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CN110725009A - 具有可供选择的结合表面的基于iii型纤连蛋白重复的蛋白质支架 - Google Patents

具有可供选择的结合表面的基于iii型纤连蛋白重复的蛋白质支架 Download PDF

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CN110725009A CN201911042902.0A CN201911042902A CN110725009A CN 110725009 A CN110725009 A CN 110725009A CN 201911042902 A CN201911042902 A CN 201911042902A CN 110725009 A CN110725009 A CN 110725009A
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Abstract

本发明涉及基于具有可供选择的结合表面设计的III型纤连蛋白（FN3）重复、编码蛋白质支架的分离的核酸、载体、宿主细胞的蛋白质支架和支架文库以及其制备方法用于产生治疗性分子以及疾病和病症的治疗和诊断。

Description

具有可供选择的结合表面的基于III型纤连蛋白重复的蛋白 质支架
本申请是申请日为2012年9月27日，申请号为201280046708.X，发明名称为“具有可供选择的结合表面的基于III型纤连蛋白重复的蛋白质支架”的发明专利的分案申请。
技术领域
本发明涉及具有可供选择的结合表面设计的基于III型纤连蛋白(FN3)重复的蛋白质支架和支架文库。更具体地，本发明涉及具有由挑选的β-链和环形成的凹型结合位点的FN3支架和文库。
背景技术
当需要对靶分子的高亲和力和特异性时，单克隆抗体是最广泛使用类型的治疗蛋白。然而，具有可被工程改造以结合期望的靶分子的相对确定的三维结构的非抗体蛋白质，通常称为蛋白质支架，因为它们的小尺寸、缺乏二硫键、高稳定性和能够在原核宿主中表达，故它们可能具有优于传统抗体的优点。这些支架通常含有可接受特异性或随机序列变异的一个或多个区域，并且经常进行这种序列随机化以产生从中可选择期望产物的蛋白质的文库。可容易地应用新型的纯化方法；支架容易与药物/毒素缀合，有效地渗透进组织并且可被设计为多特异性结合物(Binz和Pluckthun，Curr Opin Biotechnol，16，459-469，2005；Skerra，J Mol Recognit，13，167-187，2000)。
一种此类蛋白质支架是在多种蛋白质中鉴定的III型纤连蛋白(FN3)结构域，其具有其中6个环由7个β链连接的典型三级结构。三个环(具体地，FG、BC和DE环)在结构上类似于抗体的互补决定区(CDR)。这些环已被随机化来产生FN3结构域支架的文库以成功地选择许多不同靶标的特异性结合物而同时保留重要的生物物理特性(Getmanova等人，ChemBiol，13，549-556，2006；Hackel等人，J Mol Biol，381，1238-1252，2008；Karatan等人，Chem Biol，11，835-844，2004；Koide等人，J Mol Biol，284，1141-1151，1998；Koide等人，Proc Natl Acad Sci U S A，104，6632-6637，2007；Parker等人，Protein Eng Des Sel，-18，435-444，2005；Xu等人，Chemistry&Biology，9，933-942，2002)。也通过使AB、EF和CD环随机化而产生FN3结构域的文库(美国专利公布2011/0038866；国际专利公布WO2011/05133；美国专利公布2011/0124527)。对于FN3文库的其它参考文献包括国际专利公布WO2002/32925、WO2003/104418、WO2009/023184和WO2010/060095。国际专利公布WO2012/016245描述了使用CD和FG环连同β-折叠的表面暴露残基的FN3结构域。
有利的是获得用于治疗和诊断两种目的的改善的纤连蛋白结构域支架蛋白质。本公开提供此类改善的蛋白质。
发明内容
本发明的一个实施例是制备III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的文库的方法，所述文库具有由Cβ-链、CD环、Fβ-链和FG环形成的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括：提供具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽；通过使至少一个Cβ-链残基和至少一个Fβ-链残基突变来将多样性引入到参考FN3结构域多肽中以形成具有多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域文库。
本发明的另一个方面是由本文所述的本发明的方法制备的文库。
本发明的又一个方面是获得包含III型纤连蛋白模块(FN3)结构域的蛋白质支架的方法，所述蛋白质支架具有与靶分子特异性地结合的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括使权利要求11的文库与靶分子接触或用靶分子淘选权利要求11的文库，以及分离以预定亲和力与靶分子特异性地结合的蛋白质支架。
附图说明
图1示出FN3结构域和抗体VH结构域结构的条带图。标记出了在结构上与CDR类似的FN3结构域的环。
图2示出结构图，其使得在以下之间进行比较：A)具有随机化环的常规FN3文库(图2A)；B)具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3文库(TCL14文库)(图2B)；C)具有随机化A-AB-B-BC-E表面的FN3文库(TCL15文库)(图2C)。这些文库设计中被随机化的位置在条带图中被描绘为实心黑色。
图3示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面的TCL14文库(SEQ ID NO:28)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。
图4示出Tencon27支架(SEQ ID NO:27)和具有随机化A-AB-B-BC-E可供选择的表面的TCL15文库(SEQ ID NO:61)的序列比对。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。
图5示出对Tencon27(SEQ ID NO:27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面(TCN14文库)。将β-链描绘为箭头，其中在Tencon27结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描绘。
图6示出对Tencon27(SEQ ID NO:27)的文库设计的拓扑图，其具有随机化A-AB-B-BC-E可供选择的表面(TCL15文库)。将β-链描绘为箭头，其中在tencon结构中以氢键彼此键合的链的残基在图中相邻放置。随机化残基的位置用灰色阴影的椭圆形描绘。
图7示出在TCL14文库中随机化位置处预期的和观察到的氨基酸分布。
图8示出Tencon27、TCL14和对FN10、TN3和Fibcon的设计的文库的序列比对，所述Fibcon具有随机化C-CD-F-FG可供选择的表面。残基编号基于Tencon27序列。分别以SEQ IDNO:28、98、99和62示出文库的氨基酸序列。对环残基加框。在序列的上方指示特定环和β-链区域。
具体实施方式
如本文所用，术语“III型纤连蛋白模块(FN3)结构域”或“FN3结构域”指在蛋白质中频繁出现的结构域，所述蛋白质包括纤连蛋白、腱生蛋白、细胞内细胞骨架蛋白、细胞因子受体和原核酶(Bork和Doolittle，Proc Nat Acad Sci USA 89，8990-8994，1992；Meinke等人，J Bacteriol175，1910-1918，1993；Watanabe等人，J Biol Chem 265，15659-15665，1990)。示例性的FN3结构域(或模块)是存在于人腱生蛋白C中的15种不同的FN3结构域和存在于人纤连蛋白(FN)中的15种不同的FN3结构域。单独的FN3结构域通过结构域编号和蛋白质名称来表示，例如，腱生蛋白的第3FN3结构域(TN3)，或纤连蛋白的第10FN3结构域(FN10)。
如本文所用，术语“参考FN3结构域”指野生型或非天然存在的FN3结构域，其被用作其中可进行取代的模板以产生特异性地结合靶分子的蛋白质支架。
如本文所用，术语“可供选择的表面”指包含两个或多个β链和至少一个环的FN3结构域的一侧上的表面。示例性的可供选择的表面是由C和Fβ-链以及CD和FG环中的氨基酸形成的C-CD-F-FG表面，和由A、B和Eβ-链和BC环中的氨基酸形成的A-AB-B-BC-E表面。
如本文所用，术语“取代”或“取代的”或“突变”或“突变的”指在多肽或多核苷酸序列中改变、缺失或插入一个或多个氨基酸或核苷酸以产生该序列的变体。
如本文所用，术语“使随机化”或“随机化的”或“多样化的”或“使多样化”指在多核苷酸或多肽序列中进行至少一处取代、插入或缺失。
如本文所用“变体”指不同于参考多肽或参考多核苷酸一处或多处修改，例如取代、插入或缺失的多肽或多核苷酸。
如本文所用，术语“特异性地结合”或“特异性结合”指如通过表面等离子共振所测量，本发明的FN3结构域以至少为1x10-6M的亲和力(Kd)结合靶分子，和/或以比其对非特异性抗原(例如BSA或酪蛋白)的亲和力大至少10倍的亲和力结合靶分子的能力。
如本文所用，术语“靶分子”指具有被本发明的FN3结构域识别的抗原或表位的蛋白质、肽、碳水化合物、脂质等。该靶分子可为天然或非天然存在的。
术语“文库”是指变体的集合。文库可由多肽或多核苷酸变体组成。
如本文所用，术语“腱生蛋白C”指具有GenBank登录号NP_002151和SEQ ID NO:57示出的序列的人腱生蛋白C。腱生蛋白C具有15个串联的FN3结构域，所述串联的FN3结构域具有SEQ ID NO:1-15中分别示出的氨基酸序列。腱生蛋白C的第3FN3结构域(TN3)的氨基酸序列以SEQ ID NO:3示出。
如本文所用，术语“稳定性”指在生理条件下分子保持折叠状态以便其保持至少一种其正常功能活性例如结合靶分子的能力。
本发明提供特异性地结合靶分子并因而可广泛用于治疗和诊断应用的FN3结构域。本发明基于这样的发现：位于包含两条或多条β-链和至少一个环的FN3结构域一侧的可供选择的表面可被随机化以产生和选择以高亲和力特异性地结合靶分子的蛋白质支架。已通过使顶部或底部环、在结构上与抗体可变链中的CDR类似的区域多样化来产生基于FN3的结构域文库，从而提供弯曲的结合表面。在本发明中，高亲和力结合分子选自FN3结构域文库，所述FN3结构域文库展示通过使可供选择的表面随机化而产生的凹型相互作用表面；因而可能增加了针对其可选择高亲和力结合蛋白支架的表位和靶标的数目。本发明提供编码所述蛋白质结构域的多核苷酸或其互补核酸、载体、宿主细胞以及制备和使用它们的方法。本发明提供制备FN3结构域的文库的方法，以及通过本发明的方法制备的文库。
III型纤连蛋白结构域
III型纤连蛋白(FN3)结构域(或模块)是最初在纤连蛋白中鉴定的原型重复结构域并且现在已知存在于各种动物蛋白质家族，包括细胞表面受体、细胞外基质蛋白、酶和肌肉蛋白。FN3结构域在结构上具有非常类似于免疫球蛋白样结构域的拓扑结构，不同的是缺乏二硫键。如本领域所已知，天然存在的FN3结构域具有β-夹心结构，其具有七个β-链，称为A、B、C、D、E、F和G，由六个环连接，称为AB、BC、CD、DE、EF和FG环(Bork和Doolittle，ProcNatl Acad Sci USA 89，8990-8992，1992；美国专利6,673,901)。三个环，BC、DE和FG环位于FN3结构域的顶部，并且三个环，AB、CD和EF环位于结构域的底部(图1)。表1示出几种含有蛋白质的FN3结构域，以及与每种蛋白质缔合的不同FN3结构域的数目。虽然FN3结构域构象高度保守，但不同结构域之间的相似性在氨基酸水平上非常低。
FN3结构域可能是天然或非天然存在的。示例性的非天然存在的FN3结构域是共有FN3结构域，其基于存在于某种蛋白质中的挑选的FN3结构域的比对而设计并且在每个位置并入最保守(频繁)的氨基酸以产生非天然存在的FN3结构域。例如，非天然存在的FN3结构域基于来自人腱生蛋白C的15个FN3结构域的共有序列，或基于来自人纤连蛋白的15个FN3结构域的共有序列而设计。这些非天然存在的FN3结构域保持FN3结构域的典型的拓扑结构，并且可表现当与野生型FN3结构域相比时的改善性质，诸如改善稳定性。示例性的非天然存在的FN3结构域是SEQ ID NO:16和58分别示出，并且描述于美国专利公布2010/0216708和美国专利公布2010/0255056的Tencon和Fibcon结构域。
表1：
表2中示出对于FN3支架Tencon27(SEQ ID NO:27)的限定每个环和每条β-链的氨基酸残基。腱生蛋白C第3FN3结构域(TN3)(SEQ ID NO:3)和Fibcon(SEQ ID NO:58)中每个环和β-链的位置与Tencon27的位置相同。可使用熟知的方法鉴定β-链残基，例如，通过分析由X射线衍射产生的三维结构、核磁共振或分子建模。在模型不可用的情况下，与其它已知FN3分子的序列比对的分析可用于预测链和环区域的边界。最后，计算机算法可用于预测来自蛋白质一级序列的β链的存在。
表2：
FN3结构域 Tencon27(SEQ ID NO:27)
A链 1-12
AB环 13-16
B链 17-21
BC环 22-28
C链 29-37
CD环 38-43
D链 44-50
DE环 51-54
E链 55-59
EF环 60-64
F链 65-74
FG环 75-81
G链 82-89
FN3结构域上的可供选择的表面
顶部(BC、DE和FG)和底部(AB、CD和EF)环，例如FN3结构域中报道的结合表面被形成FN3结构的中心的β-链分隔(图1、2A)。位于具有与由环形成的表面不同的形状的FN3结构域两“侧”的可供选择的表面仅通过使FN3结构域结构旋转90度才可视(图2B、2C)。由两条反平行β-链，即C和Fβ-链以及CD和FG环在FN3结构域的一侧形成稍微凹型的表面，并且在本文称为C-CD-F-FG表面。也可由A、B和Eβ-链以及AB和BC环在C-CD-F-FG表面的相对侧形成可供选择的表面，在本文称为A-AB-B-BC-E表面。
FN3结构域中的可供选择的表面由每个FN3结构域中氨基酸的非邻接伸展(non-contiguous stretch)编码。例如，如表2所示，Tencon27 C-CD-F-FG表面由SEQ ID NO:27的氨基酸残基29-43和65-81形成，并且Tencon27 A-AB-B-BC-E表面由SEQ ID NO:27的氨基酸残基1-28和55-59形成。
基于使可供选择的表面随机化的蛋白质支架
本发明的一个实施例是包含含有可供选择的表面的FN3结构域的分离的蛋白质支架，其中当与参考FN3结构域相比时，所述可供选择的表面在形成可供选择的表面的每条β-链和每个环中具有至少一种氨基酸取代。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架特异性地结合不被参考FN3结构域特异性地结合的靶分子。
在另一个实施例中，参考FN3结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含由Cβ-链，CD环、Fβ-链和FG环形成的C-CD-F-FG可供选择的表面。
在另一个实施例中，形成C-CD-F-FG可供选择的表面的Cβ-链、CD环、Fβ-链或FG环包含如表4和5以及SEQ ID NO:45-48所示的氨基酸序列。
