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MX2013000491A - Conjugados de anticuerpos multifuncionales. - Google Patents

Conjugados de anticuerpos multifuncionales.

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Publication number
MX2013000491A
MX2013000491A MX2013000491A MX2013000491A MX2013000491A MX 2013000491 A MX2013000491 A MX 2013000491A MX 2013000491 A MX2013000491 A MX 2013000491A MX 2013000491 A MX2013000491 A MX 2013000491A MX 2013000491 A MX2013000491 A MX 2013000491A
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MX
Mexico
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antibody
seq
mac
further characterized
effector
Prior art date
Application number
MX2013000491A
Other languages
English (en)
Inventor
David Tumelty
Alice Lee
Abhijit Suresh Bhat
Curt William Bradshaw
Olivier Alexandre Laurent
Richard Ryan Preston
Laurence Diane Wood
Wei Hong Yu
Original Assignee
Covx Technologies Ireland Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
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Publication date
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Abstract

La presente invención se refiere a Conjugados de Anticuerpos Multifuncionales, que comprenden un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende al menos un fragmento de una región kappa constante de cadena ligera (CLx), que comprende K188 de acuerdo con la numeración de Kabat; un engarce que comprende la fórmula X-Y-Z, en la que Z es un grupo que está conectado covalentemente al anticuerpo a través de la cadena lateral de K188, Y es una cadena de conexión biológicamente compatible lineal o ramificada y X es un grupo conectado covalentemente a al menos un Resto Efector; la invención proporciona además compuestos y composiciones de MAC específicos de la invención.

Description

CONJUGADOS DE ANTICUERPOS MULTIFUNCIONALES ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El desarrollo de agentes terapéuticos bifuncionales tiene un gran potencial para aumentar las estrategias de terapia de combinación. Un agente terapéutico bifuncional puede proporcionar el beneficio de una terapia de combinación modulando 2 rutas diferentes con una entidad terapéutica. Además, los agentes terapéuticos bifuncionales también pueden beneficiarse de sinergias entre rutas y demostrar una actividad aumentada en comparación con agente monofuncionales. Además, los agentes terapéuticos bifuncionales pueden proporcionar beneficios en términos de costes de fabricación, almacenamiento y envío reducidos, asi como reducir el número de terapias administradas al paciente y simplificar los regímenes de dosificación.
El IGF1 R es una proteína heterotetramérica transmembrana que tiene dos cadenas a extracelulares y 2 cadenas ß transmembrana en una configuración unida por disulfuro (ß-a- -ß). El IGF1 R se une al IGF1 con gran afinidad. El IGF1 es un péptido de 70 aminoácidos que se produce principalmente por el hígado en respuesta a la estimulación por hormona del crecimiento, pero puede sintetizarse por casi cualquier tejido en el cuerpo y circula en suero a concentraciones de 100-200 ng/ml. La señalización de IGF1 R puede desempeñar un papel en múltiples tipos tumorales y está específicamente implicada en el cáncer pulmonar. Por ejemplo, niveles plasmáticos elevados de IGF1 se asocian con un riesgo aumentado de cáncer pulmonar. Además, IGF1 , IGF2 e IGF1 R se expresan por células pulmonares normales pero se sobreexpresan por células de cáncer pulmonar. La señalización de IGF1 R también se ha implicado en el cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, sarcoma, mieloma múltiple y otros tumores malignos. Los documentos WO02053596, WO2005016967, WO2005005635 y WO2009032145 desvelan anticuerpos contra IGF1 R y porciones de unión a antigeno de los mismos.
La angiopoyetina-1 (Ang1) y la angiopoyetina-2 (Ang2) median el proceso de angiogénesis como ligandos del receptor de células endoteliales Tie2, junto con VEGF y otros reguladores de la angiogénesis. La Ang1 estimula la fosforilación de Tie2, recluta pericitos hacia vasos sanguíneos recién formados y promueve su maduración. Se sabe que la Ang2 es angiogénica y se sobreexpresa en muchos cánceres. La Ang2 compite con la Ang1 por la unión de Tie2, promueve la disociación de pericitos y da como resultado vasos sanguíneos inestables. En presencia de VEGF y otros factores angiogénicos, las células endoteliales en estos vasos inestables proliferan y migran para formar nuevos vasos sanguíneos.
Aproximadamente el 50 % de los pacientes con tumores sólidos tienen una expresión aumentada de Ang2, pero los niveles de Ang2 en tejidos cancerosos son muy variables. Una mayor expresión de Ang2 está claramente correlacionada con una escasa supervivencia, enfermedad en fase posterior y cánceres más invasivos. También se ha correlacionado una menor proporción entre Ang1 y Ang2 con un mal pronóstico para cáncer de ovario. Se describe que la expresión de Tie2 está regulada positivamente en el carcinoma hepatocelular, astrocitomas, sarcoma de Kaposi, angiosarcoma cutáneo y carcinoma pulmonar no microcitico. Tie2 se sobreexpresa en los vasos sanguíneos de muchos tumores. Los monocitos que expresan Tie2 contribuyen a la formación de vasos sanguíneos tumorales. Datos recién publicados demuestran que el secuestro de Ang2 específicamente puede inhibir el crecimiento tumoral y provocar la regresión de tumores en fase determinada. El documento WO2008056346 devela péptidos de unión a Ang2.
Dirigirse tanto a IGF1 R como a Ang2 en la misma terapia puede mostrar ser una herramienta eficaz para los oncólogos la usen en múltiples entornos de tratamiento. Dichas estrategias se han postulado (por ejemplo, en los documentos WO2009088805 y WO2010040508), pero ninguna se ha autorizado hasta la fecha. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar terapias oncológicas alternativas que se dirijan tanto a IGF-1 R como a Ang2.
La referencia a cualquier técnica en el presente documento descriptiva no es, ni debe interpretarse como, un reconocimiento de ninguna forma o sugerencia de que la técnica citada forme parte del conocimiento general común.
A BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC), que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo conjugado con al menos un Resto Efector, y sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros, tautómeros, solvatos y profármacos del mismo. La invención también proporciona composiciones farmacéuticas y muestras que comprenden MAC de la invención.
La presente invención también proporciona un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC), que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, conjugado con al menos un péptido de unión a Ang2.
La presente invención proporciona un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC), que comprende un anticuerpo anti-IGF1 R o porción de unión a antígeno del mismo, conjugado con al menos un péptido de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el al menos un péptido de unión a Ang2 se conjuga con la cadena lateral de un resto de conjugación del anticuerpo mediante un engarce.
En algunas realizaciones, el Resto Efector se une covalentemente a la cadena lateral de un resto de lisina en la región Fab del anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo. En algunas realizaciones, el Resto Efector se une covalentemente a la cadena lateral de un resto de lisina en la región constante de la cadena pesada (CH) o constante de la cadena ligera (CL). La reacción del Resto Efector con el domino CL del anticuerpo es particularmente deseable para minimizar, o evitar, cualquier interferencia con la unión de la porción Fe del anticuerpo a receptores de Fe (tales como FcyR y FcRn) o con la unión del anticuerpo a su diana respectiva. Por el contrario, es probable que la conjugación del Resto Efector respectivo con la porción Fe del anticuerpo disminuya la semivida del anticuerpo in vivo y/o su capacidad para interaccionar con el sistema inmune (función efectora). La conjugación del Resto Efector en la región variable de la cadena pesada (VH) o variable de la cadena ligera (VL) del anticuerpo acarrea un riesgo de disminuir la unión del anticuerpo a su afín.
En algunas realizaciones, el Resto Efector se une covalentemente a la cadena lateral de un resto de lisina en el dominio de la región constante de cadena ligera kappa (CLK). La conjugación preferente del Resto Efector con el dominio CLK simplifica la creación de isotipos de MAC permitiendo cambios de isotipo de los dominios CH del anticuerpo sin afectar a los sitios de conjugación del Resto Efector con el anticuerpo.
El Resto Efector puede unirse covalentemente a la cadena lateral de K80 de la región constante del domino de cadena ligera kappa (CLK), (SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47) (K188 de acuerdo con la numeración de Kabat). En algunas realizaciones, el Resto Efector se une covalentemente a K80 de la SEQ ID NO: 15. K80 de la SEQ ID NO: 15 se localiza lejos de las regiones clave del anticuerpo respectivo, tales como la región de paratopo, domino de unión a FcRn, bisagra, dominios de unión a FcR; esto proporciona la ventaja de que la unión preferentemente en estos sitios limita la cantidad de interferencia con la interacción de antigeno-anticuerpo cuando el MAC se conjuga con el Resto Efector.
En algunos aspectos, el Resto Efector se une covalentemente a K* del motivo K*HK. El K* del motivo K*HK puede corresponder a K80 de la SEQ ID NO: 15. En algunos aspectos, el Resto Efector se une covalentemente a K188 del motivo K188H localizado en la región CLK, de acuerdo con el sistema de numeración de Kabat. En algún aspecto, la región CLK comprende al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK comprende la SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47.
En algunos aspectos, la región CLK comprende al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15. En algunos aspectos, la región CLK comprende la SEQ ID NO: 15. En algún aspecto, la región CLK comprende al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 45. En algunos aspectos, la región CLK comprende la SEQ ID NO: 45. En algún aspecto, la región CLK comprende al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 46. En algunos aspectos, la región CLK comprende la SEQ ID NO: 46. En algún aspecto, la región CLK comprende al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 47. En algunos aspectos, la región CLK comprende la SEQ ID NO: 47.
En algunos aspectos, la región CLK comprende la SEQ ID NO: 45 ó 47. Cuando la región CLK comprende la SEQ ID NO: 45 ó 47 en parte o en su totalidad, x82 puede seleccionarse del grupo que consiste en K, R, G, A, V, L, I, S, T, C, M, N, Q, D, E, H, F, W o Y. En algunos aspectos, x82 pues ser G, A, V, L o I. En algunos aspectos, x82 puede ser K, R, N o Q. En algunos aspectos, x82 puede ser D o E. En algunos aspectos, x82 puede ser K, R, G, A, V, L, I, N o Q. En algunos aspectos, x82 puede ser D o E. En algunos aspectos, x82 puede ser K, R, G, A, V, L, I, N, Q, D o E. En algunos aspectos, x82 puede ser D o E. En algunos aspectos, x82 puede ser H, F, W o Y. En algunos aspectos x82 no es prolina. En algunos aspectos, X82 (de la SEQ ID NO: 15, 45, 46 y/o 47) es R. En algunos aspectos, K190-CLK es R.
Las SEQ ID NO: 45 y 47 comprenden los polimorfismos identificados en la CLK; V/A 53 y LW191 (de acuerdo con la numeración de Kabat). Por lo tanto, los tres polimorfismos son: Km(1 ): v153/L191; Km(1 ,2): A 53/L191 y Km(3) A153A/191. En algunos aspectos de la invención que comprenden la SEQ ID NO: 45 y/o 47, x45 es V y x83 es L (Km(1 )). En algunos aspectos de la invención que comprenden la SEQ ID NO: 45 y/o 47, x45 es A y x83 es L (Km(1 ,2)). En algunos aspectos de la invención que comprenden la SEQ ID NO: 45 y/o 47, x45 es A y x83 es V (Km(3)).
En algunos aspectos, el MAC comprende un Resto Efector conjugado con CLK K188 en ambas cadenas ligeras. En algunos aspectos, el MAC comprende un Resto Efector conjugado con CLK K 88 en una cadena ligera solamente. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga solamente con el MAC en K188 CLK. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga con el MAC en K188 CLK en una cadena ligera y en otra localización en el anticuerpo. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga con el MAC en K188 CLK en una cadena ligera y otras 2 localizaciones en el anticuerpo. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga con el MAC en K188 CLK en una cadena ligera y otras 3 localizaciones en el anticuerpo. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga con el MAC en K188 CLK en ambas cadenas ligeras y en otra localización. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga con el MAC en K 88 CLK en ambas cadenas ligeras y en otras 2 localizaciones. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga con el MAC en K188 CLK en ambas cadenas ligeras y en otras 3 localizaciones.
Muestras y composiciones de la invención En algunos aspectos, la invención proporciona una composición o muestra de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo) conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 50% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K 88-CLK. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición o muestra de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antigeno del mismo) conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 60% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K188-CLK. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición o muestra de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antigeno del mismo) conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 70% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K188-CLK. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición o muestra de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo) conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 80% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K188-CLK. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición o muestra de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antigeno del mismo) conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 90% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K188-CI_ .
En algunos aspectos, la invención proporciona una composición (o muestra) de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo), en la que al menos aproximadamente el 50% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K 88-CLK en al menos una cadena ligera. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición (o muestra) de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo), en la que al menos aproximadamente el 60% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K188-CLK en al menos una cadena ligera. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición (o muestra) de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo), en la que al menos aproximadamente el 70% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K 88-CLK en al menos una cadena ligera. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición (o muestra) de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo), en la que al menos aproximadamente el 80% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K 88-CLK en al menos una cadena ligera. En algunos aspectos, la invención proporciona una composición (o muestra) de un MAC que comprende un anticuerpo (o porción de unión a antígeno del mismo), en la que al menos aproximadamente el 90% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K188-CLK en al menos una cadena ligera. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga covalentemente con ambos K188-CLK en ambas cadenas ligeras.
En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 30% de la muestra comprende Restos Efectores conjugados en aproximadamente 2 localizaciones por anticuerpo, y en la que al menos un sitio de conjugación con Resto Efector es K188-CLK. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 40%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 50%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 99%.
En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 30% de la muestra comprende Restos Efectores conjugados en aproximadamente 3 localizaciones por anticuerpo, y en la que al menos 2 sitios de conjugación con Resto Efector son K188-CLK en cada cadena ligera. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 40%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 50%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 99%.
En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 30% de la muestra comprende Restos Efectores conjugados en aproximadamente 4 localizaciones por anticuerpo, y en la que al menos 2 sitios de conjugación con Resto Efector son K188-CLK en cada cadena ligera. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 40%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 50%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 99%.
En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo conjugado covalentemente con un Resto Efector, en la que al menos aproximadamente el 30% de la muestra comprende Restos Efectores conjugados en aproximadamente 5 localizaciones por anticuerpo, y en la que al menos 2 sitios de conjugación con Resto Efector son K 88-CLK en cada cadena ligera. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 40%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 50%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 60%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 70%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 99%.
En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos el 50% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en el que al menos aproximadamente el 60% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 65% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 70% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 75% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 80% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 85% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 90% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector. En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 95% de las moléculas de cadena ligera están conjugadas con al menos un Resto Efector.
En algunos aspectos, la invención proporciona una muestra de MAC, en la que al menos aproximadamente el 70% de las moléculas de cadena pesada no están conjugadas con el Resto Efector. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 75%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 80%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 85%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 90%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 95%. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente el 99%. En algunos aspectos, sustancialmente todas las moléculas de cadena pesada no están conjugadas con el Resto Efector.
En algunos aspectos, la invención proporciona un MAC que comprende un anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, conjugado covalentemente con un Resto Efector mediante un engarce, caracterizado por que el anticuerpo o porción de un unión a antígeno del mismo comprende el motivo KHK y el Resto Efector está conjugado con la cadena lateral del resto K188 (de acuerdo con la numeración de Kabat).
En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos de cadena ligera individuales que no están conjugados tiene un limite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 1 , 5, 10, 5, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 55%, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60%. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos de cadena ligera individuales que se están conjugados en una localización tiene un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 25, 30, 35, 40, 45, 50 y 55%, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 y 95%. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos de cadena ligera individuales que están conjugados en 2 localizaciones tiene un limite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 5, 10, 15, 20 y 25%, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 5, 16, 7, 8, 9, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 y 40%.
En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos de cadena pesada individuales que no están conjugados tiene un limite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 50, 55, 60, 65, 70, 75 y 80%, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 99%. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos de cadena pesada individuales que están conjugados en una localización tiene un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 1 , 2, 5, 10, 15, 20 y 25%, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40 y 50%. En algunos aspectos, la cantidad de fragmentos de cadena pesada individuales que están conjugados en 2 localizaciones tiene un limite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 10 y 15%, y un limite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente el 2, 3, 4, 5, 10, 15 y 20%.
En algunos aspectos el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención tiene un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1 , 1 , 1 , 1 ,2, 1 ,3, 1 ,4, 1 ,5, 1 ,55, 1 ,6, 1 ,65, 1 ,7, 1 ,75, 1 ,8, 1 ,85, 1 ,9, 1 ,95 y 2, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 ,6, 1 ,7, 1 ,75 1 ,8, 1 ,85, 1 ,9, 1 ,95, 2,0, 2,05, 2,1 , 2,15, 2,2, 2,25, 2,3, 2,4, 2,5, 2,6, 2,7, 2,8, 2,9, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5 y 5, En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 1 ,5 y aproximadamente 2,5. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 1 ,6 y aproximadamente 2,4, En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 1 ,7 y aproximadamente 2,3. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 1 ,8 y aproximadamente 2,2. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención es una cantidad seleccionada del grupo que consiste en aproximadamente 1 ,5, aproximadamente 1 ,55, aproximadamente 1 ,6, aproximadamente 1 ,65, aproximadamente 1 ,7, aproximadamente 1 ,75, aproximadamente 1 ,8, aproximadamente 1 ,85, aproximadamente 1 ,9, aproximadamente 1 ,95, aproximadamente 2,0, aproximadamente 2,05, aproximadamente 2,1 , aproximadamente 2,15, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,25, aproximadamente 2,3, aproximadamente 2,4 y aproximadamente 2,5. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 1 ,7. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 1 ,8. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 1 ,9. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 2. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 2,1. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 2,1. En algunos aspectos, la cantidad es de aproximadamente 2,3.
En algunos aspectos de la invención, el número de conjugaciones por anticuerpo es inferior a 2, teniendo al menos el 50% de la población de anticuerpo una sola conjugación por anticuerpo. Estas muestras son ventajosas ya que permiten que reacciones de conjugación adicionales se dirijan al sitio de CLK restante. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1 ,5. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,6 y aproximadamente 1 ,4. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,7 y aproximadamente 1 ,3. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,8 y aproximadamente 1 ,2. En algunos aspectos, el número de conjugaciones por anticuerpo en una muestra o composición de la invención está entre aproximadamente 0,9 y aproximadamente 1 , 1 .
Una de las ventajas de la invención es que, dependiendo de los reactivos y de las condiciones de reacción (especialmente el grupo saliente éster y la proporción molar de engarce:anticuerpo), pueden generarse composiciones y muestras de MAC con un número definido de Restos Efectores respecto a un número definido de anticuerpos. Esto puede ser especialmente útil cuando se equilibran las reactividades relativas y las ventanas terapéuticas del Resto Efector y del anticuerpo. Además, en algunas situaciones, el aumento del número de péptidos por anticuerpo más allá de cierto umbral puede no dar como resultado una unión a diana o un efecto terapéutico aumentados. Por lo tanto, es útil ser capaz de controlar el número de péptidos conjugados por anticuerpo, y al hacerlo, dirigir la localización de la conjugación para minimizar la interferencia de sitio de combinación o Fe. En algunas situaciones, por lo tanto, pueden ser ventajosos aspectos de la invención que permitan una conjugación reducida, preferentemente revistiendo únicamente un solo K188-C LK.
En algunos aspectos, una muestra de MAC puede ser una composición farmacéutica.
Anticuerpo contra IGFR En algunas realizaciones, el al menos un péptido de unión a Ang2 se conjuga mediante la cadena lateral de un resto de lisina en el anticuerpo anti-IGF1 . En algunas realizaciones, el al menos un péptido de unión a Ang2 se une covalentemente al dominio CL. En algunas realizaciones, el al menos un péptido de unión a Ang2 se une covalentemente a la región F(ab) del anticuerpo anti-IGF1 R. En algunas realizaciones, el al menos un péptido de unión a Ang2 se une covalentemente a la región constante de cadena ligera del anticuerpo anti-IGF-1 R. En algunas realizaciones, el anticuerpo ant¡-IGF1 R se une covalentemente al péptido de unión a Ang2 mediante un engarce. En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 no está fusionado en el extremo C o N' terminal del anticuerpo anti-IGF1 R.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1 R se selecciona de los descritos en los documentos WO02053596 (US7.037.498) y WO2005016967 (US7.371.378) (incorporándose el contenido de cada uno de los mismos en el presente documento). En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio constante de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 5.
En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio variable de cadena pesada seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 6, los restos 1-122 de la SEQ ID NO: 1 y los restos 1-122 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio variable de cadena pesada que comprende los restos 1-122 de la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHCDR1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 7, los restos 26-35 de la SEQ ID NO: 1 y los restos 26-35 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 7. En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHCDR2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 8, los restos 50-64 de la SEQ ID NO: 3 y los restos 50-64 de la SEQ ID NO: 5. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHCDR3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: ¾ los restos 99-1 14 de la SEQ ID NO: 1 y los restos 99-1 14 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHFR1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 10, los restos 1-25 de la SEQ ID NO: 1 , los restos 1-25 de la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 1 1. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHFR1 que comprende la SEQ ID NO: 1 1.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHFR2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 12, los restos 36-49 de la SEQ ID NO: 1 y los restos 36-49 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHFR2 que comprende la SEQ ID NO: 12.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHFR3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 13, los restos 65-98 de la SEQ ID NO: 1 y los restos 65-98 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHFR3 que comprende la SEQ ID NO: 13.
En algunas realizaciones, la cadena pesada del MAC comprende una región VHFR4 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 14, los restos 1 15-122 de la SEQ ID NO: 1 y los restos 1 15-122 de la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VHFR4 que comprende la SEQ ID NO: 14.
En algunas realizaciones, las regiones VHCDR1 , VHCDR2 y VHCDR3 del anticuerpo anti-IGF1 R comprenden los restos 26-35 de la SEQ ID NO: 3, los restos 50-64 de la SEQ ID NO: 3 y los restos 99-1 14 de la SEQ ID NO: 3, respectivamente.
En algunas realizaciones, las regiones VHFR1 , VHFR2, VHFR3 y VHFR4 del anticuerpo anti-IGF1 R comprenden los restos 1-25 de la SEQ ID NO: 3, los restos 36-49 de la SEQ ID NO: 3, los restos 65-98 de la SEQ ID NO: 3 y los restos 115-122 de la SEQ ID NO: 3, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1 R comprende una cadena pesada seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 3. En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1 R comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3.
En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio constante de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 15. En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio constante de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 45, 46 ó 47.
En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio variable de cadena ligera seleccionado del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 16, los restos 1-108 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 1-108 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende un dominio variable de cadena ligera que comprende los restos 1-108 de la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLCDR1 (región determinante de complementariedad 1 de la cadena ligera variable) que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 17, los restos 24-34 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 24-34 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLCDR1 que comprende la SEQ ID NO: 17.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLCDR2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 18, los restos 48-54 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 48-54 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLCDR2 que comprende la SEQ ID NO: 8.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLCDR3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 19, los restos 89-97 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 89-97 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLCDR3 que comprende la SEQ ID NO: 19.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLFR1 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 , los restos 1 -23 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 1-23 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLFR1 que comprende la SEQ ID NO: 21.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLFR2 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 22, los restos 35-47 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 35-47 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLFR2 que comprende la SEQ ID NO: 22.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLFR3 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 23, los restos 55-88 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 55-88 de la SEQ ID NO: 4. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLFR3 que comprende la SEQ ID NO: 23.
En algunas realizaciones, la cadena ligera del MAC comprende una región VLFR4 que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, los restos 98-108 de la SEQ ID NO: 2 y los restos 98- 08 de la SEQ ID NO: 6. En algunas realizaciones, el MAC comprende una región VLFR4 que comprende la SEQ ID NO: 25.
En algunas realizaciones, las regiones VLCDR1 , VLCDR2 y VLCDR3 del anticuerpo anti-IGF1 R comprenden los restos 24-34 de la SEQ ID NO: 4, los restos 48-54 de la SEQ ID NO: 4 y los restos 89-96 de la SEQ ID NO: 4, respectivamente.
En algunas realizaciones, las regiones VLFR1 , VLFR2, VLFR3 y VLFR4 del anticuerpo anti-IGF1 R comprenden los restos 1-24 de la SEQ ID NO: 4, los restos 35-47 de la SEQ ID NO: 4, los restos 55-88 de la SEQ ID NO: 4 y los restos 97-108 de la SEQ ID NO: 4, respectivamente.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1 R comprende una cadena ligera seleccionada del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 2 y la SEQ ID NO. 4. En algunas realizaciones el anticuerpo anti-IGF1 R comprende una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1 R comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO. 1 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 2.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1 R comprende una cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 3 y una cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 4.
El anticuerpo 2.12.1 se ha descrito en el documento WO02053596. Un hibridoma, el 2.12.1 , que produce anticuerpos monoclonales específicos para IGF1 R, se depositó en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, el 12 de diciembre de 2000 con el número de depósito PTA-2792.
En algunas realizaciones, el anticuerpo anti-IGF1R comprende el motivo K188H18V90 en la región CLK, en la que x es G, A, V, I, L, S, T, C, M, N, Q, D, E, F, Y, W, H, R o K, de acuerdo con la numeración de Kabat. En algunos aspectos, el anticuerpo anti-IGF1 R es uno seleccionado del documento WO2009032145 (US2009092614) o WO2005005635 (US7.579.157), incorporándose el contenido de ambos documentos en el presente documento. En algunas realizaciones, un MAC de la invención comprende un anticuerpo anti-IGF1 R o porción de unión a antígeno del mismo, conjugado con al menos un péptido de unión a Ang2 de un modo tal que no anule la afinidad de unión a IGF1 R del anticuerpo.
En algunos aspectos, el anticuerpo se dirige a una diana diferente dentro de la misma ruta que el Resto Efector. En algunos aspectos, el anticuerpo se dirige a una diana diferente al Resto Efector.
En algunos aspectos, el anticuerpo usado para la conjugación puede ser útil en el campo de la oncología. Los anticuerpos adecuados incluyen; Rituximab, (Rituxan™), un anticuerpo quimérico lgG1K anti-CD20 usado para tratar el cáncer y, en particular, el linfoma no Hodgkin y también la artritis reumatoide; Cetuximab (Erbitux™), un anticuerpo quimérico lgG1K antireceptor de EGF usado para tratar el cáncer y, en particular, el cáncer de colon y de cabeza y cuello.
En algunos aspectos, el anticuerpo usado para la conjugación puede ser útil en el campo de los trastornos autoinmunes y otros trastornos inmunológicos. Los anticuerpos adecuados incluyen Infliximab (Remicade™), un anticuerpo quimérico lgG1K anti-TNFa usado para tratar la artritis reumatoide, la colitis ulcerosa, la enfermedad de Crohn, la psoriasis, la artritis psoriásica y la espondilitis anquilosante; Adalimumab (Humira™), un anticuerpo humano lgG1K anti-TNFa usado para tratar la artritis reumatoide, la enfermedad de Crohn, la psoriasis, la artritis psoriásica, la artritis idiopática juvenil y la espondilitis anquilosante; Natalizumab (Tysabri™), un anticuerpo humanizado lgG4K anti-integrina a4 usado para tratar la esclerosis múltiple, la artritis reumatoide, la psoriasis, la artritis idiopática juvenil, la artritis psoriásica, la espondilitis anquilosante, la enfermedad de Crohn; Omalizumab (Xolair™), un anticuerpo humanizado lgG1K anti-lgE usado para tratar el asma alérgica; Ranibizumab (Lucentis™) un anticuerpo humanizado lgG1K anti-VEGF usado para tratar la AMD húmeda; y Palivizumab (Synagis™), un anticuerpo humanizado lgG1 K anti-RSV usado para tratar enfermedades infecciosas, incluyendo el virus respiratorio sincitial.
En algún aspecto, pueden usarse compuestos y composiciones de la invención para tratar las afecciones mencionadas anteriormente.
Restos Efectores El Resto Efector puede ser un agente terapéutico, proteina, péptido, ácido nucleico, aptámero, molécula pequeña, agonista proteico, antagonista proteico, regulador metabólico, hormona, toxina, factor de crecimiento u otra proteína reguladora, o puede ser un agente de diagnóstico, tal como una enzima que pueda detectarse o visualizarse fácilmente, tal como peroxidasa de rábano picante.
En algunos aspectos, el Resto Efector puede ser una proteina o péptido y puede conectarse al engarce a través de un resto de unión a péptido. La proteína o péptido puede comprender uno o ambos de un grupo protector amino-terminal R1 y un grupo protector carboxilo-terminal R2. R1 puede ser CH3, C(0)CH3, C(0)CH3, C(0)CH2CH3, C(0)CH2CH2CH3, C(0)CH(CH3)CH3, C(0)CH2CH2CH2CH3, C(0)CH(CH3)CH2CH3, C(0)C6H5, C(0)CH2CH2(CH2CH20)i-5Me, diclorobenzoílo (DCB), difluorobenzoilo (DFB), piridinil carboxilato (PyC) o amido-2-PEG, un grupo protector amino, un grupo lipidico ácido graso o un carbohidrato. R2 puede ser OH, NH2, NH(CH3), NHCH2CH3, NHCH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH3, NHCH2CH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH2CH3, NHC6H5, NHCH2CH2OCH3, NHOCH3, NHOCH2CH3, un grupo protector carboxi, un grupo lipidico ácido graso o un carbohidrato.
El resto de unión a péptido o proteina puede ser K, K(SH), homólogos de lisina, Dap, Dab, Orn, R, C, restos que contienen tiol, S, T, Y, D, E, N o Q. La proteína o péptido puede conectarse al engarce a través del extremo amino-terminal del aminoácido N-terminal. La proteina o péptido puede conectarse al engarce a través del extremo carboxilo-terminal del aminoácido C-terminal. Puede añadirse un resto aminoacidico adicional al extremo N- o C-terminal para que funcione como un resto de unión, ya sea por conexión a través de la cadena lateral de aminoácido o del extremo amino o carboxilo terminal.
