CN101679999A - 具有增加的胁迫耐受性和产率的转基因植物 - Google Patents

Abstract

本发明公开了多核苷酸，其能够增加经转化而含有此类多核苷酸的植物在限水条件下的生长、产率，和/或增加环境胁迫耐受性。本发明还提供了利用此类多核苷酸的方法，以及含有此类多核苷酸作为转基因的转基因植物和农产品，包括种子。

Description

具有增加的胁迫耐受性和产率的转基因植物

本申请要求于2007年5月29日递交的美国临时专利申请系列号60/932,147的优先权利益，该美国临时专利申请的内容并入本文作为参考。

技术领域

本发明总体上涉及超量表达核酸序列的转基因植物，所述核酸序列编码能够赋予在正常或非生物胁迫条件下增加的胁迫耐受性从而是增加的植物生长和作物产率的多肽。另外，本发明涉及新的分离的核酸序列，其编码能够赋予植物在非生物胁迫条件下增加的胁迫耐受性，和/或在正常或非生物胁迫条件下增加的植物生长和/或增加的作物产率的多肽。

背景技术

非生物环境胁迫如干旱、盐度、热和冷是植物生长和作物产率的主要限制因素。作物产率在本文定义为每英亩收获的相应农产品(如谷物、饲料或种子)的蒲式耳数。在许多不发达国家，由这些胁迫导致的主要作物(如大豆、稻、玉蜀黍(玉米)、棉花和小麦)的作物损失及作物产率损失代表重大的经济和政治因素，并造成粮食短缺。

水可用性是非生物胁迫及其对植物生长影响的重要方面。持续暴露于干旱条件引起植物代谢的重大改变，最终导致细胞死亡，结果造成产率损失。由于一些土壤中的高盐含量造成可供细胞摄取的水更少，高盐浓度对植物所具有的影响类似于干旱对植物的影响。另外，在冷冻温度下，植物细胞由于植物体内结冰而失水。从而，干旱、热、盐度和冷胁迫所造成的作物损伤主要是因脱水所致。

由于植物在其生命周期中一般暴露于水可用性减小的条件，多数植物已进化出针对非生物胁迫所致干燥的保护机制。然而，如果干燥条件的严重程度太大、持续时间太长，则对多数作物植物发育、生长、植株大小和产率的影响是突出的。因此，开发有效利用水的植物是一项有潜力在全世界范围显著提升人类生活的策略。

传统的植物育种策略相对低效，而且需要非生物胁迫耐受性基础株系与其他种质进行杂交，以开发新的非生物胁迫抗性株系。此类基础株系有限的种质来源，以及远源相关植物物种间的杂交不相容性代表常规育种所面临的重大问题。为了耐受性的育种很大程度上是不成功的。

许多农业生物技术公司已尝试鉴定能够赋予非生物胁迫应答耐受性的基因，努力开发转基因非生物胁迫耐受性作物植物。虽然已表征了参与植物胁迫应答或水利用效率的一些基因，赋予胁迫耐受性和/或水利用效率的植物基因的表征和克隆在很大程度上依然是不完全和不连续的。迄今，开发转基因非生物胁迫作物植物方面的成功有限，且尚未有此类植物商业化。

为了开发转基因非生物胁迫作物植物，有必要在模型植物体系、作物植物的温室研究以及田间试验中测定许多参数。例如，水利用效率(WUE)是一种常与干旱耐受性相关的参数。也采用植物对干燥、渗压休克和温度极限的应答研究来确定植物对非生物胁迫的耐受性或抗性。当测试转基因的存在对于植物胁迫耐受性的影响时，温室或植物生长箱环境标准化土壤性能、温度、水和养分可用性及光强度的能力是其与田间相比的固有优势。

WUE已以多种方式进行过定义和测量。一种方法是计算整株植物干重与该植物在其整个生命中所消耗的水重量之间的比值。另一种变通形式是使用更短的时间间隔测量生物量累积和水利用。而另一种方法是应用来自植物限定部分的测量结果，例如仅测量气生生长和水利用。WUE还已被定义为CO₂摄入与叶子或叶子一部分的水蒸汽损失之间的比值，往往在非常短的一段时间(例如秒/分)测量。还已经应用以同位素比质谱仪测量的植物组织中固定的¹³C/¹²C比，来估算利用C₃光合作用的植物中的WUE。

WUE增加指示生长和水消耗效率相对提高，但仅此信息并不能表明是这两个进程之一发生了变化还是两者均发生了变化。在选择改进作物的性状方面，由于水利用下降致使WUE增加而生长不变，对于水输入成本高的灌溉农业体系将具有特别价值。主要受生长增加驱动而没有水利用对应猛增的WUE增加将适用于所有农业体系。在许多水供应并非有限的农业体系中，生长增加，即便是以水利用增加(即WUE不变)为代价，也能够增加产率。因此，需要既增加WUE又增加生物量累积的新方法来提高农业生产力。

与非生物胁迫耐受性相关参数的测量相伴的是指示转基因对作物产率潜在影响的参数的测量。对于饲料作物如苜蓿、青贮谷物和干草而言，植物生物量与总产率相关。然而，对于谷物作物而言，已利用其他参数来估算产率，例如植物大小，测量为植物总干重、地上干重、地上鲜重、叶面积、茎体积、植物高度、莲座植物(rosette)直径、叶长、根长、根质量、分蘖数和叶数。早期发育阶段的植物大小通常将与发育晚期的植物大小相关。具有更大叶面积的较大植物通常能够比较小的植物吸收更多的光和二氧化碳，因此很可能在相同时间段内增重更多。除了植物所具有的最初达到较大大小的微环境或遗传优势的潜在延续，此为其附加效应。植物大小和生长速率存在着强遗传组件，且迄今为止，种种多样化基因型植物在一种环境条件下的大小很可能与另一种环境条件下的大小相关。这样使用标准环境模拟田间作物在不同地点和时间所遭遇的多样化动态环境。

收获指数为种子产率与地上干重之间的比值，在许多环境条件下相对稳定，因此可能存在植物大小和谷物产率之间的稳固相关性。植物大小和谷物产率固有地相关联，是因为大多数谷物生物量取决于植物叶和茎当前或贮存的光合作用生产力。因此，对植物大小的选择，甚至是在发育早期阶段的选择，已经用作筛选可能在进行田间试验时展示增加的产率的植物。同非生物胁迫耐受性一样，在生长箱或温室标准条件下测量早期发育阶段的植物大小，是测量转基因存在所赋予的潜在产率优势的标准实践。

因此，需要鉴定在胁迫耐受性植物和/或有效利用水的植物中表达的其他基因，所述基因有能力赋予宿主植物及其他植物物种胁迫耐受性和/或增加的水利用效率。新生成的胁迫耐受性植物和/或具有增加的水利用效率的植物将具有许多优点，例如，通过例如降低植物物种的水需求，能够培养所述作物植物的范围增大。其他期望优点包括倒伏即芽(shoot)或茎响应风、雨、虫害或疾病弯曲的抗性增加。

