JPH08178849A - 蛍光測光装置および蛍光測光方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【目的】この発明の目的は、簡易で安価な構成により試
料の蛍光を正確に測光できる蛍光測光装置および蛍光測
光方法を提供することにある。 【構成】蛍光顕微鏡装置１は、光源６と、光源６からの
励起光の光路上に配置された励起フィルター８と、試料
１０からの蛍光の光路上に配置された蛍光フィルター２
６と、蛍光フィルター２６を通過した蛍光を測光する単
一のフォトマル３０と、を備えている。被検査物質を含
む試料には、予め蛍光指示薬が投与されている。光源６
からの励起光は、蛍光指示薬の励起波長を選択的に通過
する励起フィルター８を介して試料１０に照射される。
試料１０からの蛍光は、蛍光指示薬の等蛍光波長または
ピーク波長を選択する蛍光フィルター２６を介してフォ
トマル３０により蛍光強度が測定される。定量装置４０
は、２つの蛍光強度の比を算出し、この比を既知の蛍光
特性と比較して被検査物質の濃度を定量する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】この発明は、試料からの蛍光を測
光する蛍光測光装置および蛍光測光方法に係り、特に、
異なる２つの波長を有する蛍光の蛍光強度の比から試料
に含まれる被検査物質の濃度を定量する蛍光測光装置お
よび蛍光測光方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】例えば、細胞内のカルシウムイオン濃度
を定量する際、細胞に所定の蛍光指示薬（Ｉｎｄｏ−
１、Ｆｕｒａ−２等）を投与して、その細胞に励起光
（３４０ｎｍ）を照射すると、その細胞の蛍光像がカル
シウムイオン濃度に応じた蛍光スペクトルを有する光を
発することが知られている。この蛍光スペクトルの任意
の２波長間の比は細胞内に含まれるカルシウムイオン濃
度に応じた値となる。そこで上記蛍光像を２波長測光し
て２波長間の蛍光強度の比を求めることにより、細胞内
のカルシウムイオン濃度を定量することができる。

【０００３】このように、蛍光像を２波長測光する装置
として、例えば図６に示す蛍光顕微鏡装置５１が知られ
ている。この蛍光顕微鏡装置５１は、光源５２からの光
を励起フィルター５４、ダイクロイックミラー５６を介
して試料６０に照射し、その試料６０からの蛍光をダイ
クロイックミラー５６、ハーフミラー５８を介して光分
割プレート６２に伝搬している。光分割プレート６２で
分割された一方の光を吸収フィルター６４を介してフォ
トマル６５で検出し、もう一方の光を吸収フィルター６
４と異なる透過波長域を持つ吸収フィルター６６を介し
てフォトマル６７で検出している。

【０００４】２つのフォトマル６５、６７の各々で検出
された各波長の蛍光強度は、定量装置７０に入力されて
互いの蛍光強度の比が算出され、この強度比がカルシウ
ムイオン濃度に応じた既知の蛍光強度特性と照合されて
カルシウムイオン濃度が定量されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、従来の
装置においては、２波長同時測光を実行するために２つ
のフォトマルが必要であり、装置が大型になる問題があ
る。また、比較的高価なフォトマルを２つ設ける必要が
あることから装置が高価になる問題がある。

【０００６】また、２つのフォトマルは、互いの感度が
同じになるように感度を調整する必要があるため、感度
の調整に手間がかかり面倒である。更に、フォトマルの
感度は、周辺温度等の環境の変化に影響されやすく、測
光の途中で２つのフォトマルの感度に相対的なずれを生
じる場合がある。この場合、正確な測光が困難となる。

【０００７】この発明は、以上の点に鑑みなされたもの
で、その目的は、簡易で安価な構成により試料の蛍光を
正確に測光できる蛍光測光装置および蛍光測光方法を提
供することにある。

【０００８】

【課題を解決するための手段】上記目的を達成するた
め、この発明に係る蛍光測光装置は、被検査物質を含む
試料からの蛍光を測光する蛍光測光装置において、上記
被検査物質に作用すべく上記試料に投与された蛍光指示
薬の励起波長を有する励起光を上記試料に照射する照射
手段と、上記励起光により励起された試料から発せられ
る蛍光の光路上に配置され、上記蛍光指示薬の等蛍光波
長または所定波長を択一的に選択し、この２つの波長を
有する蛍光を選択的に通過する波長選択手段と、上記波
長選択手段により選択された蛍光の蛍光強度を測定する
単一の測光手段と、この測光手段により測定された２つ
の蛍光強度の比を算出するとともに、この比を既知の蛍
光強度特性に照合して上記被検査物質の濃度を定量する
定量手段と、を備えている。