Péptidos de unión a Ang2 El Resto Efector puede ser un péptido de unión a Ang2. En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 puede comprender una secuencia seleccionada de las descritas en el documento WO2008056346 (US2008166364) (cuyo contenido se incorpora en el presente documento). En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 X 9 D 0 K11 T12 L13 Y14 D 5 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q2 G22 (SEQ ID NO: 26) en la que X9 de la SEQ ID NO: 26 es acil-lisina (AcK) o leucina, (en lo sucesivo designada Ang2-X9) y en la que X9, K11, L 3, Q 6, 18 o L19 del péptido de unión a Ang2 se sustituye por un resto de unión a Ang2 que comprende una cadena lateral nucleófila unida covalentemente al engarce, seleccionándose el resto de unión del grupo que consiste en K, Y, S, T, H, homólogos de lisina, tales como K(SH), homocisteina, homoserina, Dap y Dab. En algunas realizaciones, el resto de unión a Ang2 puede seleccionarse del grupo que consiste en K, K(SH), Y, S, T, H, Dap y Dab. En algunas realizaciones, el resto de unión a Ang2 es K. El resto de unión a Ang2 puede ser K11. En algunas realizaciones, el resto de unión a Ang2 puede ser K(SH). El resto de unión a Ang2 puede ser K(SH)11.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 (AcK)9 D10 K11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 M18 L19 Q20 Q2 G22 (SEQ ID NO: 27) en la que Ang2-K11 es el resto de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8L 9 D 0 K11 T12 L 3 Y14 D15 Q16 F 7 M18 L19 Q20 Q21 G22 (SEQ ID NO: 28) en la que Ang2-K11 es el resto de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: SEQ ID NO: 29 Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 K9 D10 (AcK)11 T 2 L13 Y 4 D15 Q16 p17 M18 ,_19 q20 q21 22 en la que Ang2-K9 es el resto de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: SEQ ID NO: 30 Q1 (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8L 9 D10 (AcK)11 T12 L13 ?14 D15 K16 p17 M18 ,_19 Q20 Q21 Q22 en la que Ang2-K16 es el resto de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: SEQ ID NO: 31 Q (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8L 9 D10 (AcK)11 T12 L13 Y14 D15 Q16 F17 K18 L19 Q20 Q21 G22 en la que Ang2-K18 es el resto de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende la secuencia: SEQ ID NO: 32 Q (AcK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8L 9 D10 (AcK) T12 L13 ?14 D15 Q16 p17 M18 K19 Q20 Q21 Q22 en la que Ang2-K19 es el resto de unión a Ang2.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende además un grupo protector N-terminal R - en el que R es CH3, C(O)CH3, C(O)CH3, C(O)CH2CH3, C(O)CH2CH2CH3, C(O)CH(CH3)CH3, C(O)CH2CH2CH2CH3, C(O)CH(CH3)CH2CH3, C(O)C6H5, C(O)CH2CH2(CH2CH2O)i.5Me, diclorobenzoílo (DCB), difluorobenzoílo (DFB), piridinil carboxilato (PyC) o amido-2-PEG, un grupo protector amino, un grupo lipidico ácido graso o un carbohidrato.
En algunas realizaciones, el péptido de unión a Ang2 comprende además un grupo protector C-terminal -R2 en el que R2 es OH, NH2, NH(CH3), NHCH2CH3, NHCH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH3, NHCH2CH2CH2CH3, NHCH(CH3)CH2CH3, NHC6H5, NHCH2CH2OCH3, NHOCH3, NHOCH2CH3, un grupo protector carboxi, un grupo lipidico ácido graso o un carbohidrato.
En algunas realizaciones R1 puede ser C(0)CH3. En algunas realizaciones R2 puede ser NH2.
El péptido de unión a Ang2 junto con grupos protectores N-terminal y C-terminal puede comprender la fórmula : [C(0)CH3]-[SEQ ID NO: 27]-[ NH2]: [C(O)CH3]-Q1 (ACK)2 Y3 Q4 P5 L6 D7 E8 (ACK) 9 D 0 K11 T 2 L 3 Y14 D15 Q16 F17 M 8 L19 Q20 Q21 G 2-[ NH2] en la que Ang2-K11 es el grupo de unión a Ang2.
Los péptidos de Ang2 descritos en el presente documento pueden conjurase como se ha descrito con numerosos tipos de anticuerpos, en particular anticuerpos útiles en el tratamiento de trastornos proliferativos tales como cáncer o una angiogénesis aumentada, y también pueden conjugarse con anticuerpos catalíticos tales como h38C2 para formar MAC.
Engarces El Resto Efector de la invención (tal como una molécula pequeña, aptámero, ácido nucleico, protelna o péptido (por ejemplo, péptido de unión a Ang2)) puede unirse covalentemente al anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo (por ejemplo, anticuerpo anti-IGF1 R) mediante un engarce. El engarce puede unirse covalentemente al péptido mediante un grupo amino de la cadena lateral del resto de unión a péptido. Este puede ser un resto de lisina. En algunas realizaciones, el resto de unión es un resto que lleva tiol, tal como Cys o K(SH), y el engarce se une covalentemente al péptido mediante el grupo tiol terminal del resto de unión.
El engarce puede ser lineal o ramificado (para permitir la conjugación con más de un Resto Efector por Adición de Conjugación) y, opcionalmente, incluye uno o más grupos carbocíclicos o heterocíclicos. La longitud del engarce puede verse en términos del número de átomos lineales entre el Resto Efector y el anticuerpo, contándose los restos cíclicos tales como anillos aromáticos y similares tomando la vía más corta alrededor del anillo. En algunas realizaciones, el engarce tiene una extensión lineal de entre 5-15 átomos, en otras realizaciones 15-30 átomos, en otras realizaciones más 30-50 átomos, en otras realizaciones más 50-100 átomos y en otras realizaciones más 100-200 átomos. En algunas realizaciones, la longitud del engarce es un intervalo con un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190 y 200.
Otras consideraciones del engarce incluyen el efecto sobre las propiedades físicas o farmacocinéticas del compuesto resultante, tales como la solubilidad, lipofilía, hidrofilia, hidrofobia, estabilidad (más o menos estable así como degradación planeada), rigidez, flexibilidad, inmunogenicidad, modulación de la unión de anticuerpo, capacidad para incorporarse en una micela o liposoma y similares.
El engarce puede ser un engarce de peptidilo. En algunas realizaciones, el engarce peptidilo puede tener una longitud de entre 3-20 aminoácidos, tales como repeticiones de un solo resto aminoacidico (por ejemplo, poliglicina) o combinaciones de restos aminoacídicos para dar un engarce peptídico que confiera una presentación favorable del Resto Efector o de la farmacocinética. Los engarces de peptidilo que serían más compatibles con la presencia de grupos activadores pueden carecer de restos de lisina e histidina. La SEQ ID NO: 59 es un engarce de peptidilo ejemplar.
Como alternativa, el engarce puede ser un engarce no peptidilo. Serian ejemplos típicos de estos tipos de engarce los basados en hidrocarburos de cadena lineal o ramificada o polietilenglicolés de longitudes variables. Estos pueden incorporar otros grupos para lograr solubilidad, rigidez, punto isoeléctrico, tales como anillos aromáticos o no aromáticos, halógenos, cetonas, aldehidos, ésteres, sulfonilos, grupos fosfato y etc.
En algunos aspectos de la invención, el engarce puede comprender la fórmula: -X-Y-Z-; en la que X es el grupo de unión al Resto Efector (por ejemplo, mediante un resto de unión a péptido), Y es una región espaciadora y Z es un resto de unión a la cadena lateral de un resto de lisina o cisteína en un anticuerpo (por ejemplo, un anticuerpo anti-IGFR1 ). En algunos aspectos, el engarce puede ser de fórmula XYZ* cuando no está unido al anticuerpo, donde Z* es un grupo saliente, de modo que cuando se conjuga con el anticuerpo, el grupo saliente Z* reacciona con el sitio de conjugación del anticuerpo para formar el engarce XYZ conjugado.
X puede seleccionarse para permitir una estrategia de unión covalente direccional específica con el Resto Efector (por ejemplo mediante el resto de unión a péptido). En algunos aspectos, X puede seleccionarse del grupo que consiste en COOH, isocianato, isotiocianato, acil azida, ácido sulfónico, sulfonil haluro, aldehido, cetona, epóxido, carbonato, reactivo de arilación, imidoéster, grupo amina y grupo maleimida. Por ejemplo, cuando el resto de unión a péptido comprende un grupo nucleófilo, X puede ser un grupo electrófilo y viceversa. Por ejemplo, si la cadena lateral del resto de unión a péptido comprende un grupo amina, tal como K, H, Ornitina, Dap o Dab, X puede ser COOH, u otro electrófilo reactivo de forma similar, por ejemplo, un isocianato, isotiocianato, acil azida, ácido sulfónico o sulfonil haluro, aldehido o cetona, epóxido, carbonato, reactivo de arilación o imidoéster. Si el resto de unión a péptido es D o E, X puede comprender un grupo nucleófilo, tal como un grupo amina. Cualquiera de estas estrategias permite que se forme un enlace covalente entre el grupo X y el resto de unión a péptido por estrategias de formación de enlaces amida. Por ejemplo, cuando X es COOH, puede activarse como un éster pentafluorofenilico. En este caso, la reacción con un grupo amina en el péptido de unión a péptido conduce a la formación de un enlace amida, mientras que el pentafluorofenol es un grupo saliente (que puede denominarse X*).
La flecha indica el punto de unión al resto de unión a péptido y la línea paralela representa el punto de unión al grupo Y del engarce.
Cuando el grupo de unión a péptido es C, homólogos de C u otros restos que contienen un grupo tiol (tales como K(SH)), X puede comprende un grupo maleimida, permitiendo una estrategia de reacción de adición de tiol-maleimida para unir covalentemente el grupo X con el grupo de unión a péptido. En algunos aspectos, X puede ser maleimida: en la que la flecha indica el punto de unión al resto de unión a péptido y la linea paralela representa la unión al grupo Y del engarce. Para facilitar la nomenclatura, los engarces descritos en el presente documento que se han construido usando grupos maleimida se describen como engarces que contienen maleimida y pueden titularse MAL para indicarlo, aun cuando después de la construcción del engarce el grupo maleimida se convierte generalmente en un anillo de succinimida.
En algunos aspectos, el resto de unión es K(SH) y el grupo X es maleimida.
En algunos aspectos, X puede comprender una función carboxilo activada por éster pentafluorofenílico que puede formar una amida con la cadena lateral de lisina en el péptido.
Resto Elector- Resto E1ector- En algunos aspectos, X puede comprender un grupo tiol, que permite que se forme un puente disulfuro entre el resto de unión a péptido y el grupo X.
En algunas realizaciones, Y es una cadena de conexión biológicamente compatible que incluye cualquier átomo seleccionado del grupo que consiste en C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br e I, y puede comprender uno o más aminoácidos, polímeros o copolímeros de bloque. Y puede seleccionarse para proporcionar una longitud global del engarce de entre 2-100 átomos. Y puede seleccionarse de modo que la longitud global del engarce sea de entre 5 y 30 átomos. Y puede seleccionarse de modo que la longitud global del engarce sea de 15-25 átomos. Y puede seleccionarse de modo que la longitud global del engarce sea de entre aproximadamente 17 y aproximadamente 19 átomos.
En algunos aspectos, Y puede ser un ácido de amino polietilenglicol tal como en el que n = 0 a 10, en algunos aspectos 1 -10, en algunos aspectos, 1 -5 y en algunos aspectos, 1.
En algunos aspectos, Y puede se un diácido de polietilenglicol, tal como: en el que n = 0 a 10, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1-5 y en algunos aspectos, 1 y en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos de la invención, la porción Y del engarce comprende la fórmula: En algunos aspectos, Y puede ser un ácido amino alcanoico, tal como: en el que n = 0 a 20, en algunos aspectos 1 -10, en algunos aspectos, 1-5 y en algunos aspectos, 1 y en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y puede ser un diácido alcanoico, tal como: en el que n = 0 a 20, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1 -5 y algunos aspectos, 1 y en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y puede ser una poliglicina, tal como en la que n = 0 a 10, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1 -5 y en algunos aspectos, 1 y en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y, X-Y, Y-Z y X-Y-Z pueden seleccionarse del grupo que consiste en: en los que m, n y j son cada uno independientemente de 0 a 30. En algunos aspectos n = 1-10, en algunos aspectos, n = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el limite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos m = 1-10, en algunos aspectos, m = 1-5. En algunos aspectos, el limite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el limite superior para el intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. M puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos j = 1-10, en algunos aspectos, j = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de longitud de cadena global de Y en número de átomos puede tener un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100. En algunos aspectos, el engarce XYZ puede ser idéntico a los grupos Y anteriores. En algunos aspectos, la línea ondulada conecta con el grupo X. En algunos aspectos, las líneas paralelas conectan con el grupo X. En algunos aspectos, la línea ondulada conecta con el grupo Z. En algunos aspectos, las líneas paralelas conectan con el grupo Z. En algunos aspectos, la línea ondulada conecta con la cadena lateral de K188-CLK. En algunos aspectos, las líneas paralelas conectan con la cadena lateral de K188-CLK. En algunos aspectos, la linea ondulada conecta con el Resto Efector. En algunos aspectos, las líneas paralelas conectan con el Resto Efector.
En algunos aspectos, Y, Y-Z y/ o X-Y pueden ser un ácido de maleimida PEG, tal como: en el que n = 1 a 12, en algunos aspectos 1-10, en algunos aspectos, 1-5 y en algunos aspectos, 1 y en algunos aspectos, 2.
En algunos aspectos, Y, Y-Z y/o X-Y puede ser un ácido de maleimida-PEG tal como: de modo que el limite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos, Y, Y-Z y/ o X-Y comprenden la fórmula: Z* puede seleccionarse para permitir una estrategia de unión covalente direccional especifica con una cadena lateral de lisina en el anticuerpo. Por ejemplo, Z puede ser COOH u otro electrófilo reactivo de forma similar para reaccionar con e-amino de las cadenas laterales de lisina de superficie usando una de varias estrategias posibles de formación de enlaces amida.
En algunos aspectos, Z* puede usarse para formar un éster activo. Los ésteres activos conectan con aminas y, por lo tanto, pueden conjugarse con el e-amino de una cadena lateral de lisina del anticuerpo. La función carboxilo Z para permitir la formación del éster activo estará presente en el extremo terminal del grupo Y. La función alcohólica o fenólica del éster activo actúa como grupo saliente Z* durante la reacción de conjugación, permitiendo la conexión con la cadena lateral de lisina en el anticuerpo por generación de una amida.
En algunas realizaciones, el grupo Z* comprende una estructura de fórmula: en la que R' es un grupo alifático o aromático.
En algunas realizaciones, el grupo Z* es de fórmula: en la que R' = cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y puede estar presente en una cantidad entre 1 y 5. En algunas realizaciones, R puede ser un halógeno y pueden estar presentes 4 ó 5 átomos de halógeno. En algunas realizaciones, puede haber átomos 4 R1. En algunas realizaciones, puede haber 5 átomos R1. En algunas realizaciones, Z* puede ser tetrafluorofenilo. En algunas realizaciones, Z* puede comprender la fórmula: Pentafluorofenilo en la que la linea paralela representa el punto de unión a la porción Y del engarce.
En algunos aspectos, el grupo Z* es de fórmula: en la que R' = cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y h=1 , 2, 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 puede ser un halógeno. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl, y h = 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl y h = 5. En algunas realizaciones, R es F y h = 2, 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F, y h= 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 4 ó 5. En algunas realizaciones, R es F y h = 5. En algunos aspectos, Z* puede seleccionarse del grupo que consiste en: Para dichos esteres activos, el grupo saliente es Z* y el propio grupo Z es el carbonilo unido al grupo Y. Cuando reacciona con el anticuerpo, el grupo Z* forma una amida, como se muestra a continuación i algun En algunas realizaciones, el grupo Z* comprende un éster de escuarato, tal como en el que R = grupo alifático o aromático sustituido y puede seleccionarse del grupo que consiste en: En algunas realizaciones, el grupo Z comprende un grupo Maleimida: En algunos aspectos, el engarce X*YZ* comprende un éster de Maleimida-PEG-PFP de estructura: en la que = 1 a 12. En algunos aspectos, n = 1 a 5, en algunos aspectos n = 2, en algunos aspectos n = 1.
En algunos aspectos, el MAC comprende un engarce XYZ de fórmula: en la que n = 1-12. En algunos aspectos, n = 1 a 5. En algunos aspectos a 3. En algunos aspectos n = 2. En algunos aspectos n = 1.
En algunos aspectos, el engarce X*YZ* comprende estructura seleccionada del grupo que consiste en: en la que m, n y j son cada uno independientemente de 0 a 30, R1 es F y h = 2, 3, 4 ó 5. En algunos aspectos n = 1-10, en algunos aspectos, n = 1 -5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos, m = 1-10, en algunos aspectos, m = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el limite superior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. M puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos, j = 1-10, en algunos aspectos, j = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el limite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de longitud de cadena global de Y en número de átomos puede tener un limite inferior seleccionado del grupo que consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60, y un límite superior seleccionado del grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100.
En algunos aspectos el MAC comprende un engarce XYZ de fórmula: En algunos aspectos, el engarce X*YZ* comprende un éster PEG-bis-pentafluorofenílico de fórmula: en la que n = 1 a 12. En algunos aspectos n = 1 a 10. En algunos aspectos n = 1 a 5. En algunos aspectos n = 2. En algunos aspectos n = 1.
En algunos aspectos, el MAC comprende un engarce XYZ de fórmula: En algunos aspectos, el MAC comprende un engarce XYZ de fórmula: En algunas realizaciones, cuando el péptido está unido al engarce XYZ*, comprende la fórmula: En algunas realizaciones, el péptido unido al engarce XYZ* comprende la fórmula: En algunos aspectos, el MAC comprende un compuesto de fórmula : en la que Ang2-K es un resto de lisina o lisina modificada de un péptido de unión a Ang2 y Ab-K-Ab' es un resto de lisina en un anticuerpo anti-IGF1 R.
En algunos aspectos, el MAC comprende un compuesto de fórmula : en la que Ang2-K es un resto de lisina o lisina modificada de un péptido de unión a Ang2 y Ab-K-Ab es un resto de lisina en un anticuerpo anti-IGF1 R.
En algunos aspectos, el MAC comprende la fórmula: en la que Ab-K-Ab es K188 del anticuerpo 2.12.1 fx.
En algunos aspectos, el MAC comprende la fórmula en la que Ab-K-Ab es K188 del anticuerpo 2.12.1.fx.
En algunos aspectos el MAC comprende 2 péptidos (que pueden ser péptidos de unión a Ang2) conjugados por anticuerpo (que puede ser un anticuerpo anti-IGF1 R). En algunos aspectos, un péptido está conjugado en cada uno de los 2 restos K 88 del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo (que puede ser el anticuerpo 2.12.1. fx).
En algunos aspectos, el MAC comprende una fórmula seleccionada del grupo que consiste en: en la que K188-CLK es un enlace covalente con la cadena lateral de dicho K188-CLK, Resto Efector-LR es un enlace covalente con el Resto Efector, y m, n y j son cada uno independientemente 0-30. En algunos aspectos n = 1-10, en algunos aspectos, n = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el limite superior para el intervalo de valores para n se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. N puede ser 1. N puede ser 2. N puede ser 3. N puede ser 4. N puede ser 5. N puede ser 6. En algunos aspectos m = 1-10, en algunos aspectos, m = 1-5. En algunos aspectos, el limite inferior del intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el límite superior para el intervalo de valores para m se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. M puede ser 1. M puede ser 2. puede ser 3. M puede ser 4. M puede ser 5. M puede ser 6. En algunos aspectos j = 1-10, En algunos aspectos, j = 1-5. En algunos aspectos, el límite inferior del intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y el limite superior para el intervalo de valores para j se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30. J puede ser 1. J puede ser 2. J puede ser 3. J puede ser 4. J puede ser 5. J puede ser 6. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 200 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 150 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 100 átomos. En algunos aspectos, la longitud global de Y no supera los 50 átomos. En algunos aspectos, el intervalo de longitud de cadena global de Y en número de átomos puede tener un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55 y 60, y un limite superior seleccionado del grupo que consiste en 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 y 100.
Procedimientos de Conjugación En algunos aspectos, la invención proporciona un procedimiento de preparación de un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC), que comprende un anticuerpo o porción de unión a antígeno, estando el anticuerpo conjugado covalentemente con al menos un Resto Efector a través de un engarce unido a una cadena lateral de CLK-K 88 (de acuerdo con la numeración de Kabat), comprendiendo dicho procedimiento: unir covalentemente el Resto Efector a un engarce que termina en un grupo saliente Z* de fórmula: en la que R1 es cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y puede estar presente en una cantidad de entre 1 y 5, y hacer reaccionar el complejo de Resto Efector-engarce-grupo saliente así formado con el anticuerpo a una proporción molar de entre aproximadamente 3,5:1 y aproximadamente 4,5:1 de Resto Efector:anticuerpo. En algunos aspectos, la proporción molar es de aproximadamente 3,7:1 a aproximadamente 4,3:1.
En algunos aspectos, el grupo Z* es de fórmula: en la que R1 = cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y h = 1 , 2, 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 puede ser un halógeno. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl, y h = 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F o Cl y h = 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 2, 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 3, 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 4 ó 5. En algunas realizaciones, R1 es F y h = 5. En algunos aspectos, Z* puede seleccionarse del grupo que consiste en: R puede estar presente en una cantidad entre 3 y 5. Puede haber 3 grupos R1. R1 puede estar presente en una cantidad de entre 4 y 5. Puede haber 4 grupos R1. Puede haber 5 grupos R . R1 puede ser flúor. R1 puede ser cloro. R1 puede ser bromo. El grupo saliente puede comprender la fórmula: En algunos aspectos, la invención proporciona procedimientos de producción de un MAC, en los que el MAC comprende un anticuerpo, o fragmento del mismo, unido covalentemente a al menos un Resto Efector que se une a una diana adicional (tal como un péptido, molécula pequeña, aptámero, molécula de ácido nucleico o proteina), caracterizados por que el Resto Efector comprende un engarce con un grupo saliente PFP capaz de reaccionar con el e-amino de restos de lisina de superficie del anticuerpo. En algunos aspectos, la invención proporciona un procedimiento para conjugar un Resto Efector (tal como un péptido) con un anticuerpo que comprende una región constante de cadena ligera kappa, que comprende los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47, que comprende conjugar el Resto Efector con un engarce que comprende un grupo saliente de fórmula: v°X en la que R es cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y puede estar presente en una cantidad de entre 1 y 5, y hacer reaccionar el grupo saliente con la cadena lateral de K80 de la SEQ ID NO: 15 para proporcionar un anticuerpo con un Resto Efector conjugado con la región constante de cadena ligera.
El anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera sustancialmente homologa a los restos 74-106 de la SEQ ID NO: 15. El anticuerpo puede comprender una región constante de cadena ligera sustancialmente homologa a los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47. En algunos aspectos, el anticuerpo puede comprender una región de cadena ligera sustancialmente homologa a los restos 74-90 de la SEQ ID NO: 15. En algunos aspectos, el Resto Efector está conjugado en K80 de la SEQ ID NO: 15. En algunos aspectos, el Resto Efector está conjugado en K82. En algunas formas, un péptido de unión a Ang2 está conjugado con un anticuerpo ant¡-IGF1 R en CLK-K 88 (de acuerdo con la numeración de Kabat).
En algunos aspectos, el procedimiento comprende combinar un anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo con un Resto Efector, en el que el Resto Efector se une covalentemente a un engarce que comprende un grupo saliente PFP.
En algunos aspectos, la invención proporciona un procedimiento de conjugación de un Resto Efector con una proteina, en el que el Resto Efector se une a un engarce que termina en un grupo saliente Z* de fórmula: en la que R' = cualquiera de F, Cl, Br o I, nitro, ciano, trifluorometilo, solos o en combinación, y puede estar presente en una cantidad de entre 1 y 5, y la proteina comprende los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47, incluyendo K80, de modo que el Resto Efector se conjuga con el grupo e-amino del resto K80, que comprende hacer reaccionar el Resto Efector y el engarce unido con la proteina a una proporción molar de entre aproximadamente 3,7: 1 y aproximadamente 4,3:1 de Resto Efectonproteina.
En algunos aspectos, el Resto Efector, el engarce y el grupo saliente pueden ser como se describe en el presente documento. En algunos aspectos, la proteina puede comprender una región constante de cadena ligera de anticuerpo. En algunos aspectos, la proteína puede comprender la SEQ ID NO: 15 y el sitio de conjugación es K80.
En algunos aspectos, la proporción molar de Resto Efectonanticuerpo (por ejemplo, ABP:anticuerpo anti-IGF1 R) está entre aproximadamente 2,5 y aproximadamente 4,6:1. En algunos aspectos de la invención, la proporción molar es de aproximadamente 3,7:1 y aproximadamente 4,3:1. En algunos aspectos de la invención, la proporción molar de Resto Efector:anticuerpo es de aproximadamente 4: 1. En algunos aspectos, la proporción molar está entre aproximadamente 2: 1 y aproximadamente 7:1. En algunos aspectos, la proporción molar está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 6:1. En algunos aspectos, la proporción molar está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 7: 1. En algunos aspectos, la proporción molar está entre aproximadamente 3: 1 y aproximadamente 5:1.
En aspectos de la invención en los que es deseable tener menos de 1 ,5 conjugaciones por anticuerpo (tal como cuando es necesario un solo Resto Efector), la proporción molar puede estar entre aproximadamente 1 :1 y aproximadamente 6:1 , en la que el tampón comprende HEPES a una concentración de al menos 0,1 M. La concentración de HEPES puede estar entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 1 M. La concentración de HEPES puede estar entre aproximadamente 0,1 M y aproximadamente 0,5 M. En aspectos de la invención en los que es deseable tener menos de 1 ,5 conjugaciones por anticuerpo (tal como cuando es necesario un solo Resto Efector), la proporción molar puede estar entre aproximadamente 1 :1 y aproximadamente 3:1.
En algunos aspectos, la proporción molar preferida es un intervalo con un límite inferior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 , aproximadamente 1 ,2, aproximadamente 1 ,4, aproximadamente 1 ,5, aproximadamente 1 ,6, aproximadamente 1 ,8, aproximadamente 2, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,8, aproximadamente 3, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1 , aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,8, aproximadamente 6, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,8, aproximadamente 7, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,7, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, y aproximadamente 10 a 1 , y un limite superior seleccionado del grupo que consiste en aproximadamente 1 ,5, aproximadamente 1 ,6, aproximadamente 1 ,8, aproximadamente 2, aproximadamente 2,2, aproximadamente 2,4, aproximadamente 2,5, aproximadamente 2,6, aproximadamente 2,8, aproximadamente 3, aproximadamente 3,2, aproximadamente 3,3, aproximadamente 3,4, aproximadamente 3,5, aproximadamente 3,6, aproximadamente 3,7, aproximadamente 3,8, aproximadamente 3,9, aproximadamente 4,0, aproximadamente 4,1 , aproximadamente 4,2, aproximadamente 4,3, aproximadamente 4,4, aproximadamente 4,5, aproximadamente 4,6, aproximadamente 4,7, aproximadamente 4,8, aproximadamente 4,9, aproximadamente 5, aproximadamente 5,2, aproximadamente 5,4, aproximadamente 5,5, aproximadamente 5,6, aproximadamente 5,8, aproximadamente 6, aproximadamente 6,2, aproximadamente 6,4, aproximadamente 6,5, aproximadamente 6,6, aproximadamente 6,8, aproximadamente 7, aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,5, aproximadamente 7,7, aproximadamente 8, aproximadamente 8,5, aproximadamente 9, aproximadamente 9,5, aproximadamente 10, y aproximadamente 15 a 1.
En algunos aspectos, la invención comprende además conjugar el Resto Efector y la proteína en conjunto durante al menos aproximadamente 30 minutos. En algunos aspectos, la duración es de al menos aproximadamente 60 minutos. En algunos aspectos, la duración es de al menos aproximadamente 2 h. En algún aspecto, la invención comprende además conjugar el Resto Efector y el anticuerpo a entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 40 °C En algún aspecto, la invención comprende además conjugar el Resto Efector y el anticuerpo a entre aproximadamente 10 °C y aproximadamente 30 °C En algún aspecto, la invención comprende además conjugar el Resto Efector y el anticuerpo a entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 30 °C. En algunos aspectos, la reacción se realiza a de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 25 °C. En algunos aspectos, la reacción se realiza a aproximadamente 22 °C. En algunos aspectos, la reacción se realiza a aproximadamente temperatura ambiente.
En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a entre aproximadamente pH 6,5 y aproximadamente pH 8,0. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a entre aproximadamente pH 6,75 y aproximadamente pH 8,0. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a aproximadamente pH 7,7. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a aproximadamente pH 7. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a aproximadamente pH 7,2. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a aproximadamente pH 7,5. En algunos aspectos, la reacción de conjugación tiene lugar a entre un intervalo de valores de pH, cuyo limite inferior se selecciona del grupo que consiste en 5,5, 6, 6,1 , 6,2, 6,3, 6,4, 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7,1 , 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9 y 8, y cuyo límite superior se selecciona del grupo que consiste en 6,5, 6,6, 6,7, 6,8, 6,9, 7,0, 7, 1 , 7,2, 7,3, 7,4, 7,5, 7,6, 7,7, 7,8, 7,9, 8,0, 8,5 y 9.
En algunos aspectos, el pH puede ser inferior a 6,5; esto puede ser particularmente útil en las aplicaciones en las que son necesarias menos de aproximadamente 1 ,5 conjugaciones por anticuerpo. En algunos aspectos, el pH está entre aproximadamente 5,5 y aproximadamente 6,5.
En algunos aspectos, la concentración de sal puede ser inferior a aproximadamente 0,2 M. La sal puede ser una sal de haluro (F, Cl, Br, I) y puede comprender un metal tal como Li, Na, K, Be, Mg, Ca. La sal puede ser NaCI. La sal puede ser KCI. Pueden usarse concentraciones de sal por encima de aproximadamente 0,1 M para limitar la velocidad y/o número de conjugaciones por anticuerpo. La concentración de sal puede estar entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,1 M. La concentración de sal puede estar entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,5 M. La concentración de sal puede estar entre aproximadamente 0 y aproximadamente 0,3 M.
En algunos aspectos, el procedimiento de la invención comprende formular el anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo en un tampón de formulación a aproximadamente pH 5,5. El tampón de formulación puede ser tampón de acetato sódico y trehalosa. Este tampón tiene la ventaja de no contener ninguna amina primaria y se presta bien de por si al ajuste de pH. El anticuerpo puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 15 a aproximadamente 25 mg.ml"1. En algunos aspectos, el anticuerpo puede estar presente en una cantidad de 20 mg.ml"1.
El pH del tampón de formulación puede ajustarse a de aproximadamente pH 7,2 a aproximadamente pH 8,0; en algunas realizaciones, el tampón de formulación puede ajustarse a pH 7,7. El pH del tampón de formulación puede ajustarse con un tampón fosfato. El tampón fosfato puede estar a una concentración de entre aproximadamente 40 mM y aproximadamente 80 mM. El tampón fosfato puede estar a una concentración de entre aproximadamente 10 mM y aproximadamente 200 mM.
En algunos aspectos, la concentración de anticuerpo durante la reacción de conjugación con el Resto Efector/engarce y el grupo saliente Z* puede estar en un intervalo en el que el límite inferior del intervalo se selecciona de aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30 y aproximadamente 40 mg.ml"1, y el límite superior del intervalo se selecciona del grupo que consiste en aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9, aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 30, aproximadamente 40, aproximadamente 50, aproximadamente 60, aproximadamente 70, aproximadamente 80, aproximadamente 90, aproximadamente 100, aproximadamente 150, aproximadamente 200, aproximadamente 500 mg.ml"1.
El Resto Efector (tal como un péptido o ABP) puede reconstituirse a una concentración de aproximadamente 5 a aproximadamente 20 mg.ml"1 en propilenglicol diluido antes del uso y, en algunas realizaciones, puede estar a una concentración de 10 mg.ml"1.
La reacción de conjugación puede realizarse por combinación del anticuerpo o porción de unión a antigeno del mismo y el Resto Efector a una proporción molar de 4 moles de Resto Efector respecto a 1 mol de anticuerpo, e incubación a de aproximadamente 18 °C a aproximadamente 25 °C durante de aproximadamente 2 a aproximadamente 24 h. En algunas realizaciones, la reacción de conjugación entre el anticuerpo y el Resto Efector es a temperatura ambiente durante 2 h. En algunas realizaciones, la reacción de conjugación es durante al menos aproximadamente 2 h. En algunas realizaciones, la reacción de conjugación es durante al menos aproximadamente 30 minutos.