发明概述

本发明人已发现，用某些多核苷酸转化植物，当所述多核苷酸在植物中作为转基因存在时，导致增强植物生长及对环境胁迫的应答，从而增加植物农产品的产率。能够介导这样的增强作用的多核苷酸已从小立碗藓(Physcomitrella patens)、大麦(Hordeum vulgare)、欧洲油菜(Brassicanapus)、亚麻(Linum usitatissimum)、水稻(Orzya sativa)、向日葵(Helianthusannuus)、普通小麦(Triticum aestivum)和大豆(Glycine max)中分离，并在表1中列出，而其序列如表1所示在序列表中示出。

表1

基因ID	生物	多核苷酸SEQ ID NO	氨基酸SEQ ID NO
				EST462	小立碗藓	1	2
EST329	小立碗藓	3	4
				EST373	小立碗藓	5	6
HV62561245	大麦	7	8
				BN43173847	欧洲油菜	9	10
BN46735603	欧洲油菜	11	12
				GM52504443	大豆	13	14
GM47122590	大豆	15	16
				GM52750153	大豆	17	18
EST548	小立碗藓	19	20
				GM50181682	大豆	21	22
HV62638446	大麦	23	24
				TA56528531	普通小麦	25	26
HV62624858	大麦	27	28

基因ID	生物	多核苷酸SEQ ID NO	氨基酸SEQ ID NO
				LU61640267	亚麻	29	30
LU61872929	亚麻	31	32
				LU61896092	亚麻	33	34
LU61748785	亚麻	35	36
				OS34706416	水稻	37	38
GM49750953	大豆	39	40
				HA66696606	向日葵	41	42
HA66783477	向日葵	43	44
				HA66705690	向日葵	45	46
TA59921546	普通小麦	47	48
				HV62657638	大麦	49	50
BN43540204	欧洲油菜	51	52
				BN45139744	欧洲油菜	53	54
BN43613585	欧洲油菜	55	56
				LU61965240	亚麻	57	58
LU62294414	亚麻	59	60
				LU61723544	亚麻	61	62
LU61871078	亚麻	63	64
				LU61569070	亚麻	65	66
OS34999273	水稻	67	68
				HA66779896	向日葵	69	70
OS32667913	水稻	71	72
				HA66453181	向日葵	73	74
HA66709897	向日葵	75	76

在一个实施方案中，本发明提供了用含有分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：2所示序列的CBL相互作用蛋白激酶。

在另一实施方案中，本发明提供了用含有分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物，所述多核苷酸编码具有SEQ ID NO：4所示序列的14-3-3蛋白质。

在另一实施方案中，本发明提供了用含有分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物，所述多核苷酸编码RING H2锌指蛋白或RING H2锌指蛋白结构域。

在另一实施方案中，本发明提供了用含有分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物，所述多核苷酸编码GTP结合蛋白或GTP结合蛋白结构域。

在再一实施方案中，本发明提供了本发明转基因植物产生的种子，其中所述种子对于包含上述多核苷酸的转基因而言是真实遗传。与植物野生型品种相比，源自本发明种子的植物在正常或胁迫条件下显示增加的环境胁迫耐受性，和/或增加的植物生长，和/或增加的产率。

在另一方面，本发明提供了本发明转基因植物、其植物部分或其种子产生的或来自它们的产品，如食物、饲料、食品增补剂、饲料增补剂、化妆品或药物。

本发明还提供了下表1中鉴定的分离的多核苷酸，以及表1中鉴定的分离的多肽。本发明还体现为含有本发明分离的多核苷酸的重组载体。

而在另一实施方案中，本发明涉及产生前述转基因植物的方法，其中所述方法包括用含有本发明分离的多核苷酸的表达载体转化植物细胞，和自植物细胞生成表达由所述多核苷酸编码的多肽的转基因植物。所述多肽在植物中的表达导致与植物野生型品种相比，在正常或胁迫条件下增加的环境胁迫耐受性、和/或生长、和/或产率。

又在另一实施方案中，本发明提供了增加植物环境胁迫耐受性、和/或生长、和/或产率的方法。所述方法包括用含有本发明分离的多核苷酸的表达盒转化植物细胞，和自植物细胞生成转基因植物的步骤，其中所述转基因植物含有所述多核苷酸。

附图的简短说明

图1是小立碗藓EST462与表2中鉴定的已知CBL相互作用蛋白激酶之间的比对。

图2是小立碗藓EST329与表3中鉴定的已知14-3-3蛋白之间的比对。

图3是EST373与表4中鉴定的已知RING H2锌指蛋白之间的比对。

图4A和4B含EST548与表5中鉴定的已知GTP结合蛋白之间的比对。

优选实施方案的详细说明

本申请通篇引述了多篇出版物。所有这些出版物及这些出版物中引述的那些参考文献的公开内容全文并入本申请作为参考，以更充分地说明本发明所属技术领域的状态。本文使用的术语仅用于说明具体实施方案的目的，而并非旨在限制。如本文所用，“一个”或“一种”能够表示一个/种或多个/种，这取决于其所使用的上下文。因而，例如，述及“一个/种细胞”能够表示能够使用至少一个/种细胞。

在一个实施方案中，本发明提供了超量表达表1中鉴定的分离的多核苷酸或其同源物的转基因植物。本发明的转基因植物与植物野生型品种相比显示增加的环境胁迫耐受性。此类分离的核酸在植物中的超量表达可任选地导致与植物野生型品种相比，在正常或胁迫条件下植物生长或相关农产品产率的增加。不希望束缚于任何理论，本发明转基因植物增加的环境胁迫耐受性、增加的生长、和/或增加的产率据认为是由于植物的水利用效率增加所致。

如本文所定义，“转基因植物”是已经利用重组DNA技术改变从而含有否则将不存在于所述植物中的分离的核酸的植物。如本文所用，术语“植物”包括整株植物、植物细胞和植物部分。植物部分包括但不仅限于：茎、根、胚珠、雄蕊、叶、胚、分生组织区、胼胝体、配子体、孢子体、花粉、小孢子等等。本发明的转基因植物可以是雄性不育或雄性可育，并且可以还包括除包含本文所述分离多核苷酸的那些转基因之外的转基因。

