CN102235976A - 荧光强度校正方法、荧光强度计算方法及计算装置 - Google Patents

Abstract

本文提供了荧光强度校正方法、荧光强度计算方法及计算装置。更具体地，提供了一种荧光强度计算装置，包括：测量部，该测量部被构造成通过光检测器接收由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的多个荧光染料产生的荧光，然后通过从光检测器收集检测值来获得测定光谱；以及计算部，该计算部被构造成基于从用荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和来近似测定光谱，从而分别计算由荧光染料产生的荧光的强度，其中该多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且其中该光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且该光检测器的数量大于荧光染料的数量。

Description

荧光强度校正方法、荧光强度计算方法及计算装置

技术领域

本发明涉及荧光强度校正方法、荧光强度计算方法、以及荧光强度计算装置。更具体地，本发明涉及一种荧光强度校正方法、一种荧光强度计算方法、以及一种荧光强度计算装置(calculating apparatus)，其各自分别能够精确地计算由多个(多种，plural)荧光染料产生的荧光的强度，其中微粒(微小粒子，microparticle)用该多个荧光染料进行多重标记。

背景技术

迄今为止，已使用仪器(如流式细胞仪)来标记微粒，如用荧光染料(荧光色素，fluorescent dye)来标记细胞，并测量由通过对微利照射激光束而激发的荧光染料产生的荧光的强度或模式，由此测量该微粒的特性。近年来，已进行了多色测量(multicolor measurement)以更加精细地分析细胞等的特性。在这种情况下，多色测量是这样的测量，其中微粒用多个荧光染料标记，并且通过使用分别对应于不同的接收光波长带的多个光检测器(如PMT)来测量由各个荧光染料产生的光。在多色测量中，选择和使用荧光波长与各个光检测器的接收光波长带一致的荧光染料。

在另一方面，荧光染料(如FITC、藻红蛋白(PE)以及别藻蓝蛋白(APC))的荧光中心波长彼此靠近。因而，存在其中荧光光谱彼此重叠的波长带。因此，在基于这些荧光染料的组合进行多色测量的情况下，即使当通过利用滤光器将由各个荧光染料产生的荧光彼此通过波长带分开时，由不同于目标荧光染料的荧光染料产生的荧光在某些情况下仍然会泄漏到光检测器。当发生荧光的泄漏时，通过各个光检测器测得的荧光强度变得大于由目标荧光染料产生的荧光的真实强度，因而发生数据上的错配。

为了校正数据上的错配，进行了荧光校正(补偿)：从通过光检测器测得的荧光强度减去泄漏的荧光强度。荧光校正是使得将电或数学校正加入专用回路上的脉冲，以使通过光检测器测得的荧光强度变成由目标荧光染料产生的荧光的真实强度。

一种以向量形式表示通过各个光检测器测得的荧光强度，并使之前设置的泄漏矩阵(leakage matrix)的逆矩阵(inversion matrix)作用于该向量，从而计算由目标荧光染料产生的荧光的真实强度的方法称作算术地进行荧光校正的方法。在日本专利临时公开No.2003-83894中描述了这种方法(参照图10和11)。通过分析用荧光染料单个标记(single-labeled)的微粒的荧光波长分布而产生泄漏矩阵，并且以列向量的形式排列荧光染料的荧光波长分布。另外，泄漏矩阵的逆矩阵也称作“校正矩阵(correctionmatrix)”。

发明内容

由于在利用校正矩阵的荧光强度校正方法下，使得泄漏矩阵的逆矩阵作用于具有通过各个光检测器测得的荧光强度作为其要素的向量，所以必要的是，泄漏矩阵是方矩阵。

泄漏矩阵的矩阵大小取决于使用的荧光染料的数量和使用的光检测器的数量。因此，为了使校正矩阵可以是方矩阵，必要的是，使用的荧光染料的数量和使用的光检测器的数量彼此相等。图10A至10C以及图11例举了通过利用5种荧光染料(FITC、PE、ECD、PC5、以及PC7)和5个光检测器进行五色测量的情形。