La reacción puede inactivarse y ajustarse a de aproximadamente pH 5,0 a aproximadamente pH 6,0. En algunas realizaciones, la reacción inactivada puede ajustarse a pH 5,5. Esto puede lograrse usando un tampón de succinato y glicina a, por ejemplo, aproximadamente pH 4,0. Este tampón tiene ventajas sobre otros tampones más comunes tales como TRIS, u otros tampones de aminoácidos. El succinato contribuye a limitar la agregación y la precipitación durante la diafiltración, que puede ser agresiva sobre la molécula conjugada, y la glicina contiene una amina primaria adicional (particularmente en los casos de MAC-1 y MAC-2).
La reacción puede concentrarse y el Resto Efector sin reaccionar (por ejemplo, péptido o ABP), especies relacionadas (tales como un péptido en el que el engarce se hidrolizó por reacción con disolvente acuoso) y otros elementos sin reaccionar de la mezcla de reacción (tales como PFP) pueden eliminarse por diafiltración, por ejemplo, usando una membrana de 50 kDa o una cromatografía de exclusión por tamaño en un tampón de succinato, glicina, cloruro sódico y trehalosa, pH 5, 5 a 30 mg.ml' .
En algunos aspectos, el procedimiento puede comprender conjugar un Resto Efector con CLK- 188 (de acuerdo con la numeración de Kabat). En algunos aspectos, la invención comprende conjugar un péptido con un dominio de cadena ligera ? de un anticuerpo o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende sustituir una porción de la región CL con una porción correspondiente de una región CLK, unir al péptido un engarce que comprende un grupo Z* como se define en el presente documento, y hacer reaccionar dicho complejo de péptido engarce-grupo saliente con el anticuerpo, caracterizado por que la región CLK sustituida en el anticuerpo comprende al menos los restos 62-103 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK comprende al menos los restos 62-106 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK comprende al menos los restos 1-103 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK comprende al menos los restos 1-106 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 0 47.
En algunos aspectos, la invención comprende conjugar un péptido con un domino de cadena ligera de anticuerpo murino, o porción de unión a antígeno del mismo, que comprende sustituir una porción de la región CL murina con una porción correspondiente de una región CLK human, unir al péptido un engarce que comprende un grupo saliente Z* como se define en el presente documento, y hacer reaccionar dicho complejo de péptido-engarce-grupo saliente con el anticuerpo, caracterizado por que la región CLK humana sustituida en el anticuerpo comprende al menos los restos 62-103 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK humana comprende al menos los restos 62-106 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK humana comprende al menos los restos 1 -103 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. En algunos aspectos, la región CLK comprende al menos los restos 1-106 de las SEQ ID NO: 15, 45, 46 ó 47. Estos aspectos de la invención pueden ser ventajosos, ya que las regiones CLK murinas no comprenden K 88 (la secuencia correspondiente en CLK murina es RHN; véanse los restos 79-81 de la SEQ ID NO: 49).
Composiciones farmacéuticas de la invención La invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el MAC y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, la expresión "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera de y todos los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos y similares, que sean fisiológicamente compatibles. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos, y pueden incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, políalcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Sustancias farmacéuticamente aceptables tales como humectantes o cantidades minoritarias de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que aumentan la vida útil o la eficacia del anticuerpo o porción de anticuerpo.
Las composiciones de la presente invención pueden estar en una diversidad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo de administración deseado y de la aplicación terapéutica. Las composiciones típicas preferidas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos con anticuerpos en general. El modo de administración preferido es parental (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). En una realización preferida, el anticuerpo se administra por infusión o inyección intravenosa. En otra realización preferida, el anticuerpo se administra por inyección intramuscular o subcutánea.
La composición farmacéutica puede comprender además otro componente, tal como un agente antitumoral o un reactivo de formación de imágenes. Otro aspecto de la presente invención proporciona kits que comprenden MAC de la invención y composiciones farmacéuticas que comprenden estos anticuerpos. Un kit puede incluir, además del MAC o composición farmacéutica, agentes de diagnóstico o terapéuticos. Un kit también puede incluir instrucciones para su uso en un procedimiento de diagnóstico o terapéutico. En algunas realizaciones, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y un agente de diagnóstico. En otras realizaciones, el kit incluye el anticuerpo o una composición farmacéutica del mismo y uno o más agentes terapéuticos, tales como un agente antineoplásico, agente antitumoral o agente quimioterápico adicional.
Estos agentes y compuestos de la invención pueden combinarse con vehículos farmacéuticamente aceptables tales como solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, y similares. El régimen de dosificación particular, es decir, dosis, momento de administración y repetición dependerán del individuo particular y de la historia médica del individuo.
Los vehículos, excipientes o estabilizantes aceptables, no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas, y pueden comprender tampones tales como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos, sales tales como cloruro sódico; antioxidantes incluyendo ácido ascórbico y metionina; conservantes (tales como cloruro de octadecildimetilbencil amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos, tales como metil o propil parabeno; catecol; resorcinol; ciclohexanol; 3-pentanol; y m-cresol); polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente 10 restos); proteínas, tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulínas; polímeros hidrófilos, tales como polivinilpirrolidona; aminoácidos tales como glicina, glutamina, asparagina, hístidina, arginina o lisina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos incluyendo glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; contraiones formadores de sales tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína); y/o tensioactivos no iónicos tales como TWEEN™, PLURONICS™ o polietilenglicol (PEG).
Se preparan liposomas que contienen compuestos de la invención por procedimientos conocidos en la técnica, tal como se describen en las Patentes de Estados Unidos N° 4.485.045 y 4.544.545. Se describen liposomas con un tiempo en circulación aumentado en la Patente de Estados Unidos N° 5.013.556. Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE). Los liposomas se extruyen a través de filtros de un tamaño de poro definido para dar liposomas con el diámetro deseado.
Los principios activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli-(metilmetacrilato), respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones. Dichas técnicas se describen en Remington, The Science and Practice of Pharmacy, 20a Ed., Mack Publishing (2000).
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidrox¡etil-metacrilato), o 'poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y 7-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico tal como el LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímero de ácido láctico-acido glicólico y acetato de leuprolida), acetato isobutirato de sacarosa y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutirico.
Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto se logra fácilmente, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Los compuestos terapéuticos de la invención se ponen generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa o vial de solución intravenosa que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica. Pueden prepararse emulsiones adecuadas usando emulsiones de grasas disponibles en el mercado, tales como Intralipid™, Liposyn™, Infonutrol™, Lipofundin™ y Lipiphysan™. El principio activo puede disolverse en una composición en emulsión premezclada o, como alternativa, puede disolverse en un aceite (por ejemplo, aceite de soja, aceite de cártamo, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de maíz o aceite de almendra) y formarse una emulsión tras la mezcla con un fosfolípido (por ejemplo, fosfolípidos de huevo, fosfolípidos de la soja o lecitina de soja) y agua. Se apreciará que pueden añadirse otros ingredientes, por ejemplo, glicerol o glucosa, para ajusfar la tonicidad de la emulsión. Las emulsiones adecuadas contendrán típicamente hasta el 20% de aceite, por ejemplo, entre el 5 y el 20%. La emulsión grasa puede comprender gotas de grasa de entre 0,1 y 1 ,0 µ??, particularmente, 0,1 y 0,5 µ???, y tener un pH en el intervalo de 5,5 a 8,0.
Las composiciones en emulsión pueden ser las preparadas por mezcla de un compuesto de la invención con Intralipid™ o los componentes del mismo (aceite de soja, fosfolipidos del huevo, glicerol y agua).
Las composiciones para inhalación o insuflación incluyen soluciones y suspensiones en disolventes acuosos u orgánicos farmacéuticamente aceptables, o mezclas de los mismos, y polvos. Las composiciones líquidas o sólidas pueden contener excipientes farmacéuticamente aceptables adecuados como se ha expuesto anteriormente. En algunas realizaciones, las composiciones se administran por la vía respiratoria nasal u oral para un efecto local o sistémico. Las composiciones en disolventes farmacéuticamente aceptables preferentemente estériles pueden nebulizarse mediante el uso de gases. Las soluciones nebulizadas pueden respirarse directamente desde el dispositivo de nebulización o el dispositivo de nebulización puede estar unido a una mascarilla, tienda o respirador de presión positiva intermitente. Pueden administrarse composiciones en solución, suspensión o polvo, preferentemente por vía oral o por vía nasal, desde dispositivos que administran la formulación de una forma apropiada.
Pueden usarse compuestos y composiciones de la invención junto con tratamientos establecidos para la indicación pertinente. Los ejemplos incluyen 5-Fluorouracilo, irinotecán, oxilaplatino, cetuximab, sunitinib y rituximab para el tratamiento de trastornos angiogénicos, en particular, y especialmente, cáncer. Otros ejemplos incluyen ranibizumab, infliximab, adalimumab, natalizumab, omalizumab y palivizumab.
Procedimientos terapéuticos de la invención También se proporcionan por la invención procedimientos terapéuticos. Un procedimiento terapéutico comprende administrar un compuesto o composición de la invención a un sujeto que lo necesite.
La invención proporciona el uso de compuestos de la invención o composiciones farmacéuticas de la invención en un procedimiento de inhibición o reducción de la angiogénesis o para tratar o prevenir una enfermedad o síntoma asociado con un trastorno angiogénico. La invención proporciona procedimientos de inhibición o reducción de la angiogénesis o de tratamiento o prevención de una enfermedad o síntoma asociado con un trastorno angiogénico, que comprende administrar a un paciente una dosis terapéuticamente eficaz de compuestos y composiciones de la invención. También se proporcionan procedimientos de suministro o administración de compuestos y composiciones de la invención y procedimientos de tratamiento usando compuestos y composiciones de la invención. También se proporcionan procedimientos de tratamiento del cáncer que comprenden administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de un compuesto o composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Como se usa en el presente documento, una afección mediada por la angiogénesis es una afección que está causada por una actividad de angiogénesis anormal o una en la que tienen utilidad terapéutica compuestos que modulan la actividad de angiogénesis. Las enfermedades y afecciones que pueden tratarse y/o diagnosticarse con compuestos y composiciones de la invención incluyen cáncer, artritis, hipertensión, enfermedad renal, psoriasis, angiogénesis del ojo asociada con trastorno ocular, infección o intervención quirúrgica, degeneración macular, retinopatia diabética y similares.
Más específicamente, los ejemplos del término "cáncer", cuando se usa en el presente documento en relación con la presente invención, incluyen cánceres de pulmón (NSCLC y SCLC), de cabeza y cuello, de ovario, de colon, de recto, de próstata, de la región anal, de estómago, de mama, de riñon o uréter, de pelvis renal, de glándula tiroidea, de vejiga, de cerebro, carcinoma de célula renales, carcinoma de, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no Hodgkins, tumores de la médula espinal, carcinomas de orofaringe, hipofaringe, esófago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario; o linfoma o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. Aún más específicamente, los ejemplos del término "cáncer", cuando se usa en el presente documento en relación con la presente invención, incluyen cáncer seleccionado de cáncer pulmonar (NSCLC y SCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer de próstata, cáncer de la región anal o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores.
En otras realizaciones, las composiciones farmacéuticas de la invención se refieren a trastornos hiperproliferativos no cancerosos tales como, sin limitación, degeneración macular relacionada con la edad, reestenosis después de angioplastia y psoriasis. En otra realización, la invención se refiere a composiciones farmacéuticas para el tratamiento de un mamífero que requiere la activación de IGF1 R y/o Ang2, en la que la composición farmacéutica comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo activador de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Pueden usarse composiciones farmacéuticas de la invención para tratar la osteoporosis, fragilidad o trastornos en los que el mamífero secreta demasiada poca hormona de crecimiento activa o es incapaz de responder a la hormona de crecimiento.
Como se usa en el presente documento, una "dosificación eficaz" o "cantidad eficaz" de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para ejercer uno o más de cualquier resultado deseado o beneficioso. Para uso profiláctico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen eliminar o reducir el riesgo, disminuir la gravedad o retrasar el desenlace de la enfermedad, incluyendo síntomas bioquímicos, histológicos y/o conductuales de la enfermedad, sus complicaciones y fenotipos patológicos intermedios que se presentan durante el desarrollo de la enfermedad. Para uso terapéutico, los resultados beneficiosos o deseados incluyen resultados clínicos tales como reducción del tamaño tumoral, de la propagación, de la vasculatura de los tumores, o de uno o más síntomas de cáncer u otras enfermedades asociadas con una angiogénesis aumentada, disminución de la dosis de otras medicaciones necesarias para tratar la enfermedad, aumento del efecto de otra medicación y/o retraso de la progresión de la enfermedad en pacientes. Puede administrarse una dosificación eficaz en una o más administraciones. Para los fines de la presente invención, una dosificación eficaz de fármaco, compuesto o composición farmacéutica es una cantidad suficiente para lograr el tratamiento profiláctico o terapéutico directa o indirectamente. Corno se entiende en el contexto clinico, una dosificación eficaz de un fármaco, compuesto o composición farmacéutica puede o no conseguirse junto con otro fármaco, compuesto o composición farmacéutica. Por lo tanto, una "dosificación eficaz" puede considerarse en el contexto de la administración de uno o más agentes terapéuticos, y puede considerarse que un solo agente se administra en una cantidad eficaz si, junto con uno o más agentes distintos, puede conseguirse o se consigue un resultado deseable.
Un "individuo" o un "sujeto" es un mamífero, más preferentemente un ser humano. Los mamíferos también incluyen, pero sin limitación, animales de granja, animales deportivos, mascotas, primates y caballos.
Ventajosamente, la administración terapéutica de compuestos de la invención da como resultado una disminución de la angiogénesis y/o en el caso de cánceres, la estabilización o reducción del volumen tumoral. Preferentemente, el volumen tumoral es al menos aproximadamente un 10% o aproximadamente un 15% menor que antes de la administración de un MAC de la invención. Más preferentemente, el volumen tumoral es al menos aproximadamente un 20% menor que antes de la administración del MAC. Aún más preferentemente, el volumen tumoral es al menos un 30% menor que antes de la administración del MAC. Ventajosamente, el volumen tumoral es al menos un 40% menor que antes de la administración del MAC. Más ventajosamente, el volumen tumoral es al menos un 50% menor que antes de la administración del MAC. Muy preferentemente, el volumen tumoral es al menos un 60% menor que antes de la administración del MAC. Más preferentemente, el volumen tumoral es al menos un 70% menor que antes de la administración del MAC.
La administración de compuestos de la invención de acuerdo con el procedimiento de la presente invención puede ser continua o intermitente dependiendo, por ejemplo, del estado fisiológico del destinatario, de si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y de otros factores conocidos por los expertos en la materia. La administración de un compuesto de la invención puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis separadas en el tiempo.
Anticuerpos Una "inmunoglobulina" es una molécula tetramérica. En una inmunoglobulina de origen natural, cada tetrámero está compuesto por 2 parejas idénticas de cadenas polipeptidicas, teniendo cada pareja una cadena "ligera" (de aproximadamente 25 kDa) y una . cadena "pesada" (de aproximadamente 50-70 kDa). La porción amino-terminal de cada cadena incluye una región variable de aproximadamente 100 a 1 10 o más aminoácidos principalmente responsables del reconocimiento de antígeno. La porción carboxi-terminal de cada cadena define una región constante principalmente responsable de la función efectora. Las cadenas ligeras humanas se clasifican como cadenas ligeras ? y ? Las cadenas pesadas se clasifican como a, d, e, ? y µ, y definen el isotipo del anticuerpo como IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, respectivamente. Dentro de las cadenas ligera y pesada, las regiones variable y constante se unen mediante una región "J" de aproximadamente 12 o más aminoácidos, incluyendo también la cadena pesada una región "D" de aproximadamente 10 aminoácidos más. Las regiones variables de cada pareja de cadena ligera/pesada forman el sitio de unión del anticuerpo, de modo que una ¡nmunoglobulina intacta tiene 2 sitios de unión.
Las cadenas de ¡nmunoglobulina presentan la misma estructura general de regiones flanqueantes (FR) relativamente conservadas unidas por 3 regiones hipervariables, también denominadas regiones determinantes de complementariedad o CDR. Las CDR de las 2 cadenas de cada pareja se alinean por las regiones flanqueantes, permitiendo la unión a un epítopo específico. Del extremo N-terminal al C-terminal, las cadenas tanto ligera como pesada comprenden los dominios FR1 , CDR1 , FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. La asignación de aminoácidos a cada dominio es de acuerdo con las definiciones de Rabat Sequences of Proteins of Immunological Inlerest (National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1987 y 1991)).
La identidad de los restos aminoacídicos en un anticuerpo particular que componen una CDR puede determinarse usando procedimientos bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden identificarse CDR de anticuerpo como las regiones hipervariables originalmente definidas por Kabat y col (Kabat y col., 1992, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a ed., Public Health Service, NIH, Washington D.C.). Las posiciones de las CDR también pueden identificarse como las estructuras de bucle estructural originariamente descritas por Chothia y otros (Chothia y col., 1989, Nature 342: 877-883). Otras estrategias para la identificación de CDR incluyen la "definición por AbM", que es un compromiso entre Kabat y Chothia y se obtiene usando el programa informático de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular (ahora Accelrys®), o la "definición por contacto" de CDR basada en los contactos con antígeno observados, expuesta en MacCallum y col., 1996, J. Mol. Biol., 262: 732-745. En otra estrategia, denominada en el presente documento la "definición conformacional" de CDR, las posiciones de las CDR pueden identificarse como los restos que hacen contribuciones entálpicas a la unión a antígeno (Makabe y col., 2008, Journal of Biological Chemistry, 283: 1 156-1166). Otras definiciones más de límites de CDR pueden no seguir estrictamente una de las estrategias anteriores, pero solaparán no obstante con al menos una porción de las CDR de Kabat, aunque pueden acortarse o alargarse a la luz de las predicciones o de los hallazgos experimentales de que restos o grupos de restos particulares, o incluso CDR completas, no tienen un impacto significativo sobre la unión a antígeno. Como se usa en el presente documento, una CDR puede referirse a CDR definidas por cualquier estrategia conocida en la técnica, incluyendo combinaciones de estrategias. Los procedimientos usados en el presente documento pueden utilizar CDR definidas de acuerdo con cualquiera de estas estrategias. Para cualquier realización dada que contenga más de una CDR, las CDR (u otro resto del anticuerpo) pueden definirse de acuerdo con cualquiera de las definiciones por Kabat, Chothia, extendida, AbM, contacto y/o conformacional.
Como se usa en el presente documento, se ha acordado la numeración de Kabat de ciertos restos; por lo tanto, K 88-CLK se refiere al resto 188 de la cadena ligera kappa de acuerdo con la numeración de Kabat, contando desde el comienzo de la cadena ligera kappa. Se aprecia que la numeración del resto pueda alterarse dependiendo de la convención de numeración específica aplicada.
Un "anticuerpo", se refiere a una inmunoglobulina intacta o a una porción de unión a antígeno de la misma, que compite con el anticuerpo intacto por una unión especifica. Las porciones de unión a antigeno pueden producirse por técnicas de ADN recombinante o por escisión enzimática o química de anticuerpos intactos. Las porciones de unión a antígeno incluyen, entre otros, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dAb y fragmentos de región determinante de la complementariedad (CDR), anticuerpos de cadena sencilla (scFv), anticuerpos quiméricos, diacuerpos y polipéptidos que contienen al menos una porción de una inmunoglobulina que es suficiente para conferir una unión a antigeno específica al polipéptido. Un fragmento Fab es un fragmento monovalente que consiste en los dominios VL, VH, CL y CH I; un fragmento F(ab')2 es un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos por un puente disulfuro en la región de bisagra; un fragmento Fd consiste en los dominios VH y CH1 ; un fragmento Fv consiste en los dominios VL y VH de un solo brazo de un anticuerpo; y un fragmento dAb consiste en un dominio VH o un dominio VL (por ejemplo, ser humano, camélido o tiburón).
En general, debe interpretarse también que las referencias a anticuerpos se refieren a porciones de unión a antígeno de los mismos y, en particular, porciones de unión a antigeno de los mismos que comprenden al menos K 88 de CLK.
Un anticuerpo de cadena sencilla (scFv) es un anticuerpo en el que una región VL y VH se emparejan para formar una molécula monovalente mediante un engarce sintético que permite generarlas como una sola cadena proteica. Los diacuerpos son anticuerpos biespecíficos bivalentes en los que los dominios VH y VL se expresan en una sola cadena polipeptidica, pero usando un engarce que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los 2 dominios en la misma cadena, forzando de este modo a los dominios a emparejarse con dominios complementarios de otra cadena y crear 2 sitios de unión a antígeno. Pueden incorporarse una o más CDR en una molécula, covalentemente o no covalentemente, para generar una inmunoadhesina. Una inmunoadhesina puede incorporar la o las CDR como parte de una cadena polipeptidica de mayor tamaño, puede unir covalentemente la o las CDR a otra cadena polipeptidica, o puede incorporar la o las CDR no covalentemente. Las CDR permiten que la inmunoadhesina se una específicamente a un antígeno de interés particular.
Un anticuerpo puede tener uno o más sitios de unión. Si hay más de un sitio de unión, los sitios de unión pueden ser idénticos entre sí o pueden ser diferentes. Por ejemplo, una inmunoglobulina de origen natural tiene 2 sitios de unión idénticos, un anticuerpo de cadena sencilla o fragmento Fab tiene un sitio de unión, mientras que un anticuerpo "biespecífico" o "bifuncional" tiene 2 sitios de unión diferentes.
Un "anticuerpo aislado" es un anticuerpo que (1 ) no está asociado con componentes asociados de forma natural, incluyendo otros anticuerpos asociados de forma natural que lo acompañan en su estado nativo, (2) está libre de otras proteínas de la misma especie, (3) se expresa por una célula que no expresa de forma natural el anticuerpo, o se expresa por una célula de una especie diferente, o (4) no aparece en la naturaleza.
La expresión "anticuerpo humano" incluye todos los anticuerpos que tienen una o más regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina humanas. En algunas realizaciones de la presente invención, todos los dominios variables y constantes del anticuerpo anti-IGF1 R proceden de secuencias de inmunoglobulina humana (un anticuerpo totalmente humano). Un anticuerpo humanizado es un anticuerpo que procede de una especie no humana, en el que ciertos aminoácidos en la región flanqueante y en los dominios constantes de las cadenas pesada y ligera se han mutado para evitar o anular una respuesta inmune en seres humanos. Como alternativa, un anticuerpo humanizado puede producirse fusionando los dominios constantes de un anticuerpo humano con los dominios variables de una especie no humana. La expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo que contiene una o más regiones de un anticuerpo y una o más regiones de uno o más anticuerpos distintos.
El término "epítopo" incluye cualquier determinante proteico capaz de una unión específica a una ¡nmunoglobulina o receptor de célula T. Los determinantes epitópicos consisten habitualmente en agrupamientos superficiales químicamente activos de moléculas tales como aminoácidos o cadenas laterales de azúcares, y habitualmente tienen características estructurales tridimensionales específicas, así como características de carga especificas. Se dice que un anticuerpo se une específicamente a un antígeno cuando la constante de disociación es <1 µ?, preferentemente < 100 nM y, más preferentemente: <10 nM.
El término conjugado de anticuerpo multifuncional o MAC se refiere a un anticuerpo como se define en el presente documento, o porción de unión a antigeno del mismo, conjugado covalentemente con la menos un Resto Efector que se une a una diana. El Resto Efector puede ser un péptido, molécula pequeña, proteína, molécula de ácido nucleico, toxina, aptámero o fragmento de unión a antigeno o fragmento del mismo. Las referencias a la conjugación de péptidos y similares a las que se hace referencia a lo largo de toda la memoria descriptiva generalmente son aplicables a la conjugación con proteínas y anticuerpos (de unión a antigeno) o fragmentos de los mismos. La unión entre Resto Efector y anticuerpo (o fragmento del mismo) puede ser un enlace covalente. En algunas realizaciones en las que el Resto Efector es una proteina o péptido, el Resto Efector puede fusionarse con el extremo N- o C-terminal de una de las cadenas de anticuerpo Por el término fusionado se entiende que el Resto Efector y anticuerpo están fusionados por medio de un enlace peptidico entre sus cadenas principales peptidicas respectivas. En algunos aspectos, el Resto Efector se conjuga covalentemente con el anticuerpo mediante un engarce y no se fusiona a través de enlaces peptídicos que conecten las 2 cadenas principales peptidicas.
En algunas realizaciones, los MAC de la invención comprenden anticuerpos anti-IGF1 R humanizados. Los MAC de la invención pueden comprender anticuerpos anti-IGF1 R totalmente humanos por introducción de genes de inmunoglobulina humana en un roedor, de modo que el roedor produzca anticuerpos completamente humanos. También se proporcionan anticuerpos anti-IGF1 R totalmente humanos Se espera que los anticuerpos anti-IGF1 R totalmente humanos minimicen las respuestas inmunogénicas y alérgicas intrínsecas a anticuerpos monoclonales (AcM) de ratón o derivatizados de ratón y, por lo tanto, aumenten la eficacia y seguridad de los anticuerpos administrados. Puede esperarse que el uso de anticuerpos totalmente humanos proporcione una ventaja sustancial en el tratamiento de enfermedades humanas crónicas y recurrentes, tales como inflamación y cáncer, que puede requerir administraciones repetidas de anticuerpos. En otra realización, la invención proporciona un MAC que comprende un anticuerpo anti-IGF1 R que no se une al complemento.
Se describen procedimientos de producción de anticuerpos anti-IGF1 R para su uso en la invención en los documentos WO02053596 y WO2005016967, incorporándose ambos en el presente documento por referencia.
En algunas realizaciones, no hay más de 10 cambios de aminoácido en las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IGF1 R mutado en comparación con el anticuerpo anti-IGF1 R antes de la mutación. En algunas realizaciones, no hay más de 5 cambios de aminoácidos en las regiones VH o VL del anticuerpo anti-IGF1 R mutado. Puede no haber más de 3 cambios de aminoácidos. En otras realizaciones, no hay más de 15 cambios de aminoácidos en los dominios constantes. Puede no haber más de 10 cambios de aminoácidos en los dominios constantes. Puede no haber más de 5 cambios de aminoácidos en los dominios constantes.
Además, pueden crearse anticuerpos de fusión en los que 2 (o más) anticuerpos de cadena sencilla se unen entre sí. Esto es útil si se desea crear un anticuerpo divalente o polivalente en una sola cadena polipeptidica o si se desea crear un anticuerpo biespecífico.
Un tipo de anticuerpo derivatizado se produce por entrecruzamiento de 2 o más anticuerpos (del mismo tipo o de tipos diferentes; por ejemplo, para crear anticuerpos biespecificos). Los agentes entrecruzantes adecuados incluyen los que son heterobifuncionales, que tienen 2 grupos reactivos de forma distinta separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) u homobifuncionales (por ejemplo, disuccinimidil suberato).
Otro tipo de anticuerpo derivatizado es un anticuerpo marcado.
Los agentes de detección útiles con los que puede derivatizarse un anticuerpo o porción de anticuerpo de la invención incluyen compuestos fluorescentes, incluyendo fluoresceina, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, cloruro de 5-dimetilamina-1-naftalenosulfonilo, ficoeritrina, fósforos de lantánidos y similares. Un anticuerpo también puede marcarse con enzimas que sean útiles para la detección, tales como peroxidasa de rábano picante, galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina, glucosa oxidasa y similares. Cuando un anticuerpo está marcado con una enzima detectable, se detecta por adición de reactivos adicionales que la enzima usa para producir un producto de reacción que puede distinguirse. Por ejemplo, cuando está presente el agente peroxidasa de rábano picante, la adición de peróxido de hidrógeno y diaminobencidina conduce a un producto de reacción coloreado que es detectable. Un anticuerpo también puede marcarse con biotina y detectarse por medición indirecta de la unión de avidina o estreptavidina. Un anticuerpo puede marcarse con un agente magnético, tal como gadolinio. Un anticuerpo también puede marcarse con un epitopo polipeptídico predeterminado reconocido por un indicador secundario (por ejemplo, secuencias de parejas de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas epitópicas). En algunas realizaciones, los marcadores se unen por brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir los impedimentos estéricos potenciales.
El anticuerpo también puede derivatizarse con un grupo químico tal como polietilenglicol (PEG), un grupo metilo o etilo o un grupo carbohidrato. Estos grupos pueden ser útiles para mejorar las características biológicas del anticuerpo, por ejemplo, para aumentar la semivida en suero o para aumentar la unión tisular.
Anticuerpos catalíticos En algunos aspectos de la invención, el MAC comprende un anticuerpo catalítico o porción de unión a antígeno del mismo. En algunos aspectos, el anticuerpo puede ser un anticuerpo aldolasa.
El contenido del documento US2006205670 se incorpora en el presente documento por referencia, en particular los párrafos
[0153]-
[0233], que describen anticuerpos, fragmentos útiles y variantes y modificaciones de los mismos, sitios de combinación y CDR, preparación de anticuerpos, expresión, humanización, modificación de aminoácidos, glicosilación, ADCC, CDC, aumento de la semivida en suero de anticuerpos, vectores de expresión, sistemas huésped de mamífero y plegamiento, entre otros elementos de la tecnología de anticuerpos.
La expresión "sitio de combinación", como se usa en el presente documento (también conocido como sitio de unión del anticuerpo), se refiere a la región de la inmunoglobulina o dominios de Ig que se combinan (o pueden combinarse) con el determinante de un antigeno apropiado (o una proteina estructuralmente similar). El término generalmente incluye las CDR y los restos flanqueantes adyacentes que están implicados en la unión a antígeno.
Los "anticuerpos aldolasa", como se usa la expresión en el presente documento, se refieren a anticuerpos que contienen porciones del sitio de combinación que, cuando no tienen trabas (por ejemplo, por conjugación), catalizan una reacción de adición de aldol entre un donador cetona alifática y un aceptor aldehido. Los anticuerpos aldolasa son capaces de generarse por inmunización de un animal inmunosensible con un inmunógeno que incluye un hapteno de 1 ,3 dicetona de fórmula: acoplado a una proteina transportadora y caracterizado además por tener una lisina con un grupo e-amino reactivo en el sitio de combinación de anticuerpo. Los anticuerpos aldolasa se caracterizan adicionalmente por que su actividad catalítica está sometida a la inhibición con el hapteno de 1 ,3-dicetona por formación de un complejo entre el hapteno de 1 ,3-dicetona y el grupo e-amino de la lisina del anticuerpo catalítico.