【０００９】また、この発明に係る蛍光測光方法は、被
検査物質を含む試料に対して該被検査物質に作用する蛍
光指示薬を投与する工程と、上記蛍光指示薬の励起波長
を有する励起光を上記試料に照射する工程と、上記励起
光の照射により励起された試料から発せられる蛍光を単
一の測光装置により測光する工程と、上記測光する工程
は、測光の最初と最後において上記蛍光指示薬の等蛍光
波長における上記蛍光の蛍光強度を測光し、且つ測光の
中間において所定の波長における上記蛍光の蛍光強度を
測光し、上記等蛍光波長における蛍光強度と上記所定の
波長における蛍光強度との比を算出するとともに、この
比を既知の蛍光強度特性に照合して上記被検査物質の濃
度を定量する工程と、を備えている。

【００１０】

【作用】この発明に係る蛍光測光装置および蛍光測光方
法によれば、試料に含まれる被検査物質の励起波長を有
する励起光を照射手段により試料に照射する。この励起
光により励起された試料は、試料中の被検査物質の濃度
に応じた蛍光スペクトルを発する。そして、この蛍光ス
ペクトルの蛍光強度を測光手段により測光する。

【００１１】測光手段に向かう蛍光の光路上に設けられ
た波長選択手段は、蛍光指示薬の等蛍光波長または所定
の波長を択一的に選択する機能を有している。測光の最
初と最後において、波長選択手段が蛍光指示薬の等蛍光
波長を選択し、測光手段がこの波長における蛍光の蛍光
強度を測定する。測光の中間において、波長選択手段が
所定の波長、例えば蛍光指示薬が被検査物質と結合した
際の蛍光スペクトルのピーク強度を示す波長を選択し、
測光手段がこの波長における蛍光の蛍光強度を測定す
る。

【００１２】測定された２波長における蛍光強度は定量
手段に入力され、ここで両者の間の蛍光強度の比が算出
されるとともに、この蛍光強度の比が試料の既知の蛍光
強度特性に照合され、試料に含まれる被検査物質の濃度
が定量される。

【００１３】

【実施例】以下、図面を参照しながらこの発明の実施例
について詳細に説明する。図１および図２に示すよう
に、この発明の一実施例に係る蛍光測光装置、つまり、
蛍光顕微鏡装置１は、机上に載置されるベース部２ａと
ベース部２ａの一端から上方に延出するアーム部２ｂと
から構成された本体２を備えている。本体２の上部に
は、横方向に延びた投光管４が設けられ、投光管４の一
端側には落射照明用光源６が設けられている。

【００１４】投光管４内であって光源６からの励起光の
光路上には、励起フィルター８が設けられている。この
励起フィルター８は、試料１０に投与される後述する蛍
光指示薬の励起波長を有する励起光のみを選択的に通過
する機能を有し、使用する蛍光指示薬の種類に応じて交
換可能に光路上に配置されている。光源６および励起フ
ィルター８により、照射手段を構成している。

【００１５】励起フィルター８の下流側には、ダイクロ
イックミラー１２が設けられ、ダイクロイックミラー１
２により略垂直下方に折り曲げられた光路には対物レン
ズ１４が設けられている。また、本体部２は、対物レン
ズ１４の光軸に沿って試料１０を移動可能に載置するス
テージ１１を備えている。

【００１６】対物レンズ１４の上方には、鏡筒２０、お
よび波長切り替え部２５を介して測光手段としての単一
のフォトマル３０が設けられている。鏡筒２０内には、
ハーフミラー２１が設けられており、試料１０からの蛍
光の一部を鏡筒２０に接続された接眼部２２に導くよう
になっている。波長切り替え部２５内には、試料１０か
らの蛍光の所定波長成分のみを透過する波長選択手段と
しての蛍光フィルター２６が設けられている。この蛍光
フィルター２６は、試料１０に投与される蛍光指示薬の
等蛍光波長の蛍光を選択的に通過する吸収フィルター２
６ａと、蛍光指示薬が試料１０内の被検査物質と結合し
た場合の蛍光のピークを選択的に通過する吸収フィルタ
ー２６ｂと、を備えている。これらのフィルター２６
ａ、２６ｂは、いずれも蛍光の光路上に挿脱可能且つ他
のフィルターと交換可能に設けられている。

【００１７】フォトマル３０は、２つの波長に関する蛍
光強度の比を算出するとともにこの比に基づいてカルシ
ウムイオンの濃度を定量する定量手段としての定量装置
３２に接続されている。

