、第８、及び／又は第９のドメインを更に含み、
ａ．第７のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第１のドメインの第２のＮ末端に連結しており、
ｂ．第８のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第２のドメインの第２のＮ末端に連結しており、及び／又は
ｃ．第９のドメインは、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して第３のドメインの第２のＮ末端に連結している。

本発明の複数の態様では、八面体抗体は第１０、第１１、及び／又は第１２のドメインを更に含み、
ａ．第１０のドメインは、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第１のドメインの第１のＣ末端、又は
ｉｉ．第１のドメインの第２のＣ末端
に連結しており、
ｂ．第１１のドメインは、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第２のドメインの第１のＣ末端、又は
ｉｉ．第２のドメインの第２のＣ末端
に連結しており、
ｃ．第１２のドメインは、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
ｉ．第３のドメインの第１のＣ末端、又は
ｉｉ．第３のドメインの第２のＣ末端
に連結している。

複数の態様では、本発明の八面体抗体の第１、第２、及び第３のドメインは、本発明の四面体抗体の第１及び第２のドメインとしてここに記載されるドメインのいずれであってもよい。複数の態様では、本発明の八面体抗体の第４、第５、及び第６のドメインは、本発明の四面体抗体の第３及び第４のドメインとしてここに記載されるドメインのいずれであってもよい。複数の態様では、本発明の八面体抗体の第７、第８、及び第９のドメインは、本発明の四面体抗体の第５及び第６のドメインとしてここに記載されるドメインのいずれであってもよい。複数の態様では、本発明の八面体抗体の第１０、第１１、及び第１２のドメインは、本発明の四面体抗体の第７及び第８のドメインとしてここに記載されるドメインのいずれであってもよい。さらに、全てのそのようなドメインは、本発明の四面体抗体のドメインに関して記載されている特徴（例えば、変異等）のいずれを含んでもよい。

四面体及び八面体抗体
本発明の複数の態様では、
ａ．四面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び第８のドメインのうちの１つ以上、又は八面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２のドメインのうちの１つ以上はＦｃドメインであり、１つ以上のＦｃドメインは、ここに開示されるＦｃドメインのいずれかから独立に選択され、
ｂ．四面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、及び第８のドメインのうちの１つ以上、又は八面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２のドメインのうちの１つ以上はＦａｂドメインであり、１つ以上のＦａｂドメインは、ここに開示されるＦａｂドメインのいずれかから独立に選択され、
ｃ．四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７、及び第８のドメインのうちの１つ以上、又は八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２のドメインのうちの１つ以上は分泌タンパク質であり、１つ以上の分泌タンパク質は、ここに開示される分泌タンパク質のいずれかから独立に選択され、
ｄ．四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７、及び第８のドメインのうちの１つ以上、又は八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２のドメインのうちの１つ以上は、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインであり、１つ以上の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、ここに開示される膜貫通タンパク質の細胞外ドメインのいずれかから独立に選択され、
ｅ）四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７、及び第８のドメインのうちの１つ以上、又は八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２のドメインのうちの１つ以上は、
ｉ．疾患に罹患した対象を治療するために承認された薬物である化合物の構造を含み；
ｉｉ．１０００ダルトン未満の分子量を有する有機化合物、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、オリゴヌクレオチド、又は生物学的に活性なタンパク質の構造を含み；
ｉｉｉ．一級又は二級アミンを含み；
ｉｖ．アリピプラゾール又はオセルタミビルであり；
ｖ．呼吸器系薬物、抗喘息薬、鎮痛剤、抗うつ薬、抗狭心症薬、抗不整脈剤、抗高血圧剤、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、抗感染症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、解熱薬、抗潰瘍薬、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）薬、中枢神経系刺激剤、うつ血除去薬、又は精神刺激薬であり；
ｖｉ）アルプレノロール、アセブトロール、アミデフリン、アミネプチン、アモスラロール、アモキサピン、アンフェタミニル、アテノロール、アトモキセチン、バロフロキサシン、バメタン、ベフノロール、ベナゼプリル、ベンフルオレックス、ベンゾクタミン、ベタヒスチン、ベタキソロール、ベバントロール、ビフェメラン、ビソプロロール、ブリンゾラミド、ブフェニオド（bufeniode）、ブテタミン、カミロフィン、カラゾロール、カルチカイン、カルベジロール、セファエリン、シプロフロキサシン、クロザピン、クロベンゾレックス、クロルプレナリン、シクロペンタミン、デラプリル、デメキシプチリン、デノパミン、デシプラミン、デスロラタジン、ジクロフェナク、ジメトフリン、ジオキサドロール、ドブタミン、ドペキサミン、ドリペネム、ドルゾラミド、ドロプレニラミン、デュロキセチン、エルトプラジン、エナラプリル、エノキサシン、エピネフリン、エルタペネム、エサプラゾール、エスモロール、エトキサドロール、ファスジル、フェンジリン、フェネチリン、フェンフルラミン、フェノルドパム、フェノテロール、フェンプロポレクス、フレカミド（flecamide）、フルオキセチン、フォルモテロール、フロバトリプタン、ガボキサドール、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、ヘキソプレナリン、イミダプリル、インダルピン、インデカイニド、塩酸インデロキサジン、イソクスプリン、イスプロニクリン、ラベタロール、ランジオロール、ラパチニブ、レボファセトペラン、リシノプリル、ロメフロキサシン、ロトラフィバン、マプロチリン、メカミラミン、メフロキン、メピンドロール、メロペネム、メタプラミン、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、右旋性メチルフェニデート、メチルフェニデート、メチプラノロール、メトプロロール、ミトキサントロン、ミバゼロール、モエキシプリル、モプロロール、モキシフロキサシン、ネビボロール、ニフェナロール、ニプラジロール、ノルフロキサシン、ノルトリプチリン、ニリドリン、オランザピン、オキサムニキン、オクスプレノロール、オキシフェドリン、パロキセチン、ペルヘキシリン、フェンメトラジン、フェニレフリン、フェニルプロピルメチラミン、フォレドリン、ピシロレックス、ピメチリン、ピンドロール、ピペミド酸、ピリドカイン、プラクトロール、プラドフロキサシン、プラミペキソール、プラミベリン、プレナルテロール、プレニラミン、プリロカルン（prilocalne）、プロカテロール、プロネタロール、プロパフェノン、プロプラノロール、プロピルヘキセドリン、プロトキロール、プロトリプチリン、シュードエフェドリン、レボキセチン、ラサギリン、(r)-ラサギリン、レピノタン、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、サフィナミド、サルブタモール/アルブテロール、サルメテロール、サリゾタン、セルトラリン、シロドシン、ソタロール、ソテレノール、スパルフロキサシン、スピラプリル、スルフィナロール、シネフリン、タムスロシン、テバニクリン、チアネプチン、チロフィバン、トレトキノール、トリメタジジン、トロキシピド、バレニクリン、ビルダグリプチン、ビロキサジン、ビキジル（viquidil）、又はキサモテロールであり；
ｖｉｉ．生物学的に活性なタンパク質を含み；
ｖｉｉｉ．標的結合活性を有するように生物学的に活性であり；
ｉｘ．独立的にフォールディングするタンパク質又はその一部分であり；
ｘ．グリコシル化タンパク質であり；
ｘｉ．鎖内ジスルフィド結合を含み；
ｘｉｉ．サイトカインに結合し；
ｘｉｉｉ．ＴＮＦαであるサイトカインと結合し；
ｘｉｖ．心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、エンドセリン、エキセナチド、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２のアナログ、グルカゴン血管作用性小腸ペプチド（ＧＶＩＰ）、グレリン、ペプチドＹＹ若しくはセクレチン、又はその一部分を含み；
ｘｖ．配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号４６５７）内の連続したアミノ酸のストレッチを含み；
ｘｖｉ．抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖中に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含み；
ｘｖｉｉ．抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖中に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含み；
ｘｖｉｉｉ．抗体の少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’、又は少なくとも１つＦａｂ若しくはＦａｂ’の一部分を含み；
ｘｉｘ．抗体のＦａｂ－１若しくはＦａｂ’１、又はその一部分を含み；
ｘｘ．抗体のＦａｂ－２若しくはＦａｂ’２、又はその一部分を含み；
ｘｘｉ．抗体の２つのＦａｂ又はＦａｂ’ の腕部を含み；
ｘｘｉｉ．単鎖抗体中に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含み；あるいは
ｘｘｉｉｉ．ＴＮＦα受容体中に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含み、
ｆ．四面体又は八面体抗体は共有結合を含み、共有結合は、ここに開示される任意の共有結合から選択され、又はここに開示される任意のヘテロ二官能性架橋剤を含み；並びに／あるいは
ｇ．四面体又は八面体抗体は１つ以上のペプチドリンカーを含み、１つ以上のペプチドリンカーは、
ｉ．配列ＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号３２２７）であるか若しくはその中に存在する連続したアミノ酸のストレッチ；
ｉｉ．配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号２２６）であるか若しくはその中に存在する連続したアミノ酸のストレッチ、又は
ｉｉｉ．ここに開示される任意のペプチドリンカー
から独立に選択される。

図１～１４及び２９Ａ～４２は、本発明の四面体及び八面体抗体の種々の限定されない例を概略的に記載する。これらの四面体及び八面体抗体の種々の種類のドメイン（種々の色及び／又はパターンの楕円又は楕円の群によって表されるような）の説明が図面の簡単な説明に提供されている。各図は、本発明の態様を表す。

本発明はまた、組成物内のペプチド含有分子の割合（w/w）として、本発明の四面体又は八面体抗体の少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％又は少なくとも９９％を含む組成物を提供する。

ドメイン
四面体及び八面体抗体のドメインは、各ドメインの説明及び同定を容易にするためにここで番号付けされている。第１のドメインは、ここで「Ｄ１」又は「ドメイン１」と呼ばれる場合がある。同一原理が、本発明の全ての他のドメインに適用される（すなわち、第２のドメインは、ここで「Ｄ２」又は「ドメイン２」と呼ばれる場合があるなど）。さらに、特に明記しない限り、本発明の四面体抗体は、他のドメインの番号付けに影響を及ぼすことなく１つ以上のドメインを欠いている場合がある。例えば、本発明の四面体抗体は、ドメイン５を含むことなくドメイン１、２、３、４及び６を含んでもよい。別の例として、本発明の四面体抗体は、ドメイン５及び６を含むことなくドメイン１、２、３、４、７及び８を含んでもよい（例えば、図４２を参照されたい）。

原則として、本発明の四面体抗体の第１及び第２のドメインは互換性であり、すなわち、第１のドメインに適用されるように記載される特徴は、一部の態様において第２のドメインに等しく適用され得る。同様に、本発明の四面体抗体の第３及び第４のドメインは互換性であり、本発明の第５及び第６のドメインは互換性であり、第７及び第８のドメインは互換性である。

同様に、本発明の八面体抗体に関して、本発明の第１、第２、及び第３のドメインは互換性であり、第４、第５、及び第６のドメインは互換性であり、第７、第８、及び第９のドメインは互換性であり、第１０、第１１、及び第１２のドメインは互換性である。上記で論じられるように、この文脈では、互換性は、ドメインの１つに適用されるとしてここで記載される任意の特徴が、他のドメインのいずれかに適用され得ることを意味する。

同じように、当業者ならば、本発明の四面体抗体のドメイン１及び２並びに本発明の八面体抗体のドメイン１、２及び３は、同様の構造的目的を果たし、したがって、本発明の四面体抗体のドメイン１及び２に適用される任意の記載が、本発明の八面体抗体のドメイン１、２及び３に適用され得る限り同等であるということは理解するであろう。同様の同等性が、本発明の四面体抗体のドメイン３及び４並びに本発明の八面体抗体のドメイン４、５及び６の間に適用される。さらに、同様の同等性が、本発明の四面体抗体のドメイン５及び６並びに本発明の八面体抗体のドメイン７、８及び９の間に適用される。さらに、同様の同等性が、本発明の四面体抗体のドメイン７及び８並びに本発明の八面体抗体のドメイン１０、１１及び１２の間に適用される。

鎖
本発明の種々の態様は、「重鎖」及び「軽鎖」で構成されているドメインを含む。本発明の重鎖は、ここで「Ｈ鎖」又は「Ｈ１」、「Ｈ２」、「Ｈ３」などと呼ばれる場合がある。同様に、本発明の軽鎖は、ここで「Ｌ鎖」又は「Ｌ１」、「Ｌ２」、「Ｌ３」などと呼ばれる場合がある。

本発明の四面体抗体の態様は、第１の重鎖（「Ｈ１」）及び第２の重鎖（「Ｈ２」）を含む。Ｈ１及びＨ２鎖は、互いと対合してドメイン１及び２を形成してもよい。Ｈ１はまた、軽鎖と対合してドメイン３及び４を形成してもよく、Ｈ２はまた、軽鎖と対合してドメイン５及び６を形成してもよい。Ｈ１及びＨ２鎖はまた、ホモ二量体化してもよい。このような場合には、Ｈ１鎖上の二量体化ポリペプチドが、Ｈ２鎖上の二量体化ポリペプチドとヘテロ二量体化する。Ｈ１又はＨ２鎖はまた、ここで記載されるようなさらなるドメイン７及び８を含んでもよい。Ｈ１及び／又はＨ２鎖は、ドメイン１と３の間及び／又はドメイン２と４の間に二量体化ポリペプチドを含んでもよい。本発明の四面体抗体の各々では、Ｈ１及びＨ２鎖は、１つ以上のペプチドリンカーを含んでもよい。Ｈ１及び／又はＨ２鎖が二量体化ポリペプチドを含む場合には、ペプチドリンカーは、ドメイン１若しくは２のいずれかと二量体化ポリペプチドの間、二量体化ポリペプチドとドメイン３若しくは４の間又は両者に存在してもよい。ペプチドリンカーはまた、ドメイン１若しくは２と二量体化ポリペプチドの間、二量体化ポリペプチドとドメイン５若しくは６の間又は両者に存在してもよい。

同様の原則が本発明の八面体抗体に適用される。Ｈ１及びＨ２鎖は、互いと対合して、ドメイン１、２及び３を形成する。Ｈ１はまた、軽鎖と対合してドメイン４、５及び６を形成してもよく、一方で、Ｈ２は、軽鎖と対合してドメイン７、８及び９を形成してもよい。Ｈ１又はＨ２鎖はまた、ここで記載されるようなさらなるドメイン１０、１１及び１２を含んでもよい。

本発明の種々の態様は、Ｆｃ融合タンパク質を含む。このような態様では、「Ｆｃ融合鎖」の一部は、「Ｆｃ鎖」と対合してＦｃドメインを形成してもよい。本発明のＦｃドメインは通常、本発明の四面体抗体のドメイン１及び／又は２並びに本発明の八面体抗体のドメイン１、２及び／又は３である。「Ｆｃ融合鎖」はまた通常、本発明の四面体抗体のドメイン３、４、５及び／又は６並びに本発明の八面体抗体のドメイン４、５、６、７、８、９、１０、１１及び／又は１２を形成する部分を含む。

本発明の四面体抗体では、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン１及び２の一部を形成する部分と、ドメイン３及び４を形成する部分の間に二量体化ポリペプチドを含んでもよい。代替態様では、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン１及び２の「Ｆｃ鎖」が各々、そのそれぞれのＮ末端に二量体化ポリペプチドを含むので、二量体化ポリペプチドを欠く場合もある。この態様の代替では、ドメイン１及び２の「Ｆｃ鎖」は、共有結合によってそのそれぞれのＮ末端で連結される。

本発明は、（１）「Ｆｃ融合鎖」が、ドメイン１及び２の一部を形成する部分と、ドメイン３及び４を形成する部分の間に二量体化ポリペプチドを含む、並びに（２）ドメイン３及び４が、ＡＣＥ２ペプチダーゼドメインではない四面体及び八面体抗体を特に企図する。

本発明の八面体抗体では、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン１、２及び３の一部を形成する部分と、ドメイン４、５及び６を形成する部分の間に三量体化ポリペプチドを含んでもよい。

本発明の四面体抗体の各々では、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン１の一部を形成する部分と、ドメイン３又は５を形成する部分の間に１つ以上のペプチドリンカーを含んでもよい。「Ｆｃ融合鎖」が二量体化ポリペプチドを含む場合には、ペプチドリンカーは、ドメイン１と二量体化ポリペプチドの間、二量体化ポリペプチドとドメイン３若しくは５の間のいずれか、又は両者に存在してもよい。同様に、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン２の一部を形成する部分と、ドメイン４又は６を形成する部分の間にペプチドリンカーを含んでもよい。「Ｆｃ融合鎖」が二量体化ポリペプチドを含む場合には、ペプチドリンカーは、ドメイン２と二量体化ポリペプチドの間、二量体化ポリペプチドとドメイン４若しくは６の間のいずれか、又は両者に存在してもよい。

本発明の八面体抗体の各々では、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン１の一部を形成する部分と、ドメイン４又は７を形成する部分の間、ドメイン２の一部を形成する部分と、ドメイン５又は８を形成する部分の間及びドメイン３の一部を形成する部分と、ドメイン６又は９を形成する部分の間にペプチドリンカーを含んでもよい。このような場合の各々において、「Ｆｃ融合鎖」が三量体化ポリペプチドを含む場合には、「Ｆｃ融合鎖」は、ドメイン１、２及び３の一部を形成する部分と三量体化ポリペプチドの間、三量体化ポリペプチドとドメイン４、５及び６を形成する部分の間のいずれか、又は両者にペプチドリンカーを含んでもよい。

用語
ここで使用される場合、別段の記載がない限り、以下の各用語は以下に示す定義を有するものとする。

ペプチジル結合：構造

ペプチジル結合は、ペプチド結合であってもよい。

連続アミノ酸のストレッチ：各々ペプチド結合によって先行するアミノ酸に繋げられた、鎖中に配置された複数のアミノ酸、ただし、鎖中の第１のアミノ酸は、任意に先行するアミノ酸に繋げられていなくてもよい。鎖のアミノ酸は、天然に存在してもよく、天然に存在しなくてもよく、又はその混合物を含んでもよい。アミノ酸は、特に断りのない限り、遺伝的にコードされてもよく、天然に存在するが、遺伝的にコードされなくてもよく、又は天然に存在しなくてもよく、それらの任意の選択であってもよい。

Ｎ末端アミノ酸残基：遊離α－アミノ（ＮＨ_２）官能基又はα－アミノ（ＮＨ_２）官能基の誘導体を有する２個以上の連続アミノ酸のストレッチの末端残基。

Ｎ末端：Ｎ末端アミノ酸残基の遊離α－アミノ（ＮＨ_２）基（又はその誘導体）。

Ｃ末端アミノ酸残基：遊離α－カルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基又はα－カルボキシル（ＣＯＯＨ）官能基の誘導体を有する２個以上の連続アミノ酸のストレッチの末端残基。

Ｃ末端：Ｃ末端アミノ酸残基の遊離α－カルボキシル（ＣＯＯＨ）基（又はその誘導体）。

「生物学的に活性な構造」とは、ここで使用される場合、生物学的状況において（例えば、生物、細胞又はそのin vitroモデルにおいて）、機能若しくは作用を果たすことによって、又は機能、作用若しくは反応を刺激若しくは応答することによって、疾患又は状態を治療可能である、又は本発明の化合物を身体中の疾患若しくは状態の部位に局在化若しくは標的化可能である、分子又はその断片の構造を意味する。生物学的に活性な構造は、ポリペプチド、核酸、小分子、例えば、小さい有機若しくは無機分子のうち少なくとも１つの構造を含んでもよい。

「結合」とは、特に断りのない限り、又は文脈に反しない限り、共有結合、双極子－双極子相互作用、例えば、水素結合及び分子間相互作用、例えば、ファンデルワールス力を含むと理解される。

「シグナル配列」は、ポリペプチドの翻訳後輸送を指示する短い（３～６０個のアミノ酸長）ペプチド鎖である。

「アミノ酸」とは、ここで使用される場合、一態様では、遺伝的にコードされるアミノ酸、すなわち、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジンのＬ又はＤ異性体を意味し、またホモシステイン及びホモセレノシステインも含む。

アミノ酸の他の例には、タウリン、ギャバ、ドーパミン、ランチオニン、２－アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、オルニチン及びシトルリンのＬ又はＤ異性体並びに最大２個の炭素原子によって短縮又は延長されたアルキレン鎖を有するアミノ酸、任意に置換されていてもよいアリール基を含むアミノ酸並びにハロゲン化アルキル及びアリール基を含むハロゲン化基を含むアミノ酸並びにβ又はγアミノ酸及び環状類似体を含む非天然相同体及びその合成的に改変された形態が含まれる。

イオン化できるアミノ及びカルボキシル基の存在のために、これらの態様では、アミノ酸は、酸性若しくは塩基性塩の形態であってもよく、又は中性形態であってもよい。個々のアミノ酸残基はまた、酸化又は還元によって改変されてもよい。他の企図される改変として、プロリン及びリシンの水酸化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化並びにリシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化が挙げられる。

特定の官能基をアミノ酸側鎖に又はＮ若しくはＣ末端に連結することによって、共有結合誘導体を製造してもよい。

Ｒ基置換を有するアミノ酸を含む化合物は、本発明の範囲内である。本発明の化合物上の置換基及び置換パターンは、容易に入手可能な出発材料から化学的に安定な化合物を提供するように当業者によって選択できるということは理解される。

「天然アミノ酸」とは、ここで使用される場合、遺伝的にコードされるアミノ酸、すなわち、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジン並びにホモシステイン及びホモセレノシステインのＬ又はＤ異性体を意味する。

「非天然アミノ酸」とは、ここで使用される場合、α炭素とＳ又はＳｅの間にＣ３～Ｃ１０脂肪族側鎖を有するシステイン及びセレノシステイン誘導体を含む、イソロイシン、アラニン、ロイシン、アスパラギン、リシン、アスパラギン酸、メチオニン、システイン、フェニルアラニン、グルタミン酸、トレオニン、グルタミン、トリプトファン、グリシン、バリン、プロリン、アルギニン、セリン、ヒスチジン、チロシン、セレノシステイン、ピロリジン、ホモシステイン、ホモセレノシステイン、タウリン、ギャバ、ドーパミン、ランチオニン、２－アミノイソ酪酸、デヒドロアラニン、オルニチン又はシトルリンの化学的に改変されたＬ又はＤ異性体を意味する。一態様では、脂肪族側鎖はアルキレンである。別の態様では、脂肪族側鎖は、アルケニレン又はアルキニレンである。

ここで記載された連続アミノ酸配列のストレッチに加えて、そのバリアントを適切なヌクレオチド変化をコードするＤＮＡ中に導入することによって、及び／又は所望の連続アミノ酸配列の合成によって製造できることが企図される。当業者ならば、発現が、選択された合成方法（例えば、化学的合成ではなく）、例えばグリコシル化部位の数若しくは位置を変化させること又は膜固定特徴を変更することである場合には、アミノ酸変化が、ここで記載された連続アミノ酸のストレッチの翻訳後プロセスを変更する場合があることを理解するであろう。

例えば、米国特許第5,364,934号に示された保存的及び非保存的変異の技術及びガイドラインのいずれかを使用して、ここで記載される配列において変形形態を作製できる。変形形態は、天然配列と比較してアミノ酸配列の変化をもたらす、目的の連続アミノ酸配列をコードする１つ以上のコドンの置換、欠失又は挿入であってもよい。任意に、変形形態は、ドメインのうち１つ以上における少なくとも１個のアミノ酸の、任意の他のアミノ酸との置換による。所望の活性に悪影響を及ぼすことなくどのアミノ酸残基が挿入、置換又は欠失されてもよいかを決定する指針は、配列を相同の既知タンパク質のものと比較すること、及び高相同性の領域において行われたアミノ酸配列変化の数を最小化することによって見いだすことができる。アミノ酸置換は、あるアミノ酸を、同様の構造的及び／又は化学的特性を有する別のアミノ酸と置き換えること、例えば、ロイシンのセリンとの置き換え、すなわち、保存的アミノ酸置き換えの結果であり得る。挿入又は欠失は、任意に約１～５個のアミノ酸にあってもよい。許容される変形形態は、配列中のアミノ酸の挿入、欠失又は置換を体系的に行うこと及び全長又は成熟した天然配列によって示される活性について得られたバリアントを試験することによって決定してもよい。任意の末端変形形態は、ここで開示される本発明の文脈内で行われるということは理解される。

結合パートナーのアミノ酸配列バリアントは、そのリガンドに対する結合パートナーの親和性を増大すること、結合パートナーの安定性、精製及び製造を容易にすること、その血漿半減期を改変すること、治療的有効性を改善すること及び結合パートナーの治療的使用の際の副作用の重症度又は出現を減少させることを含む種々の目的を念頭に製造される。

挿入、置換又は欠失バリアントを含むこれらの配列のアミノ酸配列バリアントもまた、ここで企図される。このようなバリアントは、通常、バリアントをコードするＤＮＡが得られる標的結合単量体をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの部位特異的変異誘発及びその後、組換え細胞培養においてＤＮＡを発現させることによって製造できる。最大約１００～１５０個のアミノ酸残基を有する断片はまた、in vitro合成によって好都合に製造できる。このようなアミノ酸配列バリアントは、予め決定されたバリアントであり、天然には見いだされない。バリアントは、非バリアント形態の定性的生物活性（標的結合を含む）を示すが、必ずしも同一の定量的値ではない。アミノ酸配列変形形態を導入するための部位は、予め決定されているが、変異自体は、予め決定されている必要はない。例えば、所与の部位での変異の性能を最適化するために、ランダム又は飽和変異誘発（２０のあり得る残基全てが挿入される）が標的コドンで実施され、発現されたバリアントが所望の活性の最適組合せについてスクリーニングされる。このようなスクリーニングは、当技術分野における通常の技術の範囲内である。

アミノ酸挿入は普通、約１～１０個ほどのアミノ酸残基となり；置換は通常、単一残基のために導入され；欠失は、約１～３０個の残基となる。欠失又は挿入は、好ましくは、隣接する対で行われる、すなわち、２個の残基の欠失又は２個の残基の挿入。置換、欠失、挿入又はそれらの任意の組合せが導入又は組み合わされて、最終構築物に到達することは、以下の議論から十分に明らかとなろう。

ここで使用される場合、「改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／若しくは欠失又はタンパク質に化学的に連結された部分への変更を意味する。例えば、改変は、タンパク質に付着された変更された炭水化物又はＰＥＧ構造であってもよい。ここで使用される場合、「アミノ酸改変」とは、ポリペプチド配列におけるアミノ酸置換、挿入及び／又は欠失を意味する。明確にするために、別に記載されない限り、アミノ酸改変は、常に、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸、例えば、ＤＮＡ及びＲＮＡにおいてコドンを有する２０種のアミノ酸に対してである。

ここで使用される場合、「アミノ酸置換」又は「置換」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置のアミノ酸の異なるアミノ酸との置き換えを意味する。特に、一部の態様では、置換は、生物内又は任意の生物中に天然に存在しない、特定の位置に天然に存在しないアミノ酸へである。例えば、置換Ｅ２７２Ｙとは、バリアントポリペプチド、この場合には、２７２位のグルタミン酸が、チロシンと置き換えられているＦｃバリアントを指す。明確にするために、核酸コード配列を変化させるが、出発アミノ酸を変化させない（例えば、ＣＧＧ（アルギニンをコードする）をＣＧＡ（依然として、アルギニンをコードする）に交換して、宿主生物発現レベルを増大する）ように操作されているタンパク質は、「アミノ酸置換」ではない、すなわち、同一タンパク質をコードする新規遺伝子の作出にもかかわらず、タンパク質が、出発する特定の位置に同一アミノ酸を有する場合には、アミノ酸置換ではない。

ここで使用される場合、「アミノ酸挿入」又は「挿入」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸配列の付加を意味する。例えば、－２３３Ｅ又は２３３Ｅは、２３３位の後ろ及び２３４位の前のグルタミン酸の挿入を示す。さらに、－２３３ＡＤＥ又はＡ２３３ＡＤＥは、２３３位の後ろ及び２３４位の前のＡｌａＡｓｐＧｌｕの挿入を示す。

ここで使用される場合、「アミノ酸欠失」又は「欠失」とは、親ポリペプチド配列中の特定の位置でのアミノ酸配列の除去を意味する。例えば、Ｅ２３３－又はＥ２３３＃又はＥ２３３（ ）は、２３３位でのグルタミン酸の欠失を示す。さらに、ＥＤＡ２３３－又はＥＤＡ２３３＃は、２３３位で始まる配列ＧｌｕＡｓｐＡｌａの欠失を示す。

「バリアントタンパク質」又は「タンパク質バリアント」又は「バリアント」という用語は、ここで使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸改変によって親タンパク質のものとは異なっているタンパク質を意味する。タンパク質バリアントは、タンパク質自体、タンパク質を含む組成物又はそれをコードするアミノ配列を指す場合がある。好ましくは、タンパク質バリアントは、親タンパク質と比較して少なくとも１つのアミノ酸改変、例えば、親と比較して、約１～約７０のアミノ酸改変、好ましくは、約１～約５のアミノ酸改変を有する。以下に記載されるように、一部の態様では、親ポリペプチド、例えば、Ｆｃ親ポリペプチドは、ヒト野生型配列、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４由来のＦｃ領域であるが、バリアントを有するヒト配列も、「親ポリペプチド」として働き得る、例えば、図１３のＩｇＧ１／２ハイブリッド。タンパク質バリアント配列はここで、好ましくは、親タンパク質配列と少なくとも約８０％の同一性を、最も好ましくは、少なくとも約９０％の同一性を、より好ましくは、少なくとも約９５～９８～９９％の同一性を有するであろう。バリアントタンパク質とは、バリアントタンパク質自体、タンパク質バリアントを含む組成物又はそれをコードするＤＮＡ配列を指す場合がある。したがって、「抗体バリアント」又は「バリアント抗体」という用語は、ここで使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸改変によって親抗体から異なっている抗体を意味し、「ＩｇＧバリアント」又は「バリアントＩｇＧ」とは、ここで使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸改変によって親ＩｇＧから（やはり、多くの場合、ヒトＩｇＧ配列から）異なっている抗体を意味し、「免疫グロブリンバリアント」又は「バリアント免疫グロブリン」とは、ここで使用される場合、少なくとも１つのアミノ酸改変によって親免疫グロブリン配列のものから異なっている免疫グロブリン配列を意味する。「Ｆｃバリアント」又は「バリアントＦｃ」とは、ここで使用される場合、Ｆｃドメイン中にアミノ酸改変を含むタンパク質を意味する。本発明のＦｃバリアントは、それを構成するアミノ酸改変に従って定義される。したがって、例えば、Ｎ４３４Ｓ又は４３４Ｓとは、親Ｆｃポリペプチドと比較して４３４位に置換セリンを有するＦｃバリアントであり、番号付けは、ＥＵインデックスに従う。同様に、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓは、親Ｆｃポリペプチドと比較して置換Ｍ４２８Ｌ及びＮ４３４Ｓを有するＦｃバリアントを定義する。ＷＴアミノ酸の同一性は、特定されない場合もあり、その場合、前記のバリアントは、４２８Ｌ／４３４Ｓと呼ばれる。置換が提供される順序は任意である、すなわち、例えば、４２８Ｌ／４３４Ｓは、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓなどと同一のＦｃバリアントであることは留意されたい。抗体に関する本発明において論じられる全ての位置について、別に記載されない限り、アミノ酸位置番号付けは、ＥＵインデックスに従う。ＥＵインデックス又はＫａｂａｔにおけるようなＥＵインデックス又はＥＵ番号付けスキームとは、ＥＵ抗体の番号付けを指す（Edelman et al., 1969, Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85、参照によりこの明細書に完全に組み込まれる）。改変は、付加、欠失又は置換であり得る。置換は、天然に存在するアミノ酸、一部の場合には、合成アミノ酸を含み得る。その例は、米国特許第6,586,207号；国際公開第98/48032号；国際公開第03/073238号；米国特許出願公開第2004/0214988号；国際公開第05/35727号；国際公開第05/74524号；J. W. Chin et al., (2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027；J. W. Chin, & P. G. Schultz, (2002), ChemBioChem 11:1135-1137；J. W. Chin, et al., (2002), PICAS United States of America 99:11020-11024及びL. Wang, & P. G. Schultz, (2002), Chem. 1-10（全て参照により完全に組み込まれる）を含む。

ここで使用される場合、「タンパク質」とは、少なくとも２個の共有結合によって付着したアミノ酸を意味し、タンパク質、ポリペプチド、オリゴペプチド及びペプチドを含む。「タンパク質」及び「連続アミノ酸のストレッチ」という用語は、ここで同義的に使用される。ペプチジル基は、天然に存在するアミノ酸及びペプチド結合又は合成ペプチドミメティック構造、すなわち、「類似体」、例えば、ペプトイドを含んでもよい（Simon et al., PNAS USA 89(20):9367 (1992)（参照により完全に組み込まれる）参照）。アミノ酸は、当業者によって理解されるように、天然に存在する又は合成（例えば、ＤＮＡによってコードされるアミノ酸ではない）のいずれであってもよい。例えば、ホモ－フェニルアラニン、シトルリン、オルニチン及びノルロイシンは、本発明の目的のために考えられる合成アミノ酸であり、Ｄ－及びＬ－（Ｒ又はＳ）構成アミノ酸の両者を利用してもよい。本発明のバリアントは、例えば、それだけには限らないが、Cropp & Shultz, 2004, Trends Genet. 20(12):625-30、Anderson et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA 101 (2):7566-71、Zhang et al., 2003, 303(5656):371-3及びChin et al., 2003, Science 301(5635):964-7（全て参照により完全に組み込まれる）に記載の方法を含む、Schultzらによって開発された技術を使用して組み込まれた合成アミノ酸の使用を含む改変を含んでもよい。さらに、ポリペプチドは、１つ以上の側鎖又は末端の合成誘導体化、グリコシル化、ペグ化、円順列、環化、他の分子へのリンカー、タンパク質又はタンパク質ドメインへの融合及びペプチドタグ又は標識の付加を含んでもよい。

「残基」という用語は、ここで使用される場合、タンパク質中の位置及びその関連するアミノ酸同一性を意味する。例えば、アスパラギン２９７（Ａｓｎ２９７又はＮ２９７とも呼ばれる）は、ヒト抗体ＩｇＧ１中の２９７位の残基である。

ここで使用される場合、「Ｆａｂ」又は「Ｆａｂ領域」とは、ＶＨ、ＣＨ１、ＶＬ及びＣＬ免疫グロブリンドメインを含むポリペプチドを意味する。Ｆａｂは、単離されたこの領域又は全長抗体、抗体断片又はＦａｂ融合タンパク質の状況でのこの領域を指す場合がある。「Ｆｖ」又は「Ｆｖ断片」又は「Ｆｖ領域」とは、ここで使用される場合、単一抗体のＶＬ及びＶＨドメインを含むポリペプチドを意味する。