Como se analiza, en ciertas realizaciones, ciertos anticuerpos que pueden usarse para generar MAC, composiciones y muestras de la invención pueden comprender una cadena lateral reactiva en el sitio de combinación de anticuerpo. Una cadena lateral reactiva puede estar presente de forma natural o puede ponerse en un anticuerpo por mutación. El resto reactivo del sitio de combinación de anticuerpo puede asociarse con el anticuerpo, tal como cuando el resto está codificado por un ácido nucleico presente en la célula linfoide que primero se identificó que generaba el anticuerpo. Como alternativa, el resto aminoacidico puede surgir mutando expresamente el ADN para codificar el resto particular. El resto reactivo puede ser un resto no natural que surge, por ejemplo, por incorporación biosintética usando un codón único, ARNt, y aminoacil-ARNt como se analiza en el presente documento. En otra estrategia, el resto aminoacidico, o sus grupos funcionales reactivos (por ejemplo, un grupo sulfhidrilo o grupo amino nucleófilo), puede unirse a un resto aminoacidico en el sitio de combinación de anticuerpo. Por lo tanto, el enlace covalente con el anticuerpo que se produce "a través de un resto aminoacidico en un sitio de combinación de un anticuerpo", como se usa en el presente documento, significa que el enlace puede ser directamente con un resto aminoacidico de un sitio de combinación de anticuerpo o a través de un resto químico que se une a una cadena lateral de un resto aminoacidico de un sitio de combinación de anticuerpo. En algunas realizaciones, el aminoácido es cisteina y el grupo reactivo de la cadena lateral es un grupo sulfhidrilo. En otras realizaciones, el resto aminoacidico es lisina y el grupo reactivo de la cadena lateral es el grupo e-amino. En algunas realizaciones, el aminoácido es K93 en la cadena pesada de acuerdo con la numeración de Kabat. En algunas realizaciones, el aminoácido es K99 en HC h38C2 de acuerdo con la numeración de las SEQ ID NO: 52 y 54.
Los anticuerpos catalíticos son una fuente de anticuerpos con sitios de combinación adecuados que comprenden una o más cadenas laterales de aminoácidos reactivas. Dichos anticuerpos incluyen anticuerpos aldolasa, anticuerpos beta lactamasa, anticuerpos esterasa y anticuerpos amidasa.
Una realización comprende un anticuerpo aldolasa tal como los anticuerpos monoclonales de ratón AcM 33F12 y AcM 38C2 (cuya VL y VH comprenden las SEQ ID NO: 56 y 57), asi como versiones convenientemente quiméricas y humanizadas de dichos anticuerpos (por ejemplo, h38C2lgG1 : SEQ ID NO: 51 y 52 y h38C2-lgG2: SEQ ID NO: 53 y 54). El AcM de ratón 38C2 (y h38C2) tiene una lisina reactiva próxima a pero fuera de la HCDR3, y es el prototipo de una nueva clase de anticuerpos catalíticos que se generaron por inmunización reactiva e imitación mecánica de enzimas aldolasa naturales. Otros anticuerpos catalíticos aldolasa que pueden usarse incluyen los anticuerpos producidos por el hibridoma 85A2, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1015; hibridoma 85C7, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1014; hibridoma 92F9, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1017; hibridoma 93F3, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-823; hibridoma 84G3, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-824; hibridoma 84G11 , que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1018; hibndoma 84H9, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1019; hibridoma 85H6, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA- 825; hibridoma 90G8, que tiene el número de acceso de la ATCC PTA-1016. Por medio de una lisina reactiva, estos anticuerpos catalizan reacciones de aldol y retro-aldol usando el mecanismo de enamina de las aldolasas naturales.
Los compuestos de la invención también pueden formarse por unión de un agente de dirección a una cisterna reactiva, tal como las encontradas en los sitios de combinación de anticuerpos catalíticos tioesterasa y esterasa. Los anticuerpos que contienen aminoácidos reactivos pueden prepararse por medios bien conocidos en la técnica, incluyendo mutación de un resto de sitio de combinación de anticuerpo para codificar el aminoácido reactivo o derivatización química de una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación de anticuerpo con un engarce que contenga el grupo reactivo.
El anticuerpo puede ser un anticuerpo humanizado Cuando los compuestos de la invención se unen covalente al sitio de combinación de un anticuerpo y dichos anticuerpos se humanizan, es importante que dichos anticuerpos se humanicen con retención de la alta afinidad de unión por el grupo W. Se contemplan diversas formas de anticuerpos aldolasa murinos humanizados. Una realización usa el anticuerpo catalítico aldolasa humanizado h38c2 lgG1 o h38c2 Fab con los dominios constantes humanos CK y Cyi1. El gen de VK de línea germinal humana DPK-9 y el gen de JK humano JK4 se usaron como regiones flanqueantes para la humanización del dominio variable de cadena ligera kappa de m38c2, y el gen de línea germinal humana DP-47 y el gen de JH humano JH4 se usaron como regiones flanqueantes para la humanización del dominio variable de cadena pesada de m38c2. La figura 18A ilustra un alineamiento de secuencias entre las cadenas variables ligeras y pesadas en m38c2, h38c2 y lineas germinales humanas. El h38c2 puede utilizar dominios constantes de lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 incluyendo cualquiera de los alotipos de los mismos. Otra realización usa un anticuerpo quimérico que comprende los dominios variables (VL y VH) de h38c2 (SEQ ID NO: 55 y 56) y los dominios constantes de un anticuerpo lgG1 , lgG2, lgG3 o lgG4 que comprenden K188-CLK. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de longitud completa, Fab, Fab', F(ab')2, FV) dsFv, scFV) VH, VL, diacuerpo o minicuerpo que comprende dominios VH y VL de h38c2. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que comprende los dominios VL y VH de h38c2 y un dominio constante seleccionado del grupo que consiste en lgG1 , lgG2, lgG3 e lgG4. El anticuerpo puede ser h38C2 lgG1 (SEQ ID NO: 51 y 52). El anticuerpo puede ser h38C2 lgG2 (SEQ ID NO: 53 y 54). El anticuerpo puede ser una versión humanizada de un anticuerpo aldolasa murino que comprende una región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD o IgE humano. En otra realización, el anticuerpo es un anticuerpo quimérico que comprende la región VL y VH de un anticuerpo aldolasa murino (por ejemplo, SEQ ID NO: 57 y 58) y una región constante de un anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD o IgE humano. En realizaciones adicionales, el anticuerpo es una versión totalmente humana de un anticuerpo aldolasa murino que comprende una secuencia polipeptidica de anticuerpo IgG, IgA, IgM, IgD o IgE humano nativo o natural.
También se contemplan diversas formas de fragmentos de anticuerpo aldolasa humanizado. Una realización usa h38c2 F(ab')2. El h38c2 F(ab')2 puede producirse por la digestión proteolítica de h38c2 lgG1 . Otra realización usa un h38c2 scFv que comprende los dominios VL y VH de h38c2 que están opcionalmente conectados por el engarce intermedio (Gly4Ser)3 (SEQ ID NO: 59). Como alternativa a la humanización, pueden generarse anticuerpos humanos. Por ejemplo, ahora es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que son capaces, tras la inmunización (o inmunización reactiva en el caso de anticuerpos catalíticos), de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción de inmunoglobulina endógena.
Como se usa en el presente documento, el término "farmacocinética" se refiere a la concentración de un compuesto administrado en el suero con el tiempo. La farmacodinámica se refiere a la concentración de un compuesto administrado en tejidos diana y no diana con el tiempo y los efectos sobre el tejido diana (por ejemplo, eficacia) y el tejido no diana (por ejemplo, toxicidad). Pueden diseñarse mejoras en, por ejemplo, la farmacocinética o farmacodinámica para un agente de dirección o agente biológico particular, tal como usando enlaces inestables o modificando la naturaleza química de cualquier engarce (por ejemplo, cambiando la solubilidad, carga y similares). El término "Koff" se refiere a la constante de velocidad de disociación para la disociación de un anticuerpo del complejo de antigeno/anticuerpo. El término "Kd" se refiere a la constante de disociación de una interacción de antigeno-anticuerpo particular.
En algunas realizaciones, la porción de anticuerpo anti-IGF1 R del MAC tiene una selectividad por IGF1 R que es al menos 50 veces superior que su selectividad por el receptor de insulina. En algunas realizaciones, la selectividad de la porción de anticuerpo anti-IGF1 R del MAC es más de 100 veces superior que su selectividad por el receptor de insulina. En algunas realizaciones, la porción de anticuerpo anti-IGF1 R del MAC no presenta ninguna unión específica apreciable a ninguna otra proteína distinta de IGF 1 R.
En algunos aspectos de la invención, el MAC se une a IGF1 R con alta afinidad. En algunas realizaciones, el MAC se une a IGF 1 R con una Kd de 1 x 10"8 M o menos. En algunas realizaciones, el MAC se une a IGF1 R con una Kd de 1 x 10"9 M o menos. En algunas realizaciones, el MAC se une a IGF1 R con una Kd de 5 x 10~1 M o menos. En algunas realizaciones, el MAC se une a IGF1 R con una Kd de 1 x 10"1 M o menos.
En algunos aspectos de la invención, el MAC tiene una velocidad de disociación de IGF1 R reducida. En una realización, el MAC tiene una K0ff de 1 x104 s"1 o inferior. En algunas realizaciones, la K0tf es de 5 x 10"5 s"1 o inferior.
En algunos aspectos, la invención proporciona sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros, tautómeros, solvatos y profármacos de compuestos, muestras, composiciones y composiciones farmacéuticas de la invención.
Engarces de Anticuerpos Catalíticos Se desvelan ciertos engarces adecuados para conectar agentes de dirección al sitio de combinación de anticuerpos catalíticos (Engarces de Anticuerpos Catalíticos: engarces de CA) en el documento US2009098130, cuyo contenido se incorpora en el presente documento por referencia. La expresión "agentes de dirección" se usa en el presente documento para distinguir de la expresión "Resto Efector", pero es evidente que los tipos de moléculas unidas al final de un engarce de CA o engarce de MAC pueden ser intercambiables. En particular, se incluyen en el presente documento aspectos del documento US2009098 30 relativos a las fórmulas generales que describen engarces (de CA), estructuras de engarces (de CA) específicos, síntesis de engarces (de CA) y combinaciones de diferentes elementos de P, Q y W, y (clasificados en el mismo como grupos X, Y y Z, respectivamente) como se describen específicamente y en general en el mismo.
El engarce de CA puede ser un CA lineal o ramificado y, opcionalmente, incluye uno o más grupos carbocíclicos o heterociclicos. La longitud del engarce de CA puede verse en términos del número de átomos lineales, contándose los restos cíclicos tales como anillos aromáticos y similares tomando la vía más corta alrededor del anillo. En algunas realizaciones, el engarce de CA tiene una extensión lineal de entre 5-15 átomos, en otras realizaciones, 15-30 átomos, en otras realizaciones más 30-50 átomos, en otras realizaciones más 50-100 átomos y, en otras realizaciones más, 100-200 átomos. Otras consideraciones de engarces de CA incluyen el efecto sobre las propiedades físicas o farmacocinéticas del compuesto resultante, tales como solubilidad, lipofilia, hidrofilia, hidrofobia, estabilidad (más o menos estable así como degradación planeada), rigidez, flexibilidad, inmunogenicidad y modulación de la unión a anticuerpo, la capacidad para incorporarse en una micela o liposoma y similares.
En algunos aspectos, el engarce de CA puede unirse covalentemente a la cadena lateral del resto de engarce de TA. El engarce puede comprender la fórmula: P-Q-W; en la que P es una cadena de conexión biológicamente compatible que incluye cualquier átomo seleccionado del grupo que consiste en C, H, N, O, P, S, F, Cl, Br e I, y puede comprender un polímero o copolimero de bloque, y se une covalentemente al resto de enlace (a través de la cadena lateral, extremo amino-terminal o extremo carboxilo-terminal según sea apropiado) cuando el engarce es lineal, Q es un grupo de reconocimiento opcionalmente presente que comprende al menos una estructura de anillo; y W es un resto de unión que comprende un enlace covalente con una cadena lateral de aminoácido en un sitio de combinación de un anticuerpo.
Cuando está presente, Q puede tener la estructura opcionalmente sustituida: en la que a, b, c, d y e son independientemente carbono o nitrógeno; f es carbono, nitrógeno, oxígeno o azufre; Q se une a P y W independientemente en 2 posiciones de anillo cualesquiera de valencia suficiente; y no más de 4 de a, b, c, d, e o f son simultáneamente nitrógeno y, preferentemente, a, b, c, d y e en la estructura de anillo son cada uno carbono. En algunos aspectos, Q puede ser fenilo. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el grupo Q puede contribuir a la colocación del grupo reactivo en un sitio de combinación de anticuerpo adecuado de modo que el grupo W pueda reaccionar con una cadena lateral de aminoácido reactiva.
El engarce de CA puede diseñarse de modo que contenga un grupo reactivo capaz de formar covalentemente o no covalentemente un enlace con una macromolécula, tal como un anticuerpo, proteína o fragmento del mismo. El grupo reactivo se escoge para su uso con un resto reactivo en un sitio de combinación particular. Por ejemplo, un resto químico para su modificación por un anticuerpo aldolasa puede ser una cetona, dicetona, beta lactámico, halocetona de éster activo, lactona, anhídrido, maleimida, alfa-haloacetamida, ciclohexil dicetona, epóxido, aldehido, amidina, guanidina, imina, enamina, fosfato, fosfonato, epóxido, aziridina, tioepóxido, dicetona enmascarada o protegida (cetal, por ejemplo), lactámico, halocetona, aldehido y similares.
En algunas realizaciones, W, antes de la conjugación con la cadena con la cadena lateral de un resto en el sitio de combinación de un anticuerpo, incluye uno o más grupos C=0 dispuestos para formar una azetidinona, dicetona, un acil beta-lactámico, un éster activo, una halocetona, un grupo ciclohexil dicetona, un aldehido, una maleimida, un alqueno activado, un alquino activado o, en general, una molécula que comprende un grupo saliente susceptible a desplazamiento nucleófilo o electrófilo. Otros grupos pueden incluir una lactona, un anhídrido, una alfa-haloacetamida, una ¡mina, una hidrazida o un epóxido. Los grupos reactivos electrófilos de engarce ejemplares que pueden unirse covalentemente a un grupo nucleófilo reactivo (por ejemplo, una cadena lateral de lisina o cisteína) en un sitio de combinación de anticuerpo incluyen acil beta-lactámico, dicetona simple, éster activo de succinimida, maleimida, haloacetamida con engarce, halocetona, ciclohexil dicetona, aldehido, amidina, guanidina, imina, enamina, fosfato, fosfonato, epóxido, aziridina, tioepóxido, una dicetona enmascarada o protegida (un cetal, por ejemplo), lactámico, sulfonato y similares, grupos C=0 enmascarados tales como ¡minas, cetales, acétales y cualquier otro grupo electrófilo conocido. En ciertas realizaciones, el grupo reactivo incluye uno o más grupos C=0 dispuestos para formar un acil beta-lactámico, dicetona simple, éster activo de succinimida, maleimida, haloacetamida con engarce, halocetona, ciclohexil dicetona o aldehido. W puede ser un alquilo sustituido , cicloalquilo sustituido, arilo sustituido, arialquilo sustituido, heterociclilo sustituido o heterociclilalquilo sustituido, en el que al menos un sustituyente es un resto de 1 ,3-dicetona, un acil beta-lactámico, un éster activo, una alfa-halocetona, un aldehido, una maleimida, una lactona, un anhídrido, una alfa-haloacetamida, una amina, una hidrazida o un epóxido. En algunos aspectos, el grupo W se une covalentemente a un armazón de macromolécula que puede proporcionar una semivida aumentada a los péptidos de la invención. En algunos aspectos, el grupo W, si está presente, se une covalentemente al sitio de combinación de un anticuerpo.
En algunos aspectos, antes de la conjugación (por ejemplo, con el sitio de combinación de un anticuerpo), W tiene la estructura: en la que q = 0-5. q puede ser 1 ó 2. q puede ser 1. En otros aspectos, q puede ser 2.
En algunos aspectos, después de la conjugación con el sitio de combinación de anticuerpo, W tiene la estructura: en la que q = 0-5 y Anticuerpo-N- es un enlace covalente con una cadena lateral en un sitio de combinación de un anticuerpo, q puede ser 1 ó 2. q puede ser 1. En otros aspectos, q puede ser 2.
P puede ser un grupo que comprende tres componentes; Pp-Ps-Py, en el que Pp es un grupo específicamente adaptado para poder combinarse con el agente de dirección, Ps es una región espaciadora del grupo P y Py es un grupo adaptado a unirse al grupo W. En algunos aspectos, Py se selecciona de un enlace amida, un enlace enamina o un enlace guanidinio. Py puede seleccionarse para proporcionar una molécula de hidrógeno adyacente (dentro de dos átomos) al grupo Q. Aunque sin desear quedar ligado a teoría alguna, se cree que el átomo H puede contribuir al reconocimiento por el grupo Q de un bolsillo hidrófobo a través de interacción de enlace de H, particularmente en relación con el bolsillo hidrófobo de la hendidura de unión de un anticuerpo catalítico, tal como h38C2. Por lo tanto, el enlace amida, por ejemplo, puede orientarse de modo que el grupo NH se una directamente al grupo Q, proporcionando el H del grupo NH la formación de un enlace de hidrógeno. Como alternativa, el grupo C=0 de una amida puede unirse al grupo Q, con el H del grupo NH aproximadamente 2 átomos adyacente al grupo Q, pero todavía disponible para la formación de un enlace de H. En algunas realizaciones, Py está ausente. En algunas realizaciones, el grupo Py tiene la fórmula: En algunos aspectos, Ps se selecciona de modo que Ps no proporciona ningún grupo demasiado reactivo. Ps puede seleccionarse para proporcionar una longitud global de los grupos P de entre 2-15 átomos. Ps puede seleccionarse de modo que la longitud global del grupo P esté entre 2 y 10 átomos. Xs puede seleccionarse de modo que la longitud global del grupo P sea de 4-8 átomos. Ps puede seleccionarse de modo que la longitud global del grupo P sea de 5 átomos. Ps puede seleccionarse de modo que la longitud global del grupo P sea de 6 átomos. En algunos aspectos, Ps puede comprender una de las fórmulas siguientes: en las que n = 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10, y m está presente o ausente; n puede ser 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6; n puede ser 1 , 2, 3 ó 4; n puede ser 1 ; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4.
En algunos aspectos, Ps comprende una de las fórmulas siguientes: Pp se selecciona idealmente para permitir una estrategia de enlace covalente direccional específico con el resto de unión de una molécula de dirección (resto de unión de TA), tal como un péptido, proteina, molécula pequeña, ácido nucleico o aptámero. Por ejemplo, cuando el resto de unión de TA comprende un grupo nudeófilo, Pp puede ser un grupo electrófilo y viceversa. Por ejemplo, si la cadena lateral del resto de unión de TA comprende un grupo amina, tal como K, H, Y, ornitina, Dap o Dab, Xp puede ser COOH u otro electrófilo reactivo de forma similar. Si el resto de unión de TA es D o E, Pp puede comprender un grupo nudeófilo, tal como un grupo amina. Cualquiera de estas estrategias permite que se forme un enlace covalente entre el grupo Pp y el resto de unión de TA por estrategias de formación de enlaces amida. Cuando el grupo de unión de TA es un grupo amina, Pp puede comprender la fórmula: P puede ser un polímero o copolímero de bloque biológicamente compatible opcionalmente presente. P puede ser de estructura: , 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31 , 32, 33,34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41 , 32, 43, 44 ó 45; w, r y s son cada uno independientemente 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20; y Rb en cada aparición es independientemente hidrógeno, alquilo CMO sustituido o no sustituido, cicloalquilo C3.7-alquilo C0-6 sustituido o no sustituido o aril-alquilo Co-6 sustituido o no sustituido.
Cuando el resto de unión de TA es C, homólogos de C u otros restos que contienen grupos tiol, Pp puede comprender un grupo maleimida (o similar) que permita una estrategia de reacción de adición de tiol-maleimida para unir covalentemente el grupo Pp al resto de unión de TA. En algunos aspectos, Pp también puede comprender un grupo tiol que permita que se forme un puente disulfuro entre el resto de unión de TA y el grupo Pp. En algunos aspectos, Pp puede ser maleimida: en la que la flecha indica el punto de unión a la molécula de dirección y la linea paralela representa la unión al grupo Q del engarce. Cuando el punto de unión a la molécula de dirección comprende un resto de cisteína u otra cadena lateral que lleve tiol, el mecanismo de conjugación puede ser el siguiente: En algunos aspectos, el grupo Pp comprende una maleimida sustituida: Producto Principal Produelo Minorilano En algunos aspectos, P es en la que v y w se seleccionan de modo que la longitud de la cadena principal de X es de 6-12 átomos; En algunos aspectos, el engarce de TA es de fórmula: en la que n = 1 ó 2 ó 3 ó 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; n puede ser puede ser 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6; n puede ser 1 ; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4. M puede estar ausente. M puede estar presente.
En algunos aspectos, el engarce de TA es de fórmula: en la que n = 1 ó 2 ó 3 ó 4, 5, 6, 7, 8, 9 ó 10; n puede ser 1 , 2, 3, 4, 5 ó 6; n puede ser 1 ; n puede ser 2; n puede ser 3; n puede ser 4. M puede estar ausente. M puede estar presente.
En algunos aspectos, la porción P de engarces de CA puede usarse como la porción Y, X-Y, Y-Z y X-Y-Z, de engarces para un MAC de la invención.
Péptidos y Proteínas Acil lisina, o Kac (también AcK) se refiere a: K(SH) se refiere a: Ácido diaminobutirico (Dab) Ácido diaminopropiónico (Dap) Homocisteína Homoserina Ornitina En general las nomenclaturas usadas en relación con, y las técnicas de cultivo celular y tisular, biología molecular, inmunología, microbiología, genética y química de proteínas y ácidos nucleicos e hibridación descritas en el presente documento son aquellas bien conocidas y usadas comúnmente en la técnica. Los procedimientos y técnicas de la presente invención se realizan en general de acuerdo con procedimientos convencionales bien conocidos en la técnica y como se describe en diversas referencias generales y más especificas que se citan y analizan a lo largo de toda la presente memoria descriptiva a menos que se indique otra cosa. Como se usan en el presente documento, los 20 aminoácidos convencionales y sus abreviaturas siguen el uso convencional. Los términos "polipéptido", "péptido" y "proteína" se usan indistintamente para referirse a un polímero de restos aminoacídicos. Como se usan en el presente documento, estos términos son aplicables a polímeros de aminoácidos en los que uno o más restos aminoacídicos son un análogo químico artificial de un aminoácido de origen natural correspondiente. Estos términos también son aplicables a polímeros de aminoácidos de origen natural. Los aminoácidos pueden estar en forma L o D siempre que se mantenga la unión y otras características deseadas del péptido. Un polipéptido puede ser monomérico o polimérico.
A menos que se indique otra cosa mediante un prefijo "D", por ejemplo, D-Ala o N-Me-D-lle, o escrito en formato de minúsculas, por ejemplo, a, i, I, (versiones D de Ala, lie, Leu), la estereoquímica del carbono alfa de los aminoácidos y restos aminoacilo en péptidos descritos en la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones adjuntas es la configuración natural o "L".
Todas las secuencias peptídicas se escriben de acuerdo con la convención aceptada en general por la que el resto aminoacidico a N-terminal está a la izquierda y el resto aminoacidico a C-terminal está a la derecha. Como se usa en el presente documento, la expresión "extremo N-terminal" se refiere al grupo a-amino libre de un aminoácido en un péptido, y la expresión "extremo C-terminal" se refiere al extremo a-ácido carboxilico libre de un aminoácido en un péptido. Un péptido que está N-terminado con un grupo se refiere a un péptido que lleva un grupo en el nitrógeno alfa-amino del resto aminoacidico N-terminal. Un aminoácido que está N-terminado con un grupo se refiere a un aminoácido que lleva un grupo en el nitrógeno a-amino.
Como se usan en el presente documento, los términos "halo," "halógeno" o "haluro" se refieren a F, Cl, Br o I.
Como se usa en el presente documento, la expresión "actividad biológica" se refiere a las actividades in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla o a respuestas fisiológicas que son el resultado de la administración in vivo de un compuesto, composición u otra mezcla. La actividad biológica incluye por lo tanto efectos terapéuticos, efectos de diagnóstico y la actividad farmacéutica de dichos compuestos, composiciones y mezclas. La expresión "biológicamente activo" o "funcional" se refiere a un polipéptido que presenta al menos una actividad que es característica de o similar a un agente de dirección AA.
La expresión "biológicamente compatible", como se usa en el presente documento, se refiere a algo que es biológicamente inerte o no reactivo con moléculas biológicas intracelulares y extracelulares, y que no es tóxico.
La expresión "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo en el que uno o más enlaces con un carbono o carbonos o hidrógeno o hidrógenos se sustituyen por un enlace con átomos que no sean de hidrógeno ni de carbono tales como, pero sin limitación, un átomo de halógeno en haluros tales como F, Cl, Br e I; un átomo de oxígeno en grupos tales como grupos hidroxilo, grupos alcoxi, grupos ariloxi y grupos éster; un átomo de azufre en grupos tales como grupos tiol grupos, grupos alquil y aril sulfuro, grupos sulfona, grupos sulfonilo y grupos sulfóxido; un átomos de nitrógeno en grupos tales como aminas, amidas, alquilaminas, dialquilaminas, arilaminas, alquilarilaminas, diarilaminas, N-óxidos, imidas y enaminas; un átomo de silicio en grupos tales como en grupos trialquilsililo, grupos dialquilarilsililo, grupos alquildiarilsililo y grupos triarilsililo; y otros heteroátomos en diversos otros grupos. Los grupos alquilo sustituidos también incluyen grupos en los que uno o más enlaces con uno o varios átomos de carbono o hidrógeno se sustituye por un enlace con un heteroátomo tal como oxígeno en grupos carbonilo, carboxilo y éster; nitrógeno en grupos tales como imínas, oximas, hidrazonas y nitrilos. Los grupos alquilo sustituidos incluyen, entre otros, grupos alquilo en los que uno o más enlaces con un átomo de carbono e hidrógeno se sustituyen por uno o más enlaces con átomos de flúor. Un ejemplo de un grupo alquilo sustituido es el grupo trifluorometilo y otros grupos alquilo que contienen el grupo trifluorometilo. Otros grupos alquilo incluyen aquellos en los que uno o más enlaces con un átomo de carbono o hidrógeno se sustituyen por un enlace con un átomo de oxígeno de modo que el grupo alquilo sustituido contiene un grupo hidroxilo, alcoxi, ariloxi o un grupo heterocícliloxi. Otros grupos alquilo más incluyen grupos alquilo que tienen un grupo amina, alquilamina, dialquilamina, arilamina, (alquil)(aril)amina, diarilamina, heterociclilamina, (alquil)(heterociclil)amina, (aril)(heterocicl¡l)am¡na o dieterociclilamina.
La expresión "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo no sustituido divalente como se ha definido anteriormente. Por lo tanto, metileno, etileno y propileno son cada uno ejemplos de alquílenos no sustituidos. La expresión "alquilo sustituido" se refiere a un grupo alquilo sustituido divalente como se ha definido anteriormente. Los grupos alquileno inferior sustituidos o no sustituidos tienen de 1 a aproximadamente 6 carbonos.
La expresión "cicloalquilo no sustituido" se refiere a grupos alquilo cíclicos tales como ciclopropilo, cíclobutilo, ciclopentilo, cíclohexilo, cicloheptilo y ciclooctilo, y dichos anillos sustituidos con grupos alquilo de cadena lineal y ramificada como se han definido anteriormente. La expresión también incluye grupos alquilo policíclicos tales como, pero sin limitación, adamantilo, norbornilo y biciclo[2.2.2]octilo y similares, asi como dichos anillos sustituidos con grupos alquilo de cadena lineal o ramificada como se han definido anteriormente. Por lo tanto, la expresión incluiría grupos metilcliclohexilo entre otros. La expresión no incluye grupos alquilo cíclicos que contienen heteroátomos. Los grupos cicloalquilo no sustituidos pueden unirse a uno o más átomos de carbono, átomos de oxígeno, átomos de nitrógeno y/o átomos de azufre en el compuesto precursor. En algunas realizaciones, los grupos cicloalquilo no sustituidos tienen de 3 a 20 átomos de carbono. En otras realizaciones, dichos grupos alquilo no sustituidos tienen de 3 a 8 átomos de carbono mientras que en otros, dichos grupos tiene de 3 a 7 átomos de carbono.
La expresión "cicloalquilo sustituido" tiene el mismo significado con respecto a grupos cicloalquilo no sustituidos que los grupos alquilo sustituidos tienen con respecto a grupos alquilo no sustituidos. Por lo tanto, la expresión incluye, pero sin limitación, grupos oxociclohexilo, clorociclohexilo, hidroxiciclopentilo y clorometilciclohexilo.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS FIGURAS Figura 1A: Alineamientos de secuencias de aminoácidos de las cadenas pesadas de los anticuerpos 2.12.1 y 2.12.1.fx, con la secuencia de consenso para la región variable mostrada. Figura 1 B: Alineamiento de secuencias de aminoácidos de las cadenas ligeras de los anticuerpos 2.12.1 y 2.12.1 fx con la secuencia de consenso para la región variable mostrada. Las CDR están subrayadas y las regiones constantes se muestran en cursiva. Secuencias de los anticuerpos 2.12.1 y 2. 2.1 fx como se desvelan en los documentos WO2005016967 y WO2005016967.
Figuras 2A-2D: El análisis del peso molecular intacto de MAC por espectrometría de masas demuestra que múltiples péptidos se unen al anticuerpo anti-IGF1 R 2.12.1.fx. Figura 2A: datos de espectrometría de masas del anticuerpo anti-IGF1 R 2.12.1.fx. Figura 2B-2D: datos de espectrometría de masas de MAC-2, que muestran experimentos repetidos de 3 lotes individuales.
Figuras 3A-3H: Datos de espectrometría de masas de 2.12.1.fx (IGF1 R) y 3 lotes de MAC-2 (MAC) en los que se han reducido los enlaces disulfuro. Figura 3A: Datos de espectrometría de masas de 2.12.1.fx (IGF1 R), cadena ligera. Figura 3B: Datos de espectrometría de masas de 2. 2.1.fx (IGF1 R), cadena pesada. Figura 3C: datos de espectrometría de masas de cadena ligera de MAC-2, lote 1. Figura 3D: datos de espectrometría de masas de cadena pesada de MAC-2, lote 1. Figura 3E: datos de espectrometría de masas de cadena ligera de MAC-2, lote 2. Figura 3F: datos de espectrometría de masas de cadena pesada de MAC-2, lote 2. Figura 3G: datos de espectrometría de masas de cadena ligera de MAC-2, lote 3. Figura 3H: datos de espectrometría de masas de cadena pesada de MAC-2, lote 3.
Figura 4A: Secuencia de aminoácidos de la cadena ligera del anticuerpo 2.12.1.fx con sitios de escisión por quimotripsina señalados con balas. Los fragmentos de quimotrípticos que contienen un resto de Lys (sitio de conjugación potencial) están marcados por el número desde el extremo N-terminal El fragmento Y15 de la cadena ligera está subrayado. Figura 4B: Secuencia de aminoácidos de la cadena pesada del anticuerpo 2.12.1.fx con sitios de escisión por quimotripsina señalados con balas. Los fragmentos quimotrípticos que contienen un resto de Lys (sitio de conjugación potencial) están marcados por el número desde el extremo N-terminal.