最近，为了满足用户的需要：期望增加可用的荧光染料的数量以精细地分析细胞等的特性，也已开发了其中增加光检测器的数量的装置。在这样的设置有大量光检测器的装置中，测量中使用的光检测器的数量在某些情况下可能大于标记微粒所使用的荧光染料的数量。在这样的情况下，为了有效地应用利用校正矩阵的荧光校正，必要的是，使用的荧光染料的数量和使用的光检测器的数量彼此相等。因此，通过适当选择光检测器(其数量与荧光染料的数量一致)来利用测量数据，而没有利用从所有光检测器获得的测量数据(measured data)。为此，引起以下问题：没有有效地利用所获得的测量数据。

为了解决上述问题，形成了本发明，并因此期望提供一种荧光强度校正方法、一种荧光强度计算方法、以及一种荧光强度计算装置，在通过多个光检测器对标记有多个荧光染料的微粒进行多色测量的情况下，它们各自能够有效地利用从所有光检测器获得的测量数据而不取决(依赖)于荧光染料的数量，从而精确地计算由各个荧光染料产生的荧光强度。

为了实现上述期望，根据本发明的一种实施方式，提供了一种荧光强度校正方法，包括以下步骤：通过光检测器来接收荧光，该荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，其中该多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且光检测器的数量大于荧光染料的数量；以及基于从用荧光染料单个标记(单独标记，individually labeled)的微粒而获得的单染色光谱的线性总和，对通过从多个光检测器收集的检测值获得的测定光谱(测得的光谱，measured spectra)进行近似(approximate)。

在以上描述的荧光强度校正方法中，基于单染色光谱的线性总和的测定光谱的近似可以通过利用最小二乘法来进行。另外，这时，当检测值中包含无效值时，可以排除无效的检测值，因而可以基于单染色光谱的线性总和来近似测定光谱。通过排除无效的检测值，增强了荧光强度的校正精度。

具体地，在以上描述的荧光强度校正方法中，通过使用法方程(正规方程，normal equation)或奇异值分解(singular value decomposition)，获得参数a_k(k＝1至m)，在该参数a_k下，由以下表达式表示的评价函数得到最小值，从而使得有可能分别计算产生自荧光染料的荧光强度：

${\mathrm{\χ}}^2=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中X_k(x_i)表示在第k种荧光染料的单染色光谱中来自第i个光检测器的检测值，y_i表示在测定光谱中来自第i个光检测器的检测值，而σ_i表示来自第i个光检测器的测量值的权重(weight)的倒数。在这种情况下，权重的倒数，例如，可以是第i个光检测器的测量误差方差(measurementerror variance)等。如果没有权重的倒数，则所有σ_i可以设置为1。

另外，当在检测值中包含无效值时，在以上描述的荧光强度校正方法中，获得参数a_k(k＝1至m)，在该参数下，由以下表达式表示的评价函数得到最小值，从而使得可以计算产生自各个荧光染料的荧光强度：

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N_i}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

或

X′_k(x_i)＝X_k(x_i)  (k＝1～M、i＝1～N₁)

X′_k(x_i)＝0       (k＝1～M、i＝N₁+1～N)

${\mathrm{\χ}}^2=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X^{\′}}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中X_k(x_i)表示在第k种荧光染料的单染色光谱中来自第i个光检测器的检测值，y_i表示在测定光谱中来自第i个光检测器的检测值，而σ_i表示来自第i个光检测器的测量值的权重的倒数。然而，无效检测值被取为y_i(i＝“N₁+1”至N)，以及有效检测值被取为y_i(i＝1至N₁)。

根据本发明的另一种实施方式，提供了一种荧光强度计算方法，包括以下步骤：通过光检测器来接收荧光，该荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，其中该多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且光检测器的数量大于荧光染料的数量，并通过从光检测器收集检测值而获得测定光谱；以及基于从用荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和来近似测定光谱，从而分别计算由荧光染料产生的荧光的强度。

根据本发明的又一种实施方式，提供了一种荧光强度计算装置，包括：测量部，用于通过光检测器来接收荧光，该荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，其中该多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且光检测器的数量大于荧光染料的数量，并且通过从光检测器收集检测值而获得测定光谱；以及计算部，用于基于从用荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和来近似测定光谱，从而分别计算由荧光染料产生的荧光的强度。