「ＩｇＧサブクラス改変」又は「アイソタイプ改変」とは、ここで使用される場合、ＩｇＧアイソタイプのあるアミノ酸を、異なるアラインされたＩｇＧアイソタイプ中の対応するアミノ酸に変換するアミノ酸改変を意味する。例えば、ＥＵ２９６位にＩｇＧ１はチロシンを、ＩｇＧ２はフェニルアラニンを含むので、ＩｇＧ２におけるＦ２９６Ｙ置換は、ＩｇＧサブクラス改変と考えられる。

「天然に存在しない改変」という用語は、アイソタイプではないアミノ酸改変を意味する。例えば、ＩｇＧのうち４３４位にセリンを含むものはないので、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４（又はそれらのハイブリッド）中の置換４３４Ｓは、天然に存在しない改変と考えられる。

「エフェクター機能」という用語は、ここで使用される場合、抗体Ｆｃ領域と、Ｆｃ受容体又はリガンドとの相互作用に起因する生化学的事象を意味する。エフェクター機能には、それだけには限らないが、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ及びＣＤＣが含まれる。

「ＩｇＧ Ｆｃリガンド」という用語は、ここで使用される場合、ＩｇＧ抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。Ｆｃリガンドには、それだけには限らないが、ＦｃγＲＩｓ、ＦｃγＲＩＩｓ、ＦｃγＲＩＩＩｓ、ＦｃＲｎ、Ｃ１ｑ、Ｃ３、マンナン結合レクチン、マンノース受容体、ブドウ球菌プロテインＡ、連鎖球菌プロテインＧ及びウイルスＦｃγＲが含まれる。Ｆｃリガンドはまた、Ｆｃ受容体相同体（ＦｃＲＨ）を含み、これは、ＦｃγＲと相同であるＦｃ受容体のファミリーである（Davis et al., 2002, Immunological Reviews 190:123-136（参照により完全に組み込まれる））。Ｆｃリガンドは、Ｆｃに結合する未発見の分子を含む場合がある。特定のＩｇＧ Ｆｃリガンドは、ＦｃＲｎ及びＦｃγ受容体である。「Ｆｃリガンド」とは、ここで使用される場合、抗体のＦｃ領域に結合して、Ｆｃ／Ｆｃリガンド複合体を形成する、任意の生物に由来する分子、好ましくは、ポリペプチドを意味する。

「Ｆｃγ受容体」、「ＦｃγＲ」、「ＦｃγＲ」又は「ＦｃｇＲ」という用語は、ここで使用される場合、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃγＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のファミリーの任意のメンバーを意味する。ヒトでは、このファミリーは、それだけには限らないが、アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ及びＦｃγＲＩｃを含むＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）；アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ－１及びＦｃγＲＩＩｂ－２を含む）及びＦｃγＲＩＩｃを含むＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）；並びにアイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）及びＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩｂ－ＮＡ２を含む）を含むＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（Jefferis et al., 2002, Immunol Lett 82:57-65（参照により完全に組み込まれる））並びに任意の未発見のヒトＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプを含む。ＦｃγＲは、それだけには限らないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含む任意の生物に由来してよい。マウスＦｃγＲは、それだけには限らないが、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）及びＦｃγＲＩＩＩ－２（ＣＤ１６－２）並びに任意の未発見のマウスＦｃγＲ又はＦｃγＲアイソフォーム又はアロタイプを含む。

「ＦｃＲｎ」又は「新生児Ｆｃ受容体」という用語は、ここで使用される場合、ＩｇＧ抗体Ｆｃ領域に結合し、ＦｃＲｎ遺伝子によって少なくとも幾分かはコードされるタンパク質を意味する。ＦｃＲｎは、それだけには限らないが、ヒト、マウス、ラット、ウサギ及びサルを含む任意の生物に由来してよい。当技術分野で公知のように、機能的ＦｃＲｎタンパク質は、重鎖及び軽鎖と呼ばれることが多い２つのポリペプチドを含む。軽鎖はβ－２－ミクログロブリンであり、重鎖はＦｃＲｎ遺伝子によってコードされる。ここで別に記載されない限り、ＦｃＲｎ又はＦｃＲｎタンパク質とは、ＦｃＲｎ重鎖のβ－２－ミクログロブリンとの複合体を指す。ＦｃＲｎ受容体への結合を増大するために、一部の場合には、血清半減期を増大するために使用されるさまざまなＦｃＲｎバリアントを、図１１の簡単な説明の項に示す。

「親ポリペプチド」という用語は、ここで使用される場合、バリアントを生成するようにその後に改変される開始ポリペプチドを意味する。親ポリペプチドは、天然に存在するポリペプチド又は天然に存在するポリペプチドのバリアント若しくは操作されたバージョンであってもよい。親ポリペプチドは、ポリペプチド自体、親ポリペプチドを含む組成物又はそれをコードするアミノ酸配列を指す場合がある。したがって、「親免疫グロブリン」とは、ここで使用される場合、バリアントを生成するように改変される未改変免疫グロブリンのポリペプチドを意味し、「親抗体」とは、ここで使用される場合、バリアント抗体を生成するように改変される未改変抗体を意味する。「親抗体」は、以下に概説されるような既知の商業的な組換え生成された抗体を含むということに留意すべきである。

「Ｆｃ融合タンパク質」又は「イムノアドヘシン」という用語は、ここで使用される場合、一般に、異なるタンパク質、例えば、ここで記載されるような標的タンパク質への結合部分に連結された（任意にここで記載されるようにリンカー部分を介して）Ｆｃ領域を含むタンパク質を意味する。一部の場合には、ヘテロ二量体タンパク質の一方の単量体は、抗体重鎖（ｓｃＦｖを含む、又は軽鎖を更に含む）を含み、もう一方の単量体は、バリアントＦｃドメイン及びリガンドを含むＦｃ融合物である。

「位置」という用語は、ここで使用される場合、タンパク質の配列中の位置を意味する。位置は、順次、又は確立された形式、例えば、抗体番号付けのためのＥＵインデックスに従って番号付けられてもよい。

「標的抗原」という用語は、ここで使用される場合、所与の抗体の可変領域が特異的に結合する分子を意味する。標的抗原は、タンパク質、炭水化物、脂質又は他の化学化合物であってもよい。豊富な適した標的抗原を以下に記載する。

「標的細胞」という用語は、ここで使用される場合、標的抗原を発現する細胞を意味する。

「可変領域」という用語は、ここで使用される場合、それぞれカッパ、ラムダ及び重鎖免疫グロブリン遺伝子座を構成するＶκ、Ｖλ、及び／又はＶＨ遺伝子のいずれかによって実質的にコードされる１つ以上のＩｇドメインを含む免疫グロブリンの領域を意味する。

「野生型又はｗｔ」という用語は、ここで使用される場合、対立遺伝子変形形態を含む天然に見いだされるアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を意味する。ＷＴタンパク質は、意図的に改変されていないアミノ酸配列又はヌクレオチド配列を有する。

本発明の抗体は、一般的に単離されているか、又は組換えである。「単離された」とは、ここで開示される種々のポリペプチドを説明するために使用される場合は、それから発現された細胞若しくは細胞培養物から同定及び分離及び／又は回収されているポリペプチドを意味する。通常、単離ポリペプチドは、少なくとも１つの精製工程によって製造される。「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。

「特異的結合」又は特定の抗原又はエピトープ「に特異的に結合する」又は「に特異的である」とは、非特異的相互作用とは測定可能に異なっている結合を意味する。特異的結合は、例えば、一般に、結合活性を有さない同様の構造の分子である対照分子の結合と比較して、分子の結合を決定することによって測定できる。例えば、特異的結合は、標的と同様である対照分子との競合によって決定できる。

特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、少なくとも約１０－４Ｍ、少なくとも約１０－５Ｍ、少なくとも約１０－６Ｍ、少なくとも約１０－７Ｍ、少なくとも約１０－８Ｍ、少なくとも約１０－９Ｍ、あるいは少なくとも約１０－１０Ｍ、少なくとも約１０－１１Ｍ、少なくとも約１０－１２Ｍ又はそれより大きい抗原又はエピトープに対するＫＤを有する抗体によって示される場合があり、ＫＤは、特定の抗体－抗原相互作用の解離速度を指す。通常、抗原に特異的に結合する抗体は、抗原又はエピトープと比較して、対照分子に対して２０－、５０－、１００－、５００－、１０００－、５，０００－、１０，０００－倍又はそれより大きいＫＤを有する。

また、特定の抗原又はエピトープに対する特異的結合は、例えば、対照と比較して、エピトープに対して少なくとも２０－、５０－、１００－、５００－、１０００－、５，０００－、１０，０００－倍又はそれより大きい、抗原又はエピトープに対するＫＡ又はＫａを有する抗体によって示される場合があり、ＫＡ又はＫａは、特定の抗体－抗原相互作用の結合速度を指す。

ここで使用される場合、「消失」とは、活性の減少又は除去を意味する。したがって、例えば、「ＦｃγＲ結合が消失する」とは、Ｆｃ領域アミノ酸バリアントが特定のバリアントを含有しないＦｃ領域と比較して５０％未満の出発結合を有することを意味し、７０～８０～９０～９５～９８％未満の活性の喪失が好ましく、一般に、活性は、Ｃａｒｔｅｒｒａアッセイにおいて検出可能な結合のレベル未満である。

ここで使用される場合、「ＡＤＣＣ」又は「抗体依存性細胞媒介性細胞傷害」とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合している抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。ＡＤＣＣは、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合と相関し、ＦｃγＲＩＩＩａへの結合の増大は、ＡＤＣＣ活性の増大につながる。

ここで使用される場合、「ＡＤＣＰ」又は抗体依存性細胞媒介性食作用とは、ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合している抗体を認識し、その後標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応を意味する。

一側面では、本発明は、本出願の明細書、図面、配列番号又は配列表において開示されるアミノ酸配列に対して、少なくとも約８０％の配列同一性、好ましくは、少なくとも約８１％の配列同一性、より好ましくは、少なくとも約８２％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８３％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８４％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８５％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８６％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８７％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８８％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約８９％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９１％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９２％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９３％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９４％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９５％配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９６％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９７％の配列同一性、なおより好ましくは、少なくとも約９８％の配列同一性及びなおより好ましくは、少なくとも約９９％の配列同一性を有する連続アミノ酸のストレッチ（すなわち、タンパク質）を提供する。同様に、本発明は、本発明の実施例に記載されるものを含む、このようなタンパク質を含む二量体及び三量体を提供する。

アミノ酸配列同一性％の値は、例えば、ＷＵ－ＢＬＡＳＴ－２コンピュータプログラムを使用して容易に得ることができる（Altschul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)）。

天然配列の断片が、ここで提供される。このような断片は、例えば、全長天然タンパク質と比較して、Ｎ末端若しくはＣ末端で切断型されていてもよく、又は内部残基を欠いてもよい。やはり、任意の末端変形形態は、ここで開示される本発明の文脈内で行われるということは理解される。

ある特定の断片は、目的の配列の所望の生物活性にとって必須ではないアミノ酸残基を欠く。

いくつかの従来の技術のいずれを使用してもよい。所望のペプチド断片又は連続アミノ酸のストレッチの断片は、化学合成してもよい。代替アプローチは、酵素的消化によって、例えば、タンパク質を特定のアミノ酸残基によって定義される部位でタンパク質を切断するとわかっている酵素で処置することによって、又はＤＮＡを適した制限酵素で消化すること及び所望の断片を単離することによって断片を生成することを含む。なお別の適した技術は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、所望のポリペプチド／配列断片をコードするＤＮＡ断片を単離すること及び増幅することを含む。ＤＮＡ断片の所望の末端を定義するオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲにおいて５’及び３’プライマーで使用される。

特定の態様では、目的の保存的置換は、表Ａにおいて好ましい置換の見出しの下に示されている。このような置換が、生物活性の変化をもたらす場合には、表Ａにおいて代表的な置換と実証される、又はアミノ酸クラスに関して以下に更に記載されるようなより実質的な変化が導入され、生成物がスクリーニングされる。

配列の機能又は免疫学的同一性の実質的な改変は、（ａ）例えば、シート若しくはヘリックスコンホメーションとしての置換の領域におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位での分子の電荷若しくは疎水性又は（ｃ）側鎖の嵩の維持に対するその効果が有意に異なる置換を選択することによって達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて群にわけられる：
ａ．疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；
ｂ．中性親水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ；
ｃ．酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；
ｄ．塩基性：ａｓｎ、ｇｌｎ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；
ｅ．鎖配向に影響を及ぼす残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；
ｆ．芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。

非保存的置換は、これらのクラスのうち１つのメンバーの、別のクラスのとの交換を必要とする。このような置換残基をまた、保存的置換部位中に、又はより好ましくは、残りの（非保存的）部位中に導入してもよい。

変形形態は、当技術分野で公知の方法、例えば、オリゴヌクレオチド媒介性（部位指定）変異誘発、アラニンスキャニング及びＰＣＲ変異誘発を使用して作製できる。部位指定変異誘発（Carter et al., Nucl. Acids Res., 13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res., 10:6487 (1987)）、カセット変異誘発（Wells et al., Gene, 34:315 (1985)）、制限選択変異誘発（Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)）又は他の公知の技術を、クローニングされたＤＮＡで実施して、バリアントＤＮＡを生成できる。

連続配列に沿って１個以上のアミノ酸を同定するために、スキャニングアミノ酸分析も使用できる。好ましいスキャニングアミノ酸の中には、比較的小さく、中性のアミノ酸がある。このようなアミノ酸には、アラニン、グリシン、セリン及びシステインが含まれる。アラニンは、β－炭素を超える側鎖を排除し、バリアントの主鎖コンホメーションを変更する可能性が低いので、通常、この群の中で好ましいスキャニングアミノ酸である（Cunningham and Wells, Science, 244:1081-1085 (1989)）。アラニンはまた、最も一般的なアミノ酸であるので通常好ましい。さらに、埋もれた及び露出された位置の両者において頻繁に見いだされる（Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)）。アラニン置換が、適切な量のバリアントをもたらさない場合には、等比体積（isoteric）アミノ酸を使用できる。

共有結合改変：連続アミノ酸のストレッチは、共有結合によって改変してもよい。あるタイプの共有結合改変は、標的化アミノ酸残基を、－ｘ－ｘ－結合に関与しない選択された側鎖又はＮ－若しくはＣ末端残基と反応可能である有機誘導体化剤と反応させることを含む。二官能性物質を用いる誘導体化は、例えば、水不溶性支持体マトリックス又は目的の抗配列抗体を精製するための方法において使用するため表面に架橋するために有用であり、逆もまた同様である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１－ビス（ジアゾアセチル）－２－フェニレタン、グルタルアルデヒド、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば、４－アジドサリチル酸とのエステル、ジスクシンイミジルエステル、例えば、３，３’－ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）を含むホモ二官能性イミドエステル、二官能性マレイミド、例えば、ビス－Ｎ－マレイミド－１，８－オクタン及び薬剤、例えば、メチル－３－（（ｐ－アジドフェニル）ジチオ）プロピオイミデートが挙げられる。

他の改変には、グルタミニル及びアスパラギニル残基の、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基への脱アミド化、プロリン及びリシンの水酸化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα－アミノ基のメチル化（T. E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)）、Ｎ末端アミンのアセチル化及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

別のタイプの共有結合改変は、連続アミノ酸のストレッチの天然グリコシル化パターンを変更することを含む。「天然グリコシル化パターンを変更すること」は、アミノ酸配列中に見いだされる１つ以上の炭水化物部分を欠失すること（基礎となるグリコシル化部位を除去すること、又は化学的及び／若しくは酵素的手段によってグリコシル化を欠失することのいずれかによって）、及び／又は天然配列中に存在しない１つ以上のグリコシル化部位を付加することを意味すると、ここでの目的のために意図される。さらに、この語句は、天然タンパク質のグリコシル化の定性的変化を含み、存在する種々の炭水化物部分の性質及び割合の変化を伴う。

アミノ酸配列へのグリコシル化部位の付加は、アミノ酸配列を変更することによって達成されてもよい。変更は、例えば、天然配列への１個以上のセリン若しくはスレオニン残基の付加、又はそれによる置換によって行ってもよい（Ｏ－結合型グリコシル化部位について）。アミノ酸配列は、ＤＮＡレベルでの変化によって、特に、所望のアミノ酸へ翻訳されるコドンが生成されるように、予め選択された塩基でアミノ酸配列をコードするＤＮＡを変異させることによって任意に変更されてもよい。

アミノ酸配列上の炭水化物部分の数を増大する別の手段は、ポリペプチドへのグリコシドの化学的又は酵素的カップリングによってである。このような方法は、当技術分野で、例えば、国際公開第87/05330号（1987年9月11日発行）及びAplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)に記載されている。

アミノ酸配列上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的に若しくは酵素的に、又はグリコシル化の標的として働くアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によって達成されてもよい。化学的脱グリコシル化技術は、当技術分野で公知であり、例えば、Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987) and by Edge et al., Anal. Biochem., 118:131 (1981)に記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350 (1987)に記載されるようにさまざまなエンド－及びエキソ－グリコシダーゼの使用によって達成できる。

別のタイプの共有結合改変は、米国特許第4,640,835号；同第4,496,689号；同第4,301,144号；同第4,670,417号；同第4,791,192号又は同第4,179,337号に示される方法で、アミノ酸配列を、さまざまな非タンパク質性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール又はポリオキシアルキレンのうちの１つに連結することを含む。

「置換」、「置換された」及び「置換基」という用語は、正常な原子価が維持され、置換が安定な化合物をもたらす限り、中に含有される水素原子への１つ以上の結合が、非水素原子への結合によって置き換えられる官能基を指す。置換基はまた、炭素（複数可）又は水素（複数可）原子への１つ以上の結合が、ヘテロ原子への、二重又は三重結合を含む、１つ以上の結合によって置き換えられている基を含む。置換基の例には、ハロゲン（すなわち、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ及びＩ）；アルキル基、例えば、メチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔｅｒｔ－ブチル及びトリフルオロメチル；アリール基、例えば、フェニル；ヘテロアリール基、例えば、トリアゾール、ジヒドロピリダジン及びテトラゾール；ヒドロキシル；アルコキシ基、例えば、メトキシ、エトキシ、ｎ－プロポキシ及びイソプロポキシ；アリールオキシ基、例えば、フェノキシ；アリールアルキルオキシ、例えば、ベンジルオキシ（フェニルメトキシ）及びｐ－トリフルオロメチルベンジルオキシ（４－トリフルオロメチルフェニルメトキシ）；ヘテロアリールオキシ基；スルホニル基、例えば、スルホネート、トリフルオロメタンスルホニル、メタンスルホニル及びｐ－トルエンスルホニル；スルフニトロ、ニトロシル；メルカプト；スルファニル基、例えば、メチルスルファニル、エチルスルファニル及びプロピルスルファニル；シアノ；アミノ基、例えば、アミノ、メチルアミノ、ジメチルアミノ、エチルアミノ及びジエチルアミノ；及びカルボキシルが含まれる。複数の置換基部分が開示され、特許請求される場合には、置換化合物は、開示又は特許請求される置換基部分のうち１つ以上によって、単一で又は複数で独立に置換され得る。独立に置換されたとは、（２つ以上の）置換基が同一である場合も異なっている場合もあることを意味する。本発明の方法において使用される化合物では、アルキル、ヘテロアルキル、単環、二環、アリール、ヘテロアリール及び複素環基を、１個以上の水素原子を代替非水素基で置き換えることによって置換できる。これらには、それだけには限らないが、ハロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、カルボキシ、シアノ及びカルバモイルが含まれる。

本発明の方法において使用される化合物上の置換基及び置換パターンは、化学的に安定であり、容易に入手可能な出発材料から当技術分野で公知の技術によって容易に合成できる化合物を提供するように当業者によって選択できるということは理解される。置換基がそれ自体、１つより多い基で置換されている場合には、これらの複数の基は、安定な構造がもたらされる限り同一炭素上にあっても、異なる炭素上にあってもよいということは理解される。

本発明の方法において使用される化合物の選択では、当業者ならば、種々の置換基、すなわち、Ｒ１、Ｒ２などは、化学構造接続性の周知の原理に準拠して選択されるべきであるということは認識するであろう。

ここで使用される場合、「アルキル」は、特定の数の炭素原子を有する分枝及び直鎖両者の飽和脂肪族炭化水素基を含み、無置換であっても、置換されていてもよい。したがって、「Ｃ_１～Ｃ_ｎアルキル」におけるようなＣ_１～Ｃ_ｎは、直鎖状又は分枝配置で１、２、…、ｎ－１又はｎ個の炭素を有する基を含むように定義される。例えば、「Ｃ_１～Ｃ_６アルキル」におけるようなＣ_１～Ｃ_６は、直鎖状又は分枝配置で１、２、３、４、５又は６個の炭素を有する基を含むように定義され、具体的にメチル、エチル、ｎ－プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、ｔ－ブチル、ペンチル及びヘキシルを含む。特に断りのない限り、１～１２個の炭素を含有する。アルキル基は、無置換である場合も、それだけには限らないが、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、メトキシ及びヒドロキシルを含む１つ以上の置換基で置換されている場合もある。一態様は、Ｃ_１～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_２～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１２アルキル、Ｃ_４～Ｃ_１２アルキルなどであり得る。一態様は、Ｃ_１～Ｃ_８アルキル、Ｃ_２～Ｃ_８アルキル、Ｃ_３～Ｃ_８アルキル、Ｃ_４～Ｃ_８アルキルなどであり得る。アルキルは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「Ｃ_１～Ｃ_４アルキル」は、分枝及び直鎖両者のＣ_１～Ｃ_４アルキルを含む。

ここで使用される場合、「シクロアルカン」という用語は、不飽和であっても、部分的に不飽和であってもよい、すなわち、１つ以上の二重結合を有する、単環式又は二環式環構造を指す。単環式環構造は、３～８個の炭素原子を含有する飽和環状炭化水素基によって例示される。単環式環構造の例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、シクロヘプチル及びシクロオクチルが挙げられる。二環式縮合環構造は、別のシクロアルキル環と縮合したシクロアルキル環によって例示される。二環式縮合環構造の例として、それだけには限らないが、デカリン、１，２，３，７，８，８ａ－ヘキサヒドロ－ナフタレンなどが挙げられる。したがって、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカンには、３～８個の総炭素原子のアルカンの環式環、（例えば、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル又はシクロオクチルなど）が含まれる。シクロアルカン基は、無置換である場合も、それだけには限らないが、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、メトキシ及びヒドロキシルを含む１つ以上の置換基で置換されている場合もある。シクロアルカンは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「シクロアルケン」という用語は、１つ以上の二重結合を有するシクロアルカンを指す。したがって、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケンは、５～１０個の総炭素原子のアルカンの環式環、（例えば、シクロペンテニル、シクロヘキセニル、シクロヘプテニル、シクロヘキサジエニル、シクロオクテニル又はシクロオクタジエニルなど）を含む。シクロアルケンは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。シクロアルケンは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「アルケン」は、１つ以上の二重結合及び特定の数の炭素原子を有する分枝及び直鎖両者の脂肪族炭化水素基を含み、無置換であっても、置換されていてもよい。したがって、「Ｃ_２～Ｃ_ｎアルケン」におけるようなＣ_２～Ｃ_ｎは、直鎖状又は分枝配置で２、３、…、ｎ－１又はｎ個の炭素を有する基を含むように定義される。例えば、「Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン」におけるようなＣ_２～Ｃ_１０は、直鎖状又は分枝配置で２、３、４、５、…、１０個の炭素を有する基を含むように定義され、具体的にビニル、アリル、１－ブテン、２－ブテン、イソ－ブテン、１－ペンテン、２－ペンテンなどを含む。アルケン基は、無置換である場合も、それだけには限らないが、ハロゲン、アルコキシ、アルキルチオ、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、メトキシ及びヒドロキシルを含む１つ以上の置換基で置換されている場合もある。一態様は、Ｃ_２～Ｃ_３アルケン、Ｃ_２～Ｃ_４アルケン、Ｃ_２～Ｃ_５アルケンなどであり得る。アルケンは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「アシル」とは、第１の位置にケトンを有するアルキル基を指す。例えば、「アシル」態様は、アセチル、プロピオニル、ブチリル及びバレリルであり得る。別の例として、「アシル」態様は、

（ここで、ｎは１～１０である）であってもよい。別の態様では、ｎは１～４である。

したがって、「Ｃ_２～Ｃ_５アシル」は、アセチル、プロピオニル、ブチリル又は及びバレリルであり得る。アシルは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノは、アミンで更に置換された上記で定義されたようなアシル基である。アミンは、アミドを形成するようにアシル基のカルボニル部分に連結されてもよい、又はアミンは、アシル基の非カルボニル部分に連結されてもよい。例えば、アミノ基は、α－位、β－位、γ－位、δ－位などであってもよい。さらなる例として、アシルアミノは、α－アミノアセチル及びアセトアミド基の両者を含む。アシルアミノは、β－アミノプロピオニル）を含む。

Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシは、酸素で更に置換された上記で定義されたようなアシル基である。酸素は、アミドを形成するようにアシル基のカルボニル部分に連結されてもよい、又は酸素は、アシル基の非カルボニル部分に連結されてもよい。例えば、酸素基は、α－位、β－位、γ－位、δ－位などであってもよい。さらなる例として、アシルオキシは、α－オキシアセチル及びアセテート基の両者を含む。アシルオキシは、β－オキシプロピオニル）を含む。

ここで使用される場合、「アミノ」は、第１級、第２級、第３級及び第４級アミンを含む。したがって、アミノは、－ＮＨ－基、－ＮＨ_２基、－ＮＲ－基、－ＮＲ_２ ^＋－基、－ＮＲＨ^＋－基、－ＮＨ_２ ^＋－基、－ＮＨ_３ ^＋基及び－ＮＲ_３ ^＋基を含み、Ｒは、アルキル又はアリールである。アミノは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「硫黄」は、－Ｓ－基及び－ＳＨ基を含む。硫黄という用語は、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「酸素」は、－Ｏ－基及び－ＯＨ基を含む。硫黄という用語は、一価及び二価である部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「スクシニル」は、一方又は両者のヒドロキシル基の除去によってコハク酸から導かれる。一態様は、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－であり得る。スクシニルは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「マロニル」は、一方又は両者のヒドロキシル基の除去によってマロン酸から導かれる。一態様は、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－であり得る。マロニルは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「グルタリル」は、一方又は両者のヒドロキシル基の除去によってグルタル酸から導かれる。一態様は、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－Ｃ（Ｏ）－であり得る。グルタリルは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

ここで使用される場合、「アジポイル」は、一方又は両者のヒドロキシル基の除去によってアジピン酸から導かれる。一態様は、－Ｃ（Ｏ）－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－ＣＨ_２－（Ｏ）－であり得る。アジポイルは、一価、二価、三価などである部分を含むように意図される。

「ポリアルキレングリコール」は、ヒドロキシル基からの両者の水素の除去によってポリアルキレングリコールから導かれる。一態様は、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール又はポリブチレングリコールから導くことができる。

「ポリアルキレングリコール」態様は、

（ここで、ｎは１～１０である）
であってもよい。

ここで使用される場合、「アリール」は、各環において最大１０個の原子の任意の安定な単環式、二環式又は多環式炭素環を意味するように意図され、少なくとも１つの環は芳香族であり、無置換であっても、置換されていてもよい。このようなアリール要素の例として、それだけには限らないが：フェニル、ｐ－トルエニル（４－メチルフェニル）、ナフチル、テトラヒドロ－ナフチル、インダニル、フェナントリル、アントリル又はアセナフチルが挙げられる。アリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族である場合には、付着は、芳香環を介してであるということは理解される。

「ヘテロアリール」という用語は、ここで使用される場合、各環において最大１０個の原子の安定な単環式、二環式又は多環式環を表し、少なくとも１つの環は芳香族であり、Ｏ、Ｎ及びＳからなる群から選択される１～４個のヘテロ原子を含有する。二環式芳香族ヘテロアリール基には、（ａ）１個の窒素原子を有する６員の芳香族（不飽和）複素環式環と縮合した；（ｂ）２個の窒素原子を有する５－若しくは６員の芳香族（不飽和）複素環式環と縮合した；（ｃ）１個の酸素若しくは１個の硫黄原子のいずれかと一緒に１個の窒素原子を有する５員の芳香族（不飽和）複素環式環と縮合した；又は（ｄ）Ｏ、Ｎ若しくはＳから選択される１個のヘテロ原子を有する５員の芳香族（不飽和）複素環式環と縮合した、フェニル、ピリジン、ピリミジン又はピリジジン環が含まれる。この定義の範囲内のヘテロアリール基には、それだけには限らないが：ベンゾイミダゾリル、ベンゾフラニル、ベンゾフラザニル、ベンゾピラゾリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチオフェニル、ベンゾオキサゾリル、カルバゾリル、カルボリニル、シンノリニル、ジヒドロピリジジン、フラニル、インドリニル、インドリル、インドラジニル、インダゾリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソオキサゾリル、ナフトピリジニル、オキサジアゾリル、オキサゾリル、オキサゾリン、イソオキサゾリン、オキセタニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリドピリジニル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、テトラゾリル、テトラゾロピリジル、チアジアゾリル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリル、アゼチジニル、アジリジニル、１，４－ジオキサニル、ヘキサヒドロアゼピニル、ジヒドロベンゾイミダゾリル、ジヒドロベンゾフラニル、ジヒドロベンゾチオフェニル、ジヒドロベンゾオキサゾリル、ジヒドロフラニル、ジヒドロイミダゾリル、ジヒドロインドリル、ジヒドロイソオキサゾリル、ジヒドロイソチアゾリル、ジヒドロオキサジアゾリル、ジヒドロオキサゾリル、ジヒドロピラジニル、ジヒドロピラゾリル、ジヒドロピリジニル、ジヒドロピリミジニル、ジヒドロピロリル、ジヒドロキノリニル、ジヒドロテトラゾリル、ジヒドロチアジアゾリル、ジヒドロチアゾリル、ジヒドロチエニル、ジヒドロトリアゾリル、ジヒドロアゼチジニル、メチレンジオキシベンゾイル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、アクリジニル、カルバゾリル、シンノリニル、キノキサリニル、ピラゾリル、インドリル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾオキサゾリル、イソオキサゾリル、イソチアゾリル、フラニル、チエニル、ベンゾチエニル、ベンゾフラニル、キノリニル、イソキノリニル、オキサゾリル、イソオキサゾリル、インドリル、ピラジニル、ピリダジニル、ピリジニル、ピリミジニル、ピロリル、テトラ－ヒドロキノリンが含まれる。ヘテロアリール置換基が二環式であり、１つの環が非芳香族であるか、又はヘテロ原子を含有しない場合には、付着は、それぞれ、芳香環を介して、又はヘテロ原子含有環を介してであるということが理解される。ヘテロアリールが窒素原子を含有する場合には、その対応するＮ－オキシドもこの定義によって包含されるということは理解される。

「フェニル」という用語は、６個の炭素を含有する芳香族６員環及びその任意の置換誘導体を意味するように意図される。

「ベンジル」という用語は、ベンゼン環に直接的に付着したメチレンを意味するように意図される。ベンジル基は、水素がフェニル基と置き換えられているメチル基及びその任意の置換誘導体である。

「トリアゾール」という用語は、２個の炭素原子及び３個の窒素原子を含有する５員環を有するヘテロアリール及びその任意の置換誘導体を意味するように意図される。

ジヒドロピラジジンは、任意に置換され、１，２－ジヒドロピリダジン、

；１，４－ジヒドロピリダジン、

；１，６－ジヒドロピリダジン、

；及び４，５－ジヒドロピリダジン、

を含む。

ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造には、それだけには限らないが、ジヒドロピリダジンの第３及び第４位と縮合したシクロオクタンを含む化学構造又は飽和シクロオクタ［ｄ］ピリダジンを含む化学構造が含まれ、それらのいずれも任意に置換されていてもよい。例えば、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造には、それだけには限らないが、２，４ａ，５，６，７，８，９，１０－オクタヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジン、

；４ａ，５，６，７，８，９，１０，１０ａ－オクタヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジン、

；２，３，５，６，７，８，９，１０－オクタヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジン、

；又は１，２，５，６，７，８，９，１０－オクタヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジン、

を含む化学構造が含まれ、それらの各々は、任意に置換されていてもよい。

の互変異性体には、それだけには限らないが、

が含まれる。

一部の態様では、ジヒドロピリダジンは、ピリダジンに酸化される。

一部の態様では、ジヒドロピリダジンは、還元されて、１，４－ジカルボニル化合物を有する開環構造をもたらす。

本発明の方法において使用される化合物は、有機合成において周知の、当業者が精通している技術で製造してもよい。しかし、これらは、所望の化合物を合成又は入手するための唯一の手段ではない場合がある。

対象発明の化合物は、吸収及びバイオアベイラビリティを最適化するためにプロドラッグに変換できる。プロドラッグの形成は、それだけには限らないが、遊離ヒドロキシル基をカルボン酸と反応させてエステルを形成すること、遊離ヒドロキシル基をオキシ塩化リンと反応させ、続いて、加水分解してリンを形成すること、又は遊離ヒドロキシル基をアミノ酸と反応させて、アミノ酸エステルを形成することを含み、それらの方法は、Chandranによって国際公開第2005/046575号に先に記載されている。置換基は選択され、得られた類似体は、医薬品及び製薬化学の技術分野で周知の原則、例えば、構造－活性関連性の定量化、生物活性及びＡＤＭＥＴ（吸収、分布、代謝、排泄及び毒性）特性の最適化に従って評価される。

ここで開示される化合物の芳香環に付着された種々のＲ基は、標準手順、例えば、Advanced Organic Chemistry: Part B: Reaction and Synthesis, Francis Carey and Richard Sundberg, (Springer) 5th ed. Edition. (2007)（参照によりこの明細書に組み込まれる）に示されるものによって環に付加されてもよい。

本発明の化合物は、Vogel’s Textbook of Practical Organic Chemistry, A.I. Vogel, A.R. Tatchell, B.S. Furnis, A.J. Hannaford, P.W.G. Smith, (Prentice Hall) 5th Edition (1996)、March's Advanced Organic Chemistry: Reactions, Mechanisms, and Structure, Michael B. Smith, Jerry March, (Wiley-Interscience) 5th Edition (2007)及びこれらの参考文献（参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載の技術で製造してもよい。しかし、これらは、所望の化合物を合成又は入手するための唯一の手段ではない場合がある。

当業者ならば、ここで提供される置換基及び部分の定義は、化学的価数の標準的な規則に従うように意図されることを直ちに理解するであろう。例えば、ここで提供される構造が、特定の置換基又は部分が二価であることを必要とする場合（例えば、部分の直鎖の部分）には、当業者は、置換基又は部分の定義は、化学的価数の標準的な規則に従うために二価であることを直ちに理解するであろう。

当業者ならば、本発明において表される一部の二価部分は、１つよりも多い方法で他の化学構造に連結されてもよい、例えば、表される構造は、回転又は反転された場合に他の化学構造に連結されてもよいということを直ちに理解するであろう。