Figura 5A: Datos de espectrometría de masas de un péptido que contiene lisina:Y15 de cadena ligera conjugado, que muestra datos de espectrometría de masas para el anticuerpo anti-IGF1 R no conjugado 2.12.1 .fx (IGF1 R) y MAC-2 (MAC), así como una representación del fragmento Y15. Figura 5B: Datos de espectrometría de masas del fragmento de cadena ligera no conjugado Y15, que muestra datos de espectrometría de masas para el anticuerpo anti-IGF1 R no conjugado 2.12.1.fx (IGF1 r) y MAC-2 (MAC), así como una representación del fragmento Y15.
Figura 6A: Los datos de cromatograma de CLEM de ¡ón seleccionado para el fragmento tríptico de 2.12.1.fx. Figura 6B: Los datos de cromatograma de CLEM de ión seleccionado para el fragmentó tríptico cuando Lys188 está modificado con ABP de MAC-2.
Figura 7A: Los datos de cromatograma de CLEM de ión seleccionado para el fragmento tríptico de 2.12.1.fx. Figura 7B: Los datos de cromatograma de CLEM de ión seleccionado para el péptido tríptico cuando Lys190 está modificado con ABP de MAC-2.
Figura 8: Espectros de masas de MAC-2 intacto.
Figura 9A: Espectros de masas de cadena pesada reducida para MAC-2. Figura 9B: Espectros de masas de cadena ligera reducida para MAC-2.
Figura 10: ELISA de unión a Ang1-4. Gráfica representativa de la unión de MAC a miembros de la familia de Ang (Ang1 -4).
Figura 1 1 : ELISA de competición con Ang2. Gráfica representativa de la competición con la unión de Ang2 al receptor de Tie2 para MAC.
Figura 12: ELISA de competición con IGF1 R. Gráfica representativa de la competición con la unión de IGF1 a IGF1 R para MAC.
Figura 13: Inhibición de la autofosforilación de IGF1 R inducida por IGF1 por MAC en células 3T3-MGF1 R.
Figura 14A: Volumen tumoral de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon Colo205 después del tratamiento con vehículo, Ang2-h38c2, anticuerpo contra IGF1 R (2.12.1 fx) o MAC-2 (IP, 1x/sem). Los datos se representan como la media y ET de n = 10/grupo para los días 0-28 (n = 10 para todos los grupos más allá del día 28). *: P < 0,05, anticuerpo contra IGF1 R (2.12.1.fx) 10 mg/kg frente a MAC-2 10 mg/kg; **: P < 0,01 , Ang2-h38C2 frente a MAC-2; Anova de dos factores, post-prueba de Bonferroni. Figura 14B: Niveles de expresión de IGF1 R relativos en lisados preparados a partir de tumores escindidos y congelados.
Figura 15A: Volumen tumoral de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon Colo205 después del tratamiento IP semanal con vehículo o MAC-2 (IP, 1x/sem, 0,3-10 mg/kg). Los datos se representan como la media y ET de n = 10/grupo. ***: P<0,001 , PBS frente a MAC-2 (todas las dosis); Anova de dos factores, post-prueba de Bonferroni. Figura 15B: Pesos tumorales finales a Día 28. Figura 15C: Densidad de microvasos tumorales de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon Colo205 después del tratamiento con vehículo o MAC-2 (IP, una vez por semana). Figura 15D: Niveles de expresión de Ang2 relativos en lisados preparados a partir de tumores escindidos y congelados. Figura 15E: Niveles de expresión de IGF1 R relativos en lisados preparados a partir de tumores escindidos y congelados.
Figura 16A: Volumen tumoral de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon Colo205 después del tratamiento IP una vez por semana con vehículo Ang2-h38c2 (10 mg/kg), anticuerpo IGF1 R (2. 2.1.fx) (10 mg/kg) o MAC-2 (1 , 3 ó 10 mg/kg). Figura 16B: Volumen tumoral de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon Colo205 después del tratamiento IP una vez por semana con vehículo, anticuerpo IGF1 R (2.13.2) (10 mg/kg) o MAC-2 (10 mg/kg). Figura 16C: Volumen tumoral de xenoinjertos de adenocarcinoma de colon Colo205 después del tratamiento IP una vez por semana con vehículo, Ang2-h38c2 (10 mg/kg), anticuerpos contra IGF1 R (2.12.1.fx y 2.13.2) (10 mg/kg), MAC-2 (1 , 3 ó 10 mg/kg) o Ang2-h38c2 (10 mg/kg) en combinación con 2.12.2.fx o 2.13.2 (10 mg/kg). Todos los datos se representan como la media y ET de n = 10/grupo.
Figura 17: Volumen tumoral de melanoma MDA-MB-435 después del tratamiento semanal con vehículo o MAC-2 (IP, una vez por semana). **: P < 0,05, PBS frente a MAC-2, 20mg/kg; P < 0,01 PBS frente a Ang2-h38c2, 10 mg/kg o MAC-2, 3 mg/kg: Anova de dos factores, postprueba de Bonferroni. Los datos se representan como la media y ET de n = 10/grupo.
Figura 18A: Alineamiento de secuencia de aminoácidos de los dominios variables de m38c2, h38c2 y líneas germinales humanas. Las regiones flanqueantes (FR) y las regiones determinantes de complementariedad (CDR) están definidas de acuerdo con Kabat y col. Los asteriscos marcan las diferencias entre m38c2 y h38c2 o entre h38c2 y las líneas germinales humanas. Figura 18B: Alineamiento de secuencia de aminoácidos de región kappa de cadena ligera constante murina (mCLt ), región kappa de cadena ligera constante humana (hCLi ) y región lambda de cadena ligera constante humana (hCU.). Las diferencias entre ITICLK y hCLic; y entre hCI_ y hCl ; se muestran como asteriscos y las sustituciones conservadas se muestran como cruces.
Para que la presente invención se entienda mejor, se exponen los siguientes ejemplos. Estos ejemplos son con fines ilustrativos solamente y no deben interpretarse como limitantes del alcance de la invención de ningún modo.
EJEMPLOS EJEMPL01 Síntesis de Péptidos usados en la invención Resina de Amida de Ring Etapas para SPPS usando química de Fmoc: (i) Eliminación de Fmoc con piperidina al 20%/DMF; (ii) Acoplamiento de aminoácidos; la proporción de HBTU:Aminoácido:HOBt:NMM respecto a la carga de amina de la resina es de 5:5:5:20. El disolvente usado era NMP, (iii) Etapas repetidas para cada acoplamiento de aminoácido. X = grupo protector de cadena lateral inestable a ácido.
Ensamblaje completado de péptido unido a resina totalmente protegido: (i) Eliminación de Fmoc con piperidina al 20%/DMF, (ii) 5 Acetilación: anhídrido acético/NMM/NMP.
Ensamblaje completado de péptido unido a resina protegido N- acetilado.
ESQUEMA 1 10 Síntesis en fase sólida de una cadena peptídica usando química de Fmoc (ejemplificada con un péptido de unión a Ang2 típico (ABP), SEQ ID NO: 27) EJEMPLO 2 Escisión de la resina del péptido preparado como en el EJEMPLO 1 1. Ensamblaje completado de péptido unido a resina protegido N-acetilado. 2. TFA/agua/fenol/triisopropilsilano (90:4:4:2).
ESQUEMA 2 Escisión de ABP (SEQ ID NO: 27) de la resina.
EJEMPLO 3 Síntesis de compuestos de ABP-tiol-engarce 1. Péptido de unión a Ang2. 2. Ácido S-tritil-mercaptopropiónico/HBTU/NMM (proporción 5:5:10 con respecto al péptido Ang2). 3. Intermedio peptídico de Ang2 con tiol protegido con tritilo. 4. TFA/DCM/TIPS (proporción 5:93:2). 5. Péptido modificado Ang2 que lleva tiol.
ESQUEMA 3 Síntesis de ???-1-ti (3.3) (SEQ ID NO: 27 con K 1 sustituido con resto de unión K(SH)).
Se sintetizaron análogos de un péptido de unión a Ang-2 (ABP) con diferentes puntos de unión (véanse los Ejemplos 1 y 2). Inicialmente, el intermedio de ABP con tiol libre se sintetizó y se purificó y después se añadió un engarce de maleimida-PEG2-PFP, seguido de una etapa de purificación final para obtener un ABP activado con PFP puro. El ensamblaje y la escisión de la cadena peptidica se llevaron a cabo como se resume en los esquemas 1 y 2 para generar el ABP puro.
El ABP (284 mg, 0,1 mmol) se disolvió en dimetilformamida (0,5 mi) con agitación. Por separado, se agitó ácido S-tritil-mercaptopropiónico (MPA, 62 mg, aproximadamente 0,125 mmol), HBTU (48 mg, 0,125 mmol) y N-metilmorfolina (0,025 mi, 0,25 mmol) en DMF (0,5 mi) durante 5 min hasta su disolución. La solución de ABP y las soluciones de MPA activado se mezclaron entre sí durante 2 h. El progreso de la reacción se controló mediante CLEM. Después de 2 h, la solución se añadió lentamente a éter helado (40 mi) para precipitar el producto ABP-S-tritil-MPA. El precipitado blanco se recogió por filtración y después se secó. El resto sólido se disolvió después en una solución de ácido trifluoroacético en diclorometano (1 : 10, 10 mi), añadiéndose triisopropilsilano (TIPS) (0,050 mi) y se agitó durante 1 h. La solución se evaporó a presión reducida hasta un aceite amarillo claro, después el péptido con tiol bruto se precipitó por adición de éter helado. El producto se recogió por centrifugación y se secó al vacio. El resto se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50%, después se liofilizó para dar el péptido con tiol bruto (pureza de aproximadamente el 80% por análisis de HPLC). El péptido con tiol bruto se purificó por HPLC semipreparativa para dar 145 mg de SEQ ID NO: 27.
Síntesis de SEQ ID NO: 27-K(SH)11-MAL-2PEG-PFP 11 4.1 SEC ID N°: 27-K(SH) + (engarce de MAL-2PEG-PFP) i 4.3 (SEC ID N°: 27-K(SH)11-MAL-2PEG-PFP) ESQUEMA 4 Síntesis de SEQ ID NO: 27-K(SH)11-MAL-2PEG-PFP EJEMPLO 4 Generación de intermedios de Péptido de Unión a Ang-2-tiol (ABP-ti) El ensamblaje de la cadena peptídica se realizó en una escala de 0,1 milimoles. La resina usada era resina Fmoc-Rink-PL (150 mg, sustitución 0,67 mmol/g). Se usaron protocolos de química de Fmoc convencionales para ensamblar el péptido. La eliminación de Fmoc era con piperidina al 20%/DMF durante 3 5 min y todas las etapas de lavado de resina usaban DMF. Para incorporar los aminoácidos, se empleó una sola etapa de acoplamiento para cada resto, usando activación con HBTU/HOBt/NMM durante un periodo de 2 h. El Resto de Unión (K(SH)) se incorporó como Fmoc-Lys(Ne-mercaptopropionato-S-Trt)-OH. Tras el ensamblaje de la cadena, el grupo Fmoc N-terminal se eliminó y el péptido-resina se protegió terminalmente por acetilación. La resina final se lavó con DCM y se secó durante una noche al vacío. Los pesos de resina finales obtenidos eran los siguientes: SEQ ID NO: 29-K(SH)9: 627 mg , SEQ ID NO: 30-K(SH)16: 573 mg, SEQ ID NO: 31-K(SH)18: 642 mg y SEQ ID NO: 32-K(SH)19: 641 mg.
La eliminación acidolítica de grupos protectores y la escisión del péptido de la resina se consiguieron usando un cóctel de TFA/agua/ditiotreitol/triisopropilsilano (proporción 90:4:4:2, 5 mi) durante 2 h. La solución se filtró de la resina y la resina se lavó con otros 5 mi de TFA puro. Los filtrados combinados se evaporaron hasta un jarabe y después de la adición de éter helado precipitó un polvo blanco. El polvo se recogió por centrifugación, después se disolvió en acetonitrilo acuoso al 50% (20 mi), se congeló y se liofilizó durante una noche.
Resultados SEQ ID NO: 29-K(SH)9 La cantidad de SEQ ID NO: 29-K(SH)9 bruto obtenido era de 252 mg. El análisis del SEQ ID NO: 29-K(SH)9 bruto por HPLC mostró un pico principal limpio; 5-95%B/30 min, C18, Tp = 18,3 min. Un análisis de CLEM adicional del SEQ ID NO: 29-K(SH)9 bruto mostró que el pico principal era el producto deseado; [M+H)+ = 2930, +2 = 1465, +3 = 977 observado.
SEQ ID NO: 30-K(SH)16 La cantidad de SEQ ID NO: 30-K(SH)16 bruto obtenido era de 229 mg. El análisis del SEQ ID NO: 30-K(SH)16 bruto por HPLC mostró un pico principal limpio; 5-95%B/30 min, C18, Tp = 22,0 min. Un análisis de CLEM adicional del SEQ ID NO: 30-K(SH)16 bruto mostró que el pico principal era el producto deseado; [M+H]+ = 2915, +2 = 1458, +3 = 972 observado.
SEQ ID NO: 31-K(SH)1 La cantidad de SEQ ID NO: 31-K(SH)18 bruto obtenido era de 252 mg. El análisis del SEQ ID NO: 31-K(SH)18 bruto por HPLC mostró un pico principal limpio; 5-95%B/30 min, C18, Tp = 21 ,1 min. Un análisis de CLEM adicional del SEQ ID NO: 31-K(SH)18 bruto mostró que el pico principal era el producto deseado; [M+H]+ = 2912, +2 = 1456, +3 = 971 observado.
SEQ ID NO: 32-K(SH)19 La cantidad de SEQ ID NO: 32-K(SH)19 bruto obtenido era de 261 mg. El análisis del SEQ ID NO: 32-K(SH)19 bruto por HPLC mostró un pico principal limpio; 5-95%B/30 min, C18, Tp = 20,0 min. Un análisis de CLEM adicional del SEQ ID NO: 32-K(SH)19 bruto mostró que el pico principal era el producto deseado; [M+H]+ = 2912, +2 = 1465, +3 = 977 observado.
Purificación Una columna de HPLC preparativa se preequilibró con TFA acuoso diluido y acetonitrilo. Los intermedios de ABP-tiol brutos (es decir, ABP con K(SH) como resto de unión) se disolvieron en DMF (3 mi), después se adsorbieron sobre la columna y se eluyeron por aplicación de un gradiente de acetonitrilo en TFA diluido. Las fracciones se recogieron automáticamente por la masa (M = 1465). La elución de la columna se controló por UV, las fracciones obtenidas se analizaron por RP-HPLC analítica. Las fracciones más puras (>95% por HPLC analítica) se combinaron y se liofilizaron para dar las cantidades siguientes: 87 mg de SEQ ID NO: 29-K(SH)9 puro, 50 mg de SEQ ID NO: 30-K(SH)16 puro, 59 mg de SEQ ID NO: 31-K(SH)18 puro y 39 mg de SEQ ID NO: 32-K(SH)19 puro.
Síntesis de Engarce Se consideraron 5 estrategias de activación diferentes para conjugar un ABP con anticuerpos anti-IGF1 R de la invención, (Ejemplos 5-9) (se muestran estructuras ejemplares usando el SEQ ID NO: 27-K(SH)11): EJEMPLO 5 Esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) (SEQ ID NO: 27-K1 -NHS) Esteres de N-hidroxisuccinimida (NHS) (SEQ ID NO: 27-K11- 5.2 Éster de Bis-PEG5-NHS 5.3 SEQ ID NO: 27-K 1-5PEG-NHS ESQUEMA 5 Síntesis de SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-NHS Síntesis de SEQ ID NO: 27-K -5PEG-NHS La SEQ ID NO: 27 (5.1 ) se hizo reaccionar con un Bis-NHS, PEGx-engarce (5.2), de modo que el grupo carboxilo activado con NHS permaneció en el producto peptídico activado final (5.3) y permaneció disponible para la conjugación posterior. Esto requería la presencia de otros 4 grupos carboxilo libres en el ABP. Estos excluían una estrategia de activación ¡n situ simple ya que la posición del grupo activado no podía haberse controlado fácilmente y sería probable que se hubieran activado múltiples cadenas laterales carboxilo.
Se examinó la reacción entre el éster de bis-PEG5-NHS y el ABP (SEQ ID NO: 27). Usando un exceso de 10 veces del engarce en DMSO, una solución del ABP y N-metilmorfolina (como base) en DMSO se valoró lentamente en una solución bien agitada. Se tomaron muestras y se examinaron por HPLC y CLEM a diversos puntos temporales. Después de aproximadamente 2 h había una formación de producto sustancial (conversión de aproximadamente el 80% de 5.1 a forma 5.3) y éste sé separaba fácilmente del reactivo de engarce de bis-NHS. Sin embargo, incluso en DMSO, el producto 5.3 se convertía lentamente con el tiempo en la forma de ácido libre (en la que el grupo éster de NHS se convertía en el carboxilo libre inactivo). Además, cuando la mezcla de reacción bruta se fraccionó para aislar el producto deseado 5.3, éste también estaba sometido a hidrólisis durante las etapas de purificación y posterior liofilización. Aunque el procedimiento tenía éxito en la síntesis de cierto producto, se creía que la inestabilidad acuosa del éster de NHS resultante limitaría su aplicación en las reacciones de conjugación posteriores. Se muestran ensayos adicionales de MAL-PEG2-NHS en el Ejemplo 30 (que comprende el grupo Z* Z13).
EJEMPLO 6 Maleimida (Mal) (SEQ ID NO: 27-K11-Mal) La activación de maleimida se usa generalmente de acuerdo con un compañero de conjugación con tiol libre. Aunque no están presentes restos de tiol libres en el anticuerpo 2.12.1.fx, hay varios procedimientos químicos que pueden usarse para introducir tioles libres en proteínas y de este modo proporcionar sitios de enlace para conjugación basada en maleimida.
Los péptidos que contienen Mal son en general relativamente sencillos de sintetizar usando engarces que contienen maleimida/ácido simples. Varios compuestos de SEQ ID NO: 27-MAL se sintetizaron como se muestra a continuación. En general, los péptidos activados con maleimida no se conjugaban bien con proteínas o anticuerpos que carecen de un tiol endógeno (derivado de una cadena lateral de cisteína libre) o un tiol introducido por otro medio químico, por ejemplo, por reactivo de Traut.
SEQ ID NO: 27-K11-4PEG-Mal-2 EJEMPLO 7 Azetidinona (AZD) (SEQ ID NO: 27-K11-AZD) SEQ ID NO: 27-AZD Se sintetizó ABP activado con AZD por unión de un engarce de AZD-ácido al ABP en solución.
Activación con A2D 6.2 Engarce de AZD-ácido 6.3 SEQ ID NO: 27-K1 -AZD ESQUEMA 6 Síntesis de SEQ ID NO: 27-K 1-AZD (6.3) El ABP activado con AZD reaccionaba muy lentamente con grupos amino de cadenas laterales de lisina. La conjugación se intentó a pH de 7 a 9 en tampón fosfato para aumentar la tendencia nucleófila de las lisinas de superficie del anticuerpo por disminución de su carga (el pKa de las lisinas en las proteínas de superficie es de aproximadamente 9, 1 a 1 1 ,2). Las cuestiones de estabilidad del anticuerpo y la hidrólisis de AZD excluían el uso de un pH por encima de 9. Se añadieron 15 moles de ABP activado con AZD por 1 mol de anticuerpo durante 3 días de tiempo de reacción, produciendo niveles de conjugación reducidos (un promedio de 2 ABP activados con AZD por anticuerpo). A pH básico, la hidrólisis de AZD se produce rápidamente (50% después de 24 h) contribuyendo a niveles disminuidos de conjugación.
EJEMPLO 8 Esteres de ácido escuárico (Escuaratos). (SEQ ID NO: 27-Escuarato) SEQ ID NO: 27-K Escuarato-R 7.2 Escuarato derivado en R1 y R2, en este ejemplo, R1 y R2 son ambos CH?CH3.
ESQUEMA 7 7.3 SEQ ID NO: 27-K 1-Escuarato ESQUEMA 7 Derivados de ácido escuárico Engarce de SEQ ID NO: 27-K 1-Escuarato-1? ABP-1-Escuarato-1 Se sabe que los ésteres de alquilo generados a partir de ácido escuárico reaccionan selectivamente con tioles a pH neutro mientras que a pH mayores (aproximadamente 8,5 y superiores) también pueden reaccionar con aminas pero más lentamente. La reactividad de los escuaratos puede aumentarse significativamente por sustitución de grupos alquilo con arilo. La presente invención proporciona varios derivados de escuarato del ABP, en los que la naturales del "R" varía (R se selecciona del grupo que consiste en etilo, fenilo, 2-metoxicarbonilfenilo, 3-fluorofenilo y 3,5-difluorofenilo) y otros derivados en los que se ha variado la posición de engarce. Los escuaratos de etilo se conjugan bien con tioles libres pero mal con aminas libres en proteínas y anticuerpos a menos que el pH esté por encima de 9. Los escuaratos de arilo demostraron mejor eficacia cuando se conjugaban con lisinas libres en los anticuerpos de la invención a pH neutro.
EJEMPLO 9 Esteres pentafluorofenilicos (PFP) (SEQ ID NO: 27-PFP) La presente invención también proporciona el uso de ésteres pentafluorofenilicos (PFP) para formar péptidos activados relativamente estables. Este procedimiento tiene varias ventajas sobre otras estrategias en el sentido de que el grupo PFP puede introducirse en solución fácilmente a partir de un producto peptidico activado estable que de por sí puede purificarse usando procedimientos de HPLC convencionales, observándose escasa hidrólisis de éster de PFP. El desafío en la síntesis de un ABP conectado covalentemente a un engarce con un grupo reactivo capaz de conjugación con un anticuerpo es la presencia de cuatro cadenas laterales ácidas (3 ácidos aspárticos y un ácido glutámico) en la secuencia de ABP. Esto excluye una estrategia de activación simple usando el péptido y un agente activador puesto que no hay procedimientos simples conocidos que aseguren una activación específica de sitio en una cadena lateral acida particular.
Para resolver este problema, la presente invención proporciona una ruta sintética por la que un grupo éster activado, tal como PFP, puede acoplarse directamente a una lisina de cadena lateral en el péptido por una reacción quimioselectiva (usando química de tiol/maleimida) o por uso de un reactivo de bis-éster activo que forma una amida con la cadena lateral peptidica pero deja el otro extremo como el éster activo.
En algunas realizaciones, la estrategia puede ser un bis-ácido PEG con cada ácido activado como éster de PFP. En soluciones orgánicas, con alguna base presente, el extremo del engarce de bis-PFP reaccionaba con la cadena lateral ?-e-amino de la lisina en la posición de unión necesaria para formar un enlace amida estable, mientras que el otro extremo mantenía el otro grupo PFP. Un problema potencial con esta estrategia es la posibilidad de formar dimeros de péptidos, en la que se añadiría un péptido a cada uno de los restos PFP presentes en cada extremo del engarce. En algunos aspectos, la presente invención supera este problema adicional alterando la estequiometría y la adición del péptido y engarce de bis-PEG-PFP respectivos. Una solución proporcionada por la invención es tener un exceso del engarce de bis-PFP en solución y añadir lentamente el péptido en solución, de modo que esté siempre presente un exceso de engarce por encima del péptido. Teniendo una proporción de entre aproximadamente 3,7:1 y aproximadamente 4,3:1 , o en algunas realizaciones una proporción de aproximadamente 4:1 de engarce sobre péptido, el péptido activado con PFP necesario puede sintetizarse sin dimero presente. El esquema de síntesis para el SEQ ID NO. 27-K1 -5PEG-PFP se muestra a continuación en el Esquema 8: Bis-dPEGg-OPfp (8.2) SEQ ID NO: 27-K -5PEG-PFP (8.3) ESQUEMA 8 SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP Síntesis de engarce de bis-dPEGs-OPfp (8.2) Se disolvió bis-dPEG5-ácido (1 mmol, 338 mg) en diclorometano anhidro (5 mi), después se añadió pentafluorofenol (2 mmol, 368 mg), junto con diciclohexícarbodiimida (1 mmol, 208 mg). La solución se agitó durante una noche a temperatura ambiente. Después de este tiempo, el producto secundario diciclohexilurea blanco fino se eliminó por filtración y el filtrado se evaporó hasta sequedad para dar un aceite ligero amarillo pálido. El análisis por TLC y HPLC indicó un producto puro con una EM correcta = 670. El producto se usó en la siguiente etapa sin una purificación adicional. El producto es estable durante varios meses a -20 °C.
Síntesis de SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP (8.3) El SEQ ID NO: 27 (8.1) (730 mg) se disolvió en dimetilformamida anhidra (8 mi) y se añadió N-metilmorfolina (0,05 mi). Se puso una alícuota de reactivo bis-dPEGs-OPfp puro (8.2) (0,5 mi) en un vial de vidrio (20 mi). Con agitación enérgica, la solución de SEQ ID NO: 27/NMM se añadió en 4 x alícuotas de 2 mi al reactivo de bis-dPEGs-OPfp durante 2 h, después la mezcla final se agitó durante 1 h adicional. El progreso de la conversión a producto SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP se controló por HPLC analítica. Al final de la reacción, la solución se filtró y se purificó directamente por HPLC semipreparativa en una columna 1" C8. Las fracciones más puras (>95% por HPLC analítica) se combinaron y se liofilizaron para dar 400 mg (rendimiento del 48% ) de producto final de engarce de péptido ABP-1 -5PEG-PFP-2. Un mecanismo similar puede usarse para generar el SEQ ID NO: 27-K(SH)11-Maleimida-2PEG-PFP (véase el Esquema 4).
Síntesis de engarce de maleimida-2PEG-PFP ESQUEMA 9 lv1ale¡mida-dPEG2-ácido (9.1 )? Maleimida-2PEG-PFP (9.2) Se disolvió maleimida-dPEG2-ácido (328 mg, 1 mmol, Quanta Biodesign), pentafluorofenol (0,103 mi, 1 mmol, PFP) y diciciohexilcarbodiimida (206 mg, 1 mmol, DCC) en DCM seco (10 mi) y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El precipitado blanco fino (producto secundario DCU) que se formó se eliminó por filtración y el filtrado se evaporó hasta sequedad al vacio. El producto se obtuvo como un polvo blanco fino en alto rendimiento (490 mg, cuantitativo). La pureza era >95% por HPLC analítica, la EM mostró [M+H]+ = 495.
Síntesis de análogos de ABP activados con PFP Una muestra (30-40 mg) de cada uno de los intermedios de ABP-tiol purificados (es decir, ABP con K(SH) como resto de unión) se disolvió en DMF anhidro (2 mi). Se añadió Mal-PEG2-PFP (20 mg) junto con N-metilmorfolina (5 mi). La reacción se agitó y se controló a temperatura ambiente por HPLC para seguir el curso temporal de formación de producto.
La conversión completa de péptido de partida en producto ABP activado con PFP se observó en las primeras 2 h. La solución se filtró y el pico de producto se aisló directamente por HPLC semipreparativa. En cada caso, el producto se aisló en un rendimiento de aproximadamente el 40% después de la liofilización.
SEQ ID NO: 32-K(SH)19-MAL-2PEG-PFP: 12 mq EJEMPLO 10 Conjugación de anticuerpo Los productos farmacológicos MAC-1 y MAC-2 se generaron por conjugación de 2.12.1.fx con un péptido de unión a Ang2. El MAC-1 está compuesto por 2.12.1.fx con SEQ ID NO: 27-K(SH) 1-MAL-2PEG-PFP y el MAC-2 está compuesto por 2.12.1.fx con SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP. Se calculó el número de conjugaciones de péptido por molécula de 2.12.1.fx en una muestra de cada MAC (véase la Tabla 1).
TABLA 1 Perfil de conjugación de MAC-1 y MAC-2 Generación de MAC-1 SEQ ID NO: 27-K(SH) -MAL-2PEG-PFP MAC-1 ESQUEMA 10 Reacción de SEQ ID NO: 27-K(SH)1 -MAL-2PEG-PFP con una cadena lateral de lisina de un anticuerpo (Ab-K-Ab): Cuando el anticuerpo es 2.12.1. fx, el MAC es MAC-1.
Generación de MAC-2 MAC-2 ESQUEMA 11 Reacción de SEQ ID NO: 27-K 1-5PEG-PFP con una cadena lateral de lisina de una anticuerpo (Ab-K-Ab): Cuando el anticuerpo es 2.12.1. fx. el MAC es MAC-2.
EJEMPLO 11 Condiciones de optimización para conjugación basada en PFP Se procesaron una serie de ensayos para establecer las condiciones de reacción óptimas para la conjugación dirigida. Al final de cada conjugación de reacción, la reacción se inactivo con un tampón de succinato y glicina, disminuyendo el pH hasta aproximadamente 5,5 e inactivando cualquier péptido libre o péptido/engarce. El análisis de MAC-2 se realizó midiendo el peso molecular intacto (PM) del MAC usando detección por espectrometría de masas por electronebulización-tiempo de vuelo después de la separación de proteína de sales y excipientes a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño.
Temperatura El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El péptido/engarce (SEQ ID NO. 27-K1 5PEG-PFP) se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml" . El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 h a 18, 22 ó 25 °C. Los resultados se presentan en la Tabla 2.
TABLA 2 Temperatura de reacción en fosfato 0,06 M á péptido:anticuerpo 4,3:1 pH de reacción El anticuerpo 2.12.1 fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 6,5, 6,75, 7,0, 7,25, 7,5, 7,75 u 8,0 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El SEQ ID NO: 27-K11 5PEG-PFP (L2) se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. Se añadió péptido/engarce al anticuerpo 2.12. .fx a una proporción molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 3.
TABLA 3 pH en tampón fosfato sódico 0,06 M a péptido.anticuerpo 4,3:1 El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.m 1 a pH 7,0, 7,5 y 8,0 con un tampón HEPES a una concentración final de 0,02 M. La SEQ ID NO: 27-K11 5PEG-PFP se reconstituyó en DMSO a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió a anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 5: 1 y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 4. El nivel de conjugación disminuyó por encima de pH 8,0.
TABLA 4 pH en tampón HEPES 0,02 M a péptido:anticuerpo 5:1 Duración de la reacción de conjugación El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.mr1 a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El SEQ ID NO: 27/5PEG-PFP se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.m 1. El péptido/engarce se añadió a anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 30, 60, 120, 180, 240, 300 ó 2400 min a temperatura ambiente (Tabla 5).
TABLA 5 Duración de la reacción de conjugación en fosfato sódico 0,06 M a péptido:anticuerpo 4,3:1 Proporción molar de péptido respecto a proteína El anticuerpo 2.12.1 fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 7,5 con un tampón HEPES a una concentración final de HEPES 0,02 M. El SEQ ID NO: 27-K11 5PEG-PFP se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 1 , 2, 4, 4 y 5:1 (Tabla 6) y se dejó reaccionar durante al menos 2 h a temperatura ambiente, pero la alta concentración del tampón HEPES dio como resultado un nivel disminuido de conjugación.
TABLA 6 Proporción molar de péptido respecto a proteina 1 :1-5:1 en HEPES 0,2 M El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El SEQ ID NO: 27-K 1 5PEG-PFP se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 5, 7, 10, 12 y 15:1 (Tabla 7) y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente para generar un MAC con un mayor nivel de conjugación.
