CN101838628B - 利用埃希杆菌属细菌生产l-氨基酸的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了用埃希杆菌属细菌生产L-氨基酸(例如L-苯丙氨酸或L-精氨酸)的方法，其中通过增强yddG基因编码的蛋白质活性而提高了这些细菌对L-氨基酸的生产效率。

Description

利用埃希杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法

本申请为分案申请，原申请的申请日为2002年11月21日，申请号为02827470.9(PCT/JP02/12203)，发明名称为“利用埃希杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法”。

技术领域

本发明涉及生物技术，具体涉及发酵生产某些氨基酸，即芳香族酸，例如L-苯丙氨酸和L-色氨酸的方法，更具体地涉及来源于大肠杆菌的一个基因。该基因能提高L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生产效率。

背景技术

传统上，利用天然来源微生物菌株或对该微生物菌株特别修饰以提高L-氨基酸生产效率的突变株进行发酵，来实现L-氨基酸的工业生产。

现已公开了许多提高L-氨基酸生产效率的技术，例如用重组DNA转化微生物(参见：美国专利4,278,765)。这些技术建立在提高参与氨基酸生物合成的酶活性和/或降低对生成的氨基酸起反馈抑制作用的靶标酶敏感性的基础之上(参见：日本专利申请No 56-18596(1981)，WO 95/16042或美国专利5,661,012和6,040,160)。

另一方面，增加氨基酸的分泌活性也可以提高L-氨基酸产生株的生产效率。已经公开了一种属于棒状杆菌属的赖氨酸产生株，其赖氨酸分泌基因(lysE基因)的表达增加(WO 9723597A2)。此外，编码用于L-半胱氨酸、L-胱氨酸、N-乙酰丝氨酸或噻唑烷衍生物分泌的外泌蛋白的基因也已被公开(美国专利5,972,663)。

目前，已公开了大肠杆菌中几个能增加L-氨基酸产量、编码产物推定为膜蛋白质的基因。rhtB基因的额外拷贝使细菌对L-高丝氨酸的耐受增加并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP994190A2)。rhtC基因的额外拷贝使细菌对L-高丝氨酸、L-苏氨酸更具耐受力，并提高L-高丝氨酸、L-苏氨酸和L-亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP1013765A1)。yahN、yeaS、yfiK和yggA基因的额外拷贝能提高L-谷氨酸、L-赖氨酸、L-苏氨酸、L-丙氨酸、L-组氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-缬氨酸和L-异亮氨酸的产量(欧洲专利申请EP 1016710A2)。

在本发明人早期曾获得了一个突变株大肠杆菌K-12，该突变株具有突变的thrR基因(在这里被称作rhtA23)，该突变与该菌株对基础培养基中高浓度的苏氨酸和高丝氨酸的耐受性有关(Astaurova，O.B.etal.，Appl.Biochem.Microbiol.，21，611-616，1985)。对于不同的大肠杆菌生产株系，突变分别提高了L-苏氨酸(SU974817)、高丝氨酸和谷氨酸盐(Astaurova，O.B.et al.，Appl.Biochem.Microbiol.，27，556-561，1991)的产量。

另外，本发明人发现rhtA基因位于大肠杆菌染色体的第18微小体(min)处，邻近编码谷氨酰胺转运体系组分的glnHPQ操纵子，而且与pexB基因和ompX基因之间的ybiF开放式阅读框一致。表达这个开放式阅读框编码的蛋白质的DNA单位定名为rhtA基因(rht：高丝氨酸和苏氨酸耐受)。

此外，本发明人发现rhtA基因扩增也会增加细菌对高丝氨酸、苏氨酸的耐受性。rhtA23突变将在其ATG起始密码子-1位上的A替换为G(1997年8月24-29号在加利福尼亚旧金山市召开的第17届国际生物化学和分子生物学大会及1997年美国生物化学和分子生物学界年会论文摘要第457号)。已知起始密码子和SD序列的间隔区核苷酸组成、尤其是起始密码子即上游的序列极大的影响mRNA的翻译能力。现已发现起始密码子前三位的核苷酸的差异可造成基因表达水平相差20倍(Gold et al.，Annu.Rev.Microbiol.，35，365-4031981；Hui et al.，EMBO J.，3，623-629，1984)。因此，rhtA23突变可增加rhtA的基因表达。

rhtA基因编码的蛋白质由295个氨基酸残基组成，计算得到分子量为31.3KD。对RhtA序列的分析表明此蛋白质高度疏水且预测含10个跨膜片段。对大肠杆菌K-12株系核苷酸序列进行PSI-BLAST检索(Science，277，1453-1474(1997))显示至少有10个RhtA蛋白的类似物。其中包括由ydeD和yddA基因编码的蛋白质。较早些时候，人们发现ydeD基因参与半胱氨酸通路代谢产物的外泌(Dassler et al.，Mol.Microbiol.，36，1101-1112，2000；US5,972,663)。yddG已推定为CDS，可编码功能未知的蛋白质(GenBank注册号为AE000244U00096的序列中3687～4568位)。

发明内容

本发明的目的是提高L-苯丙氨酸生产菌株的生产效率并提供利用此菌株生产L-苯丙氨酸的方法。本发明的目的还在于提高L-色氨酸生产菌株的生产效率并提供利用此菌株生产L-色氨酸的方法。

本发明的目标是通过对yddG基因的鉴定而实现的。yddG基因编码一个膜蛋白，为RhtA的类似物，它并不参与目标L-氨基酸的生物合成路径，而当微生物多拷贝载体上的该基因的野生型等位基因扩增时可增高微生物对苯丙氨酸和几种氨基酸类似物的耐受。此外，当yddG基因附加拷贝导入氨基酸产生株细胞时，可提高L-苯丙氨酸的产量。并且当yddG基因在氨基酸产生株细胞中的表达增加时，可提高L-色氨酸的产量。本发明由此得以完成。