在另一个实施例中，Cβ-链包含在1、2、3或4个残基处具有取代的氨基酸序列DSFLIQYQE(SEQ ID NO:33)，Fβ-链包含在1、2、3、4或5个残基处具有取代的氨基酸序列TEYTVSIYGV(SEQ ID NO:39)，Cβ-链和CD环包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个残基处具有取代的氨基酸序列DSFLIQYQESEKVGE(SEQ ID NO:42)，或Fβ-链和FG环包含在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11个残基处具有取代的氨基酸序列TEYTVSIYGVKGGHRSN(SEQ ID NO:43)。
在另一个实施例中，Cβ-链和Fβ-链包含分别与SEQ ID NO:33至少67％相同和与SEQ ID NO:39至少70％相同的氨基酸序列，Cβ-链和CD环包含与SEQ ID NO:42至少53％相同的氨基酸序列，或Fβ-链和FG环包含与SEQ ID NO:43至少65％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含FN3结构域，所述FN3结构域包含如SEQ ID NO:28所示的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含III型纤连蛋白模块(FN3)结构域，所述FN3结构域包含：
分别在残基1-12、13-16、17-21、22-28、44-50、51-54、55-59、60-64和82-89处具有与SEQ ID NO:27相同的氨基酸序列的Aβ-链、AB环、Bβ-链、BC环、Dβ-链、DE环、Eβ-链、EF环和Gβ-链；
具有与SEQ ID NO:42至少53％相同的氨基酸序列的Cβ-链和CD环；和
具有与SEQ ID NO:43至少65％相同的氨基酸序列的Fβ-链和FG环，其任选地在对应于SEQ ID NO:27的氨基酸残基11、14、17、37、46、73或86的氨基酸位置处具有至少一种取代，其中蛋白质支架特异性地结合不被参考FN3结构域特异性地结合的靶分子。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含FN3结构域，所述FN3结构域包含与SEQ ID NO:27所示的氨基酸序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含由Aβ-链、AB环、Bβ-链、BC环和Eβ-链形成的A-AB-B-BC-E可供选择的表面。
在另一个实施例中，形成A-AB-B-BC-E可供选择的表面的Aβ-链、AB环、Bβ-链和BC环包含如表4和5以及SEQ ID NO:49和50所示的某些氨基酸序列。
在另一个实施例中，Aβ-链、AB环、Bβ-链和BC环包含与SEQ ID NO:44至少59％相同的氨基酸序列，并且Eβ-链包含与SEQ ID NO:37至少60％相同的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的蛋白质支架包含FN3结构域，所述FN3结构域包含如SEQ ID NO:61所示的氨基酸序列。
在另一个实施例中，本发明的分离的蛋白质支架包含FN3结构域，所述FN3结构域包含：
分别在残基29-37、38-43、44-50、51-54、60-64、65-74、75-81和82-89处具有与SEQID NO:27相同的氨基酸序列的Cβ-链、CD环、Dβ-链、DE环、EF环、Fβ-链、FG环和Gβ-链；
具有与SEQ ID NO:44至少59％相同的氨基酸序列的Aβ-链、AB环、Bβ-链和BC环；和
与SEQ ID NO:37至少60％相同的氨基酸序列的Eβ-链，其任选地在对应于SEQ IDNO:27的氨基酸残基11、14、17、37、46、73或86的氨基酸位置处具有至少一种取代，其中所述蛋白质支架特异性地结合不被参考FN3结构域特异性地结合的靶分子。
特异性地结合靶分子的FN3结构域可通过使形成可供选择的表面的残基的子组随机化来产生。例如，在有助于形成可供选择的表面的每条β-链和每个环中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基可被随机化。另外的残基可被随机化以增加文库的多样性。例如，形成所述可供选择的表面的每条β-链和每个环中20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的残基可被随机化。作为另外一种选择，特异性地结合靶分子的FN3结构域可通过使有助于形成所述可供选择的表面的β-链中残基的子组随机化而不使环的任何残基随机化来产生。例如，在有助于形成可供选择的表面的每条链中，至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个残基可被随机化。可通过使位于β-链中另外的残基随机化来增加文库多样性。例如，形成所述可供选择的表面的每条β-链中20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％或95％的残基可被随机化。
β-链具有重复结构，其中每隔一个残基的侧链暴露于蛋白质的表面。通过检查三维结构或通过经由多序列比对与具有已知结构的FN3结构域的序列比较来确定表面暴露的侧链。可选择有助于形成可供选择的表面的β-链中的表面暴露残基的全部或子组进行随机化。例如，Tencon27(SEQ ID NO:27)C-CD-F-FG可供选择的表面在Cβ-链中具有4个表面暴露残基(S30、L32、Q34和Q36)并且在Fβ-链中具有5个表面暴露残基(E66、T68、S70、Y72和V74)，残基编号基于SEQ ID NO:27。这些残基的一个或多个可被随机化以产生文库。在可供选择的表面的接合处的残基，诸如S30、E66和V74可被随机化或可不被随机化。β-链的内埋残基的随机化由于结构的核心中疏水触点的丧失可导致支架不稳定。内埋残基可被随机化使得使用仅氨基酸的子组，例如仅疏水氨基酸。
有助于形成可供选择的表面的环区域中一个子组的残基或所有残基可被随机化。例如，在有助于形成可供选择的表面的CD和/或FG环中0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个位置可被取代。环中的甘氨酸残基，诸如G42、G76和/或Tencon27中的G77可提供灵活性并且可被随机化或可不被随机化。在β-链/环边界处的残基，诸如Tencon27中的E43可被随机化或可不被随机化。β-链或环区域中的另外残基可被纳入随机化或从随机化排除。例如，基于例如FN3结构域的晶体结构的分析而鉴定的似乎对稳定性必需的残基可被随机化或可不被随机化。例如，Tencon27中的S80与FN3结构域核心接触以可能使FG环稳定，并且K75部分地转向远离可供选择的表面。因此，这些残基都可从初始文库设计排除。在具有随机化C-CD-F-FG表面的示例性FN3结构域文库中，可被随机化的残基包括SEQ ID NO:27的位置30、32、34、36、38、39、40、41、42、43、66、68、70、72、74、75、76、77、78、79、80、或81处的残基。在具有随机化A-AB-B-BC-E表面的示例性FN3结构域文库中，可被随机化的残基包括位置6、8、10、11、12、13、14、15、16、18、20、22、23、24、25、26、27、55和57处的残基。
有助于形成可供选择的表面的环处的多样性可通过环处残基的插入和/或缺失来实现。例如，FG和/或CD环可延伸1-22个氨基酸，或减少1-3个氨基酸。Tencon27中的FG环的长度为7个氨基酸，而抗体重链中相应环的范围为4-28个残基。为提供最大的多样性，有助于形成可供选择的表面的环，例如FG环，可在序列以及长度方面被多样化以对应于4-28个残基的抗体CDR3长度范围。
特异性地结合靶分子的所得FN3结构域可在位于可供选择的表面外部或可供选择的表面内的残基处被进一步修饰以用于以下目的，例如提高稳定性、降低免疫原性、增强结合亲和力、结合速率、解离速率、半衰期、溶解度或任何其它合适的特征。在实现这一目的的一种方式中，可通过使用亲本和工程改造序列的三维模型分析亲本序列和各种概念上的工程改造产物的过程任选地制备支架蛋白质。三维模型通常可用并且为本领域技术人员所熟悉。计算机程序可用，其说明并且显示所选择的候选序列的可能的三维构象结构并且可测量可能的免疫原性(例如，Immunofilter program of Xencor，Inc.of Monrovia，CA)。对这些显示的检测允许分析对候选序列的功能起作用的残基的可能作用，例如，影响支架蛋白质的稳定性或候选支架蛋白质结合其靶分子的能力的残基。按此方式，可由亲本和参考序列选择并组合残基以便实现期望的特性，诸如提高的支架稳定性。作为另外一种选择或除了以上程序，可如本领域所已知使用其它合适的工程改造方法。
本发明的FN3结构域的期望的物理特性包括高热稳定性以及热折叠和解折叠的可逆性。多种方法已应用于增加蛋白质和酶的表观热稳定性，包括基于与高度相似的热稳定序列比较的合理设计、稳定二硫桥的设计、增加α-螺旋倾向的突变、对盐桥进行工程改造、蛋白质表面电荷的改变、定向进化和共有序列的构成(Lehmann和Wyss，Curr OpinBiotechnol，12，371-375，2001)。高度的热稳定性可增加所表达蛋白质的产量、提高溶解度或活性、降低免疫原性并且使生产中对冷链的需要最小化。
可通过进行取代并测定支架的期望特性来确定可被取代以改善本发明的FN3结构域的任何特性的残基。具有改善的特性的示例性的基于FN3结构域的支架为Tencon支架(SEQ ID NO:16)或Tencon27支架(SEQ ID NO:27)，其在一个或多个氨基酸残基位置11、14、17、37、46、73或86处被修饰。
根据稳定性的丧失，即，蛋白质的“变性(denaturing/denaturation)”意指其中赋予蛋白质的功能特性的三维构象的一些或全部已伴随活性和/或溶解性的丧失而丧失的过程。在变性过程中被破坏的力包括分子内键，例如，静电力、疏水力、范德华力、氢键和二硫键。蛋白质变性可由施加于蛋白质或包含蛋白质的溶液的力和由化学变性剂引起，所述力诸如机械力(例如压力或剪切力)，热、渗透应力、pH的变化、电场或磁场、电离辐射、紫外线辐射和脱水。
蛋白质稳定性和蛋白质易变性的测量可视为蛋白质完整性的相同或不同方面。蛋白质对由热、由紫外线或电离辐射、环境同渗容摩和pH(如果在液体溶液中)的变化、由小孔径过滤施加的机械剪切力、紫外线辐射、电离辐射(诸如由γ辐射)、化学或热脱水或任何其它可造成蛋白质结构破坏的作用或力引起的变性敏感或“易变”。可使用标准方法确定分子的稳定性。例如，可通过使用标准方法测量热解链(“TM”)温度，即1/2的分子变为解折叠的以摄氏度(℃)表示的温度来确定分子的稳定性。通常，TM越高，分子越稳定。除了热之外，化学环境也改变蛋白质的稳定性以保持特定的三维结构。
在一个实施例中，由TM的增加所测量，与工程改造之前的相同结构域相比，本发明的FN3结构域表现稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。
可通过多种方法同样地测量化学变性。化学变性剂包括盐酸胍、硫氰酸胍、脲、丙酮、有机溶剂(DMF、苯、乙腈)、盐(硫酸铵、溴化锂、氯化锂、溴化钠、氯化钙、氯化钠)；还原剂(例如二硫苏糖醇、β-巯基乙醇、二硝基硫苯和氢化物，诸如硼氢化钠)、非离子和离子型去污剂、酸(例如盐酸(HCl)、乙酸(CH3COOH)、卤代乙酸)、疏水分子(例如，磷脂)和靶向变性剂。变性程度的定量可依赖于功能性质的丧失，诸如结合靶分子的能力，或通过物理化学性质定量，诸如聚集的趋势、先前溶剂不可及残基的暴露或二硫键的破坏或形成。
在一个实施例中，如通过使用盐酸胍作为化学变性剂所测量，与工程改造之前的相同支架相比，本发明的支架表现稳定性增加至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％或更多。使用熟知的方法，在用增加浓度的盐酸胍处理后，增加的稳定性可测量为降低的色氨酸荧光的函数。
可使用任何FN3结构域作为模板以供根据本发明提供的方法取代来产生特异性地结合本发明的靶分子的FN3结构域。具有随机化可供选择的表面的示例性FN3结构域为腱生蛋白C的第3FN3结构域(TN3)(SEQ ID NO:3)、Tencon(SEQ ID NO:16)、Tencon27(SEQ IDNO:27)、Fibcon(SEQ ID NO:58)，以及纤连蛋白的第10FN3结构域(FN10)(SEQ ID NO:97)。描绘Tencon27中可供选择的表面的氨基酸位置示出在表2和图8中，并且在Tencon、TN3和Fibcon线性序列中相同描绘FN10中可供选择的表面的氨基酸位置示出在图8中。可通过检查三维结构(在可用的情况下)或通过经由熟知方法分析FN3结构域的序列比对来鉴定形成其它FN3结构域中供选择的表面的残基。
本发明的FN3结构域可作为单体、二聚体或多聚体产生，例如作为增加化合价和因此靶分子结合的亲和力的手段，或产生同时结合两种或多种不同的靶分子双特异性或多特异性支架的手段。二聚体和多聚体可通过连接单特异性、双特异性或多特异性蛋白质支架来产生，例如，通过纳入氨基酸接头，例如含有聚甘氨酸、甘氨酸和丝氨酸或丙氨酸和脯氨酸的接头。使用天然存在的以及人工肽接头将多肽连接成新型连接的融合多肽在文献中为熟知的(Hallewell等人，J Biol Chem 264，5260-5268，1989；Alfthan等人，ProteinEng.8，725-731，1995；Robinson&Sauer，Biochemistry 35，109-116，1996；美国专利5,856,456)。
本发明的FN3结构域可用作双特异性分子，其中结构域中第一可供选择的表面对第一靶分子具有特异性，而相同结构域中的第二可供选择的表面对第二靶分子具有特异性。示例性的双特异性蛋白质结构域为Tencon27的变体，其结合C-CD-F-FG表面处的第一靶分子和A-AB-B-BC-E表面处的第二靶分子。
本发明的FN3结构域可例如通过共价相互作用并入其它亚基。可将抗体恒定区的全部或一部分可连接至FN3结构域以赋予抗体样特性，特别是与Fc区域相关的那些特性，例如，补体活性，半衰期等。例如，Fc效应子功能诸如C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用，细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等可通过修饰促成这些活性的Fc中的残基来提供和/或控制(对于综述，参见Strohl，Curr Opin Biotechnol.20，685-691，2009)。
另外的部分可并入本发明的FN3结构域，诸如用于期望特性的毒素缀合物；白蛋白或白蛋白结合物；聚乙二醇(PEG)分子，诸如PEG5000或PEG20,000；不同链长度的脂肪酸和脂肪酸酯，例如，月桂酸酯、肉豆蔻酸酯，硬脂酸酯、花生酸酯、二十二烷酸酯、油酸酯、花生四烯酸、辛二酸、十四烷二酸、十八烷二酸、二十二烷二酸等、聚赖氨酸、辛烷、糖类(葡聚糖、纤维素、寡糖或多糖)。这些部分可与蛋白质支架编码序列直接融合并且可通过标准的克隆和表达技术产生。作为另外一种选择，熟知的化学偶联方法可用于将这些部分连接至本发明重组制备的FN3结构域。
可通过多种熟知的测定比较并入另外部分的FN3结构域的官能度。例如，由于并入Fc结构域和/或Fc结构域变体而导致的改变的FN3结构域特性可在Fc受体结合测定中使用该受体的可溶形式来测定，该受体的可溶形式诸如FcγRI、FcγRII、FcγRIII或FcRn受体，或使用熟知的测量例如ADCC或CDC的基于细胞的测定，或在体外模型中评估蛋白质支架药代动力学特性。
FN3结构域蛋白质的产生和制备
本发明的一个实施例为制备包含可供选择的表面的FN3结构域的文库的方法，其中与参考FN3结构域相比，所述可供选择的表面具有至少一种氨基酸取代，所述方法包括：提供编码参考FN3结构域的多核苷酸；通过使可供选择的表面随机化来产生参考FN3结构域的多核苷酸序列的文库；在体外翻译该文库或在宿主中表达该文库。
本发明的另一个实施例为制备具有由Cβ-链、CD环、Fβ-链和FG环形成的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域的文库的方法，所述方法包括提供具有与SEQ ID NO:27的氨基酸序列至少80％相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽；通过使至少一个Cβ-链残基和至少一个Fβ-链残基突变来将多样性引入到所述参考FN3结构域多肽中以形成具有多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域文库。