TABLA 7 Proporción molar de péptido respecto a proteina 7:1-15:1 en fosfato sódico 0,06 M Para optimizar adicionalmente la proporción molar de anticuerpo 2.12.1. fx y SEQ ID NO: 27-K 5PEG-PFP, el anticuerpo 2.12.1. fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El péptido/engarce se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1. fx a una proporción molar de 2,5, 2,8, 3,1 , 3,4, 3,7, 4,0, 4,3 ó 4,6: 1 (Tabla 8) y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente.
TABLA 8 Proporción molar de péptido respecto a proteína 2,5:1-4,6:1 en fosfato sódico 0,06 M El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.ml"1 a pH 7,0 con un tampón HEPES a una concentración final de 0,02 M. El CVX-4176 se reconstituyó en DMSO a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 5, 6, 7, 8, 10:1 y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 9.
TABLA 9 Proporción molar de péptido respecto a proteína 5:1 -10:1 en HEPES 0,02 M Perfil de conjugación de 2.12.1.fx a diversas concentraciones de proteina Se analizaron los perfiles de conjugación de 2.12.1.fx con SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP a diversas concentraciones. El 2.12.1 .fx se concentró a >50 mg/ml, se diluyó a la concentración deseada con acetato sódico 20 mM, trehalosa 200 m pH 5,5 y se adicionó fosfato sódico 60 mM pH 7,7. El SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP se resuspendió con propilenglicol al 50% y se mezcló con el anticuerpo a una proporción molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteina conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; se observan múltiples sitios de conjugación como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 10 muestra el perfil de conjugación de 2.12.1 fx con péptido a diversas concentraciones de anticuerpo. A concentraciones de anticuerpo de 10 mg/ml a 50 mg/ml, la conjugación se produce a una distribución de entre 0-5 adiciones con un promedio de adiciones de 1 ,8 o superior. A concentraciones de anticuerpo de 0,5 a 5 mg/ml, la conjugación se produce a una distribución de entre 0-3 adiciones con un promedio de adiciones de 1 ,5 o menos.
TABLA 10 Efecto de la concentración de anticuerpo Selección de tampón de reacción El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 7,7 con un tampón de carbonato sódico, borato sódico o fosfato sódico a una concentración final de fosfato sódico 0,05 M. El SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2. 2.1 fx a una proporción molar de 1 , 2, 3, 4 ó 5: 1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. El pH de reacción reducido dio como resultado el nivel de conjugación reducido (Tabla 11).
TABLA 11 Tampón y alteraciones de pH El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 7,5, 7,7 y 8,0 con un tampón borato sódico y fosfato sódico a una concentración final de 0,04 M. El SEQ ID NO: 27-K 1-5PEG-PFP se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1 fx a una proporción molar de 4,3:1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente (Tabla 12).
TABLA 12 Tampón y alteraciones de pH El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml" a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,04 M, 0,06 M o 0,08 M. El péptido/engarce (SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP) se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1 fx a una proporción molar de 4,3: 1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 13.
TABLA 13 Concentración de fosfato Efecto de los constituyentes del tampón sobre la conjugación Propilenglicol El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 18 mg.ml"1 a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El péptido/engarce (SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP) se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 20 mg.ml"1 (propilenglicol al 5% en la reacción de conjugación). El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 4,3:1 y se le adicionó propilenglicol del 0 al 15% adicional (porcentaje de propilenglicol final del 5, 10, 15 y 20%) y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 14.
TABLA 14 Porcentaje de propilenglicol en fosfato sódico 0,06 M Cloruro sódico El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.ml'1 a pH 7,0 con un tampón HEPES a una concentración final de 0,02 M, en presencia y ausencia de cloruro sódico 0,14 M. El CVX-4176 se reconstituyó en DMSO a 10 mg.ml" El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1 fx a una proporción molar de 5:1 y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 15. El nivel de conjugación disminuye en presencia de cloruro sódico.
TABLA 15 Concentración de cloruro sódico en HEPES 0,02 M HEPES El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 2 mg.ml"1 a pH 7,0 con un tampón HEPES a una concentración final de 0,2 y 0,02 M. El SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP se reconstituyó en propilenglicol al 50% a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1 fx a una proporción molar de 5:1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 16. El nivel de conjugación se reduce a tampón HEPES 0,2 M.
TABLA 16 Concentración de HEPES „ DMSO El anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a 15 mg.ml"1 a pH 7,7 con tampón fosfato sódico a una concentración final de 0,06 M y se añadió DMSO a una concentración final del 30%. El SEQ ID NO: 27-K 1-5PEG-PFP se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1. El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1.fx a una proporción molar de 4:1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. Los resultados se presentan en la Tabla 17.
TABLA 17 DMSO en fosfato sódico 0.06 M Discusión de los parámetros de la reacción de conjugación Cuando la proporción molar de Resto Efector (en este ejemplo, un péptido) respecto a anticuerpo se reduce por debajo de aproximadamente 3,5:1 , el nivel de conjugación se disminuye, como se observa en la Tabla 8. Como alternativa, la Tabla 9 muestra que el aumento de la proporción molar da como resultado un aumento del nivel de conjugación. El aumento del número de péptidos por anticuerpo generalmente disminuye la eficacia de unión del anticuerpo (en este caso 2.12.1 fx) respecto a su antigeno (en este caso el receptor IGF1 R), por lo tanto, la proporción molar de péptido respecto a anticuerpo se optimizó para maximizar la unión tanto de antigeno-anticuerpo como de péptido-afín.
También se descubrió que la variación del tampón de conjugación puede alterar el patrón de conjugación. Los excipientes que contienen amina son menos preferibles en general ya que pueden reaccionar con el grupo PFP. Pueden usarse tampones tales como carbonato y borato para la conjugación pero se evitaron ya que sus pKa (ácido bórico con un pKa ~9 y carbonato con dos pKa de ~6 y -1 1) estaban lejos del pH de conjugación de 7,7 que se identificó como óptimo para MAC-1 y MAC-2 (Tabla 1 1 ). El nivel de conjugación no sólo depende de las condiciones químicas de la reacción sino que también se basa en el tiempo. Después de 2 h, la mayoría del péptido activado con PFP había reaccionado con el anticuerpo o el PFP Z* se había hidrolizado (Tabla 5).
El péptido/engarce activado con PFP reaccionaba rápidamente con grupos amino de la cadena lateral de lisina. La conjugación se realizó a pH de 6,5 a 8 en tampón fosfato para aumentar la tendencia nucleófila de las lisinas de la superficie del anticuerpo disminuyendo su carga (el pKa de las lisínas en las proteínas de superficie es de aproximadamente 9,1 u 1 1 ,2) como se muestra en la Tabla 3 y 4.
Las condiciones óptimas para la conjugación de MAC-1 y MAC-2 - se describen de la forma siguiente: el anticuerpo 2.12.1.fx se ajustó a pH 7,7 con un tampón fosfato a una concentración final de fosfato sódico 0,06 M. El péptido/engarce (SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP) se reconstituyó en una solución de propilenglicol a 10 mg.ml"1 (concentración final de propilenglicol en la reacción del 10%). El péptido/engarce se añadió al anticuerpo 2.12.1 .fx a una proporción molar de 4,3: 1 y se dejó reaccionar durante 2 h a temperatura ambiente. La reacción se inactivo con un tampón de succinato y glicina disminuyendo el pH hasta aproximadamente 6,0 e inactivando cualquier péptido libre. En algunos aspectos, la reacción puede concentrarse y pueden eliminarse especies relacionadas con péptidos (tales como péptidos en los que el engarce se hidrolizó por reacción con disolvente acuoso) y otros elementos de la mezcla de reacción (tales como PFP) por diafiltración, por ejemplo, usando una membrana de 50 kDa o cromatografía de exclusión por tamaño en un tampón de succinato, glicina, cloruro sódico y trehalosa, pH 5,5 a 30 mg.ml' .
Las condiciones de conjugación enumeradas anteriormente se variaron para determinar el intervalo de cada parámetro de procedimiento. Los intervalos de parámetros se ajustaron basándose en la variabilidad que podía ocurrir durante la conjugación y/o se ampliaron hasta que se observó un cambio superior al 10% en la población de especies. La Tabla 18 resume los parámetros que dan como resultado perfiles de conjugación similares para MAC-2.
TABLA 18 Parámetros de procedimiento optimizados para MAC-2 EJEMPLO 12 Sitio de engarce en anticuerpo En general, sólo los grupos salientes Z* que comprenden ésteres fenílicos de halógeno demostraron niveles uniformes de conjugación direccional, aunque los escuaratos y ésteres de NHS mostraron cierto potencial de uso en determinadas circunstancias.
Sólo 2 de los 5 engarces propuestos (ésteres de PFP y escuaratos) tuvieron éxito en la preparación de MAC. Aunque se postula que los engarces electrófilos permitirán generalmente la conjugación de péptidos (tales como péptidos Ang2 (ABP)) con un anticuerpo (tal como el anticuerpo contra IGF1 R), los engarces de azetidinona no permitían la conjugación de péptidos con anticuerpos a velocidades aceptables (las reacciones requerían excesos significativos de engarces de azetidinona y eran extremadamente lentas). La Tabla 19 presenta algunas consideraciones de cada uno de los engarces usados para preparar MAC.
TABLA 19 Procedimientos de activación mediante ésteres de PFP y escuaratos EJEMPLO 13 Localización de péptidos conjugados en anticuerpos La molécula de producto farmacológico MAC-2 consiste en una distribución de 1-4 moléculas de SEQ ID NO: 27 unidas al anticuerpo 2.12.1.fx (a-IGFI R-1 ), usando el engarce de 5PEG-PFP como se describe en el Esquema 11. Esto se determinó midiendo el peso molecular intacto (PM) del MAC-2 usando detección por espectrometría de masas por electronebulización, tiempo de vuelo después de la separación de proteina de sales y excipientes a través de una columna de cromatografía de exclusión por tamaño. Se muestran en las figuras 3A-3H los datos de espectrometría de masas que demostraban el peso molecular intacto (PM) del anticuerpo 2.12.1. fx y 3 lotes del MAC-2. La Figura 2A muestra el 2.12.1.fx antes de la conjugación. Esta es una molécula uniforme que presenta un solo PM. Los lotes de MAC-2 presentan una distribución de péptidos conjugados con 2.12.1.fx; se observaron entre 1 -4 adiciones de conjugación (CA). La cantidad relativa de cada forma es uniforme entre lotes y la forma más común en cada lote tiene 2 péptidos (SEQ ID NO: 27) unidos a cada anticuerpo 2.12.1.fx individual.
Por reducción de los enlaces disulfuro en el anticuerpo 2.12.1 fx, se observan por separado las cadenas ligeras y pesadas. La reducción de disulfuro se realiza tratando el anticuerpo 2.12.1.fx intacto con tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) 20 mM. La mezcla resultante de cadenas pesadas y ligeras se analiza para determinar el peso molecular intacto como se ha descrito anteriormente. Los datos mostrados en las figuras 3A-3H proporcionan pruebas hacia la localización del ABP en el 2.12.1.fx. La mayoría de la cadena ligera (>65%) en los lotes de MAC-2 está conjugada. La mayoría de la cadena ligera conjugada contiene 1 CA. También se observa 2CA a un nivel menor. Casi todas las cadenas pesadas observadas (>90%) no están modificadas, lo que sugiere que muy pocos de los péptidos conjugados se localizan en la cadena pesada.
Se usó el mapeo de péptidos para determinar la localización exacta de la conjugación. El procedimiento era el siguiente: una alícuota de MAC-2 se desnaturalizó con clorhidrato de guanidina 8M, se redujeron los puentes disulfuro con TCEP y los sulfhidrilos de cisteína resultantes se alquilaron con yodoacetamida. Esta muestra de proteína tratada se digirió después con la proteasa quimotripsina (proporción de proteasa:MAC 1 : 125 en peso). Los péptidos quimotrípticos resultantes se detectaron después individualmente por espectrometría de masas después de la separación a través de una columna de cromatografía liquida C8. Con esta técnica, el MAC-2 se digirió por quimotripsina en las cadenas pesadas y ligeras en fragmentos en las localizaciones señaladas en la secuencia (con balas) en las figuras 4A-4B. La detección por cromatografía liquida-espectrometría de masas (CL-EM) del PM de cada péptido se usó después para determinar qué restos de lísina estaban modificados por un péptido conjugado. Si un fragmento estaba modificado por unión de péptido conjugado, su PM se desplazaba en consecuencia.
Los fragmentos Y1 , Y6, Y9, Y10, Y20, Y25, Y26, Y29, Y32, Y33, Y34, Y37, Y40 e Y43 de la cadena pesada contienen restos de Lys. De estos, se detectó conjugación con péptido en Y6, Y10, Y25, Y33 e Y37. Los fragmentos Y3, Y10, Y1 1 , Y12, Y13, Y14, Y15 e Y16 de la cadena ligera contienen restos de Lys. De estos, se detectó conjugación en Y3, Y13 e Y15.
Se descubrió que el fragmento de cadena ligera denominado Y15 (el 15° fragmento quimotríptico en la cadena ligera desde el extremo N-terminal) estaba conjugado basándose en los datos mostrados en las figuras 5A-5B. El PM del fragmento Y15 modificado en MAC se detectó claramente. En la muestra de 2.12.1.fx no conjugado no había pruebas de fragmento Y15 modificado. El fragmento Y15 no modificado se observó tanto en MAC como en 2.12.1.fx. La magnitud de este fragmento es superior en la muestra de 2.12.1.fx porque todo este fragmento está presente en la forma no modificada. Como este fragmento está conjugado en el MAC-2, el nivel observado de Y15 no modificado disminuye, observándose en las figuras 5A-5B como un pico con un área más pequeña.
La cantidad de conjugación de SEQ ID NO: 27-5PEG observada en el fragmento de cadena ligera Y15 en MAC-2 se estima por medición del área de pico disminuida de Y15 no modificado. Después de normalizar la intensidad de señal de modo que el 2.12.1.fx no conjugado mostrase el 100%, 3 lotes independientes de MAC-2 mostraron el 17%, 27% y 22% de fragmentos Y15 no conjugados, respectivamente.
La magnitud observada de Y15 en las muestras de MAC se normalizó respecto a la magnitud de Y15 en la muestra de 2.12.1.fx. Entre el 75-85% de los fragmentos Y15 se determinaron como modificados en el MAC-2. Considerando que el MAC-2 contiene en su mayoría 1-2 adiciones de conjugación, esto sugiere que la mayoría de la conjugación en MAC-2 se localiza en uno de los 2 restos K del fragmento de cadena ligera Y15 (K188 o K190). La localización del fragmento Y15 en relación con la secuencia de 2.12.1 fx se muestra en las figuras 4A-4B.
La digestión enzimática con tripsina se usó para discriminar entre K 88 y K 90 (la tripsina tiene especificidad por el extremo C-terminal de K y R). Como la tripsina no digiere los restos K conjugados, la digestión enzimática genera diferentes longitudes de péptidos dependiendo de qué resto K esté conjugado. El examen de los datos de CLEM de MAC-2 que se digirió con tripsina proporciona pruebas de que el péptido se une específicamente a K188. No se observaron pruebas de K190 modificado.
El MAC-2 se redujo con TCEP y se desnaturalizó con clorhidrato de guanidina como se ha descrito anteriormente. La concentración de proteína se ajustó a 2 mg/ml y el pH a 7,8 con tampón de digestión con Tris. Se añadió tripsina purificada a una proporción de proteasa:MAC de 1 :125 en peso y se incubó a 30 °C durante 4 h. Se almacenaron muestras a -20 °C hasta analizarse por CLEM. Se separaron muestras de fragmentos en una columna de fase inversa C18 usando fases móviles de agua/acetonitrilo + TFA al 0,1 %. La detección de fragmentos se controló tanto por UV a 214 nm como por espectrometría de masas IEN-TOF. Todos los análisis de datos se realizaron usando el programa informático MassLynx.
La formación de fragmentos tras la digestión con tripsina de MAC-2 depende del sitio de conjugación con péptido. Las lisinas son el resto diana para la conjugación. Los datos mostrados en las Figuras 2A-2D a 5A-5B indican que el sitio predominante de unión a péptido es K188 o K 90. El esquema a continuación muestra las reacciones de digestión con tripsina que se producen tras la conjugación en K188 o K190.
ADYEK*HK HK*VYACEVETHQGLSSPVTK Las estructuras químicas de los dos fragmentos de digestión potenciales en cuestión son las siguientes: Las figuras 6A-6B muestran los datos de cromatograma de CLEM de ión seleccionado para el péptido con tripsina cuando K 88 se conjuga con el péptido. Las figuras 7A-7B muestra los datos de cromatograma de CLEM de ión seleccionado para el fragmento de tripsina cuando K 90 está modificado con un péptido conjugado. Estos datos sugieren que sólo el K 88 en solitario está conjugado; esta situación da como resultado una señal significativa que se detecta en MAC-2 pero está ausente en el experimento de control con 2.12.1 fx. Los resultados de la modificación en K190 no proporcionan ningún dato que sea único en comparación con el control negativo.
Al contrario de lo que podía esperarse, parece que el péptido/engarce reviste preferentemente el K188 de la cadena ligera de 2.12.1.fx (K80 de SEQ ID NO: 15). Esto tiene la sorprendente ventaja de que la porción Fe del anticuerpo 2.12.1.fx no se ve afectada. Los ensayos muestran que la PK resultante de MAC-2 es aproximadamente igual a la PK del 2. 2.1.fx no conjugado. La conjugación inespecifica promiscua con múltiples sitios en un anticuerpo puede dar como resultado un producto con menor PK. La conjugación direccional de la invención, ejemplificada por MAC-1 y MAC-2, proporciona la ventaja de minimizar algunos de los posibles efectos perjudiciales que puedan causarse por una conjugación inespecifica promiscua, incluyendo una PK menor.
Para establecer la reproducibilidad del procedimiento, se repitió el experimento. El MAC-2 se diluyó a 2 mg/ml y se analizó como una proteina conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteina. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido conjugado/engarce. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Figura 8 muestra un espectro representativo de MAC-2; los cálculos usados para la cuantificación se muestran en la Tabla 20. El promedio de adiciones de conjugación para el MAC-2 intacto se calcula como de 2,11 usando la fórmula siguiente: PRODUCTO DE SUMA (Número de Adiciones de Conjugación (CA), Porcentaje por CA). Este ejemplo demuestra la conjugación de péptidos que aparecen como una distribución entre 0-4 adiciones de péptido siendo la forma mayor de 2 adiciones de péptido y el número promedio de adiciones de péptido es de 2,1 . El análisis repetido por múltiples individuos demuestra que el perfil de conjugación es uniforme y reproducible.
TABLA 20 Promedio ponderado de adiciones de conjugación: 2,11 El grado de conjugación con péptido se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas de 2.12.1.fx. El MAC-2 se desnaturalizó y los enlaces disulfuro se redujeron usando clorhidrato de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando CLEM para determinar el perfil de conjugación en cada una. Las figuras 9A-9B muestra un espectro representativo de cada cadena; el cálculo usado para la cuantificación se muestra en la Tabla 21. El promedio de adiciones de conjugación (Prom. CA) para el MAC-2 de cadena pesada reducida se calcula como de 0, 14 y el Prom. CA para el MAC-2 de cadena ligera reducida se calcula a 0,86 usando la fórmula siguiente: PRODUCTO DE SUMA (Número de Adiciones de Conjugación (CA), Porcentaje por CA). Estos datos demuestran que la localización de conjugaciones es superior en la cadena ligera; la forma más abundante en la cadena ligera contiene una adición de péptido y la cadena ligera contiene un promedio de 0,86 adiciones de péptido. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente inferior. El análisis repetido de este experimento por múltiples individuos demuestra que el perfil de conjugación es uniforme y reproducible.
TABLA 21 Caracterización del mapeo de péptidos de MAC-2 identificando la localización especifica de la conjugación El MAC-2 se redujo con ditiotreitol y los restos de cisteina se alquilaron por carboximetilación con yodoacetamida. Se usó quimotripsina para la digestión proteolítica. Los fragmentos digeridos en solución se analizaron usando cromatografía liquida-espectrometría de masas (CLEM). Se separaron los fragmentos individuales sobre una columna de HPLC C18 y su masa exacta se midió en n espectrómetro de masas Cuádruple-Tiempo de Vuelo (Q-ToF). La masa de fragmento resultante se usó para identificar fragmentos no modificados o fragmentos modificados con un péptido conjugado. Este experimento se interpretó centrándose en los fragmentos quimotripticos que contienen un resto de lisina, ya que estos eran sitios posibles para la conjugación con péptido. La Tabla 22 muestra un listado de todos los fragmentos de este tipo. Las entradas en blanco son fragmentos que no se detectaron usando esta técnica. Los fragmentos detectados que se observaron con un modificador de péptido se consideraban sitios de conjugación potenciales.
Las entradas de la Tabla 16 se explican a continuación: • Número de fragmento: Numeración del fragmento de quimotripsina desde el extremo N-terminal; los fragmentos unidos (es decir, Y1 -2) indican un sitio de escisión saltado.
• Inicio/Fin: Numeración de la localización del fragmento desde el extremo N-terminal.
• Masa de Péptido (Da): Masa teórica del fragmento enumerada en Daltons.
• Tiempo de Permanencia (Control/Analito): Tiempo de permanencia/elución cromatográfica en el experimento de mapeo de fragmentos por CLEM.
• Intensidad de Señal de EM (Control/Analito): Magnitud de la señal observada, observada por EM.
• Error de Masa-ppm (Control/Analito): Comparación de la masa teórica frente a la observada del fragmento; valores >10 y especialmente próximos a cero (0) demuestran mayor exactitud de la masa.
• Modificadores: Adiciones covalentes potenciales al fragmento; péptido-fragmento de unión de anticuerpo de resto de Lys, CAM-carboximetilación de resto de Cisteina.
• Los asteriscos indican la versión modificada (por ejemplo, conjugada) del fragmento respectivo.
• Pep indica un péptido conjugado.
La conjugación direccional de un péptido con el fragmento Y15 se demuestra cuantificando el nivel de conjugación. El análisis siguiente se realizó en cada uno de los fragmentos peptidicos que se observó que tenían una conjugación durante el experimento de mapeo de péptidos del producto de referencia 2.12.1.fx. La proporción de intensidad de señal observada para el péptido no modificado en el control no conjugado (armazón de anticuerpo 2.12.1.fx— sin conjugación) en comparación con el producto de referencia conjugado (MAC-2) se muestra en la Tabla 23. La señal no modificada se usa porque es posible una comparación directa de la misma señal de péptido en cada muestra. Por ejemplo, se esperaría que un péptido no conjugado tuviera la misma intensidad de señal observada en las muestras de control frente a producto resultantes en una proporción de uno (1 ). La conjugación daría como resultado una disminución en la cantidad observada de péptido no modificado en la muestra de producto que se indicaría por una proporción superior a uno (1). Los datos en la Tabla 23 se normalizaron además para corregir para variación de muestra y experimental entre el control y el producto. La Tabla 23 demuestra que el péptido de cadena ligera Y15 está conjugado a un nivel significativamente superior que cada uno de los otros péptidos conjugados. Esto sugiere que la conjugación se produce de una forma direccional y no se distribuye aleatoriamente por restos K.
TABLA 22 Caracterización del mapeo de péptidos de producto de referencia de cadena pesada de MAC-2 TABLA 22 (CONTINUACIÓN) Caracterización del mapeo de péptidos de producto de referencia de cadena pesada de MAC-2 TABLA 22 (CONTINUACIÓN) Caracterización del mapeo de péptidos de producto de referencia de cadena ligera de MAC-2 TABLA 23 Conjugación direccional de péptido con fragmento Y15 en la cadena ligera ELISA de Unión a Ang1-4 Se revistieron placas de semipocillos de alta unión con Ang1 humana, Ang2 humana, Ang3 de ratón o Ang4 humana recombinante (todos los reactivos de R&D Systems, 250 µg/ml) en 50 µ? de PBS y se incubaron a 4 °C durante una noche. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,1 %, PBS, pH 7,4) y se bloquearon con Superblock, 150 µ?/pócillo a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado. Después del lavado, se añadió una solución de dosificación preparada (intervalo: 0,005-50.000 ng/ml) a la placa y se incubó durante 1 h para permitir la unión de los compuestos a los miembros de la familia Ang revestidos en las placas. Los controles positivos para cada angiopoyetina incluían anticuerpos monoclonales o policlonales contra cada miembro de la familia (suministrados por R&D Systems). Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? de anti-lgG humana conjugado con HP (0,8 µg/ml) (o de las especies respectivas para los controles positivos) y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? (25 µ? TMB + 25 µ? H202) de solución de sustrato y se incubaron durante 1-5 minutos. El desarrollo de color se detuvo con 25 µ? de H2S04 2 M. Se midió la DO450 nm con una longitud de onda de corrección de 540 nm.
EJEMPLO 14 Ensayo de Competición Inverso de Anq2 Para el ELISA de competición inverso de Ang2, se usó Tie2 humano-Fc, proteina angiopoyetina-2, anticuerpo anti-Ang2 humana biotinilado y estreptavidina HP (R&D Systems) y sustrato TMB de Pierce. Se revistieron placas de semipocillos de alta unión con Tie2-Fc (50 ng/pocillo) en 50 µ? de PBS y se incubaron a 4 °C durante una noche. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,1 %, PBS, pH 7,4) y se bloquearon con Superblock, 150 µ?/pocillo a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado. Después del lavado, se añadieron 50 µ? de un compuesto de péptido de unión a Ang2 (50 nM, dilución seriada 5x) en presencia de 50 ng/ml (0,83 nM) de Ang2 en Superblock y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces, se añadieron 50 µ? de anticuerpo de detección anti-Ang2 biotinilado 1 µg/ml en Superblock y se incubaron a temperatura ambiente durante 2 h. Las placas se levaron 3 veces y se añadieron 50 µ? de estreptavidina HP (dilución 1 :200 en Superblock) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? (25 µ? TMB + 25 µ? H2O2) de solución de sustrato y se incubaron durante 20-30 minutos. Se detuvo el desarrollo de color con 25 µ? de H2S04 2 M. Se midió la DO450 nm con una longitud de onda de corrección de 540 nm. Se calcularon los valores de CI50 (inhibición del 50% de la unión de Ang2-Tie2) usando la función sigmoidal no lineal de ajuste de curva de respuesta a la dosis en el programa informático Prism 4.
El Ang2-h38C2-lgG1 se usó como control en ciertos ejemplos.
La generación y la estructura del Ang2-h38C2 se describe totalmente como compuesto 43 en el documento WO2008056346, cuyo contenido se incorpora en el presente documento, con referencia particular a los aspectos relacionados con la generación de compuesto 43. En resumen, la estructura es la siguiente: en la que el engarce se une covalentemente al grupo e-amino de K (K de acuerdo con la numeración de Kabat) del sitio de combinación de Anticuerpo y el Anticuerpo es h38C2-lgG1 (SEQ ID NO: 51 y 52) (SEQ ID NO: 189 y SEQ ID NO: 190 del documento WO2008/056346).
EJEMPLO 15 Ensayo de Competición de IGF1R Para el ELISA de competición de IGF1 R, se usó IFG1 R humano recombinante (R&D Systems), IGF1 biotinilado (GroPep Ltd.), estreptavidina-poli-HP20 (SDT), Superblock y sustrato TMB (Pierce). Se revistieron placas de semipocillos de alta unión con IGF1 R (62,5 ng/pocillo) en 50 µ? de PBS y se incubaron a 4 °C durante una noche. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,1 %, PBS, pH 7,4) y se bloquearon con Superblock, 150 µ?/pocillo a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado. Después del lavado, se añadieron 50 µ? de un compuesto de unión a IGF1 R (1 µ?, dilución seriada 5x) en presencia de 100 ng/ml (13,3 nM) de IGF1 biotinilado en Superblock y se incubaron a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? de estreptavidina-poli-HP 20 (dilución 1 :5000 en Superblock) a temperatura ambiente durante 20 minutos. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? (25 µ? TMB + 25 µ? H2O2) de solución de sustrato y se incubaron durante 5-10 minutos. El desarrollo de color se detuvo con 25 µ? de H2S04 2 M. Se midió la DO450 nm con una longitud de onda de corrección de 540 nm. Se calcularon los valores de Cl50 (inhibición del 50% de la unión de IGF1 a IGF1 R) usando una función sigmoidal no lineal de ajuste de curva de respuesta a la dosis en el programa informático Prism 4.
EJEMPLO 16 Ensayo de Inhibición de la Autofosforilación de IGF1 R Inducida por IGF1 Para el ensayo de inhibición de la autofosforilación de IGF1 R, se usaron células 3T3 de ratón modificadas por ingeniería genética para expresar IGF1 R humano y la fosforilación se determinó mediante un kit de ELISA de tipo sándwich de fosfo-receptor de IGF1 ß (Tyr1 131 ) N° 7302 de Cell Signaling Technologies. Se sembraron células intactas que expresaban IGF1 R humano (5,0 x 104 células/pocilio) en una placa de fondo redondo tratada con cultivo tisular de 96 pocilios, y se dejó que se unieran durante una noche en 50 µ? de medio de cultivo (37 °C, C02 al 5%, medio de cultivo que consistía en DMEM con FBS al 10%, L-Glutamina 2 mM, Penicilina-Estreptomicina y Geneticina 500 µ?/???). Después de 16 horas, el medio de cultivo se eliminó por aspiración y se añadieron 50 µ? por pocilio de nuevo medio de cultivo que contenia un compuesto de unión a IGF1 R (1 mM, dilución seriada 8x) en presencia de 100 ng/ml (13,3 nM) de IGF1 humano recombinante, y se incubó durante 10 minutos a temperatura ambiente. La placa se lavó mediante eliminación por aspiración del líquido y se añadieron 100 µ? por pocilio de PBS helado. El PBS frío se eliminó inmediatamente por aspiración y se añadieron 60 µ? de tampón de lisis (comenzando con el tampón de lisis, todos los reactivos siguientes se suministraron como parte de un kit comercial fabricado por Cell Signaling Technologies, diseñado para cuantificar la fosforilación de IGF1 R en la tirosina 1 131 ) a cada pocilio y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación. Después, las placas se centrifugaron a 4 °C durante 5 minutos. Después se retiró el sobrenadante (50 µ? por pocilio) y se añadió a una placa de 96 pocilios previamente revestida con un anticuerpo de conejo contra Fosfo-Receptor de IGF1 beta (Tyr1 31) y que contenía 50 µ? por pocilio de un diluyente de muestra. Las placas se incubaron durante una noche durante 16 h a 4 °C con agitación suave. Después de la incubación, las placas se lavaron 4 veces con tampón de lavado y se añadieron 100 µ? de un anticuerpo de detección de receptor de IGF1 humano (de origen murino) a cada pocilio durante 1 h a 37 °C. Las placas se lavaron 4 veces con tampón de lavado y se añadieron 100 µ? de un anticuerpo secundario contra IgG de ratón unido a HP a cada pocilio durante 30 minutos a 37 °C. Las placas se lavaron 4 veces y se añadieron 100 µ? de sustrato TMB a cada pocilio y se incubaron durante 30 minutos. El desarrollo de color se detuvo con 50 µ? de H2S04 2 M. Se midió la DO450 nm con una longitud de onda de corrección de 540 nm. Los controles internos con y sin tratamiento con IGF1 confirmaron la especificidad del acontecimiento de fosforilación y determinaron el % de inhibición de la señalización transmembrana. Se calcularon los valores de CE50 (concentración a la que se consiguió la señal semimáxima) usando una función sigmoidal no lineal de ajuste de curva de respuesta a la dosis en el programa informático Prism 4.
