SU1694643A1 - Штамм бактерий ЕSснеRIснIа coLI - продуцент L-треонина - Google Patents

Description

1

(21)4334022/13

(22)26.11.87

(46) 30.11.91. Бюл. №44

(71)Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов

(72)В.Г.Дебабов, Ю.И.Козлов, Е.М.Хургес, В.А.Лившиц, Н.И.Жданова, М.М.Гус ти- нер, А.К.Соколов, Т.А.Бачина, Н.К.Янковский , Ю.Д.Цыганков, А.Ю.Чистосердов, Т.Г.Плотникова, И.О.Шакалис. А.В.Беларе- ва, Р.А.Арсат нц, А.Ф.Шолин и Т.М.Поздн кова

(53)663.15(088.8)

(56)Авторское свидетельство СССР № 974817, кл. С 12 Р 13/08, 1981.

Авторское свидетельство СССР № 1362021, кл. С 12 Р 13/08, 1987. (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ L-ТРЕОНИНА

(57)Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма бактерий, продуцирующего

незаменимую аминокислоту L-треонин, который примен етс  как компонент различных питательных смесей медицинского назначени , в качестве добавки в корма животных , а также как реактив дл  фармацевтической и химической промышленности. Цель изобретени  - штамм бактерий Escherichla coll ВКПМ-3996, позвол ющий получить высокий выход L-треонина в услови х большого числа генераций бактериальной культуры. Штамм содержит рекомбинантную плазмиду котора  в отличие от плазмиды pYN 7 иззестного штамма-продуцента стабильно сохран етс  при росте культуры без селективного давлени , направленного на поддержание плазмиды . Предлагаемый штамм позвол ет получать до 85 г/л L-треонина за 36 ч ферментации в лабораторных услови х. В услови х , аналогичных -промышленной ферментации по числу генераций, продуцирует до 79 г/л L-треонина за 50 ч ферментации . 3 табл.

Изобретение относитс  к микробиологической промышленности и касаетс  нового штамма бактерий, продуцирующего незаменимую аминокислоту L-треонин, который примен етс  как компонент различных питательных смесей медицинского назначени , в качестве добавки о корма жи- вотных, а также как реактив дл  фармацевтической и химической промышленности .

Цель изобретени  - штамм бактерий, позвол ющий получить высокий выход Lтреонинавуслови хбольшого числа генераций бактериальной культуры при отсутствии в питательной среде антибиотик1.

Новый штамм бактерий Escherichla col ВНИИгенешка-640 содержит рекомбинантную плазмиду pVIC 40, котора  в отличие от плазмиды pYN7 известного штамма-продуцента L-треонина Е.соП ВКПМ В-3420 (лабораторный номер ВНИИ- генетика ТДГ-6)стабильно сохран етс  при росте культуры без селективного давлени , направленного на поддержание плэзмиды,

о

4Ь W

т.е в отсутствие в питательной среде антибиотика . Это свойство плазмиды pVIC 40 позвол ет предлагаемому штамму обеспечивать высокий вывод треонина в услови х большого числа генераций бактериальной культуры, а именно при обогащении питательной среды ростовыми факторами (аминокислотами ), а также в услови х промышленного производства.

Предлагаемый штамм позвол ет пол- учать до 85 г/л треонина за 36 ч ферментации в лабораторных услови х. В услови х, аналогичных промышленной ферментации по числу генераций (клеточных делений) культуры на средах без антибиотиков, штамм продуцирует до 79 г/л L-треонина за 50 ч ферментации. Накопление подобных аминокислот (аланин, глицин, глутаминова  кислота) составл ет не более 3 г/л.

Новый продуцент получен в результате генетической трансформации плазмидой pVIC 40 бесплазмидных клеток известного штамма ВНИИгенетика ТДГ-6 и сохран ет те генетические свойства известного штамма , которые определ ютс  хромосомой кле- ток. Нова  гибридна  плазмида pVIC40 несет тот же фрагмент хромосомы E.coli, что и плазмида pYN7, кодирующа  ген биосинтеза треонина, и сообщает клеткам устойчивость к антибиотику стрептомицину. В отличие от нее нова  плазмида сохран етс  в клетках при росте в неселективных услови х.