本发明内容如下：

1)埃希杆菌(Escherichia)属的L-氨基酸生产细菌，其中通过增强细菌细胞内下面(A)或(B)所定义的蛋白质活性提高细菌的L-氨基酸产量：

(A)含有序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列的蛋白质。

(B)含有对序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列的蛋白质，其具有使细菌增强对L-苯丙氨酸和/或氨基酸类似物(例如对-氟-苯丙氨酸和5-氟-DL-色氨酸等)的耐受性的活性。

(在下文中，上述(A)或(B)定义的蛋白质称为“本发明的蛋白质”)；

2)如上所述细菌，其中通过使用编码(A)或(B)所定义蛋白质的DNA转化细菌，或者通过改变细菌染色体中上述DNA的表达调控序列，增强(A)或(B)所定义蛋白质的活性。

3)如上所述细菌，其中转化是使用含有所述DNA的多拷贝载体进行的。

4)如上所述细菌，其中所述DNA的天然启动子被替换为更强的启动子。

5)生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养如前所述的细菌，并从培养基中收集所产生并积累的L-氨基酸。

6)如上所述的方法，其中L-氨基酸为L-苯丙氨酸。

7)如上所述的方法，其中细菌提高了苯丙氨酸生物合成基因的表达。

8)如上所述的方法，其中L-氨基酸为L-色氨酸。

9)如上所述的方法，其中细菌提高了色氨酸生物合成基因的表达。

10)生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法，包括：在培养基中培养依照前文的细菌，以在培养基中生成并积累L-苯丙氨酸，所述细菌具有L-苯丙氨酸的生产能力；从天冬氨酸或其衍生物，和获得的L-苯丙氨酸来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。

11)如前所述的方法，进一步包括：

酯化L-苯丙氨酸以生产L-苯丙氨酸低级烷基酯，

用天冬氨酸衍生物凝聚(condensing)L-苯丙氨酸低级烷基酯，其中衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐，

从反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，

氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。

本发明中除非另外注明，氨基酸均为L-构型。

本发明生产L-氨基酸的方法包括：利用L-苯丙氨酸生产菌生产L-苯丙氨酸，该菌中本发明的蛋白质活性增加，所述蛋白质如含有SEQID NO：2中氨基酸序列的蛋白质。另外，生产L-氨基酸的方法还包括：利用L-色氨酸生产菌生产L-色氨酸，该菌中本发明的蛋白质活性增加，所述蛋白质如含有SEQ ID NO：2中氨基酸序列的蛋白质。

本发明详述如下：

本发明所涉及的细菌是埃希杆菌属的L-氨基酸生产菌，其中细菌产生L-氨基酸的量通过增强细菌细胞中本发明的蛋白质活性得以提高。

在本发明中，“L-氨基酸生产菌”是指在培养基中培养时能在培养基中产生并积累L-氨基酸的细菌。L-氨基酸的产生能力可以是细菌的某个野生株系所具有的性质，也可以通过繁育获得或提高。

本发明细菌的优选实施方案是增高了本发明中蛋白质活性的埃希杆菌属L-苯丙氨酸生产菌。更具体地说，本发明所涉及的细菌DNA的yddG基因在染色体中或细菌质粒中超表达(overexpress)，提高了L-苯丙氨酸的生产能力。本发明细菌的另一个优选实施方案是增高了本发明中蛋白质活性的埃希杆菌属L-色氨酸生产菌。更具体地说，本发明所涉及的细菌DNA的yddG基因在染色体中或细菌质粒中超表达，提高了L-色氨酸的生产能力。

本发明的蛋白质包含定义如下的蛋白(A)或(B)：

(A)包含有序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列的蛋白质。

(B)包含有对序列表SEQ ID NO：2中氨基酸序列缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸后所得的序列的蛋白质，且具有使细菌增强对例如苯丙氨酸的氨基酸和/或例如对-氟-苯丙氨酸、5-氟-DL-色氨酸等氨基酸类似物耐受性的活性。

前文中“几个”氨基酸的具体指代数目根据氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置和类型而变化。它可以是2～30个，优选2～15个，对蛋白(A)来说更优选2～5个氨基酸残基。

“对L-氨基酸和/或氨基酸类似物的耐受性(resistance)”指细菌在含有某种浓度的L-氨基酸或其类似物的基础培养基中生长的能力，在这种浓度的L-氨基酸或其类似物存在时其它未修饰的或野生型的细菌或细菌的亲代株系不能生长；或是指细菌在含有L-氨基酸或其类似物的基础培养基中比其它未修饰的或野生型的细菌或细菌的亲代株系具有更快速生长的能力。L-氨基酸类似物可举例如对-氟-苯丙氨酸、5-氟-DL-色氨酸等。对L-苯丙氨酸来说，上面提到的L-氨基酸或氨基酸类似物的浓度通常为10～25mg/mL，优选15～20mg/mL。对对-氟-苯丙氨酸来说，上面提到的L-氨基酸或氨基酸类似物的浓度通常为0.1～5mg/mL，优选0.5～2.0mg/mL；对5-氟-DL-色氨酸来说通常为0.2～20μg/mL，优选2～5μg/mL。

本发明所涉及的细菌还包括：通过使用编码蛋白(A)或(B)的DNA转化前述细菌而使菌体内本发明的蛋白质活性增加的细菌；或者通过改变细菌染色体中上述DNA的表达调控序列而使菌体内本发明的蛋白质的活性增强的细菌。