EJEMPLO 17 Ensayo de Regulación Negativa de IGF1 R Para la regulación negativa de IGF1 R, se usaron células de adenocarcinoma de colon humano Colo205 y se determinó la expresión en superficie celular de IGF1 R por citometría de flujo. Se trataron placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios sembradas con 5 x 104 células/pocilio en medio de cultivo (RPMI, suero bovino fetal al 10%, glutamina) con una valoración de compuesto durante 3 h a 37 °C. Las células se aclararon con PBS, se levantaron con un CellStripper y se transfirieron a placas de 96 pocilios recién preparadas. Las células se lavaron 3 veces con PBS con suero bovino fetal al 2,5%. Las células se incubaron con un monoclonal de ratón anti-IGFIR humano conjugado con ficoeritrina (R&D FAB391 P, 10 µ?/5 x 10"5 células) en la oscuridad durante una hora. Después, las células se lavaron 3 veces con PBS con suero bovino fetal al 2,5%. La presencia de IFG1 R en la superficie celular se determinó mediante citometría de flujo usando un FACSArray y los datos se analizaron con el programa informático FloJo. El número de receptores se calculó por ajuste de los datos a curvas patrón generadas usando perlas de PE QuantiBRITE (BD 340495). Los datos se describieron como el porcentaje de regulación negativa por compuesto de ensayo frente al control negativo hlgG2.
Resultados y Discusión La capacidad de MAC-2 para unirse a Ang2 humana específicamente se muestra en la Figura 10. El MAC-2 y el Ang2-h38c2 eran capaces de unirse a la Ang2 humana pero no a Ang1 humana, Ang4 humana o Ang3 de ratón, mostrando alta especificidad por Ang2 y no por otros miembros de la familia de la angiopoyetina.
MAC-1 y MAC-2 eran capaces de unirse a Ang2 y evitar su unión a Tie2, como se muestra en el ensayo de competición de Ang2 (Figura 11 y Tabla 24). Sorprendentemente, en comparación con Ang2-h38c2, el MAC-1 y el MAC-2 mostraban ambos un aumento en la capacidad para unirse competitivamente a Ang2. Después de confirmar que los MAC conjugados se unían a e inhibían la unión de Ang2 a Tie2, la capacidad para competir por la unión de IGF1 a ÍGF1 R se determinó por ensayo de competición de IGF1 R (Figura 12). El MAC-1 y el MAC-2 eran tan eficaces como el anticuerpo anti-IGF1 R parental (2.12.1.fx) para competir con IGF1 por la unión a IGF1 R. MAC-1 y MAC-2 mostraban valores de Cl50 en el intervalo nanomolar bajo. Por el contrario, en ensayos con ciertos otros anticuerpos anti-IGF1 R, se observó que la conjugación del péptido interfería con la capacidad del anticuerpo para interaccionar con IGF1 R (no se muestran los datos).
Para confirmar que la inhibición de IGF observada en el ensayo de competición se traduce en la inhibición de los acontecimientos de señalización inducidos por IGF, se usó un ensayo funcional basado en células para determinar la inhibición de la autofosforilación de IGF1 R después de la estimulación con IGF (Figura 13 y Tabla 24). MAC-1 y MAC-2 tienen una actividad similar a la del anticuerpo anti-IGF1 R precursor (2.12.2.fx)¡ por lo tanto, la conjugación de péptidos Ang2 limitados no parece cambiar la unión e inhibición innatas de MAC.
Además de inhibir la autofosforilación de IGF1 R, el anticuerpo anti-IGF1 R también causa la internalización y la degradación de IGF1 R, dando como resultado la regulación negativa del receptor. Este comportamiento se observa en las 2 horas siguientes al tratamiento y se mantiene durante 24 h. Los MAC se ensayaron para determinar la capacidad para regular negativamente los niveles de IGF1 R en una línea celular de carcinoma de colon humano Colo205. Las células se trataron durante 3 h en cultivo con valoración de compuestos MAC. Las células se recogieron y se determinó la expresión en superficie de IGF1 R por citometría de flujo. Se determinó el porcentaje de IGF1 R regulado negativamente en comparación con el control negativo hlgG2 (Tabla 24). MAC-1 y MAC-2 tienen una actividad de regulación negativa de IGF1 R similar al anticuerpo contra IGF1 R precursor (2.12.1.fx).
TABLA 24 Capacidad de MAC-1 y MAC-2 para unirse a y modular IGF1 R y Ang2 Se demostró que la conjugación de 2 péptidos por anticuerpo era ideal en términos de lograr la autofosforilación y la regulación negativa de IGF1 R, y que la conjugación de más o menos que 2 péptidos por anticuerpo disminuye la capacidad del MAC para ejercer estas funciones.
Para evaluar el efector del número de efectos por anticuerpo sobre la capacidad de 2.12. fx para modular la actividad de IGF1 R, se prepararon 2 muestras de MAC-1 en las que las condiciones de reacción se ajustaron para proporcionar una conjugación reducida (MAC-1 reducido) o una conjugación aumentada (MAC-1 elevado) (Tabla 25). Las muestras se analizaron para determinar la capacidad para regular negativamente y fosforilar IGF1 R (Tabla 25). Existe una diferencia significativa en la capacidad del MAC-1 elevado en comparación con el MAC-1 reducido para modular eficazmente la ruta de IGF1 R. La conjugación de más de aproximadamente 2 péptidos por anticuerpo limita la actividad funcional del MAC tanto para inhibir la autofosforilación de IGF1 R como para inducir la regulación negativa de IGF1 R, en comparación con la conjugación de aproximadamente 2 o menos péptidos por anticuerpo. Por lo tanto, para modular eficazmente 2 rutas biológicas diferentes en una entidad bifuncional, la conjugación de aproximadamente 2 péptidos por anticuerpo puede ser ideal (dependiendo del perfil farmacocinético del péptido y de la diana).
TABLA 25 Análisis de MAC-1 Elevado y MAC-1 Reducido EJEMPLO 18 Farmacocinética in vivo Protocolo Se usó un procedimiento de ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) de unión directa validado para medir los niveles séricos de MAC en suero de ratón y mono. En resumen, el MAC en la muestra se une a IGF1 R o Ang2 que se ha absorbido pasivamente sobre una placa de microtitulación, y se usa un anti-lgG humana conjugado con peroxidasa de rábano picante junto con un sustrato cromogénico para generar una señal que sea proporcional a la concentración de MAC-2 en la muestra de suero. Los limites de cuantificación superior e inferior de MAC-2 en suero de ratón son de 26,0 y 1000 ng/ml, y de 52,0 y 2000 ng/ml en suero de mono cynomolgus.
ELISA Inverso de Ang2 e IGF1 R Se revistieron placas de semipocillos de alta unión con IGF1 R (62,5 ng/pocillo) o Ang2 (6,25 ng/ml) en 50 µ? de PBS y se incubaron a 4 °C durante una noche. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado (Tween 20 al 0,1 %, PBS, pH 7,4) y se bloquearon con Superblock, 150 µ?/pocillo a temperatura ambiente durante 1 h. Las placas se lavaron 3 veces con tampón de lavado. Después de lavar, se añadieron patrones de solución de dosificación preparados (intervalo: 3,91-500 ng/ml) y muestras de suero a la placa y se incubaron durante una hora para permitir la unión de los complejos de MAC al Ang2 o IGF1 R revestido en las placas. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? de un anti-lgG humana de cabra conjugado con HP (0,8 µ????) y se incubaron a temperatura ambiente durante una hora. Las placas se lavaron 3 veces y se añadieron 50 µ? (25 µ? TMB + 25 µ? H2O2) de solución de sustrato y se incubaron durante 1 -5 minutos. Se detuvo el desarrollo de color con 25 µ? de H2S04 2 M. Se midió la DO450 nm con una longitud de onda de corrección de 540 nm. Se calcularon las concentraciones en suero de los complejos de MAC usando las curvas patrón.
Las concentraciones de complejo de MAC, según se determinaron por ELISA, estaban representadas en función del tiempo. Se emprendieron análisis de datos adicionales usando WinNonlin versión 4.1 (Pharsight Corporation) para determinar la semivida ß (T1/2) y el área bajo la curva (AUC) para los complejos de MAC.
Ratón Se realizaron estudios de PK usando ratones Swiss Webster macho (CFW, Charles River, Hollister, CA) que pesaban aproximadamente 20-22 gramos al inicio de la dosificación. Los compuestos de MAC se administraron por vía intravenosa. Se tomaron muestras de sangre de 4 ratones por punto temporal a los siguientes puntos temporales: 0,08, 0,5, 1 , 3, 5, 7 y 24 h. Se añadió cóctel inhibidor de proteasas a todos los tubos de sangre antes de la recogida de muestras. Se dejó que la sangre coagulara en hielo durante 30 minutos y después se centrifugó a 12000 rpm durante 5-10 minutos a 4 °C para recoger el suero y se almacenó inmediatamente a -80 °C hasta su análisis por ELISA. Se usaron soluciones de dosificación para establecer las curvas patrón para el análisis de muestras de suero por ELISA inverso de Ang2 o IGF R. Se analizaron alícuotas de cada muestra de suero por ELISA inverso de Ang2 o de IGF1 R.
Mono Se determinó el perfil farmacocinético de MAC-2. Se usaron 2 monos Cynomolgus macho (Macaca fascicularís) en el estudio, se administró MAC-2 mediante una inyección intravenosa (en embolada) a un nivel de dosis de 10 mg/kg. Todos los animales se observaron a 5 min, 15 min, 1 h, 4 h y 8 h post-dosis el Día 1 y dos veces al día después de eso para cualquier reacción al tratamiento. Los pesos corporales se midieron y se registraron los Días 1 , 2, 3, 4, 5, 7 y 14. Se obtuvieron muestras de sangre para análisis toxicocinético a los puntos temporales designados y el suero se separó y se almacenó a -80 °C.
No se observaron signos clínicos adversos durante el estudio que pudieran estar relacionados con el tratamiento con MAC-2. Los perfiles de peso corporal eran satisfactorios. Se recogieron muestras de sangre de aproximadamente 1 ,0 mi de la vena femoral de cada animal y en tubos de coagulación lisos a los puntos temporales (0,08-504 h). Las muestras de sangre se dejaron reposar durante una hora a temperatura ambiente después de la recogida y después se centrifugaron a 3000 rpm durante 10 minutos a 4 °C. Las muestras de suero resultantes se almacenaron a aproximadamente -80 °C antes del análisis.
Resultados Se realizaron estudios farmacocinéticos (PK) no GLP exploratorios en ratones Swiss Webster macho y monos cynomolgus macho (Tabla 26 y 27). Se analizaron las actividades de unión tanto a Ang2 como a IGF1R del MAC. En ratones, MAC-1 y MAC-2 demostraron un tiempo de permanencia similar al del anticuerpo anti-IGF1 R precursor con semividas de fase beta de 383-397 h. La capacidad de unión a Ang 2 de MAC-1 y MAC-2 demostró un tiempo de permanencia similar a Ang2-h38c2 con semividas de fase beta de 105-120 h en ratón en estudios IV de dosis única. En mono cynomolgus, el MAC-2 demostró un tiempo de permanencia ligeramente más corto que el anticuerpo anti-IGF1 R precursor, con semividas de fase beta de 100,4 h. La capacidad de unión a Ang2 de MAC-2 demostró un tiempo de permanencia similar a Ang2-h38c2 con semividas de fase beta de 97,8 h.
TABLA 26 PK de dosis única de MAC administrados IV a 10 mg/mk en ratón TABLA 27 PK de dosis única de MAC administrados IV a 10 mg/mk en mono cynomolgus EJEMPLO 19 Farmacología in vivo Protocolo La actividad antitumoral de MAC-2 se evaluó en el modelo de xenoinjerto de Colo205 (adenocarcinoma de colon humano) o MDA-MB-435 (melanoma). Se cultivaron células Colo205 o MDA-MB-435 con medio RPMI con FBS al 10% y se inyectaron 3 x 106 células en 0,1 mi de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) por vía subcutánea en el flanco derecho superior de ratones nu/nu hembra de 5-7 semanas de edad, y se dejó que se establecieran hasta un volumen de 200-400 mrh3 antes del inicio del tratamiento. Una vez que se establecieron los tumores, los ratones se aleatorizaron a grupos de tratamiento con volúmenes tumorales idénticos (n = 9-10/grupo) y el tratamiento con MAC-2 se administró una vez por semana por inyección intraperitoneal (IP). En estudios de combinación, se administraron agentes anticancerosos adicionales semanalmente por inyección IP, iniciándose los tratamientos concomitantes con el MAC-2. Se midieron los volúmenes tumorales una vez o dos veces por semana usando calibradores, y se midieron los pesos corporales semanalmente durante el periodo de tratamiento. En algunos estudios, todos los ratones se eutanasiaron por asfixia con C02 y los tumores se escindieron, se pesaron y se procesaron para evaluación histológica y/o inmunoquímica adicional una vez que el volumen tumoral en el grupo de control tratado con vehículo alcanzó los 2000 mm3. En estudios de pseudo-supervivencia, los ratones se eutanasiaron por asfixia con C02 y los tumores se escindieron y se pesaron una vez que el volumen tumoral medio de cada grupo de tratamiento superó los 2000 mm3.
Resultados Un experimento realizado en el modelo de xenoinjerto de Colo205 (adenocarcinoma de colon humano) se ilustra en las Figuras 12 y 13. La administración semanal de Ang2-h38c2 o anticuerpo anti-IGF1 R (2.12.1.fx) inhibía el crecimiento del tumor Colo205. La combinación de Ang2-h38c2 y anticuerpo anti-IGF1 R administrada semanalmente mostró un beneficio aditivo sobre la inhibición del crecimiento del tumor Colo205. La administración semanal de MAC-2 en solitario mostró un beneficio similar al de la combinación (Figura 14A). En un estudio separado, el MAC-2 inhibía de forma dependiente de la dosis el crecimiento del tumor Colo205 y los pesos tumorales finales (Figura 15A, 15B).
Al día 28, los ratones tratados con compuesto se sacrificaron y los tumores se escindieron y se congelaron inmediatamente. Para evaluar el efecto antiangiogénico de MAC-2, se evaluó la densidad de microvasos tumorales inmunohistoquimicamente en secciones congeladas de tumores de xenoinjerto de adenocarcinoma de colon Colo205 tratados con Vehículo (PBS) o MAC-2 (respuesta a la dosis que varía de 0,3 mg/kg a 10 mg/kg). Los tumores se tiñeron con un anticuerpo monoclonal especifico de ratón contra CD31 y se cuantificó la inmunorreactividad a partir de 5 áreas de 3 secciones de cada tumor (Figura 13). La densidad de microvasos tumorales se redujo significativamente -42% por MAC-2 (10 mg/kg, una vez por semana) en comparación con el grupo tratado con vehículo, confirmando la actividad antíangiogénica del tratamiento con MAC-2.
Para investigar si el MAC-2 se dirige tanto a Ang2 como a IGF1 R in vivo, los efectos del MAC-2 sobre los niveles de expresión de Ang2 e IGF1R se evaluaron en 2 tumores de xenoinjerto Colo205 independientes tratados con Vehículo, Ang2-h38c2, anticuerpo contra IGF1 R (2.12.1.fx) o MAC-2 (respuesta a la dosis que varia de 0,3 mg/kg a 10 mg/kg). Se prepararon lisados a partir de tumores escindidos congelados y se cuantificó la inmunorreactividad contra Ang2 e IGF1 R por ELISA. La inmunorreactividad contra Ang2 e IGF1 R se redujo significativamente por tratamiento con MAC-2 de una forma dependiente de la dosis (1 , 3 y 10 mg/kg) en comparación con el grupo tratado con Vehículo (Figura 14B, 15D y 15E). El efecto de MAC-2 sobre los niveles de IGF1 R es similar al observado para un anticuerpo antagonizante de IGF1 R (2.12.1 fx) (Figura 14B). Además, los niveles de IGF1 R fosforilado se redujeron en tumores de animales tratados con MAC-2 (no se muestran los datos). La inmunofluorescencia en secciones fijadas de estos tumores también confirmó la reducción en IGF1 R y pIGFI R (no se muestran los datos). Estos datos demuestran que el tratamiento con MAC-2 afecta a las rutas tanto de Ang2 como de IGF1 R en el modelo de xenoinjerto Colo205.
En 3 estudios separados, el tratamiento con MAC-2 condujo a una inhibición tumoral sostenida en comparación con el vehículo (PBS), Ang2-h38c2 y anticuerpos contra IGF1 R (2.12.1.fx y 2.13.2) (Figura 16A, 16B, 16C). El anticuerpo anti-IGF1 R 2.13.1 se describe como las SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 47 en el documento WO02/053596, menos las secuencias señal respectivas. La inhibición tumoral por MAC-2 era similar a la combinación de Ang2-h38c2 y 2.12.1.fx y más activo que Ang2-h38c2 y 2.13.2 (Figura 16C). El tratamiento con MAC-2 no afectó al aumento de peso corporal (no se muestran los datos) y los ratones parecían estar en buen estado de salud durante todo el estudio. Se dejó que los tumores en cada grupo de animales progresaran hasta 2000 mm3 como un estudio de pseudo-supervivencia. Los grupos tratados tanto con Ang2-h38c2 como con anticuerpo anti-IGF1 R tuvieron que interrumpirse a día 48; sin embargo, los tumores tratados con MAC-2 (3-10 mpk) estaban todavía por debajo de 2000 mm3 a día 94 cuando el estudio sé paró La eficacia antitumoral de MAC-2 también se evaluó en un modelo de xenoinjerto de melanoma MDA-MB-435. La administración semanal de MAC-2 (3 y 20 mg/kg IP) dio como resultado una reducción significativa del 40% (día 67) en el crecimiento tumoral en el modelo de MDA-MB-435 (Figura 17). Por lo tanto, el MAC-2 demuestra una eficacia antitumoral significativa en 2 modelos de tumores de xenoinjerto humano diferentes.
EJEMPLO 20 Perfil de conjugación con péptido de diversos anticuerpos Los perfiles de conjugación de varios anticuerpos diferentes con péptidos se analizaron usando la SEQ ID NO: 27 y 5PEG como péptido y engarce ejemplares, respectivamente. Todos los anticuerpos ensayados eran anticuerpos IgG humanos o totalmente humanizados con interacciones con antígenos bien definidas y caracterizadas. El hAbXTest comprende una CL , mientras que 2.12.1.fx, mAb Testl , h28C2-lgG1 (SEQ ID NO: 51 y 52) y h38C2-lgG2 (SEQ ID NO: 53 y 54) comprenden cada uno CLK. Cada uno de los anticuerpos se cambió de tampón a HEPES 20 mM, pH 7,0 y se concentró hasta 5-20 mg/ml. El SEQ ID NO: 27/K11-5PEG-PFP se resuspendió con propilenglicol al 50 % y se mezcló con el anticuerpo pertinente a una proporción molar de 4,3:1 , y se dejó reaccionar durante al menos 2 h a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron hasta 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación con péptido se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido unido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación con péptidos se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 22 muestra el perfil de conjugación con péptido de diversos anticuerpos.
Para anticuerpos que contienen una CLK, la conjugación con péptido se produce una distribución de entre 0-4 adiciones de péptido siendo la forma mayor de 2 a 3 adiciones de péptido. Por el contrario, para el anticuerpo que comprende CL , hAb lesi, la conjugación del péptido se produce a una distribución de entre 0-4 adiciones de péptidos, siendo la forma mayor de 1 a 2 adiciones de péptido.
El grado de conjugación con péptido se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas. Cada muestra se desnaturalizó y se redujeron los enlaces disulfuro usando clorhidrato de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando CLEM para determinar el perfil de conjugación en cada una. El perfil de conjugación con péptido en la cadena ligera y pesada de diversos anticuerpos se muestra en la Tabla 28. En 2.12.1 fx y hAbicTestl , los datos demuestran que la localización de conjugaciones es mayor en la cadena ligera; la forma más abundante en la cadena ligera contiene una ( 1 ) adición de péptido. La conjugación en la cadena pesada se observa a un nivel significativamente inferior. En h38C2-lgG1 y h38C2-lgG2, se observan niveles de conjugación comparables en la cadena ligera y pesada, con una ligera preferencia de conjugación en la cadena ligera. En un anticuerpo que contiene CLX (hAb Test), la mayoría de la conjugación se produce en la cadena pesada, observándose un nivel reducido de conjugación en la cadena ligera.
TABLA 28 Perfil de conjugación de diversos anticuerpos Cada uno de los anticuerpos 2.12.1.fx, hAb Test y hAbicTestl se evaluaron después de procedimiento de conjugación para determinar el efecto de las adiciones de conjugación sobre la capacidad del armazón de anticuerpo para retener su unión a receptor (en comparación con el AcM nativo) (Tabla 29). Los resultados muestran que la conjugación direccional de péptidos con los anticuerpos de ensayo no parecía alterar la unión del anticuerpo.
TABLA 29 Unión de anticuerpo antiqeno nativo antes y después de la conjugación EJEMPLO 21 Perfil de conjugación con péptido de un anticuerpo representativo de lgG2-K Se analizó el perfil de conjugación de un anticuerpo lgG2x (hAB Test2) con un péptido de 39 unidades. El anticuerpo se concentró hasta 8 mg/ml y se cambió de tampón a HEPES 40 mM, pH 8,0. El péptido se resuspendió con DMSO al 100 % y se mezcló con el anticuerpo a una proporción molar de 5,0: 1 y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron hasta 2 mg/ml y se analizaron como una proteina conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación con péptido se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación con péptidos se realiza por medición de la magnitud de la señal. La Tabla 30 muestra el perfil de conjugación con péptido de hAbi Test2 con el péptido de 39 unidades. La conjugación de péptido se produce a una distribución de entre 0-4 adiciones de péptido con un promedio de 2,03 adiciones de péptido, y concuerda con la conjugación direccional en el CLK-K188.
TABLA 30 Perfil de conjugación de péptido de 39 unidades y hAbicTest2 En un experimento separado, el péptido de 39 unidades se conjugó con h38C2-lgG2 con MAL-2PEG-PFP como se ha descrito anteriormente, a diferentes concentraciones molares. Además, se ensayó la unión del receptor afín al péptido de 39 unidades. Los resultados (Tabla 31 ) mostrados concuerdan con la conjugación direccional en K188-CLK. Además, el aumento del número promedio de péptidos por anticuerpo no aumentó sustancialmente la unión global a la diana. Esto demuestra que, en ciertos escenarios, el aumento de la conjugación por anticuerpo puede no aumentar la unión a diana, demostrando una de las ventajas de la invención; el control del número de péptidos que se conjugan por anticuerpo puede ayudar a conseguir la unión a diana máxima por péptido unitario.
TABLA 31 Perfil de conjugación de péptido de 39 unidades y H38C2-lgG2 EJEMPLO 22 Conjugación de biotina con 2.12.1.fx Fab Biotina-2.12.1.fx Se analizó el perfil de conjugación de la región Fab del 2.12.1.fx (SEQ ID NO: 50 y 4) con PFP-Biotina. El anticuerpo Fab se concentró hasta 20 mg/ml y se cambió de tampón a acetato sódico 20 mM + trehalosa 200 mM, pH 5,5 y se le adicionó fosfato sódico 60 mM pH 7,7. El PFP-Biotina se resuspendió con DMSO al 100% y se mezcló con el anticuerpo a proporciones molares sucesivas, y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron hasta 2 mg/ml y se analizaron como una proteina conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido conjugado. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza por medición de la magnitud de la señal. La Tabla 32 muestra el perfil de conjugación del 2.12.1.fx Fab con PFP-Biotina a proporciones molares. La conjugación se produce a una distribución de entre 0-2 adiciones a medida que aumenta la proporción molar. El menor número de moléculas por anticuerpo concordaba con los resultados anteriores, basándose en la proporción molar usada. Esta es una demostración útil de la flexibilidad del procedimiento para controlar la cantidad de conjugación alterando uno o más de los parámetros de reacción.
Biotina-PFP TABLA 32 Perfil de conjugación de biotina con 2.12.1.fx Fab EJEMPLO 23 Conjugación de biotina con h38C2-lqG1 Biotina-h38C2-lqG1 El anticuerpo h38C2-lgG1 se ajustó a 20 mg/ml con tampón HEPES pH 7,5 a una concentración final de 0,02 M. Se reconstituyó biotina-PFP en agua a 10 mg/ml y se añadió a h38C2-lgG1 a una proporción molar de 5: 1 y se dejó reaccionar a temperatura ambiente durante 2 h. El PFP-biotina sin reaccionar se eliminó por cromatografía de exclusión por tamaño y se cambió el tampón a un tampón de histidina, glicina y sacarosa pH 6,5. Las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteina conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteina. La Tabla 33 muestra el perfil de conjugación de h38C2-lgG1 con Biotina-PFP. La conjugación de h38C2-lgG1 se produce a una distribución de entre 0-3 CA con un promedio de 1 ,1 conjugaciones. Una conjugación aumentada sería posible después de la optimización de las condiciones de reacción. Se confirmó que la reactividad de VH-K99 (K93 de acuerdo con la numeración de Kabat) en h38C2-lgG1 era >95% cuando reaccionaba con el compuesto de ensayo de anticuerpo catalítico CATC-1 , y se analizó mediante cromatografía de fase inversa.
TABLA 33 Conjugación de biotina y h38C2-lgG1 EJEMPLO 24 Perfil de conjugación de 2.12.1.fx y mutantes K188, K Basándose en el mapeo de péptidos, hay 2 Lys en el fragmento Y15. Para distinguir el sitio de conjugación activo, K188 y K190 se mutaron a R, respectivamente o en combinación. Los mutantes se generaron siguiendo los protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida QuickChange (Stratagene). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron por secuenciación de ADN. Los AcM mutados se expresaron de forma transitoria en células HEK 293 y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los AcM purificados se caracterizaron usando EM. Las SEQ ID NO: 33, 34 y 35 muestran las secuencias de cadena ligera mutantes de 2.12.1.fx IGF1 r.
El anticuerpo se cambió de tampón a tampón HEPES 0,02 M pH 7,5 o 6,5 a 2 mg/ml. Si el pH era de 6,5, al anticuerpo se le adicionó después fosfato sódico 60 mM. Después, a las proteínas se les adicionó fosfato sódico 60 mM pH 7,7. Se resuspendió SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP con propilenglicol al 50% y se mezcló con la proteína a una proporción molar de 4,3:1 , y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una próteína conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteina. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de una proteina conjugada. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación con proteínas se realiza midiendo la magnitud de la señal. La Tabla 34 muestra el perfil de conjugación de 2.12.1. fx, 2.12.1.fx-K188R (LC: SEQ ID NO: 33), 2.12.1.fx-K 90R (LC: SEQ ID NO: 34) y 2.12.1.fx-K188R-K190R (LC: SEQ ID NO: 35). El mutante K188R mostraba una conjugación reducida. El K190R tenia una conjugación similar al 2.12.1.fx no conjugado. La conjugación de MAC-2 era inferior a la observada en otros ensayos debido al uso de un tampón de HEPES/fosfato de aproximadamente pH 6,5.
TABLA 34 Perfil de conjugación de 2.12.1.fx, mutantes K188 y R1 EJEMPLO 25 Mutantes de 2.12.1.fx para elucidar el mecanismo de conjugación direccional en K 88 Se examinaron los restos próximos a K188. La cadena lateral H189 está muy próxima al grupo e-amino de K188. Puesto que la His está implicada con frecuencia en reacciones de transferencia de protones, es muy probable que la H189 sea necesaria para la conjugación de K188. Para estudiar el papel de H189 en la conjugación específica de sitio K188, se eliminó el anillo de imidazol por sustitución de histidina con alanina.
Se generaron mutantes D151A y D151A/H189A para estudiar el papel de D151 en la conjugación especifica de sitio y el efecto combinado de D151 y H189 Los mutantes se generaron siguiendo protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida QuickChange (Stratagene). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron por secuenciación de ADN. Los AcM mutados se expresaron de forma transitoria en células HEK 293 y se purificaron usando una columna de afinidad de proteína A. Los AcM purificados se caracterizaron usando EM. Se generaron los siguientes mutantes de cadena ligera de 2.12.1.fx: D 5 A (SEQ ID NO: 36), K 88A (SEQ ID NO: 37), H189A (SEQ ID NO: 38), K190A (SEQ ID NO: 39) y D151A/H 89A (SEQ ID NO: 40).
Cada uno de los anticuerpos se cambio de tampón a acetato sódico 20 mM, trehalosa 200 m, pH 5,5 a 20 mg/ml. Después, a las proteínas se les adicionó fosfato sódico 60 mM pH 7,7. La SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP se resuspendió con propilenglicol al 50% y se mezcló con el anticuerpo a una proporción molar de 4,3:1 , y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteina conjugada intacta por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantificación de formas de conjugado de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido conjugado. La cuantificación relativa de múltiples especies de conjugación se realiza midiendo la magnitud de la señal.
La Tabla 35 muestra el perfil de conjugación de mutantes 2.12.1 -fx, 2.12.1.fx-D15 A, 2.12.1.fx-K188A, 2.12.1. fx-H1MA , 2.12.1 fx-K190A y 2.12.1.fx-D151A/H 89A. Todos los mutantes mostraban un nivel de conjugación promedio reducido en comparación con el anticuerpo 2.12.1 .fx no modificado, excepto por K190A, que mantenía una conjugación direccional.
El grado de conjugación se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas. Cada muestra se desnaturalizó y se redujeron los enlaces disulfuro usando clorhidrato de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando CLEM para determinar el perfil de conjugación en cada una. El perfil de conjugación en la cadena ligera y pesada de 2.12.1.fx y mutantes se muestra en la Tabla 35.
Todos los mutantes enumerados en la tabla mostraban un nivel de conjugación reducida en la cadena ligera en comparación con el 2.12. .fx no modificado, excepto K190A. El nivel de conjugación de la cadena pesada de los mutantes era a un nivel similar al 2.12.1 .fx no modificado.
TABLA 35 Perfil de conjugación de MAC-2 y mutantes K 88A, D15 y H1 EJEMPLO 26 Sustitución de lambda/kappa La LC en hAb Testl se sustituyó con LCK para determinar si esto aumentaba el nivel, la direccionalidad y/o el control de la derivatización de LC . Las construcciones híbridas de sustitución de dominio LC /LCKQ se generaron usando PCR solapante. La LV y LCK se amplificaron por PC R usando ^??ße? y una cadena ligera de AcM kappa como moldes por separado. Estos 2 productos de PCR se mezclaron como moldes; se usó cebador directo de hAt^Testl y cebador inverso de LCK Den la reacción de PC R solapante para amplificar el ADN de LV/CLK de hAb Test de longitud completa. Las construcciones de anticuerpo híbridas se expresaron de forma transitoria en células HEK 293 y se purificaron usando una columna de afinidad de proteina A. Los anticuerpos purificados se caracterizaron usando EM. El híbrido de LCK de hAb Test Dse unía a su receptor afín de forma similar al AcM nativo (hV Test) (Tabla 36). Las SEQ ID NO: 41 , 42 y 43 son las regiones constantes de cadena ligera de hAb Test, hAbXTest K (con ??) y hAb Test^KÜ (con KJ).