本発明の一部の態様では、化合物は、非タンパク質性ポリマーを含む。一部の態様では、非タンパク質性ポリマーは、親水性合成ポリマー、すなわち、そうでなければ天然に見いだされないポリマーであってもよい。しかし、天然に存在し、組換え又はin vitro法によって生成されるポリマーは、自然界から単離されたポリマーがそうであるように、有用である。親水性ポリビニルポリマーは、本発明の範囲内に入る、例えば、ポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドン。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル又はメトキシポリエチレングリコール；ポリオキシアルキレン、例えば、ポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（プルロニック（登録商標））；ポリメタクリレート；カルボマー；ホモ多糖及びヘテロ多糖、例えば、ラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、硫酸デキストラン、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン又は酸性ムコ多糖の多糖サブユニット、例えば、ヒアルロン酸を含む、糖単量体であるＤ－マンノース、Ｄ－及びＬ－ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－グルクロン酸、シアル酸、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－マンヌロン酸（例えば、ポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルコース及びノイラミン酸を含む分枝又は非分枝多糖；糖アルコールのポリマー、例えば、ポリソルビトール及びポリマンニトール；並びにヘパリン又はヘパロン（heparon）である。

塩
ここで開示される化合物の塩は、本発明の範囲内にある。ここで使用される場合、「塩」は、化合物の酸性又は塩基性塩を作製することによって改変されている本化合物の塩である。

連続アミノ酸のストレッチ
ここで言及されるような連続アミノ酸のストレッチの例には、それだけには限らないが、結合ドメイン、例えば、分泌又は膜貫通タンパク質、細胞内結合ドメイン及び抗体（全体又はその部分）及びそれらの改変されたバージョンを含む連続アミノ酸が含まれる。以下は、一部の限定されない例である：

免疫グロブリン
「抗体」という用語は、広義に使用され、具体的に、所望の生物活性を示す限り、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、一価抗体、多価抗体及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ及び／又は単一アーム抗体）を対象とする。

抗体の「クラス」とは、その重鎖によって有される定常ドメイン又は定常領域のタイプを指す。抗体の５つの主要なクラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭがあり、これらのうちいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１及びＩｇＡ２に更にわけられてもよい。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。

「抗体断片」とは、無傷抗体が結合する抗原に結合する無傷抗体の部分を含む無傷抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、それだけには限らないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’－ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディー；直鎖状抗体；単鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられる。

「全長抗体」、「無傷抗体」及び「全抗体」という用語は、ここで同義的に使用され、天然抗体構造と実質的に同様の構造を有する、又はここで定義されるようなＦｃ領域を含有する重鎖を有する抗体を指す。

「ブロッキング」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物活性を有意に阻害する（部分的又は完全にのいずれかで）ものである。

参照抗体と「同一エピトープに結合する抗体」とは、競合アッセイにおいて参照抗体のその抗原への結合を５０％又はそれ以上ブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて抗体のその抗原への結合を５０％又はそれ以上ブロックする。代表的競合アッセイは、ここで提供される。

「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、ＶＨ及びＶＬ）は、一般に同様の構造を有し、各ドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む。例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)参照。抗原結合特異性を付与するために単一ＶＨ又はＶＬドメインが十分である場合がある。さらに、特定の抗原に結合する抗体は、抗原に結合する抗体からＶＨ又はＶＬドメインを使用してそれぞれ相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをスクリーニングして単離してもよい。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)参照。

「超可変領域」又は「ＨＶＲ」という用語は、ここで使用される場合、配列中の超可変である、及び／又は構造的に規定されたループ（「超可変ループ」）を形成する、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般に、天然の４鎖抗体は、６つのＨＶＲ；ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）を含む。ＨＶＲは一般に、超可変ループ由来の、及び／又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）由来のアミノ酸残基を含み、後者は、最高配列可変性のものであり、及び／又は抗原認識に関与する。代表的な超可変ループは、アミノ酸残基２６～３２（Ｌ１）、５０～５２（Ｌ２）、９１～９６（Ｌ３）、２６～３２（Ｈ１）、５３～５５（Ｈ２）及び９６～１０１（Ｈ３）に生じる。（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）代表的ＣＤＲ（ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２、ＣＤＲ－Ｌ３、ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２及びＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基２４～３４、Ｌ２の５０～５６、Ｌ３の８９～９７、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～６５及びＨ３の９５～１０２で生じる。（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)）。ＶＨ中のＣＤＲ１を除いて、ＣＤＲは一般に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲはまた、抗原に接触する残基である「特異性決定残基」又は「ＳＤＲ」を含む。ＳＤＲは、短縮型（abbreviated－）ＣＤＲ又はａ－ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含有される。代表的ａ－ＣＤＲ（ａ－ＣＤＲ－Ｌ１、ａ－ＣＤＲ－Ｌ２、ａ－ＣＤＲ－Ｌ３、ａ－ＣＤＲ－Ｈ１、ａ－ＣＤＲ－Ｈ２及びａ－ＣＤＲ－Ｈ３）は、Ｌ１のアミノ酸残基３１～３４、Ｌ２の５０～５５、Ｌ３の８９～９６、Ｈ１の３１～３５Ｂ、Ｈ２の５０～５８及びＨ３の９５～１０２で生じる（Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)参照）。特に断りのない限り、可変ドメイン中のＨＶＲ残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Kabat et al.（前掲）に従ってここで番号付けされる。

「フレームワーク」又は「ＦＲ」とは、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは一般に、４つのＦＲドメイン：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４からなる。したがって、ＨＶＲ及びＦＲ配列は、一般に、ＶＨ（又はＶＬ）中で以下の順序：ＦＲ１－Ｈ１（Ｌ１）－ＦＲ２－Ｈ２（Ｌ２）－ＦＲ３－Ｈ３（Ｌ３）－ＦＲ４で現れる。

語句「Ｎ末端切断型重鎖」とは、ここで使用される場合、全長免疫グロブリン重鎖の部分を含むが全ては含まないポリペプチドを指し、失われた部分は、普通、重鎖のＮ末端領域に位置するものである。失われた部分は、それだけには限らないが、可変ドメイン、ＣＨ１及びヒンジ配列の一部又は全てを含む場合がある。一般に、野生型ヒンジ配列が存在しない場合には、Ｎ末端切断型重鎖中の残りの定常ドメイン（複数可）は、別のＦｃ配列（すなわち、ここで記載されるような「第１の」Ｆｃポリペプチド）に連結可能である成分を含むであろう。例えば、前記成分は、ジスルフィド結合を形成可能な改変された残基又は付加されたシステイン残基であり得る。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合する受容体を記載する。一部の態様では、ＦｃＲは、天然ヒトＦｃＲである。一部の態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体に結合するもの（γ受容体）であり、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスの受容体を含み、それらの受容体の対立遺伝子バリアント及び選択的にスプライシングされた形態を含む。ＦｃγＲＩＩ受容体には、その細胞質ドメインにおいて主に異なる同様のアミノ酸配列を有する、ＦｃγＲＩＩＡ（「活性化受容体」）及びＦｃγＲＩＩＢ（「阻害性受容体」）が含まれる。活性化受容体ＦｃγＲＩＩＡは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含有する。阻害性受容体ＦｃγＲＩＩＢは、その細胞質ドメイン中に免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）を含有する。例えば、Daeron, Annu. Rev. Immunol. 15:203-234 (1997))参照。ＦｃＲｓは、例えば、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991)；Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994)及びde Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995)で総説されている。将来同定されるべきものを含む他のＦｃＲは、ここで「ＦｃＲ」という用語によって包含される。

「Ｆｃ受容体」又は「ＦｃＲ」という用語はまた、母体のＩｇＧの胎児への移行（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) and Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）及び免疫グロブリンのホメオスタシスの調節に関与する、新生児受容体、ＦｃＲｎを含む。ＦｃＲｎへの結合を測定する方法は公知である（例えば、Ghetie and Ward., Immunol. Today 18(12):592-598 (1997)；Ghetie et al., Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton et al., J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第2004/92219号（Hinton et al.）参照）。

ヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドのin vivoでのヒトＦｃＲｎへの結合及び血清半減期は、例えば、ヒトＦｃＲｎを発現する、トランスジェニックマウス又はトランスフェクトされたヒト細胞株において、又はバリアントＦｃ領域を有するポリペプチドが投与される霊長類においてアッセイできる。国際公開第2000/42072号（Presta）には、ＦｃＲへの結合が改善されている、又は減少している抗体バリアントが記載されている。例えば、Shields et al. J. Biol. Chem. 9(2):6591-6604 (2001)も参照。

「ヒンジ領域」、「ヒンジ配列」及びその変形形態は、ここで使用される場合、例えば、Janeway et al., Immuno Biology: the immune system in health and disease, (Elsevier Science Ltd., NY) (4th ed., 1999)；Bloom et al., Protein Science (1997), 6:407-415; Humphreys et al., J. Immunol. Methods (1997), 209:193-202に例証される当技術分野で公知の意味を含む。

特に断りのない限り、表現「多価抗体」は、３つ又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を表すために本明細書を通じて使用される。多価抗体は、好ましくは、３つ又はそれ以上の抗原結合部位を有するように操作され、一般に、天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。

「Ｆｖ」断片は、完全抗原認識及び結合部位を含有する抗体断片である。この領域は、密接に会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、天然に、例えば、ｓｃＦｖにおいて共有結合であり得る。各可変ドメインの３つのＨＶＲが相互作用して、ＶＨ－ＶＬ二量体の表面上で抗原結合部位を規定するのは、この立体配置においてである。まとめると、６つのＨＶＲ又はそのサブセットは、抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、各単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＨＶＲのみを含むＦｖの半分）は、普通、全結合部位よりは低い親和性であるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。

「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び定常ドメイン並びに重鎖の可変ドメイン及び第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般に、それらの間でヒンジシステインによってそのカルボキシ末端の近くで共有結合によって連結されるＦａｂ断片の対を含む。抗体断片の他の化学的カップリングも当技術分野で公知である。

語句「抗原結合アーム」とは、ここで使用される場合、目的の標的分子に特異的に結合する能力を有する抗体断片の成分の一部を指す。一般に、好ましくは、抗原結合アームは、免疫グロブリン軽及び重鎖の免疫グロブリンのポリペプチド配列、例えば、ＨＶＲ及び／又は可変ドメイン配列の複合体である。

「単鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一ポリペプチド鎖中に存在する。一般に、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨ及びＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーを更に含み、これによって、ｓｃＦｖが抗原結合にとって所望の構造の形成が可能になる。ｓｃＦｖの総説は、Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。

「ダイアボディー」という用語は、同一ポリペプチド鎖（ＶＨ及びＶＬ）中に軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に結びつけられた重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指す。同一鎖上の２つのドメインの間で対合を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対合することを強いられ、２つの抗原結合部位を作出する。ダイアボディーは、例えば、欧州特許出願公開第404,097号；国際公開第93/11161号及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に十分に説明されている。

表現「直鎖状抗体」とは、Zapata et al., Protein Eng., 8(10):1057-1062 (1995)に記載の抗体を指す。手短には、これらの抗体は、相補的軽鎖ポリペプチドと一緒に、抗原結合領域の対を形成する、タンデムＦｄセグメント（Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１－Ｖ_Ｈ－Ｃ_Ｈ１）の対を含む。直鎖状抗体は、二重特異性である場合も単一特異性である場合もある。

「モノクローナル抗体」という用語は、ここで使用される場合、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団を構成する個々の抗体は、可能性あるバリアント抗体、例えば、天然に存在する変異を含有するもの又はモノクローナル抗体調製物の生成の際に生じるものを除いて、同一である、及び／又は同一エピトープに結合し、このようなバリアントは、一般に、微量で存在する。通常、異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各モノクローナル抗体は、一抗原上の単一決定基に対して向けられる。したがって、修飾語句「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集団から得られているとして抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の生成を必要とすると解釈されるべきではない。例えば、使用されるべきモノクローナル抗体は、それだけには限らないが、ハイブリドーマ法、組換えＤＮＡ法、ファージディスプレイ法及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全て又は一部を含有するトランスジェニック動物を利用する方法を含むさまざまな技術によって作製されてもよく、このような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の代表的な方法は、ここで記載されている。

「キメラ」抗体という用語は、重及び／又は軽鎖の部分が特定の供給源又は種に由来し、重及び／又は軽鎖の残りが異なる供給源又は種に由来する抗体を指す。

「ヒト化」抗体とは、非ヒトＨＶＲに由来するアミノ酸残基及びヒトＦＲに由来するアミノ酸残基を含むキメラ抗体を指す。ある特定の態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）の全て又は実質的に全てが、非ヒト抗体のものに対応し、ＦＲの全て又は実質的に全てがヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、任意に、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」とは、ヒト化を受けている抗体を指す。

「ヒト抗体」とは、ヒト若しくはヒト細胞によって産生された、又はヒト抗体レパートリー若しくは他のヒト抗体をコードする配列を利用する非ヒト供給源に由来する抗体のものに対応するアミノ酸配列を有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を具体的に排除する。

「裸の抗体」とは、異種部分（例えば、細胞傷害性部分）又は放射標識にコンジュゲートされていない抗体を指す。裸の抗体は、医薬品調合物中に存在してもよい。

「天然抗体」とは、変動する構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合された、２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖から構成される約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。ＮからＣ末端に、各重鎖は、可変重鎖ドメイン又は重鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＨ）と、それに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）を有する。同様に、ＮからＣ末端に、各軽鎖は、可変軽鎖ドメイン又は軽鎖可変ドメインとも呼ばれる可変領域（ＶＬ）と、それに続く定常軽鎖（ＣＬ）ドメインを有する。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２種類のうち１種類に割り当てられる。

「親和性」とは、分子（例えば、抗体）の単一結合部位及びその結合パートナー（例えば、抗原）の間の非共有結合相互作用の合計の力を指す。特に断りのない限り、ここで使用される場合、「結合親和性」とは、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）の間の１：１相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、ここで記載されるものを含む当技術分野で公知の一般的な方法によって測定できる。結合親和性を測定するための特定の例証的及び代表的態様は以下に記載される。

「親和性成熟された」抗体とは、このような変更を有さない親抗体と比較して、１つ以上のＨＶＲにおいて１つ以上の変更を有し、このような変更が抗体の抗原に対する親和性の改善をもたらす抗体を指す。

指定された抗体の「生物学的特徴」を有する抗体とは、それを、同一抗原に結合する他の抗体と区別するその抗体の生物学的特徴のうち１つ以上を有するものである。

抗体の「機能的抗原結合部位」とは、標的抗原に結合可能であるものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体ほど強力である必要はないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために公知のさまざまな方法のいずれか１つを使用して測定可能でなくてはならない。さらに、ここで多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は、定量的に同一である必要はない。ここで多量体抗体については、機能的抗原結合部位の数は、米国特許出願公開第2005/0186208号の例２に記載されるような超遠心分析を使用して評価できる。この分析方法によれば、標的抗原対多量体抗体の種々の比が組み合わされ、異なる数の機能的結合部位を仮定して複合体の平均分子量が算出される。これらの理論値が、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実験値と比較される。

「種依存性抗体」とは、第２の哺乳動物種に由来するその抗原の相同体に対して有するよりも、第１の哺乳動物種に由来する抗原に対してより強い結合親和性を有するものである。通常、種依存性抗体は、ヒト抗原に「特異的に結合する」（すなわち、約１×１０^－７Ｍ以下、好ましくは、約１×１０^－８Ｍ以下、最も好ましくは、約１×１０^－９Ｍ以下の結合親和性（Ｋ_ｄ）値を有する）が、ヒト抗原に対するその結合親和性よりも少なくとも約５０倍又は少なくとも約５００倍又は少なくとも約１０００倍弱い、第２の非ヒト哺乳動物種に由来する抗原の相同体に対する結合親和性を有する。種依存性抗体は、上記で定義されるような種々の種類の抗体のいずれかであり得る。一部の態様では、種依存性抗体は、ヒト化又はヒト抗体である。

「単離された」抗体とは、天然環境の成分から分離されているものである。一部の態様では、抗体は、例えば、電気泳動的なもの（例えば、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー的なもの（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）によって決定されるような、９５％又は９９％を超える純度まで精製される。抗体純度の評価方法の総説は、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照。

Ｆｃドメイン
「Ｆｃドメイン」という用語は、ここで使用される場合、一般に、免疫グロブリン重鎖のＣ末端ポリペプチド配列を含む、単量体又は二量体複合体を指す。Ｆｃドメインは、天然又はバリアントＦｃ配列を含んでもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃドメインの境界は、変わる可能性があるが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃドメインは、普通、ヒンジ領域中のアミノ酸残基からＦｃ配列のカルボキシ末端のストレッチに規定される。免疫グロブリンのＦｃ配列は、一般に、２つの定常領域、ＣＨ２領域及びＣＨ３領域を含み、任意にＣＨ４領域を含む。ヒトＦｃドメインは、任意の適した免疫グロブリン、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４サブタイプ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ又はＩｇＭから得てもよい。

適したＦｃドメインは、２）Ｎ末端システイン残基を有するＦｃドメインポリペプチドと隣接した、１）Ｎ末端システイン残基を有する成熟ポリペプチドの前で切断される、分泌型又は膜貫通タンパク質から得られるシグナルペプチドを含む、プレ－Ｆｃキメラポリペプチドの組換えＤＮＡ発現によって製造される。

シグナルペプチドの適した例は、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）（GenBankアクセッション番号NM000193）、ＩＦＮα－２（ＩＦＮ）（GenBankアクセッション番号NP000596）及びコレステロールエステルトランスフェラーゼ（ＣＥＴＰ）（GenBankアクセッション番号NM000078）である。他の適した例には、インドヘッジホッグ（GenBankアクセッション番号NM002181）、デザートヘッジホッグ（GenBankアクセッション番号NM021044）、ＩＦＮα－１（GenBankアクセッション番号NP076918）、ＩＦＮα－４（GenBankアクセッション番号NM021068）、ＩＦＮα－５（GenBankアクセッション番号ＮＭ００２１６９）、ＩＦＮα－６（GenBankアクセッション番号NM021002）、ＩＦＮα－７（GenBankアクセッション番号NM021057）、ＩＦＮα－８（GenBankアクセッション番号NM002170）、ＩＦＮα－１０（GenBankアクセッション番号NM002171）、ＩＦＮα－１３（GenBankアクセッション番号NM006900）、ＩＦＮα－１４（GenBankアクセッション番号NM002172）、ＩＦＮα－１６（GenBankアクセッション番号NM002173）、ＩＦＮα－１７（GenBankアクセッション番号NM021268）及びＩＦＮα－２１（GenBankアクセッション番号NM002175）が含まれる。

Ｆｃドメイン及びそのプレ－Ｆｃキメラポリペプチドの適した例は、配列番号１２０から配列番号２１５に示されている。Ｆｃドメインは、その分泌及びシグナルペプチドの切断につながる条件下で細胞においてプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。プレ－Ｆｃポリペプチドは、原核生物又は真核生物の宿主細胞のいずれで発現されてもよい。好ましくは、哺乳動物宿主細胞が、プレ－Ｆｃポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトされる。

Ｎ末端配列ＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＣＰＰＣＰＡＰＥ及びＣＰＡＰＥを有するヒトＩｇＧ１ Ｆｃドメインは、それぞれ配列番号１２０、配列番号１２８及び配列番号１３６に示されており、それらをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１２１、配列番号１２９及び配列番号１３７に示されている。配列番号１２０のＩｇＧ１ドメインは、それぞれ配列番号１２３、配列番号１２５及び配列番号１２７に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１２２（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１２４（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１２６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号１２８のＩｇＧ１ドメインは、それぞれ配列番号１３１、配列番号１３３及び配列番号１３５に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１３０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１３２（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１３４（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号１３６のＩｇＧ１ドメインは、それぞれ配列番号１３９、配列番号１４１及び配列番号１４３に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１３８（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１４０（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１４２（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。

Ｎ末端配列ＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＥ、ＣＰＰＣＰＡＰＥ及びＣＰＡＰＥを有するヒトＩｇＧ２ Ｆｃドメインは、それぞれ配列番号１４４、配列番号１５２、配列番号１６０及び配列番号１６８に示されており、それらをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１４５、配列番号１５３、配列番号１６１及び配列番号１６９に示されている。配列番号１４４のＩｇＧ２ドメインは、それぞれ配列番号１４７、配列番号１４９及び配列番号１５１に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１４６（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１４８（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１５０（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号１５２のＩｇＧ２ドメインは、それぞれ配列番号１５５、配列番号１５７及び配列番号１５９に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１５４（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１５６（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１５８（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号１６０のＩｇＧ２ドメインは、それぞれ配列番号１６３、配列番号１６５及び配列番号１６７に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１６２（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１６４（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１６６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドから得られる。配列番号１６８のＩｇＧ２ドメインは、それぞれ配列番号１７１、配列番号１７３及び配列番号１７５に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１７０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１７２（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１７４（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドから得られる。

Ｎ末端配列（ＣＰＲＣＰＥＰＫＳＤＴＰＰＰ）３－ＣＰＲＣＰＡＰＥ、ＣＰＲＣＰＡＰＥ及びＣＰＡＰＥを有するヒトＩｇＧ３ Ｆｃドメインは、それぞれ配列番号１７６、配列番号１８４及び配列番号１９２に示されており、それらをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号１７７、配列番号１８５、配列番号１６１及び配列番号１９３に示されている。配列番号１７６のＩｇＧ３ドメインは、それぞれ配列番号１７９、配列番号１８１及び配列番号１８３に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１７８（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１８０（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１８２（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号１８４のＩｇＧ３ドメインは、それぞれ配列番号１８７、配列番号１８９及び配列番号１９１に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１８６（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１８８（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１９０（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号１９２のＩｇＧ３ドメインは、それぞれ配列番号１９５、配列番号１９７及び配列番号１９９に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号１９４（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号１９６（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号１９８（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。

Ｎ末端配列ＣＰＳＣＰＡＰＥ及びＣＰＡＰＥを有するヒトＩｇＧ４ Ｆｃドメインの配列は、それぞれ配列番号２００及び配列番号２０８に示されており、それらをコードするＤＮＡ配列は、それぞれ配列番号２０１及び配列番号２０９に示されている。配列番号２００のＩｇＧ４ドメインは、それぞれ配列番号２０３、配列番号２０５及び配列番号２０７に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号２０２（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２０４（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２０６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２０８のＩｇＧ４ドメインは、それぞれ配列番号２１１、配列番号２１３及び配列番号２１５に示されるＤＮＡ配列を使用して、配列番号２１０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２１２（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２１４（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－Ｆｃキメラポリペプチドを発現させることによって得られる。

その重鎖Ｎ末端にシステイン残基を有する適した抗体バリアントは、２）Ｎ末端システイン残基を有する抗体重鎖ポリペプチドと隣接した、１）Ｎ末端システイン残基を有する成熟ポリペプチドの前で切断される、分泌型又は膜貫通タンパク質から得られたシグナルペプチドを含む、プレ重鎖キメラポリペプチドの組換えＤＮＡ発現によって製造される。

その軽鎖Ｎ末端にシステイン残基を有する適した抗体バリアントは、２）Ｎ末端システイン残基を有する抗体軽鎖ポリペプチドと隣接した、１）Ｎ末端システイン残基を有する成熟ポリペプチドの前で切断される、分泌型又は膜貫通タンパク質から得られるシグナルペプチドを含む、プレ－軽鎖キメラポリペプチドの組換えＤＮＡ発現によって製造される。

トラスツズマブ重及び軽鎖は、シグナルペプチドのその分泌及び切断につながる条件下で細胞においてプレ－重及びプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。プレ－重鎖及びプレ－軽鎖ポリペプチドは、原核生物又は真核細胞の宿主細胞のいずれで発現されてもよい。好ましくは、哺乳動物宿主細胞は、プレ－重鎖及びプレ－軽鎖ポリペプチドをコードする発現ベクターをトランスフェクトされる。

前記の抗体重鎖、プレ－重鎖、軽鎖及びプレ－軽鎖バリアントのＮ末端に付加されたタンパク質配列は、組換え抗体トラスツズマブについてここで例証されるが、一般に、任意の組換え抗体に適用できる。トラスツズマブ及びそのバリアントをコードするＤＮＡ配列は、米国特許第5,821,337号（名称「Immunoglobulin Variants」、参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載されるように、その重及び軽鎖並びにその誘導されたバリアントのためにＤＮＡベクターを同時トランスフェクトすることによって哺乳動物細胞において構築及び発現されてもよい。野生型トラスツズマブ軽及び重鎖のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号２４７及び配列番号２４８に示される。

Ｎ末端システイン残基を有するトラスツズマブ軽鎖及びそのプレ－Ｆｃキメラポリペプチドの適した例は、配列番号２４９から配列番号２８４に示されている。Ｎ末端システイン残基を有するトラスツズマブ重鎖及びそのプレ－Ｆｃキメラポリペプチドの適した例は、配列番号２８５から配列番号３２０に示されている。

Ｎ末端配列Ｃ、ＣＰ、ＣＰＰ、ＣＰＲ、ＣＰＳ、ＣＤＫＴ、ＣＤＫＴＨＴ、ＣＶＥ及びＣＤＴＰＰＰを有するトラスツズマブ軽鎖は、それぞれ配列番号２４９、配列番号２５３、配列番号２５７、配列番号２６１、配列番号２６５、配列番号２６９、配列番号２７３、配列番号２７７及び配列番号２８１に示されている。配列番号２４９の軽鎖は、配列番号２５０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２５１（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２５２（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２５３の軽鎖は、配列番号２５４（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２５５（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２５６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２５７の軽鎖は、配列番号２５８（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２５９（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２６０（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２６１の軽鎖は、配列番号２６２（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２６３（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２６４（ＣＥＴＰシグナルペプチド）において示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２６５の軽鎖は、配列番号２６６（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２６７（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２６８（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２６９の軽鎖は、配列番号２７０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２７１（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２７２（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２７３の軽鎖は、配列番号２７４（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２７５（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２７６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２７７の軽鎖は、配列番号２７８（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２７９（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２８０（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２８１の軽鎖は、配列番号２８２（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２８３（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２８４（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－軽鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。

Ｎ末端配列Ｃ、ＣＰ、ＣＰＰ、ＣＰＲ、ＣＰＳ、ＣＤＫＴ、ＣＤＫＴＨＴ、ＣＶＥ及びＣＤＴＰＰＰを有するトラスツズマブ重鎖は、それぞれ配列番号２８５、配列番号２８９、配列番号２９３、配列番号２９７、配列番号３０１、配列番号３０５、配列番号３０９、配列番号３１３及び配列番号３１７に示される。配列番号２８５の重鎖は、配列番号２８６（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２８７（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２８８（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２８９の重鎖は、配列番号２９０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２９１（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２９２（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号２９３の重鎖は、配列番号２９４（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２９５（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号２９６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドから得られる。配列番号２９７の重鎖は、配列番号２９８（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号２９９（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号３００（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドから得られる。配列番号３０１の重鎖は、配列番号３０２（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号３０３（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号３０４（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号３０５の重鎖は、配列番号３０６（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号３０７（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号３０８（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドを発現させることによって得られる。配列番号３０９の重鎖は、配列番号３１０（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号３１１（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号３１２（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドから得られる。配列番号３１３の重鎖は、配列番号３１４（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号３１５（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号３１６（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドから得られる。配列番号３１７の重鎖は、配列番号３１８（ＳＨＨシグナルペプチド）、配列番号３１９（ＩＦＮシグナルペプチド）及び配列番号３２０（ＣＥＴＰシグナルペプチド）に示されるプレ－重鎖キメラポリペプチドから得られる。

適した宿主細胞には、American Type Culture Collection（Rockville, Md）から得られる２９３ヒト胚細胞（ATCC CRL-1573）及びＣＨＯ－Ｋ１ハムスター卵巣細胞（ATCC CCL-61）が含まれる。細胞は、空気、９５％、二酸化炭素、５％の雰囲気中、３７ＯＣで増殖させる。２９３細胞は、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、０．１ｍＭの非必須アミノ酸及び１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、９０％；ウシ胎児血清、１０％を含有するように調整された、２ｍＭ Ｌ－グルタミン及びEarleのＢＳＳを有する最小必須培地（Eagle）中で維持する。ＣＨＯ－Ｋ１細胞は、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、９０％；ウシ胎児血清、１０％を含有するよう調整された、２ｍＭ Ｌ－グルタミンを有するＨａｍのＦ１２Ｋ培地で維持する。他の適した宿主細胞として、ＣＶ１サル腎臓細胞（ATCC CCL-70）、ＣＯＳ－７サル腎臓細胞（ATCC CRL-1651）、ＶＥＲＯ－７６サル腎臓細胞（ATCC CRL-1587）、ＨＥＬＡヒト子宮頸部細胞（ATCC CCL-2）、Ｗ１３８ヒト肺細胞（ATCC CCL-75）、ＭＤＣＫイヌ腎臓細胞（ATCC CCL-34）、ＢＲＬ３Ａラット肝臓細胞（ATCC CRL-1442）、ＢＨＫハムスター腎臓細胞（ATCC CCL-10）、ＭＭＴ０６０５６２マウス乳腺細胞（ATCC CCL-51）及びヒトＣＤ８^＋ Ｔリンパ球が挙げられる（米国出願第08/258,152号に記載（その全体が参照によりこの明細書に組み込まれる））。

適した発現ベクターの例は、配列番号２１６に示されるｐＣＤＮＡ３．１（＋）及び配列番号２１７に示されるｐＳＡである。プラスミドｐＳＡは、以下のＤＮＡ配列エレメント：１）ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩＫＳ（＋）（ヌクレオチド９１２－２９４１／１－６１９、GenBankアクセッション番号X52327）、２）ヒトサイトメガロウイルスプロモーター、エンハンサー及び第１のエクソンスプライスドナー（ヌクレオチド６３－９１２、GenBankアクセッション番号K03104）、３）ヒトα１－グロビン第２のエクソンスプライスアクセプター（ヌクレオチド６８０８－６９１９、GenBankアクセッション番号J00153）、４）ＳＶ４０Ｔ抗原ポリアデニル化部位（ヌクレオチド２７７０－２５３３、Reddy et al. (1978) Science 200, 494-502）及び５）ＳＶ４０複製起点（ヌクレオチド５７２５－５５７８、Reddy et al., ibid）を含む。他の適した発現ベクターとして、プラスミドｐＳＶｅＣＤ４ＤＨＦＲ及びｐＲＫＣＤ４（米国特許第5,336,603号）、プラスミドｐＩＫ．１．１（米国特許第5,359,046号）、プラスミドｐＶＬ－２（米国特許第5,838,464号）、プラスミドｐＲＴ４３．２Ｆ３（米国出願第08/258,15号に記載（その全体が参照によりこの明細書に組み込まれる））が挙げられる。

ヒトＩｇＧプレ－Ｆｃポリペプチドの適した発現ベクターは、配列番号２１７から製造したＨｉｎｄＩＩＩ－ＰｓｐＯＭ１ベクター断片の、配列番号１２３、１２５、１２７、１３１、１３３、１３５、１３９、１４１、１４３、１４７、１４９、１５１、１５５、１５７、１５９、１６３、１６５、１６７、１７１、１７３、１７５、１７９、１８１、１８３、１８７、１８９、１９１、１９５、１９７、１９９、２０３、２０５、２０７、２１１、２１３及び２１５から製造したＨｉｎｄＩＩＩ－ＥａｇＩ挿入断片とのライゲーションによって構築されてもよい。

適した選択マーカーとして、Ｔｎ５トランスポゾンネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ＮＥＯ）遺伝子（Southern and Berg (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1, 327-341）及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）ｃＤＮＡ（Lucas et al. (1996) Nucl. Acids Res. 24, 1774-1779）が挙げられる。ＮＥＯ遺伝子を組み込む適した発現ベクターの一例は、配列番号２１８をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを用いて消化することで製造した第１のＤＮＡ断片を、配列番号２１７をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを用いて消化することで製造した第２のＤＮＡ断片をライゲーションすることによって構築されるプラスミドｐＳＡ－ＮＥＯである。配列番号２１８は、翻訳開始のための配列によって進行され、ＮＥＯ遺伝子（ヌクレオチド１５５１～２３４５、Genbank Accession No. U00004）を組み込む（Kozak (1991) J. Biol. Chem, 266, 19867-19870）。ＮＥＯ遺伝子及びＤＨＦＲ ｃＤＮＡを組み込む適した発現ベクターの別の例は、配列番号２１８をＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを用いて消化することで製造した第１のＤＮＡ断片を、ｐＳＶｅＣＤ４ＤＨＦＲをＥｃｏＲＩ及びＢｇｌＩＩを用いて消化することで製造した第２のＤＮＡ断片とライゲーションすることによって構築されるプラスミドｐＳＶｅ－ＮＥＯ－ＤＨＦＲである。プラスミドｐＳＶｅ－ＮＥＯ－ＤＨＦＲは、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用して、ＮＥＯ遺伝子及びＤＨＦＲ ｃＤＮＡの発現を駆動する。他の適した選択マーカーとして、ＸＰＧＴ遺伝子（Mulligan and Berg (1980) Science 209, 1422-1427）及びハイグロマイシン耐性遺伝子（Sugden et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5, 410-413）が挙げられる。

一態様では、細胞にGraham et al. (1977) J. Gen. Virol. 36, 59-74のリン酸カルシウム法によってトランスフェクトする。ＤＮＡ混合物（１０μｇ）を、０．５ｍｌの１ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ及び２２７ｍＭ ＣａＣｌ２に溶解する。ＤＮＡ混合物は、（１０：１：１の比で）発現ベクターＤＮＡ、選択マーカーＤＮＡ及びＶＡ ＲＮＡ遺伝子をコードするＤＮＡを含有する（Thimmappaya et al. (1982) Cell 31, 543-551）。この混合物に、０．５ｍＬの５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ及び１．５ｍＭ ＮａＰＯ４を滴加する。ＤＮＡ沈殿物を２５℃で１０分間形成させ、次いで、懸濁し、１００ｍｍのプラスチック組織培養ディッシュでコンフルエントに増殖させた細胞に添加する。３７℃で４時間後、培養培地を吸引し、２ｍｌのＰＢＳ中の２０％グリセロールを添加し０．５分間おく。次いで、細胞を血清不含培地で洗浄し、新鮮培養培地を添加し、細胞を５日間インキュベートする。

別の態様では、細胞に、Somparyrac et al. (1981) Proc. Nat. Acad. Sci. 12, 7575-7579の硫酸デキストラン法によって一過性にトランスフェクトする。細胞を、スピナーフラスコにおいて最大密度に増殖させ、遠心分離によって濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。細胞ペレット上でＤＮＡ－デキストラン沈殿物をインキュベートする。３７℃で４時間後、ＤＥＡＥ－デキストランを吸引し、ＰＢＳ中の２０％グリセロールを添加し１．５分間おく。次いで、細胞を血清不含培地で洗浄し、５μｇ／ｍｌのウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌのウシトランスフェリング（transferring）を有する新鮮培養培地を含有するスピナーフラスコ中に再度入れ、４日間インキュベートする。