在本发明制备文库的方法中，可使Cβ-链中的1、2、3或4个残基突变，条件是S30未突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，可使Cβ-链残基L32、Q34和Q36突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，可使Fβ-链中的1、2、3或4个残基突变，条件是E66未突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，可使F-β链残基T68、S70和Y72突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，可使CD环中的1、2、3或4个残基突变，条件是G42和E43未突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，可使CD环中的残基S38、E39、K40和V41突变。
在本发明制备文库的方法中，可使FG环中的1、2、3或4个残基突变，条件是残基K75、G76、G77和S80未突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，可使FG环中的残基H78、R79和N81突变(残基编号根据SEQ ID NO:27)。
在本发明制备文库的方法中，参考FN3结构域包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列，其在氨基酸位置11、14、17、37、46、73或86处任选地包含至少一种取代。
其它参考FN3结构域可用于本发明的方法，诸如Tencon(SEQ ID NO:16)或SEQ IDNO:17-26和表3中示出的其变体。
本发明的另一个实施例为由本发明的方法制备的文库。
支架蛋白质，本发明的FN3结构域(或模块)的产生通常在核酸水平上实现。可例如使用标准PCR克隆方法，或根据美国专利6,521,427和美国专利6,670,127中描述的方法的化学基因合成来合成在一个或多个特异性残基处具有取代的密码子的本发明的FN3结构域的文库。可使用熟知的方法，例如匹配设计多样性的简并寡核苷酸或使用Kunkel诱变使密码子随机化(Kunkel等人，MethodsEnzymol.154，367-382，1987)。
可使用随机或确定组的氨基酸在所选密码子处使文库随机化。例如，可使用NNK密码子(其编码所有20种天然存在的氨基酸)产生具有随机取代的文库中的变体。在其它多样化方案中，DVK密码子可用于编码氨基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Lys、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly和Cys。作为另外一种选择，NNS密码子可用于产生所有20种氨基酸残基并同时降低终止密码子的频率。密码子命名根据熟知的IUB密码。
和任何其它蛋白质一样，本发明的FN3结构域倾向于多种物理和/或化学不稳定性，导致对下游加工的不利影响。例如，物理和化学不稳定性可导致聚集、降解、产物产量降低、效能的丧失、对免疫原性的可能性增加、分子异质性和活性的丧失。因此，在设计文库的过程中，可能的不稳定性诱导残基和识别序列的存在可被最小化。例如，在存储条件中，表面暴露的甲硫氨酸和色氨酸可被氧化，可能导致蛋白质支架效能的丧失。天冬酰胺的存在，除了促成熟知的N-糖基化识别位点(NXS/T)，当在甘氨酸前面时还可被去酰胺化，可能产生异质性(heterogeneicity)(Robinson，Proc NatlAcad Sci USA，99，5283-5288，2002)。因此这些氨基酸中的一些或全部可从用于使所选位置随机化的混合物中删除或可以不删除。此外，可删除半胱氨酸和脯氨酸以最小化二硫桥形成和β折叠的破坏。
可例如使用technology(http:_//www_sloning_com)来合成在待多样化的位置具有偏向氨基酸分布的FN3结构域。这种技术使用预先制备的双链三体的文库，其用作对于成千上万的基因合成工艺而言为足够的通用构建模块。该三体文库代表对构建任何期望的DNA分子所必需的所有可能的序列组合。
用某些位置处所选的核苷酸“简并性”合成寡核苷酸是本领域熟知的，例如TRIM方法(Knappek等人，J Mol Biol 296，57-86，1999；Garrard&Henner，Gene 128，103-109，1993)。可使用可商购获得的核苷酸或核苷试剂和设备来合成具有某些密码子组的核苷酸的此类组。
在示例性的多样化方案中，用NNS密码子使Cβ-链中的Tencon27FN3结构域(SEQ IDNO:27)残基L32、Q34和Q36，CD环中的S38、E39、K40和V41，Fβ-链中的T68、S70和Y72以及FG环中的H78、R79和N81随机化。
标准的克隆和表达技术用于将文库克隆进载体或合成文库的双链cDNA盒以在体外表达或翻译文库。例如，顺式展示可用于将编码支架蛋白质的DNA片段连接至编码RepA的DNA片段以产生在体外翻译后形成的蛋白质-DNA复合物的集合，其中每种蛋白质与编码其的DNA稳定地缔合(美国专利7,842,476；Odegrip等人，Proc Natl Acad Sci U S A 101，2806-2810，2004)。可使用其它方法，例如核糖体展示(Hanes和Pluckthun，Proc Natl AcadSci USA，94，4937-4942，1997)、mRNA展示(Roberts和Szostak，Proc NatlAcadSci USA，94，12297-12302，1997)或其它无细胞系统(美国专利5,643,768)。蛋白质支架的文库可表达为展示在例如任何合适的噬菌体的表面上的融合蛋白。用于在噬菌体的表面上展示融合多肽的方法是熟知的(美国专利公布2011/0118144；国际专利公布WO2009/085462；美国专利6,969,108；美国专利6,172,197；美国专利5,223,409；美国专利6,582,915；美国专利6,472,147)。
筛选
筛选工程改造的蛋白质FN3结构域或FN3结构域变体的文库与靶分子的特异性结合可例如通过使用如实施例和Odegrip等人，Proc Natl Acad Sci USA 101，2806-2810，2004所述的顺式展示产生文库和通过本领域已知的任何方法测定文库与靶分子的特异性结合来实现。可使用的示例性熟知的方法为ELISA、夹心免疫测定和竞争性和非竞争性测定(参见例如，Ausubel等人，eds，1994，Current Protocols in Molecular Biology，Vol.1，John Wiley&Sons，Inc.，New York)。
本发明的FN3结构域可以宽泛的亲和力(KD)范围结合人或其它哺乳动物蛋白质。如通过表面等离子共振或Kinexa方法所测定，如本领域技术人员所实践，通常本发明的FN3结构域可以KD等于或小于约10-7M、10-8M、10-9M、10-10M、10-11M、10-12M、10-13M、10-14M或10-15M结合靶蛋白。可使用任何合适的方法通过实验测定FN3结构域对抗原的亲和力。(参见例如，Berzofsky等人，“Antibody-Antigen Interactions，”Fundamental Immunology，Paul，W.E.编辑，Raven Press:New York，NY(1984)；Kuby，Janis Immunology，W.H.Freeman andCompany:New York，NY(1992)；以及本文所述的方法)。如果在不同的条件(例如，同渗容摩、pH)下测量，特定FN3结构域-抗原相互作用的测量亲和力可变化。因此，亲和力和其它抗原-结合参数(例如，KD、Kon、Koff)的测量优选地用蛋白质支架和抗原的标准溶液，以及标准缓冲液，诸如本文所述的缓冲液进行。
核酸分子和载体
本发明将编码本发明的FN3结构域的核酸提供为分离的多核苷酸或表达载体的部分或线性DNA序列的部分，包括用于体外转录/翻译的线性DNA序列、与原核、真核或丝状噬菌体表达、组合物或其定向诱变剂的分泌和/或展示相容的载体。本文公开某些示例性的多核苷酸，然而，在给定的表达系统中给定遗传密码的简并性或密码子偏好，编码本发明的蛋白质支架和蛋白质支架的文库的多核苷酸也在本发明的范围内。
本发明的多核苷酸可以通过化学合成(诸如在自动化多核苷酸合成仪上的固相多核苷酸合成)来生产，并装配成完整的单链或双链分子。作为另外一种选择，本发明的多核苷酸可以通过其它技术来生产，诸如PCR之后进行常规克隆。制备或获得具有给定的已知序列的多核苷酸的技术是本领域熟知的。
本发明的多核苷酸可包含至少一个非编码序列，诸如启动子或增强子序列、内含子、聚腺苷酸化信号、促进RepA结合的顺式序列等。多核苷酸序列还可包含编码另外的氨基酸的另外序列，其编码例如标记或标签序列，诸如组氨酸标签或HA标签以促进蛋白质的纯化或检测；信号序列；融合蛋白配偶体诸如RepA、Fc；或噬菌体外壳蛋白诸如pIX或pIII。
示例性的多核苷酸包含用于Tac启动子的序列、编码FN3结构域文库和repA的序列、顺式元件以及细菌复制起点(ori)。另一个示例性的多核苷酸包含pelB或ompA信号序列、pIII或pIX噬菌体外壳蛋白、FN3结构域和聚腺苷酸位点。编码TCL14文库和Tencon27的示例性多核苷酸分别在SEQ ID NO:100和101中示出。
本发明的另一实施例是包含至少一个本发明多核苷酸的载体。此类载体可以是质粒载体、病毒载体、用于杆状病毒表达的载体、基于转座子的载体或适于通过任何方式将本发明的多核苷酸引入给定生物体或遗传背景的任何其它载体。此类载体可以是包含可控制、调节、引起或允许由这种载体编码的多肽的表达的核酸序列元件的表达载体。此类元件可包含转录增强子结合位点、RNA聚合酶起始位点、核糖体结合位点以及有利于被编码多肽在给定表达系统中的表达的其它位点。此类表达系统可以是本领域熟知的基于细胞的系统或无细胞系统。
宿主细胞选择或宿主细胞工程改造
如本领域所熟知，本发明的FN3结构域可任选地由细胞系、混合细胞系、无限增殖化细胞或无限增殖化细胞的克隆群产生。参见例如，Ausubel等人编辑，Current Protocolsin Molecular Biology，John Wiley&Sons，Inc.，NY，NY(1987-2001)；Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Harlow和Lane，Antibodies，a Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，NY(1989)；Colligan等人编辑，Current Protocols in Immunology，John Wiley&Sons，Inc.，NY(1994-2001)；Colligan等人，CurrentProtocols in Protein Science，John Wiley&Sons，NY，NY，(1997-2001)。
选择用于表达的宿主细胞可以是哺乳动物起源的或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、HeLa、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞、或其任何衍生物、无限增殖化细胞或转化的细胞。作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能够使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，诸如BL21、BL21(DE3)、BL21-GOLD(DE3)、XL1-Blue、JM109、HMS174、HMS174(DE3)以及任何天然或工程改造的大肠杆菌属(E.coli spp)、克雷伯氏菌属(Klebsiella spp.)或假单胞菌属(Pseudomonasspp)菌株。
本发明FN3结构域的用途
本文描述并且通过任何以上描述的方法产生的基于FN3结构域(模块)的分子的组合物可用于诊断、监测、调节、治疗、缓解、帮助预防人类疾病或细胞、组织、器官、液体或(一般来讲)宿主中的特定病理学的发生，或减少人类疾病或细胞、组织、器官、体液或(一般来讲)宿主中的特定病理学的症状。被工程改造以用于特定目的的FN3结构域可用于治疗免疫介导的或免疫缺陷疾病、代谢疾病、心血管病症或疾病；恶性疾病；神经病症或疾病；感染，诸如细菌、病毒或寄生虫感染；或其它已知或指定相关病状，包括肿胀、疼痛和组织坏死或纤维变性。
这样的方法可包括向需要此种调节、治疗、缓解、预防或症状减少、效果或机制的细胞、组织、器官、动物或患者施用有效量的组合物或药物组合物，该组合物或药物组合物包含至少一种特异性地结合靶分子的FN3结构域。如本文描述或相关领域已知的，如使用已知方法进行和确定，该有效量可包括每单次(例如，推注)、多次或连续施用约0.001至500mg/kg的量，或每单次、多次或连续施用达到血清浓度为0.01-5000μg/ml血清浓度，或其中的任何有效范围或值。
包含基于FN3结构域的蛋白质的药物组合物
可使用本领域熟知的用于捕获、固定、分配或沉定的分离程序分离为经修饰的或未经修饰的、单体、二聚体或多聚单特异性、双特异性或多特异性的特异性地结合靶分子的FN3结构域，或将其纯化至商业适用所必需的程度。
对于治疗用途，可将特异性地结合靶分子的FN3结构域制备为药物组合物，该药物组合物含有有效量的FN3结构域作为药学上可接受的载体中的活性成分。术语“载体”是指据以施用该活性化合物的稀释剂、辅助剂、赋形剂或媒介物。此类媒介物可以是液体，例如水和油，包括那些来源于石油、动物、植物的油或合成的油，诸如花生油、大豆油、矿物油和芝麻油等。例如，可以使用0.4％生理盐溶液和0.3％甘氨酸。这些溶液是无菌的，通常不含颗粒物质。它们可通过常规的熟知的灭菌技术(例如过滤)进行灭菌。组合物可按需含有药学上可接受的辅助物质以近似生理条件，如pH调节剂和缓冲剂、稳定剂、增稠剂、润滑剂和着色剂等。本发明的物质在这种药物组合物中的浓度可变动很大，即从小于约0.5％、通常为或至少约1％至高达15或20％(以重量计)，且将根据所选择的具体施用方式主要基于所需的剂量、流体体积、粘度等进行选择。包含其它人蛋白如人血清白蛋白在内的合适的媒介物和制剂描述在例如，Remington:The Science和Practice of Pharmacy，第21版，Troy，D.B.编辑，Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA，2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing，第691-1092页，特别参见第958-989页。
用于特异性地结合靶分子的FN3结构域的治疗用途的施用方式可以是将药剂递送至宿主的任何合适的途径，诸如非肠道施用，例如，真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、肺部；经粘膜(口腔、鼻内、阴道内、直肠)；使用在片剂、胶囊、溶液、粉末、凝胶、颗粒中的制剂；以及包含在注射器、植入装置、渗透泵、盒、微型泵中的制剂；或技术人员理解、本领域熟知的其它方式。可通过例如以下方式实现位点特异性施用：关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、口腔、舌下、鼻内或经皮递送。
虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在下列实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求的范围的限制。
实例1：Tencon支架
Tencon设计
来自人腱生蛋白C的第三III型纤连蛋白模块(Fn3)结构域(SEQ ID NO:3)可用作可被工程改造以结合特异性靶分子的蛋白质支架。在其天然形式下这种结构域在PBS中的解链温度为54℃。