Нова  гибридна  плазмида pVIC 40 получена путем обработки плазмиды pYN 7, а также векторной плазмиды,  вл ющейс  производной известных плазмид pRSF1010 и pBR322, характеризующейс  высокой стабильностью в клетках E.coli, рестриктазами Bam H 1 и Pst I с последующей обработкой полинуклеотидлигазой. Смесью после лиги- ровани  трансформировали клетки бес- плазмидного варианта штамма ВНИИ-генетика ТДГ-6, нуждающегос  в треонине, и на минимальном агаре (среда Мд), лишенном треонина, но содержащем стрептомицин (100 мкг/мл), отбирали колонии трансформантов, утративших устойчивость к пенициллину. Из клеток одного такого трансформанта выделена плазмида pViC40 с молекул рной массой 9,7 МД, сообщающа  устойчивость к стрептомицину, но не к пенициллину, и несуща  фрагмент плазмиды pYN7, детерминирующий ген тре- онинового биосинтеза у E;coli.

Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-3996 и имеет следующую характеристику.

Культу рал ьно-морфологичес кие признаки . Грамотрицательные слабо подвижные палочки с закругленными концами, размер 1,5 - 2 мкм в длину.

М со-пептонный агар. Через 24 ч роста при 37°С образует круглые беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5-3 мм, поверхность колоний гладка , кра  ровные или слегка волнистые, центр колоний приподн т , структура однородна , консистенци  пастообразна , легко эмульгируетс .

Агар-Луриа. Через 24 ч роста при 37°С образует беловатые полупрозрачные колонии диаметром 1,5 - 2,5 мм, поверхность колоний гладка , кра  ровные, структура однородна , консистенци  пастообразна , легко эмульгируетс .

Агаризованна  минимальна  среда Адамса. Через 40 - 48 ч роста при 37°С образует колонии диаметром 0,5 - 1,5 мм. серовато-белые, полупрозрачные, слегка выпуклые, с блест щей поверхностью.

Рост в м со-пептонном бульоне. Удельна  скорость роста при 37°С 1,3 . После 24 ч роста происходит сильное равномерное помутнение, имеетс  характерный запах.

Физиолого-биологические признаки.

Отношение к источникам углерода: хорошо растет на сахарозе, глюкозе, фруктозе , лактозе, маннозе, галактозе, ксилозе, глицерине, манните с образованием кислоты и газа.

Отношение к источникам азота: усваивает азот в форме аммони , солей азотной кислоты, а также азот некоторых органических соединений.

Желатину не разжижает. Рост на молоке хороший с коагул цией молока.

Индол не образует.

Устойчив к стрептомицину, L-треонину и L-гомосерину,

Стимул тором роста  вл етс  L-изо- лейцин. При росте в присутствии L-треонина аминоацетон не образует.

Факультативный анаэроб.

Растет на м со-пептонном бульоне при 37°С и ниже. Оптимальна  температура 37 - 38°С.

Растет на жидких средах, имеющих рН от 6 до 8. Оптимальное значение рН 7,0.

Содержание плазмид. Клетки содержат многокопийную гибридную плазмиду pVIC 40 (молекул рна  масса 9.7 МД), обеспечивающую устойчивость к стрептомицину и несущую гены треонинового оперона.

Стабильность плазмиды. Штамм E.coli ВКПМ В-3996 характеризуетс  повышенной способностью к сохранению плазмиды при росте без селективного давлени , направленного на поддержание плазмиды.