いずれかの方法によるトランスフェクション後、条件付けされた培地を遠心分離し、濾過して、宿主細胞及び細片を除去する。次いで、Ｆｃドメインを含有していた試料を、任意の選択された方法、例えば、透析及び／又はカラムクロマトグラフィー（以下を参照されたい）によって濃縮及び精製する。細胞培養上清においてＦｃドメインを同定するために、培養培地をトランスフェクションの２４～９６時間後に回収し、濃縮し、還元剤、例えば、ジチオトレイトールの存在下及び非存在下でＳＤＳ－ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）によって分析する。

未増幅発現のために、高効率手順（Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3 10 (1990)）を使用してプラスミドをヒト２９３細胞（Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 74 (1977)）中にトランスフェクトする。培地を血清不含に変更し、最大５日間ごと日回収する。未増幅発現のために、高効率手順（Gorman et al., DNA Prot. Eng. Tech. 2:3 10 (1990)）を使用してプラスミドをヒト２９３細胞（Graham et al., J. Gen. Virol. 36:59 74 (1977)）中にトランスフェクトする。培地を血清不含に変更し、最大５日間ごと日回収する。Ｆｃドメインを、ＨｉＴｒａｐプロテインＡ ＨＰ（Pharmacia）を使用して細胞培養上清から精製する。溶出されたＦｃドメインを、Centricon-30（Amicon）を使用してＰＢＳ中に緩衝剤交換し、０．５ｍｌに濃縮し、４℃でMillex-GV（Millipore）を使用して滅菌濾過する。

Ｆｃ受容体結合性及び／又はエフェクター機能を変化させるＦｃドメインの改変
ある特定の態様では、工学操作されないＦｃドメインと比較して、Ｆｃ受容体に対する結合親和性を変化させ、及び／又はエフェクター機能を変化させるために、Ｆｃドメインが工学操作される。前記改変の態様は、米国特許出願公開第2013/0058937号及び下記のパラグラフに記載されている。

Ｆｃ受容体に対する結合性は、例えば、ＥＬＩＳＡにより、又は標準的な機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ装置（GE Healthcare）、及びＦｃ受容体、例えば組換え発現により取得され得るＦｃ受容体を使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により容易に決定され得る。適したそのような結合アッセイはここに記載されている。あるいは、Ｆｃドメイン又はＦｃ受容体に対するＦｃドメインを含む四面体抗体の結合親和性は、特定のＦｃ受容体を発現することが公知の細胞系、例えばＦｃγＩＩＩａ受容体を発現するＮＫ細胞を使用して評価してもよい。

Ｆｃドメインのエフェクター機能は、当技術分野において公知の方法により測定可能である。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するための適したin vitroアッセイは、国際公開第2006/082515号又はＰＣＴ国際出願第PCT/EP2012/055393号（これらの全体が参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載されている。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞には、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは又は付加的に、目的の分子ＡＤＣＣ活性は、例えば動物モデル、例えばClynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998)において開示される動物モデルを対象にin vivoで評価してもよい。

いくつかの態様では、補体成分、特にＣ１ｑに対するＦｃドメインの結合を変化させる。したがって、エフェクター機能を変化させるようにＦｃドメインが工学操作されるいくつかの態様では、前記エフェクター機能の変化には、ＣＤＣの変化が含まれる。Ｃ１ｑ結合アッセイは、ＦｃドメインはＣ１ｑに結合でき、したがってＣＤＣ活性を有するか判定するのに実施してもよい。例えば、国際公開第2006/029879号及び国際公開第2005/100402号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996)；Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003)及びCragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)を参照）。

Ｆｃバリアント
本発明は、多重特異性、特に二重特異性結合タンパク質、とりわけ多重特異性抗体の生成と関連する。本発明は、製造細胞内で自己会合してヘテロ二量体タンパク質を生成できる、工学操作された又はバリアントＦｃドメインの使用、及びそのようなヘテロ二量体タンパク質を生成及び精製する方法に一般的に立脚する。

さらに、ここに概説するように、追加の機能を付加するために、追加のアミノ酸バリアントを本発明のＦｃドメインに導入してもよい。例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣの増加（例えば、Ｆｃγ受容体に対する結合性の変化）を円滑化し；毒素及び薬物の添加を可能にし（例えば、ＡＤＣの場合）、又はその収率を増加させ、並びにＦｃＲｎに対する結合性を増加させ、及び／又は得られた分子の血清半減期を増加させるために、Ｆｃ領域内アミノ酸変化を加えることができる（一方の単量体又は両者に対して）。ここに更に記載されるように、また当業者により認識されるように、ここに概説されるバリアントのいずれも全て、その他のバリアントと任意かつ独立的に組み合わせることができる。同様に、機能的バリアントの別のカテゴリーは、「Ｆｃγアブレーションバリアント」又は「Ｆｃγ発現停止バリアント」である。これらの態様では、一部の治療用途について、付加的作用機序を回避するために、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ等）の１つ以上、又は全てに対するＦｃドメインの正常な結合を低下させ、又は取り除くことが望ましい。すなわち、例えば、多くの態様において、特に、ＣＤ３に１価として結合し、また他方においては腫瘍抗原（例えば、ＣＤ１９、ｈｅｒ２／ｎｅｕ等）に結合する二重特異性抗体の使用において、ＦｃγＲＩＩＩａ結合性を切除してＡＤＣＣ活性を除去するか又は有意に低下させるのが一般的に望ましい。

更なる機能のための更なるＦｃバリアント
したがって、ＦｃγＲ受容体のうちの１つ以上に対する結合性を変化させるためになし得るいくつかの有用なＦｃ置換が存在する。結合性の増加並びに結合性の低下を引き起こす置換が有用であり得る。例えば、ＦｃγＲＩＩＩａに対する結合性の増加は、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害；ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が標的細胞上の結合している抗体を認識し、その後標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応）の増加を一般的に引き起こすことが公知である。同様に、ＦｃγＲＩＩｂ（阻害受容体）に対する結合性の低下も、状況によってはやはり有益であり得る。本発明において利用価値が見いだされるアミノ酸置換には、米国出願第11/124,620号（特に図４１）、同第11/174,287号、同第11/396,495号、同第11/538,406号（これらの全ては、全体が参照によりこの明細書に明示的に組み込まれる）に掲載の置換、特にそこで開示されるバリアントが含まれる。利用価値が見いだされる特別なバリアントとして、Ｋａｂａｔ位置２３６Ａ、２３９Ｄ、２３９Ｅ、３３２Ｅ、３３２Ｄ、２３９Ｄ／３３２Ｅ、２６７Ｄ、２６７Ｅ、３２８Ｆ、２６７Ｅ／３２８Ｆ、２３６Ａ／３３２Ｅ、２３９Ｄ／３３２Ｅ／３３０Ｙ、２３９Ｄ、３３２Ｅ／３３０Ｌ、２４３Ａ、２４３Ｌ、２６４Ａ、２６４Ｖ、及び２９９Ｔが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

それに加えて、米国出願第12/341,769号（その全体が参照によりこの明細書に組み込まれる）において特に開示されるように、ＦｃＲｎ受容体に対する結合性の増加及び血清半減期の増加において利用価値が見いだされる、４３４Ｓ、４３４Ａ、４２８Ｌ、３０８Ｆ、２５９Ｉ、４２８Ｌ／４３４Ｓ、２５９Ｉ／３０８Ｆ、４３６Ｉ／４２８Ｌ、４３６Ｉ、又はＶ／４３４５、４３６Ｖ／４２８Ｌ、及び２５９Ｉ／３０８Ｆ／４２８Ｌを含む、ただしこれらに限定されない追加のＦｃ置換が存在する。

抗原結合ドメイン
当業者により認識されるように、２つの基本的な種類の抗原結合ドメインが存在し、それらは、抗体及びＴ細胞抗原結合ドメイン（例えば、６つのＣＤＲのセット、又は単一ドメイン抗体の場合、単一ドメインＴ細胞受容体等、３つのＣＤＲを含む）に類似するドメイン、及びそれ以外の、例えばＣＤＲを使用しないで標的と結合する「リガンド結合パートナー」（すなわち、リガンド、又は受容体、酵素若しくは基質、又はその等価物）であり得るドメインである。

Ｆａｂドメイン
多重特異性抗体の生成における難問は、所望の機能分子とは別にさまざまな望ましくない副産物が形成されることである。２つ以上の異なるＦａｂドメインが存在するとき、誤った対形成は、正しくない重鎖が相互に対形成すること、並びに軽鎖が正しくない重鎖カウンターパートと対形成すること、又は軽鎖が望ましくない対を形成することに一般的に起因する。軽鎖の誤対形成問題は特に難問であり、今日まで、単一のアプローチのいずれも、それによって、軽鎖と重鎖との不適切な会合及び／又はその他の副生成物の形成を防止することにおいて一貫性が証明されていない。

軽鎖ポリペプチドがその正しい重鎖カウンターパートと強制的に対形成させる際に、これまでに有用であった１つのアプローチは、キメラ重鎖及び軽鎖を利用する。「可変領域ドメイン交換型ＩｇＧ」又は「インサイドアウト（ｉｏ：inside-out）型抗体」と当初記載されたこのアプローチは、特定のＦａｂドメイン内の重鎖及び軽鎖可変領域の交換を伴う重鎖と軽鎖と間のドメイン内クロスオーバーに基づく（Chan et al, Molecular Immunology 421, 527-538 (2004)）。

このアプローチは、「クロスマブ（CrossMab）技術」としても知られ、重鎖と軽鎖との間に異なるドメインクロスオーバーを設け、これにより異なる特異性の重鎖及び軽鎖に対して異なるドメイン配置を創出するのに使用されてきた。国際公開第2009/080251号、同第2009/080252号、同第2009/080253号、同第2009/080254号は、そのようなドメインクロスオーバーを有する二価の二重特異性ＩｇＧ抗体に関する。国際公開第2010/145792号及び同第2010/145792号は、そのようなドメインクロスオーバーを有する四価抗原結合タンパク質に関する。１つの結合アーム内にそのようなドメイン交換を有する多重特異性抗体（クロスマブＶＨ－ＶＬ）は、国際公開第2009/080252号及びSchaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191（これらの引用の全てはその全体が参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載されている。

可変領域のドメイン交換は、副生成物を一般的に低下させるものの、第１の抗原に対する軽鎖と正しくない第２の抗原に対する重鎖とのミスマッチに起因して、それを除去するものではない。それに加えて、生成物は、その他の副産物を完全に含まないとは限らない。主要な副産物は、Bence-Jonesタイプの相互作用に基づく（Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191；補遺の図Ｓ１Ｉ、参照）。

そのような多重特異性抗体の収率を改善するための副産物及び関連する凝集挙動の更なる低下が、ＶＨ及びＣＬドメイン並びにＣＨ１及びＣＬドメイン内の特定のアミノ酸位置において、反対電荷を有する荷電アミノ酸の置換を導入することにより促進される。得られた「電荷対」の改変は静電ステアリング効果に関与し、その効果は、軽鎖がその正しい重鎖と正しく対形成するように支援する際に、可変領域ドメイン交換の効果に対して補足的である。

そのような電荷対の構成要素として、本発明において利用価値が見いだされるアミノ酸置換には、Kannan et al（国際公開第2014//081955号）、Shaefer et al（国際公開第2015/150447号）、Ast et al（国際公開第2016/020309号）及びCarter et al（国際公開第2016/172485号）（参照によりその全体がこの明細書に組み込まれる）に記載されているアミノ酸置換が含まれる。利用価値が見いだされる好ましいバリアントとして、カッパ及びラムダ軽鎖定常領域内のＥＵ位置Ｅ１２３、Ｑ１２４、及びＶ１３３、重鎖定常領域内のＫ１４７、Ｓ１８３、及びＫ２１３、軽鎖可変領域内のＱ３８、並びに重鎖可変領域内のＱ３９が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。アミノ酸置換の具体例として、軽鎖定常領域内のＫ、Ｒ又はＨによる１２３又は１２４位における置換、重鎖定常領域内のＥ又はＤによる１４７又は２１３位における置換、軽鎖定常領域内のＫ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、又はＤによる１３３位における置換、重鎖定常領域内のＫ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、又はＤによる１８３位における置換、軽鎖可変領域内のＫ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、又はＤによる３８位における置換、及び重鎖可変領域内のＫ、Ｒ、Ｈ、Ｅ、又はＤによる３９位における置換が挙げられるが、ただしこれらに限定されない。

本発明は、２種類の重鎖及び２種類の軽鎖を含む四面体抗体を提供する。そのような抗体では、第３及び第４のドメインが１つ以上の電荷対を含んでもよい一方、第５及び第６のドメインは「クロスマブ」である。反対に、第３及び第４のドメインが「クロスマブ」であってもよい一方、第５及び第６のドメインは１つ以上の電荷対を含む。さらに、第３及び第４のドメインが、「クロスマブ」であってもよく、かつ１つ以上の電荷対を含んでもよい一方、第５及び第６のドメインは、そのような改変のいずれも含まない。反対に、第５及び第６のドメインが「クロスマブ」であってもよく、かつ１つ以上の電荷対を含んでもよい一方、第３及び第４のドメインは、そのような改変のいずれも含まない。いずれの場合にも、そのような改変は、２種類の重鎖とその対応する軽鎖との間の正しい対形成を円滑化する。そのような四面体抗体は、二重特異性及び四価であってもよい。

同様に、本発明は、２種類の重鎖及び２種類の軽鎖を含む八面体抗体を提供する。そのような抗体では、第４、第５、及び第６のドメインは１つ以上の電荷対を含んでもよい一方、第７、第８、及び第９のドメインは「クロスマブ」である。反対に、第４、第５、及び第６のドメインは「クロスマブ」であってもよい一方、第７、第８、及び第９は１つ以上の電荷対を含む。さらに、第４、第５、及び第６のドメインは、「クロスマブ」であってもよく、かつ１つ以上の電荷対を含んでもよい一方、第７、第８、及び第９のドメインは、そのような改変のいずれも含まない。反対に、第７、第８、及び第９のドメインは、「クロスマブ」であってもよく、かつ１つ以上の電荷対を含んでもよい一方、第４、第５、及び第６のドメインは、そのような改変のいずれも含まない。いずれの場合にも、そのような改変は、２種類の重鎖とその対応する軽鎖との間の正しい対形成を円滑化する。そのような抗体は、二重特異性及び八価であってもよい。

細胞外タンパク質
細胞外タンパク質は、とりわけ、多細胞生物の形成、分化、及び維持において重要な役割を演じている。目的のさまざまな細胞内タンパク質の考察は、米国特許第6,723,535号（Ashkenazi et al.、2004年4月20日発行、参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載されている。細胞外タンパク質には、分泌タンパク質及び膜貫通タンパク質の細胞外ドメインが含まれる。

分泌タンパク質
多くの個々の細胞の運命、例えば、増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、他の細胞及び／又は隣接環境から受け取った情報により一般的に支配される。この情報は、多くの場合、分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞傷害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、ひいては多様な細胞受容体又は膜結合型タンパク質によって受け取られ、解釈される。これらの分泌ポリペプチド又はシグナル伝達分子は、細胞分泌経路を通常通過して、細胞外環境内のその作用部位に達する。

分泌タンパク質は、医薬品、診断薬、バイオセンサー、及びバイオリアクターを含むさまざまな工業的用途を有する。現時点で入手可能なほとんどのタンパク質薬物、例えば血栓溶解剤、インターフェロン、インターロイキン、エリスロポエチン、コロニー刺激因子、及びさまざまなその他のサイトカインは分泌型タンパク質である。膜タンパク質であるそれらの受容体も、治療剤又は診断用薬剤としての可能性を秘める。新たな天然分泌タンパク質を同定するために、工業界と学界の両者による努力が払われている。多くの努力は、新規の分泌タンパク質に対するコーディング配列を特定するための哺乳動物組換えＤＮＡライブラリーのスクリーニングに重点が置かれている。スクリーニングの方法及び／技術の例は、文献（例えば、Klein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 93:7108-7113 (1996)；米国特許第5,536,637号参照）に記載されている。

インターロイキン－１５（ＩＬ－１５）は、Ｔ、Ｂ、及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の増殖を刺激し、そしてステム、セントラル、及びエフェクターメモリーＣＤ８ Ｔ細胞を誘発するγサイトカインファミリーのメンバーである。ＩＬ－１５の配列は、Grabstein et al., Science. 1994 May 13;264(5161):965-8に記載されている。ＩＬ－１５の生物学及びその治療的意味合いは、例えば、Steel et al. Trends Pharmacol Sci. 2012 Jan; 33(1): 35-41、Perera et al. Microbes Infect. 2012 March; 14(3): 247-261及びWaldmann et al. Nature Reviews Immunology volume 6, pages 595-601(2006)において議論されている。

膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン
膜結合型タンパク質及び受容体は、とりわけ、多細胞生物の形成、分化、及び維持において重要な役割を演じることができる。多くの個々の細胞の運命、例えば、増殖、遊走、分化、又は他の細胞との相互作用は、他の細胞及び／又は隣接環境から受け取った情報により一般的に支配される。この情報は、多くの場合、分泌ポリペプチド（例えば、分裂促進因子、生存因子、細胞傷害性因子、分化因子、神経ペプチド、及びホルモン）により伝達され、ひいては多様な細胞受容体又は膜結合型タンパク質によって受け取られ、解釈される。そのような膜結合型タンパク質及び細胞受容体として、サイトカイン受容体、受容体キナーゼ、受容体ホスファターゼ、細胞－細胞相互作用に関与する受容体、及び細胞アドヘシン分子、例えばセレクチンやインテグリンが挙げられるが、ただしこれらに限定されない。例えば、細胞増殖及び分化を制御するシグナルの伝達は、さまざまな細胞タンパク質のリン酸化により一部調節される。タンパク質のチロシンキナーゼはそのようなプロセスを触媒する酵素であり、増殖因子受容体としても作用できる。例として、線維芽細胞増殖因子受容体及び神経増殖因子受容体が挙げられる。

膜結合型タンパク質及び受容体分子は、医薬品及び診断用薬剤を含むさまざまな工業的用途を有する。例えば、受容体イムノアドヘシンは、受容体－リガンド相互作用をブロックするための治療剤として利用され得る。膜結合型タンパク質は、関連する受容体／リガンド相互作用の有望なペプチド又は小分子阻害剤をスクリーニングするためにも利用できる。

腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＮＦＲＳＦ）は、システインに富んだ細胞外ドメインを介して腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）に結合する能力によって特徴づけられるサイトカイン受容体のタンパク質スーパーファミリーである。ＴＮＦＲＳＦのメンバーは、Locksley et al., Cell. 2001 Feb 23;104(4):487-501と以下で再現した表に記載されている。Hehlgans et al., Immunology. 2005 May; 115(1): 1-20も参照。

免疫グロブリンスーパーファミリー（ＩｇＳＦ）は、細胞の認識、結合、又は接着プロセスに関与する、細胞表面の可溶性タンパク質からなる大型のタンパク質スーパーファミリーである。ＩｇＳＦは、Natarajan et al. (April 2015) Immunoglobulin Superfamily. In: eLS. John Wiley & Sons, Ltd: Chichesterで議論されている。

アンジオテンシン変換酵素２（ＡＣＥ２）は、肺、動脈、心臓、腎臓、及び腸内細胞の細胞膜に連結した酵素である。ＡＣＥ２は、Donoghue, et al., 2000. Circulation research, 87(5), pp. e1-e9で議論されている。

本発明の細胞外タンパク質は、配列番号８４７～８９０及び９３５～２０３８において提示される。配列番号８９１～９３４及び２０３９～３１４２は、シグナルペプチド（ＳＰ）の配列及びプレタンパク質（ＰＰ）配列も含む細胞外ドメインの配列を提示する。

共有結合
本発明の共有結合は、米国特許出願公開第2017/0008950号（2017年1月12日発行、その内容は参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載されている任意の「非ペプチジル結合」を含むか又はそれからなってもよい。

ペプチドリンカー
ペプチドリンカーは、２つのドメインをリンクさせる連続したアミノ酸のストレッチである。

１つの態様では、ペプチドリンカーの長さは少なくとも５アミノ酸である。１つの態様では、ペプチドリンカーの長さは５～１００アミノ酸である。

１つの態様では、ペプチドリンカーの長さは１０～５０アミノ酸である。

１つの態様では、ペプチドリンカーの長さは２３アミノ酸である。１つの態様では、ドメイン１と二量体化ポリペプチドとを結びつけるペプチドリンカー、及びドメイン２と二量体化ポリペプチドとを結びつけるペプチドリンカーのそれぞれは、長さが２３アミノ酸である。１つの態様では、そのようなペプチドリンカーそれぞれは、長さが２３アミノ酸であり、かつＴＮＦ受容体のストーク領域に由来し、好ましくは、ＴＮＦ受容体はＴＮＦ受容体１Ｂであり、更により好ましくは、ペプチドリンカーは配列番号４４６８で表されるアミノ酸配列からなる。

１つの態様では、ペプチドリンカーは、免疫グロブリンヒンジ領域又はその部分に見いだされる連続したアミノ酸のストレッチである。

１つの態様では、ペプチドリンカーは、配列：
ＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号３２２７）
に見いだされる５～５７個の連続したアミノ酸のストレッチである。

１つの態様では、ペプチドリンカーは、グリシン－セリン又はグリシン－アラニンリンカーである。

１つの態様では、ペプチドリンカーは、
ａ．（ＧｘＳ）ｎ、又は（ＧｘＳ）ｎＧｍ、又は（ＧｘＡ）ｎ、又は（ＧｘＡ）ｎＧｍ
ｂ．ただし、Ｇ＝グリシン、Ｓ＝セリン、Ａ＝アラニン、及び
ｃ．ｘ＝３、ｎ＝２、３、４、５又は６、ｍ＝０、１、２又は３；あるいは
ｄ．ｘ＝４、ｎ＝１、２、３、４又は５、ｍ＝０、１、２又は３
である。

本発明の代表的リンカーは、配列番号３１４３～４６５６に提示される。

ドメイン内の内部ホモ二量体化及び内部ヘテロ二量体化
ヘテロ二量体化を促進するＦｃドメインの改変
本発明は四面体抗体を提供するが、その場合、２つのＮ末端及び２つのＣ末端が存在し、それに追加のドメインがペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して直接連結してもよいように、第１及び第２のドメインそれぞれが２つのポリペプチド鎖を含む。同様に、本発明は八面体抗体を提供するが、その場合、２つのＮ末端及び２つのＣ末端が存在し、それに追加のドメインがペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して直接連結してもよいように、第１、第２、及び第３のドメインそれぞれが２つのポリペプチド鎖を含む。本発明のその他のドメイン（例えば四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７、及び第８のドメイン、並びに八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１、及び第１２のドメイン）も２つのポリペプチド鎖を含んでもよい。

特定の態様では、そのようなドメインは、２つの異なるＦｃドメインサブユニットの会合、すなわち、内部ヘテロ二量体化を促進する改変を含むＦｃドメインである。改変は、第１のＦｃドメインサブユニット及び／又は第２のＦｃドメインサブユニット内に存在してもよい。前記改変の態様は、米国特許出願公開第2013/0058937号に記載されている。

ヒトＩｇＧ Ｆｃドメインの２つのサブユニット間でタンパク質－タンパク質相互作用が最も広範に生ずる部位は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。したがって、１つの態様では、前記改変は、ＦｃドメインのＣＨ３ドメイン内にある。

特定の態様では、前記改変は、いわゆる「ノブ－イントゥ－ホール（knob into hole）」改変であり、Ｆｃドメインの２つのサブユニットの一方の中に「ノブ」改変、及びＦｃドメインの２つのサブユニットの他方の中に「ホール」改変を含む。

ノブ－イントゥ－ホール技術は、例えばU.S. Pat. No. 5,731,168; U.S. Pat. No. 7,695,936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) and Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001)に記載されている。一般的に、方法は、第１のポリペプチドの界面に突起（「ノブ」）を、そして第２のポリペプチドの界面に対応するキャビティー（「ホール」）を導入し、突起がキャビティー内に収まってヘテロ二量体形成の促進及びホモ二量体形成の妨害が可能となるようにすることと関係する。突起は、第１のポリペプチドの界面由来の小さなアミノ酸側鎖をより大きな側鎖（例えば、チロシン又はトリプトファン）に置きかえることにより構築される。突起と同一又は類似サイズのキャビティーが、大きなアミノ酸側鎖をより小さな側鎖（例えば、アラニン又はトレオニン）に置きかえることにより、第２のポリペプチドの界面内に創出される。

したがって、特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のＦｃドメインサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基をより大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置きかえ、これにより第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内に突起（第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内のキャビティー内に配置可能）を生成し、及び第２のＦｃドメインサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、アミノ酸残基をより小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基に置きかえ、これにより第２のサブユニットのＣＨ３ドメイン内にキャビティー（その中に第１のサブユニットのＣＨ３ドメイン内の突起が配置可能）を生成する。

突起及びキャビティーは、例えば部位特異的変異誘発によってポリペプチドをコードする核酸を変化させることにより、又はペプチド合成により形成され得る。

特定の態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、３６６位のトレオニン残基がトリプトファン残基に置きかわり（Ｔ３６６Ｗ）、かつＦｃドメインの第２のサブユニットのＣＨ３ドメインにおいて、４０７位のチロシン残基がバリン残基に置きかわる（Ｙ４０７Ｖ）。１つの態様では、Ｆｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に３６６位のトレオニン残基がセリン残基に置きかわり（Ｔ３６６Ｓ）、かつ３６８位のロイシン残基がアラニン残基に置きかわる（Ｌ３６８Ａ）。なおもさらなる態様では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットにおいて、更に３５４位のセリン残基がシステイン残基に置きかわり（Ｓ３５４Ｃ）、かつＦｃドメインの第２のサブユニットにおいて、更に３４９位のチロシン残基が、システイン残基に置きかわる（Ｙ３４９Ｃ）。これら２つのシステイン残基を導入することで、その結果Ｆｃドメインの２つのサブユニットの間にジスルフィド架橋が形成され、二量体が更に安定化する（Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)）。

代替的態様では、Ｆｃドメインの第１及び第２のサブユニットの会合を促進する改変は、例えば、国際公開第2009/089004号に記載されるような、静電ステアリング効果に関与する改変を含む。一般的に、この方法は、ホモ二量体の形成が静電的に不都合となるが、ヘテロ二量体化は静電的に好都合となるように、２つのＦｃドメインサブユニットの界面において、１つ以上のアミノ酸残基を、荷電アミノ酸残基に置きかえることと関係する。

実例は、例えば、米国特許出願公開第2003/0078385号（Arathoon et al.－Genentech：；ノブ－イントゥ－ホールについて記載）；国際公開第2007/147901号（(Kjaegaard et al.－Novo Nordisk：イオン相互作用について説明）；国際公開第2009/089004号（Kannan et al.－Amgen：静電ステアリング効果について記載）；米国仮特許出願第61/243,105号（Christensen et al.－Genentech；コイルドコイルについて記載）に含まれるが、これらに限定されるものではない。
特定の態様では、本発明の四面体抗体のドメイン１及び２、又は本発明の八面体抗体のドメイン１、２、及び３は、それらの各Ｆｃドメインサブユニットの内部ヘテロ二量体化を促進する改変の異なる組合せを含む、２又は３つの異なるヘテロ二量体Ｆｃドメインである。異なるＦｃヘテロ二量体の選好的集合を促進するのに使用可能である、抗体重鎖定常領域内の変異の異なる組合せの実例には、例えば米国出願第11/533,709号、同第13/494,870号、同第12/875,015号、同第13/289,934号、同第14/773418号、同第12/811,207号、同第13/866,756号、同第14/647,480号及び同第14/830,336号が含まれるが、これらには限定されない。例えば、変異は、ヒトＩｇＧ１、並びに第１のポリペプチド及び第２のポリペプチド内に、これら２つの鎖が相互に選択的にヘテロ二量体化するのを可能にするアミノ酸置換の異なる対を組み込むことに基づき、ＣＨ３ドメイン内に形成可能である。下記で例証されるアミノ酸置換の位置は、いずれもＫａｂａｔに倣いＥＵインデックスに従い番号付けされている。

例えば、１つ以上の変異が、ヒトＩｇＧ１定常領域と比較して、例えばＱ３４７、Ｙ３４９、Ｌ３５１、Ｓ３５４、Ｅ３５６、Ｅ３５７、Ｋ３６０、Ｑ３６２、Ｓ３６４、Ｔ３６６、Ｌ３６８、Ｋ３７０、Ｎ３９０、Ｋ３９２、Ｔ３９４、Ｄ３９９、Ｓ４００、Ｄ４０１、Ｆ４０５、Ｙ４０７、Ｋ４０９、Ｔ４１１、及び／又はＫ４３９において、定常領域に組込み可能である。代表的置換には、例えば、Ｑ３４７Ｅ、Ｑ３４７Ｒ、Ｙ３４９Ｓ、Ｙ３４９Ｋ、Ｙ３４９Ｔ、Ｙ３４９Ｄ、Ｙ３４９Ｅ、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３５０Ｖ、Ｌ３５１Ｋ、Ｌ３５１Ｄ、Ｌ３５１Ｙ、Ｓ３５４Ｃ、Ｅ３５６Ｋ、Ｅ３５７Ｑ、Ｅ３５７Ｌ、Ｅ３５７Ｗ、Ｋ３６０Ｅ、Ｋ３６０Ｗ、Ｑ３６２Ｅ、Ｓ３６４Ｋ、Ｓ３６４Ｅ、Ｓ３６４Ｈ、Ｓ３６４Ｄ、Ｔ３６６Ｖ、Ｔ３６６Ｉ、Ｔ３６６Ｌ、Ｔ３６６Ｍ、Ｔ３６６Ｋ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ｅ、Ｌ３６８Ａ、Ｌ３６８Ｄ、Ｋ３７０Ｓ、Ｎ３９０Ｄ、Ｎ３９０Ｅ、Ｋ３９２Ｌ、Ｋ３９２Ｍ、Ｋ３９２Ｖ、Ｋ３９２Ｆ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｔ３９４Ｆ、Ｔ３９４Ｗ、Ｄ３９９Ｒ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｖ、Ｓ４００Ｋ、Ｓ４００Ｒ、Ｄ４０１Ｋ、Ｆ４０５Ａ、Ｆ４０５Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｙ４０７Ｉ、Ｙ４０７Ｖ、Ｋ４０９Ｆ、Ｋ４０９Ｗ、Ｋ４０９Ｄ、Ｔ４１１Ｄ、Ｔ４１１Ｅ、Ｋ４３９Ｄ、およびＫ４３９Ｅが含まれる。

あるいは、アミノ酸置換は以下の表に示す置換の組合せから選択され得る：

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換が、下記の表Ｃ－５に示す置換の組合せから選択され得るが、ただし第１のポリペプチドの欄に表示する位置（複数可）は、公知の負に荷電したアミノ酸のいずれかに置きかわっており、かつ第２のポリペプチドの欄に表示する位置（複数可）は、公知の正に荷電したアミノ酸のいずれかに置きかわっている。

あるいは、少なくとも１つのアミノ酸置換は、下記の表Ｃ－６に示す組合せから選択され得るが、ただし第１のポリペプチドの欄に表示する位置（複数可）は、公知の正に荷電したアミノ酸のいずれかに置きかわっており、かつ第２のポリペプチドの欄に表示する位置（複数可）は、公知の負に荷電したアミノ酸のいずれかに置きかわっている。

あるいは、アミノ酸置換は下記の表Ｃ－７に示す組合せから選択される。

あるいは又はそれに付加して、ヘテロ多量体タンパク質の構造的安定性は、第１又は第２のポリペプチド鎖のいずれかにＳ３５４Ｃ、及び対向するポリペプチド鎖にＹ３４９Ｃを導入する（それらは２つのポリペプチドの界面内に人工的なジスルフィド架橋を形成する）ことより増加し得る。

ドメイン１とドメイン２との間の外部ホモ二量体化及び外部ヘテロ二量体化
一態様では、ドメイン１とドメイン２と間のホモ二量体化（すなわち、外部ホモ二量体化）は、ホモ二量体化する第１及び第２の二量体化ポリペプチドの使用により達成される。ホモ二量体化ドメインの１つの例は、ＡＣＥ２コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）である。

一態様では、ドメイン１とドメイン２との間のヘテロ二量体化（すなわち、外部ヘテロ二量体化）は、ホモ二量体よりもヘテロ二量体の形成に利する第１及び第２の二量体化ポリペプチドの使用により達成される。ホモ二量体よりもヘテロ二量体形成に対して強い選好性を有する任意の非免疫グロブリン二量体化ポリペプチドは、本発明の範囲内にある。

二量体化ポリペプチド
ロイシンジッパードメイン
ロイシンジッパーは当技術分野において周知されている（例えば、Hakoshima; Encyclopedia of Life Sciences; 2005参照）。ロイシンジッパーは、二量体化ドメインとして機能し得るスーパー二次構造である。それが存在することで、平行アルファヘリックス内に接着力が生じる。単一のロイシンジッパーは、一方の側面に沿って延在する疎水性領域と共に両親媒性アルファヘリックスを形成する、およそ７残基間隔の複数のロイシン残基からなる。この疎水性領域は二量体化するためのエリアを提供し、モチーフが共に「ジッパー開閉（zip）」するのを可能にする。ロイシンジッパーの長さは、一般的に２０～４０アミノ酸、例えばおよそ３０アミノ酸である。Pack, P. & Plueckthun, A., Biochemistry 31, 1579-1584 (1992)も参照。
ロイシンジッパードメインは、例えば、ヘテロ二量体の形成はヘリックスのホモ二量体形成よりも有利であるというようであってもよい。ロイシンジッパーは、合成であってもまた天然であってもよい。合成ロイシンは、きわめてより高い結合親和性を有するように設計され得る。あるいは、天然に存在するロイシンジッパー又は類似した結合親和性を有するロイシンジッパーを使用してもよい。ｃ－ｊｕｎ及びｃ－ｆｏｓタンパク質由来のロイシンジッパーは、ロイシンジッパーの一例である。その他のロイシンジッパーには、ｍｙｃ及びｍａｘタンパク質由来のものが含まれる（Amati, B., S. Dalton, et al. (1992). Nature 359(6394): 423-6）。適した特性を有するその他のロイシンジッパーを、例えばO'Shea, E. K., Lumb, K. J. and Kim, P. S. (1993) Curr. Biol. 3: 658-667に記載のように設計してもよい。ｃ－ｊｕｎ（α鎖）及びｃ－ｆｏｓ（β鎖）由来のロイシンジッパーについて説明するO'Shea, E. K., Rutkowski, R., et al. (1989) Science 245: 646-648及びO'Shea, E. K., R. Rutkowski, et al. (1992). Cell 68(4): 699-708も参照。

米国特許出願公開第2002/0119149号（Jakobsen）で説明のとおり、ロイシンジッパーは、当業者により、ホモ二量体、ヘテロ二量体、又は三量体複合体を形成するように設計及び工学操作され得る。Lumb, K. J. and P. S. Kim (1995). Biochemistry 34(27): 8642-8；Nautiyal, S., D. N. Woolfson, et al. (1995). Biochemistry 34(37): 11645-51；Boice, J. A., G. R. Dieckmann, et al. (1996). Biochemistry 35(46): 14480-5及びChao, H., M. E. Houston, Jr., et al. (1996). Biochemistry 35(37): 12175-85を参照。