为了制备具有类似结构和改善的物理特性(诸如改善的热稳定性)的蛋白质支架，基于来自人腱生蛋白C的15个FN3结构域(示出在SEQ ID NO:1-15)的比对设计了共有序列。所述15个选择的FN3结构域彼此具有13至80％的序列同一性，其中对之间的平均序列同一性为29％。通过在每个位置并入最保守(频繁)的氨基酸来设计指定为Tencon(SEQ ID NO:16)的共有序列(参见美国专利公布2010/0216708)。在双序列比对中，Tencon与来自腱生蛋白C的FN3结构域在34-59％的位置相同，其中平均序列同一性为43％。
Tencon表达和纯化
将Tencon的氨基酸序列回译(back translate)，产生SEQ ID NO：59所示的cDNA序列。使用常规方法将cDNA扩增并克隆进修饰的pET15载体。蛋白质在大肠杆菌中表达为可溶形式的C-末端His6-融合蛋白，并且使用标准Ni-NTA琼脂糖并使用在500mM咪唑中洗脱来进行纯化。将期望的组分合并并透析至PBS(pH 7.4)中。作为第二纯化步骤，将蛋白质上样至在PBS中平衡的Superdex-75HiLoad 16/60柱(GE Healthcare)。将含有Tencon的组分合并并使用Centriprep UltraCel YM-3浓缩器(Amicon)进行浓缩。SDS-PAGE分析显示Tencon在6和14kDa之间迁移，这与单体蛋白10.7kDa的期望质量一致。获得每升培养物>50mg纯Tencon蛋白的产量。
Tencon生物物理学表征
通过圆二向色性光谱学(CD)和差示扫描量热法(DSC)表征Tencon的结构和稳定性。CD测量于20℃下在PBS中和0.2mg/mL的浓度下在AVIV光度计上进行。光谱显示最小值在218nm，表明如对于属于FN3家族的蛋白质所预期的β-折叠结构。通过在N-DSCII热量计(Applied Thermodynamics)中于PBS中将来自腱生蛋白C的第3FN3结构域(TN3)或Tencon的0.5mg/mL溶液以1℃/分钟的速率从35℃加热至95℃来获得DSC数据。使用CpCalc(应用热力学)软件，从该数据分别计算TN3和Tencon的解链温度为54℃和78℃。在这些温度下，两种结构的折叠和解折叠是可逆的。因此，当与TN3的热稳定性相比时，所产生的Tencon支架显示提高的热稳定性。基于这种稳定性增加，Tencon支架可能更能接受氨基酸取代并且更易于制造。在更稳定的支架的情况下，降低蛋白质稳定性的突变可能更耐受，并且因此具有增强的稳定性的支架可能从支架变体的文库中产生更具功能性、良好折叠的结合物。
M13噬菌体上的Tencon展示
通过标准的PCR和限制酶切消化克隆，将编码Tencon氨基酸序列的cDNA(SEQ IDNO:59)亚克隆进噬粒表达载体pPep9(国际专利公布WO2008/079973)，产生载体pTencon-pIX。在Lac启动子(在没有IPTG的情况下允许较低水平的表达，而在添加IPTG后允许增加的表达)下，使用OmpA信号序列，该载体将N-末端Myc-标记的Tencon表达为与噬菌体M13 pIX蛋白的N-末端的C-末端融合物。将短TSGGGGS接头(SEQ ID NO:60)插入到Tencon和pIX之间以防止这些蛋白质之间的空间相互作用。
对于确认在M13噬菌体颗粒的表面上的展示，使XL1-Blue大肠杆菌中的pTencon-pIX的单菌落转化株在37℃下生长直到到达中间对数生长期(mid-log phase)并且用610pfu的VCSM13辅助噬菌体拯救。在用氨苄青霉素补充的2YT培养基中伸展16小时后之后1mMIPTGS诱导，从拯救的培养物中收集上清液，在4000Xg离心20分钟并在4℃储存用于分析。
噬菌体颗粒与抗Myc抗体(Life Technologies，Carlsbad，CA)的结合用于确认Myc-Tencon构建体在M13噬菌体表面上的展示。用抗-Myc或抗-αv抗体(阴性对照)在2.5μg/mL的浓度下对Maxisorp板进行包被过夜并且用SuperBlock T20(Thermo Scientific，Rockford IL)进行封闭。1小时后，用TBST洗涤板，并且将抗M13 HRP抗体添加至每个孔，在1小时孵育后用TBST洗涤。加入Roche BD ELISA POD底物，并且在Tecan酶标仪上检测发光。
实例2：Tencon中的稳定突变
经设计以将多样性同时引入FG和BC环的Tencon文库FG7和BC6/FG7已描述在(美国专利公布2010/0255056；美国专利公布2010/0216708中)。
变体的设计
设计变体以提高Tencon(SEQ ID NO:16)的折叠稳定性。进行多处点突变以产生SEQ ID NO:16的单个残基的取代，诸如N46V(Tencon17；SEQ ID NO:17)、E14P(Tencon18；SEQ ID NO:18)、E11N(Tencon19；SEQ ID NO:19)、E37P(Tencon20；SEQ ID NO:20)和G73Y(Tencon21；SEQ ID NO:21)，预期它们通过程序PoPMuSiC v2.0提高支架稳定性(Dehouck等人，Bioinformatics，25，2537-2543，2009)。先前已发现突变体E86I(Tencon22；SEQ ID NO:22)使同源蛋白，来自人腱生蛋白C的第3rd FN3结构域稳定(WO2009/086116)。发现L17A突变(Tencon26；SEQ ID NO:26)在丙氨酸扫描实验过程中显著地使Tencon稳定，其中Tencon的所有环残基独立得被丙氨酸替代(数据未显示)。在初始轮的稳定性测定后，产生了组合突变体N46V/E86I(Tencon23；SEQ ID NO:23)、E14P/N46V/E86I(Tencon24；SEQ ID NO:24)和L17A/N46V/E86I(Tencon25；SEQ ID NO:25)以进一步增加稳定性。
表达和纯化
使用QuikChange诱变试剂盒(Stratagene)进行Tencon编码序列的突变，并且使用标准方案使突变蛋白质表达为HIS6融合蛋白。在50mM磷酸钠(pH 7.4)、500mM NaCl和250mM咪唑中从Ni-NTA(Novagen)柱洗脱蛋白质。洗脱后，将蛋白质透析至PBS(pH 7.4)。
热稳定性的表征
通过毛细管差示扫描量热法(DSC)测量Tencon和每种突变蛋白在pBS(pH 7.4)(2-3mg/mL)中的热稳定性。使用装备有自动取样机的VP-DSC仪器(MicroCal，LLC)测量这些样本的解链温度。以每分钟1℃的速率将样本从10℃加热至95℃或100℃。在每种样本扫描之间完成仅缓冲液扫描以计算对于整合的基线。在减去仅缓冲液信号后，将数据拟合为两状态解折叠模型。通过重复对每种样本的扫描而不从细胞移除来确定热变性的可逆性。通过比较第1次扫描与第2次扫描的曲线下面积来计算可逆性。在表3中将DSC实验的结果呈现为来自完整熔解曲线的值(Tm(Kcal))。与亲本Tencon序列相比，单个突变体Tencon17、Tencon18、Tencon19和Tencon22具有提高的热稳定性。仅Tencon21显著不稳定。组合突变体Tencon23、Tencon24和Tencon25以及所有的稳定性具有显著更大的增强，表明设计的突变就提高热稳定性而言是相加的。
由盐酸胍引起的变性
如通过色氨酸荧光所测量，在用增加浓度的盐酸胍(GdmCl)处理后Tencon和每种突变体保持折叠的能力用于评估稳定性。Tencon仅含有一个色氨酸残基。色氨酸残基内埋在疏水核心并且因此在360nm的荧光发射是这种蛋白质的折叠状态的敏感度量。将含有50mM磷酸钠(pH 7.0)、150mM NaCl和各种浓度为0.48至6.63M的GdmC 200μL溶液移取到黑色、非结合96-孔板(Greiner)以便产生17点滴定。将含有Tencon突变体的10μL溶液加入到整个板上的每个孔以使得最终蛋白质浓度为23μM并且通过轻轻上下吸取来混合。在室温下孵育24小时后，使用在280nm激发和在360nm发射的Spectramax M5酶标仪(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)读取荧光。使用以下方程将荧光信号转变为解折叠分数(Pace，MethodsEnzymol 131:,266-280，1986):
fu＝(yF-y)/(yF-yU)
其中yF是折叠样本的荧光信号，并且yu是解折叠样本的荧光信号。
通过拟合为以下方程确定解折叠过渡段的中点和过渡段的斜率(Clarke等，1997)：
Figure BDA0002253336670000251
其中F是给定变性剂浓度下的荧光，并且αN和αD是天然和变性状态的y-截距，并且βN和βD是对于天然和变性状态的基线的斜率，[D]是GdmCl的浓度，[D]50％是50％样本变性所在点的GdmCl浓度，m是过渡段的斜率，R是气体常数，并且T是温度。使用以下方程估计对于每种样本的折叠自由能(Pace 1986同上；Clarke等人，J Mol Biol 270，771-778，1997)：ΔG＝m[D]50％
通常难于准确地计算此类曲线的过渡段的斜率m。另外，这里描述的突变不预期改变tencon的折叠机制。因此，计算对于每种突变体的m值，并且取平均值(Pace 1986同上)以产生m＝3544cal/mol/M用于所有自由能计算。将这些计算的结果呈现在表3中。GdmCl解折叠实验的结果证明就热稳定性而言使Tencon稳定的相同突变体也使针对GdmCl诱导的变性的蛋白质稳定。
表3：
Figure BDA0002253336670000252
Figure BDA0002253336670000261
尺寸排阻色谱法
尺寸排阻色谱法(SEC)用于评估Tencon和每种Tencon变体的聚集状态。将5μL的每种样本以0.3mL/min的流速与PBS流动相注入到Superdex 755/150柱(GE医疗集团(GEHealthcare))。通过280nm处的吸光度监测来自柱的洗脱液。为了评估聚集状态，在前用球状分子量标准物(Sigma)校准柱。所有测试的样本，除了Tencon21外，在与单聚体样本一致的洗脱体积时洗脱出一个峰。Tencon21洗脱出2个峰，表明聚集物的存在。
实例3：具有可供选择的结合表面的Tencon文库的产生
TCL14文库的设计
在特定的文库设计中选择待随机化的残基管理所创建的相互作用表面的总体形状。自其中BC、DE和FG环被随机化的文库中选择以结合麦芽糖结合蛋白(MBP)的含有FN3结构域的支架蛋白质的X-射线晶体学分析显示具有主要弯曲界面，其适合MBP的活性位点。(Koide等人，Proc Natl Acad Sci U S A，104，6632-6637，2007)。相比之下，发现选择以与MBP结合的锚蛋白重复支架蛋白质具有非常平坦的相互作用表面并且结合MBP远离活性位点的外表面。(Binz等人，Nat Biotechnol，22，575-58，2004)。这些结果表明支架分子的结合表面的形状(弯曲比对平坦)可决定什么靶蛋白或这些靶蛋白上的特异性表位能够被支架有效地结合。已公布的围绕工程改造含有FN3结构域的蛋白质支架以用于蛋白质结合的努力依赖于工程改造用于靶标结合的相邻的环(图1)，因此产生弯曲的结合表面。这种方法可能限制靶标和此类支架可及的表位的数量。
Tencon和其它FN3结构域含有位于分子相对面的两组CDR-样环，第一组由BC、DE和FG环形成，而第二组由AB、CD和EF环形成。两组环由形成FN3结构的β-链分隔(图1、2A)。如果在图1中呈示的Tencon结构的图像被旋转90度，则可供选择的表面可视(图2B)。该稍微凹型的表面由CD和FG环以及两条反平行的β-链(C和Fβ-链)形成，并在本文被称为C-CD-F-FG表面(图2B)。通过使形成该表面的残基的子组随机化，该C-CD-F-FG表面可用作模板来设计蛋白质支架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，其中每隔一个残基的侧链暴露于蛋白质的表面。因此，可通过使β链中的一些或所有表面暴露残基随机化来制备文库。通过选择β-链中的合适残基，Tencon支架的固有稳定性应被最低限度地损坏而同时提供用于与其它蛋白质相互作用的唯一支架表面。
新文库，在本文称为TCL14(SEQ ID NO:28)被设计为Tencon25支架(SEQ ID NO:25)，其具有另外的E11R取代(Tencon27，SEQ ID NO:27)(图2B、3)。对于Tencon27(SEQ IDNO:27)和TCL14(SEQ ID NO:28)环和链的位置以及它们的序列分别示出在表4和表5中。在表5中，“X”指示任何氨基酸。
Tencon27(SEQ ID NO:27)：
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT
TCL14文库(SEQ ID NO:28)：
LPAPKNLVVSRVTEDSARLSWTAPDAAFDSFXIXYXEXXXXGEAIVLTVPGSERSYDLTGLKPGTEYXVXIXGVKGGXXSXPLSAIFTT；
其中“X”为任何氨基酸。
形成Tencon27中的C-CD-F-FG表面的两条β链具有总共9个可被随机化的表面暴露残基；C-链：S30、L32、Q34、Q36；F-链：E66、T68、S70、Y72和V74，而CD环具有6个潜在残基：S38、E39、K40、V41、G42和E43，而FG环具有7个潜在残基：K75、G76、G77、H78、R79、S80和N81(图5)。如果所有22个残基都被随机化，那么由于文库的较大理论尺寸，选择挑选的残基以纳入TCL14设计中。
选择Tencon27(SEQ ID NO:27)中的13个位置用于随机化：C-链中的L32、Q34和Q36；CD-环中的S38、E39、K40和V41；F-链中的T68、S70和Y72；FG-环中的H78、R79和N81。在C和F链中，S30和E66未被随机化，因为它们刚好位于CD和FG环外并且似乎并非为C-CD-F-FG表面的部分。对于CD环，G42和E43未被随机化，因为甘氨酸(提供灵活性)在环中可以是有价值的，并且E43位于表面的接合点。FG环具有K75、G76、G77，并且不包括S80。因为上述原因而不包括甘氨酸，而晶体结构的仔细检查揭示与核心主要接触的S80有助于形成稳定的FG环。K75转向远离C-CD-F-FG表面的表面并且对于随机化不是极好的候选者。虽然以上提及的残基在原始TCL14设计中未被随机化，但它们可被纳入随后的文库设计中以为重新选择或例如为挑选的TCL14靶标特异性命中上的亲和力突变文库提供另外的多样性。
表4：
Figure BDA0002253336670000281
与现有的基于FN3-支架的文库设计(Koide，et al.J Mol Biol，284，1141-1151，1998；Koide等人，Proc Natl Acad Sci USA 104，6632-6637，2007；Dineen等人，BMCCancer，8，352-361，2008；Olson和Roberts，Protein Sci，16，476-484，2007；Xu等人，Chemistry&Biology，9，933-942，2002；Karatan等人，Chem Biol，11，835-844，2004；Hackel等人，JMol Biol，401，84-96，2010；Hackel等人，JMol Biol 381，1238-1252，2008；Koide等人，Proc Natl Acad Sci U S A，104，6632-6637，2007；Lipovsek等人，J Mol Biol，368，1024-1041，2007；国际专利公布WO2009/133208；国际专利公布WO2009/058379；美国专利7,115,396)相反，所设计的TCL14文库表面与抗体可变结构域或CDR或先前描述的FN3文库的结构在结构上没有相似性。由于由该设计产生的大相互作用表面，可能不需要亲和力成熟步骤就可以快速分离高亲和力分子。因为该设计并不
表5：
Figure BDA0002253336670000291
使连续氨基酸的长伸展随机化，所以其可产生比先前描述的文库更可溶且更稳定的FN3结合分子。与先前文库相比，所描述的TCL14文库产生平坦或凹型的相互作用表面。因此，选自TCL14的FN3分子可能结合与从先前FN3文库设计发现的那些不同的抗原和表位。TCL14文库设计也可允许产生相同分子上的两个不同的结合表面以实现双特异性。
TCL14文库的产生