如本文所用，术语“品种”是指同一物种内共有恒定特征从而将其与该物种中的典型形式或其他可能存在的品种区分开的一组植物。在拥有至少一种独特性状的同时，品种的特征还在于品种内一些品种个体间的一些差异，所述差异主要是基于连续传代子代中性状的孟德尔分离。若品种对于特定性状而言是遗传纯合的，以至于达到当真实遗传品种为自花传粉时，观察不到子代中该性状显著量的自由分离，则该品种被视为是该特征性状“真实遗传”。在本发明中，性状由引入植物品种内的一种或多种分离的多核苷酸的转基因表达而产生。同样如本文所用，术语“野生型品种”是指为比较目的作为对照进行分析的一组植物，其中除了野生型品种未曾用根据本发明的分离的多核苷酸转化以外，植物野生型品种与转基因植物(用根据本发明的分离的多核苷酸转化的植物)相同。

如本文所定义，术语“核酸”和“多核苷酸”可互换使用，是指线性或分支、单链或双链的RNA或DNA或其杂化物。该术语也包括RNA/DNA杂化物。“分离的”核酸分子为与该核酸天然来源中存在的其他核酸分子(即编码其他多肽的序列)基本分离的核酸分子。例如，认为克隆的核酸是分离的。若核酸已由人工干预改变，或置于并非其天然位置的基因座或位置，或若通过转化将其引入细胞，则也认为该核酸是分离的。而且，分离的核酸分子如cDNA分子，可不含有其天然在一起的其他细胞物质，或通过重组技术产生时的培养基，或化学合成时的化学前体或其他化学品。虽然分离的核酸可任选地包括位于基因编码区3’和5’端的非翻译序列，但其优选不合在其天然存在的复制子中天然侧接编码区的序列。

如本文所用，术语“环境胁迫”是指与盐度、干旱、氮、温度、金属、化学品、病原或氧化胁迫或其任意组合相关的亚佳条件。术语“水利用效率”和“WUE”是指植物所产生的有机物量除以植物为产生之所利用的水量，即，与植物水利用相关的植物干重。如本文所用，术语“干重”是指在植物中除了水以外的所有东西，并且包括例如糖类、蛋白质、油类和矿物质营养物。

可转化任何植物物种来建立根据本发明的转基因植物。本发明的转基因植物可以是双子叶植物或单子叶植物。例如并非限制性地，本发明的转基因植物可源自任何如下科的双子叶植物：豆科(Leguminosae)，包括诸如豌豆、苜蓿和大豆等植物；伞形科(Umbelliferae)，包括诸如胡萝卜和芹菜等植物；茄科(Solanaceae)，包括诸如番茄、马铃薯、茄子、烟草和胡椒等植物；十字花科(Cruciferae)，特别是芸苔属(Brassica)，包括诸如油菜籽油菜、甜菜、甘蓝、花椰菜和椰菜等植物；以及拟南芥(Arabidopsis thaliana)；菊科(Compositae)，包括诸如莴苣等植物；锦葵科(Malvaceae)，包括棉花；豆科(Fabaceae)，包括诸如花生等植物。本发明的转基因植物可源自单子叶植物，例如小麦、大麦、高粱、粟、裸麦、黑小麦、玉蜀黍、稻、燕麦、柳枝稷、芒属(miscanthus)和甘蔗。本发明的转基因植物也体现为树，例如苹果、梨、温柏、李、樱桃、桃、油桃、杏、木瓜、芒果及其他木本物种，包括松柏类和落叶树，例如白杨、松树、红杉、雪松、橡树、柳树等。尤其优选的是拟南芥、烟草(Nicotiana tabacum)、油菜籽油菜、大豆、玉米(玉蜀黍)、小麦、亚麻子、马铃薯和万寿菊。

如表1所示，本发明的一个实施方案是用含有编码CBL相互作用蛋白激酶的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物。钙依赖磷酸酶B样蛋白相互作用蛋白激酶(CIPK)家族蛋白代表钙依赖性丝氨酸苏氨酸蛋白激酶家族。CIPK具有两结构域结构，包括高度保守的N-末端催化激酶结构域和次保守的C-末端结构域。正是此C-末端结构域与钙依赖磷酸酶B样蛋白(CBL)相互作用。CIPK和CBL蛋白以钙依赖性方式直接相互作用形成复合物，其提供翻译细胞钙信号的调控机制。已经鉴定到一类CIPK，以含有最少24个氨基酸的蛋白质相互作用模块为特征，这对于介导CIPK和CBL蛋白之间的相互作用而言既是必要的又是充分的。此基序因其所含的特征性天冬酰胺、丙氨酸和苯丙氨酸残基已被命名为NAF结构域。已有人提出含NAF的CIPK蛋白的另一层调控是在十四烷基化后的钙依赖性可逆膜缔合。已证明这些CIPK参与植物胁迫信号发放。尤其是，已表明SOS3(CBL4)/SOS2(CIPK24)信号发放复合物在拟南芥中通过调控膜定位的Na⁺/H⁺交换器SOS1而特异性地介导盐胁迫信号传递。

此实施方案的转基因植物可含有任何编码CBL相互作用蛋白激酶的多核苷酸，所述蛋白激酶具有含SEQ ID NO：2的氨基酸1-449的序列。此实施方案的转基因植物可含有编码CBL相互作用蛋白激酶结构域或NAF结构域的多核苷酸，所述CBL相互作用蛋白激酶结构域具有含SEQ IDNO：2的氨基酸21-293的序列，所述NAF结构域具有含SEQ ID NO：2的氨基酸315-376的序列。

在另一实施方案中，本发明提供了用含有编码14-3-3蛋白的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物。14-3-3家族蛋白形成高度保守的二聚体蛋白。它们结合多种多样的系列细胞蛋白，其中逾200种迄今已知。各单体14-3-3蛋白的结构包括以反平行束排列的9个α螺旋，形成结合磷酸化配基的沟。14-3-3蛋白本身也能够通过磷酸化、二聚化、cAMP和Ca⁺⁺离子调控。二聚体形式的14-3-3蛋白能够容纳两个配基，单体的每一个沟中一个配基；由此，14-3-3蛋白在支撑多种多样蛋白靶标和调节个体蛋白靶标结构方面发挥作用。已经证明14-3-3蛋白的结合以可逆方式，即激活或失活，来改变酶，并且能够借助于稳定化或降解作用来改变蛋白质。

14-3-3蛋白具有高度保守的中心结构域和可变的N-和C-末端。已有人提出C-末端区域形成可移动的帽子，其可能调控配基自中心结合沟的进入和退出，和/或调控靶配基的特异性结合。结构及截短蛋白质的研究表明C-末端区域具有抑制作用，并可通过沟内的竞争结合阻止与14-3-3蛋白和配基的不适当相互作用。

此实施方案的转基因植物可含有任何编码14-3-3蛋白的多核苷酸，所述14-3-3蛋白具有含SEQ ID NO：4的氨基酸1-257的序列。此实施方案的转基因植物可含有编码14-3-3蛋白结构域或C-末端功能结构域的多核苷酸，所述14-3-3蛋白结构域具有含SEQ ID NO：4的氨基酸6-243的序列，所述C-末端功能结构域具有含SEQ ID NO：4的氨基酸245-258的序列。