【００１８】以上のように構成された蛍光顕微鏡装置１
を用いて試料中の被検査物質の濃度を定量する方法につ
いて図３を用いて説明する。ここでは、特に、試料とし
ての細胞に含まれるカルシウムイオン濃度を定量する方
法を例にとって説明する。

【００１９】まず、検査対象となる細胞に所定の蛍光指
示薬を投与する（ステップ４１）。この蛍光指示薬（例
えば、Ｉｎｄｏ−１）は、細胞内のカルシウムイオンと
結合して細胞から発せられる蛍光スペクトルをシフトす
る機能を有している。

【００２０】そして、励起フィルター８により、光源６
からの励起光のうち蛍光指示薬の励起波長（３４０ｎ
ｍ）を有する励起光のみを選択的に通過して、ダイクロ
イックミラー１２および対物レンズ１４を介してこの励
起光を細胞に照射する（ステップ４２）。これにより、
励起された細胞から蛍光指示薬によりシフトされた蛍光
スペクトルを有する光が発せられる。

【００２１】蛍光を測光する場合、まず初めに、蛍光の
光路上に蛍光指示薬の等蛍光波長（４５５ｎｍ）のみを
通過する吸収フィルター２６ａを配置する。そして、フ
ォトマル３０により蛍光の蛍光強度Ｓ０を測定する（ス
テップ４３）。

【００２２】次に、蛍光の光路上に所定波長、即ち蛍光
指示薬がカルシウムイオンと結合した際の蛍光のピーク
強度を示す波長（４０５ｎｍ）のみを通過する吸収フィ
ルター２６ｂを配置する。そして、フォトマル３０によ
り蛍光の蛍光強度Ｓ１を測定する（ステップ４４）。

【００２３】測光の最後に、蛍光の光路上に吸収フィル
ター２６ａを再び配置して、フォトマル３０により蛍光
の蛍光強度Ｓ０´を測定する（ステップ４５）。この蛍
光強度Ｓ０´は、ステップ４３において測定された蛍光
強度Ｓ０を補正するために用いられる。

【００２４】そして、フォトマル３０により測定された
蛍光強度Ｓ０および蛍光強度Ｓ１は、カルシウムイオン
濃度を定量する定量装置３２に入力されて強度比Ｓ１／
Ｓ０が算出される（ステップ４６）。ステップ４６にお
いて算出された強度比Ｓ１／Ｓ０は、カルシウムイオン
を含む細胞の既知の蛍光強度特性と比較され、或いは既
知の変換式に入力され、カルシウムイオン濃度が定量さ
れる（ステップ４７）。

【００２５】以上のように、この発明の蛍光顕微鏡装置
は、単一のフォトマルを用いて蛍光を測光することか
ら、従来の装置と比較して装置を小型化できるとともに
装置コストを安価にできる。また、単一のフォトマルを
用いることにより、フォトマルの感度調整が容易にな
り、従来の装置のように測光中に互いの感度に相対的な
ずれを生じる問題がなく、正確な測光が可能となる。

【００２６】また、この発明の測光方法によれば、測光
の最初と最後で蛍光強度Ｓ０、Ｓ０´を測光し、測光の
途中で蛍光強度Ｓ１を測光している。このため、測光の
度に測光波長を切り替えることなく２波長測光が可能と
なり、波長選択に要する時間を短縮でき、カルシウムイ
オンの経時的な変化に対応した迅速な測光が可能とな
る。

【００２７】次に、この発明の変形例について図４およ
び図５を用いて説明する。尚、基本的な構成は上記実施
例と同じであるので、同一の部分については同一符号を
用いて説明を省略し、異なる部分についてのみ説明す
る。

【００２８】図４および図５に示すように、蛍光顕微鏡
装置１０１は、光源６と投光管４との間に励起光の波長
を選択的に切り替えるための励起波長選択装置１２５を
備えている。この励起波長選択装置１２５としては、分
光器や連続干渉フィルター、または任意の角度を選択し
て透過波長を変化する機能を備えた干渉フィルター等が
あり、光源からの励起光のうち所望の波長を有する励起
光のみを透過できる機能を有している。尚、上述した実
施例において蛍光の光路上に設けられていた波長切り替
え部２５は、取り外されている。

【００２９】このように構成された装置を用いて、細胞
内のカルシウムイオン濃度を定量する。この場合、カル
シウムイオン濃度の定量に先立って、蛍光指示薬として
のＦｕｒａ−２の等蛍光波長を確定する。