在实施方式中，生物学相关微粒如细胞、微生物和脂质体，合成颗粒如乳胶颗粒、凝胶颗粒，以及工业颗粒等通常包含在“微粒”中。

染色体、脂质体、线粒体、细胞器等，包括各种细胞，包含在生物学相关微粒中。动物细胞(如三系细胞)和植物细胞包含在细胞中。杆菌类如大肠杆菌、病毒类如烟草花叶病毒、真菌类如酵母菌等包含微生物中。另外，如核酸、蛋白质、以及它们的复合物也可以包含在生物学相关微粒中。另外，工业颗粒，例如，也可以是有机或无机聚合材料、金属等。聚苯乙烯、苯乙烯、二乙烯基苯、聚甲基丙烯酸甲酯等包含在有机聚合材料中。玻璃、二氧化硅、磁性材料等包含在无机聚合材料中。而且，金胶体、铝等包含在金属中。虽然每种上述微粒的形状通常是球形，但它们的形状还可以是非球形，并且并不特别限制它们的尺寸、质量等。

另外，在本发明实施方式中，“无效检测值”是指具有明显低可靠性的检测值，以及当检测值用于计算时具有计算荧光强度的精度降低的可能性的检测值。例如，当进行关于用某种荧光染料单个标记的微粒的测量时，在对应于作为接收光波长带的该某种荧光染料的荧光波长带中的波长的光检测器中获得的检测值，当通过对用某种荧光染料单个标记的微粒照射具有激发波长带中的波长带的光进行测量时，在光检测器中获得的检测值等包含在无效检测值中。在理论上，不应该检测到这些检测值。然而，在实际装置中，由于应加以机械屏蔽的荧光泄漏、施加电子噪声等的原因，在某些情况下获得这些检测值。另外，由于某种原因，具体的光检测器的特性变得更差，在某些情况下获得这样的低可靠性的检测值。

如上文所述，根据本发明实施方式，可以提供荧光强度校正方法、荧光强度计算方法、以及荧光强度计算装置，在通过多个光检测器对用多个荧光染料标记的微粒进行多色测量的情况下，它们各自能够有效地利用从所有光检测器获得的测量数据，而不取决于荧光染料的数量，从而精确地计算由各个荧光染料产生的荧光强度。

附图说明

图1是解释通过基于单染色光谱的线性总和来近似测定光谱而获得的近似曲线的曲线图；

图2是解释(N×M)矩阵的要素的图示；

图3A至3D分别是在阳性过程对照(positive process control)中的PE-PE-TR二维作图中在荧光校正之前的标图(描绘图，plot diagram)、在阳性过程对照中的PE-PE-TR二维作图中通过利用逆矩阵方法作为现有技术来执行荧光校正处理所获得的标图、在阳性过程对照中的PE-PE-TR二维作图中通过利用最小二乘法(法方程)来执行荧光校正处理所获得的标图、以及在阳性过程对照中的PE-PE-TR二维作图中通过利用最小二乘法(SVD方法)来执行荧光校正处理所获得的标图；

图4是解释指数的定义的图示，根据该指数评价在细胞组之间分开的对错；

图5A至5K分别是标图，各自分别通过使用逆矩阵方法作为现有方法，使模拟数据经受荧光校正处理而获得；

图6A至6K是标图，各自分别通过在本发明实施方式中利用最小二乘法使模拟数据经受荧光校正处理而获得；

图7是光谱图，示出了其中分别包含无效检测值的测定光谱的实例；

图8是光谱图，示出了通过从图7所示的测定光谱中排除无效检测值而获得的光谱；

图9是图示，示出了在本发明实施方式中通过使用利用最小二乘法的方法使图7和8中所示的光谱经受荧光校正处理而获得的结果，从而比较彼此分开的对错；

图10A至10C是解释利用现有校正矩阵的荧光校正方法的图示；以及

图11是解释现有校正矩阵的矩阵要素的图示。

具体实施方式

在下文中将参照附图来详细描述本发明的优选实施方式。值得注意的是，以下描述的本发明的实施方式仅举例说明本发明的典型实施方式而不是用来限制本发明的范围。还值得注意的是，下文将按下列顺序进行描述。

1.荧光强度校正方法

(1-1)近似曲线(approximated curve)