使用顺式展示系统表达以上所述的TCL14文库(Odegrip等，Proc Natl Acad SciUSA 101:2806-2810，2004)。在该系统中，将文库连接至编码RepA编码序列的DNA片段、cis和ori元件和Tac启动子，并且所得的连接产物在体外转录/翻译。将所产生的TCL14-RepA融合蛋白在cis中结合至借其编码融合蛋白的DNA筛选文库的特异性地结合受关注蛋白质的支架分子，分离该分子并扩增结合的DNA以鉴定结合的支架分子的编码序列。
用简并引物和克隆的5'至RepA基因，使用聚合酶链式反应(PCR)通过使Tencon 27(SEQ ID NO:27)中的位置L32、Q34、Q36(C-链)；S38、E39、K40、V41(CD-环)；T68、S70、Y72(F-链)；H78、R79和N81(FG-环)随机化来产生TCL14文库以用于使用标准方案的顺式展示。使用引物C-CD N46V(SEQ ID No.51)使C链和C:D环随机化，并且使用引物F-FG-Sf E86I-R(SEQID No.52)使F链和F:G环随机化。用引物R1RecFor(SEQ ID NO:53)和DigLigRev(SEQ IDNO:54)扩增最终的连接物以产生用于体外转录/翻译的TCL14文库。表6示出所利用的引物的序列。密码子NNS用于多样化(IUB密码；N指示A、C、G或T；S指示C或G)。
表6：
Figure BDA0002253336670000301
TCL14文库的表征
使用TCON6(SEQ ID NO:55)和TCON5 E86I短(SEQ ID NO:56)引物将产生的TCL14文库PCR克隆进含有不依赖连接酶的克隆位点(pET154-LIC)的修饰的pET15载体(EMDBiosciences)。并且在使用标准方案进行转化和IPTG诱导(1mM最终浓度，30℃持续16小时)后，蛋白质表达为C末端His6-标记的蛋白质。通过离心收获细胞并随后用补充有0.2mg/mL鸡蛋清溶解酵素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)的Bugbuster HT(EMD Chemicals，Gibbstown，NJ)溶解。通过离心使细菌溶解物澄清并将上清液转移至新的96深孔板。使用96孔Ni-NTA Multitrap板(GE Lifesciences，Piscataway，NJ)对蛋白质进行纯化。
挑选克隆的随机选择和序列以评估文库中所得的分布。根据所期望的，文库中所观察到的多样性良好(图7)。为了计算全长文库克隆中观察到的多样性，在所有克隆中计数给定氨基酸在多样化文库区域中出现的次数并除以随机位置的总数(13个随机文库位置*69个全长克隆)并乘以100以产生频率％。预期的多样性基于具有以下氨基酸分布的NNS简并密码子：Phe＝1、Leu＝3、Ile＝1、Met＝1、Val＝2、Ser＝3、Pro＝2、Thr＝2、Ala＝2、Cys＝1、Arg＝3、Gly＝2、Tyr＝1、His＝1、Gln＝1、Asn＝1、Lys＝1、Asp＝1、Glu＝1、Trp＝1个密码子除以密码子的总数(32)乘以100以产生频率％。
使纯化的蛋白质经历尺寸排阻色谱以确定单独文库成员的聚集倾向。使用Agilent 1200HPLC通过将10μL纯化的蛋白质注入到Superdex 755/150柱来确定挑选的克隆的洗脱特征，其中吸光度读数在280nm。约80％的含有非半胱氨酸的克隆洗脱为单个单体峰，因此预示大多数单独的文库成员保持亲本分子的固有溶解性和结构。
人们发现，在纯化后一些分子包含游离半胱氨酸的分子被氧化，因此洗脱为二聚合分子。使用差示扫描量热法(DSC)进一步表征具有如通过SEC分析所确定的单分散特征。通过在VP-DSC毛细管细胞微热量计(Microcal，LLC，Piscataway，NJ)中以1℃/min的速率将每个克隆在PBS中的0.5mg/mL溶液从35℃加热至95℃来获得DSC数据。使用CpCalc(Microcal，LLC，Piscataway，NJ)软件计算每个克隆的解链温度，其中数据的汇总示于表7。所测试分子的平均解链温度为70±9℃。所获得的数据证明TCL14文库设计产生如下的支架分子，其保持显著量的亲本分子Tencon25的热稳定性(93℃)并且其本身在本质上热稳定并且折叠良好。
表7：
Figure BDA0002253336670000321
特异性地结合受关注靶分子的TCL14文库分子的选择
针对不同蛋白质类型的各种靶蛋白筛选TCL14文库以鉴定特异性地结合这些蛋白质和/或蛋白质结构域的支架分子，所述不同的蛋白质类型的靶蛋白由细胞表面受体细胞外结构域、细胞因子、激酶、磷酸酶、热休克蛋白和免疫球蛋白以及它们的片段。使用EZ-Link No-Weigh磺基-NHS-LC-生物素微量试管(Thermo Fisher，Rockford，IL)使在HEK293或大肠杆菌中表达的纯化可溶性蛋白质生物素酰化，然后深度透析至PBS。对于选择，使3μg的TCL14文库在大肠杆菌S30线性提取物(Promega，Madison，WI)中体外转录并翻译(IVTT)，并且表达的文库用Cis Block(2％BSA(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)、100μg/ml HerringSperm DNA(Promega，Madison，WI)、1mg/mL肝素(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)封闭。对于选择，每种生物素酰化的靶蛋白以浓度为400nM(第1轮)、200nM(第2和3轮)和100nM(第4和5轮)添加。结合的文库成员使用中和亲和素磁珠(Thermo Fisher，Rockford，IL)(第1、3和5轮)或链霉抗生物素蛋白磁珠(Promega，Madison，WI)(第2和4轮)回收，并且未结合的文库成员通过用500μL PBST洗涤珠粒5-14次接着用500μL PBS洗涤2次来去除。
5轮选择之后，DNA输出通过PCR扩增，并且使用标准方案亚克隆至pET154-LIC。
进行另外的选择轮以便鉴定对于两种靶蛋白具有提高的亲和力的支架分子。简而言之，如上所述制备来自第5轮的输出并且使其经历另外重复轮的选择，除了以下变化：与生物素酰化靶蛋白的孵育从1小时减少至15分钟，并且珠粒捕获从20分钟减少至15分钟，生物素酰化的靶蛋白减少至25nM(第6和7轮)或2.5nM(第8和9轮)，并且在过量的非生物素酰化靶蛋白存在下进行另外1小时的洗涤。这些变化的目的是同时选择具有可能较快的结合速率和较慢的解离速率的结合物，产生大致较低的KD。如上所述，对第9轮输出进行PCR扩增、克隆和表达。
结合受关注蛋白质和/或蛋白质结构域的支架分子的表征
结合
对来自第5轮淘选输出的188个单独克隆进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。Maxisorp板(Nunc，Rochester，NY)用0.1μg抗-His抗体(Qiagen，Valencia，CA)包被过夜，用Tris-缓冲盐水(pH 7.4)和0.05％Tween-20(TBST)洗涤，并且用Starting Block T20(Thermo Fisher，Rockford，IL)封闭。将含有1μg/ml His6-标记的TCL14-RepA融合物的澄清细菌溶解物或对照蛋白(人血清白蛋白)涂覆至包被板的孔上。将板孵育1小时，用TBST洗涤，并且使用Molecular Devices M5酶标仪用链霉抗生物素蛋白-HRP(JacksonImmunoresearch，West Grove，PA)和POD化学发光底物(Roche，Indianapolis，IN)检测生物素酰化的蛋白。通过命中率来评估文库的性能。命中率定义为具有高于对照信号10倍发光信号的支架分子除以所筛选克隆的总数(188)的百分比(％)。如表8所示，TLC14文库产生对于8种不同的蛋白质命中率在8％至45％之间的支架分子。细胞因子2为小鼠IL-17A。
表8：
靶标 命中率(％)
Ser/Thr激酶 37
受体ECD 45
免疫球蛋白 22
热休克蛋白 18
细胞因子 6
免疫球蛋白2 42
细胞因子2 18
磷酸酶 8
小鼠IL-17A结合物的表征
IL-17A受体抑制
进行抑制测定以确定针对小鼠IL-17A(mIL-17A)的第5和9轮淘选输出是否抑制mIL-17A与mIL-17A受体的结合。Maxisorp板用0.2μg/ml mIL-17A受体Fc融合物(R&DSystems，Minneapolis，MN)包被过夜，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)(pH 7.4)和0.05％Tween-20(TBST)洗涤并且用PBS中的2％BSA、5％蔗糖封闭。将10ng/ml生物素酰化-mIL17A(b-mIL-17A)添加至在PBS中的1％BSA中按1:50稀释的澄清细菌溶解物中，并且将混合物孵育20分钟。将封闭的板洗涤，并且将细菌溶解物/b-mIL-17A孵育物转移至板上。将板再孵育1小时，用PBST洗涤，并且生物素酰化蛋白用链霉抗生物素蛋白-HRP(Jackson Immunoresearch，West Grove，PA)和OPD比色底物(Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)检测。使用M5酶标仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在490nm处读取吸光度，并且将数据转化为抑制％。将mIL-17A:mIL-17受体结合的抑制百分比定义为100-(样本/阴性对照×100)。
使用上述方案在剂量响应抑制测定中对含有抑制mIL-17A:mIL-17受体相互作用的支架分子的挑选细菌溶解物进一步表征，除了以下不同：在测定中使用100μl的纯化的TCL14-His(Ni-NTA)融合蛋白，浓度为10μM至56pM。使用S形剂量响应拟合，从剂量响应曲线计算IC50值。如表9所述总结，mIL-17A特异性抑制剂的IC50范围为约9至约428pM。
表9：
克隆ID IC<sub>50</sub>(pM) k<sub>on</sub>(1/Ms) k<sub>off</sub>(1/s) K<sub>D</sub>(M)
TP1KR9P61-A2 33.93 137000 3.93E-05 2.87E-10
TP1KR9P61-A7 55.75 82000 3.46E-05 4.21E-10
TP1KR9P61-E2 42.82 147000 3.96E-05 2.70E-10
TP1KR9P61-G4 8.83 162000 5.02E-05 3.09E-10
TP1KR9P62-A2 261.1 408000 2.17E-05 5.31E-11
TP1KR9P62-C3 117.1 281000 1.05E-05 3.74E-11
TP1KR9P62-C6 109.1 568000 1.20E-05 2.12E-11
TP1KR9P62-D3 91.18 110000 6.07E-05 5.54E-10
TP1KR9P62-D4 242 105000 1.00E-05 9.52E-11
TP1KR9P62-D8 427.5 381000 1.48E-05 3.89E-11
TP1KR9P62-E3 64.16 113000 5.26E-05 4.64E-10
TP1KR9P62-H10 301.8 438000 2.11E-05 4.82E-10
亲和力测量
使用ProteOn XPR-36仪器(Bio-Rad)利用表面等离振子共振来测量结合mIL-17A的挑选分子的亲和力。以不同的密度(100～300Rus)在pH5.0和流速为30μL/min下经由胺偶联将纯化的分子直接固定在芯片上持续5分钟。测试以3倍浓度系列稀释的100nM时的mIL-17A与芯片表面上不同分子的结合。取决于其解离速率，在流速为100μL/min下监测所有样本的所有浓度的解离相1-2小时。注入缓冲液样本以监测基线稳定性，并且不使表面再生以用于进一步使用。将对于选自TLC14文库的支架分子的不同表面中的每一个的所有浓度系列的应答数据在总体拟合为1:1样本langmuir结合模型以提取动力学(kon，koff)和亲和力(KD)常数的估计值。如表9所总结，特异性地结合mIL-17A的支架分子的亲和力在亚毫微摩尔范围。
挑选的mIL-17A结合物的序列示出在SEQ ID NO:85-96，并且C和Fβ-链以及CD和FG环的序列示出在表10。
表10：
Figure BDA0002253336670000361
实例4：在第二可供选择的表面随机化的Tencon27文库
如在图2C中可视的，在C-CD-F-FG表面的相对侧上的Tencon27残基的第二可供选择的表面，在本文称为A-AB-B-BC-E表面，由Aβ-链、AB环、Bβ-链、BC环和Eβ-链形成。A-AB-B-BC-E表面也呈稍微凹型，并且可用作模板以通过使形成该表面的残基的子组随机化来设计蛋白质支架相互作用表面的文库。β-链具有重复结构，其中每隔一个残基的侧链暴露于蛋白质的表面。因此，可通过使β-链中的一些或所有表面暴露残基随机化来制备文库。通过选择β-链中的合适残基，Tencon27支架的固有稳定性应被最小损坏而同时提供用于与其它蛋白质相互作用的唯一支架表面。当与TCL14文库设计相比，使A-AB-B-BC-E表面随机化将在Tencon27结构的相对侧产生结合表面。对具有随机化A-AB-B-BC-E表面的Tencon27的文库设计示于SEQ ID NO:61(TCL15文库)和图6。
TCL15文库(SEQ ID NO:61)：
LPAPKXLXVXXVXXXXAXLXWXAPDAAFDSFLIQYQESEKVGEAIVLTVPGSERXYXLTGLKPGTEYTVSIYGVKGGHRSNPLSAIFTT；
其中X为任何氨基酸。
如以上对于TCL14文库所述，产生TCL15文库并选择特异性地结合靶分子的支架。
实例5：其它FN3结构域：通过使可供选择的表面随机化产生文库
由于FN3结构域之间的结构相似性，利用对于Tencon27支架的实例中描述的可供选择的表面的文库设计可应用于各种蛋白质的其它FN3结构域。此类FN3结构域可能是天然存在的或合成的，并且例如是基于纤连蛋白结构域的共有序列的Fibcon共有支架(SEQ IDNO:58)(美国专利公布2010/0255056)、人纤连蛋白的第10FN3结构域(FN10)(SEQ ID NO:97)、或来自人腱生蛋白的第3FN3结构域(TN3)(SEQ ID NO:3)，或表1列出的蛋白质中存在的任何FN3结构域。
对于具有随机化的C-CD-F-FG可供选择的表面的Fibcon,、FN10和TN3文库的文库设计分别示于图8和SEQ ID NO:62、98和99。使用其中描述的方案合成、表达设计的文库，并对其选择特异性结合物。
具有随机化的C-CD-F-FG表面的基于Fibcon的蛋白质支架文库(SEQ ID NO:62)：
LDAPTDLQVTNVTDTSITVSWTPPSATITGYXIXYXPXXXXGEPKELTVPPSSTSVTITGLTPGVEYXVXLXALKDNXXSXPLVGTQTT；
其中X为任何氨基酸。
具有随机化的C-CD-F-FG表面的基于FN10的蛋白质支架文库(SEQ ID NO:98)：
VSDVPRDLEVVAATPTSLLISWDAPAVTVRYYXIXYXEXXXXSPVQEFTVPGSKSTATISG LKPGVDYXIXVXAVTGRGDSPXXSXPISINYRT；
其中X为任何氨基酸。
具有随机化的C-CD-F-FG表面的基于TN3的蛋白质支架文库(SEQ ID NO:99)：
DAPSQIEVKDVTDTTALITWFKPLAEIDGIXLXYXIXXXXGDRTTIDLTEDENQYSIGNLKPDTEYXVXLXSRRGDXXSXPAKETFTT；
其中X为任何氨基酸。
与如对于Tencon27支架所描述的相似，组成其它FN3结构域的CD和/或FG环的一些或所有残基可被1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13个随机化位置替代以产生不同长度的文库。
将清楚的是本发明可不同于前述具体实施方式和实例中特别描述的其它方式实践。按照以上的教义，本发明的许多修改形式和变型是可能的，并且因此在所附权利要求的范围内。
序列表
<110> Janssen Biotech, Inc.