コレクトリン様ドメイン
完全長ＡＣＥ２は、Ｎ末端ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）、並びに単一の膜貫通ヘリックス及び約４０残基の細胞内セグメントで終わるＣ末端コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）からなる。ＣＬＤ（ＡＣＥ２の残基６１６～７６８）は、小さな細胞外ドメイン、長いリンカー、及び単一の膜貫通（ＴＭ）ヘリックスからなる。ＣＬＤは、ＡＣＥ２の二量体化の一次メディエーターであるＡＣＥ２の「頸部ドメイン」（残基６１６～７２６）を含む（Yan et al., Science 367, 1444-1448 (2020））。

コレクトリンドメイン
コレクトリンはＡＣＥ２のホモログであり、また腎臓の集合管内で特異的に発現している膜貫通型糖タンパク質である。ＡＣＥ２ ＣＬＤに対するその相同性に基づき、コレクトリンドメインはホモ二量体形成能力を有し得るものと期待される（Zhang et al. J Biol. Chem. Vol. 276, No. 20, Issue of May 18, pp. 17132-17139, 2001）。

三量体化ドメイン
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバー
ＴＮＦリガンドスーパーファミリーのメンバーは、本発明の三量体化ドメインとして使用してもよい。それらは、Locksley et al., Cell. 2001 Feb 23;104(4):487-501及び以下で再現した表に記載されている。

本発明の三量体化ポリペプチドの適した例は、ＴＮＦＳＦ１（UniProtKB TNFB_HUMAN、GenBankアクセッション番号P01374）、ＴＮＦＳＦ２（UniProtKB TNFA_HUMAN、GenBankアクセッション番号P01375）、ＴＮＦＳＦ３（UniProtKB TNFC_HUMAN、GenBankアクセッション番号Q06643）、ＴＮＦＳＦ４（UniProtKB TNFL4_HUMAN、GenBankアクセッション番号P23510）、ＴＮＦＳＦ５（UniProtKB CD40L_HUMAN、GenBankアクセッション番号P29965）、ＴＮＦＳＦ６（UniProtKB TNFL6_HUMAN、GenBankアクセッション番号P48023）、ＴＮＦＳＦ７（UniProtKB CD70_HUMAN、GenBankアクセッション番号P32970）、ＴＮＦＳＦ８（UniProtKB TNFL8_HUMAN、GenBankアクセッション番号P32971）、ＴＮＦＳＦ９（UniProtKB TNFL9_HUMAN、GenBankアクセッション番号P41273）、ＴＮＦＳＦ１０（UniProtKB TNF10_HUMAN、GenBankアクセッション番号P50591）、ＴＮＦＳＦ１１（UniProtKB TNF11_HUMAN、GenBankアクセッション番号O14788）、ＴＮＦＳＦ１２（UniProtKB TNF12_HUMAN、GenBankアクセッション番号O43508）、ＴＮＦＳＦ１３（UniProtKB TNF13_HUMAN、GenBankアクセッション番号O75888）、ＴＮＦＳＦ１３Ｂ（UniProtKB TN13B_HUMAN、GenBankアクセッション番号Q9Y275）、ＴＮＦＳＦ１４（UniProtKB TNF14_HUMAN; GenBankアクセッション番号O43557）、ＴＮＦＳＦ１５（UniProtKB TNF15_HUMAN、GenBankアクセッション番号O95150）及びＴＮＦＳＦ１８（UniProtKB TNF18_HUMAN；GenBankアクセッション番号Q9UNG2）の完全な細胞外領域又はその一部分である。

好ましい三量体化ポリペプチドを配列番号７８７～７９０（ＴＮＦＳＦ１）、配列番号７９１～７９２（ＴＮＦＳＦ２）、配列番号７９３～７９５（ＴＮＦＳＦ３）、配列番号７９６～７９８（ＴＮＦＳＦ４）、配列番号７９９～８０２（ＴＮＦＳＦ５）、配列番号８０３～８０６、配列番号８０７～８０９（ＴＮＦＳＦ７）、配列番号８１０～８１３（ＴＮＦＳＦ８）、配列番号８１４～８１６（ＴＮＦＳＦ９）、配列番号８１７～８２０（ＴＮＦＳＦ１０）、配列番号８２１～８２２（ＴＮＦＳＦ１１）、配列番号８２３～８２７（ＴＮＦＳＦ１２）、配列番号８２８～８３１（ＴＮＦＳＦ１３）、配列番号８３２～８３３（ＴＮＦＳＦ１３Ｂ）、配列番号８３４～８３７（ＴＮＦＳＦ１４）、配列番号８３８～８４１（ＴＮＦＳＦ１５）及び配列番号８４２～８４３（ＴＮＦＳＦ１８）に示す。

キット
本発明の別の側面は、ここに開示される化合物及びそのような化合物を含む医薬組成物を含むキットを提供する。キットは、化合物又は医薬組成物に付加して、診断用薬剤又は治療剤を含んでもよい。キットは、診断又は治療方法における使用説明書も含んでもよい。診断的な態様では、キットは、化合物又はその医薬組成物、及び診断用薬剤を含む。治療的な態様では、キットは、抗体又はその医薬組成物、及び１つ以上の治療剤、例えば追加の抗新生物薬、抗腫瘍薬、又は化学療法剤を含む。

一般的な技法
以下の記載は主に、コード核酸を含有するベクターで形質転換された、又はこれをトランスフェクトされた細胞を培養することによる、目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチの生成に関する。当然ながら、当技術分野において周知の代替的な方法を利用してもよいことが想定される。例えば、アミノ酸配列又はその一部分を、固相技法を使用する直接ペプチド合成によって生成してもよい（例えば、Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, Calif. (1969)；Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照）。手技又は自動化を使用してin vitroタンパク質合成を実施してもよい。例えば、Applied Biosystems Peptide Synthesizer（Foster City, Calif.）を使用して、製造業者の使用説明書を用いて自動化合成を達成してもよい。目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチのさまざまな一部分を別々に化学的に合成し、化学的又は酵素的方法を組み合わせて使用して、目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドの全長ストレッチを生成してもよい。

宿主細胞の選択及び形質転換
宿主細胞の生成のためにここで記載される発現又はクローニングベクターで形質転換し、又は宿主細胞にこれをトランスフェクトし、プロモーターの誘導、形質転換体の選択、又は所望の配列をコードする遺伝子の増幅のために、従来の栄養培地中で適切に培養する。培養条件、例えば培地、温度、ｐＨ等を、当業者は過度の実験を行うことなく選択できる。全体として、細胞培養の生産性を最大化するための原理、プロトコール、及び実用的な技術は、Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991)及びSambrook et al.（前掲）に見いだすことができる。

真核細胞トランスフェクション及び原核細胞形質転換の方法は当業者に公知であり、例えば、ＣａＣｌ_２、ＣａＰＯ_４、リポソーム媒介及び電気穿孔である。使用する宿主細胞に応じて、適切な標準的な技法を使用して形質転換を実施する。原核生物に対しては、Sambrook et al.（前掲）の、塩化カルシウムを利用するカルシウム処理、又は電気穿孔が一般に使用される。Shaw et al., Gene, 23:315 (1983)及び国際公開第89/05859号（1989年7月29日発行）に記載されるように、アグロバクテリウム・ツメファシエンス（Agrobacterium tumefaciens）による感染が、ある特定の植物細胞の形質転換のために使用される。そうした細胞壁を持たない哺乳動物細胞に対しては、Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈殿法を利用できる。哺乳動物細胞宿主系トランスフェクションの一般的な側面は、米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、通常、Van Solingen et al., J. Bact., 130:946(1977)及びHsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って行われる。しかし、例えば核マイクロインジェクション、電気穿孔、インタクトな細胞との細菌プロトプラスト融合、又はポリカチオン、例えば、ポリブレン、ポリオルニチンによる、ＤＮＡを細胞中に導入するための他の方法も使用してもよい。哺乳動物細胞を形質転換するためのさまざまな技法については、Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990)及びMansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)を参照。

ベクター中のＤＮＡをクローニング又は発現させるためのここでの適した宿主細胞としては、原核生物、酵母、又は高等真核細胞が挙げられる。適した原核生物としては、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、例えば大腸菌が挙げられるが、これらに限定されない。さまざまな大腸菌株、例えば大腸菌Ｋ１２株ＭＭ２９４（ATCC 31,446）；大腸菌Ｘ１７７６（ATCC 31,537）；大腸菌株Ｗ３１１０（ATCC 27,325）及びＫ５７７２（ATCC 53,635）が公的に利用可能である。他の適した原核生物宿主細胞としては、腸内細菌科（Enterobacteriaceae）、例えば大腸菌属（Escherichia）、例えば、大腸菌、エンテロバクター属（Enterobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、クレブシエラ属（Klebsiella）、プロテウス属（Proteus）、サルモネラ属（Salmonella）、例えば、ネズミチフス菌（Salmonella typhimurium）、セラチア属（Serratia）、例えば、セラチア・マルセスカンス（Serratia marcescans）、及びシゲラ属（Shigella）、並びに桿菌（Bacilli）、例えば枯草菌（B. subtilis）及びバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）（例えば、旧東ドイツ国経済特許第266,710号（1989年4月12日発行）に開示されているバチルス・リケニフォルミス（B. licheniformis）４１Ｐ）、シュードモナス属（Pseudomonas）、例えば緑膿菌（P. aeruginosa）、及びストレプトマイセス属（Streptomyces）が挙げられる。これらの例は限定ではなく例示である。Ｗ３１１０株は、組換えＤＮＡ産物の発酵に対する一般的な宿主株であるので、１つの特に好ましい宿主又は親宿主である。好ましくは、宿主細胞は最小限の量のタンパク質分解酵素を分泌する。例えば、Ｗ３１１０株を改変して、宿主にとって内因性のタンパク質をコードする遺伝子中に遺伝的変異をもたらしてもよく、このような宿主の例としては、完全な遺伝子型ｔｏｎＡを有する、大腸菌Ｗ３１１０株１Ａ２；完全な遺伝子型tonA ptr3を有する、大腸菌Ｗ３１１０株９Ｅ４；完全な遺伝子型tonAptr3phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kan^rを有する、大腸菌Ｗ３１１０株２７Ｃ７（ATCC 55,244）；完全な遺伝子型tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kan^rを有する、大腸菌Ｗ３１１０株３７Ｄ６、非カナマイシン抵抗性degP欠失変異を有する３７Ｄ６株である、大腸菌Ｗ３１１０株４０Ｂ４；及び米国特許第4,946,783号（1990年8月7日発行）に開示された、変異ペリプラズムプロテアーゼを有する大腸菌株が挙げられる。あるいは、in vitroのクローニングの方法、例えば、ＰＣＲ又は他の核酸ポリメラーゼ反応が適する。

原核生物に加え、真核微生物、例えば糸状菌又は酵母が、コードベクターにとって適したクローニング又は発現宿主である。サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）は、一般的に使用される下等真核宿主微生物である。その他としては、分裂酵母（Schizosaccharomyces pombe）（Beach and Nurse, Nature, 290:140 (1981)；欧州特許出願公開第139,383号（1985年5月2日））；クルイベロマイセス属（Kluyveromyces）宿主（米国特許第4,943,529号；Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)）、例えば、クルイベロマイセス・ラクチス（K. lactis）（ＭＷ９８－８Ｃ、ＣＢＳ６８３、ＣＢＳ４５７４；Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 (1983)）、クルイベロマイセス・フラギリス（K. fragilis）（ATCC 12,424）、クルイベロマイセス・ブルガリクス（K. bulgaricus）（ATCC 16,045）、クルイベロマイセス・ウィッケラミイ（K. wickeramii）（ATCC 24,178）、クルイベロマイセス・ワルチイ（K. waltii）（ATCC 56,500）、クルイベロマイセス・ドロソフィラルム（K. drosophilarum）（ATCC 36,906；Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135 (1990)）、クルイベロマイセス・サーモトレランス（K. thermotolerans）、及びクルイベロマイセス・マルキシアヌス（K. marxianus）；ヤロウイア属（yarrowia）（欧州特許出願公開第402,226号）；ピキア・パストリス（Pichia pastoris）（欧州特許出願公開第183,070号；Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 (1988)）；カンジダ属（Candida）；トリコデルマ・レエシア（Trichoderma reesia）（欧州特許出願公開第244,234号）；アカパンカビ（Neurospora crassa）（Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 (1979)）；シュワニオマイセス属（Schwanniomyces）、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス（Schwanniomyces occidentalis）（欧州特許出願公開第394,538号（1990年10月31日発行））；及び糸状菌、例えば、アカパンカビ属（Neurospora）、アオカビ属（Penicillium）、トリポクラジウム属（Tolypocladium）（国際公開第91/00357号（1991年1月10日発行））、並びにコウジカビ属（Aspergillus）宿主、例えば偽巣性コウジ菌（A. nidulans）（Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 (1983)；Tilburn et al., Gene, 26:205-221 (1983)；Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:1470-1474 (1984)）及びアスペルギルス・ニガー（A. niger）（Kelly and Hynes, EMBO J., 4:475479 (1985)）が挙げられる。メチル栄養酵母がここで適しており、これらとして、ハンゼヌラ属（Hansenula）、カンジダ属（Candida）、クロエケラ属（Kloeckera）、ピキア属（Pichia）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、トルロプシス属（Torulopsis）、及びロドトルラ属（Rhodotorula）からなる属から選択される、メタノールで増殖可能な酵母が挙げられるが、これらに限定されない。このクラスの酵母の例である具体的な種のリストは、C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)に見いだすことができる。

目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのグリコシル化されたストレッチの発現のための適した宿主細胞は、多細胞生物に由来する。植物細胞に加え、無脊椎動物細胞の例として、昆虫細胞、例えばショウジョウバエ属（Drosophila）Ｓ２及びスポドプテラ属（Spodoptera）Ｓｆ９が挙げられる。有用な哺乳動物宿主細胞系の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）及びＣＯＳ細胞が挙げられる。より具体的な例として、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１系（COS-7, ATCC CRL 1651）；ヒト胚性腎臓系（２９３細胞又は懸濁培養での増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／－ＤＨＦＲ（CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)）；マウスセルトリ細胞（TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)）；ヒト肺細胞（W138, ATCC CCL 75）；ヒト肝細胞（Hep G2, HB 8065）；及びマウス乳房腫瘍（MMT 060562, ATCC CCL51）が挙げられる。適切な宿主細胞の選択は当技術分野の技術内にあると考えられる。

複製可能なベクターの選択及び使用
目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチをコードする核酸（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）を、クローニング（ＤＮＡの増幅）又は発現用の複製可能なベクター中に挿入してもよい。さまざまなベクターが公的に利用可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態であってもよい。適切な核酸配列を、多様な手順によってベクター中に挿入できる。一般に、当技術分野において公知の技法を使用してＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ部位中に挿入する。ベクター成分は、シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終了配列のうちの１つ以上を一般に含むが、これらに限定されない。これらの成分のうちの１つ以上を含有する適したベクターの構築に、当業者に公知の標準的なライゲーション技法を利用する。

目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチを、直接のみならず、異種ポリペプチドとの融合ポリペプチドとして生成してもよく、異種ポリペプチドは、シグナル配列又は成熟タンパク質若しくはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドであってもよい。一般に、シグナル配列はベクターの成分であってもよく、ベクター中に挿入されたコードＤＮＡの一部であってもよい。シグナル配列は、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、１ｐｐ、又は熱安定エンテロトキシンＩＩリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってもよい。酵母分泌のために、シグナル配列は、例えば、酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー（サッカロマイセス属（Saccharomyces）及びクルイベロマイセス属（Kluyveromyces）α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている）、又は酸ホスファターゼリーダー、カンジダ・アルビカンス（C. albicans）グルコアミラーゼリーダー（欧州特許出願公開第362,179号（1990年4月4日発行））、又は国際公開第90/13646号（1990年11月15日発行）に記載されたシグナルであってもよい。哺乳動物細胞発現において、哺乳動物シグナル配列を使用して、タンパク質、例えば同種又は近縁種の分泌ポリペプチドに由来するシグナル配列、及びウイルス分泌リーダーの分泌を促してもよい。

発現及びクローニングベクターのいずれもが、ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞中で複製することを可能にする核酸配列を含有する。このような配列は、多様な細菌、酵母及びウイルスについて周知である。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製起点は大半のグラム陰性細菌に適しており、２ｍｕプラスミド起点は酵母に適しており、各種ウイルス起点（ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ）は哺乳動物細胞におけるベクターのクローニングに有用である。

発現及びクローニングベクターは、通常、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含有する。代表的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質若しくは他の毒素、例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセート、又はテトラサイクリンに対する耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性の欠損を補完する、又は（ｃ）複合培地から利用できない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードし、例えば、桿菌（Bacilli）の場合、Ｄ－アラニンラセマーゼをコードする遺伝子である。

哺乳動物細胞にとって適した選択可能マーカーの例は、コード核酸を取り込む能力を持つ細胞の特定を可能にする選択可能マーカー、例えばＤＨＦＲ又はチミジンキナーゼである。野生型ＤＨＦＲを使用した場合の適切な宿主細胞は、Urlaub et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載のとおりに調製され増殖させられる、ＤＨＦＲ活性が欠損したＣＨＯ細胞系である。酵母における使用にとって適した選択遺伝子は、酵母プラスミドＹＲｐ７中に存在するｔｒｐ１遺伝子である（Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979)；Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979)；Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)）。ｔｒｐ１遺伝子は、トリプトファン中で増殖する能力を欠いた酵母の変異株に対する選択マーカー、例えば、ATCC番号44076又はＰＥＰ４－１をもたらす（Jones, Genetics, 85:12 (1977)）。

発現及びクローニングベクターは、通常、コード核酸配列に作動可能に連結した、直接のｍＲＮＡ合成を促すためのプロモーターを含有する。多様な潜在的宿主細胞によって認識されるプロモーターが周知である。原核生物宿主との使用に適するプロモーターとして、β－ラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系（Chang et al., Nature, 275:615 (1978)；Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)）、アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系（Goeddel, Nucleic Acids Res., 8:4057 (1980)；欧州特許出願公開第36,776号）、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーター（deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)）が挙げられる。細菌系における使用のためのプロモーターもまた、コードＤＮＡに作動可能に連結したシャイン・ダルガーノ（Ｓ．Ｄ．）配列を含有する。

酵母宿主との使用にとって適した促進配列の例として、３－ホスホグリセリン酸キナーゼに対するプロモーター（Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)）又は他の糖分解酵素（Hess et al., J. Adv. Enzyme Re.g., 7:149 (1968)；Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)）、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース－６－リン酸イソメラーゼ、３－ホスホグリセリン酸ムターゼ、ピリビン酸キナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが挙げられる。

増殖条件によって制御された転写というさらなる利点を有する誘導性プロモーターである他の酵素プロモーターは、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソシトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド－３－リン酸デヒドロゲナーゼ、並びにマルトース及びガラクトース利用に関与する酵素のためのプロモーター領域である。酵母発現における使用のための適したベクター及びプロモーターは、欧州特許出願公開第73,657号に更に記載されている。

哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの転写は、例えば、ウイルス、例えばポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス（英国特許出願公開第2,211,504号（1989年7月5日発行））、アデノウイルス（例えばアデノウイルス２）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトルウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及びサルウイルス４０（ＳＶ４０）のゲノム、異種哺乳動物プロモーター、例えば、アクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、並びに熱ショックプロモーターから得られるプロモーターによって制御されるが、ただし、当該プロモーターが宿主細胞系と適合していることを条件とする。

高等真核生物による目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチをコードするＤＮＡの転写を、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増加させてもよい。エンハンサーはＤＮＡのシス作用性エレメントであり、通常は約１０～３００ｂｐで、プロモーターに作用してその転写を増加させる。今では多くのエンハンサー配列が哺乳動物遺伝子から知られている（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α－胎児タンパク質、及びインスリン）。しかし、通常、真核細胞ウイルスに由来するエンハンサーが使用される。例として、複製開始点の後方側（ｂｐ１００～２７０）におけるＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後方側におけるポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、コード配列に対して５’又は３’位においてベクター中にスプライシングされてもよいが、好ましくはプロモーターから５’部位に位置する。

真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物に由来する有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終了及びｍＲＮＡの安定化のために必要な配列も含有する。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５’、時には３’の非翻訳領域から一般に得ることができる。これらの領域は、目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写された、ヌクレオチドセグメントを含有する。

組換え脊椎動物細胞培養における連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチの合成への適合に適する更に別の方法、ベクター、及び宿主細胞は、Gething et al., Nature 293:620-625 (1981)；Mantei et al., Nature, 281:4046 (1979)；欧州特許出願公開第117,060号及び同第117,058号に記載されている。

遺伝子増幅／発現の検出
遺伝子増幅及び／又は発現を、試料中において直接、例えば、ここで提供される配列に基づく適切に標識されたプローブを使用して、ｍＲＮＡの転写を定量する従来のサザンブロッティング、ノーザンブロッティング（Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)）、ドットブロッティング（ＤＮＡ分析）、又はインサイチューハイブリダイゼーションによって測定してもよい。あるいは、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ－ＲＮＡハイブリッド二重鎖又はＤＮＡ－タンパク質二重鎖を含む、特定の二重鎖を認識できる抗体を利用してもよい。そしてこの抗体を標識してもよく、二重鎖が表面上に形成されると二重鎖に結合した抗体の存在を検出できるように、二重鎖を表面に結合させるアッセイを行ってもよい。

あるいは、遺伝子発現を、免疫学的方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学染色、及び遺伝子産物の発現を直接定量する細胞培養又は体液のアッセイによって測定してもよい。免疫組織化学染色及び／又は試料流体のアッセイに有用な抗体は、モノクローナルであってもポリクローナルであってもよく、いずれの哺乳動物で製造されてもよい。都合のよいことには、抗体を、目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドの天然配列ストレッチに対して製造してもよく、ここで提供されるＤＮＡ配列に基づく合成ペプチドに対して製造してもよく、目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチをコードするＤＮＡと融合し、特定の抗体エピトープをコードする外因性配列に対して製造してもよい。

ポリペプチドの精製
目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチの形態を、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収してもよい。膜と結合している場合、適した界面活性剤溶液（例えばTriton-X 100）を使用して、又は酵素的切断によってこれを放出させることができる。目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチの発現において利用された細胞を、さまざまな物理的又は化学的手段、例えば凍結－解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤によって破壊できる。

目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドのストレッチを組換え細胞タンパク質又はポリペプチドから精製することが望ましい場合がある。以下の手順は適した精製手順の例である：イオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばＤＥＡＥによるクロマトグラフィー；等電点電気泳動；ＳＤＳ－ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、Sephadex G-75を使用したゲル濾過；夾雑物、例えばＩｇＧを除去するプロテインＡセファロースカラム；及びエピトープタグ付加形態に結合する金属キレート化カラム。タンパク質精製のさまざまな方法を利用でき、このような方法は当技術分野において公知であり、例えば、Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)に記載されている。選択される精製工程は、例えば、使用される生成過程及び生成される目的の連続したアミノ酸又はポリペプチドの個別のストレッチの性質に依存する。

インテインに基づくＣ末端合成
例えば米国特許第6,849,428号（2005年2月1日発行）に記載のとおり、インテインは自己スプライシングＲＮＡイントロンのタンパク質等価物であり（Perler et al., Nucleic Acids Res. 22:1125-1127 (1994)参照）、前駆体タンパク質からの自身の切り出しを触媒し、同時に、エクステインとして知られる隣接しているタンパク質配列と融合する（Perler et al., Curr. Opin. Chem. Biol. 1:292-299 (1997)；Perler, F. B. Cell 92(1):1-4 (1998)；Xu et al., EMBO J. 15(19):5146-5153 (1996)で総説）。

インテインスプライシングの機序の研究が、Ｓｃｅ ＶＭＡインテインのＮ末端におけるペプチド結合のチオール誘導性切断を活用したタンパク質精製系の開発に繋がった（Chong et al., Gene 192(2):271-281 (1997)）。このインテイン媒介系を用いた精製により、Ｃ末端チオエステルを有する細菌発現タンパク質が生じる（Chong et al., (1997)）。細胞傷害性タンパク質を単離すると記載される１つの応用では、その後、「ネイティブケミカルライゲーション」に関して記載される化学反応を使用して、Ｃ末端チオエステルを有する細菌発現タンパク質を、Ｎ末端システインを有する化学合成ペプチドと融合させる（Evans et al., Protein Sci. 7:2256-2264 (1998)；Muir et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:6705-6710 (1998)）。

「インテイン媒介タンパク質ライゲーション」（ＩＰＬ）と称されるこの技法は、タンパク質半合成技法における重要な進歩である。しかし、約１００残基より大きい化学合成ペプチドは得ることが難しいため、ＩＰＬの全般的な適用は、ライゲーションパートナーである化学合成ペプチドが必要であることによって制限されていた。

ＩＰＬ技法は、例えば米国特許第6,849,428号に記載されているように、所定のＮ末端、例えばシステインを有する発現タンパク質が作製された際に著しく発達した。これにより、宿主細胞、例えば細菌、酵母又は哺乳動物細胞に由来する１つ以上の発現タンパク質の融合が可能である。１つの非限定的な例において、Ｃ末端又はＮ末端のいずれかで切断されるメタノバクテリウム・サーモオートトロフィカム（Methanobacterium thermoautotrophicum）の修飾ＲＩＲ１であるインテインが使用され、これにより、ワンカラム精製中における細菌発現タンパク質の放出が可能となり、よって、プロテアーゼの必要性が完全に排除される。

インテイン技法は、成分を得るための一経路の一例である。一態様において、本発明の化合物のサブユニットは、成熟キメラポリペプチドを発現及び分泌可能な適した細胞にトランスフェクトすることによって得られ、このようなポリペプチドは、例えば、単離可能なＣ末端インテインドメインと連続した接着ドメインを含む（米国特許第6,849,428号（Evans et al.、2005年2月1日発行、参照によりこの明細書に組み込まれる）参照）。細胞、例えば哺乳動物細胞又は細菌細胞に、公知の組換えＤＮＡ技法を使用してトランスフェクトする。次いで、例えばインテイン－キチン結合ドメインの場合、キチン誘導体化樹脂を使用して、分泌されたキメラポリペプチドを単離でき（米国特許第6,897,285号（Xu et al.、2005年5月24日発行、参照によりこの明細書に組み込まれる）参照）、次いで、チオール媒介切断及びこの時点ではＣ末端であるチオエステル末端サブユニットの放出を可能にする条件下で処理する。チオエステル末端接着サブユニットは、Ｃ末端システイン末端サブユニットに容易に変換される。

例えば、インテイン自己切断反応後にチオエステル中間体が生じ、システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、ホモセレノシステインの誘導体が天然の化学的ライゲーションによってＣ末端に容易に付加することを可能にする。システイン、セレノシステイン、ホモシステイン、若しくはホモセレノシステイン、又はシステイン、セレノシステイン、ホモシステイン、ホモセレノシステインの誘導体を天然の化学的ライゲーションによってＣ末端に付加する、本発明の側面において有用な方法は、米国特許出願公開第2008/0254512号（Capon、2008年10月16日、その全体の内容は、参照によりこの明細書に組み込まれる）に記載されている。

さまざまな細胞における目的の連続したアミノ酸又はポリペプチド成分のストレッチの発現の例
大腸菌の場合
最初に、所望の目的のアミノ酸配列又はポリペプチドをコードするＤＮＡ配列を、選択されたＰＣＲプライマーを使用して増幅する。プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位を含んでいなければならない。多様な発現ベクターを利用できる。適したベクターの例は、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性のための遺伝子を含有するｐＢＲ３２２（大腸菌に由来；Bolivar et al., Gene, 2:95 (1977)参照）である。ベクターを制限酵素で消化し、脱リン酸化する。次いで、ＰＣＲ増幅した配列をベクター中にライゲーションする。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、ｔｒｐプロモーター、ポリｈｉｓリーダー（最初の６つのＳＴＩＩコドン、ポリｈｉｓ配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む）、目的の特定のアミノ酸配列／ポリペプチドコード領域、ラムダ転写ターミネーター、及びａｒｇＵ遺伝子をコードする配列を含む。

次いで、ライゲーション混合物を使用して、選択された大腸菌株をSambrook et al.（前掲）の方法を用いて形質転換する。形質転換体をＬＢプレート上で増殖する能力によって特定し、次いで、抗生物質耐性コロニーを選択する。プラスミドＤＮＡを単離し、制限分析及びＤＮＡ配列決定によって確認できる。

選択されたクローンを、抗生物質を追加した液体培養培地、例えばＬＢブロス中で終夜増殖させることができる。その後、終夜培養物をより大規模の培養物を接種するために使用してもよい。次いで、細胞を所望の光学濃度となるまで増殖させ、その間、発現プロモーターがオンにされる。

細胞を更に数時間培養した後、細胞を遠心分離によって回収できる。遠心分離によって得られた細胞ペレットを、当技術分野において公知のさまざまな薬剤を使用して可溶化でき、次いで、タンパク質の密な結合を可能にする条件下で金属キレート化カラムを使用して、可溶化された目的のアミノ酸配列又はポリペプチドを精製できる。

プライマーは、選択された発現ベクター上の制限酵素部位に対応する制限酵素部位、並びに効率的で信頼性のある翻訳開始、金属キレート化カラムでの迅速な精製、及びエンテロキナーゼによるタンパク質分解除去をもたらす他の有用な配列を含み得る。ＰＣＲ増幅ポリＨｉｓタグ付加配列を、例えば、５２株（W3110 fuhA(tonA) Ion galE rpoHts(htpRts) clpP(lacIq)）に基づく大腸菌宿主を形質転換させるために使用される発現ベクター中にライゲーションできる。まず、形質転換体を、Ｏ．Ｄ．６００が３～５に達するまで、５０ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含有するＬＢ中で３０℃で振盪しながら増殖させることができる。次いで、培養物をＣ ＲＡＰ培地（５００ｍＬの水中における３．５７ｇの（ＮＨ_４）_２ＳＯ_４、０．７１ｇのクエン酸ナトリウム－２Ｈ_２Ｏ、１．０７ｇのＫＣｌ、５．３６ｇのＤｉｆｃｏ酵母抽出物、５．３６ｇのSheffield hycase SFと、１１０ｍＭ ＭＰＯＳ、ｐＨ７．３、０．５５％（w/v）グルコース及び７ｍＭ ＭｇＳＯ_４とを混合することによって調製）中に５０～１００倍で希釈し、３０℃でおよそ２０～３０時間、振盪しながら増殖させる。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析によって発現を検証するため、試料を取り出し、バルク培養物を遠心分離して細胞をペレット化する。細胞ペレットを精製及びリフォールディングまで凍結させた。

０．５～１Ｌの発酵物（６～１０ｇのペレット）から得た大腸菌ペーストを７Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８緩衝剤中に１０体積（w/v）で再懸濁させた。固体の亜硫酸ナトリウム及びテトラチオン酸ナトリウムを、それぞれ０．１Ｍ及び０．０２Ｍの終濃度となるように添加し、溶液を４℃で終夜撹拌した。この工程により、全てのシステイン残基が亜硫酸エステル化によって遮断された変性タンパク質が生じる。溶液をBeckman Ultracentifugeにおいて４０，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離した。上清を３～５体積の金属キレートカラム緩衝剤（６Ｍグアニジン、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４）で希釈し、０．２２μｍフィルターで濾過して清澄化させた。清澄化された抽出物を、金属キレートカラム緩衝剤で平衡化させた５ミルQiagen Ｎｉ－ＮＴＡ金属キレートカラムにロードした。カラムを５０ｍＭイミダゾール（Calbiochem、Utrolグレード）、ｐＨ７．４を含有するさらなる緩衝剤で洗浄した。タンパク質を２５０ｍＭイミダゾールを含有する緩衝剤で溶出した。所望のタンパク質を含有する画分をプールし、４℃で保存した。タンパク質濃度を、そのアミノ酸配列に基づいて計算された吸光係数を使用して、２８０ｎｍにおける吸光度により推定した。

哺乳動物細胞の場合
この一般例は、所望の目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分のグリコシル化形態の、哺乳動物細胞における組換え発現による調製を例示する。

ｐＲＫ５ベクター（欧州特許出願公開第307,247号（1989年3月15日発行）参照）を発現ベクターとして利用できる。任意に、ライゲーション方法、例えばSambrook et al.（前掲）のものを使用して、ＤＮＡの挿入を可能にする選択された制限酵素により、ｐＲＫ５中にコードＤＮＡをライゲーションする。

一態様において、選択された宿主細胞は２９３細胞であってもよい。ヒト２９３細胞（ATCC CCL 1573）を組織培養プレート中において、ウシ胎児血清並びに任意に栄養成分及び／又は抗生物質を追加した培地、例えばＤＭＥＭ中でコンフルエントになるまで増殖させる。ライゲーションされたベクターＤＮＡ約１０μｇをＶＡ ＲＮＡ遺伝子［Thimmappaya et al., Cell 31:543 (1982)］をコードするＤＮＡ約１μｇと混合し、５００μｌのＩｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、０．１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ ＣａＣｌ_２中に溶解させる。この混合物に、５００μｌの５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．３５）、２８０ｍＭ ＮａＣｌ、１．５ｍＭ ＮａＰＯ_４を滴下添加し、２５℃で１０分間沈殿物を形成させた。沈殿物を懸濁させ、２９３細胞に添加し、３７℃で約４時間沈降させた。培養培地を吸引して除き、２ｍｌのＰＢＳ中２０％グリセロールを添加して３０秒間おく。次いで、２９３細胞を無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約５日間インキュベートする。

トランスフェクションのおよそ２４時間後、培養培地を取り除き、培養培地（単独）又は２００μＣｉ／ｍｌ ^３５Ｓ－システイン及び２００μＣｉ／ｍｌ ^３５Ｓ－メチオニンを含有する培養培地と置きかえる。１２時間のインキュベーション後、馴化培地を採取し、スピンフィルターで濃縮し、１５％ＳＤＳゲル上にロードする。処理されたゲルを乾燥させ、選択された時間の間フィルムに曝露して、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の存在を明らかにしてもよい。トランスフェクトされた細胞を含有する培養物をさらなるインキュベーション（無血清培地中）に供してもよく、培地を選択されたバイオアッセイにおいて試験する。

代替的な技法では、Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12:7575 (1981).によって記載されたデキストラン硫酸法を使用して、目的の核酸アミノ酸配列又はポリペプチド成分を２９３細胞中に一時的に導入してもよい。２９３細胞をスピナーフラスコ中で最大密度まで増殖させ、７００μｇのライゲーションされたベクターを添加する。まず、細胞を遠心分離によってスピナーフラスコから濃縮し、ＰＢＳで洗浄する。ＤＮＡ－デキストラン沈殿物を細胞ペレット上で４時間インキュベートする。細胞を２０％グリセロールで９０秒間処理し、組織培養培地で洗浄し、組織培養培地、５μｇ／ｍｌウシインスリン及び０．１μｇ／ｍｌウシトランスフェリンの入ったスピナーフラスコ中に再導入する。約４日後、馴化培地を遠心分離し、濾過して細胞及び残骸を除去する。次いで、発現された目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含有する試料を、任意の選択された方法、例えば透析及び／又はカラムクロマトグラフィーによって濃縮及び精製する。