TABLA 36 Unión de antígeno:anticuerpo de la sustitución lambda/kappa EJEMPLO 27 Mutantes de hAb Testl : modificación de motivo Para establecer si el motivo corto "KH" era suficiente para la formación de MAC en la región correspondiente de la CLX, se generó un mutante con un cambio de secuencia simple de restos CLX188'189 en hAb Test para poner una histidina al lado de K 87, por lo tanto, el "K187S 88H 189" se convirtió en "K187H 88S189". Los mutantes se generaron siguiendo protocolos descritos en el kit de mutagénesis dirigida QuickChange (Stratagene). Las mutaciones se introdujeron mediante cebadores oligonucleotídicos y se confirmaron por secuenciación del ADN. Las construcciones de anticuerpos mutados se expresaron de forma transitoria en células HEK 293 y se purificaron usando una columna de afinidad de proteina A. Los anticuerpos purificados se caracterizaron usando EM. El mutante ?????ee?-ß^?/? 8^ (LC: SEQ ID NO: 44) se unía a su receptor tan bien como lo hacia el anticuerpo hAb?Test precursor (Tabla 37).
TABLA 37 hAb Test-S188H/H189S EJEMPLO 28 Perfil de conjugación de mutantes de hAb Testl Cada anticuerpo (hAb Test, hAb Test- K, ?^??ee?,-??? y hAb Test-S 88H/H189S) se cambió de tampón a acetato sódico, 20 mM, trehalosa 200 m pH 5,5 a 20 mg/ml. Después, a las proteínas se les adicionó fosfato sódico 60 mM pH 7,7. Se resuspendió el SEQ ID NO: 27/K11-5PEG-PFP con propilenglicol al 50% y se mezcló con el anticuerpo a una proporción molar de 4.3:1 y se dejó reaccionar durante una noche a temperatura ambiente. Todas las muestras se diluyeron a 2 mg/ml y se analizaron como una proteína conjugada por cromatografía de exclusión por tamaño-espectrometría de masas (SEC-EM) para determinar el número y la cuantifícación de formas de conjugado de la proteína. Esta técnica mide el peso molecular de cada forma proteica; los múltiples sitios de conjugación con péptidos se observan como distintas señales separadas por la diferencia de masa de un péptido. La cuantifícación relativa de las múltiples especies de conjugación con péptido se realiza por medición de la magnitud de la señal. La tabla 38 muestra que el nivel global de conjugación se ha aumentado en los 2 híbridos de LC cambiada (?? y ???— el primero incluye un fragmento J de lambda, el último incluye un fragmento J de kappa). El nivel de conjugación aumenta sobre el CA promedio del control G?????ee?, que va de 1 ,66 a 2, 19 (??) y 2,53 (?? ), respectivamente. El mutante tenía escaso efecto en comparación con la secuencia nativa, sugiriendo que el motivo "KH" en solitario no es suficiente para la formación de MAC.
El grado de conjugación con péptido se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas (Tabla 38). Cada muestra se desnaturalizó y se redujeron los enlaces disulfuro usando clorhidrato de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando CLME para determinar el perfil de conjugación en cada una. En los análisis reducidos, la LC de hAb Test nativo tiene sólo el 5% de 1 CA pero salta de forma espectacular al 58% de 1 CA para hAb Test^K y al 63% de 1 CA para hAb Test^KÜ . El cambio de LC tenia escaso efecto sobre el nivel de conjugación de HC, que permanecía bastante constante (excepto para ???, en la que la conjugación de HC aumentada moderadamente). De nuevo, el mutante tenia escaso efecto en comparación con la secuencia nativa, sugiriendo que el motivo "KH" en solitario no es suficiente para la formación de MAC.
TABLA 38 Perfil de conjugación de mutantes de hAb Test Los atributos de unión a receptor de estas formas conjugadas también se evaluaron para determinar el efecto de la conjugación con el SEQ ID NO: 27/K11-5PEG-PFP sobre la capacidad de los anticuerpos conjugados para unirse todavía a su receptor (Tabla 39).
TABLA 39 Unión de antigeno:anticuerpo de lambda en anticuerpos EJEMPLO 29 Generación de MAC usando grupos salientes diferentes Para investigar si el grado de activación y/o estructura del grupo saliente de éster activo era importante para definir el efecto de conjugación direccional, se sintetizaron una serie de análogos de éster activado alternativamente de SEQ ID NO: 27-K 1(SH)MAC-2PEG-PFP. La distribución del producto conjugado se examinó por EM de los conjugados intactos, y el grado de adición de péptido a las cadenas tanto ligeras como pesadas también se determinó por EM después de la reducción del conjugado intacto y de la separación de las cadenas ligeras y pesadas.
La estructura y las designaciones de los ésteres activados alternativamente se muestran a continuación.
Los péptidos activados alternativamente se sintetizaron usando las mismas estrategias y procedimientos mostrados anteriormente en los Ejemplos 1 -3. En resumen, cada grupo activado se incorporó en un engarce de maleimida-2PEG-Z*, en el que Z* representaba el nuevo grupo saliente que sustituye a PFP. Para sintetizar los compuestos anteriores, se disolvió una muestra (30-40 mg) del péptido ABP-tiol purificado (es decir, ABP con K(SH) como resto de unión) en DMF anhidro (2 mi). Se añadió MAL-PEG2-Z* (20 mg) junto con N-metilmorfolina (5 mi). La reacción se agitó y se controló a temperatura ambiente por HPLC para seguir el curso temporal de formación de producto. La conversión completa de péptido de partida en producto ABP unido a éster activado se observó en las 2-6 h siguientes. La solución se filtró y el pico de producto se aisló directamente por HPLC semipreparativa. Los productos se aislaron en rendimientos que variaban de aproximadamente el 30-50% después de la liofilización.
Las reacciones de conjugación se llevaron a cabo en las condiciones convencionales. En resumen, la solución de anticuerpo 2.12.1.fx se preparó diluyendo la solución de 2.12.1.fx con fosfato sódico, pH 7,7, a una concentración final de 0,06 M. Por separado, la solución de péptido se preparó disolviendo el péptido a 20 mg/ml en propilenglicol, diluyendo después esta solución a 10 mg/ml con agua. Para la reacción de conjugación, las soluciones de péptido y anticuerpo se mezclaron a una proporción molar de 4,1 :1 durante el periodo prescrito. Para los estudios de curso temporal, se inactivaron muestras de la solución de conjugación a diversos puntos temporales mezclando una muestra de la reacción de conjugación con una solución de ácido succínico 40 mM, glicina 200 mM, pH 4,0 (1 :1 , v/v). El curso temporal de las reacciones de conjugación se siguió por HPLC. La SEQ ID NO: 27 se usó como péptido ejemplar.
SEQ ID NO: 27-K11-MAL-2PEG-Z* TABLA 40 Conjugación intacta con ésteres reactivos a las 24 h La Tabla 40 muestra la distribución del producto final de los conjugados intactos 24 h después del inicio de la reacción de conjugación. Los resultados muestran que algunos de los ésteres no reaccionaban en absoluto (Z4, Z 2), otros reaccionaban lentamente (por ejemplo, Z5), mientras que varios dieron perfiles que se aproximaban al del PFP (Z1 ) (por ejemplo, Z3).
Cinética de conjugación Las velocidades de adición con el tiempo para cada uno de los conjugados finales se muestran en las Tablas 41 , 42, 43 y 44. OCA representa el anticuerpo 2.12.1.fx no derivatizado, mientras que 1 , 2, ó 3CA representan adicionales de 1 , 2 ó 3 péptidos al anticuerpo 2.12.1.fx en cada uno de los periodos temporales examinados.
TABLA 41 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 0 CA TABLA 42 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 1 CA TABLA 43 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* que producen 2 CA TABLA 44 Cinética de conjugación de diferentes grupos Z* gue producen 3 CA.
Distribución de cadena ligera y pesada El grado de conjugación con péptido para cada uno de los ésteres activados alternativamente se examinó por separado en las cadenas ligeras y pesadas. Cada muestra se desnaturalizó y se redujeron los enlaces disulfuro usando clorhidrato de guanidina y ditiotreitol. Las cadenas ligeras y pesadas libres resultantes se analizaron usando CLEM para determinar el perfil de conjugación en cada una. El perfil de conjugación con péptido en la cadena ligera y pesada de 2.12.1 fx y mutantes se muestran en la Tabla 45. Casi todos los péptidos activados enumerados en la tabla mostraban un nivel de conjugación reducido en la cadena ligera en comparación con el compuesto que usaba PFP (Z1 ), excepto 2,3,6-trifluorofenilo (Z3), que mostraba un nivel de conjugación similar. Los ésteres activados derivados de N-hidroxisuccinimida (NHS), es decir, ¡mida del ácido N-hidroxil-5-norborneno-2,3-dicarboxilico y 2-hidroxil-isoindolin-1 ,3-diona (Z8 y Z9), mostraban una mayor tendencia a la derivatización de la cadeqa pesada.
TABLA 45 Resumen de resultados de éster activado. Algunos datos también se presentan en las Tablas 40-44 Z* Curso temporal de aductos de conjugación Conjugación reducida Nombre Estructura [separados 24 h excepto en negrita] a las 24 h Penta fluoro fenilo 2,3,4- trifluoro- fenilo 2,3,6- trifluorofenilo 10 4-n¡tro- (enilo 11 2,6- difluoro fenilo 12 1-naflilo EJEMPLO 30 Se muestran ejemplos adicionales de ésteres activados alternativamente en la Tabla 45. Se examinó el curso temporal de conjugación de varios análogos de ésteres de PFP. Disminuyendo el número y la posición de los grupos flúor en PFP, pueden sintetizarse e investigarse formas de éster activo menos reactivas. El éster 2,3,5,6-tetrafluorofenílico y éster 2,4,6-trifluorofenílico se ensayaron ambos después de la conjugación con SEQ ID NO: 27-K11(SH)MAC-2PEG-PFP. La 1-hidroxil-pirrolidin-2,5-diona (NHS) se conjugó con SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP.
SEQ ID NO:27-K1 (SH)MAC-2PEG-PFP SEQ ID NO:27-K11-5PEG-PFP Después de 2 h de conjugación, estas formas menos activadas dieron una conjugación global menor con 2.12.1.fx que PFP. El grupo NHS también mostró menor conjugación global. Se conjugaron péptidos que contenían NHS y PFP con 2.12.1.fx. Las formas reducidas se analizaron para ver la distribución a las 2 h. El PFP mostraba una tendencia mucho mayor para la derivatización de cadena ligera (global del 77% para LC, sólo del 6% para pesada) en comparación con la 1-hidroxil-pirrolidin-2,5-diona (NHS) (global del 31 % para LC, pero global del 34% para pesada).
TABLA 46 Ejemplos adicionales con ésteres activados alternativamente Los compuestos Z1-Z15 representan una diversidad de diferentes tipos estructurales de éster activo. Es instructivo considerar la serie de ésteres activos aromáticos fluorados, que tienen un número y un patrón de sustitución de átomos de flúor diferente alrededor del anillo aromático (compuestos Z1 , Z2, Z3, Z11 , Z14 y Z15) y considerar cómo su estructura influye sobre su reactividad y tendencia a la derivatización de proteínas. La cinética de la conjugación con anticuerpo de estos derivados puede compararse convenientemente en el punto temporal de 2 h, cuando la reacción de pentafluorofenilo (Z1 ) ha llegado a completarse. Con un nivel creciente de sustitución con flúor alrededor del anillo, hay un nivel creciente de conjugación global y una disminución concomitante en el anticuerpo sin reaccionar. La velocidad de reacción está directamente relacionada con la pKa del grupo saliente fenol fluorado, dando los fenoles más ácidos mayores velocidades de reacción. Las velocidades de conjugación son Z1 >Z14>Z3>Z15>Z2>Z 1. Los efectos sutiles de los patrones de sustitución con flúor pueden observarse comparando los compuestos Z2, Z3 y Z15.
La estructura del éster activo también afectaba significativamente a la direccionalidad de la reacción de conjugación. En general, los ésteres aromáticos fluorados mostraban una tendencia marcada hacia la derivatización de la cadena ligera (principalmente CLK-K188, como se ha mencionado anteriormente). Por el contrario, varios ésteres basados en derivados de N-hidroxisuccinimida (Z8, Z9 y Z13) mostraban menos preferencia, observándose con frecuencia mayores niveles de derivatización de la cadena pesada.
EJEMPLO 31 Se evaluó la velocidad de conjugación entre MAC-1 (engarce de PEG-2-maleimido-mercaptopropionilo entre el péptido y el grupo activador PFP) y MAC-2 (engarce de PEG-5 de cadena lineal entre el péptido y el grupo activador PFP). La Tabla 47 compara estos péptidos activados con 2.12.1 x. Los resultados muestran que los péptidos activados se comportan de forma muy similar en términos de velocidad y grado de derivatización, a pesar de su estructura de engarce ligeramente diferente.
TABLA 47 Comparación de conjugación entre MAC-1 y MAC-2 EJEMPLO 32 Efecto de la longitud del engarce Se examinó el efecto sobre el perfil de distribución de conjugado final de tener diferentes longitudes de engarce. Se sintetizaron compuestos con engarces de PEG de diferente longitud que unían el péptido con el grupo PFP. Los resultados para la adición a 2.12.1.fx de 0, 1 , 2, 3 y 4 péptidos se resumen en la Tabla 48. En su conjunto, el cambio de la longitud del engarce de PEG tenia generalmente escaso efecto sobre la distribución de conjugados obtenida.
TABLA 48 Efecto de la longitud del engarce Estructura de compuestos del Ejemplo 32.
EJEMPLO 33 Conjugación de secuencias peptidicas alternativas Para confirmar la aplicabilidad de la invención a través de otras secuencias peptidicas, se conjugó la SEQ ID NO: 60 y la SEQ ID NO: 61 (péptidos de ensayo 1 y 2). Las SEQ ID NO: 60 y 61 se sometieron a conjugación con 5-PEG-PFP y después con el anticuerpo 2.12.1 .fx en condiciones previamente optimizadas para la reacción con SEQ ID NO: 27-K11-5PEG-PFP. Los resultados del análisis del perfil de conjugación y la conjugación de LC/HC se muestran en la Tabla 49. La SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 mostraban ambas una conjugación direccional con la cadena ligera. En un análisis adicional de las distribuciones de LC/HC, se observaron perfiles similares a los de MAC-2, con aproximadamente un 70% de derivatización de LC y menos del 10% en la HC.
TABLA 49 Perfil de conjugación de SEQ ID NO: 60 y SEQ ID NO: 61 SEQ ID NO: 60/K7-5PEG-PFP SEQ ID NO: 61/K4-5PEG-PFP EJEMPLO 34 Se realizaron experimentos de mapeo de péptidos en un intervalo de combinaciones de proteina/conjugado con el fin de confirmar los parámetros importantes que conducían a la conjugación direccional en K188 en cadenas ligeras de anticuerpo. La Tabla 50 enumera los resultados de los experimentos de mapeo de péptidos realizados. Para cada parámetro de estudio, se usó el procedimiento de mapeo de péptidos descrito anteriormente. "***" indica un alto nivel de conjugación direccional con K188- CLK. "**" y en menor medida "*", indican que todavía se observa conjugación direccional, pero puede mostrar diferencias, tal como condiciones de reacción más lentas, menos conjugación global o promedio en una cadena ligera solamente, y por tanto puede ser más adecuada para circunstancias especiales, tales como generar MAC con entre 0,5 y 1 ,5 péptidos por anticuerpo (por ejemplo). "-" indica que estas condiciones de reacción no parecían favorables hacia la conjugación direccional en K188-CLK.
Como en MAC-2 se observó que K188-CLK era la localización de la conjugación direccional, los estudios de mapeo de péptidos en parámetros alternativos se centraron en esta localización. No se incluyen los datos del mapeo de péptidos detallados para cada parámetro de estudio, pero no se observaron niveles de conjugación significativos en otros restos K, y las observaciones de otros MAC concordaban con la conjugación direccional en K188-CLK.
Las mutaciones K188R y K188A de 2.12.1.fx daban como resultado la pérdida de conjugación direccional en este sitio; sugiriendo un papel esencial para este resto especifico. Las mutaciones K190R y K 90A no obstaculizaban la conjugación direccional con K188 y podían incluso aumentarla. De los otros parámetros de estudio examinados, se observó que al menos una porción del subtipo de región constante de cadena ligera tenía un impacto significativo sobre la conjugación direccional; se determinó que era necesaria al menos una porción del subtipo de cadena ligera kappa. La conjugación sobre un subtipo de cadena ligera lambda (usando un anticuerpo que contiene ? ejemplar, hAb Testl ) no demostró conjugación direccional. Cuando la ??? de hAbÁTestl se mutó a LCK, se recuperó la conjugación direccional en K 88.
TABLA 50 Resumen de conjugación direccional en K CLK Por lo tanto, la invención se ha descrito ampliamente y se ha ilustrado en relación con realizaciones representativas descritas anteriormente. Los expertos en la materia reconocerán que pueden realizarse diversas modificaciones en la presente invención sin alejarse del espíritu y alcance de la misma. Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes expedidas se incorporan en el presente documento por referencia en la misma medida en que si se indicase específicamente e individualmente que cada publicación, solicitud de patente o patente expedida individual se incorpora por referencia en su totalidad. Las definiciones que están contenidas en el texto incorporado por referencia se excluyen en la medida que contradigan las definiciones en la presente divulgación.
Se aprecia que ciertas características de la invención, que se describen por claridad en el contexto de realizaciones separadas, también pueden proporcionarse en combinación en una sola realización. Por el contrario, diversas características de la invención que se describen, por brevedad, en el contexto de una sola realización, también pueden proporcionarse por separado o en cualquier subcombinación adecuada.
Se contempla específicamente que cualquier limitación analizada con respecto a una realización de la invención pueda ser aplicable a cualquier otra realización de la invención. Además, cualquier composición de la invención puede usarse en cualquier procedimiento de la invención y cualquier procedimiento de la invención puede usarse para producir o utilizar cualquier composición de la invención. En particular, cualquier aspecto de la invención descrito en las reivindicaciones, en solitario o en combinación con una o más reivindicaciones y/o aspectos adicionales de la descripción, debe entenderse como combinable con otros aspectos de la invención expuestos en otra parte en las reivindicaciones y/o descripción y/o listado de secuencias y/o dibujos.
En la medida en que los ejemplos específicos encontrados en el presente documento no se incluyan dentro del alcance de una invención, puede renunciarse explícitamente a dicho ejemplo específico.
El uso del término "o" en las reivindicaciones se usa para significar "y/°" a menos que se indique explícitamente que se refiere a alternativas únicamente o que la alternativa sea mutuamente excluyente, aunque la divulgación respalda una definición que se refiera a las alternativas únicamente y "y/°"- Como se usan en la memoria descriptiva, "un" o "uno/a" pueden significar uno o más, a menos que se indique claramente otra cosa. Como se usan en el presente documento en la reivindicación o reivindicaciones, cuando se usan junto con la palabra "que comprende", las palabras "un" o "uno/a" pueden significar uno o más de uno. Como se usa en el presente documento, "otro" puede significar al menos un segundo o más. A menos que se defina otra cosa en el presente documento, los términos científicos y técnicos usados en relación con la presente invención tendrán los significados que se entienden comúnmente por el experto en la materia. Además, a menos que se requiera otra cosa por el contexto, los términos en singular incluirán la pluralidad y los términos en plural incluirán el singular. Las palabras "comprende/que comprende" y las palabras "que tiene/que incluye", cuando se usan en el presente documento con relación a la presente invención, se usan para especificar la presencia de las características, números enteros, etapas o componentes indicados, pero no excluyen la presencia o adición de una o más características, números enteros, etapas, componentes o grupos distintos de los mismos.
Descripción de Secuencias

Claims (80)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES
1. Un conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC) que comprende (i) un anticuerpo, o porción de unión a antigeno del mismo, que comprende al menos un fragmento de una región kappa constante de cadena ligera (CLK) que comprende K188 de acuerdo con la numeración de Kabat; (¡i) un engarce que comprende la fórmula X-Y-Z, en la que Z es un grupo que está conectado covalentemente al anticuerpo a través de la cadena lateral de K188, Y es una cadena de conexión biológicamente compatible lineal o ramificada y X es un grupo conectado covalentemente a al menos un Resto Efector, y sales farmacéuticamente aceptables, estereoisómeros, tautómeros, solvatos y profármacos del mismo.
2. El MAC de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque comprende también H188-CLK.
3. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque comprende también D 51- CLK.
4. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque la región CLK comprende al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47.
5. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque la región CLK comprende al menos los restos 1-106 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47.
6. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el Resto Efector está conjugado con el MAC solamente en K 88-CLK.
7. El MAC de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque el Resto Efector está conjugado con el MAC en K188-CLK en al menos una cadena ligera, y al menos otra localización en el anticuerpo.
8. El MAC de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado además porque el Resto Efector está conjugado con el MAC en K 88-CLK en al menos una cadena ligera, y en otras dos localizaciones en el anticuerpo.
9. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el Resto Efector está conjugado con CLK K188 en ambas cadenas ligeras.
10. El MAC de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado además porque el Resto Efector está conjugado con CLK K188 en una cadena ligera solamente.
11. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el Resto Efector es un agente terapéutico, proteína, péptido, ácido nucleico, aptámero, molécula pequeña, agonista proteico, antagonista proteico, regulador metabólico, hormona, toxina, factor de crecimiento o agente de diagnóstico.
12. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el al menos un Resto Efector es una proteina o péptido.
13. El MAC de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado además porque el grupo X del engarce se une covalentemente al extremo amino-terminal, extremo carboxilo-terminal o cadena lateral de un resto de unión a péptido en la proteina o péptido.
14. El MAC de conformidad con la reivindicación 13, caracterizado además porque el resto de unión a péptido se selecciona del grupo que consiste en K, R, C, T, Y, S, Dap, Dab, K(SH) y homólogos de K y C.
15. El MAC de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque el resto de unión es K.
16. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque Y, X-Y, Y-Z o X-Y-Z se seleccionan del grupo que consiste en: inferiores se seleccionan del grupo que consiste en 0, 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 y 20, y cuyo límite superior se selecciona del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, y en el que la longitud global del engarce no supera los 200 átomos.
17. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque comprende la fórmula: en donde K 88-CLK es un enlace covalente con la cadena lateral de dicho K188-CLK, el Resto Efector-LR es un enlace covalente con el Resto Efector y m, n y j son cada uno independientemente un intervalo cuyos límites inferiores se seleccionan del grupo que consiste en 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 , 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 y 30, y en la que la longitud global del engarce no supera los 200 átomos.
18. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque la longitud global del engarce no supera los 150 átomos.
19. El MAC de conformidad con la reivindicación 18, caracterizado además porque la longitud global del engarce no supera los 100 átomos.
20. El MAC de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado además porque la longitud global del engarce no supera los 60 átomos.
21. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el anticuerpo se selecciona del grupo que consiste en Rituximab, Cetuximab, Infliximab, Adalimumab, Natalizumab, Omalizumab, Ranibizumab y Palivizumab.
22. El MAC de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo aldolasa catalítico.
23. El MAC de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el anticuerpo es un anticuerpo de longitud completa, Fab, Fab', F(ab')2, Fv, dsFv, scFv, VH, diacuerpo o minicuerpo que comprende dominios VH y VL de h38c2.
24. El MAC de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 51 y la SEQ ID NO: 52 o la SEQ ID NO: 53 y la SEQ ID NO: 54.
25. El MAC de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -19, caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región HC que comprende la SEQ ID NO: 5, una región VH que comprende la SEQ ID NO: 6, una región VL que comprende la SEQ ID NO: 16 y una región CL que comprende una de las SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47.
26. El MAC de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el anticuerpo comprende la SEQ ID NO: 3 y la SEQ ID NO: 4.
27. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el Resto Efector es un péptido de unión a Ang2.
28. El MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, caracterizado además porque el péptido de unión a Ang2 comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31 y SEQ ID NO: 32.
29. El MAC de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado además porque el péptido de unión a Ang2 comprende la SEQ ID NO: 27.
30. El MAC de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado además porque el resto de unión a péptido es K11 de la SEQ ID NO: 27.
31. El MAC de conformidad con la reivindicación 30, caracterizado además porque comprende la estructura: en donde K188-CLK es un enlace covalente con la cadena lateral de dicho K188-CLK, y el anticuerpo comprende la SEQ ID NO:3 y la SEQ ID NO: 4.
32. Una composición que comprende el MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde al menos aproximadamente el 50% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K1 88-CLK.
33. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque al menos aproximadamente el 60% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K 88-CLK.
34. La composición de conformidad con la reivindicación 32, caracterizada además porque al menos aproximadamente el 70% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K188-CLK.
35. La composición de conformidad con la reivindicación 32 , caracterizada además porque al menos aproximadamente el 80% del Resto Efector en la composición o muestra está conjugado con K 88-CLK.
36. Una composición que comprende el MAC de conformidad con cualquier reivindicación anterior, en donde al menos aproximadamente el 50% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K188-CLK.
37. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque al menos aproximadamente el 60% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K188-CL .
38. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque al menos aproximadamente el 70% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K 88-CLK.
39. La composición de conformidad con la reivindicación 36, caracterizada además porque al menos aproximadamente el 80% del anticuerpo comprende un Resto Efector unido covalentemente a K188-CLK.
40. Una composición que comprende el MAC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31 , en donde al menos aproximadamente el 70% de las moléculas de cadena pesada no están conjugadas con el Resto Efector.
41. La composición de conformidad con la reivindicación 40, caracterizada además porque al menos aproximadamente el 80% de las moléculas de cadena pesada no están conjugadas con el Resto Efector.
42. La composición de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizada además porque al menos aproximadamente el 90% de las moléculas de cadena pesada no están conjugadas con el Resto Efector.
43. Una composición que comprende el MAC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31 , en donde la cantidad de fragmentos de cadena ligera individuales que comprenden un solo sitio de conjugación para el Resto Efector está entre aproximadamente el 25 y el 95%.
44. Una composición que comprende un MAC de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31 , en donde el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 5.
45. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 3.
46. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 0,5 y aproximadamente 1 ,5.
47. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 1 ,5 y aproximadamente 5,0.
48. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 1 ,5 y aproximadamente 3,0.
49. La composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 1 ,5 y aproximadamente 2,5.
50. La. composición de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada además porque el número de conjugaciones por anticuerpo está entre aproximadamente 1 ,7 y aproximadamente 2,3.
51. Un procedimiento para preparar el conjugado de anticuerpo multifuncional (MAC) de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-31 , o una composición de conformidad cvon cualquiera de las reivindicaciones 32-50, que comprende una reacción de conjugación que comprende unir covalentemente el Resto Efector a un engarce que termina en un grupo saliente Z* de fórmula: en donde R1 es F o Cl, h = 0 2, 3, 4 ó 5, y hacer reaccionar el complejo de Resto-Efector-Engarce-Z* así formado con el anticuerpo.
52. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 51 , caracterizado además porque R1 es F.
53. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-52, caracterizado además porque h = 3, 4 ó 5.
54. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-53, caracterizado además porque Z* se selecciona del grupo que consiste en:
55. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-54, caracterizado además porque h = 4 ó 5.
56. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-55, caracterizado además porque Z* es de fórmula:
57. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-56, caracterizado además porque la proporción de Resto Efectonanticuerpo está entre aproximadamente 1 :1 y aproximadamente 15: 1.
58. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque la proporción está entre aproximadamente 2:1 y aproximadamente 5:1.
59. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque la proporción está entre aproximadamente 3:1 y aproximadamente 6:1.
60. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque la proporción está entre aproximadamente 3,5:1 y aproximadamente 5:1.
61. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque la proporción está entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 15:1.
62. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 57, caracterizado además porque la proporción está entre aproximadamente 5:1 y aproximadamente 7:1.
63. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-62, caracterizado además porque la concentración de anticuerpo durante la reacción de conjugación está entre aproximadamente 1 y aproximadamente 100 mg.ml"1.
64. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-62, caracterizado además porque la concentración de anticuerpo durante la reacción de conjugación es de al menos aproximadamente 5 mg.ml"1.
65. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-62, caracterizado además porque la concentración de anticuerpo durante la reacción de conjugación es de al menos aproximadamente 10 mg.ml"1.
66. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-62, caracterizado además porque la concentración de anticuerpo durante la reacción de conjugación estaba entre aproximadamente 5 y aproximadamente 50 mg.ml"1.
67. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-66, caracterizado además porque la reacción se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 40 °C.
68. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-66, caracterizado además porque la reacción s lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 4 °C y aproximadamente 30 °C.
69. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-66, caracterizado además porque la reacción se lleva a cabo a una temperatura de entre aproximadamente 15 °C y aproximadamente 25 °C.
70. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-69, caracterizado además porque la reacción tiene lugar a un pH de entre aproximadamente 6 y aproximadamente 9.
71. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-69, en el que la reacción tiene lugar a un pH de entre aproximadamente 6,5 y aproximadamente 8.
72. El procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-71 , caracterizado además porque el anticuerpo comprende una región CL-? que comprende además la etapa inicial de sustituir una porción correspondiente de la región CL-? (de acuerdo con la numeración de Kabat) con al menos los restos 62-103 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47.
73. El procedimiento de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado además porque la región CIA correspondiente del anticuerpo se sustituye con al menos los restos 1-106 de la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 45, SEQ ID NO: 46 o SEQ ID NO: 47.
74. Un MAC producido por el procedimiento de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 51-73.
75. Una composición que comprende el MAC de conformidad con la reivindicación 74.
76. Una composición farmacéutica que comprende el MAC de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1 -31 , o con la reivindicación 74, o una composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 32-50, y que comprende además un vehículo aceptable.
77. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 76, caracterizada además porque también comprende uno o más compuestos seleccionados del grupo que consiste en 5-fluorouracilo, irinotecán, oxilaplatino, cetuximab, sunitínib y rítuximab.
78. El uso de una composición farmacéutica de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 76-77, en la fabricación de un medicamento para la inhibición o reducción de la angiogénesis o del tratamiento o prevención de una enfermedad o síntoma asociado con un trastorno angiogénico en un paciente.
79. El uso como se reclama en la reivindicación 78, en donde la enfermedad es cáncer.
80. El uso como se reclama en la reivindicación 79, en donde el cáncer es cáncer de pulmón (NSCLC y SCLC), de cabeza o cuello, de ovario, de colon, de recto, de próstata, de región anal, de estómago, de mama, de riñon o uréter, de pelvis renal, de glándula tiroidea, de vejiga, de cerebro, carcinoma de células renales, carcinoma de, neoplasias del sistema nervioso central (SNC), linfoma primario del SNC, linfoma no Hodking, tumores de la médula espinal, carcinomas de orofaringe, hipofaringe, esófago, páncreas, hígado, vesícula biliar y conductos biliares, intestino delgado, tracto urinario; o linfoma, cáncer pulmonar (NSCLC y SCLC), cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer rectal, cáncer de próstata, cáncer de la región anal o una combinación de uno o más de los cánceres anteriores. .
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