Оценку стабильности признаков штамма, определ емого плазмидой, проводили у предлагаемого (плазмида pVIC 40) и известного (плазмида pYN 7) штаммов. Клетки обоих штаммов выращивали в присутствии соответствующего антибиотика до ранней стационарной фазы и засевали среду Лурма, лишенную антибиотиков, с исходным титром 5. После 48 ч культивировани  полученными клетками вновь засевали такую же среду до исходного титра 50 и вновь инкубировали 48 ч. Каждый пассаж соответствовал 20 генераци м. После указанных пассажей клетки высевали на агаре Луриа и выросшие колонии провер ли на устойчм- вость к стрептомицину и пенициллину (табл.1).

Из данных табл.1 видно, что плазмида pVIG 40 стабильно сохран етс  в клетках нового продуцента в неселективных услови-  х. В этих же услови х клетки известного штамма быстро утрачивают плазмиду.

Получение L-треонина с использованием нового штамма-продуцента осуществл - ют следующим образом. Культуру штамма E.coll ВКПМ В-3996 выращивают на агари- зованной среде Адамса со стрептомицином и суспензией клеток, выращенных таким же образом, засевают жидкую посевную или ферментационную среду. Эти среды содержат источник углерода, азота, необходимые минеральные соли, а также питательную добавку в виде гидролизатов белковых субстратов (присутствие этой добавки в фер- ментационной среде не об зательно). Выращивание посевного материала ведут в услови х рН-статировани  при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 - 38°С с непрерывным аэрированием и перемешиванием. Приготовлен- ный таким образом посевной материал или суспензию клеток, смытых с агара, используют дл  засева ферментационной среды, содержащей источник углерода, азота, минеральные соли, а также питательную до- бавку в виде гидролизатов белковых субстратов (при низких дозах засева указанна  добавка позвол ет сократить продолжительность ферментации, при высоких дозах засева присутствие ее не об затель- но).

Ферментацию осуществл ют в ферментерах , оснащенных системой рН-статиро- вани , при рН 6,8 - 7,2, температуре 36 38°С с непрерывным аэрированием и пере- мешиванием. В качестве рН-статирующего агента примен ют либо аммиачную воду, либо сбалансированную по углероду и азоту сахаро-аммиачную подпитку. Продолжительность ферментации зависит от дозы засева и степени обогащени  ферментационной среды ростовыми факторами и может составл ть 24 - 60 ч. К концу ферментации накапливаетс  70 - 85 г/л L-треонина. Удельный расход источника углерода на синтез 1 г L-треонина составл ет 2 - 2,3 г. Накопление аминоацетона Б культуралыюй жидкости отсутствует.

Пример 1,Купьтуры штаммов ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 параллельно выращивают на агаризовачной среде Адамса, содержащей сахарозу (0,2%) м антибиотики (500 ад/мл пенициллина дл  известного штамма и 100 мкг/мл стрептомицина дл  предлагаемого штамма) Клетки, выращенные в течение 2 сут, суспендируют в физиологическом растворе и 10 мл суспензии с титром 10 исполкзуют дл  засева 500 мл посевной среды следующего состава, %: сахароза 4; аммоний сернокислый 0,5; калий фосфорнокислый 2-замещенный 0,2; магний сернокислый 7-водный 0,04; железо (II) сернокислое 7-водное 0,002; марганец (II) сернокислый 5-водный 0,002; автолизат дрожжей 0,2; вода остальное.

Посевной материал выращивают в течение 20 ч в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании (0,5 л/мин) и перемешивании со скоростью 1000 об/мин при 37°С. Значение рН автоматически поддерживают в пределах 6,9 + 0.2 аммиачной водой. Выращенным посевным материалом с титром 7 - 8-Ю9 в количестве 50 мл засевают ферментационные среды объемом 500 мл. Состав ферментационной среды такой же, как и состав посевной, но концентраци  сахарозы 3% и дополнительно внесен хлористый натрий (0,06%).