(1-2)线性最小二乘方程

(1-2-1)法方程

(1-2-2)奇异值分解

2.荧光强度计算方法

(2-1)标记

(2-2)测量

(2-3)荧光强度计算

3.荧光强度计算装置

1.荧光强度校正方法

(1-1)近似曲线

根据本发明的第一种实施方式的荧光强度校正方法的特征在于，测定光谱基于单染色光谱的线性总和进行近似，从而计算由各个荧光染料产生的荧光的真实强度。通过光检测器来接收荧光，该荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，其中该多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且光检测器对应于不同的接收光波长带且其数量大于荧光染料的数量，另外，“单染色光谱”是各个荧光染料的荧光波长分布，并且分别通过用光检测器接收由通过对用荧光染料单个标记的微粒照射光而激发的荧光染料产生的荧光，以及通过从各个光检测器收集检测值而获得。

现将参照图1来描述通过基于单染色光谱的线性总和来近似测定光谱所获得的近似曲线。

在图1中，X轴表示观察点，而Y轴表示检测值。在图1中，由光检测器x₁接收的荧光的检测值用y₁指示，由光检测器x₂接收的荧光的检测值用y₂指示，以及由光检测器x_n接收的荧光的检测值用y_n指示。连接检测值y₁至y_n的线是测定光谱。

另外，在图1中，表示第一种荧光染料(荧光染料1)的单染色光谱的曲线(基函数(basis function))由X₁(x)指示，表示第二种荧光染料(荧光染料2)的单染色光谱的曲线由X₂(x)指示，以及表示第m种荧光染料(荧光染料m)的单染色光谱的曲线由X_m(x)指示。

借助于光检测器，以某种状态接收来自荧光染料1至荧光染料m的所有荧光染料的荧光以其中这些荧光分别以预定比率泄漏的状态被接收。为此，从各个光检测器获得的检测值可以根据表达式(4)近似为通过荧光染料1至荧光染料m的基函数乘以各个预定比率所获得的数值的总和：

$y\left(x\right)=\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k\·X_k\left(x\right)...\left(4\right)$

其中a_k表示从荧光染料k到光检测器x_k的荧光的泄漏比率。这里，从荧光染料k到光检测器x_k的荧光的泄漏比率a_k通过荧光染料k的荧光强度(真实荧光强度)进行调节。

具体地，例如，从光检测器x₁获得的检测值y₁被近似为通过荧光染料1的基函数X₁(x₁)乘以比率a₁所获得的值至通过荧光染料m的基函数X_m(x₁)乘以比率a_m所获得的值的总和y(x₁)。而且，荧光染料1至m的荧光到光检测器x₁的泄漏比率a_k(k＝1至m)分别对应于荧光染料1至m的荧光强度。

通过利用接下来将要描述的线性最小二乘法获得泄漏比率a_k而获得由表达式(4)表示的近似曲线。泄漏比率a_k等于相应的一种荧光染料的真实荧光强度。

(1-2)线性最小二乘法

为了获得a_k，首先，定义由表达式(5)表示的评价函数(x检验法(chi-square))。而且，获得这样的参数a_k(k＝1至m)，在此参数下，表达式(5)得到最小值。

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2...\left(5\right)$

其中σ_i表示来自第i个光检测器的测量值的权重的倒数。在这种情况下，权重的倒数，例如，可以是第i个光检测器的测量误差方差。如果没有权重的倒数，则所有σ_i可以设置为1。

(1-2-1)法方程

接着，定义由通过表达式(6)表示的要素组成的(N x M)矩阵A(参照图2)，以及具有长度N的向量b(表达式(7))，而其中M个参数a₁至a_m获自应用的向量设定为a。

$A_{\mathrm{ij}}=\frac{X_j\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}...\left(6\right)$

$b_i=\frac{y_i}{{\mathrm{\σ}}_i}...\left(7\right)$

当通过M个参数a_k对χ²求微分获得的所有值变为零时，表达式(5)得到最小值。

$0=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{1}{{\mathrm{\σ}}_i^2}[y_i-\underset{i=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_j{X}_j\left(x_i\right)]\·X_j\left(x_i\right),k=1,...,M...\left(8\right)$

当改变用于获得总和的阶(order)时，可以将表达式(8)变换成表达式(9)，作为矩阵方程(法方程)：

$\underset{j=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_{\mathrm{kj}}{a}_j={\mathrm{\β}}_k...\left(9\right)$

其中[a_kj]表示矩阵(M x N)，而[β_k]表示具有长度M的向量。

$a_{\mathrm{kj}}=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{X_j\left(x_i\right)\·X_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i^2}$ 即，[α]＝A^T·A...(10)