用来修饰本发明所涉及的细菌的DNA可编码有L-氨基酸分泌活性的蛋白质。更具体地说，yddG基因即为此类DNA的代表。yddG基因可以通过如PCR等方式获得，PCR引物可依据SEQ ID NO：1中的氨基酸序列设计。

本发明所涉及的DNA包含如下DNA，其编码的蛋白可由蛋白(A)中一个或几个位点上缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸得到，只要所得蛋白的活性不丧失。“几个”氨基酸的具体数目根据氨基酸残基在蛋白质三维结构中的位置和类型而变化，可以是2～30个，优选2～15个，对蛋白(A)来说更优选2～5个氨基酸残基。通过一些方式可获得实质上与蛋白(A)相同的蛋白质的编码DNA，例如，运用定点突变来修饰编码蛋白(A)的DNA的核苷酸序列使得缺失、替换、插入或添加一个或几个氨基酸残基。这样修饰的DNA能在常见的试剂和条件下诱变获得。这些处理方法，包括用羟胺诱变蛋白(A)的编码DNA，或对含有这样DNA的细菌用紫外线照射或用如N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍或亚硝酸之类的试剂诱变。

本发明所涉及的DNA包含在自然界分类中属于埃希杆菌属的不同株系和变种的各种变异DNA。编码变体的这些DNA能在严苛的条件下与yddA基因的全部或部分杂交后分离获得，它们编码的蛋白质可提高L-氨基酸的产量。术语“严苛的条件”在此是指某个特定的条件，在这样的条件下，形成所谓的“特异性杂交”，而不发生非特异的杂交。举例来说，严苛的条件包含这样一个情形，只有在此条件下高度同源的DNA之间，例如同源性不少于70％的DNA之间可杂交成功。不然的话，严苛的条件可能代表如下情形，它包括常用的Southern杂交洗脱条件，比如60℃、1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS。对于那些编码变种的DNA和杂交yddG基因后的DNA产物，SEQ ID NO：1核苷酸序列的一部分依然可以用作探针。这样的探针可以由依据SEQ ID NO：1核苷酸序列制得的寡核苷酸作为引物，由含有SEQ ID NO：1核苷酸序列的DNA片段为模板用PCR方法合成。举例来说，当用一个长度约为300bp的DNA片段作为探针时，洗脱的条件则变为50℃、2×SSC、0.1％SDS。

用编码蛋白质的DNA转化细菌意思是把该DNA导入菌体(如通过常规的方法)来增加本发明的蛋白质表达，增强其在菌体内的活性。

增高基因表达的方法包括增加基因的拷贝数目。基因拷贝数的增加可通过把基因引入能在埃希杆菌属细菌中行使功能的载体而实现。为达到此目的，优选使用多拷贝载体，例如pBR322、pUC19、pBluescriptKS+、pACYC177、pACYC184、pAYC32、pMW119、pET22b或其它此类载体。

此外，基因表达的增高可通过将多拷贝基因整合到细菌染色体上实现，其途径诸如同源重组或其它此类方法。

倘若两个或多个基因表达增高了，则这些基因可能处于同一质粒中或者分散在不同质粒里。也可以是其中一个基因定位于染色体上，而其它基因存在于质粒中。

另一方面，用强启动子替代其天然启动子起调控作用也可使本发明所涉及的DNA的基因表达增高。启动子的强度根据RNA合成起始的频率来判定。Deuschle，U.，Kammerer，W.，Gentz，R.，Bujard，H.描述了评价启动子强弱的方法，并举出了强启动子的例子(大肠杆菌中的启动子：一个标志菌体结构更替的体内强度体系，EMBO J.1986，5，2987-2994)。举例来说，λ噬菌体P_L启动子就是强启动子。其它已知的强启动子有lac启动子、trp启动子、trc启动子等等。可以将利用强启动子和增多基因拷贝相结合。

染色体DNA的制备、杂交、PCR、质粒的制备、DNA的消化和连接、转化、寡核苷酸引物的选择等可采用本领域中的技术人员所熟知的常规方法。这些方法在Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.编著的，冷泉港实验室出版社出版的《分子克隆实验指南》第三版(2001)等著作中有描述。

将前述DNA导入可生产L-氨基酸的埃希杆菌属细菌可获得本发明所涉及的细菌。或者，也可通过将生产L-氨基酸的能力传给具有前述DNA的埃希杆菌属细菌而获得本发明所涉及的细菌。

埃希杆菌属的具体细菌并无特殊限定，只要它有生产L-氨基酸的能力或者它能获得这种能力。这样的埃希杆菌属细菌的例子包括大肠杆菌。

埃希杆菌属的苯丙氨酸生产菌株可以作为亲代株系来提高本发明的蛋白质活性，例如，菌株AJ12739(tyrA::Tn10，tyrR)(VKPM B-8197)、含有pheA34基因(US5,354,672)的菌株HW1089(ATCC编号55371)、突变的MWEC101-b菌株(KR8903681)、菌株NRRL B-12141、NRRLB-12145、NRRL B-12146和NRRL B-12147(US4,407,952)等。同样的，属于埃希杆菌属的大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPHAB](FERMBP-3566)、大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPHAD](FERM BP-12659)、大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPHATerm](FERM BP-12662)和命名为AJ12604的大肠杆菌K-12株系[W3110(tyrA)/pPB-aroG4，pACMAB](FERM BP-3579)等苯丙氨酸生产菌株也可作为亲代株系来提高本发明涉及蛋白的活性(欧洲专利EP488424B1)。