<120> 具有可供选择的结合表面的基于III型纤连蛋白重复的
蛋白质支架
<130> CEN5315WOPCT
<140> 待转让
<141> 2012-09-27
<150> 61/539670
<151> 2011-09-27
<160> 101
<170> PatentIn 版本 3.5
<210> 1
<211> 87
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 1
Ser Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val
1 5 10 15
Asn Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val
20 25 30
Tyr Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro
35 40 45
Gly Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu
50 55 60
Tyr Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro
65 70 75 80
Val Ser Ala Arg Val Ala Thr
85
<210> 2
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 2
Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe Lys Ser Ile Lys Glu
1 5 10 15
Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp Ile Ala Phe Glu Thr
20 25 30
Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu Asp Glu Gly Glu Ile
35 40 45
Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr Arg Gln Thr Gly Leu
50 55 60
Ala Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Ile Ser Leu His Ile Val Lys Asn Asn
65 70 75 80
Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr Thr Arg Leu Asp
85 90 95
<210> 3
<211> 88
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 3
Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Glu Leu
20 25 30
Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu
35 40 45
Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr
50 55 60
Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met Ser Ser Asn
65 70 75 80
Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr
85
<210> 4
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 4
Thr Gly Leu Asp Ala Pro Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp
1 5 10 15
Asn Ser Ile Thr Leu Glu Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser
20 25 30
Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val
35 40 45
Asp Val Pro Lys Ser Gln Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly
50 55 60
Leu Arg Pro Gly Thr Glu Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu
65 70 75 80
Asp Lys Glu Ser Asn Pro Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp
85 90 95
Thr Pro Lys Asp
100
<210> 5
<211> 88
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 5
Asp Thr Pro Lys Asp Leu Gln Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu
1 5 10 15
Thr Leu Leu Trp Lys Thr Pro Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu
20 25 30
Asn Tyr Ser Leu Pro Thr Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg
35 40 45
Asn Thr Thr Ser Tyr Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr
50 55 60
Asn Val Leu Leu Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala
65 70 75 80
Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys
85
<210> 6
<211> 92
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 6
Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Gly Trp Asp
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Gln Ala Tyr Glu His Phe
20 25 30
Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala
50 55 60
Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg
65 70 75 80
Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Gly Glu
85 90
<210> 7
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 7
Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val Ala Glu Val Gly Trp Asp
1 5 10 15
Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe
20 25 30
Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala
50 55 60
Ala Thr His Tyr Thr Ile Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser
65 70 75 80
Thr Thr Pro Leu Ser Val Glu Val Leu Thr Glu
85 90
<210> 8
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 8
Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr Val Thr Glu Val Ser Trp Asp
1 5 10 15
Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe
20 25 30
Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala
50 55 60
Gly Thr Pro Tyr Thr Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser
65 70 75 80
Thr Arg Pro Leu Ala Val Glu Val Val Thr Glu
85 90
<210> 9
<211> 95
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 9
Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp
1 5 10 15
Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe
20 25 30
Val Ile Gln Val Gln Glu Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu
35 40 45
Thr Leu Pro Gly Ser Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala
50 55 60
Ala Thr Pro Tyr Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg
65 70 75 80
Thr Pro Val Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu
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<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 10
Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu
1 5 10 15
Ser Phe Asn Leu Ser Trp Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe
20 25 30
Thr Ile Glu Ile Ile Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr
35 40 45
Asn Ile Ser Gly Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro
50 55 60
Ser Thr Asp Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg
65 70 75 80
Thr Lys Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu
85 90
<210> 11
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 11
Ala Leu Pro Leu Leu Glu Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr
1 5 10 15
Gly Phe Thr Val Ser Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Leu Val Thr Val Val Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe
35 40 45
Thr Leu Ser Gly Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr
50 55 60
Gly Ile Gly Tyr Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln
65 70 75 80
Thr Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val Thr Glu
85 90
<210> 12
<211> 92
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 12
Ala Glu Pro Glu Val Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp
1 5 10 15
Gly Phe Arg Leu Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe
20 25 30
Val Leu Lys Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu Glu Ile
35 40 45
Thr Leu Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Leu Thr Gly Leu Arg Glu
50 55 60
Ala Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg
65 70 75 80
Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met
85 90
<210> 13
<211> 89
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 13
Gly Ser Pro Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala
1 5 10 15
Thr Val Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile
20 25 30
Thr Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp
35 40 45
Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val Glu
50 55 60
Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser Glu Pro
65 70 75 80
Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu
85
<210> 14
<211> 88
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 14
Asp Gly Pro Ser Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala
1 5 10 15
Leu Ala Arg Trp Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile
20 25 30
Ser Tyr Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly
35 40 45
Asn Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
50 55 60
Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser Ser Thr Ile
65 70 75 80
Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu
85
<210> 15
<211> 89
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 15
Asp Ser Pro Arg Asp Leu Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala
1 5 10 15
Leu Leu Thr Trp Arg Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu
20 25 30
Val Tyr Glu Ser Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro
35 40 45
Asp Thr Thr Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr
50 55 60
Thr Ala Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile
65 70 75 80
Gln Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu
85
<210> 16
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于腱生蛋白C FN3域的共有FN3序列
<400> 16
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 17
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 17
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 18
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 18
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 19
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 19
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Asn Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 20
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 20
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Pro Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 21
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 21
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Tyr Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 22
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 22
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 23
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 23
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 24
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 24
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Pro Asp Ser
1 5 10 15
Leu Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 25
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 25
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 26
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 26
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Glu Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Asn Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Glu Phe Thr Thr
85
<210> 27
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有另外突变改善稳定性的腱生蛋白C FN3域的共有
FN3序列
<400> 27
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 28
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 基于具有随机化C-CD-F-FG表面的tencon27支架的TCL14
文库
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (34)..(34)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (36)..(36)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (38)..(41)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (68)..(68)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (70)..(70)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (72)..(72)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (78)..(79)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (81)..(81)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 28
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Xaa
20 25 30
Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser
65 70 75 80
Xaa Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 29
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架A链序列
<400> 29
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val
1 5 10
<210> 30
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架AB环
<400> 30
Thr Glu Asp Ser
1
<210> 31
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架B链
<400> 31
Ala Arg Leu Ser Trp
1 5
<210> 32
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架BC环
<400> 32
Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe
1 5
<210> 33
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架C链
<400> 33
Asp Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu
1 5
<210> 34
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架CD环
<400> 34
Ser Glu Lys Val Gly Glu
1 5
<210> 35
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架D链
<400> 35
Ala Ile Val Leu Thr Val Pro
1 5
<210> 36
<211> 4
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架DE环
<400> 36
Gly Ser Glu Arg
1
<210> 37
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架E链
<400> 37
Ser Tyr Asp Leu Thr
1 5
<210> 38
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架EF环
<400> 38
Gly Leu Lys Pro Gly
1 5
<210> 39
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架F链
<400> 39
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val
1 5 10
<210> 40
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架FG环
<400> 40
Lys Gly Gly His Arg Ser Asn
1 5
<210> 41
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架G链
<400> 41
Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
1 5
<210> 42
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架C链和CD环
<400> 42
Asp Ser Phe Leu Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu
1 5 10 15
<210> 43
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架F链和FG环
<400> 43
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
1 5 10 15
Asn
<210> 44
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Tencon27支架A链、AB环、B链和BC环
<400> 44
Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp Ser
1 5 10 15
Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe
20 25
<210> 45
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCL14文库C链
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 45
Asp Ser Phe Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu
1 5
<210> 46
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCL14文库F链
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 46
Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val
1 5 10
<210> 47
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCL14文库C链和CD环
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (10)..(13)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 47
Asp Ser Phe Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu
1 5 10 15
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCL14文库F链和FG环
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (4)..(4)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (14)..(15)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (17)..(17)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 48
Thr Glu Tyr Xaa Val Xaa Ile Xaa Gly Val Lys Gly Gly Xaa Xaa Ser
1 5 10 15
Xaa
<210> 49
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCL15文库A链、AB环、B链和BC环
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (10)..(11)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (13)..(16)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (18)..(18)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (20)..(20)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 49
Leu Pro Ala Pro Lys Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Ala Xaa Leu Xaa Trp Xaa Ala Pro Asp Ala Ala Phe
20 25
<210> 50
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TCL15文库E链
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (1)..(1)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (3)..(3)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 50
Xaa Tyr Xaa Leu Thr
1 5
<210> 51
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (19)..(20)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (21)..(21)
<223> s为g或c
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (25)..(26)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (27)..(27)
<223> s为g或c
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (31)..(32)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (33)..(33)
<223> s为g或c
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (37)..(38)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (39)..(39)