${\mathrm{\β}}_k=\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}\frac{y_i\·X_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i^2}$ 即，[β]＝A^T·b...(11)

因此，当以矩阵形式来表示上述表达式(8)时，获得以下表达式(12)。

[α]·a＝[β]或(A^T·A)·a＝A^T· b...(12)

表达式(12)是具有M个未知数的联立线性方程(simultaneous linearequation)，因此可以通过求解表达式(12)而获得a_j。

(1-2-2)奇异值分解

代替利用使用上述法方程的方法，还可以通过利用奇异值分解而获得其中a₁至a_m作为M个参数的向量。

奇异值分解(SVD)基于线性代数的定理，其中任意(N×M)矩阵A被写成三个矩阵(U、W以及V^T)的积的形式(参见表达式(13))。矩阵U是(N×M)列正交矩阵，矩阵W是(M×M)对角矩阵(对角分量w_i是非负的并且称作奇异值)，矩阵V^T是(M×M)正交矩阵V的转置(对换，transposition)。另外，矩阵U和V是正交矩阵。在这种情况下，各个列彼此正交(参见表达式(14))。

$\left(U^T\right)\·\left(U\right)=\left(V^T\right)\·\left(V\right)=\left(1\right)...\left(14\right)$

可以将上述表达式(5)改写为表达式(15)：

x²＝|A·a-b|²...(15)

当对矩阵A经受奇异值分解以获得如上述表达式(13)的矩阵U、W以及V时，从表达式(16)获得使表达式(15)最小的向量a。这种运算称作回代(backward substitution)。如果在w_i中存在足够小的值，则用0代替1/w_i并进行处理。

a＝V·[diag(1/w_j)]·(U^T·b)...(16)

2.荧光强度计算方法

接下来，将描述根据本发明的第二种实施方式的荧光强度计算方法，其中应用上述第一种实施方式的荧光强度校正方法。

(2-1)标记

首先，用多种荧光染料标记作为测量目标的微粒。通常通过将荧光标记的抗体偶联至存在于微粒表面上的分子来进行荧光染料的标记。虽然并不特别限制荧光染料，但是例如，可以给出藻红蛋白(PE)、FITC、PE-Cy5、PE-Cy7、PE-德克萨斯红、别藻蓝蛋白(allophycocyanin)(APC)、APC-Cy7、溴化乙啶(ethidium bromide)、碘化丙啶(propidium iodide)、烟酸己可碱(hoechst)33258/33342、DAPI、吖啶橙(acridine orange)、色霉素(chromomycin)、光神霉素(mithramycin)、橄榄霉素(olivomycin)、派洛宁Y(pyronin Y)、噻唑橙(thiazole orange)、异硫氰酸罗丹明101(rhodamine 101 isothiocyanate)、BCECF、BCECF-AM、C.SNARF-1、C.SNARF-1-AMA、水母发光蛋白(aequorin)、Indo-1、Indo-1-AM、Fluo-3、Fluo-3-AM、Fura-2、Fura-2-AM、Oxonol、德克萨斯红、若丹明123、10-N-壬基-吖啶橙、荧光素、二乙酸荧光素、羧基荧光素、二乙酸羧基荧光素、羧基二氯荧光素(carboxydichlorofluorescein)、二乙酸羧基二氯荧光素等。

(2-2)测量

通过利用多色测量装置来测量用荧光染料标记的微粒，在该多色测量装置中设置有对应于不同的接收光波长带(受光波长带，received lightwavelength band)并且其数量大于荧光染料的数量的光检测器。而且，收集从各个光检测器获得的检测值以获得测定光谱。可以类似于通常实施的方法的情形，进行移动操作。

(2-3)荧光强度计算

按照上述方法，基于单染色光谱的线性总和来近似测定光谱，从而计算由各个荧光染料产生的真实荧光强度。这时，当光检测器中的测量误差方差不清楚时，表达式(5)中的所有σ_i可以设置为1。无论什么时候进行测量都可以通过制备用荧光染料单个标记的样品来获得单染色光谱，或者可以利用之前已存储数据的标准光谱。

3.荧光强度计算装置

类似于现有的流式细胞仪等的情形，根据本发明的第三种实施方式的荧光强度计算装置由流体系统、光学系统、分类系统(分选系统，sortingsystem)、数据处理系统等构成。