埃希杆菌属的色氨酸生产菌株可以作为亲代株系来提高本发明的蛋白质活性，例如，trpS基因突变产生的大肠杆菌色氨酸tRNA合成酶缺陷菌株JP4735/pMU3028(DSM10122)和JP6015/pMU91(DSM10123)(US5,756,345)；含有serA等位基因而不受丝氨酸反馈抑制的大肠杆菌SV164(pGH5)菌株(US6,180,373)；大肠杆菌色氨酸合成酶缺陷菌株AGX17(pGX44)(NRRL B-12263)和AGX6(pGX50)aroP(NRRL B-12264)(US4,371,614)；增强了磷酸烯醇丙酮酸产量的大肠杆菌AGX17/pGX44、pACKG4-pps菌株(WO97/08333，US6,319,696)等等。

本发明方法包括生产L-氨基酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明所涉及的细菌，使L-氨基酸在培养基中产生并积累，从培养基中收集L-氨基酸。同样的，本发明方法包括生产L-苯丙氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明所涉及的细菌，使L-苯丙氨酸在培养基中产生并积累，从培养基中收集L-苯丙氨酸。同样，本发明方法也包括生产L-色氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养本发明所涉及的细菌，使L-色氨酸在培养基中产生并积累，从培养基中收集L-色氨酸。

在本发明中，在培养基中培养微生物、收集和纯化L-氨基酸等可以采用和常规发酵生产氨基酸的方法相类似的方法。所用的培养基可以是合成的或者是天然的，只要该培养基含有碳源、氮源、矿物质和必要时微生物生长需添加的其它适当营养物质。碳源可以包括各种碳水化合物，例如葡萄糖、蔗糖以及各种有机酸。根据微生物同化作用的不同，也可用醇类，包括乙醇和甘油作为碳源。至于氮源，包括各种铵盐(氨水和硫酸铵等)，其它的含氮化合物如胺类，天然来源的氮源(如蛋白胨、豆类水解产物和发酵消化的微生物等)。矿物质，包括单磷酸钾盐、硫酸锰、氯化钙等。必要时培养基中还要加入其它的营养素，举例来说，微生物(酪氨酸缺陷型)的生长需要酪氨酸，培养基中就要另外加入足量的酪氨酸。

培养时优选在有氧状态中进行，比如通风状态下振摇和搅拌培养基，温度为20～42℃，更优选37～40℃下培养。培养的pH值为5～9，优选6.5～7.2。培养时的pH值可以用氨水、碳酸钙、各种酸、各种碱和缓冲液来调整。一般来说，一至五天的培养可使目标L-氨基酸在液体培养基中累积。

培养后，固态物如菌体能通过离心或膜过滤的方式从液体培养基中分离出来，接着目标L-氨基酸可以用常规的方法如离子交换，浓缩和结晶来收集和纯化。

举例来说，采用本发明方法获得的苯丙氨酸可以用作生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯(还称作“天冬氨酰苯丙氨酸酯(aspartame)”)。这就是说，本发明方法包括以L-苯丙氨酸为原料生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法。该方法包含用本发明前述方法生产的苯丙氨酸和天冬氨酸或其衍生物来进行α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的合成。低级烷基酯可以指甲酯、乙酯、丙酯等等。

本发明方法中，由苯丙氨酸以及天冬氨酸或其衍生物来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的具体过程并无特殊限定，可采用能用L-苯丙氨酸或其衍生物合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的任意常规方法。具体的，举例来说，α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的生产可能经由下列步骤(US3,786,039)：L-苯丙氨酸酯化得到L-苯丙氨酸低级烷基酯；L-苯丙氨酸烷基化酯和氨基及β-羟基被保护、α-羟基被酯化激活的L-天冬氨酸衍生物反应，此衍生物包括N-酰基-L-天冬氨酸酐，例如N-甲酰基-、N-苄氧羰基-或N-对-甲氧基-苄氧羰基-L-天冬氨酸酐；浓缩得到N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸和N-酰基-β-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸混合物，如果浓缩反应体系在37℃下解离常数为10^-4或更低的有机酸存在，混合物中α型对β型的比率会增加(日本专利申请No.51-113841)；然后从混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸，再将其氢化，获得α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸。

附图简述

图1所示为构建的yddG基因上游染色体区域的结构。

实施本发明的最佳模式

本发明将在以下实施例中得到更具体的解释。

实施例1：从大肠杆菌中克隆yddG基因

已测定了大肠杆菌K-12菌株的全部核苷酸序列(Science，277，1453-1474，1997)。PSI-BLAST检索发现其基因组上至少有10个rhtA基因旁系同源物(paralogues)，其中包括yddG基因。yddG基因编码产物推测为能跨膜的亚单位，该蛋白质的功能还不清楚。

根据报道的核苷酸序列，合成了如SEQ ID所述的No.3(引物1)和No.4(引物2)两个引物。引物1的序列与yddG基因终止密码子下游91～114的核苷酸序列互补，并在其5′末端加入了限制性内切酶BamHI的识别位点。引物2的序列与yddG基因起始密码子上游224～200的核苷酸序列互补，并在其5′末端加入了限制性内切酶SalI的识别位点。

通过常规方法制得大肠杆菌TG1菌株的染色体DNA。使用Taq聚合酶(Fermentas)在“Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400”PCR仪中进行PCR反应，条件如下：95℃40秒，47℃40秒，72℃40秒，共30个循环。扩增得到的、含yddG基因及其启动子的片段用BamHI和SalI双酶切后，与经过同样双酶切的载体pUC19或pAYCTER3连接，分别得到质粒pYDDG1和pYDDG2。pAYCTER3载体是pAYC32的衍生物。pAYC32是在质粒RSF1010的基础上构建的，有中度的拷贝数，非常稳定(Christoserdov A.Y.，Tsygankov Y.D，来源于RSF1010Tn1质粒的广泛宿主载体，Plasmide，1986，V.16，pp.161-167)。pAYCTER3载体是按如下步骤将来自pUC19质粒的接头和强终止子rrnB引入pAYC32质粒取代其启动子而得到的。首先，以SEQ ID No.5和No.6描述的序列作为引物，PCR扩增来自pUC19的接头，用限制性内切酶EcoRI和BglII酶切扩增产物；同样以SEQ IDNo.7和No.8描述的序列作为引物PCR扩增终止子rrnB，用限制性内切酶BglII和BclI酶切扩增产物；而后将这两个DNA片段连接到经EcoRI和BclI预先处理过的pAYC32质粒上。这样即获得了pAYCTER3。