【００３０】まず、異なるカルシウムイオン濃度を有す
る試料（溶液）を２種類用意し、この２種類の溶液にそ
れぞれＦｕｒａ−２を投与する。そして、これら濃度の
異なる溶液を交互に蛍光顕微鏡装置１０１に配置して、
それぞれ３６０ｎｍの励起光を照射する。励起された溶
液から得られる蛍光スペクトルをそれぞれグラフ化し、
両者の交点からＦｕｒａ−２の等蛍光波長を確定する。

【００３１】次に、励起波長選択装置１２５の選択波長
をこの確定された等蛍光波長と一致するように調整し、
カルシウムイオン濃度を測定する細胞を蛍光顕微鏡装置
１０１にセットする。そして、細胞に励起光を照射して
細胞から反射される蛍光の強度をフォトマル３０により
測光する。

【００３２】この蛍光強度は、定量装置３２に入力さ
れ、既知の蛍光強度特性値と比較されて細胞のカルシウ
ムイオン濃度が定量される。以上のように、等蛍光波長
を確定した後にこの等蛍光波長を有する励起光を試料に
照射し、試料からの蛍光を測光することにより、より確
実な測光が可能となり、正確な定量が実施できる。尚、
この発明は、上述した実施例に限定されるものではな
く、発明の範囲を超えることなく種々変形可能である。

【００３３】

【発明の効果】以上説明したように、この発明の蛍光測
光装置は、上記のような構成および作用を有しているの
で、比較的高価とされている測光装置（フォトマル）の
数を減少できる、このことから、装置を比較的小型に構
成できるとともに装置コストを安価にできる。

【００３４】また、従来の装置のように複数の測光装置
を設ける必要がないことから、測光装置同士の感度を一
致させるように互いの感度を調整する必要がなく、感度
調整の手間が省ける。更に、測光の途中で各測光装置の
感度が相対的にずれる問題を解消することができ、より
正確な測光が可能となる。

【００３５】更にまた、測光の最初と最後に蛍光指示薬
の等蛍光波長を有する蛍光の蛍光強度を測定し、測光の
中間において蛍光のピーク強度を測定することから、蛍
光フィルターの切り替えに要する時間を削減でき、カル
シウムイオンの経時的変化に対応した迅速な測光が可能
となる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、この発明の実施例に係る蛍光顕微鏡装
置を示す概略図。

【図２】図２は、図１の蛍光顕微鏡装置の装置構成を示
すブロック図。

【図３】図３は、図１の蛍光顕微鏡装置を用いたカルシ
ウムイオン濃度の定量動作を示す図。

【図４】図４は、この発明の蛍光顕微鏡装置の変形例を
示す概略図。

【図５】図５は、図４の蛍光顕微鏡装置の装置構成を示
すブロック図。

【図６】図６は、従来の蛍光顕微鏡装置を示す概略図。

【符号の説明】

１…蛍光顕微鏡装置、６…光源、８…励起フィルター、
１０…試料、１２…ダイクロイックミラー、１４…対物
レンズ、２６…蛍光フィルター、３０…フォトマル、４
０…濃度定量装置。

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 被検査物質を含む試料からの蛍光を測光
   する蛍光測光装置において、 上記被検査物質に作用すべく上記試料に投与された蛍光
   指示薬の励起波長を有する励起光を上記試料に照射する
   照射手段と、 上記励起光により励起された試料から発せられる蛍光の
   光路上に配置され、上記蛍光指示薬の等蛍光波長または
   所定波長を択一的に選択し、この２つの波長を有する蛍
   光を選択的に通過する波長選択手段と、 上記波長選択手段により選択された蛍光の蛍光強度を測
   定する単一の測光手段と、 この測光手段により測定された２つの蛍光強度の比を算
   出するとともに、この比を既知の蛍光強度特性に照合し
   て上記被検査物質の濃度を定量する定量手段と、 を備えていることを特徴とする蛍光測光装置。
2. 【請求項２】 被検査物質を含む試料に対して該被検査
   物質に作用する蛍光指示薬を投与する工程と、 上記蛍光指示薬の励起波長を有する励起光を上記試料に
   照射する工程と、 上記励起光の照射により励起された試料から発せられる
   蛍光を単一の測光装置により測光する工程と、 上記測光する工程は、測光の最初と最後において上記蛍
   光指示薬の等蛍光波長における上記蛍光の蛍光強度を測
   光し、且つ測光の中間において所定の波長における上記
   蛍光の蛍光強度を測光し、 上記等蛍光波長における蛍光強度と上記所定の波長にお
   ける蛍光強度との比を算出するとともに、この比を既知
   の蛍光強度特性に照合して上記被検査物質の濃度を定量
   する工程と、 を備えていることを特徴とする蛍光測光方法。