如表1所示，本发明的一个实施方案是用含有编码RING H2锌指蛋白或RING H2锌指蛋白结构域的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物。真核细胞中借助于遍在蛋白/26S蛋白酶体通路的蛋白质降解调控物之一是遍在蛋白连接酶，也称为E3酶。这些E3酶负责募集将成为遍在蛋白化靶标、从而作为遍在蛋白化通路识别组分主要底物的蛋白质。E3连接酶基于保守结构域的存在分成3类。RING型E3连接酶可进一步细分为简单和复杂型。简单型在单个蛋白质中既含底物结合结构域又含E2结合RING结构域。RING结构域类似于锌指结构域：含半胱氨酸和/或组氨酸以与两个锌原子配位；但是又不同于锌指：RING结构域作为蛋白质-蛋白质相互作用结构域发挥功能。规范的RING基序含有7个半胱氨酸和1个组氨酸。C3H2C3/RING-H2E3连接酶家族包含第五个半胱氨酸取代为组氨酸。在拟南芥中，基于激发子和突变体研究，此RING-H2连接酶家族有参与生长调控物应答、生物胁迫应答和植物发育的一些证据。

此实施方案的转基因植物可含有任何编码RING H2锌指蛋白的多核苷酸。优选此实施方案的转基因植物含有编码锌指C3HC4型结构域的多核苷酸，所述C3HC4型结构域具有的序列包含SEQ ID NO：6的氨基酸88-129；SEQ ID NO：8的氨基酸98-139；SEQ ID NO：10的氨基酸121-162；SEQ ID NO：12的氨基酸123-164；SEQ ID NO：14的氨基酸84-125；SEQID NO：16的氨基酸117-158；SEQ ID NO：18的氨基酸80-121。更优选此实施方案的转基因植物含有编码RING H2锌指蛋白的多核苷酸，所述RING H2锌指蛋白具有的序列包含SEQ ID NO：6的氨基酸1-381；SEQ IDNO：8的氨基酸1-199；SEQ ID NO：10的氨基酸1-268；SEQ ID NO：12的氨基酸1-278；SEQ ID NO：14的氨基酸1-320；SEQ ID NO：16的氨基酸1-219；SEQ ID NO：18的氨基酸1-177。

在另一实施方案中，本发明提供了用含有编码GTP结合蛋白或GTP结合蛋白结构域的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物。单体/小G蛋白参与许多不同的细胞过程，并已牵涉到囊泡运输/转运系统、细胞周期调控以及蛋白质输入到细胞器中。当结合于GTP核苷酸时，GTP蛋白激活细胞过程，而当GTP水解为GDP时变得失活。这些蛋白质基于结构和功能相似性可以归为5个超家族：Ras、Rho/Rac/Cda42、Rab、Sar1/Arf和Ran。一般而言，在酵母和哺乳动物细胞中，仅Sar1和Rab家族小G蛋白的成员参与囊泡运输。在植物中，已经表明Rab G蛋白以类似于其酵母和哺乳动物对应物的方式发挥功能。Rab G蛋白调控内吞运输通路和生物合成运输通路。

此实施方案的转基因植物可含有任何编码GTP结合蛋白的多核苷酸。优选此实施方案的转基因植物含有编码Ras家族结构域的多核苷酸，所述Ras家族结构域具有的序列包含SEQ ID NO：20的氨基酸17-179；SEQ IDNO：22的氨基酸21-182；SEQ ID NO：24的氨基酸19-179；SEQ ID NO：26的氨基酸17-179；SEQ ID NO：28的氨基酸19-179；SEQ ID NO：30的氨基酸19-179；SEQ ID NO：32的氨基酸22-193；SEQ ID NO：34的氨基酸19-179；SEQ ID NO：36的氨基酸22-193；SEQ ID NO：38的氨基酸22-193；SEQ ID NO：40的氨基酸22-193；SEQ ID NO：42的氨基酸19-179；SEQ IDNO：44的氨基酸22-193；SEQ ID NO：46的氨基酸10-171；SEQ ID NO：48的氨基酸19-179；SEQ ID NO：50的氨基酸17-179；SEQ ID NO：52的氨基酸10-171；SEQ ID NO：54的氨基酸11-172；SEQ ID NO：56的氨基酸1-137；SEQ ID NO：58的氨基酸10-171；SEQ ID NO：60的氨基酸15-179；SEQ ID NO：62的氨基酸17-195；SEQ ID NO：64的氨基酸10-171；SEQ IDNO：66的氨基酸10-171；SEQ ID NO：68的氨基酸10-171；SEQ ID NO：70的氨基酸10-171；SEQ ID NO：72的氨基酸10-171；SEQ ID NO 74的氨基酸10-171；SEQ ID NO：76的氨基酸10-171。更优选此实施方案的转基因植物含有编码GTP结合蛋白的多核苷酸，所述GTP结合蛋白具有的序列包含SEQ ID NO：20的氨基酸1-216；SEQ ID NO：22的氨基酸1-184；SEQ ID NO：24的氨基酸1-191；SEQ ID NO：26的氨基酸1-214；SEQ IDNO：28的氨基酸1-182；SEQ ID NO：30的氨基酸1-181；SEQ ID NO：32的氨基酸1-193；SEQ ID NO：34的氨基酸1-183；SEQ ID NO：36的氨基酸1-193；SEQ ID NO：38的氨基酸1-193；SEQ ID NO：40的氨基酸1-193；SEQ ID NO：42的氨基酸1-181；SEQ ID NO：44的氨基酸1-193；SEQ IDNO：46的氨基酸1-204；SEQ ID NO：48的氨基酸1-182；SEQ ID NO：50的氨基酸1-214；SEQ ID NO：52的氨基酸1-206；SEQ ID NO：54的氨基酸1-204；SEQ ID NO：56的氨基酸1-158；SEQ ID NO：58的氨基酸1-202；SEQ ID NO：60的氨基酸1-212；SEQ ID NO：62的氨基酸1-216；SEQ IDNO：64的氨基酸1-201；SEQ ID NO：66的氨基酸1-203；SEQ ID NO：68的氨基酸1-203；SEQ ID NO：70的氨基酸1-203；SEQ ID NO：72的氨基酸1-209；SEQ ID NO：74的氨基酸1-202；SEQ ID NO：76的氨基酸1-199。