实施例2：yddG基因扩增对于大肠杆菌TG1菌株对氨基酸及氨 基酸类似物的耐受性的影响

将pYDDG1、pYDDG2质粒和pUC19及pAYCTER3载体分别导入大肠杆菌TG1菌株，获得TG1(pYDDG1)、TG1(pYDDG2)、TG1(pUC19)、TG1(pAYCTER3)菌株。

利用含有梯度浓度抑制剂的M9葡萄糖基础琼脂平板检测这些菌株在有氨基酸及氨基酸类似物存在时的生长能力。从培养过夜的基础培养基(含质粒的菌株另加了100μg/mL的氨苄霉素)中取10⁶到10⁷个细菌点到这些平板上。37℃下培养44小时后评价生长状况，结果如表1所示。

表1

^＊+：生长良好  ±：生长状态差  -：不生长  n.d.：未确定

^＊＊含pAYCTER3载体的TG1菌株与它有相同的结果

实施例3：yddG基因扩增对于苯丙氨酸生成的影响

以生产苯丙氨酸的大肠杆菌AJ12739菌株作为亲代株，用含有yddG基因的质粒转化该菌株。菌株AJ12739于2001年11月6日被俄罗斯国家工业微生物保藏中心(VKPM)(俄罗斯，113545莫斯科，1^stDorozhny proezd，1)保藏，保藏号VKPM B-8197。

用pYDDA2质粒或pAYCTER3载体转化生产苯丙氨酸的AJ12739株系，分别得到AJ12739/pYDDG2和AJ12739/pAYCTER3菌株。将这些菌株在加入100mg/L氨苄霉素的营养肉汤培养基中37℃下培养18小时，然后取0.3mL接种到含100mg/L氨苄霉素的发酵培养基中，在20×200mm的试管里37℃下用摇床振摇培养48小时。培养结束后，用薄层层析的方法检测培养基中累积的苯丙氨酸的量。10×15cm的TCL板铺上0.11mm的不加荧光指示剂的吸附性硅胶(Sorbpolymer股份公司，krasnodar，俄罗斯)。硅胶板用以下的流动相展开：丙-2-醇∶乙酸乙酯∶25％氨水∶水＝40∶40∶7∶16(v/v)。2％水合茚三酮丙酮溶液作为显色剂。

发酵培养基的组分(g/L)：

葡萄糖            40.0

(NH₄)₂SO₄         16.0

K₂HPO₄            1.0

MgSO₄·7H₂O       1.0

FeSO₄·7H₂O       0.01

MnSO₄·5H₂O       0.01

盐酸硫胺          0.0002

酵母浸膏          2.0

酪氨酸            0.125

CaCO₃             20.0

葡萄糖和硫酸镁分别进行灭菌处理。碳酸钙于180℃干热灭菌2小时。pH值调为7.0。抗生素在灭菌后加入培养基。结果如表2所示。

表2

大肠杆菌菌株	OD600	苯丙氨酸的量g/L
			AJ12739(pAYCTER3)	7.0	1.5
AJ12739(pYDDG2)	7.8	1.9

从表2可以看出yddG基因的扩增提高了AJ12739菌株对苯丙氨酸的生产效率。

实施例4：含有P _L 启动子和大肠杆菌染色体SD _lacZ 的杂合调控元 件取代yddG基因原始上游区域

为了提高yddG基因的表达，通过Datsenko K.A.和Wanner B.L.所述、称为“Red-driven整合”的方法，将λ噬菌体的早期P_L启动子区(Giladi et al.，J.Mol.Biol.，260，484-491，1996)和来源于大肠杆菌lacZ基因的Shine-Dalgarno序列(SD序列)连接后整合到大肠杆菌BW25113菌株染色体中，以取代yddG基因编码区上游的原始区域(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6640-6645，2000)。另外，该人工构建的DNA片段还带有氯霉素抗性基因(Cm^R)(图1)。被取代的yddG基因上游原始区域的核苷酸序列在序列表中已经列出(SEQ ID No：9)。

上述整合进细菌染色体相应区域的人工DNA片段的构建分几步进行。首先，用PCR方法获得DNA片段，该片段的“上游”区有BglII限制性酶切位点，“下游”区有和yddG基因起始密码子ATG直接相连的P_L启动子片段和大肠杆菌lacZ基因SD序列。PCR的模板为λ噬菌体DNA(#SD0011，“Fermentas”，Lithuania)。引物P1含BglII制性酶切位点。引物P2含有λ噬菌体DNA序列、Xba□限制性酶切位点、大肠杆菌lacZ基因SD序列和yddG阅读框的36个核苷酸。将yddG基因的序列引入引物2是为了进一步用Red-driven整合方法将该片段整合到细菌染色体上。

PCR反应均使用“Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System2400”PCR仪。100μL反应体系，其构成包括：另加终浓度为2mM的氯化镁的10×PCR缓冲液(“Fermentas”，Lithuania)10μL，每种dNTP各200μM，每种引物各400nM以及2μL的Taq聚合酶(“Fermentas”，Lithuania)。PCR的温度条件如下：起始的变性条件为95℃5分钟，以后30个循环的变性均为95℃30秒，退火条件50℃30秒，延伸条件72℃30秒，最后聚合72℃5分钟。