流体系统用来使其中包含微粒(作为测量的目标)的样品液体流动到流动池(flow cell)中的鞘液(sheath liquid)的层流中心，从而将微粒布置在流动池内的一条线上的部分。代替使用流动池，微粒可以布置在在微芯片上形成的流路中的一条线上。

光学系统是测量部，用于通过光检测器接收产生自通过对用荧光染料标记的微粒照射光而激发的荧光染料的荧光，并从各个光检测器收集检测值，从而获得测定光谱。借助于该光学系统，还可以检测散射光如前向散射光、侧向散射光、瑞利散射光(Rayleigh scattered light)、或米氏散射光(Mie scattered light)。具体地，该光学系统由激光光源、照射系统以及检测系统构成。在这种情况下，照射系统由聚光透镜(condensing lens)和分色镜(二向色镜，dichroic mirror)(用于将激光束聚光和照射到微粒)、带通滤波器(band-pass filter)等构成。而且，该检测系统检测通过对微粒照射激光束而从微粒产生的荧光和散射光。检测系统，例如，由光电倍增管(PMT)、面积摄像元件如CCD或CMOS元件等构成。而且，将分别对应于不同的接收光波长带的光检测器设置在该检测系统中。

当需要对微粒进行分类时，将样品液体作为其中包含各种微粒的液滴喷射到流动池外部的空间，并且控制这些液滴的移动方向，从而将具有期望特性的微粒进行分类。分类系统由振动元件如压电元件、充电部、成对电极等构成。在这种情况下，振动元件将样品液体变成液滴并从流动池释放液滴。充电部使喷射的液滴带有电荷。而且，成对电极设置成通过移动的液滴沿着液滴的移动方向彼此面对。

将检测值作为来自光检测器的电信号输入到数据处理系统。基于该电信号，数据处理系统分析微粒的光学特性。而且，根据上述方法，基于单染色光谱的线性总和，该数据处理系统对通过从各个光检测器收集的检测值而获得的测定光谱进行近似，从而计算由各种荧光染料产生的真实荧光强度。为此，数据处理系统具有记录介质，如硬盘，用于在其中存储程序，用于执行以上描述的根据本发明的第二种实施方式的荧光强度计算方法的步骤；用于执行上述程序的CPU；存储器等。

实施例1

通过使用逆矩阵的现有荧光校正方法和根据本发明的第一种实施方式的荧光校正方法，处理从利用用于商购流式细胞仪的阳性过程对照(全血对照样本)(Immuno-Trol，Beckman-Coulter，Inc.)进行分析所获得的测量数据。而且，对处理结果进行比较和考察。

根据附带文献，通过使用4种荧光试剂FITC、PE、PE-TR和PE-Cy5进行Immuno-Trol的标记。图3A至3D分别是当将门(gate)施加于细胞组时所获得的PE-PE-TR二维标图，其中该细胞组在FITC-SSC二维标图中似乎可能是淋巴细胞。

图3A是当测量PE单染色光谱时具有峰值的PMT(CH15)描绘在横坐标轴上，并且当测量PE-TR单染色光谱谱时具有峰值的PMT(CH19)描绘在纵坐标轴上的二维标图。而且，图3A对应于在进行荧光校正之前的标图。

图3B是通过利用逆矩阵方法作为现有技术来执行荧光校正处理所获得的标图。图3C是通过利用最小二乘法(法方程)来执行荧光校正处理所获得的标图。而且，图3D是通过利用最小二乘法(SVD方法)来执行荧光校正处理所获得的标图。

分别在图3A至3D中所示的每个标图中，根据其来评价细胞组之间的分开的对错的指数定义如下。也就是说，在每个标图中，取对数，并相对于PE阳性细胞组和PE-TR阳性细胞组获得中心坐标和标准偏差。而且，相互中心到中心的距离取为D，以及两个标准偏差分别取为σ₁和σ₂(参照图4)。而且，数学公式(D-σ₁-σ₂)/D”形成表示细胞组之间的分开的指数。该指数是指，当指数的数值更大时，细胞组之间的分开是良好的并且荧光校正处理的性能是有利的。