本发明还提供了由表达表1所列多核苷酸的转基因植物产生的种子，其中种子含有所述多核苷酸，且其中所述植物为与植物野生型品种相比，在正常或胁迫条件下生长和/或产率增加，和/或环境胁迫耐受性增加的真实遗传。本发明还提供了由表达所述多核苷酸的转基因植物、其植物部分或其种子产生或来自它们的产品。可以利用本领域熟知的多种方法获得所述产品。如本文所用，单词“产品”包括但不限于：食物、饲料、食品增补剂、饲料增补剂、化妆品或药物。食物视为营养用组合物或补充营养用组合物。特别地，动物饲料和动物饲料增补剂视为食物。本发明还提供了由任意转基因植物、植物部分及植物种子产生的农产品。农产品包括但不仅限于：植物提取物、蛋白质、氨基酸、糖类、脂肪、油类、聚合物、维生素等等。

在优选实施方案中，本发明分离的多核苷酸包含具有选自表1所列核苷酸序列的序列的多核苷酸。这些多核苷酸可包含编码区的序列，以及5”非翻译序列和3’非翻译序列。

利用标准分子生物学技术及本文提供的序列信息，能够分离本发明的多核苷酸。例如，本发明的小立碗藓cDNA利用本文公开序列的一部分从小立碗藓文库中分离。可基于表1所示的核苷酸序列来设计用于聚合酶链式反应扩增的合成寡核苷酸引物。本发明的核酸分子可利用cDNA或可选的基因组DNA作为模板和适当的寡核苷酸引物，根据标准PCR扩增技术来扩增。可将如此扩增的核酸分子克隆到适当的载体中，并通过DNA序列分析进行表征。此外，对应于表1所列核苷酸序列的寡核苷酸可通过标准合成技术例如用自动DNA合成仪来制备。

“同源物”在本文定义为分别具有相似或基本上相同的核苷酸或氨基酸序列的两个核酸或多肽。同源物包括下文定义的等位基因变体、类似物和直系同源物。如本文所用，术语“类似物”是指具有相同或相似功能、但在非相关生物中独立进化而来的两种核酸。如本文所用，术语“直系同源物”是指来自不同物种、但由共同祖先基因通过物种形成进化而来的两种核酸。术语同源物还包括由于遗传密码简并性虽不同于如表1所示核苷酸序列之一但编码相同多肽的核酸分子。如本文所用，“天然存在的”核酸分子是指具有天然存在的核苷酸序列(例如编码天然多肽)的RNA或DNA分子。

为了确定两个氨基酸序列(例如表1的多肽序列之一及其同源物)之间的序列同一性百分比，以最佳比较目的来比对所述序列(例如，可向一个多肽序列中引入空位以达到与另一多肽或核酸的最佳比对)。然后比较对应氨基酸位置上的氨基酸残基。当一个序列中某一位置为另一个序列中相应位置上的相同氨基酸残基所占据时，则这两个分子在该位置上是相同的。可在两个核酸序列间进行同类比较。

优选本发明多肽的分离的氨基酸同源物、类似物和直系同源物与表1中鉴定的完整氨基酸序列具有至少约50-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，最优选至少约96％、97％、98％、99％或更大的同一性。在另一优选实施方案中，本发明分离的核酸同源物包含与表1所示核酸序列具有至少约40-60％，优选至少约60-70％，更优选至少约70-75％、75-80％、80-85％、85-90％或90-95％，甚至更优选至少约95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性的核苷酸序列。

为本发明目的计，利用Align 2.0(Myers和Miller，CABIOS(1989)4：11-17)以所有参数设为默认设置或者Vector NTI 9.0(PC)软件包(Invitrogen，1600 Faraday Ave.，Carlsbad，CA92008)来确定两个核酸或多肽序列之间的百分比序列同一性。对于Vector NTI计算的百分比同一性，应用空位开放罚分15和空位延伸罚分6.66，来确定两个核酸之间的百分比同一性。应用空位开放罚分10和空位延伸罚分0.1，来确定两个多肽之间的百分比同一性。所有其他参数设为默认设置。为多重比对目的(Clustal W算法)，blosum62矩阵的空位开放罚分为10，而空位延伸罚分为0.05。应当了解，为了确定序列同一性，当比较DNA序列和RNA序列时，胸腺嘧啶核苷酸等同于尿嘧啶核苷酸。

基于与本文所述多肽的同一性，可以使用编码相应多肽的多核苷酸或基于此的引物作为杂交探针，在严谨杂交条件下根据标准杂交技术来分离对应于表1所列多肽同源物、类似物和直系同源物的核酸分子。如本文所用，就DNA与DNA印迹杂交而言，术语“严谨条件”是指在10×Denhart溶液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中于60℃杂交过夜。相继在3×SSC/0.1％SDS，接着在1×SSC/0.1％SDS，最后在0.1×SSC/0.1％SDS中于62℃洗涤印迹，每次30分钟。同样如本文所用，在优选的实施方案中，“严谨条件”是指在6×SSC溶液中于65℃杂交。在另一实施方案中，短语“高严谨条件”是指在10×Denhart液、6×SSC、0.5％SDS和100μg/ml变性鲑精DNA中于65℃杂交过夜。相继在3×SSC/0.1％SDS，接着在1×SSC/0.1％SDS，最后在0.1×SSC/0.1％SDS中于65℃洗涤印迹，每次30分钟。核酸杂交的方法描述于Meinkoth和Wahl，1984，Anal.Biochem.138：267-284；其为本领域熟知(参见例如CurrentProtocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人编辑，GreenePublishing and Wiley-Interscience，纽约，1995；和Tijssen，1993，Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology：Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，Elsevier，纽约，1993)。优选在严谨或高严谨条件下与表1所列核苷酸序列杂交的本发明分离的核酸分子对应于天然存在的核酸分子。

有多种方法可用于从简并寡核苷酸序列中产生潜在的同源物文库。可在自动DNA合成仪中进行简并基因序列的化学合成，然后将合成基因连接进适当的表达载体。使用基因简并集合能够在同一混合物内提供编码潜在序列期望集合的所有序列。合成简并寡核苷酸的方法为本领域公知(参见例如Narang，1983，Tetrahedron 39：3；Itakura等人，1984，Annu.Rev.Biochem.53：323；Itakura等人，1984，Science 198：1056；Ike等人，1983，Nucleic Acid Res.11：477)。

另外，可产生优化的核酸。优选优化的核酸编码的多肽具有类似于表1所列多肽的功能，和/或在正常或限水条件下调节植物的生长和/或产率和/或环境胁迫耐受性，更优选当其在植物中超量表达时在正常或限水条件下增加植物的生长和/或产率和/或环境胁迫耐受性。如本文所用，“优化的”是指经遗传改造以提高其在给定植物或动物中表达的核酸。为了向植物提供优化的核酸，可修饰基因的DNA序列，以使其1)含有高表达植物基因所偏好的密码子；2)包含在植物中大量可见的A+T含量核苷酸碱基组成；3)形成植物起始序列；4)消除导致RNA去稳定、不恰当聚腺苷化、降解和终止的序列，或那些形成二级结构发卡或RNA剪接位点的序列；或5)消除反义可读框。利用一般植物或特定植物中密码子使用的频率分布，可实现植物中核酸表达的增加。优化植物中核酸表达的方法可见于EPA0359472；EPA 0385962；PCT申请WO 91/16432；美国专利No.5,380,831；美国专利No.5,436,391；Perlack等人，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA88：3324-3328；以及Murray等人，1989，Nucleic Acids Res.17：477-498。