相应的完成构建所需DNA片段的第二步。以商品化质粒pACYC184(GeneBank/EMBL编码X06403，“Fermentas”，Lithuania)为模板、用引物P3(SEQ ID NO：12)和引物P4(SEQ ID NO：13)PCR扩增得到氯霉素抗性基因。引物P3含有BglII的限制性酶切位点，以便和上面得到的含P_L启动子的DNA片段连接。引物P4含有利用Red-driven整合的方法将片段整合进细菌染色体必需的36个yddG基因上游核苷酸序列。

获得的上述两个DNA片段用限制性内切酶Bgl II酶切后用T4DNA连接酶连接起来(Maniatis T.，Fritsch E.F.，Sambrook，J：《分子克隆实验指南》第三版，冷泉港实验室出版社，2001)。

连接产物再用引物2和引物4扩增。PCR的条件与上面基本相同，不同的是：反应体系中含有的是2ng的连接产物以及延伸的时间增加到2分钟。所构建的位于yddG基因上游的DNA结构如图1所示。该DNA的核苷酸序列见SEQ ID NO：14。

用乙醇沉淀纯化获得的DNA片段，经电穿孔和Red-driven整合而整合到大肠杆菌BW25113菌株染色体上。Red-driven重组体系中λ噬菌体导入的基因来源于带有热敏感复制子的重组质粒pKD46(Datsenko，K.A.，Wanner，B.L.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，6640-6645，2000)。

菌株BW25113(pKD46)在30℃下在添加了氨苄霉素(100μg/mL)的液态LB培养基中培养过夜，然后用添加了氨苄霉素(100μg/mL)和阿拉伯糖(10mM)(阿拉伯糖用于诱导Red-driven体系质粒编码的基因)的SOC培养基(酵母浸膏，5g/L；NaCl，0.5g/L；胰化蛋白胨，20g/L；KCl，2.5mM；MgCl₂，10mM)按1∶100稀释并在30℃下培养到OD₆₀₀值是0.4～0.7。取10mL培养物，将菌体用冰冻的去离子水洗三次，然后在100μL水中混悬。10μL获得的DNA片段(10ng)事先溶解到要制成细胞悬液的水中。按厂商的操作说明用“Bio-Rad”电穿孔仪(美国)(No.165-2098，version 2-89)进行电穿孔。电击后的细胞加入到1mL的SOC培养基中，37℃下培养2小时，然后涂在含25μg/mL氯霉素的L-琼脂上。用引物P4(SEQ ID NO：13)和引物P5(SEQ IDNO：15)进行PCR扩增，验证24小时内所得到菌落的yddG基因上游是否存在氯霉素抗性基因的筛选标记。上面步骤中，新挑出的菌落混悬在20μL水中，取其中1μL用来做PCR。PCR条件如下：起始的变性条件为95℃10分钟，以后30个循环的变性均为95℃30秒，退火条件50℃30秒，延伸条件72℃50秒，最后聚合72℃5分钟。测得数个有氯霉素抗性标记(Cm^R)的菌落含有所需的2172核苷酸的DNA片段。

实施例5：yddG基因表达的增加对于色氨酸生成的影响

以大肠杆菌色氨酸生产菌株SV164(pGH5)为亲代菌株，评估增加yddG基因的表达对色氨酸产量的影响。美国专利6,180,373或欧洲专利0662143中对菌株SV164(pGH5)作有详细的描述。

为了验证使用强启动子增高yddG基因表达对色氨酸产量的影响，将前述来源于大肠杆菌BW25113菌株染色体的DNA片段通过P1转导到大肠杆菌色氨酸生产菌株SV164(pGH5)(Miller，J.H.(1972)《分子遗传学实验》，冷泉港实验室出版社，Plainview，纽约)，获得SV164P_L-yddG(pGH5)菌株。

菌株SV164(pGH5)和SV164P_L-yddG(pGH5)均在3mL加入了20μg/mL四环素的营养肉汤培养基中37℃下振摇培养18小时。然后取0.3mL接种到含20μg/mL四环素的发酵培养基中，20×200毫米的试管中于37℃、在摇床上250rmp振摇培养48小时。

发酵培养基的构成组分如表3所示。

表3

组份(sections)	组成成分(component)	终浓度，g/L
			ABCDEFGH	KH2PO4NaCl(NH4)2SO4L-甲硫氨酸L-苯丙氨酸L-酪氨酸Mameno(总N)葡萄糖MgSO4·7H2OCaCl2FeSO4·7H2O柠檬酸钠Na2MoO4·2H2OH3BO3CoCl2·6H2OCuSO4·5H2OMnCl2·4H2OZnSO4·7H2O盐酸硫胺CaCO3维生素B6	1.50.51.50.050.10.10.0740.00.30.0110.0751.00.000150.00250.000070.000250.00160.00030.00530.00.03

A组份用氨水调pH值到7.1。各个组份均分别灭菌。

培养后，用实施例3中描述的薄层色谱方法检测培养基中色氨酸的累积量。所得数据在表4中列出。

表4

大肠杆菌菌株	OD600 ＊	色氨酸的量，g/L＊
			SV164(pGH5)	7.0	3.72±0.13
SV164PL-yddG(pGH5)	7.0	4.17±0.35