別の態様において、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分をＣＨＯ細胞中で発現させることができる。公知の試薬、例えばＣａＰＯ_４又はＤＥＡＥ－デキストランを使用して、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分をＣＨＯ細胞中にトランスフェクトできる。上記のように、細胞培養物をインキュベートし、培地を培養培地（単独）又は放射標識、例えば^３５Ｓ－メチオニンを含有する培地と置きかえることができる。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の存在を決定した後、培養培地を無血清培地と置きかえてもよい。好ましくは、培養物を約６日間インキュベートし、次いで、馴化培地を回収する。次いで、発現された目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含有する培地を、任意の選択された方法によって濃縮及び精製できる。

また、エピトープタグが付加された目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を宿主ＣＨＯ細胞中で発現させてもよい。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分をｐＲＫ５ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物をＰＣＲに供して、選択されたエピトープタグ、例えばポリｈｉｓタグを用いてバキュロウイルス発現ベクター中にインフレームで融合させることができる。次いで、ポリｈｉｓタグが付加された目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の挿入物を、安定なクローンの選択のための選択マーカー、例えばＤＨＦＲを含有するＳＶ４０駆動ベクター中にサブクローニングできる。最後に、ＣＨＯ細胞にＳＶ４０駆動ベクターをトランスフェクトする（上記のように）ことができる。上記のように、発現を検証するために標識を実施してもよい。次いで、発現されたポリＨｉｓタグが付加された目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含有する培養培地を、任意の選択された方法、例えばＮｉ^２＋キレートアフィニティークロマトグラフィーによって濃縮及び精製できる。

ある態様において、目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分をＩｇＧ構築物（イムノアドヘシン）として発現させ、ＩｇＧ構築物中では、各タンパク質の可溶性形態（例えば細胞外ドメイン）に対するコード配列が、ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ２ドメインを含むＩｇＧ１定常領域配列と融合され、並びに／又はポリＨｉｓタグ付加形態である。

ＰＣＲ増幅後、Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, Unit 3.16, John Wiley and Sons (1997)に記載された標準的な技法を使用して、各ＤＮＡをＣＨＯ発現ベクター中でサブクローニングする。目的のＤＮＡの５’及び３’側に、適合する制限部位を有するようにＣＨＯ発現ベクターを構築して、ｃＤＮＡの簡便なシャトリングを可能とする。ＣＨＯ細胞での発現において使用されるベクターはLucas et al., Nucl. Acids Res. 24:9 1774-1779 (1996)に記載のとおりであり、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサーを使用して目的のｃＤＮＡ及びジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の発現を駆動する。ＤＨＦＲ発現は、トランスフェクション後におけるプラスミドの安定な維持のための選択を可能にする。

酵母の場合
以下の方法は、酵母における所望の目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の組換え発現を記載する。

まず、連続したアミノ酸のストレッチの細胞内産生又は分泌のために、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーターから酵母発現ベクターを構築する。所望の目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分、選択されたシグナルペプチド及びプロモーターをコードするＤＮＡを、選択されたプラスミドにおける適した制限酵素部位中に挿入して、直接目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分の細胞内発現を促す。分泌のために、連続したアミノ酸のストレッチをコードするＤＮＡを、ＡＤＨ２／ＧＡＰＤＨプロモーター、酵母α因子分泌シグナル／リーダー配列、及びリンカー配列（必要であれば）をコードするＤＮＡと共に選択されたプラスミド中にクローニングして、連続したアミノ酸のストレッチを発現させることができる。

次いで、酵母細胞、例えば酵母株ＡＢ１１０を上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換された酵母上清を、１０％トリクロロ酢酸を用いた沈殿及びＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分離を行い、その後クーマシーブルー色素によるゲルの染色を行うことによって分析できる。

その後、遠心分離を行い、次いで、選択されたカートリッジフィルターを使用して培地を濃縮することで発酵培地から酵母細胞を除去することにより、目的の組換えアミノ酸配列又はポリペプチド成分を単離及び精製できる。目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を含有する濃縮物を、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を使用して更に精製してもよい。

バキュロウイルス感染昆虫細胞の場合
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞における連続したアミノ酸のストレッチの組換え発現を記載する。

連続したアミノ酸のストレッチをコードする所望の核酸を、バキュロウイルス発現ベクターに含有されるエピトープタグの上流に融合させる。このようなエピトープタグとしては、ポリｈｉｓタグ及び免疫グロブリンタグ（例えばＩｇＧのＦｃ領域）が挙げられる。市販のプラスミド、例えばｐＶＬ１３９３（Novagen）に由来するプラスミドを含む、多様なプラスミドを利用できる。簡潔に述べると、目的のアミノ酸配列若しくはポリペプチド成分又は目的のアミノ酸配列若しくはポリペプチド成分の所望の部分（例えば膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列）を、５’及び３’領域と相補的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅する。５’プライマーは、隣接する（選択された）制限酵素部位を組み込んでもよい。次いで、産物をそれらの選択された制限酵素で消化し、発現ベクター中にサブクローニングする。

リポフェクチン（GIBCO-BRLから市販されている）を使用して上記プラスミド及びBaculoGold（商標）ウイルスＤＮＡ（Pharmingen）をヨトウガ（Spodoptera frugiperda）（「Ｓｆ９」）細胞（ATCC CRL 1711）中にコトランスフェクトすることによって、組換えバキュロウイルスを作製する。２８℃での４～５日間のインキュベーション後、放出されたウイルスを回収し、さらなる増幅のために使用する。ウイルス感染及びタンパク質発現を、O'Reilley et al., Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載のように実施する。

次いで、発現されたポリｈｉｓタグが付加された目的のアミノ酸配列又はポリペプチド成分を、例えば、Ｎｉ^２＋キレートアフィニティークロマトグラフィーによって以下のように精製できる。Rupert et al., Nature, 362:175-179 (1993)によって記載されているように、抽出物を組換えウイルス感染Ｓｆ９細胞から調製する。簡潔に述べると、Ｓｆ９細胞を超音波処理用緩衝剤（２５ｍＬのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．９；１２．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２；０．１ｍＭ ＥＤＴＡ；１０％グリセロール；０．１％ ＮＰ４０；０．４Ｍ ＫＣｌ）中で洗浄し、再懸濁させ、氷上で２回、２０秒間超音波処理する。超音波処理物を遠心分離によって透明化し、上清をローディング用緩衝剤（５０ｍＭホスフェート、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ７．８）で５０倍に希釈し、０．４５μｍフィルターによって濾過する。Ｎｉ^２＋－ＮＴＡアガロースカラム（Qiagenから市販されている）を５ｍＬの床体積で調製し、２５ｍＬの水で洗浄し、２５ｍＬのローディング用緩衝剤で平衡化させる。濾過された細胞抽出物を毎分０．５ｍＬでカラムにロードする。カラムをローディング用緩衝剤でベースラインＡ_２８０まで洗浄し、この時点で画分の採取を開始する。次に、カラムを二次洗浄用緩衝剤（５０ｍＭホスフェート、３００ｍＭ ＮａＣｌ、１０％グリセロール、ｐＨ６．０）で洗浄し、これにより非特異的に結合したタンパク質を溶出する。再びＡ_２８０ベースラインに達した後、カラムを二次洗浄用緩衝剤中０～５００ｍＭイミダゾール勾配で展開する。１ｍＬの画分を採取し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及び銀染色又はＮｉ^２＋－ＮＴＡがコンジュゲートしたアルカリホスファターゼ（Qiagen）を用いたウエスタンブロットによって分析する。溶出されたＨｉｓ_１０タグ付加配列を含有する画分をプールし、ローディング用緩衝剤に対して透析する。

あるいは、ＩｇＧタグ付加（又はＦｃタグ付加）アミノ酸配列の精製を、例えば、プロテインＡ又はプロテインＧカラムクロマトグラフィーを含む公知のクロマトグラフィー技法を使用して実施できる。

タンパク質のＦｃ含有構築物を、以下のように馴化培地から精製できる。馴化培地を、２０ｍＭリン酸Ｎａ緩衝剤、ｐＨ６．８で平衡化した５ｍｌプロテインＡカラム（Pharmacia）上にポンプ送出する。ローディング後、カラムを平衡化用緩衝剤でくまなく洗浄し、その後、１００ｍＭクエン酸、ｐＨ３．５により溶出する。１ｍｌの画分を２７５ｍＬの１Ｍ Ｔｒｉｓ緩衝剤、ｐＨ９の入ったチューブ中に採取することによって、溶出されたタンパク質を即座に中和する。その後、上記のように、ポリＨｉｓタグ付加タンパク質のために、高度に精製されたタンパク質を貯蔵用緩衝剤中に入れて脱塩する。タンパク質の均一性を、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル（ＰＥＧ）電気泳動及びエドマン分解によるＮ末端アミノ酸配列決定によって検証する。

医薬組成物の例
医薬組成物及び投薬量の非限定的な例を以下に述べる。
エタネルセプト及び関連する組成物
四面体又は八面体抗体を含む組成物であって、四面体又は八面体抗体の１つ以上のドメインが、エタネルセプト（例えばＥｎｂｒｅｌ）の配列又はその１つ以上のドメインの配列を有する連続したアミノ酸を含む組成物は、マンニトール、スクロース、及びトロメタミンを含んでいてもよい。ある態様において、組成物は、凍結乾燥物の形態である。ある態様において、組成物は、例えば、注入用滅菌静菌水（ＢＷＦＩ）、ＵＳＰ（０．９％ベンジルアルコールを含有）で復元される。ある態様において、化合物は、中程度から重度の活動期関節リウマチを有する対象において、徴候及び症状を低減する、大きな臨床応答を誘発する、構造的損傷の進行を阻害する、及び身体機能を改善するために、対象に投与される。化合物を、メトトレキセート（ＭＴＸ）と組み合わせて加えても、単独で使用してもよい。ある態様において、化合物は、１つ以上のＤＭＡＲＤに対する不十分な応答を有していた対象における中程度から重度の活動期多関節型若年性関節リウマチの徴候及び症状を低減するために、対象に投与される。ある態様において、化合物は、乾癬性関節炎を有する対象において、徴候及び症状を低減する、活動期関節炎の構造的損傷の進行を阻害する、及び身体機能を改善するために、対象に投与される。ある態様において、化合物は、活動期強直性脊椎炎を有する対象において、徴候及び症状を低減するために対象に投与される。ある態様において、化合物は、慢性の中程度から重度の局面型乾癬の治療のために対象に投与される。対象が関節リウマチ、乾癬性関節炎、又は強直性脊椎炎を有するある態様において、化合物は、１回以上の皮下（ＳＣ）注入として毎週２５～７５ｍｇで投与される。さらなる態様において、化合物は、単回ＳＣ注入において毎週５０ｍｇで投与される。対象が局面型乾癬を有するある態様において、化合物は、２５～７５ｍｇで週２回又は４日置きに３か月間、その後、毎週２５～７５ｍｇの維持用量に減少させて投与される。さらなる態様において、化合物は、５０ｍｇの用量で週２回又は４日置きに３か月間、その後、毎週５０ｍｇの維持用量に減少させて投与される。ある態様において、用量は、ここで述べられる用量の２分の１～１００分の１である。対象が活動期多関節型ＪＲＡを有するある態様において、化合物は、毎週０．２～１．２ｍｇ／ｋｇ（最大で毎週７５ｍｇまで）の用量で投与されてもよい。さらなる態様において、化合物は、０．８ｍｇ／ｋｇ（最大で毎週５０ｍｇまで）の用量で投与される。一部の態様において、用量は、ここで述べられる用量の２分の１～１００分の１である。

インフリキシマブ、アダリムマブ、及び関連する組成物
四面体又は八面体抗体を含む組成物であって、四面体又は八面体抗体の１つ以上のドメインが、インフリキシマブ（例えば、Ｒｅｍｉｃａｄｅ）の配列又はその１つ以上のドメインの配列を有する連続したアミノ酸を含む組成物は、スクロース、ポリソルベート８０、リン酸二水素ナトリウム一水和物、及びリン酸水素二ナトリウム二水和物を含んでいてもよい。一態様において、保存剤は存在しない。ある態様において、組成物は、凍結乾燥物の形態である。ある態様において、組成物は、例えば、注入用水（ＢＷＦＩ）、ＵＳＰで復元される。ある態様において、組成物のｐＨは７．２又は約７．２である。一態様において、化合物は、静脈内点滴として２～４ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、最初の点滴から２及び６週間後、次いで以降は８週間ごとに更に類似の用量で、関節リウマチを有する対象に投与される。さらなる態様において、化合物は、静脈内点滴として３ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、最初の点滴から２及び６週間後、次いで以降は８週間ごとに更に類似の用量で、関節リウマチを有する対象に投与される。ある態様において、用量は最大で１０ｍｇ／ｋｇに調整されるか、又は４週間ごとに治療している。ある態様において、化合物は、メトトレキセートと組み合わせて投与される。一態様において、化合物は、中程度から重度の活動期クローン病又は瘻孔形成疾患の治療のために、０、２及び６週目に導入レジメンとして２～７ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、以降は８週間ごとに４～６ｍｇ／ｋｇの維持レジメンとして、クローン病又は瘻孔形成クローン病を有する対象に投与される。さらなる態様において、化合物は、中程度から重度の活動期クローン病又は瘻孔形成疾患の治療のために、０、２及び６週目に導入レジメンとして５ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、以降は８週間ごとに５ｍｇ／ｋｇの維持レジメンとして投与される。ある態様において、用量は最大で１０ｍｇ／ｋｇに調整される。一態様において、化合物は、静脈内点滴として２～７ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、最初の点滴から２及び６週間後、次いで以降は６週間ごとに更に類似の用量で、強直性脊椎炎を有する対象に投与される。さらなる態様において、化合物は、静脈内点滴として５ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、最初の点滴から２及び６週間後、次いで以降は６週間ごとに更に類似の用量で投与される。一態様において、化合物は、静脈内点滴として２～７ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、最初の点滴から２及び６週間後、次いで以降は８週間ごとに更に類似の用量で、乾癬性関節炎を有する対象に投与される。さらなる態様において、化合物は、静脈内点滴として５ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、最初の点滴から２及び６週間後、次いで以降は８週間ごとに更に類似の用量で投与される。ある態様において、化合物はメトトレキセートと共に投与される。一態様において、化合物は、中程度から重度の活動期潰瘍性大腸炎の治療のために、０、２及び６週目に導入レジメンとして２～７ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、以降は８週間ごとに２～７ｍｇ／ｋｇの維持レジメンとして、潰瘍性大腸炎を有する対象に投与される。さらなる態様において、化合物は、０、２及び６週目に導入レジメンとして５ｍｇ／ｋｇの用量で、その後、以降は８週間ごとに５ｍｇ／ｋｇの維持レジメンとして、潰瘍性大腸炎を有する対象に投与される。一部の態様において、用量は、個々の疾患を治療するためのここで述べられる用量の２分の１～１００分の１である。

リツキシマブ、オクレリズマブ、及び関連する組成物
四面体又は八面体抗体を含む組成物であって、四面体又は八面体抗体の１つ以上のドメインが、リツキシマブ、オクレリズマブの配列又はその１つ以上のドメインの配列を有する連続したアミノ酸を含む組成物は、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム二水和物、クエン酸ナトリウム二水和物、及び注入用滅菌水を含んでいてもよい。ある態様において、組成物は、静脈内（ＩＶ）投与のための、滅菌、透明、無色、保存剤不含液体濃縮物で提供される。ある態様において、組成物は、１０ｍｇ／ｍｌの濃度で供給される。ある態様において、静脈内投与のために、９．０ｍｇ／ｍｌ塩化ナトリウム、７．３５ｍｇ／ｍｌクエン酸ナトリウム二水和物、０．７ｍｇ／ｍｌポリソルベート８０、及び注入用滅菌水で生成物が製剤化される。ある態様において、組成物のｐＨは６．５又は約６．５である。ある態様において、組成物は、ｐＨ５．３、２０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０６ｍＭトレハロース二水和物、０．０２％（w/v）ポリソルベート２０中３０ｍｇ／ｍＬの濃度で、四面体又は八面体抗体を含む。

ブリナツモマブ、及び関連する組成物
四面体又は八面体抗体を含む組成物であって、四面体又は八面体抗体の１つ以上のドメインが、ブリナツモマブの配列又はその１つ以上のドメインの配列を有する連続したアミノ酸を含む組成物は、クエン酸一水和物（Ｅ３３０）、トレハロース二水和物、リシン塩酸塩、ポリソルベート８０、水酸化ナトリウム（ｐＨ調整用）、及び注入用水を含んでいてもよい。ある態様において、ｐＨは７又は約８である。再発性又は難治性前駆Ｂ細胞型ＡＬＬの治療の場合、用量は患者の体重に依存する。組成物は、４週間の治療サイクル中、連続的に点滴される。治療の各サイクルは、２週間の無治療期間によって隔てられる。２サイクル後にがんの徴候を有さない患者は、最大で更に３サイクルの治療を受けてもよい。微小残存病変を有する患者の治療の場合、用量は患者の体重に依存する。組成物は、４週間の治療サイクル中、連続的に点滴される。患者は最大で更に３サイクルの治療を受けてもよく、各サイクルは２週間の無治療期間の後で行われる。

ＡＣＥ２及び関連する組成物
四面体又は八面体抗体を含む組成物であって、四面体又は八面体抗体の１つ以上のドメインが、ＡＣＥ２の配列又はその部分を有する連続したアミノ酸を含む組成物は、公知の賦形剤、例えば上記の部で解説されたものを含んでいてもよい。当該組成物を、例えば、SARS-CoV-2の治療のために使用してもよい。

ここで記載される組成物の態様の各々において、組成物は、凍結乾燥物の形態の場合、例えば、滅菌水溶液、滅菌水、注入用滅菌水（ＵＳＰ）、注入用滅菌静菌水（ＵＳＰ）、及び当業者に公知のこれらの等価物で復元されてもよい。

即席化合物のいずれかを投与する際、化合物を、単離状態、担体中、医薬組成物の一部として、又は任意の適切なビヒクル中で投与してもよいことは理解される。

投薬量
例えば毎週１～１０ｍｇ／ｋｇなど、ここで投薬量が述べられる場合、ここで開示される発明が、上限と下限の間の各整数の用量、及びその１０分の１も想定している点は理解される。したがって、与えられた例の場合、本発明は、１．０、１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４ｍｇ／ｋｇ等から最大で１０ｍｇ／ｋｇを想定している。

態様において、本発明の化合物を単回投与でき、複数回投与してもよい。

一般に、上記の方法に従って障害又は状態を治療するための１日投薬量は、概ね約０．０１～約１０．０ｍｇ／ｋｇ（治療される対象の体重）となる。

通常の技術を有する医師により、既知の事項、例えば治療されている人物の重量、年齢、及び状態、苦痛の重症度、並びに選択された特定の投与経路を考慮して、上述の投薬量に基づく変化が加えられてもよい。

開示される化合物が、要求される有効投薬量に対する付随する結果を伴う協調的結合をもたらすことも予想される。

医薬品
「薬学的に許容される担体」という用語は、賦形剤、担体又は希釈剤を含むと理解される。使用される個別の担体、希釈剤又は賦形剤は、有効成分が適用される手段及び目的に依存する。

非経口投与の場合、滅菌水溶液中に本発明の化合物又は薬学的に許容されるその塩を含有する溶液を利用してもよい。当該水溶液は、必要であれば適切に緩衝化されなければならず、液体希釈剤を最初に十分な食塩水又はグルコースで等張化しなければならない。これらの特別な水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下及び腹腔内投与にとりわけ適する。利用される滅菌水性媒体は全て、当業者に公知の標準的な技法により容易に入手可能である。

本発明の組成物は多様な形態であり得る。これらは、例えば、液体、半固体及び固体剤形、例えば液剤（例えば、注入及び点滴用溶液剤）、分散剤又は懸濁剤を含む。好ましい形態は、意図される投与形態及び治療的用途に依存する。一部の組成物は、注入及び点滴用溶液剤の形態である。１つの投与形態は、非経口（例えば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。ある態様において、化合物は、静脈内点滴又は注入によって投与される。別の態様において、化合物は、筋肉内又は皮下注入によって投与される。別の態様において、化合物は鼻腔内投与される。

治療的使用の場合、ここで開示される組成物は、ボーラス注入による可溶性形態、連続点滴、インプラントからの徐放、経口摂取、局所注入（例えば心臓内、筋肉内）、全身注入、又は製薬技術分野で周知の他の適した技法を含む、さまざまな方法で投与され得る。医薬品投与の他の方法として、皮下、経皮、静脈内、筋肉内、及び非経口の投与方法が挙げられるが、これらに限定されない。通常、可溶性組成物は、生理学的に許容される担体、賦形剤又は希釈剤と共に、精製された化合物を含む。担体は、利用される投薬量及び濃度においてレシピエントに対して非毒性である。組成物の製造は、化合物を、緩衝剤、抗酸化剤、グルコース、スクロース又はデキストリンを含む炭水化物、キレート化剤、例えばＥＤＴＡ、グルタチオン並びに他の安定化剤及び賦形剤と組み合わせることを伴い得る。同種の血清アルブミンと混合された中性の緩衝食塩水又は食塩水が、適切な希釈剤の例である。適切な賦形剤溶液（例えば、スクロース）を希釈剤として使用して、生成物を凍結乾燥物として製剤化できる。

他の誘導体は、非タンパク質性ポリマーに共有結合した本発明の化合物／組成物を含む。ポリマーへの結合は、一般に、化合物の好ましい生物活性、例えば標的に対する化合物の結合活性と干渉しないように実行される。通常、非タンパク質性ポリマーは親水性合成ポリマー、すなわち、合成以外では自然界に見いだされないポリマーである。しかし、自然界に存在し、組換え又はin vitroの方法によって生成されるポリマーは、自然界から単離されたポリマーがそうであるように、有用である。親水性ポリビニルポリマー、例えばポリビニルアルコール及びポリビニルピロリドンは、本発明の範囲に該当する。特に有用なのは、ポリアルキレンエーテル、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレンエステル又はメトキシポリエチレングリコール；ポリオキシアルキレン、例えばポリオキシエチレン、ポリオキシプロピレン、及びポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンのブロックコポリマー（Ｐｌｕｒｏｎｉｃ）；ポリメタクリレート；カルボマー；ホモ多糖及びヘテロ多糖、例えばラクトース、アミロペクチン、デンプン、ヒドロキシエチルデンプン、アミロース、デキストラン硫酸、デキストラン、デキストリン、グリコーゲン、又は酸ムコ多糖の多糖サブユニット、例えばヒアルロン酸を含む、糖単量体であるＤ－マンノース、Ｄ－及びＬ－ガラクトース、フコース、フルクトース、Ｄ－キシロース、Ｌ－アラビノース、Ｄ－グルクロン酸、シアル酸、Ｄ－ガラクツロン酸、Ｄ－マンヌロン酸（例えばポリマンヌロン酸又はアルギン酸）、Ｄ－グルコサミン、Ｄ－ガラクトサミン、Ｄ－グルコース及びノイラミン酸を含む分枝又は非分枝多糖；糖アルコールのポリマー、例えばポリソルビトール及びポリマンニトール；並びにヘパリン又はヘパロンである。

本発明の医薬組成物は、「治療有効量」又は「予防有効量」の本発明の化合物を含んでいてもよい。「治療有効量」とは、必要な投薬量及び期間において所望の治療効果を達成するのに有効な量を指す。化合物の治療有効量は、因子、例えば個体の病状、年齢、性別、及び重量に従って変動し得る。治療有効量は、化合物の毒性又は有害な効果に対して治療的に有益な効果が上回る量でもある。「予防有効量」とは、必要な投薬量及び期間において所望の予防結果を達成するのに有効な量を指す。通常、対象において疾患の前又は初期において予防的用量が使用されるので、予防有効量は治療有効量より少ない。

一般
ここで開示される種々のエレメントの全ての組合せが本発明の範囲内である。

ここで使用される場合、全ての見出しは、単に構成のためのものであり、いかなる方法でも本開示を制限することを意図するものではない。任意の個々の節の内容は、全ての節に等しく適用可能でなくてもよい。ここで開示される種々のエレメントの全ての組合せが本発明の範囲内である。

本発明のさらなる目的、利点及び新規特徴は、制限であると意図されない以下の例を調査すると当業者には明らかになるであろう。さらに、本明細書において上記で詳細に説明されたような、以下の特許請求の節において特許請求されるような本発明の種々の態様及び側面の各々は、以下の例において実験的支持を見いだす。

明確にするために、別の態様の文脈で記載される本発明のある特定の特徴はまた、単一態様において組み合わせて提供されてもよいということは理解される。逆に、簡潔にするために、単一態様の文脈において記載される本発明の種々の特徴はまた、別個に、又は任意の適した部分組合せで、又は本発明の任意の他の記載される態様において適するように提供されてもよい。種々の態様の文脈で記載されるある特定の特徴は、態様がそれらのエレメントなしで無効でない限り、それらの態様の必須の特徴と考えるべきではない。

本発明は、以下の例を参照することによってより良好に理解されるであろうが、当業者ならば、詳述される特定の実験は、その後に続く特許請求の範囲においてより十分に記載される本発明の例証的なものにすぎないことは容易に理解するであろう。

実施例１ 方法及び材料
組換えタンパク質
哺乳動物発現ベクターを使用してチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞において組換えタンパク質を発現させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー及びサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。血清不含懸濁培養（TunaCHO, LakePharma Inc., Belmont, CA）に適応したＣＨＯ－Ｋ１細胞における一過性発現によって産生した。懸濁液ＣＨＯ細胞を振盪フラスコ中に播種し、血清不含の、化学的に規定された培地を使用して増殖した。トランスフェクションの当日に、増殖した細胞を、新鮮培地を含む新たな容器中に播種した。一過性トランスフェクションは、高密度条件下でＤＮＡと複合体形成したトランスフェクション試薬を添加して行った。トランスフェクションは、０．１～２．０Ｌの培養物で実施した。トランスフェクション後、産生工程の最後まで細胞を振盪フラスコ中でバッチ－フェッド培養として維持した。７～１４日後に条件付けされた細胞培養液を回収し、遠心分離によって透明化し、滅菌濾過し、その後、精製した。

プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーは、培養上清を、１３７ｍＭのＮａＣｌ、２．７ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４、２ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４（ＰＢＳ）を用いて予め平衡化されたCaptivA（登録商標）プロテインＡ親和性樹脂（Repligen, Massachusetts, USA）を充填したカラムを使用した。カラムを、ＰＢＳ緩衝剤を用いて、ＯＤ２８０値がベースラインに戻るまで洗浄した。次いで、標的タンパク質を、０．２５％酢酸緩衝剤ｐＨ３．５を用いて溶出した。画分を収集し、１Ｍ ＨＥＰＥＳで緩衝し、各画分のＯＤ２８０値を記録した。標的タンパク質を含有する画分をプールし、１００ｍＭ ＨＥＰＥＳ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＮａＯＡｃ、ｐＨ６．０に緩衝剤交換し、０．２μｍメンブレンフィルターを通して濾過し、４℃で保存し、その後使用した。タンパク質濃度をＯＤ２８０値から算出し、吸光係数を算出した。

分取ＳＥＣを、AKTA Avant 25 FPLCシステム（GE Healthcare, Uppsala, Sweden）を使用して実施した。最初に、タンパク質を、Amicon Ultra-15, 3MWCO、超遠心フィルターユニット、catalog #UFC900324（Millipore, Burlington, MA）を使用して１０～１５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、次いで、HiLoad 26/600 Superdex 200 prepグレードカラム（GE Healthcare）上にロードした。溶出は、１０ｍＭ ＥＤＴＡを含有しカルシウム又はマグネシウム塩を含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（UCSF Cell Culture Facility, San Francisco, CA）を用いて実施した。目的のタンパク質に対応する画分を、分析用ＳＥＣ、並びに還元及び非還元ＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析に基づいて同定し、プールし、限外濾過によって濃縮し、４℃で保存した。

ヘテロ二官能性架橋剤

エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）
無傷のタンパク質を、モデル1260HPLCシステム（Agilent Technologies, Santa Clara, CA）及びMicroTOF-QII MSシステム（Bruker Corporation, Billerica, MA）を使用してＥＳＩ－ＭＳによって分析した。２．７μｍの粒径、４５０Åの孔径及び２．１×１００ｍｍの寸法を有するBioResolve RP mAbポリフェニルカラム（Waters Corporation, Milford, MA）を、５０℃で０．３ｍｌ／分の流量及び２～５μＬの注入容量を用いて使用した。移動相は、以下のとおりの水中０．１％のギ酸（溶媒Ａ）及びアセトニトリル中の０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）の勾配とした：０分、９５％：５％；２分、６５％：３５％；１０分、５４％：４６％；１１分、５％：９５％で３分間保持。データを質量範囲６００～４０００ＤａでフルスキャンＭＳモードにより収集した。衝突ＲＦ設定は、８００Ｖｐｐとした。脱グリコシル化分析のために、Rapid PNGase F.P0710S（New England BioLabs Inc, Ipswich, MA）を製造業者の使用説明書に従って試料を還元し、脱グリコシル化した。マススペクトルの表示及びデコンボリューションのためにBruker DataAnalysisバージョン4.0 sp4ソフトウェアを使用した。

分析用サイズ排除ＨＰＬＣ（ＳＥ－ＨＰＬＣ）
分析用ＳＥ－ＨＰＬＣをProminence HPLCシステム（Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan）を使用して実施した。３μｍの粒径、３００Åの孔径及び４．６×３００ｍｍの寸法を有するZenix-Cカラム（Sepax Technologies, Newark, Delaware）を個別に又は順次結びつけられたカラムの対として使用した。使用する移動相、流量、カラム温度及び検出波長は、それぞれ５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ７．４＋３００ｍＭのＮａＣｌ、０．２ｍＬ／分、２５℃及び２８０／２１４ｎｍとした。ＵＶデータ獲得及び処理のためにLabSolutions v5.9ソフトウェア（Shimadzu Corporation）を使用した。

多角度光散乱分析（ＭＡＬＳ）
タンパク質のモル質量は、インラインのOptilab T-rEX RI検出器及びTreos MALS検出器（Wyatt Technology, Goleta, CA）を使用して、ＳＥ－ＨＰＬＣと、屈折率（ＲＩ）及び多角度光散乱（ＳＥＣ－ＭＡＬＳ）の測定を組み合わせることによって決定した。検出器の温度は２５℃で維持した。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の単量体形態について得られたシグナルを使用して検出器を較正し、検出器間のバンドの広がりを補正した。Astra v7.3ソフトウェア（Wyatt Technology）を、光散乱と屈折率データ獲得及び処理のために使用した。タンパク質のｄｎ／ｄｃ比のために０．１８５ｍＬ／ｇの値を使用した。

ＳＥ－ＨＰＬＣによる化学量論的結合測定
２種の別個のタンパク質の共通のリガンド結合パートナーに対する相対結合親和性を、ＳＥ－ＨＰＬＣを使用して化学量論的結合分析によって決定した。２種のタンパク質の部分精製された混合物又は２種の精製されたタンパク質を組み合わせることによって製造した混合物を、モル比０．２～２．０のリガンド結合パートナーを含有する結合反応物においてその成分の相対結合親和性について相対評価した。２５℃で２時間のインキュベーション後、結合反応物をＳＥ－ＨＰＬＣによって分析して、２種のタンパク質各々の未結合のままである割合を決定した。

速度論的排除アッセイ（KinExA（登録商標））
KinExA 3200機器（Sapidyne Instruments, Boise, Idaho）を使用して溶液中の未改変分子の間の平衡結合親和性及び速度論的結合測定を行った。SARS-CoV-2 Ｓタンパク質へのＡＣＥ２結合のＫｄ分析のために、ＰＭＭＡビーズを組換えSARS-CoV-2スパイクタンパク質Reference No. 46328（LakePharma Inc, Belmont, CA）を用いて吸着コーティングし、次いで、ＡＣＥ２タンパク質（定常結合パートナー（ＣＢＰ））を捕捉するための固相として使用した。各実験のために、ＡＣＥ２タンパク質のバックグラウンドにおいてＳタンパク質を滴定し、平衡に到達させた。次いで、結合反応物を短時間固相に曝露し、遊離ＡＣＥ２タンパク質の一部を捕捉し、次いで、蛍光二次分子を用いて検出した。固相との短い接触時間は、溶液において予め形成された複合体の解離に必要な時間より短く、したがって、溶液と固相滴定結合パートナーの間の競合は、「速度論的に排除される」。固相は、各試料中の遊離ＣＢＰのプローブとして使用されるだけであるので、溶液平衡は、このようなKinExA測定の間に変更されない。

Ｏｃｔｅｔ
Ｆｃγ受容体での速度論的アッセイ
Ｆｃγ受容体での抗体結合の速度論的特性決定を、３８４ウェルプレートを使用してOctet Red384（Satorius）で実施した。

Ｃ末端にポリヒスチジンタグを含有する種々の組換えヒトＦｃγ受容体を、R&D systemsから購入した。５μｇ／ｍｌの濃度のＦｃγ受容体を、ＰＢＳ－Ｂ（１ｍｇ／ｍＬのＢＳＡ、ｐＨ７．４を有するＰＢＳ）中、２６℃、１０００ｒｐｍの振盪速度で抗Penta-Hisバイオセンサー（Satorius）上に固定化した。ＰＢＳ－Ｂを用いて洗浄した後、Ｆｃγ受容体が捕捉されたバイオセンサーを、種々の濃度の試験抗体中に１５秒間浸漬した。次いで、解離の間、バイオセンサーをＰＢＳ－Ｂ中に６０秒間浸漬した。バイオセンサーを、各サイクルの最後にグリシンｐＨ１．５を用いてストリッピングすることによって再生した。データ分析は、標準１：１結合モデルを使用して実施した。

実施例２ 図１Ａ、図２、図１１Ａ～Ｈ、図１２に示した構造の四面体抗体
図１Ａ、図２及び図１１Ａ～Ｈに、この例の四面体抗体の概略構造を示す。

図１２に、四面体抗体Ｒｃ６－Ｐ４－Ｒｃ６の製造を示す。

Ｒｃ６－Ｒｃ６
図１Ａに示す構造の四面体抗体を、以下のドメインを用いて構築した：
ａ．ドメイン１：Ｆｃ
ｂ．ドメイン２：Ｆｃ
ｃ．ドメイン３：抗ＣＤ２０Ｆａｂ
ｄ．ドメイン４：抗ＣＤ２０Ｆａｂ

Ｒｃ６－Ｂ１９
図１Ａに示す構造の四面体抗体を、以下のドメインを用いて構築した：
ａ．ドメイン１：Ｆｃ
ｂ．ドメイン２：Ｆｃ
ｃ．ドメイン３：抗ＣＤ２０Ｆａｂ
ｄ．ドメイン４：抗ＣＤ１９Ｆａｂ