可优化本发明分离的多核苷酸，从而其密码子使用的分布频率相对于那些高表达的植物基因偏差优选不大于25％，更优选不大于10％。另外，应当考虑简并的第三碱基的G+C含量百分比(单子叶植物在这个位置上似乎更偏好G+C，而双子叶植物则不)。也发现XCG(其中X为A、T、C或G)核苷酸为双子叶植物最不优选的密码子，而XTA密码子则是单子叶和双子叶植物都避免使用。本发明优化的核酸也优选与所选宿主植物具有非常接近的CG和TA双联体避免指数(doublet avoidance indices)。更优选这些指数与宿主指数间的偏差不大于约10-15％。

本发明还提供了含有上文所述多核苷酸的分离的重组表达载体，其中所述载体在宿主细胞中的表达导致与宿主细胞的野生型品种相比，在正常或限水条件下植物生长和/或产率增加，和/或环境胁迫耐受性增加。本发明的重组表达载体中含有以适于核酸在宿主细胞中表达的形式存在的本发明核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种基于待用于表达的宿主细胞选择的、与待表达的核酸序列有效连接的调控序列。如本文所用，就重组表达载体而言，“有效连接”旨在表示目的核苷酸序列以使该核苷酸序列得以表达(例如在载体被引入宿主细胞情况下的细菌或植物宿主细胞中表达)的方式连接于调控序列。术语“调控序列”旨在包括启动子、增强子及其他表达控制元件(例如聚腺苷化信号)。此类调控序列为本领域熟知。调控序列包括指导核苷酸序列在多类宿主细胞中组成型表达的序列，以及仅在某些宿主细胞中或某些条件下指导核苷酸序列表达的序列。本领域技术人员将会理解，表达载体的设计可取决于诸如待转化宿主细胞的选择、期望的多肽表达水平等因素。可将本发明的表达载体引入宿主细胞，从而产生由本文所述核酸编码的多肽。

植物基因表达应当有效连接于适当的启动子，使基因以时序性、细胞特异性或组织特异性方式表达。可用于本发明表达盒的启动子包括能够在植物细胞中起始转录的任何启动子。此类启动子包括但不仅限于可获自植物、植物病毒以及含有能在植物中表达的基因的细菌(如农杆菌属(Agrobacterium)和根瘤菌属(Rhizobium))的启动子。

启动子可为组成型、诱导型、发育阶段偏好型、细胞类型偏好型、组织偏好型或器官偏好型启动子。组成型启动子在大部分情况下均有活性。组成型启动子的实例包括CaMV 19S和35S启动子(Odell等人，1985，Nature 313：810-812)、sX CaMV 35S启动子(Kay等人，1987，Science236：1299-1302)、Sep1启动子、稻肌动蛋白启动子(McElroy等人，1990，Plant Cell 2：163-171)、、拟南芥肌动蛋白启动子、泛酰(ubiquitan)启动子(Christensen等人，1989，Plant Molec.Biol.18：675-689)、pEmu(Last等人，1991，Theor.Appl.Genet.81：581-588)、玄参花叶病毒35S启动子、Smas启动子(Velten等人，1984，EMBO J 3：2723-2730)、超级启动子(美国专利No.5,955,646)、GRP1-8启动子、肉桂醇脱氢酶启动子(美国专利No.5,683,439)、农杆菌T-DNA启动子，例如甘露碱合酶、胭脂碱合酶和章鱼碱合酶，核酮糖二磷酸羧化酶小亚基(ssuRUBISCO)启动子等等。

诱导型启动子优选在诸如有无营养物或代谢物、热或冷、光、病原攻击、缺氧条件等的某些环境条件下具有活性。例如，芸苔属的hsp80启动子由热激诱导；PPDK启动子由光诱导；烟草、拟南芥和玉蜀黍的PR-1启动子由病原感染诱导；而Adh1启动子由低氧和冷胁迫诱导。诱导型启动子也可有助于植物基因表达(综述参见Gatz，1997，Annu.Rev.PlantPhysiol.Plant Mol.Biol.48：89-108)。化学诱导型启动子尤其适用于需要以时间特异性方式进行基因表达的情况。此类启动子的实例有水杨酸诱导型启动子(PCT申请WO 95/19443)、四环素诱导型启动子(Gatz等人，1992，Plant J.2：397-404)和乙醇诱导型启动子(PCT申请WO 93/21334)。

在本发明的一个优选实施方案中，诱导型启动子为胁迫诱导型启动子。就本发明目的而言，胁迫诱导型启动子优选在如下一种或多种胁迫下具有活性：与盐度、干旱、氮、温度、金属、化学、病原和氧化胁迫有关的亚佳条件。胁迫诱导型启动子包括但不仅限于：Cor78(Chak等人，2000，Planta 210：875-883；Hovath等人，1993，Plant Physiol.103：1047-1053)、Cor15a(Artus等人，1996，PNAS 93(23)：13404-09)、Rci2A(Medina等人，2001，Plant Physiol.125：1655-66；Nylander等人，2001，Plant Mol.Biol.45：341-52；Navarre和Goffeau，2000，EMBO J.19：2515-24；Capel等人，1997，Plant Physiol.115：569-76)、Rd22(Xiong等人，2001，Plant Cell13：2063-83；Abe等人，1997，Plant Cell 9：1859-68；Iwasaki等人，1995，Mol.Gen.Genet.247：391-8)、cDet6(Lang和Palve，1992，Plant Mol.Biol.20：951-62)、ADH1(Hoeren等人，1998，Genetics 149：479-90)、KAT1(Nakamura等人，1995，Plant Physiol.109：371-4)、KST1(Müller-

等人，1995，EMBO 14：2409-16)、Rha1(Terryn等人，1993，Plant Cell 5：1761-9；Terryn等人，1992，FEBS Lett.299(3)：287-90)、ARSK1(Atkinson等人，1997，GenBank登录号L22302和PCT申请WO 97/20057)、PtxA(Plesch等人，GenBank登录号X67427)、SbHRGP3(Ahn等人，1996，Plant Cell8：1477-90)、GH3(Liu等人，1994，Plant Cell 6：645-57)、病原诱导型PRP1基因启动子(Ward等人，1993，Plant.Mol.Biol.22：361-366)、番茄热诱导型hsp80启动子(美国专利No.5187267)、马铃薯冷诱导型α-淀粉酶启动子(PCT申请WO 96/12814)或创伤诱导型pinII-启动子(欧洲专利No.375091)。有关干旱、冷和盐诱导型启动子的其他实例，如RD29A启动子，参见Yamaguchi-Shinozalei等人，1993，Mol.Gen.Genet.236：331-340。