<223> s为g或c
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (40)..(41)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (42)..(42)
<223> s为g或c
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (43)..(44)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (45)..(45)
<223> s为g或c
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (46)..(47)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (48)..(48)
<223> s为g或c
<400> 51
gcggcgttcg actctttcnn satcnnstac nnsgaannsn nsnnsnnsgg tgaagcgatc 60
ggtctgaccg ttccgggttc tgaacgttct tacgacctga ccggtctgaa accgggtacc 120
gaatac 126
<210> 52
<211> 102
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (25)..(25)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (26)..(27)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (31)..(31)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (32)..(33)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (34)..(34)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (35)..(36)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (52)..(52)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (53)..(54)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (58)..(58)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (59)..(60)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (64)..(64)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (65)..(66)
<223> n为a、c、g或t
<400> 52
ggtggtgaag atcgcagaca gcggsnnaga snnsnnacca cctttaacac csnngatsnn 60
aacsnngtat tcggtacccg gtttcagacc ggtcaggtcg ta 102
<210> 53
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 53
gaacgcggct acaattaata cataacc 27
<210> 54
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 54
catgattacg ccaagctcag aa 22
<210> 55
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 55
aagaaggaga accggtatgc tgccggcgcc gaaaaac 37
<210> 56
<211> 65
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 56
gagccgccgc caccggttta atggtgatgg tgatggtgac caccggtggt gaagatcgca 60
gacag 65
<210> 57
<211> 2201
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 57
Met Gly Ala Met Thr Gln Leu Leu Ala Gly Val Phe Leu Ala Phe Leu
1 5 10 15
Ala Leu Ala Thr Glu Gly Gly Val Leu Lys Lys Val Ile Arg His Lys
20 25 30
Arg Gln Ser Gly Val Asn Ala Thr Leu Pro Glu Glu Asn Gln Pro Val
35 40 45
Val Phe Asn His Val Tyr Asn Ile Lys Leu Pro Val Gly Ser Gln Cys
50 55 60
Ser Val Asp Leu Glu Ser Ala Ser Gly Glu Lys Asp Leu Ala Pro Pro
65 70 75 80
Ser Glu Pro Ser Glu Ser Phe Gln Glu His Thr Val Asp Gly Glu Asn
85 90 95
Gln Ile Val Phe Thr His Arg Ile Asn Ile Pro Arg Arg Ala Cys Gly
100 105 110
Cys Ala Ala Ala Pro Asp Val Lys Glu Leu Leu Ser Arg Leu Glu Glu
115 120 125
Leu Glu Asn Leu Val Ser Ser Leu Arg Glu Gln Cys Thr Ala Gly Ala
130 135 140
Gly Cys Cys Leu Gln Pro Ala Thr Gly Arg Leu Asp Thr Arg Pro Phe
145 150 155 160
Cys Ser Gly Arg Gly Asn Phe Ser Thr Glu Gly Cys Gly Cys Val Cys
165 170 175
Glu Pro Gly Trp Lys Gly Pro Asn Cys Ser Glu Pro Glu Cys Pro Gly
180 185 190
Asn Cys His Leu Arg Gly Arg Cys Ile Asp Gly Gln Cys Ile Cys Asp
195 200 205
Asp Gly Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Gln Leu Ala Cys Pro Ser Asp
210 215 220
Cys Asn Asp Gln Gly Lys Cys Val Asn Gly Val Cys Ile Cys Phe Glu
225 230 235 240
Gly Tyr Ala Gly Ala Asp Cys Ser Arg Glu Ile Cys Pro Val Pro Cys
245 250 255
Ser Glu Glu His Gly Thr Cys Val Asp Gly Leu Cys Val Cys His Asp
260 265 270
Gly Phe Ala Gly Asp Asp Cys Asn Lys Pro Leu Cys Leu Asn Asn Cys
275 280 285
Tyr Asn Arg Gly Arg Cys Val Glu Asn Glu Cys Val Cys Asp Glu Gly
290 295 300
Phe Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Leu Ile Cys Pro Asn Asp Cys Phe
305 310 315 320
Asp Arg Gly Arg Cys Ile Asn Gly Thr Cys Tyr Cys Glu Glu Gly Phe
325 330 335
Thr Gly Glu Asp Cys Gly Lys Pro Thr Cys Pro His Ala Cys His Thr
340 345 350
Gln Gly Arg Cys Glu Glu Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Phe Ala
355 360 365
Gly Val Asp Cys Ser Glu Lys Arg Cys Pro Ala Asp Cys His Asn Arg
370 375 380
Gly Arg Cys Val Asp Gly Arg Cys Glu Cys Asp Asp Gly Phe Thr Gly
385 390 395 400
Ala Asp Cys Gly Glu Leu Lys Cys Pro Asn Gly Cys Ser Gly His Gly
405 410 415
Arg Cys Val Asn Gly Gln Cys Val Cys Asp Glu Gly Tyr Thr Gly Glu
420 425 430
Asp Cys Ser Gln Leu Arg Cys Pro Asn Asp Cys His Ser Arg Gly Arg
435 440 445
Cys Val Glu Gly Lys Cys Val Cys Glu Gln Gly Phe Lys Gly Tyr Asp
450 455 460
Cys Ser Asp Met Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gln His Gly Arg Cys
465 470 475 480
Val Asn Gly Met Cys Val Cys Asp Asp Gly Tyr Thr Gly Glu Asp Cys
485 490 495
Arg Asp Arg Gln Cys Pro Arg Asp Cys Ser Asn Arg Gly Leu Cys Val
500 505 510
Asp Gly Gln Cys Val Cys Glu Asp Gly Phe Thr Gly Pro Asp Cys Ala
515 520 525
Glu Leu Ser Cys Pro Asn Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asn
530 535 540
Gly Gln Cys Val Cys His Glu Gly Phe Met Gly Lys Asp Cys Lys Glu
545 550 555 560
Gln Arg Cys Pro Ser Asp Cys His Gly Gln Gly Arg Cys Val Asp Gly
565 570 575
Gln Cys Ile Cys His Glu Gly Phe Thr Gly Leu Asp Cys Gly Gln His
580 585 590
Ser Cys Pro Ser Asp Cys Asn Asn Leu Gly Gln Cys Val Ser Gly Arg
595 600 605
Cys Ile Cys Asn Glu Gly Tyr Ser Gly Glu Asp Cys Ser Glu Val Ser
610 615 620
Pro Pro Lys Asp Leu Val Val Thr Glu Val Thr Glu Glu Thr Val Asn
625 630 635 640
Leu Ala Trp Asp Asn Glu Met Arg Val Thr Glu Tyr Leu Val Val Tyr
645 650 655
Thr Pro Thr His Glu Gly Gly Leu Glu Met Gln Phe Arg Val Pro Gly
660 665 670
Asp Gln Thr Ser Thr Ile Ile Gln Glu Leu Glu Pro Gly Val Glu Tyr
675 680 685
Phe Ile Arg Val Phe Ala Ile Leu Glu Asn Lys Lys Ser Ile Pro Val
690 695 700
Ser Ala Arg Val Ala Thr Tyr Leu Pro Ala Pro Glu Gly Leu Lys Phe
705 710 715 720
Lys Ser Ile Lys Glu Thr Ser Val Glu Val Glu Trp Asp Pro Leu Asp
725 730 735
Ile Ala Phe Glu Thr Trp Glu Ile Ile Phe Arg Asn Met Asn Lys Glu
740 745 750
Asp Glu Gly Glu Ile Thr Lys Ser Leu Arg Arg Pro Glu Thr Ser Tyr
755 760 765
Arg Gln Thr Gly Leu Ala Pro Gly Gln Glu Tyr Glu Ile Ser Leu His
770 775 780
Ile Val Lys Asn Asn Thr Arg Gly Pro Gly Leu Lys Arg Val Thr Thr
785 790 795 800
Thr Arg Leu Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp
805 810 815
Thr Thr Ala Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly
820 825 830
Ile Glu Leu Thr Tyr Gly Ile Lys Asp Val Pro Gly Asp Arg Thr Thr
835 840 845
Ile Asp Leu Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys
850 855 860
Pro Asp Thr Glu Tyr Glu Val Ser Leu Ile Ser Arg Arg Gly Asp Met
865 870 875 880
Ser Ser Asn Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr Gly Leu Asp Ala Pro
885 890 895
Arg Asn Leu Arg Arg Val Ser Gln Thr Asp Asn Ser Ile Thr Leu Glu
900 905 910
Trp Arg Asn Gly Lys Ala Ala Ile Asp Ser Tyr Arg Ile Lys Tyr Ala
915 920 925
Pro Ile Ser Gly Gly Asp His Ala Glu Val Asp Val Pro Lys Ser Gln
930 935 940
Gln Ala Thr Thr Lys Thr Thr Leu Thr Gly Leu Arg Pro Gly Thr Glu
945 950 955 960
Tyr Gly Ile Gly Val Ser Ala Val Lys Glu Asp Lys Glu Ser Asn Pro
965 970 975
Ala Thr Ile Asn Ala Ala Thr Glu Leu Asp Thr Pro Lys Asp Leu Gln
980 985 990
Val Ser Glu Thr Ala Glu Thr Ser Leu Thr Leu Leu Trp Lys Thr Pro
995 1000 1005
Leu Ala Lys Phe Asp Arg Tyr Arg Leu Asn Tyr Ser Leu Pro Thr
1010 1015 1020
Gly Gln Trp Val Gly Val Gln Leu Pro Arg Asn Thr Thr Ser Tyr
1025 1030 1035
Val Leu Arg Gly Leu Glu Pro Gly Gln Glu Tyr Asn Val Leu Leu
1040 1045 1050
Thr Ala Glu Lys Gly Arg His Lys Ser Lys Pro Ala Arg Val Lys
1055 1060 1065
Ala Ser Thr Glu Gln Ala Pro Glu Leu Glu Asn Leu Thr Val Thr
1070 1075 1080
Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr Ala Ala Asp
1085 1090 1095
Gln Ala Tyr Glu His Phe Ile Ile Gln Val Gln Glu Ala Asn Lys
1100 1105 1110
Val Glu Ala Ala Arg Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu Arg Ala
1115 1120 1125
Val Asp Ile Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr Pro Tyr Thr Val Ser
1130 1135 1140
Ile Tyr Gly Val Ile Gln Gly Tyr Arg Thr Pro Val Leu Ser Ala
1145 1150 1155
Glu Ala Ser Thr Gly Glu Thr Pro Asn Leu Gly Glu Val Val Val
1160 1165 1170
Ala Glu Val Gly Trp Asp Ala Leu Lys Leu Asn Trp Thr Ala Pro
1175 1180 1185
Glu Gly Ala Tyr Glu Tyr Phe Phe Ile Gln Val Gln Glu Ala Asp
1190 1195 1200
Thr Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Val Pro Gly Gly Leu Arg
1205 1210 1215
Ser Thr Asp Leu Pro Gly Leu Lys Ala Ala Thr His Tyr Thr Ile
1220 1225 1230
Thr Ile Arg Gly Val Thr Gln Asp Phe Ser Thr Thr Pro Leu Ser
1235 1240 1245
Val Glu Val Leu Thr Glu Glu Val Pro Asp Met Gly Asn Leu Thr
1250 1255 1260
Val Thr Glu Val Ser Trp Asp Ala Leu Arg Leu Asn Trp Thr Thr
1265 1270 1275
Pro Asp Gly Thr Tyr Asp Gln Phe Thr Ile Gln Val Gln Glu Ala
1280 1285 1290
Asp Gln Val Glu Glu Ala His Asn Leu Thr Val Pro Gly Ser Leu
1295 1300 1305
Arg Ser Met Glu Ile Pro Gly Leu Arg Ala Gly Thr Pro Tyr Thr
1310 1315 1320
Val Thr Leu His Gly Glu Val Arg Gly His Ser Thr Arg Pro Leu
1325 1330 1335
Ala Val Glu Val Val Thr Glu Asp Leu Pro Gln Leu Gly Asp Leu
1340 1345 1350
Ala Val Ser Glu Val Gly Trp Asp Gly Leu Arg Leu Asn Trp Thr
1355 1360 1365
Ala Ala Asp Asn Ala Tyr Glu His Phe Val Ile Gln Val Gln Glu
1370 1375 1380
Val Asn Lys Val Glu Ala Ala Gln Asn Leu Thr Leu Pro Gly Ser
1385 1390 1395
Leu Arg Ala Val Asp Ile Pro Gly Leu Glu Ala Ala Thr Pro Tyr
1400 1405 1410
Arg Val Ser Ile Tyr Gly Val Ile Arg Gly Tyr Arg Thr Pro Val
1415 1420 1425
Leu Ser Ala Glu Ala Ser Thr Ala Lys Glu Pro Glu Ile Gly Asn
1430 1435 1440
Leu Asn Val Ser Asp Ile Thr Pro Glu Ser Phe Asn Leu Ser Trp
1445 1450 1455
Met Ala Thr Asp Gly Ile Phe Glu Thr Phe Thr Ile Glu Ile Ile
1460 1465 1470
Asp Ser Asn Arg Leu Leu Glu Thr Val Glu Tyr Asn Ile Ser Gly
1475 1480 1485
Ala Glu Arg Thr Ala His Ile Ser Gly Leu Pro Pro Ser Thr Asp
1490 1495 1500
Phe Ile Val Tyr Leu Ser Gly Leu Ala Pro Ser Ile Arg Thr Lys
1505 1510 1515
Thr Ile Ser Ala Thr Ala Thr Thr Glu Ala Leu Pro Leu Leu Glu
1520 1525 1530
Asn Leu Thr Ile Ser Asp Ile Asn Pro Tyr Gly Phe Thr Val Ser
1535 1540 1545
Trp Met Ala Ser Glu Asn Ala Phe Asp Ser Phe Leu Val Thr Val
1550 1555 1560
Val Asp Ser Gly Lys Leu Leu Asp Pro Gln Glu Phe Thr Leu Ser
1565 1570 1575
Gly Thr Gln Arg Lys Leu Glu Leu Arg Gly Leu Ile Thr Gly Ile
1580 1585 1590
Gly Tyr Glu Val Met Val Ser Gly Phe Thr Gln Gly His Gln Thr
1595 1600 1605
Lys Pro Leu Arg Ala Glu Ile Val Thr Glu Ala Glu Pro Glu Val
1610 1615 1620
Asp Asn Leu Leu Val Ser Asp Ala Thr Pro Asp Gly Phe Arg Leu
1625 1630 1635
Ser Trp Thr Ala Asp Glu Gly Val Phe Asp Asn Phe Val Leu Lys
1640 1645 1650
Ile Arg Asp Thr Lys Lys Gln Ser Glu Pro Leu Glu Ile Thr Leu
1655 1660 1665
Leu Ala Pro Glu Arg Thr Arg Asp Ile Thr Gly Leu Arg Glu Ala
1670 1675 1680
Thr Glu Tyr Glu Ile Glu Leu Tyr Gly Ile Ser Lys Gly Arg Arg
1685 1690 1695
Ser Gln Thr Val Ser Ala Ile Ala Thr Thr Ala Met Gly Ser Pro
1700 1705 1710
Lys Glu Val Ile Phe Ser Asp Ile Thr Glu Asn Ser Ala Thr Val
1715 1720 1725
Ser Trp Arg Ala Pro Thr Ala Gln Val Glu Ser Phe Arg Ile Thr
1730 1735 1740
Tyr Val Pro Ile Thr Gly Gly Thr Pro Ser Met Val Thr Val Asp
1745 1750 1755
Gly Thr Lys Thr Gln Thr Arg Leu Val Lys Leu Ile Pro Gly Val
1760 1765 1770
Glu Tyr Leu Val Ser Ile Ile Ala Met Lys Gly Phe Glu Glu Ser
1775 1780 1785
Glu Pro Val Ser Gly Ser Phe Thr Thr Ala Leu Asp Gly Pro Ser
1790 1795 1800
Gly Leu Val Thr Ala Asn Ile Thr Asp Ser Glu Ala Leu Ala Arg
1805 1810 1815
Trp Gln Pro Ala Ile Ala Thr Val Asp Ser Tyr Val Ile Ser Tyr
1820 1825 1830
Thr Gly Glu Lys Val Pro Glu Ile Thr Arg Thr Val Ser Gly Asn
1835 1840 1845
Thr Val Glu Tyr Ala Leu Thr Asp Leu Glu Pro Ala Thr Glu Tyr
1850 1855 1860
Thr Leu Arg Ile Phe Ala Glu Lys Gly Pro Gln Lys Ser Ser Thr
1865 1870 1875
Ile Thr Ala Lys Phe Thr Thr Asp Leu Asp Ser Pro Arg Asp Leu
1880 1885 1890
Thr Ala Thr Glu Val Gln Ser Glu Thr Ala Leu Leu Thr Trp Arg
1895 1900 1905
Pro Pro Arg Ala Ser Val Thr Gly Tyr Leu Leu Val Tyr Glu Ser
1910 1915 1920
Val Asp Gly Thr Val Lys Glu Val Ile Val Gly Pro Asp Thr Thr
1925 1930 1935
Ser Tyr Ser Leu Ala Asp Leu Ser Pro Ser Thr His Tyr Thr Ala
1940 1945 1950
Lys Ile Gln Ala Leu Asn Gly Pro Leu Arg Ser Asn Met Ile Gln
1955 1960 1965
Thr Ile Phe Thr Thr Ile Gly Leu Leu Tyr Pro Phe Pro Lys Asp
1970 1975 1980
Cys Ser Gln Ala Met Leu Asn Gly Asp Thr Thr Ser Gly Leu Tyr
1985 1990 1995
Thr Ile Tyr Leu Asn Gly Asp Lys Ala Glu Ala Leu Glu Val Phe
2000 2005 2010
Cys Asp Met Thr Ser Asp Gly Gly Gly Trp Ile Val Phe Leu Arg
2015 2020 2025
Arg Lys Asn Gly Arg Glu Asn Phe Tyr Gln Asn Trp Lys Ala Tyr
2030 2035 2040
Ala Ala Gly Phe Gly Asp Arg Arg Glu Glu Phe Trp Leu Gly Leu
2045 2050 2055
Asp Asn Leu Asn Lys Ile Thr Ala Gln Gly Gln Tyr Glu Leu Arg
2060 2065 2070
Val Asp Leu Arg Asp His Gly Glu Thr Ala Phe Ala Val Tyr Asp
2075 2080 2085
Lys Phe Ser Val Gly Asp Ala Lys Thr Arg Tyr Lys Leu Lys Val
2090 2095 2100
Glu Gly Tyr Ser Gly Thr Ala Gly Asp Ser Met Ala Tyr His Asn
2105 2110 2115
Gly Arg Ser Phe Ser Thr Phe Asp Lys Asp Thr Asp Ser Ala Ile
2120 2125 2130
Thr Asn Cys Ala Leu Ser Tyr Lys Gly Ala Phe Trp Tyr Arg Asn
2135 2140 2145
Cys His Arg Val Asn Leu Met Gly Arg Tyr Gly Asp Asn Asn His
2150 2155 2160
Ser Gln Gly Val Asn Trp Phe His Trp Lys Gly His Glu His Ser
2165 2170 2175
Ile Gln Phe Ala Glu Met Lys Leu Arg Pro Ser Asn Phe Arg Asn
2180 2185 2190
Leu Glu Gly Arg Arg Lys Arg Ala
2195 2200
<210> 58
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> FN3 scaffold based on consensuns fibronecting FN3 domains
<400> 58
Leu Asp Ala Pro Thr Asp Leu Gln Val Thr Asn Val Thr Asp Thr Ser
1 5 10 15
Ile Thr Val Ser Trp Thr Pro Pro Ser Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Arg
20 25 30
Ile Thr Tyr Thr Pro Ser Asn Gly Pro Gly Glu Pro Lys Glu Leu Thr
35 40 45
Val Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Thr Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly
50 55 60
Val Glu Tyr Val Val Ser Leu Tyr Ala Leu Lys Asp Asn Gln Glu Ser
65 70 75 80
Pro Pro Leu Val Gly Thr Gln Thr Thr
85
<210> 59
<211> 267
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码tencon支架的cDNA
<400> 59
ctgccggcgc cgaaaaacct ggttgtttct gaagttaccg aagactctct gcgtctgtct 60
tggaccgcgc cggacgcggc gttcgactct ttcctgatcc agtaccagga atctgaaaaa 120
gttggtgaag cgatcaacct gaccgttccg ggttctgaac gttcttacga cctgaccggt 180
ctgaaaccgg gtaccgaata caccgtttct atctacggtg ttaaaggtgg tcaccgttct 240
aacccgctgt ctgcggaatt caccacc 267
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 接头
<400> 60
Thr Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 61
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有随机化A-AB-B-BC-E表面的tencon27上的TCL15文库
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (6)..(6)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (8)..(8)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (10)..(11)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (13)..(16)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (18)..(18)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (20)..(20)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (22)..(22)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (55)..(55)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (57)..(57)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 61