Ферментацию провод т в лабораторных ферментерах емкостью 1,2 л при аэрировании 0,5 л/мин воздуха и перемешивании со скоростью 1200 об/мин и при температуре культивировани  37°С. Значение рН поддерживают в пределах 6,9 +Ю,2 путем автоматической подачи сахаро-ам- миачной подпитки, представл ющей собой смесь 70%-ного раствора сахарозы с 25%- ной аммиачной водой в соотношении 3,6:1 по объему. Ферментацию провод т в течение 36ч. Результаты проведенного процесса показаны в табл.2.

П р и м е р 2. Культуры штаммов Е. coli ВКПМ В-3420 и ВКПМ В-3996 выращивают аналогично примеру 1, но полученную клеточную суспензию развод т физиологическим раствором до титра 10 и 1 мл такой суспензии используют дл  засева 500 мл ферментационной среды, отличающейс  от указанной в примере 1 ферментационной среды повышенным до 0.5% содержанием

автолизата дрожжей (моделируетс  вариант засева производственного ферментера объемом 1000 м3 суспензией клеток, смытых с 1 кос ка). Ферментацию провод т в течение 50 ч в услови х, аналогичных указанным в примере 1. Результаты проведенного процесса показаны в табл.3.

ПримерЗ. Культуру штамма ВКПМ В-3996 выращивают на агаризованной среде Адамса со стрептомицином, как показано в примере 1, затем клетки суспендируют в физрастворе и полученной суспензией засевают посевную среду, аналогичную приведенной в примере 1, но отличающуюс  заменой сахарозы на мелассу (4% по сахару ). Выращивание посевного материала ведут по примеру 1. Через 18 ч готовым посевным материалом засевают ферментационную среду, содержащую 4% мелассы (2 % по сахару), 1,5% сернокислого аммони  и минеральные соли, перечисленные в ферментационной среде примера 1. Дл  рН-статировани  в ходе ферментации используют мелассно-аммиачную подпитку, представл ющую собой смесь 30%-ного по сахару раствора мелассы с 25%-ной аммиачной водой в соотношении 12:1 по объему.

Ферментацию провод т в течение 36 ч. К концу ферментации в культуральной жидкости накапливаетс  треонин в конДол  клеток известного и предлагаемого штаммов, утративших плазмиды при пассировании в среде Луриа

Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов при культивировании на средах без антибиотиков в лабораторных ферментерах

центрации 44 г/л. Дол  клеток, утративших плазмиду, менее 1%.

Сравнение предлагаемого и известного штаммов в услови х небольшого числа клеточных генераций без антибиотика (пример 1) показывает одинаковую продуктивность штаммов (82 - 85 г/л).

Преимущества предлагаемого штамма про вл ютс  в услови х большого числа

клеточных генераций (пример 2), т.е. в услови х , моделирующих производственные в отсутствие антибиотика. В этом случае уровень накоплени  треонина предлагаемым штаммом в 1,5 раза выше, чем у известного

штамма (79 г/л треонина против 53 г/л). Это объ сн етс  тем, что значительна  дол  клеток известного штамма на обогащенных средах без антибиотиков утрачивает плазмиду , в то врем  как потери плазмиды у

предлагаемого штамма в этих услови х не отмечены.

Таким образом, предлагаемый штамм позвол ет в производственных услови х увеличивать выход L-треонина и упростить

процесс за счет полного исключени  применени  антибиотика в процессе выращивани  посевного материала.

Claims (1)

1. Формула изобретени  Штамм бактерий Escherichia coll ВКПМ

   В-3996-продуцент L-треонина.

   Таблица 1

   Таблица 2

   Накопление треонина и утрата плазмиды у известного и предлагаемого штаммов

   при культивировании на средах без антибиотиков в услови х, моделирующих по

   числу генераций производственные услови 

   Редактор М.Петрова

   Техред М.Моргентал

   Заказ 4130ТиражПодписное

   ВНИИПИ Государственного комитета по изобретени м и открыти м при ГКНТ СССР 113035, Москва. Ж-35, Раушска  наб., 4/5

   Производственно-издательский комбинат Патент, г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

   Таблица 3

   Корректор v М.Демчик