发育阶段偏好型启动子优先表达于发育的某些阶段。组织和器官偏好型启动子包括那些优先在某些组织或器官中表达的启动子，如叶、根、种子或木质部。组织偏好型和器官偏好型启动子的实例包括但不仅限于果实偏好型、胚珠偏好型、雄性组织偏好型、种子偏好型、珠被偏好型、块茎偏好型、柄偏好型、果皮偏好型、叶偏好型、柱头偏好型、花粉偏好型、花药偏好型、花瓣偏好型、萼片偏好型、花梗偏好型、长角果偏好型、茎偏好型、根偏好型启动子等。种子偏好型启动子优先在种子发育和/或萌发期间表达。例如，种子偏好型启动子可为胚偏好型、胚乳偏好型以及种皮偏好型(参见Thompson等人，1989，BioEssays 10：108)。种子偏好型启动子的实例包括但不仅限于纤维素合酶(celA)、Cim1、γ-玉米醇溶蛋白、球蛋白-1、玉蜀黍19kD玉米醇溶蛋白(cZ19B1)等。

其他适当的组织偏好型或器官偏好型启动子包括油菜籽的油菜籽蛋白(napin)基因启动子(美国专利No.5,608,152)、蚕豆(Vicia faba)的USP启动子(Baeumlein等人，1991，Mol.Gen.Genet.225(3)：459-67)、拟南芥的油质蛋白启动子(PCT申请WO 98/45461)、菜豆(Phaseolus vulgaris)的菜豆蛋白启动子(美国专利No.5,504,200)、芸苔属的Bce4启动子(PCT申请WO91/13980)或豆球蛋白B4启动子(LeB4；Baeumlein等人，1992，PlantJournal，2(2)：233-9)以及赋予单子叶植物如玉蜀黍、大麦、小麦、裸麦、稻等种子特异性表达的启动子。需提及的适宜启动子有大麦的lpt2或lpt1基因启动子(PCT申请WO 95/15389和PCT申请WO 95/23230)，或PCT申请WO 99/16890中所述的启动子(大麦的大麦醇溶蛋白基因、稻的谷蛋白基因、稻的水稻素基因、稻的醇溶蛋白基因、小麦的麦醇溶蛋白基因、小麦的谷蛋白基因、燕麦的谷蛋白基因、高粱的kasirin基因和裸麦的裸麦醇溶蛋白基因的启动子)。

可用于本发明表达盒的其他启动子包括但不仅限于：主要叶绿素a/b结合蛋白启动子、组蛋白启动子、Ap3启动子、β-大豆球蛋白(β-conglysin)启动子、油菜籽蛋白启动子、大豆凝集素启动子、玉蜀黍15kD玉米醇溶蛋白启动子、22kD玉米醇溶蛋白启动子、27kD玉米醇溶蛋白启动子、g玉米醇溶蛋白启动子、蜡质、萎缩蛋白(shrunken)1、萎缩蛋白2和青铜色启动子、Zm13启动子(美国专利No.5,086,169)、玉蜀黍多聚半乳糖醛酸酶启动子(PG)(美国专利No.5,412,085和5,545,546)和SGB6启动子(美国专利No.5,470,359)，以及合成的或其他天然启动子。

利用异源来源的DNA结合结构域及应答元件(即非植物来源的DNA结合结构域)，在调控植物中异源基因表达方面能够带来附加的灵活性。此类异源DNA结合结构域的实例是LexA DNA结合结构域(Brent和Ptashne，1985，Cell 43：729-736)。

在本发明优选的实施方案中，表1所列的多核苷酸在高等植物(例如种子植物如作物植物)的植物细胞中表达。可通过任何方法将多核苷酸“引入”植物细胞中，包括转染、转化或转导、电穿孔、粒子轰击、农杆菌感染法等。转化或转染植物细胞的适宜方法已有公开，例如，如美国专利No.4,945,050；5,036,006；5,100,792；5,302,523；5,464,765；5,120,657；6,084,154等所示利用粒子轰击。更优选地，本发明的转基因玉米种子可利用农杆菌转化法制备，如美国专利No.5,591,616；5,731,179；5,981,840；5,990,387；6,162,965；6,420,630，美国专利申请公开2002/0104132等所述。可利用例如欧洲专利No.0424047、美国专利No.5,322,783、欧洲专利No.0397687、美国专利No.5,376,543或美国专利No.5,169,770中所述的技术进行大豆的转化。小麦转化的具体实例可见PCT申请WO 93/07256。棉花可利用美国专利No.5,004,863；5,159,135；5,846,797等公开的方法转化。稻可利用美国专利No.4,666,844；5,350,688；6,153,813；6,333,449；6,288,312；6,365,807；6,329,571等公开的方法转化。其他植物转化方法公开于例如美国专利No.5,932,782；6,153,811；6,140,553；5,969,213；6,020,539等。可根据本发明使用任何适于将转基因插入特定植物的植物转化方法。

根据本发明，如果所引入的多核苷酸掺入到非染色体自主复制子或整合入植物染色体中，则其可稳定保留在植物细胞中。可选地，所引入的多核苷酸可存在于染色体外非复制性载体上，并可瞬时表达或具有瞬时活性。

本发明另一方面涉及具有选自表1所列多肽序列的序列的分离的多肽。当用重组DNA技术生产时，“分离的”或“纯化的”多肽不含有某些细胞物质，或当化学合成时不含有化学前体或其他化学品。表述“基本上不含细胞物质”包括其中多肽从天然或重组产生该多肽的细胞的某些细胞成分中分离出来的多肽制备物。在一个实施方案中，表述“基本上不含细胞物质”包括含有少于约30％(干重)杂质多肽的多肽制备物，更优选少于约20％杂质多肽的多肽制备物，还更优选少于约10％杂质多肽的多肽制备物，最优选少于约5％杂质多肽的多肽制备物。

本领域已经充分确立了酶活性和动力学参数的测定方法。确定任何给定改变的酶的活性的实验必须根据野生型酶的比活予以定制，这在本领域技术人员的能力范围之内。关于酶的总体概述以及关于结构、动力学、原理、方法、应用和确定许多酶活性的实例的具体细节大量存在，且为本领域技术人员熟知。