在图3A至3D中所示的在PE-TR-PE二维标图、PE-Cy5-PE二维标图、以及PE-Cy5-PE-TR二维标图中的指数概括在“表1”中。

表1

在所有二维标图中，在通过基于最小二乘法(法方程或SVD方法)执行荧光校正处理所获得的标图中的指数具有比通过基于逆矩阵方法执行荧光校正处理并所获得的标图中更大的值。作为结果，可以确认，根据本发明的第一种实施方式的荧光校正方法提供了细胞组之间的有利分开。

另外，图5A至5K、以及图6A至6K分别示出了二维标图，其是假设使用了12种荧光试剂FITC、Alexa 500、Alexa 514、Alexa 532、PE、PE-TR、PI、Alexa 600、PE-Cy5、PerCP、PerCP-Cy5.5、以及PE-Cy7，通过处理基于其随机产生其中包含噪声的光谱波形的模拟数据所获得的并。在图5A至5K、以及图6A至6K中，所有FITC描绘在横坐标轴上，并且记载在每个图上侧的荧光染料描绘在纵坐标轴上。在图4中所示的图示的情况下，通过使用利用逆矩阵方法作为现有方法的方法来进行荧光校正。而且，在图5A至5K中所示的图示的情况下，通过使用本发明实施方式的利用最小二乘法的方法进行荧光校正。应当明了，虽然存在在逆矩阵方法的情况下不能分开的一些标图，但在本发明实施方式的情况下，可以满意地分开所有标图。

实施例2

通过使用利用最小二乘法的荧光强度校正方法来处理其中包含无效值的测量数据、以及其中排除了无效检测值的测量数据。而且，对处理结果进行比较和考察。

图7示出测定光谱的实例，其各自中包含无效检测值。

通过测量关于AF488、PE、PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、PI、APC、以及APC-Cy7的7种单染色光谱而获得图7中所示的曲线。在这种情况下，将7种单染色光谱都归一化，以使它们的每个峰值变成1。在图7中，横坐标轴表示PMT，而纵坐标轴表示检测值。而且，通过照射488nm激光束形成的激发而获得的荧光光谱的检测值在488Ch1至488Ch32中指示，以及通过照射640nm激光束形成的激发而获得的荧光光谱的检测值在640Ch1至640Ch32中指示。

虽然关于通过辐射640nm激光束而激发的荧光染料，有PerCP-Cy5.5、PE-Cy7、APC、以及APC-Cy7，但已知的是，那些荧光染料任一种在理论上并不产生具有通过检测器640Ch1至640Ch20感测到的波长的荧光。另外，通过照射640nm激光束根本不会激发AF488、PE以及PI中的任一种。因此，在640Ch1至640Ch20中出现的波长是噪声，因而是无效检测值。图8示出了其各自中排除了这些无效检测值的光谱。

图9是曲线图，示出了通过使用利用最小二乘法的荧光强度校正方法来处理图7和8中所示的光谱所获得的结果，从而比较分开的对与错。在图9中，“所有通道”表示通过处理其中包含无效检测值的测量数据所获得的结果。而且，“Cut Ch1-20”表示通过处理排除了无效检测值的数据所获得的结果。应当明了，从检测值，由640Ch1至640Ch20指示，由于无效检测值从该测量数据排除，因而，特别是，APC-Cy7的分开变好。

根据本发明的实施方式的荧光强度校正方法、荧光强度计算方法、以及荧光强度计算装置，当通过利用多个光检测器对用多种荧光染料标记的微粒进行多色测量时，可有效利用获自所有光检测器的测量数据而不取决于荧光染料的数量，从而使得可以精确计算来自各个荧光染料的荧光强度。因此，本发明的实施方式的荧光强度校正方法、荧光强度计算方法、以及荧光强度计算装置可以有助于更详细地分析微粒如细胞的特性。

本申请包含与于2010年4月28日向日本专利局提交的日本优先权专利申请JP 2010-104566中披露的主题有关的主题将其全部内容以引用方式结合于本文。

本领域技术人员应当明了，根据设计要求和其它因素，可以发生各种更改、组合、子组合以及变形，只要它们在所附权利要求或其等同替换的范围内。

Claims (11)

1.一种荧光强度校正方法，包括以下步骤：

通过光检测器来接收荧光，所述荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，其中所述多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且其中所述光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且所述光检测器的数量大于所述荧光染料的数量；以及