Ｒｃ６６ＳＩＤＥ－Ｒｃ６６ＳＩＤＥ
図１Ａに示す構造の四面体抗体を、以下のドメインを用いて構築した：
ａ．ドメイン１：ＦｃＳＩＤＥ
ｂ．ドメイン２：ＦｃＳＩＤＥ
ｃ．ドメイン３：抗ＣＤ２０Ｆａｂ
ｄ．ドメイン４：抗ＣＤ２０Ｆａｂ

ＨＡ９ＡＡＣ９－ＨＡ９ＡＡＣ９
図１Ａに示す構造の四面体抗体を、以下のドメインを用いて構築した：
ａ．ドメイン１：ＦｃＡＡＣ９
ｂ．ドメイン２：ＦｃＡＡＣ９
ｃ．ドメイン３：抗ＣＤ１６Ｆａｂ
ｄ．ドメイン４：抗ＣＤ２６Ｆａｂ

６Ｅｃ６６－Ｓｏｃ６６
図１Ａに示す構造の四面体抗体を、以下のドメインを用いて構築した：
ａ．ドメイン１：Ｆｃ
ｂ．ドメイン２：Ｆｃ
ｃ．ドメイン３：抗βアミロイドＦａｂ
ｄ．ドメイン４：抗βアミロイドＦａｂ

Ａｃｅ２－Ａｃｅ２
図１Ａに示す構造の四面体抗体を、以下のドメインを用いて構築した：
ａ．ドメイン１：Ｆｃ
ｂ．ドメイン２：Ｆｃ
ｃ．ドメイン３：Ａｃｅ２－６１５
ｄ．ドメイン４：Ａｃｅ２－６１５

実施例３ 図１Ｂ、図３及び図１３に示した構造の四面体抗体
図１Ｂ及び図３に、この例の四面体抗体の概略構造を示す。
図１３に、図１Ｂに示す非共有結合を有する四面体抗体の製造を示す。

実施例４ 図１Ｃ、図４及び図１４～１８に示した構造の四面体抗体
図１Ｃ及び図４に、この例の四面体抗体の概略構造を示す。

図１４に、四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧの製造を示す。

図１５は、ＳＥ－ＨＰＬＣによる四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧの分析を示す。

図１６は、種々のペプチドリンカーである（Ｌ－１）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ、（Ｌ－１８５）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１８５－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１８５、（Ｌ－１９８）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１９８－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ１９８、（Ｌ－２０８）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２０８－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２０８、（Ｌ－２１２）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５、（Ｌ－２３５）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２３５、（Ｌ－２４０）ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２４０－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧＲＦ２４０を有する四面体抗体の、ＳＥ－ＨＰＬＣによる分析を示す。

図１７は、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳによる四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧの分析を示す。

図１８は、四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ｃ６０ＰＧ及びＡＣＥ単量体ＡＣＥ２ＲＱ６１５ｃ６０ＰＧの混合物の化学量論的結合分析を示す。

実施例５ 図１Ｄ及び図５～１０、１９～２８に示した構造の四面体抗体
図１Ｄ及び図５～１０に、この例の四面体抗体の概略構造を示す。

図１９に、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の製造を示す。

図２０は、ＳＥ－ＨＰＬＣによる四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の分析を示す。

図２１は、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳによる四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の分析を示す。

図２２は、ＳＥ－ＨＰＬＣ／ＭＡＬＳによる四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧの分析を示す。

図２３は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９の不純物の化学量論的結合分析を示す。

図２４は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－７４０Ｆｃ－Ｇ９の混合物の化学量論的結合分析を示す。

図２５は、四面体抗体ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－７４０Ｆｃ－Ｇ９の混合物の化学量論的結合分析を示す。

図２６は、四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－６１５Ｆｃ－Ｇ９の混合物の化学量論的結合分析を示す。

図２７は、ＡＣＥ２四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧによる、並びにＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－６１５Ｆｃ－Ｇ９及びＡＣＥ２ＲＱ６１５ＦｃＰＧによるSARS-CoV-2-VSV偽型ウイルス感染の阻害を示す。

図２８は、ＡＣＥ２四面体抗体ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９－ＡＣＥ２７４０ＦｃＧ９及びＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧ－ＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧによる、並びにＡＣＥ２二量体ＡＣＥ２－７４０Ｆｃ－Ｇ９及びＡＣＥ２ＲＱ７４０ＦｃＰＧによるSARS-CoV-2-VSV偽型ウイルス感染の阻害を示す。

実施例６ スーパー二量体ＡＣＥ２四面体抗体の構造研究
図１９の実験は、４つの同一のＡＣＥ２－Ｆｃ融合ポリペプチド鎖のスーパー二量体化によって４つのＡＣＥ２ドメインを含む四面体抗体である構築物ＡＣＥ２－７４０ＦｃＰＧ－Ｇ９（配列番号８１）の生成を実証した。スーパー二量体化反応は、二量体化ポリペプチドとして作用するコレクトリン様ドメインの存在を必要とし（図１９Ｂ）、その非存在下では、四面体抗体は検出されなかった（図１９Ａ）。この実験における四面体抗体の収率は２７％であり、さらに、ＡＣＥ２－７４０ＦｃＰＧ－Ｇ９の二量体形態が６４％のレベルで生成された（図２０、表１６）。ＳＥＣ－ＭＡＬＳ分析によって、スーパー二量体及び二量体形態について５１０ｋＤａ及び２５７ｋＤａのモル質量が示され、それぞれ４３８ｋＤａ及び２１９ｋＤａの、特に、ＡＣＥ２分子の広範なグリコシル化を考慮したその予測分子量と良好に一致した（図２１、表１７）。

スーパー二量体ＡＣＥ２四面体抗体の予測される第４級構造を、図４３ｃに示す。この構造の確認は、ＩｇＧ１分子をヒンジ領域のすぐ下で切断するＩｄｅＺプロテアーゼを用いて行った断片化実験によって提供された。ＩｄｅＺ（Genovis, Lund, Sweden）を用いて消化し、続いて、ＴＣＥＰを用いてヒンジジスルフィドを還元すると、スーパー二量体形態（図４３ｃ）及び二量体形態（図４３ｂ）の両者とも、予測されたようにＡＣＥ２二量体をもたらしたのに対し、図４３ａに示した単量体ＡＣＥ２－Ｆｃ融合タンパク質（配列番号７４）は、予測されたＡＣＥ２単量体のみをもたらした。

ＡＣＥ２四面体抗体のスーパー二量体及び二量体形態は、サイズ排除クロマトグラフィーによって容易に分離された（図２０、２１）。精製後、両形態は明らかに安定であり、１月間、著しく相互変換することはなく、これは、２種の相対的形成が細胞からの移行前に生じていたことを示唆する。二量体化ポリペプチドをＦｃドメインに結びつけるリンカーが、細胞上清から得られるスーパー二量体及び二量体形態の相対量において役割を果たすか否かを決定するために、変動する長さの一連のリンカーを使用して一連の四面体抗体を製造し（表１５）、スーパー二量体及び二量体の相対収率を決定した。表２０に要約されるように、ＴＮＦ受容体１Ｂのストーク領域に由来する２３個のアミノ酸の配列からなる２０１リンカーが、スーパー二量体及び二量体形態の最高比である３８％と高分子量（ＨＭＷ）種の最低レベルである５．１％をもたらした（表２０）。

実施例７ スーパー二量体ＡＣＥ２四面体抗体の機能的研究
図２３～２５の化学量論結合実験によって、SARS-CoV-2スパイクタンパク質が、ＡＣＥ２スーパー二量体及び二量体に添加されると、スーパー二量体の本質的に全てが、二量体が結合し始める前に消費されることが実証された。これは、実験が、細胞によって産生されたスーパー二量体／二量体混合物を用いて実施されたか（図２３）、サイズ排除クロマトグラフィーによって得た分離・精製したスーパー二量体及び二量体を使用して製造した混合物を用いて実施されたか（図２４）に関わらず観察された。実験において野生型ＡＣＥ２タンパク質又は触媒的に不活性のＡＣＥ２変異体タンパク質（Ｒ２７３Ｑ）が使用されたかに関わらず（図２４と２５を比較）、同様のオーダーの結合結果が得られた。これらの結果から、ＡＣＥ２スーパー二量体は二量体よりもかなり高い親和性で結合することが示唆された。SARS-CoV-2偽ウイルス中和実験（図２７、２８）は、ＡＣＥ２スーパー二量体が、スーパー二量体生成物中に見いだされるＡＣＥ２二量体（図４３ｂ）又はコレクトリン様二量体化ポリペプチドを欠くＡＣＥ２－Ｆｃ二量体（図４３ａ）のいずれかよりもおよそ２桁強力であることを一貫して実証した。

化学量論結合及び偽ウイルス実験の生物学的関連性を確認するために、生SARS-CoV-2ウイルスを用いて中和アッセイを実施した。これらの実験によって、ＡＣＥ２は、ＡＣＥ２二量体よりもウイルスの中和においておよそ２桁強力であり、ＡＣＥ２－Ｆｃ二量体よりもおよそ３桁強力であることが確認された（図４４）。ＡＣＥ２受容体を介して細胞に感染するＮＬ６３αコロナウイルスを用いて実施された中和アッセイでも、同様の結果が得られた。

方法：生SARS-CoV-2中和アッセイ USA-WA1/2020（NR-52281）及びGermany/BavPat1/2020（NR-52370）をBEI Resources, Manassas, VAから入手し、Vero/TMPRSS2における単回継代を使用して増殖した。ウイルスをVero/TMPRSS2においてエンドポイント滴定し、ウェルあたり１００ＴＣＩＤ_５０を使用した。ウイルスを抗体の段階希釈物ととともに３７℃で１時間プレインキュベートし、次いで、Vero/TMPRSS2細胞上に８複製でプレーティングした。７日後、細胞変性効果についてウェルをスコア化した。

実施例８ ＡＣＥ２スーパーヘテロ二量体四面体抗体のエンジニアリング
リンカー最適化単独では、スーパー二量体ＡＣＥ２四面体抗体の収率を制限した明らかな構造的制約を克服されなかったので、図４３ｅに示された予測された構造を有する一連の構築物を作製した（表２２）。「スーパーヘテロ二量体」と呼ばれるこの構造は、２対の二量体化ポリペプチドの代わりに１対を有することで、図４３ｃに示される「スーパーホモ二量体」とは異なる。スーパーヘテロ二量体は、スーパー二量体化を重鎖の一方に限定することによって、より大きなコンホメーションの柔軟性という利点を有すると考えられた。この予測は、Ｈ１及びＨ２鎖上のリンカー長を独立に変動させることによって裏付けられ、ＡＣＥ２スーパーヘテロ二量体は、培養上清から９８．８％という高い収率で得られた（表２３）。

実施例９ ＡＣＥ２スーパーヘテロ二量体四面体抗体のウイルス中和活性
生ウイルス中和研究によって、スーパーヘテロ二量体は、SARS-CoV-2βコロナウイルス及びＮＬ６３αコロナウイルスの両者の中和においてスーパーホモ二量体の優れた効力を保持したことが確認された（表２４）。

実施例１０ ＡＣＥ２変異体
これらの調査の過程で、SARS-CoV-2患者において活性酵素の臨床使用と関連する可能性ある合併症を避けるために、Ｒ２７３Ｑ変異を、ＡＣＥ２を酵素的に活性にする手段として評価した。本発明者らは、Ｒ２７３Ｑが、ＡＣＥ２の血漿半減期に対して重度の効果を有していることを発見した。したがって、５つの新規変異体、Ｒ２７３Ａ、Ｒ２９３Ｇ、Ｒ２７３Ｃ、Ｈ３７８Ａ及びＥ４０２Ａを作製し、いくつかのＡＣＥ２構築物において評価した（表２５Ａ、２５Ｂ及び２６Ａ）。カルボキシペプチダーゼに対する変異の効果は、異なるものの中で一致しており、種々の構築物の中で一致していた。Ｈ３７８Ａは、半減期に関して最も耐容性が高く、酵素活性の最大の低減を提供すると決定された。

Ｈ３７８Ａ変異は、ＡＣＥ２カルボキシペプチダーゼ活性のレベルをアンジオテンシン－ＩＩを用いた場合９９．９５％、ブラジキニンを用いた場合９９．９３％及びアペリン－１３を用いた場合９９．８５％低下させた（表２６Ｂ）。

材料：アンジオテンシンＩＩペプチド（AS-20633）、Ｄｅｓ－Ａｒｇ９－ブラジキニンペプチド（AS-65642）（AnaSpec, Fremont, CA）、アペリン－１３ペプチド（APEL-003）（CPC Scientific, San Jose, CA）。組換えヒトＡＣＥ２（79200）（BioLegend, San Diego, CA）を陽性対照として使用した。フェニルアラニンアッセイキット（ab83376）（Abcam, Cambridge, UK）。

方法：ＡＣＥ２カルボキシペプチダーゼ活性をフェニルアラニンの存在を使用して定量化した。カルボキシペプチダーゼ反応は、COVICEPTの０．０２５μｇ（野生型）又は１５μｇ（ＡＣＥ２変異株）を、３７℃で反応緩衝剤（１０μＭのＺｎＣｌ２を有するＰＢＳ）の存在下で０．２μＭのアンジオテンシンＩＩ、ブラジキニン又はアペリン－１３に添加した時点で開始された。２０μＬのアリコートを、２分ごとに２０分まで反応混合物から採取し、８０℃で５分間熱不活化した。熱不活化されたアリコート中のフェニルアラニンの量を、フェニルアラニンアッセイキットを使用して定量化した。

実施例１１ SARS-CoV-2中和抗体
緊急時使用許可を受けているか、又は後期治験中である８種の抗体であるＲＥＧＮ１０８９７、ＲＥＧＮ１０９３３、バムラニビマブ、エテセビマブ、ＡＺＤ１０６１、ＡＺＤ８８９５、ＶＩＲ－７８４１及びＣＴ－Ｐ５９のバイオシミラーバージョンを表２７に従って生成して、SARS-CoV-2バリアントに対してＡＣＥ２スーパー二量体四面体抗体の相対有効性を評価した。

実施例１２
２種の異なる標的に特異的に結合する２つの別個の種類のドメインを含む四面体抗体を実証する原理を証明するために、２シリーズの構築物、表２８及び２９に従う図３１Ｂに示される予測された構造を有する第１のシリーズ、表３０及び３１に従う図３２Ｃに示される予測された構造を有する第２のシリーズを生成し、次いで、その構造的及び機能的二重特異性について評価した。

実施例１３

実施例１４ 薬物動態
設計した２シリーズの構築物を用いて薬物動態研究を実施して、ＦｃｇＲ及びＦｃＲｎ結合に影響を及ぼすＦｃ領域中の変異の効果を評価した。第１のシリーズは、表２８及び２９に記載され、第２のシリーズは、表３３及び３４に記載されている。

方法：研究は、The Jackson Laboratory, Bar Harbor, MEで実施した。６～８週齢の雄のB6.Cg-Fcgrttm1Dcr Tg（ＦＣＧＲＴ）32Dcr/DcrJマウスは、ヒトＦｃＲｎ導入遺伝子についてホモ接合性であった。体重を各被験物質投与の１日以内に測定した。０日目０時間で、COVICEPTを、５ｍｌ／ｋｇの容量で１０ｍｇ／ｋｇでＩＶ注入によって投与した。２５μＬの血液試料を、５分、６時間、１日、４日、７日、１０日、１４日、１７日、２１日及び２８日後に各マウスから収集した。血液試料を１μＬのＫ_３ＥＤＴＡ中に収集し、血漿に処理し、ＰＢＳ中５０％グリセロールで１／１０希釈し、専用の９６ウェル保存プレート中で凍結し、－２０℃で保存した。血漿試料を電気化学発光イムノアッセイ（Meso Scale Diagnostics LLC, Rockville, MD）によって評価して、COVICEPTのレベルを検出した。

電気化学発光イムノアッセイ：野生型スパイクタンパク質（LakePharma, Inc., San Carlos, CA）を、ＰＢＳを用いて２０ｎＭに希釈し、ウェルあたり２５μＬを用いてQuickPlex 96ウェルプレート（Meso Scale Diagnostics）上にコーティングした。プレートを密閉し、４℃で一晩インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ－Ｂ（１％ ＢＳＡを有するＰＢＳ）によって室温で３０分間ブロッキングした。血漿試料をＰＢＳ－Ｂを用いて２５０～４０００倍希釈した。２５μＬの希釈血漿試料を、Biomek I5液体ハンドラー（Beckman Coulter Inc., Brea, CA）を使用して、コーティングされたＭＳＤプレートに添加した。血漿試料を振盪（７００ｒｐｍ）しながら室温で６０分間インキュベートした。２５μＬのビオチン化ヤギ抗ヒトＦａｂ抗体（Abcam）又はビオチン化ヤギ抗ヒトＡＣＥ－２検出抗体（R&D Systems）を、検出抗体として使用した。検出抗体を振盪（７００ｒｐｍ）しながら室温で６０分間インキュベートした。次いで、２５μＬのスルホタグストレプトアビジン及びＲｅａｄ緩衝剤Ａ（Meso Scale Diagnostics LLC, Rockville, MD）を添加して、電気化学発光シグナルを生じさせた。データをＭＳＤディスカバリーワークベンチ４．０．１３（Meso Scale Diagnostics LLC, Rockville, MD）を用いて分析した。薬物動態分析をPKSolver22を使用して実施した。

実施例１５
表３３及び３４に従って一連の構築物を作製して、ＦｃｇＲ及びＦｃＲｎ結合及び薬物動態に影響を及ぼすＦｃ領域中の変異の効果を評価した。

結合測定の結果は、表３５Ａ、３５Ｂ、３５Ｃ、３５Ｄに提示されている。

方法：表面プラズモン共鳴捕捉動態実験を、Carterra, Inc. Salt Lake City, UTから購入したCarterra LSA機器で実施した。COVICEPT及びその対照（５μｇ／ｍｌ）をアミンカップリングを使用してCarterra CMD-Pチップ上に固定化した。組換えＦｃγ受容体（R&D Systems）を、ランニング緩衝剤（0.05% TWEEN（登録商標）を有するＰＢＳ）を用いて２０００ｎＭの濃度に希釈し、３倍段階希釈を７回続けて、０．９ｎＭにした。会合相の間にＦｃγ受容体をCMD-Pチップ上に５分間注入し、続いて、解離相の間に更に５分間ランニング緩衝剤を注入した。Ｆｃ－γ受容体注入の各ラウンド後に、Pierce（商標）ＩｇＧ溶出緩衝剤を１分間流すことによってCMD-Pチップを再生した（Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA）。データをCarterraの動態ツールを使用して分析した。

実施例１６ SARS-CoV-2バリアント中和研究
四面体抗体構築物１５－１５及び１５－１６（ＡＣＥ２－Ｂ１３Ａ）、１５－２３及び１５－２４（ＡＣＥ２－Ｏ２４）、１５－０７及び１５－５３（ＡＣＥ２－ＡＣＥ２）並びに、１０－６１及び１０－６５（図４３に示すようなＡＣＥ２コア二量体）を、SARS-CoV-2の幅広い抗体耐性バリアントに対する活性について偽ウイルス中和アッセイ（Integral Molecular, Philadelphia, PA）を使用して評価した。１０－６１及び１０－６５構築物は、Glasgow et al. PNAS 117:28046-28055 (2020)に記載される３１３親和性増強変異を組み込んでいた。各構築物を１１種のSARS-CoV-2バリアント及び１種のSARS-CoV-1株に対して評価し、親抗体Ｂ１３Ａ及びＯ２４並びに米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって緊急時使用許可（ＥＵＡ）を受けているか、又は後期臨床試験中である８種の抗体であるＲＥＧＮ１０８９７、ＲＥＧＮ１０９３３、バムラニビマブ、エテセビマブ、ＡＺＤ１０６１、ＡＺＤ８８９５、ＶＩＲ－７８４１及びＣＴ－Ｐ５９のバイオシミラーバージョンと並べて比較した。

試験したSARS-CoV-2バリアントは、D614G B.1（ＲＶＰ－７０２）、カリフォルニアB.1.427/B.1.429（ＲＶＰ－７１３）、インドB.1.617.2（ＲＶＰ－７６３）、南アフリカB.1.351（ＲＶＰ－７０７）、南アフリカΔB.1.351（ＲＶＰ－７２４）、N439K（ＲＶＰ－７０３）、ブラジルP.1（ＲＶＰ－７０８）、ナイジェリア／欧州B.1.525(ＲＶＰ－７２３）、ニューヨークB.1.526（ＲＶＰ－７２６）、UK B.1.1.7（ＲＶＰ－７０６）及びＥ４８４Ｋを有するUK B.1.1.7（ＲＶＰ－７１７）であった。試験したSARS-CoV-1バリアントは、ウルバニ（ＲＶＰ－８０１）であった。Integral Moleclarカタログ番号を、括弧内に示す。

結果を、図４８Ａ～４８Ｐに示す。とりわけ、四面体抗体構築物ＨＢ１５１５及びＨＢ１５１６は、１１種のSARS-CoV-2バリアント並びにSARS-CoV-1全てに対して有効であった。対照的に、SARS-CoV-2バリアントのうち少なくとも２種を用いた１０種の抗体全てについて著しいウイルス耐性が観察された。さらに、ＨＢ１５１５及びＨＢ１５１６は、試験した１０種の抗体全て（Ｄ６１４Ｇバリアントに対するＣＴ－Ｐ５９を除く）と少なくとも同程度に強力であった。

方法：SARS-CoV-2偽ウイルス中和アッセイ。中和アッセイを、製造業者のプロトコールに従って実施した。手短には、段階希釈した抗体を偽型SARS-CoV-2－ウミシイタケルシフェラーゼとともに３７℃で１時間インキュベートした。各抗体について、少なくとも７つの濃度を試験した。抗体を有さない培養培地中の偽ウイルスを陰性対照として使用して、１００％感染性を決定した。次いで、９６ウェルプレート中で混合物を２．５×１０^５個細胞／ｍｌの２９３Ｔ－ｈｓＡＣＥ２細胞とともにインキュベートした。感染は、３７℃で５％ ＣＯ２を用いておよそ７２時間にわたって起こった。ルシフェラーゼシグナルを、１ｍｓの積分時間で設定されたルミノメーターを備えた、ウミシイタケ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Promega, Cat# E2710）を使用して測定した。陰性対照ウェルからの得られた相対発光シグナル（ＲＬＵ）を標準化し、これを使用して各濃度の中和パーセンテージを算出した。これらのデータをPrism 9（GraphPad）によって処理して、４ＰＬ曲線にフィッティングし、ｌｏｇ ＩＣ５０を算出した。

実施例１７ ハムスターCovid-19モデルにおける四面体抗体ＨＢ１５１６の有効性
SARS-CoV-2の研究のための主要な動物モデルは、ゴールデンシリアンハムスターを利用して、病原性を研究し、治療薬又はワクチンを試験する。このモデルを使用する先行研究は、ハムスターのSARS-CoV-2感染が、軽度～中程度の臨床徴候（速い呼吸、体重減少、上及び下気道におけるウイルスの高力価及び肺における組織学的変化）をもたらし、ハムスターとヒトの間で同様の感染性及び病理特徴を示すことを見いだした。ＨＢ１５１６（タンパク質１５－１６）を、このモデルの予防的バージョンにおいて評価して、ＲＥＧＮ１０９８７（タンパク質１２－０１）及びＲＥＧＮ１０９３３（タンパク質１２－０１）からなり、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって緊急時使用許可（ＥＵＡ）を受けており、ハムスターにおいて有効性をこれまでに実証した中和抗体カクテル（Promega, Cat# E2710）であるREGN-CoV-2と比較して、SARS-CoV-2の南アフリカバリアントを使用する負荷からの保護におけるその有効性を決定した（GraphPad）。

材料。感染のために使用したSARS-CoV-2ウイルスの南アフリカバリアントは、BEI Resources, American Type Culture Collection (Manassas, VA): Catalog No. NR-54974 (hCoV-19/South Africa/KRISP-K005325/2020)から調達した。このSARS-CoV-2バリアントは、Ｗｕｈａｎ－１分離菌（NCBI Reference Sequence: NC_045512.2）の配列に関連して、そのスパイク（Ｓ）タンパク質中に以下のアミノ酸変異を有する：Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ａ、Ｌ２４２／Ａ２４３／Ｌ２４４欠失、Ｋ４１７Ｎ、Ｅ４８４Ｋ、Ｎ５０１Ｙ、Ｄ６１４Ｇ、Ａ７０１Ｖ。この研究において使用されるＲＥＧＮ１０９８７及びＲＥＧＮ１０９３３のバイオシミラーバージョンは、Lakepharma Inc.（Belmont, CA）で生成された。

方法。研究は、BIOQUAL, Inc.（Rockville, MD）で実施した。合計２４匹の雄のゴールデンハムスター６～８週齢を、４群（ｎ＝６）に割り当てた。動物を、腹膜内（ＩＰ）経路によってマイナス１（－１）研究日にその群にとって適切な材料で治療した。被験物質は、ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（ATCC No. 30-2020）中で調製し、以下の濃度で投与した：ＨＢ１５１６（２５ｍｇ／ｋｇ）、ＲＥＧＮ１０９３３（２５ｍｇ／ｋｇ）及びＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２（ＲＥＧＮ１０９８７及びＲＥＧＮ１０９３３、各２５ｍｇ／ｋｇ）。

研究０日目に、動物を負荷前に出血させ、続いて、南アフリカSARS-CoV-2株を用いて鼻腔内負荷した。負荷後相において動物を１日２回観察し、その体重を毎日収集した。

結果。図４９に示されるように、ＰＢＳ陰性対照群は、感染後に着実に体重減少し、７日目までにその出発体重のおよそ１８％を失った。ＨＢ１５１６治療群は、研究を通じてその体重を維持し、７日目までにその出発体重のおよそ３％増加した（ＨＢ１５１６対ＰＢＳ対照：ｐ値＜０．０００１）、ＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２治療群の結果（ＨＢ１５１６対ＲＥＧＮ－ＣｏＶ：ｐ値０．９０１９）と同等であった。対照的に、ＲＥＧＮ１０９３３治療群は、５日目までにその体重の約７％を失った。

実施例１８ SARS-CoV-2スパイクタンパク質に対する２つの別個の結合特異性のＦａｂドメインを含む四面体抗体
２種の異なる標的に特異的に結合する２つの別個の種類のＦａｂドメインを含む四面体抗体を実証する原理の証明を提供するために、表３６に従う、図３２Ｃに示される予測される構造を有する２シリーズの構築物を生成し、次いで、その構造的及び機能的二重特異性について評価した。第１のシリーズの構築物は、ＲＥＧＮ１０９８７（配列番号４２１～４２２）及びＲＥＧＮ１０９３３（配列番号４２３～４２４）由来のＶＨ及びＶＬ領域を利用し、第２のシリーズの構築物は、Ｂ１３Ａ（配列番号４６３～４６４）及びＯ２４Ａ（配列番号４６７～４６８）由来のＶＨ及びＶＬ領域を利用した（表３６及び３７）。

正しいＶＨ／ＶＬ対合を最適化し、ＶＨ／ＶＬ誤対合を最小化するために、Ｖ領域交換を静電ステアリングと組み合わせた（表３８）。３組の静電的に対応する変異を利用した。各シリーズの構築物において、Ｖ領域交換を両配向、例えば、ＲＥＧＮ１０９８７／ＲＥＧＮ１０９３３及びＲＥＧＮ１０９３３／ＲＥＧＮ１０９８７で評価した。各配向において、Ｄ５／Ｄ６ドメインのＶ領域を交換した。Ｈ１及びＨ２鎖のヘテロ二量体化を、ノブ－イントゥ－ホールアプローチ（ノブ：Ｔ３６６Ｗ／Ｓ３５４Ｃ、ホール：Ｔ３６６／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ）を使用して達成した。プロテインＡクロマトグラフィーによる正しく対合された生成物の精製を更に容易にするために、Ｈ１又はＨ２鎖のいずれかがＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ置換を組み込んだ（表３７）。

構築物を、インタクト質量分析によって構造的二重特異性について評価した。タンパク質脱グリコシル化ミックスＩＩ（NEB, Ipswich, MA）を使用してＮ－グリカン及びＯ－グリカンを除去した後、試料を、サイズ排除クロマトグラフィー（Bruker, Billerica, MA）後にMaxis II UHR QTOF機器でＬＳ／ＭＳによって非還元、変性条件下で分析した。室温で、１８０ｍＭ酢酸アンモニウムを含む水の１０分勾配からなる移動相中、２０μＬの流量で、各試料の１～５μｇを注入した。１０，０００の質量分解能のフルスキャンＭＳ取得法を使用した。

デコンボリューション後、正しくＶＨ／ＶＬ対合された四面体抗体（Ｌ１Ｌ２Ｈ１Ｈ２）及び２種の誤対合された副生成物（Ｌ１Ｌ１Ｈ１Ｈ２、Ｌ２Ｌ２Ｈ１Ｈ２）のシグナルの強度を決定した。１６種の構築物について結果が得られた（図５０Ａ～５０Ｃ）。Ｈ１／Ｈ２鎖について著しい誤対合は検出されなかった。主生成物及び副生成物のパーセンテージを算出し、正しい及び誤った生成物の総収率に対して標準化した（表３９）。正しく対合されたＶＨ／ＶＬ構築物（Ｌ１Ｌ２Ｈ１Ｈ２）の収率は、９８．０～９９．７％であり、構築物のうち４種について正しく対合されたＶＨ／ＶＬの収率は、９９．５％よりも高かった。

実施例１９ 二重特異性四面体抗体によるSARS-CoV-2偽ウイルスの中和
実施例１８の四面体抗体構築物を、例１８に記載されるようなSARS-CoV-2偽ウイルス中和アッセイ（Integral Molecular, Philadelphia, PA）を使用してその機能的二重特異性について評価した。各構築物を、２種のSARS-CoV-2バリアント：ＲＥＧＮ１０９８７（遺伝子型Ｎ４３９Ｋ、Ｄ６１４Ｇ；カタログ番号ＲＶＰ－７０３）に対して高度に耐性のＮ４３９Ｌバリアント及びＲＥＧＮ１０９３３（遺伝子型Ｌ１８Ｆ、Ｄ８０Ａ、Ｄ２１５Ｇ、ΔＬ２４２／Ｌ２４３／Ｌ２４４、Ｒ２４６Ｉ、Ｋ４１７Ｎ、Ｎ５０１Ｙ、Ｅ４８４Ｋ、Ａ７０１Ｖ；カタログ番号ＲＶＰ－７２４）に対して高度に耐性の南アフリカΔ３ Ｂ．１．３５１バリアントに対して評価した。二重特異性構築物の各活性を、親抗体ＲＥＧＮ１０９８７及びＲＥＮ１０９３３並びにＲＥＧＮ１０９８７とＲＥＧＮ１０９３３の１：１カクテルであるＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２と直接比較した。この研究に使用したＲＥＧＮ１０９８７、ＲＥＧＮ１０９３３及びＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２のバイオシミラーバージョンは、Lakepharma Inc.（Belmont, CA）で生成した。

１８種の構築物について結果が得られた（図５１Ａ～５１Ｃ、表４０）。対照構築物に関しては、ＲＥＧＮ１０９８７は、Ｎ４３９Ｋバリアントに対してＲＥＧＮ１０９３３よりもおよそ１，０００倍強力ではなく、ＲＥＧＮ１０９３３は、南アフリカバリアントに対してＲＥＧＮ１０９８７よりもおよそ３，０００倍強力ではなかった。ＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２カクテルは、Ｎ４３９バリアントに対してＲＥＧＮ１０９３３よりもおよそ１．５倍強力であり、南アフリカバリアントに対してはＲＥＧＢ１０９８７に対しておよそ同等に強力であった。１８種全ての四価の二重特異性四面体抗体構築物が、Ｎ４３９Ｋ及び南アフリカバリアントの両者を強力に中和し、１８種の二重特異性構築物のうち１５種が、Ｎ４３Ｋバリアントに対してＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２カクテルと少なくとも同程度に強力であり、１８種の二重特異性構築物のうち１４種が、南アフリカバリアントに対してＲＥＧＮ－ＣｏＶ－２カクテルよりもおよそ２～３倍強力であった。

実施例２０ ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＤ１６又はＣＤ３に特異的に結合する２つの別個のＦａｂを含む四価の二重特異性四面体抗体
SARS-CoV-2に対する四価の二重特異性四面体抗体の並外れた活性は、多重特異性標的化薬剤の可能性に研究者の間で強い関心が寄せられている他の分野、例えば、がんにおける幅広い適用性を示唆する。したがって、図３１Ｄ、図３２Ｃ及び図３４Ｄにおいて示される予測された構造を有する３シリーズの構築物を生成し、次いで、その二重特異性について評価した。

第１のシリーズの構築物は、ダラツムマブ（Ｄａ）、複数の骨髄腫を標的とし、治療するために使用されるＦＤＡによって承認された抗ＣＤ３８抗体（配列番号６４１、６８６）、ＨＡ９、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を特異的に標的とし、エンゲージする抗ＣＤ１６抗体（配列番号６４８、６８８）及びＳＰ３４、Ｔ細胞を特異的に標的とし、エンゲージする抗ＣＤ３抗体（配列番号６５７、６９７）に由来するＶＨ及びＶＬ領域を利用した。第２のシリーズの構築物は、４Ｃ８、骨髄腫細胞及びある特定の他の細胞種を標的とする抗ＢＣＭＡ抗体に由来するＶＨ及びＶＬ領域（配列番号６６３、７００）を更に利用した。第３のシリーズの構築物は、Ｂ３４、骨髄腫細胞及びある特定の他の細胞種を標的とする抗ＢＣＭＡ抗体に由来するＶＨ及びＶＬ領域（配列番号６７６、７０３）を更に利用した（表４１、４２、４３）。

正しいＶＨ／ＶＬ対合を最適化し、ＶＨ／ＶＬ誤対合を最小化するために、実施例１８に記載されるようにＶ領域交換を静電ステアリングと組み合わせた（表４４）。さらに、プロテインＡクロマトグラフィーによる正しく対合された生成物の精製を更に容易にするために、一部の構築物、特に、図３１Ｄ及び図３２Ｃに示される予測される構造を有するものでは、Ｈ１鎖はＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ置換を組み込み、Ｈ２鎖は、Ｈ４３５／Ｙ４３６野生型配列を有していた。他の構築物、特に、図３４Ｄに示される予測される構造を有するものでは、Ｈ１及びＨ２鎖は、Ｈ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ置換を組み込み、Ｆｃ鎖は、Ｈ４３５／Ｙ４３６野生型配列を有していた（表４２）。