^＊此处显示的结果由每个菌株至少六次独立实验得来。

从表4可以看出yddG基因表达的增加提高了SV164(pGH5)菌株对色氨酸的生产效率。

工业适用性

本发明提供了一种埃希杆菌属细菌，该细菌对氨基酸，例如L-苯丙氨酸和L-色氨酸的生产效率增加。本发明也提供了用细菌生产L-氨基酸的方法

序列表

<110>味之素公司

<120>利用埃希杆菌属细菌生产L-氨基酸的方法

<130>B890SMOP1411

<140>

<141>2002-11-21

<150>RU 2001131571

<151>2001-11-23

<150>RU 2002121670

<151>2002-08-14

<160>15

<170>PatentIn Ver.2.1

<210>1

<211>882

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>1

atgacacgac aaaaagcaac gctcataggg ctgatagcga tcgtcctgtg gagcacgatg 60

gtaggattga ttcgcggtgt cagtgagggg ctcggcccgg tcggcggcgc agctgctatc 120

tattcattaa gcgggctgct gttaatcttc acggttggat ttccgcgtat tcggcaaatc 180

ccgaaaggct atttactcgc cgggagtctg ttattcgtca gctatgaaat ctgtctggcg 240

ctttccttag ggtatgcggc gacccatcat caggcgattg aagtgggtat ggtgaactat 300

ctgtggccca gcctgacaat tctctttgcc attctgttta atggtcagaa aaccaactgg 360

ttgattgtac ctggattatt attagccctc gtcggcgtct gttgggtgtt aggcggtgac 420

aatgggttac attatgatga aatcatcaat aatatcacca ccagcccatt gagttatttc 480

ctggcgttca ttggtgcgtt tatctgggca gcctattgca cagtaacgaa taaatacgca 540

cgcggattta atggaattac cgtttttgtc ctgctaacgg gagcaagtct gtgggtttac 600

tattttctta cgccacaacc agaaatgata tttagcacgc ccgtcatgat taaactcatc 660

tctgcggcat ttaccttagg atttgcttat gctgcatgga atgtcggtat attgcatggc 720

aatgtcacca ttatggcggt aggttcgtat tttacgcctg tactttcctc agcgcttgca 780

gccgtgctgc tcagcgcccc gctgtcgttc tcgttctggc aaggcgcgct gatggtctgc 840

ggcggttccc tgctctgctg gctggcgaca cgtcgtggtt aa                    882

<210>2

<211>293

<212>PRT

<213>大肠杆菌

<400>2

Met Thr Arg Gln Lys Ala Thr Leu Ile Gly Leu Ile Ala Ile Val Leu

  1               5                  10                  15

Trp Ser Thr Met Val Gly Leu Ile Arg Gly Val Ser Glu Gly Leu Gly

             20                  25                 30

Pro Val Gly Gly Ala Ala Ala Ile Tyr Ser Leu Ser Gly Leu Leu Leu

         35                  40                  45

Ile Phe Thr Val Gly Phe Pro Arg Ile Arg Gln Ile Pro Lys Gly Tyr

     50                  55                  60

Leu Leu Ala Gly Ser Leu Leu Phe Val Ser Tyr Glu Ile Cys Leu Ala

 65                  70                  75                  80

Leu Ser Leu Gly Tyr Ala Ala Thr His His Gln Ala Ile Glu Val Gly

                 85                  90                  95

Met Val Asn Tyr Leu Trp Pro Ser Leu Thr Ile Leu Phe Ala Ile Leu

            100                 105                 110

Phe Asn Gly Gln Lys Thr Asn Trp Leu Ile Val Pro Gly Leu Leu Leu

        115                 120                 125

Ala Leu Val Gly Val Cys Trp Val Leu Gly Gly Asp Asn Gly Leu His

    130                135                 140

Tyr Asp Glu Ile Ile Asn Asn Ile Thr Thr Ser Pro Leu Ser Tyr Phe

145                 150                 155                 160

Leu Ala Phe Ile Gly Ala Phe Ile Trp Ala Ala Tyr Cys Thr Val Thr

                165                 170                 175

Asn Lys Tyr Ala Arg Gly Phe Asn Gly Ile Thr Val Phe Val Leu Leu

            180                 185                 190

Thr Gly Ala Ser Leu Trp Val Tyr Tyr Phe Leu Thr Pro Gln Pro Glu

        195                 200                 205

Met Ile Phe Ser Thr Pro Val Met Ile Lys Leu Ile Ser Ala Ala Phe

    210                 215                 220

Thr Leu Gly Phe Ala Tyr Ala Ala Trp Asn Val Gly Ile Leu His Gly

225                 230                 235                 240

Asn Val Thr Ile Met Ala Val Gly Ser Tyr Phe Thr Pro Val Leu Ser

                245                 250                 255

Ser Ala Leu Ala Ala Val Leu Leu Ser Ala Pro Leu Ser Phe Ser Phe

            260                 265                 270

Trp Gln Gly Ala Leu Met Val Cys Gly Gly Ser Leu Leu Cys Trp Leu

        275                 280                 285

Ala Thr Arg Arg Gly

    290

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>3

tgatcggatc cgaaatgaga tataa                                      25

<210>4

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>4

ctgcggtcga cgtccattgc tttc                                            24

<210>5

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>5

gaccatagat ctgaattcga gctcggtac                                       29

<210>6

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>6

acggccagat ctaagcttgc atgcctgca                                       29

<210>7

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>7

aacagtgatc atttgcctgg cggcagtagc gcgg                                 34

<210>8

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>8

ataaaaagct tagatctcaa aaagagtt tg tagaaacgca a                    41

<210>9

<211>160

<212>DNA

<213>大肠杆菌

<400>9

cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagaaaaa cgcaccactg cctgacaggc 60

cagttaaaaa aatgctataa aattcagctt aatttttaac ggcaagagag acaaaacagc 120

gagcatgaca cgacaaaaag caacgctcat agggctgata                       160

<210>10

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>10

aaatcagatc ttcagaattc tcacctacc                                   29

<210>11

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>11

tatcagccct atgagcgttg ctttttgtcg tgtcatagct gtttccttct agacggccaa 60

tgcttcgta                                                         69

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>12

tagcgaagat ctctgatgtc cggcggtgct tttg                            34

<210>13

<211>57

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>13

cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagattac gccccgccct gccactc   57