基于从用所述荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和，对通过从所述多个光检测器收集检测值而获得的测定光谱进行近似。

2.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，基于所述单染色光谱的线性总和的所述测定光谱的近似通过利用最小二乘法进行。

3.根据权利要求2所述的荧光强度校正方法，其中，获得参数a_k(k＝1至m)，从而分别计算由所述荧光染料产生的荧光的强度，在所述参数a_k下，由以下表达式表示的评价函数得到最小值：

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中，X_k(x_i)表示在第k个荧光染料的单染色光谱中的来自第i个光检测器的检测值，y_i表示在所述测定光谱中的来自第i个光检测器的检测值，而σ_i表示来自第i个光检测器的测量值的权重的倒数。

4.根据权利要求3所述的荧光强度校正方法，其中，通过利用法方程或奇异值分解而获得所述参数a_k。

5.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，当所述检测值中包含无效值时，排除所述无效值，并通过利用最小二乘法进行基于所述单染色光谱的线性总和的所述测定光谱的近似。

6.根据权利要求5所述的荧光强度校正方法，其中，获得参数a_k(k＝1至m)，从而计算由各个荧光染料产生的荧光的强度，在所述参数a_k下，由以下表达式表示的评价函数得到最小值：

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N_i}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中，X_k(x_i)表示在第k个荧光染料的单染色光谱中的来自第i个光检测器的检测值，y_i表示在所述测定光谱中的来自第i个光检测器的检测值，σ_i表示来自第i个光检测器的测量值的权重的倒数，无效检测值被取为y_i(i＝“N₁+1”至N)，而有效检测值被取为y_i(i＝1至N₁)。

7.根据权利要求5所述的荧光强度校正方法，其中，获得参数a_k(k＝1至m)，从而计算由各个荧光染料产生的荧光的强度，在所述参数a_k下，由以下表达式表示的评价函数得到最小值：

X′_k(x_i)＝X_k(x_i)  (k＝1～M、i＝1～N₁)

X′_k(x_i)＝0       (k＝1～M、i＝N₁+1～N)

${\mathrm{\χ}}^2\≡\underset{i=1}{\overset{N}{\mathrm{\Σ}}}{\left[\frac{y_i-\underset{k=1}{\overset{M}{\mathrm{\Σ}}}{a}_k{X^{\′}}_k\left(x_i\right)}{{\mathrm{\σ}}_i}\right]}^2$

其中，X_k(x_i)表示在第k个荧光染料的单染色光谱中的来自第i个光检测器的检测值，y_i表示在所述测定光谱中的来自第i个光检测器的检测值，σ_i表示来自第i个光检测器的测量值的权重的倒数，无效检测值取为y_i(i＝“N₁+1”至N)，而有效检测值取为y_i(i＝1至N₁)。

8.根据权利要求1所述的荧光强度校正方法，其中，所述微粒是细胞。

9.一种荧光强度计算方法，包括以下步骤：

通过光检测器来接收荧光，所述荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，并通过从所述光检测器收集检测值而获得测定光谱，其中所述多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且其中所述光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且所述光检测器的数量大于所述荧光染料的数量；以及

基于从用所述荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和，对所述测定光谱进行近似，从而分别计算从所述荧光染料产生的荧光的强度。

10.一种荧光强度计算装置，包括：

测量装置，用于通过光检测器来接收荧光，所述荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，并通过从所述光检测器收集检测值而获得测定光谱，其中所述多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且其中所述光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且所述光检测器的数量大于所述荧光染料的数目；以及

计算装置，用于基于从用所述荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和，对所述测定光谱进行近似，从而分别计算从所述荧光染料产生的荧光的强度。

11.一种荧光强度计算装置，包括：

测量部，所述测量部被构造成通过光检测器来接收荧光，所述荧光由通过对用多个荧光染料多重标记的微粒照射光而激发的所述多个荧光染料产生，并通过从所述光检测器收集检测值而获得测定光谱，其中所述多个荧光染料具有彼此重叠的荧光波长带，并且其中所述光检测器分别对应于不同的接收光波长带，并且所述光检测器的数量大于所述荧光染料的数量；以及

计算部，所述计算部被构造成基于从用所述荧光染料单个标记的微粒获得的单染色光谱的线性总和，对所述测定光谱进行近似，从而分别计算从所述荧光染料产生的荧光的强度。

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