実施例１８に記載されるようにＮ－グリカン及びＯ－グリカンを除去した後に、構築物を、インタクト質量分析によって構造的二重特異性について評価した。１８種の構築物について結果が得られた（表４５）。Ｈ１／Ｈ２鎖について著しい誤対合は検出されなかった。主生成物及び副生成物のパーセンテージを算出し、正しい及び誤った生成物の総収率に対して標準化した（表４５）。正しく対合されたＶＨ／ＶＬ構築物（Ｌ１Ｌ２Ｈ１Ｈ２）の収率は、ダラツムマブをＨＡ９と組み合わせた場合には９４．６～９８．２％、４Ｃ８をＨＡ９と組み合わせた場合には９４．３～９７．７％、４Ｃ８をダラツムマブと組み合わせた場合には９６．８～９９．５％であった。構築物１８－３０、１８－３１及び１８－３２について、図３４Ｄに示される予測される構造について予想されるように、ＬＣ／ＭＳによって２種の二重特異性生成物が検出され、利用されたＬＣ／ＭＳ法の変性条件と一致した。第１の構造は、四面体抗体のＤ２／Ｄ４／Ｄ６部分に対応し；第２の構造は、四面体抗体のＤ１／Ｄ３部分に対応する。Ｄ２／Ｄ４／Ｄ６部分内に含有された正しく対合されたＶＨ／ＶＬ構築物（Ｌ１Ｌ２Ｈ１Ｈ２）の収率は、９７．１～９９．５％であり；Ｄ１／Ｄ３部分内に含有された正しく対合されたＶＨ／ＶＬ構築物（Ｌ１Ｈ１Ｆｃ）の収率は、９９．４～９９．８％であった。

実施例２１ ＣＤ１９、ＣＤ２０及び４－１ＢＢ受容体に特異的に結合する２つの別個のＦａｂを含む六価の三重特異性四面体抗体
四面体抗体は、がん及び他の疾患の治療のための多価、多重特異性標的化薬剤の作出において次元性の寄与を利用する特有の機会を提供する。したがって、図４０Ｃに示される予測される構造を有する一連の構築物を生成し、したがって、その三重特異性の評価及び適用を可能にした。

このシリーズの三重特異性構築物は、ＦＭＣ６３、Ｂ細胞がんを治療するためにキメラ抗原受容体（ＣＡＲ－Ｔ）の形態で使用されるＦＤＡによって承認された抗ＣＤ１９抗体（配列番号７３４、７０８）並びにリツキシマブ、Ｂ細胞がん及び炎症性疾患を治療するために使用されるＦＤＡによって承認されたスタンドアロンの抗ＣＤ２０抗体（配列番号７３９、７１３）に由来するＶＨ及びＶＬ領域を利用した。さらに、このシリーズの三重特異性構築物は、単鎖４－１ＢＢリガンド（配列番号８４４）（表４６、４７、４８）を利用し、任意に、単鎖ＯＸ４０リガンド（配列番号８４５）又は単鎖ＧＩＴＲリガンド（配列番号８４６）を利用してもよい。単一治療薬によってＣＤ１９及びＣＤ２０を標的化することは、Ｂ細胞がんにおける耐性及び緩解の治療及び予防において重要な機会を提供し、一方で４－１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ又はＧＩＴＲＬの同時送達は、がんの近傍においてＮＫ細胞及びＴ細胞を活性化する重要な機会を提供する。

正しいＶＨ／ＶＬ対合を最適化し、ＶＨ／ＶＬ誤対合を最小化するために、実施例１８に記載されるようにＶ領域交換を静電ステアリングと組み合わせた（表４９）。さらに、プロテインＡクロマトグラフィーによる正しく対合された生成物の精製を更に容易にするために、Ｈ１鎖はＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ置換を組み込んだ。次いで、実施例１８に記載されるようにＮ－グリカン及びＯ－グリカンを除去した後に、構築物を、インタクト質量分析によってその構造的三重特異性について評価した。これらの構築物及び実施例２０のものは、当業者に周知のさまざまなin vitro及びin vivoがん細胞標的化及び細胞傷害性モデルを使用してその機能的二重及び三重特異性について更に評価される。

Claims (38)

1. 第１、第２、第３及び第４のドメインを含む四面体抗体であって、
   ａ）前記第１及び第２のドメインのそれぞれがＦａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、
   ｂ）前記第１及び第２のドメインのそれぞれが、ｉ）前記ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、ｉｉ）前記ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖とを含み、
   ｃ）前記第１のドメインの第１のＮ末端と前記第２のドメインの第１のＮ末端とが、非ペプチジル結合により相互に接続しており、前記非ペプチジル結合が、ｉ）共有結合であるか、又は、ｉｉ）（１）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の二量体化ポリペプチドと、（２）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第１のＮ末端に連結している第２の二量体化ポリペプチドとの間の非共有結合であり、前記第１及び第２の二量体化ポリペプチドが免疫グロブリンのポリペプチドではなく、
   ｄ）前記第３のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第１のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
   ｅ）前記第４のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第２のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第２の二量体化ポリペプチドの前記Ｎ末端に連結している、四面体抗体。
2. ａ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２のドメインがＦａｂドメインである、
   ｂ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインである、
   ｃ）前記第１及び第２のドメインがＦａｂドメインである、
   ｄ）前記第３及び第４のドメインがＦａｂドメインである、
   ｅ）前記第３及び／若しくは第４のドメインが、（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインからなる群より選択される、
   ｆ）前記第３のドメインが、（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインの群から選択され、かつ、前記第４のドメインがＦａｂである、
   ｇ）前記第３のドメインがＩＬ－１５である、
   ｈ）前記第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ、前記第４のドメインがＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインである、
   ｉ）前記第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ、前記第４のドメインがＦａｂである、
   ｊ）前記第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）である、
   ｋ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３及び第４のドメインが（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインからなる群より選択される、
   ｌ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、前記第３のドメインが（ｉ）分泌タンパク質及び（ｉｉ）膜貫通タンパク質の細胞外ドメインからなる群から選択され、かつ、前記第４のドメインがＦａｂである、
   ｍ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３及び第４のドメインがＦａｂドメインである、
   ｎ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）である、
   ｏ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第３及び第４のドメインがＦａｂドメインである、
   ｐ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、前記第２のドメインがＦａｂドメインであり、前記第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ、第４のドメインがＩＬ－１５Ｒα ｓｕｓｈｉドメインである、又は
   ｑ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、前記第２のドメインがＦａｂドメインであり、前記第３のドメインがＩＬ－１５であり、かつ、前記第４のドメインがＦａｂである、
   請求項１に記載の四面体抗体。
3. 前記第１のドメインの第１のＮ末端と前記第２のドメインの第１のＮ末端との間の前記非ペプチジル結合が共有結合である、請求項１又は２に記載の四面体抗体。
4. 前記共有結合が、構造：
   （ここで、
   ａ）Ｘ_ａが、ｉ）ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、ｉｉ）ピリダジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造からなる群から選択される化学構造であり、
   ｂ）Ｒ_ａが、結合であるか、又は、Ｘ_ａを前記第１のドメインの第１のＮ末端と結びつける化学構造であり、
   ｃ）Ｒ_ｂが、結合であるか、又は、Ｘ_ａを前記第２のドメインの第１のＮ末端と結びつける化学構造である）
   を含む、請求項３に記載の四面体抗体。
5. Ｘ_ａが、構造
   （ここで、Ｒ_ｃは、Ｈ、アルキル若しくはアリール、又はその互変異性体である）
   を含む、請求項４に記載の四面体抗体。
6. 前記共有結合が、構造
   （ここで、Ｒ_ｃは、Ｈ、アルキル若しくはアリール、又はその互変異性体である）
   を含む、請求項４又は５に記載の四面体抗体。
7. Ｒ_ａ及びＲ_ｂが、独立して、結合であるか、又は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０若しくはそれ以上の数の部分の鎖を含むか若しくはそれからなる化学構造であり、前記部分が、独立して、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
   （ここで、Ｘ_１はＣＨ又はＮであり、Ｘ_２はＣＨ_２又はカルボニル基であり、Ｒ_５はアリール又はアルキル基であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは
   （ｙ＝１～１００、ｚ＝１～１０）である）
   からなる群から選択される、請求項４～６のいずれか一項に記載の四面体抗体。
8. Ｒ_ａ及び／又はＲ_ｂが、それぞれ独立して、
   ａ）［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む；
   ｂ）ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）又は多糖類基を含む；
   ｃ）Ｃ_１～Ｃ_４アルキル基を含む；
   ｄ）スクシンイミドを含む；
   ｅ）アミンを含む；
   ｆ）スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル又はアジポイルを含む；
   ｇ）マロニルを含む；
   ｈ）アミノ酸を含む；
   ｉ）システインを含む；
   ｊ）リシンを含む；
   ｋ）［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
   からなる群から選択される３つの部分の鎖からなる；
   ｌ）［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
   からなる群から選択される４つの部分の鎖からなる；
   ｍ）［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、ポリアルキレングリコール、ポリオキシアルキル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリビニルアルキルエーテル、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸－グリコール酸）、多糖類、分枝した残基、Ｃ_１～Ｃ_１０アルキル、Ｃ_３～Ｃ_１０シクロアルカン、Ｃ_２～Ｃ_１０アルケン、Ｃ_５～Ｃ_１０シクロアルケン、アミン、イオウ、酸素、スクシンイミド、マレイミド、グリセロール、トリアゾール、イソオキサゾリジン、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、Ｃ_２～Ｃ_５アシルアミノ、Ｃ_２～Ｃ_５アシルオキシ、スクシニル、マロニル、グルタリル、フタリル、アジポイル、アミノ酸、アリール基、ヘテロアリール基、カルバメート、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
   からなる群から選択される５つの部分の鎖からなる；
   ｎ）リシンに結合した［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む；
   ｏ）スクシンイミド基に結合したＣ_１～Ｃ_４アシル基を含む；
   ｐ）Ｃ_１～Ｃ_４アシルに結合したリシンを含む
   ｑ）グルタリルに結合した［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ基を含む；
   ｒ）［ＰＥＧ（ｙ）］ｚ、Ｃ_２～Ｃ_５アシル、スクシニル、マロニル、グルタリル、アミノ酸、ジヒドロピリダジンと縮合したシクロオクタンを含む化学構造、トリアゾールと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、イソオキサゾリジンと縮合したシクロオクテンを含む化学構造、ジベンゾシクロオクテン、ジベンゾアザシクロオクテン、
   （ここで、Ｘ_１はＣＨ又はＮであり、Ｘ_２はＣＨ_２又はカルボニル基であり、Ｒ_５はアリール又はアルキル基であり、［ＰＥＧ（ｙ）］ｚは、
   （ｙ＝１～１００、ｚ＝１～１０）である）
   からなる群から選択される、３、４又は５つの部分の鎖からなる；
   ｓ）結合である；
   ｔ）システインである；
   ｕ）直鎖状構造を有する；
   ｖ）分枝した構造を有する；
   ｗ）構造
   を有する；
   ｘ）
   （ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
   である；
   ｙ）
   （ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０であり、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０であり、ｚは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
   である；
   ｚ）
   （ここで、ｘは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０であり、ｚが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
   である；又は
   ａａ）
   （ここで、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、１～３０、１～４０又は１～５０である）
   である、請求項７に記載の四面体抗体。
9. Ｒ_ａ及び／又はＲ_ｂが、部分
   （ここで、Ｘ_１はＣＨ又はＮであり、Ｘ_２はＣＨ_２又はカルボニル基である）
   を含む、請求項７又は８に記載の四面体抗体。
10. 前記非ペプチジル結合が、前記第１のドメインの第１のＮ末端に連結した第１の二量体化ポリペプチドと、前記第２のドメインの第１のＮ末端に連結した第２の二量体化ポリペプチドとの間の非共有結合である、請求項１又は２に記載の四面体抗体。
11. 前記第１及び第２の二量体化ポリペプチドが、
    ａ）ロイシンジッパードメイン、
    ｂ）コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）、及び
    ｃ）コレクトリンドメイン（ＣＤ）
    からなる群より選択される、請求項１０に記載の四面体抗体。
12. ａ）前記第１の二量体化ポリペプチドが、前記第２の二量体化ポリペプチドと同一であり、かつ
    ｂ）前記二量体化ポリペプチドがホモ二量体を形成する、
    請求項１０又は１１に記載の四面体抗体。
13. ａ）前記第１の二量体化ポリペプチドが前記第２の二量体化ポリペプチドとは異なり、かつ
    ｂ）前記第１と第２の二量体化ポリペプチドとがヘテロ二量体を形成する、
    請求項１０又は１１に記載の四面体抗体。
14. 前記第１及び第２の二量体化ポリペプチドは、互いの存在下で、形成するホモ二量体が、３０％、２０％、１０％、５％、４％、３％、２％又は１％未満である、請求項１３に記載の四面体抗体。
15. ａ）前記第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ペプチダーゼドメイン（ＰＤ）であり、かつ
    ｂ）前記第１及び第２の二量体化ポリペプチドが、それぞれＡＣＥ２コレクトリン様ドメイン（ＣＬＤ）である、
    請求項１０～１２のいずれか一項に記載の四面体抗体。
16. 前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインである、請求項１５に記載の四面体抗体。
17. ａ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３のドメインが第１の種類のＦａｂドメインである、
    ｂ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３及び第４のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｃ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２及び第３のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、又は
    ｄ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第３及び第４のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    請求項１０～１５のいずれか一項に記載の四面体抗体。
18. 第５のドメインを更に含み、前記第５のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
    ａ）前記第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端、
    ｂ）前記第１のドメインの第２のＮ末端、又は
    ｃ）第３の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結している、
    ここで、前記第３の二量体化ポリペプチドは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第２のＮ末端と連結している、請求項１０～１４及び１７のいずれか一項に記載の四面体抗体。
19. ａ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第５のドメインが第１の種類のＦａｂドメインである、
    ｂ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｃ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｄ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３、第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｅ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｆ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第３及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｇ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、又は
    ｈ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第３、第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、第３の種類のＦａｂドメイン及び第４の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    請求項１８に記載の四面体抗体。
20. 第５及び／又は第６のドメインを更に含み、
    ａ）前記第５のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
    ｉ）前記第１の二量体化ポリペプチドのＮ末端、
    ｉｉ）前記第１のドメインの第２のＮ末端、又は
    ｉｉｉ）第３の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
    ここで、前記第３の二量体化ポリペプチドは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第２のＮ末端に連結している、
    ｂ）前記第６のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
    ｉ）前記第２の二量体化ポリペプチドのＮ末端、
    ｉｉ）前記第２のドメインの第２のＮ末端、又は
    ｉｉｉ）第４の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結している、
    ここで、前記第４の二量体化ポリペプチドは、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第２のＮ末端に連結している、
    請求項１０～１９のいずれか一項に記載の四面体抗体。
21. ａ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第５のドメインが第１の種類のＦａｂドメインである、
    ｂ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｃ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｄ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第３、第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｅ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン及び第２の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｆ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第３及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｇ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン及び第３の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、
    ｈ）前記第１のドメインがＦｃドメインであり、かつ、前記第２、第３、第４及び第５のドメインが、独立して、第１の種類のＦａｂドメイン、第２の種類のＦａｂドメイン、第３の種類のＦａｂドメイン及び第４の種類のＦａｂドメインからなる群から選択される、又は
    ｉ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、前記第３及び第４のドメインがＡＣＥ２ペプチダーゼドメインであり、かつ、前記第５及び第６のドメインがＦａｂドメインである、
    請求項２０に記載の四面体抗体。
22. 第７及び／又は第８のドメインを更に含み、
    ａ）前記第７のドメインが、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
    ｉ）前記第１のドメインの第１のＣ末端、又は
    ｉｉ）前記第１のドメインの第２のＣ末端
    に連結しており、
    ｂ）前記第８のドメインが、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、
    ｉ）前記第２のドメインの第１のＣ末端、又は
    ｉｉ）前記第２のドメインの第２のＣ末端
    に連結している、
    請求項１～２１のいずれか一項に記載の四面体抗体。
23. ａ）前記第３、第４、第５及び第６のドメインが、それぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、かつ、前記二量体化ポリペプチドが、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤである、
    ｂ）前記第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、前記第５及び第６のドメインがそれぞれＦａｂドメインであり、かつ、前記二量体化ポリペプチドが、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤである、
    ｃ）前記第３及び第４のドメインが、それぞれＦａｂドメインであり、前記第５及び第６のドメインが、それぞれＡＣＥ２ ＰＤであり、かつ、前記二量体化ポリペプチドが、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤである、又は
    ｄ）前記第１及び第２のドメインがＦｃドメインであり、前記第３及び第４のドメインがＡＣＥ２ ＰＤであり、前記第５及び第６のドメインがＦａｂドメインであり、前記二量体化ポリペプチドが、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤであり、かつ、前記第１及び第２のドメインが、ペプチドリンカーを介してその各二量体化ポリペプチドとそれぞれ結びついており、好ましくは、そのようなドメイン及びリンカーが、
    ｉ）前記Ｆｃドメインが、
    （１）ヘテロ二量体である、
    （２）ＩｇＧ１ Ｆｃドメインである、
    （３）前記ＦｃドメインがＦｃγ受容体結合活性を欠くように発現停止変異を含み、好ましくはそのような変異はＰ３２９Ｇ／Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＰＧＬＡＬＡ）の組合せである、
    （４）ＦｃＲｎ活性を増強させる変異を含み、好ましくはそのような変異は前記四面体抗体の半減期を延長し、好ましくは、前記変異はＬ３０９Ｄ／Ｑ３１１Ｈ／Ｎ４３４Ｓ（ＤＨＳ）の組合せである、及び
    （５）プロテインＡ結合部位を切断する変異を含み、好ましくはそのような変異はＨ４３５Ｒ／Ｙ４３６Ｆ（ＨＹ／ＲＦ）である、
    という特徴の１つ以上又は全てにより特徴付けられる、
    ｉｉ）前記ＡＣＥ２ペプチダーゼドメインが、そのアンジオテンシン変換酵素活性をブロックする変異を含み、好ましくはそのような変異はＨ３７８Ａ変異である、
    ｉｉｉ）前記Ｆａｂドメインが、マウス可変領域を含むキメラＦａｂドメインである、
    ｉｖ）前記ペプチドリンカーが、それぞれ、２３アミノ酸長であり、かつ、ＴＮＦ受容体のストーク領域に由来し、好ましくは前記ＴＮＦ受容体がＴＮＦ受容体１Ｂであり、更により好ましくは前記ペプチドリンカーが配列番号４４６８で表されるアミノ酸配列からなる、
    ｖ）そのようなドメイン及びペプチドリンカーが３つの異なる種類のポリペプチド鎖により形成され、より好ましくは前記３つの異なる種類のポリペプチド鎖が、Ｈ１、Ｌ２及びＨ２で表され、前記Ｈ１鎖が配列番号５２２で表されるアミノ酸配列を含み、前記Ｌ２鎖が配列番号４６５で表されるアミノ酸配列を含み、かつ、前記Ｈ２鎖が配列番号５３４で表されるアミノ酸配列を含む
    という特徴の１つ以上又は全てにより特徴付けられる、
    請求項２０に記載の四面体抗体。
24. ａ）前記第３及び第４のドメインが、それぞれＡＣＥ２ ＰＤである、
    ｂ）前記第５のドメインが、存在する場合、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して第３の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、前記第３の二量体化ポリペプチドが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第２のＮ末端に連結している、
    ｃ）前記第６のドメインが、存在する場合、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して第４の二量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、前記第４の二量体化ポリペプチドが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第２のＮ末端に連結している
    、かつ、
    ｄ）前記第１、第２、第３及び第４の二量体化ポリペプチドが、それぞれＡＣＥ２ ＣＬＤである、
    請求項２０に記載の四面体抗体。
25. ＡＣＥ２ ＰＤが、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸１８～６１５又はその一部分を含むか又はそれからなる、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の四面体抗体。
26. ＡＣＥ２ ＣＬＤが、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸６１６～７４０又はその一部分を含むか又はそれからなる、請求項１４～２４のいずれか一項に記載の四面体抗体。
27. ＡＣＥ２ ＰＤが触媒的に活性である、請求項１４～２６のいずれか一項に記載の四面体抗体。
28. ＡＣＥ２ ＰＤが触媒的に不活性である、請求項１４～２６のいずれか一項に記載の四面体抗体。
29. ＡＣＥ２ ＰＤが、Ｒ２７３Ｑ又はＨ３７８Ａ変異を含む、請求項２８に記載の四面体抗体。
30. 前記Ｆｃドメインが、Ｆｃγ受容体結合活性を欠く、請求項１４～２９のいずれか一項に記載の四面体抗体。
31. 前記Ｆｃドメインが、Ｐ３２９Ｇ変異、Ｌ２３４Ａ変異及びＬ２３５Ａ変異を含む、請求項３０に記載の四面体抗体。
32. ａ）前記第５のドメイン、第３の二量体化ポリペプチド及び前記第１のドメインの第２のポリペプチド鎖が、連続したアミノ酸のストレッチである、
    ｂ）前記第３のドメイン、第１の二量体化ポリペプチド及び前記第１のドメインの第１のポリペプチド鎖が、連続したアミノ酸のストレッチである、
    ｃ）前記第４のドメイン、第２の二量体化ポリペプチド及び前記第２のドメインの第１のポリペプチド鎖が、連続したアミノ酸のストレッチである、かつ、
    ｄ）前記第６のドメイン、第４の二量体化ポリペプチド及び前記第２のドメインの第２のポリペプチド鎖が、連続したアミノ酸ストレッチである、
    ここで、連続したアミノ酸の各ストレッチが、配列番号７４～１１９からなる群から選択される配列で表されるアミノ酸配列からなる、請求項２４に記載の四面体抗体。
33. 第１、第２、第３、第４、第５及び第６のドメインを含む八面体抗体であって、
    ａ）前記第１、第２及び第３のドメインのそれぞれが、Ｆａｂドメイン及びＦｃドメインからなる群より選択され、
    ｂ）前記第１、第２及び第３のドメインのそれぞれが、ｉ）前記ドメインの第１のＮ末端を含む第１のポリペプチド鎖と、ｉｉ）前記ドメインの第２のＮ末端を含む第２のポリペプチド鎖とを含み、
    ｃ）前記第１のドメインの第１のＮ末端、前記第２のドメインの第１のＮ末端、及び前記第３のドメインの第１のＮ末端が、非ペプチジル結合により相互に接続しており、前記非ペプチジル結合が、ｉ）分枝した共有結合であるか、又は、ｉｉ）（１）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第１のＮ末端に連結している第１の三量体化ポリペプチド、（２）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第１のＮ末端に連結している第２の三量体化ポリペプチド、及び、（３）ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第３のドメインの前記第１のＮ末端に連結している第３の三量体化ポリペプチドとの間の非共有結合であり、前記第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドが免疫グロブリンのポリペプチドではなく、
    ｄ）前記第４のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第１のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第１の三量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
    ｅ）前記第５のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第２のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第２の三量体化ポリペプチドのＮ末端に連結しており、
    ｆ）前記第６のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第３のドメインの第２のＮ末端、又は、ｉｉ）前記第３の三量体化ポリペプチドのＮ末端に連結している、八面体抗体。
34. 前記非ペプチジル結合が、前記第１のドメインの第１のＮ末端に連結した第１の三量体化ポリペプチド、前記第２のドメインの第１のＮ末端に連結した第２の三量体化ポリペプチド、及び前記第３のドメインの第１のＮ末端に連結した第３の三量体化ポリペプチドの間の非共有結合であり、前記第１、第２及び第３の三量体化ポリペプチドが、ＯＸ４０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ４、ＣＤ４０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ５、ＦＡＳＬ／ＴＮＦＬＳＦ６、ＣＤ７０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ７、ＣＤ３０Ｌ／ＴＮＦＬＳＦ８、４－１ＢＢＬ／ＴＮＦＬＳＦ９、ＴＲＡＩＬ／ＴＮＦＬＳＦ１０、ＲＡＮＫＬ／ＴＮＦＬＳＦ１１、ＴＷＥＡＫ／ＴＮＦＬＳＦ１２、ＡＰＲＩＬ／ＴＮＦＬＳＦ１３、ＢＡＦＦ／ＴＮＦＬＳＦ１３Ｂ、ＬＩＧＴ／ＴＮＦＬＳＦ１４、ＶＥＧＩ／ＴＮＦＬＳＦ１５、ＧＩＴＲＬ／ＴＮＦＬＳＦ１８、エクトジスプラシンＡＴＮＦＬＳＦ１９、ＴＮＦ／ＴＮＦＬＳＦ２、リンホトキシンα／ＴＮＦＬＳＦ１及びリンホトキシンβ／ＴＮＦＬＳＦ３からなる群のＴＮＦリガンドスーパーファミリーメンバーより選択される、請求項３３に記載の八面体抗体。
35. 第７、第８及び／又は第９のドメインを更に含み、
    ａ）前記第７のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第１のドメインの第２のＮ末端に連結しており、
    ｂ）前記第８のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第２のドメインの第２のＮ末端に連結しており、及び／又は
    ｃ）前記第９のドメインが、そのＣ末端において、ペプチド結合により若しくはペプチドリンカーを介して前記第３のドメインの第２のＮ末端に連結している、
    請求項３３又は３４に記載の八面体抗体。
36. 第１０、第１１及び／又は第１２のドメインを更に含み、
    ａ）前記第１０のドメインが、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第１のドメインの第１のＣ末端、又は、ｉｉ）前記第１のドメインの第２のＣ末端に連結しており、
    ｂ）前記第１１のドメインが、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第２のドメインの第１のＣ末端、又は、ｉｉ）前記第２のドメインの第２のＣ末端に連結しており、
    ｃ）前記第１２のドメインが、そのＮ末端において、ペプチド結合により又はペプチドリンカーを介して、ｉ）前記第３のドメインの第１のＣ末端、又は、ｉｉ）前記第３のドメインの第２のＣ末端に連結している、
    請求項３３～３５のいずれか一項に記載の八面体抗体。
37. ａ）前記四面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７及び第８のドメインの１つ以上、又は前記八面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１及び第１２のドメインの１つ以上が、Ｆｃドメインであり、前記１つ以上のＦｃドメインが、独立して、明細書に記載したＦｃドメインから選択される、
    ｂ）前記四面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７及び第８のドメインの１つ以上、又は前記八面体抗体の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１及び第１２のドメインの１つ以上が、Ｆａｂドメインであり、前記１つ以上のＦａｂドメインが、独立して、明細書に記載したＦａｂドメインから選択される、
    ｃ）前記四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７及び第８のドメインの１つ以上、又は前記八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１及び第１２のドメインの１つ以上が、分泌タンパク質であり、前記１つ以上の分泌タンパク質が、独立して、明細書に記載した分泌タンパク質から選択される、
    ｄ）前記四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７及び第８のドメインの１つ以上、又は前記八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１及び第１２のドメインの１つ以上が、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインであり、前記１つ以上の膜貫通タンパク質の細胞外ドメインが、独立して、明細書に記載した膜貫通タンパク質の細胞外ドメインから選択される、
    ｅ）前記四面体抗体の第３、第４、第５、第６、第７及び第８のドメインの１つ以上、又は前記八面体抗体の第４、第５、第６、第７、第８、第９、第１０、第１１及び第１２のドメインの１つ以上が、
    ｉ）疾患に罹患した対象を治療するための承認された薬物である化合物の構造を含む、
    ｉｉ）生物学的に活性な、分子量が１０００ダルトン未満の有機化合物、ＤＮＡアプタマー、ＲＮＡアプタマー、オリゴヌクレオチド又はタンパク質の構造を含む、
    ｉｉｉ）一級又は二級アミンを含む、
    ｉｖ）アリピプラゾール又はオセルタミビルである、
    ｖ）呼吸器系薬物、抗喘息薬、鎮痛剤、抗うつ薬、抗狭心症薬、抗不整脈剤、抗高血圧剤、抗糖尿病薬、抗ヒスタミン薬、抗感染症薬、抗生物質、抗炎症剤、抗パーキンソン病薬、抗精神病薬、解熱薬、抗潰瘍薬、注意欠陥多動障害（ＡＤＨＤ）薬、中枢神経系刺激剤、うつ血除去薬、又は精神刺激薬である、
    ｖｉ）アルプレノロール、アセブトロール、アミデフリン、アミネプチン、アモスラロール、アモキサピン、アンフェタミニル、アテノロール、アトモキセチン、バロフロキサシン、バメタン、ベフノロール、ベナゼプリル、ベンフルオレックス、ベンゾクタミン、ベタヒスチン、ベタキソロール、ベバントロール、ビフェメラン、ビソプロロール、ブリンゾラミド、ブフェニオド（bufeniode）、ブテタミン、カミロフィン、カラゾロール、カルチカイン、カルベジロール、セファエリン、シプロフロキサシン、クロザピン、クロベンゾレックス、クロルプレナリン、シクロペンタミン、デラプリル、デメキシプチリン、デノパミン、デシプラミン、デスロラタジン、ジクロフェナク、ジメトフリン、ジオキサドロール、ドブタミン、ドペキサミン、ドリペネム、ドルゾラミド、ドロプレニラミン、デュロキセチン、エルトプラジン、エナラプリル、エノキサシン、エピネフリン、エルタペネム、エサプラゾール、エスモロール、エトキサドロール、ファスジル、フェンジリン、フェネチリン、フェンフルラミン、フェノルドパム、フェノテロール、フェンプロポレクス、フレカミド（flecamide）、フルオキセチン、フォルモテロール、フロバトリプタン、ガボキサドール、ガレノキサシン、ガチフロキサシン、グレパフロキサシン、ヘキソプレナリン、イミダプリル、インダルピン、インデカイニド、塩酸インデロキサジン、イソクスプリン、イスプロニクリン、ラベタロール、ランジオロール、ラパチニブ、レボファセトペラン、リシノプリル、ロメフロキサシン、ロトラフィバン、マプロチリン、メカミラミン、メフロキン、メピンドロール、メロペネム、メタプラミン、メタプロテレノール、メトキシフェナミン、右旋性メチルフェニデート、メチルフェニデート、メチプラノロール、メトプロロール、ミトキサントロン、ミバゼロール、モエキシプリル、モプロロール、モキシフロキサシン、ネビボロール、ニフェナロール、ニプラジロール、ノルフロキサシン、ノルトリプチリン、ニリドリン、オランザピン、オキサムニキン、オクスプレノロール、オキシフェドリン、パロキセチン、ペルヘキシリン、フェンメトラジン、フェニレフリン、フェニルプロピルメチラミン、フォレドリン、ピシロレックス、ピメチリン、ピンドロール、ピペミド酸、ピリドカイン、プラクトロール、プラドフロキサシン、プラミペキソール、プラミベリン、プレナルテロール、プレニラミン、プリロカルン（prilocalne）、プロカテロール、プロネタロール、プロパフェノン、プロプラノロール、プロピルヘキセドリン、プロトキロール、プロトリプチリン、シュードエフェドリン、レボキセチン、ラサギリン、(r)-ラサギリン、レピノタン、レプロテロール、リミテロール、リトドリン、サフィナミド、サルブタモール／アルブテロール、サルメテロール、サリゾタン、セルトラリン、シロドシン、ソタロール、ソテレノール、スパルフロキサシン、スピラプリル、スルフィナロール、シネフリン、タムスロシン、テバニクリン、チアネプチン、チロフィバン、トレトキノール、トリメタジジン、トロキシピド、バレニクリン、ビルダグリプチン、ビロキサジン、ビキジル（viquidil）又はキサモテロールである、
    ｖｉｉ）生物学的に活性なタンパク質を含む、
    ｖｉｉｉ）標的結合活性を有するように生物学的に活性である、
    ｉｘ）独立的にフォールディングするタンパク質又はその一部分である、
    ｘ）グリコシル化タンパク質である、
    ｘｉ）鎖内ジスルフィド結合を含む、
    ｘｉｉ）サイトカインに結合する、
    ｘｉｉｉ）ＴＮＦαと結合する、
    ｘｉｖ）心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、カルシトニン、副腎皮質刺激ホルモン放出ホルモン（ＣＲＨ）、エンドセリン、エキセナチド、胃抑制ペプチド（ＧＩＰ）、グルカゴン様ペプチド－１（ＧＬＰ－１）、グルカゴン様ペプチド－２（ＧＬＰ－２）、ＧＬＰ－１又はＧＬＰ－２のアナログ、グルカゴン血管作用性小腸ペプチド（ＧＶＩＰ）、グレリン、ペプチドＹＹ若しくはセクレチン、又はその一部分を含む、
    ｘｖ）配列ＨＧＥＧＴＦＴＳＤＶＳＳＹＬＥＥＱＡＡＫＥＦＩＡＷＬＶＫＧＲＧ（配列番号４６５７）内の連続したアミノ酸のストレッチを含む、
    ｘｖｉ）抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の重鎖に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含む、
    ｘｖｉｉ）抗体のＦａｂ又はＦａｂ’の軽鎖に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含む、
    ｘｖｉｉｉ）抗体の少なくとも１つのＦａｂ若しくはＦａｂ’、又は少なくとも１つＦａｂ若しくはＦａｂ’の一部分を含む、
    ｘｉｘ）抗体のＦａｂ－１若しくはＦａｂ’１、又はその一部分を含む、
    ｘｘ）抗体のＦａｂ－２若しくはＦａｂ’２、又はその一部分を含む、
    ｘｘｉ）抗体の２つのＦａｂ又はＦａｂ’の腕部を含む、
    ｘｘｉｉ）単鎖抗体に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含む、又は
    ｘｘｉｉｉ）ＴＮＦα受容体に存在する連続したアミノ酸のストレッチと同一である、少なくとも１つの連続したアミノ酸のストレッチを含む、
    ｆ）前記四面体又は八面体抗体が共有結合を含み、前記共有結合が、明細書に記載した共有結合から選択され、又は明細書に記載したヘテロ二官能性架橋剤を含む、並びに／又は
    ｇ）前記四面体又は八面体抗体が、１つ以上のペプチドリンカーを含み、前記１つ以上のペプチドリンカーが、独立して、
    ｉ）配列ＴＳＴＳＰＴＲＳＭＡＰＧＡＶＨＬＰＱＰＶＳＴＲＳＱＨＴＱＰＴＰＥＰＳＴＡＰＳＴＳＦＬＬＰＭＧＰＳＰＰＡＥＧＳＴＧＤ（配列番号３２２７）であるか若しくは当該配列内の連続したアミノ酸のストレッチ、
    ｉｉ）配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧＧＡＧＧＧ（配列番号３２２６）であるか若しくは当該配列内の連続したアミノ酸のストレッチ、又は
    ｉｉｉ）明細書に記載したペプチドリンカー
    から選択される、
    請求項１～３６のいずれか一項に記載の四面体又は八面体抗体。
38. 組成物内のペプチド含有分子の割合（w/w）として、請求項１～３７のいずれか一項に記載の四面体又は八面体抗体を、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％、少なくとも４６％、少なくとも４７％、少なくとも４８％、少なくとも４９％、少なくとも５０％、少なくとも５１％、少なくとも５２％、少なくとも５３％、少なくとも５４％、少なくとも５５％、少なくとも５６％、少なくとも５７％、少なくとも５８％、少なくとも５９％、少なくとも６０％、少なくとも６１％、少なくとも６２％、少なくとも６３％、少なくとも６４％、少なくとも６５％、少なくとも６６％、少なくとも６７％、少なくとも６８％、少なくとも６９％、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％を含む組成物。

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