<210>14

<211>1362

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：Cm耐受性基因，PL启动子和SD序列，来自lacZ基因

<400>14

cgccttcgca aattgaccta cctcaatagc ggtagattac gccccgccct gccactcatc 60

gcagtactgt tgtaattcat taagcattct gccgacatgg aagccatcac agacggcatg 120

atgaacctga atcgccagcg gcatcagcac cttgtcgcct tgcgtataat atttgcccat 180

ggtgaaaacg ggggcgaaga agttgtccat attggccacg tttaaatcaa aactggtgaa 240

actcacccag ggattggctg agacgaaaaa catattctca ataaaccctt tagggaaata 300

ggccaggttt tcaccgtaac acgccacatc ttgcgaatat atgtgtagaa actgccggaa 360

atcgtcgtgg tattcactcc agagcgatga aaacgtttca gtttgctcat ggaaaacggt 420

gtaacaaggg tgaacactat cccatatcac cagctcaccg tctttcattg ccatacggaa 480

ttccggatga gcattcatca ggcgggcaag aatgtgaata aaggccggat aaaacttgtg 540

cttatttttc tttacggtct ttaaaaaggc cgtaatatcc agctgaacgg tctggttata 600

ggtacattga gcaactgact gaaatgcctc aaaatgttct ttacgatgcc attgggatat 660

atcaacggtg gtatatccag tgattttttt ctccatttta gcttccttag ctcctgaaaa 720

tctcgataac tcaaaaaata cgcccggtag tgatcttatt tcattatggt gaaagttgga 780

acctcttacg tgccgatcaa cgtctcattt tcgccaaaag ttggcccagg gcttcccggt 840

atcaacaggg acaccaggat ttatttattc tgcgaagtga tcttccgtca caggtattta 900

ttcggcgcaa agtgcgtcgg gtgatgctgc caacttactg atttagtgta tgatggtgtt 960

tttgaggtgc tccagtggct tctgtttcta tcagctgtcc ctcctgttca gctactgacg 1020

gggtggtgcg taacggcaaa agcaccgccg gacatcagag atcttcacct accaaacaat 1080

gcccccctgc aaaaaataaa ttcatataaa aaacatacag ataaccatct gcggtgataa 1140

attatctctg gcggtgttga cataaatacc actggcggtg atactgagca catcagcagg 1200

acgcactgac caccatgaag gtgacgctct taaaaattaa gccctgaaga agggcagcat 1260

tcaaagcaga aggctttggg gtgtgtgata cgaaacgaag cattggccgt ctagaaggaa 1320

acagctatga cacgacaaaaagcaacgctc atagggctga ta                     1362

<210>15

<211>17

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列的描述：引物

<400>15

ttaaccacga cgtgtcg                                                17

Claims (10)

1.生产L-苯丙氨酸或L-色氨酸的大肠杆菌，其中通过增强由序列表的SEQ ID NO：2中所示氨基酸序列组成的蛋白质的活性而提高大肠杆菌的L-苯丙氨酸或L-色氨酸产量，其中通过使用编码所述蛋白质的DNA转化该大肠杆菌，或者通过改变大肠杆菌染色体中上述DNA的表达调控序列，增强所述蛋白质的活性。

2.根据权利要求1的大肠杆菌，其中转化是使用含有所述DNA的多拷贝载体进行的。

3.根据权利要求1的大肠杆菌，其中所述DNA位于强启动子的控制之下。

4.生产L-苯丙氨酸或L-色氨酸的方法，该方法包括在培养基中培养权利要求1～3任意一项中的大肠杆菌，并从培养基中收集所产生并积累的L-苯丙氨酸或L-色氨酸。

5.权利要求4的方法，其中所述大肠杆菌是权利要求2的大肠杆菌，其中多拷贝的编码SEQ ID NO：2中氨基酸序列的基因被整合到大肠杆菌染色体上。

6.权利要求5的方法，其中所述编码SEQ ID NO：2中氨基酸序列的基因位于强启动子的控制之下，所述强启动子为P_L启动子、lac启动子、trp启动子或trc启动子。

7.生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯的方法，该方法包括：

在培养基中培养权利要求1的大肠杆菌，以在培养基中生成和积累L-苯丙氨酸，所述大肠杆菌具有L-苯丙氨酸的生产能力；和

从天冬氨酸或N-酰基-L-天冬氨酸酐，和获得的L-苯丙氨酸来合成α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。

8.权利要求7中所述方法，进一步包括：

酯化L-苯丙氨酸以生产L-苯丙氨酸低级烷基酯；

使L-苯丙氨酸低级烷基酯与天冬氨酸衍生物缩合，其中衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐；

从反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯；

氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。

9.权利要求7的方法，其中所述大肠杆菌是权利要求2的大肠杆菌，其中多拷贝的编码SEQ ID NO：2中氨基酸序列的基因被整合到大肠杆菌染色体上。

10.权利要求9中所述方法，进一步包括：

酯化L-苯丙氨酸以生产L-苯丙氨酸低级烷基酯；

使L-苯丙氨酸低级烷基酯与天冬氨酸衍生物缩合，其中衍生物是N-酰基-L-天冬氨酸酐；

从反应混合物中分离N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯；

氢化N-酰基-α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯，生产α-L-天冬氨酰基-L-苯丙氨酸低级烷基酯。

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