Leu Pro Ala Pro Lys Xaa Leu Xaa Val Xaa Xaa Val Xaa Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
Ala Xaa Leu Xaa Trp Xaa Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe Leu
20 25 30
Ile Gln Tyr Gln Glu Ser Glu Lys Val Gly Glu Ala Ile Val Leu Thr
35 40 45
Val Pro Gly Ser Glu Arg Xaa Tyr Xaa Leu Thr Gly Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Thr Val Ser Ile Tyr Gly Val Lys Gly Gly His Arg Ser
65 70 75 80
Asn Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 62
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有随机化C-CD-F-FG表面的Fibcon文库
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (32)..(32)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (34)..(34)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (36)..(36)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (38)..(41)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (68)..(68)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (70)..(70)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (72)..(72)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (78)..(79)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (81)..(81)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 62
Leu Asp Ala Pro Thr Asp Leu Gln Val Thr Asn Val Thr Asp Thr Ser
1 5 10 15
Ile Thr Val Ser Trp Thr Pro Pro Ser Ala Thr Ile Thr Gly Tyr Xaa
20 25 30
Ile Xaa Tyr Xaa Pro Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Glu Pro Lys Glu Leu Thr
35 40 45
Val Pro Pro Ser Ser Thr Ser Val Thr Ile Thr Gly Leu Thr Pro Gly
50 55 60
Val Glu Tyr Xaa Val Xaa Leu Xaa Ala Leu Lys Asp Asn Xaa Xaa Ser
65 70 75 80
Xaa Pro Leu Val Gly Thr Gln Thr Thr
85
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 支架TP1KR9P61-A2的C链序列
<400> 63
Asp Ser Phe Ala Ile Glu Tyr Phe Glu
1 5
<210> 64
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆TP1KR9P62-A2的C链序列
<400> 64
Asp Ser Phe Ala Ile Glu Tyr Ser Glu
1 5
<210> 65
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆TP1KR9P62-D4的C链序列
<400> 65
Asp Ser Phe Gly Ile Ile Tyr Phe Glu
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 克隆TP1KR9P62-E3的C链序列
<400> 66
Asp Ser Phe Gly Ile Glu Tyr Phe Glu
1 5
<210> 67
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-A2的CD环
<400> 67
Asp Trp Trp Ser Gly Glu
1 5
<210> 68
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-A2的CD环
<400> 68
Asp Tyr Trp Leu Gly Glu
1 5
<210> 69
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-D4的CD环
<400> 69
Asp Trp Trp Ala Gly Glu
1 5
<210> 70
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-E3的CD环
<400> 70
Asp Tyr Trp Thr Gly Glu
1 5
<210> 71
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-A2的F链
<400> 71
Thr Glu Tyr Ala Val Ser Ile Arg Gly Val
1 5 10
<210> 72
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-A7的F链
<400> 72
Thr Glu Tyr Ser Val Ser Ile Arg Gly Val
1 5 10
<210> 73
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-A2
<400> 73
Thr Glu Tyr Gly Val Ser Ile Arg Gly Val
1 5 10
<210> 74
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-C3的F链
<400> 74
Thr Glu Tyr Ser Val Thr Ile Arg Gly Val
1 5 10
<210> 75
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-A2的FG环
<400> 75
Lys Gly Gly Met Pro Ser Ala
1 5
<210> 76
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-A7的FG环
<400> 76
Lys Gly Gly Tyr Pro Ser Ser
1 5
<210> 77
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-E2的FG环
<400> 77
Lys Gly Gly Met Pro Ser Pro
1 5
<210> 78
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P61-G4的FG环
<400> 78
Lys Gly Gly Tyr Pro Ser Ala
1 5
<210> 79
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-A2的FG环
<400> 79
Lys Gly Gly Tyr Pro Ser Pro
1 5
<210> 80
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-C3的FG环
<400> 80
Lys Gly Gly Pro Pro Ser Ser
1 5
<210> 81
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-C6的FG环
<400> 81
Lys Gly Gly Tyr Pro Ser Ser
1 5
<210> 82
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-D4的FG环
<400> 82
Lys Gly Gly Pro Pro Ser Arg
1 5
<210> 83
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-D8的FG环
<400> 83
Lys Gly Gly Leu Ala Ser Pro
1 5
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TP1KR9P62-H10的FG环
<400> 84
Lys Gly Gly His Pro Ser Val
1 5
<210> 85
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P61-A2
<400> 85
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ala Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Met Pro
65 70 75 80
Ser Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 86
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P61-A7
<400> 86
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ser Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro
65 70 75 80
Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 87
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P61-E2
<400> 87
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ala Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Met Pro
65 70 75 80
Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 88
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P61-G4
<400> 88
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ala Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro
65 70 75 80
Ser Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 89
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-A2
<400> 89
Met Leu Pro Ala Leu Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala His Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Ser Glu Asp Tyr Trp Leu Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Gly Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro
65 70 75 80
Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 90
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-C3
<400> 90
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ser Val Thr Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Pro Pro
65 70 75 80
Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 91
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-C6
<400> 91
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Cys Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ser Val Thr Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro
65 70 75 80
Ser Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 92
<211> 89
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-D3
<400> 92
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Leu Lys Pro Gly
50 55 60
Thr Glu Tyr Ser Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro Ser
65 70 75 80
Ser Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85
<210> 93
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-D4
<400> 93
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ile Ile Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ala Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Gly Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Pro Pro
65 70 75 80
Ser Arg Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 94
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-D8
<400> 94
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Gly Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Leu Ala
65 70 75 80
Ser Pro Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 95
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-E3
<400> 95
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Gly Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Tyr Trp Thr Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ala Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly Tyr Pro
65 70 75 80
Ser Ala Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 96
<211> 90
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mIL-17A结合支架TP1KR9P62-H10
<400> 96
Met Leu Pro Ala Pro Lys Asn Leu Val Val Ser Arg Val Thr Glu Asp
1 5 10 15
Ser Ala Arg Leu Ser Trp Thr Ala Pro Asp Ala Ala Phe Asp Ser Phe
20 25 30
Ala Ile Glu Tyr Phe Glu Asp Trp Trp Ser Gly Glu Ala Ile Val Leu
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Glu Arg Ser Tyr Asp Leu Thr Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Thr Glu Tyr Ser Val Ser Ile Arg Gly Val Lys Gly Gly His Pro
65 70 75 80
Ser Val Pro Leu Ser Ala Ile Phe Thr Thr
85 90
<210> 97
<211> 94
<212> PRT
<213> 智人（homo sapiens）
<400> 97
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr
20 25 30
Arg Ile Thr Tyr Gly Glu Thr Gly Gly Asn Ser Pro Val Gln Glu Phe
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Val Asp Tyr Thr Ile Thr Val Tyr Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp
65 70 75 80
Ser Pro Ala Ser Ser Lys Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr
85 90
<210> 98
<211> 94
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有随机化C-CD-F-FG表面的基于FN10的支架文库
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (33)..(33)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (35)..(35)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (37)..(37)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (39)..(42)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (69)..(69)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (71)..(71)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (73)..(73)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (83)..(84)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (86)..(86)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 98
Val Ser Asp Val Pro Arg Asp Leu Glu Val Val Ala Ala Thr Pro Thr
1 5 10 15
Ser Leu Leu Ile Ser Trp Asp Ala Pro Ala Val Thr Val Arg Tyr Tyr
20 25 30
Xaa Ile Xaa Tyr Xaa Glu Xaa Xaa Xaa Xaa Ser Pro Val Gln Glu Phe
35 40 45
Thr Val Pro Gly Ser Lys Ser Thr Ala Thr Ile Ser Gly Leu Lys Pro
50 55 60
Gly Val Asp Tyr Xaa Ile Xaa Val Xaa Ala Val Thr Gly Arg Gly Asp
65 70 75 80
Ser Pro Xaa Xaa Ser Xaa Pro Ile Ser Ile Asn Tyr Arg Thr
85 90
<210> 99
<211> 88
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 具有随机化C-CD-F-FG表面的基于TN3的支架文库
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (31)..(31)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (33)..(33)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (35)..(35)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (37)..(40)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (67)..(67)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (69)..(69)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (71)..(71)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (77)..(78)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (80)..(80)
<223> Xaa可为任何天然存在的氨基酸
<400> 99
Asp Ala Pro Ser Gln Ile Glu Val Lys Asp Val Thr Asp Thr Thr Ala
1 5 10 15
Leu Ile Thr Trp Phe Lys Pro Leu Ala Glu Ile Asp Gly Ile Xaa Leu
20 25 30
Xaa Tyr Xaa Ile Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Asp Arg Thr Thr Ile Asp Leu
35 40 45
Thr Glu Asp Glu Asn Gln Tyr Ser Ile Gly Asn Leu Lys Pro Asp Thr
50 55 60
Glu Tyr Xaa Val Xaa Leu Xaa Ser Arg Arg Gly Asp Xaa Xaa Ser Xaa
65 70 75 80
Pro Ala Lys Glu Thr Phe Thr Thr
85
<210> 100
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码tencon27的cDNA
<400> 100
atgctgccgg cgccgaaaaa cctggttgtt tctcgtgtta ccgaagactc tgcgcgtctg 60
tcttggaccg cgccggacgc ggcgttcgac tctttcctga tccagtacca ggaatctgaa 120
aaagttggtg aagcgatcgt tctgaccgtt ccgggttctg aacgttctta cgacctgacc 180
ggtctgaaac cgggtaccga atacaccgtt tctatctacg gtgttaaagg tggtcaccgt 240
tctaacccgc tgtctgcgat cttcaccacc 270
<210> 101
<211> 270
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 编码TCL14文库的cDNA
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (97)..(98)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (99)..(99)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (103)..(104)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (105)..(105)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (109)..(110)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (111)..(111)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (115)..(116)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (117)..(117)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (118)..(119)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (120)..(120)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (121)..(122)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (123)..(123)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (124)..(125)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (126)..(126)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (205)..(206)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (207)..(207)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (211)..(212)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (213)..(213)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (217)..(218)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (219)..(219)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (235)..(236)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (237)..(237)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (238)..(239)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (240)..(240)
<223> s为c或g
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (244)..(245)
<223> n为a、c、g或t
<220>
<221> 尚未归类的特性
<222> (246)..(246)
<223> s为c或g
<400> 101
atgctgccgg cgccgaaaaa cctggttgtt tctcgtgtta ccgaagactc tgcgcgtctg 60
tcttggaccg cgccggacgc ggcgttcgac tctttcnnsa tcnnstacnn sgaannsnns 120
nnsnnsggtg aagcgatcgt tctgaccgtt ccgggttctg aacgttctta cgacctgacc 180
ggtctgaaac cgggtaccga atacnnsgtt nnsatcnnsg gtgttaaagg tggtnnsnns 240
tctnnsccgc tgtctgcgat cttcaccacc 270

Claims (15)

1.一种制备III型纤连蛋白模块（FN3）结构域的文库的方法，所述文库具有由C β-链、CD环、F β-链和FG环形成的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括：
a. 提供具有与SEQ ID NO: 27的氨基酸序列至少80%相同的氨基酸序列的参考FN3结构域多肽；
b. 通过使至少一个C β-链残基和至少一个F β-链残基突变来将多样性引入到所述参考FN3结构域多肽中以形成具有所述多样化C-CD-F-FG可供选择的表面的FN3结构域文库。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述C β-链的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基S30是未突变的。
3.根据权利要求2所述的方法，其中对应于SEQ ID NO: 27的C β-链残基L32、Q34和Q36是突变的。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述F β-链中的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基E66是未突变的。
5.根据权利要求4所述的方法，其中对应于SEQ ID NO: 27的F-β链残基T68、S70和Y72是突变的。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述CD环中的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基G42和E43是未突变的。
7.根据权利要求6所述的方法，其中对应于SEQ ID NO: 27的残基S38、E39、K40和V41是突变的。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述FG环中的1、2、3或4个残基是突变的，并且对应于SEQ ID NO: 27的残基K75、G76、G77和S80是未突变的。
9.根据权利要求8所述的方法，其中对应于SEQ ID NO: 27的残基H78、R79和N81是突变的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述参考FN3结构域包含SEQ ID NO: 27的氨基酸序列。
11.根据权利要求10所述的方法，包括在氨基酸位置11、14、17、37、46、73或86处的至少一种取代。
12.一种由权利要求1的方法制备的文库。
13.根据权利要求12所述的文库，其中所述文库包含SEQ ID NO: 28的氨基酸序列。
14.一种获得包含III型纤连蛋白模块（FN3）结构域的蛋白质支架的方法，所述蛋白质支架具有能够与靶分子特异性地结合的多样化C-CD-F-FG可供选择的表面，所述方法包括使权利要求12的文库与所述靶分子接触或用所述靶分子淘选权利要求12的文库，以及分离以预定亲和力与所述靶分子特异性地结合的蛋白质支架。
15.本文描述的任何发明。
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