本发明也体现为产生含有至少一种表1所列多核苷酸的转基因植物的方法，其中多核苷酸在植物中的表达导致植物与植物野生型品种相比，在正常或限水条件下生长和/或产率增加，和/或环境胁迫耐受性增加，所述方法包括步骤：(a)向植物细胞中引入含有至少一种表1所列多核苷酸的表达载体，和(b)从植物细胞生成表达所述多核苷酸的转基因植物，其中多核苷酸在转基因植物中的表达导致植物与植物野生型品种相比，在正常或限水条件下生长和/或产率增加，和/或环境胁迫耐受性增加。植物细胞可以是但不仅限于：原生质体、产配子细胞以及再生为整株植物的细胞。如本文所用，术语“转基因的”，指含有至少一种表1所列重组多核苷酸的任何植物、植物细胞、胼胝体、植物组织或植物部分。在许多情况下，重组多核苷酸稳定整合于染色体或稳定的染色体外元件，因此可连续传代。

本发明也提供了增加植物在正常或限水条件下的生长和/或产率和/或增加植物环境胁迫耐受性的方法，其包括增加植物中至少一种表1所列多核苷酸的表达的步骤。可通过本领域技术人员已知的任何方法增加蛋白质的表达。

通过使修饰的植物在亚适条件下生长，然后分析植物的生长特征和/或代谢，能够评估遗传修饰对植物生长和/或产率和/或胁迫耐受性的影响。此类分析技术为本领域技术人员熟知，并且包括干重、鲜重、多肽合成、糖类合成、脂质合成、蒸发蒸腾作用速率、一般植物和/或作物产率、开花、繁殖、结实、根生长、呼吸速率、光合作用速率等，应用生物技术领域技术人员已知的方法。

以下实施例进一步举例说明了本发明，这些实施例不意图以任何方式对本发明的范围进行限制。

实施例

实施例1

鉴定小立碗藓可读框

由来自汉堡大学遗传研究部门保藏中心的植物物种小立碗藓(Hedw.)B.S.G.制备的cDNA文库利用标准方法测序。植物最初源于位于GransdenWood，亨廷登郡(英国)的H.L.K.Whitehouse保藏的16/14株，由Engel从孢子次培养而来(1968，Am.J.Bot.55：438-446)。

小立碗藓部分cDNA(EST)在小立碗藓EST测序项目中利用EST-MAX程序(Bio-Max(德国慕尼黑))得以鉴定。利用已知方法确定了全长核苷酸cDNA序列。所公开多肽序列的氨基酸序列与已知蛋白质序列的同一性和相似性示于表2-5(与Align和默认设置一起使用两两比较)。

表2

EST462(SEQ ID NO：2)与已知CBL相互作用蛋白激酶的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABJ91230	毛果杨(Populus trichocarpa)	68.50％
ABJ91231	毛果杨	66.20％
			NP_001058901	水稻	65.60％
NP_171622	拟南芥	65.40％
			ABJ91219	毛果杨	65.60％
EST443(SEQ ID NO：77)	小立碗藓	58.00％

表3

EST329(SEQ ID NO：4)与已知14-3-3蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			BAD12177	烟草	84.20％
AAY67798	木薯(Manihot esculenta)	84.10％
			BAD12176	烟草	83.80％
AAC04811	贝母(Fritillaria agrestis)	83.40％
			Q9SP07	麝香百合(Lilium longiflorum)	83.40％
EST217	小立碗藓	75.5％

表4

EST373(SEQ ID NO：6)与已知RING H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			AAF27026	拟南芥	20.00％
AAD33584	拟南芥	19.50％
			AAM60957	拟南芥	18.20％
NP_198094	拟南芥	18.20％
			NP_192651	拟南芥	16.80％

表5

EST548(SEQ ID NO：20)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001055761	水稻	87.10％
BAB84323	烟草	86.30％
			NP_001059259	水稻	86.30％
BAB84324	烟草	86.20％
			ABE82101	蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)	85.80％

实施例2

从其他植物克隆全长cDNA

卡诺拉油菜(canola)、大豆、稻、玉蜀黍、亚麻子和小麦植物在多种条件和处理下生长，并在多个发育阶段收获不同的组织。植物生长和收获以策略性的方式进行，从而最大化在至少一个或多个所产生的文库中收获所有可表达基因的概率。从各收集样品中分离mRNA，并构建cDNA文库。在文库制备过程中未应用扩增步骤，以最小化样品内的基因冗余和保留表达信息。所有文库由寡聚dT柱上纯化的mRNA自3’生成。随机挑取cDNA文库转化大肠杆菌所得的菌落，并置于微量滴定板中。

从大肠杆菌菌落中分离质粒DNA，然后点样到膜上。一组288种³³P放射性同位素标记的7-元(mer)寡核苷酸相继与这些膜杂交。为增加通量，膜一式两份进行处理。在每份杂交后，在磷光图像扫描期间捕获印迹图像，以生成各寡核苷酸的杂交谱。这种原始数据图像自动传送至计算机。通过条形码标记来维系图像暗匣(cassette)、滤膜及暗匣内取向的确凿身份。然后利用相对温和的条件来处理滤膜，以使结合的探针剥离并返至杂交室进行另一轮杂交。重复杂交和成像循环直至该组288种寡聚体均已完成。

杂交结束后，每个斑点(代表cDNA插入物)均生成了关于这288种³³P放射性同位素标记的7-元寡核苷酸中哪些个与该特定斑点(cDNA插入物)结合、以及以何种程度结合的谱图。此谱图定义为由该克隆生成的标签。将每个克隆的标签与来自相同生物的所有其他标签进行比较，以鉴定相关标签簇。此方法在测序之前将来自生物的所有克隆“分选”成簇。

克隆基于其具有相同或相似的杂交标签而被分选成多个簇。簇应指示个体基因或基因家族的表达。此分析的副产品为特定文库中各基因丰度的表达谱。应用自5’端起始的单程测序(one-path sequencing)通过在序列数据库中进行相似性和基序搜索来预测具体克隆的功能。

小立碗藓RING H2锌指蛋白的全长DNA序列(SEQ ID NO：6)针对卡诺拉油菜、大豆、稻、玉蜀黍、亚麻子和小麦cDNA专有数据库以e^-10的e值进行blast(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。对所有重叠群命中事件进行推定全长序列的分析，并对代表推定全长重叠群的最长克隆进行全长测序。鉴定到来自大麦的一个同源物、来自芸苔属的两个同源物以及来自大豆的三个同源物。这些序列与最接近的已知公开序列的氨基酸同一性和相似性程度示于表6-11(与Align和默认设置一起使用两两比较)。

表6

HV62561245(SEQ ID NO：8)与已知RING-H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001053607	水稻	62.60％
CAH67054	水稻	62.60％
			NP_001047725	水稻	50.20％
EAZ31640	水稻	41.1％
			ABN08252	蒺藜苜蓿	36.1％

表7

BN43173847(SEQ ID NO：10)与已知RING-H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			AAM65773	拟南芥	70.50％
AAC77829	拟南芥	69.80％
			NP_188294	拟南芥	68.80％
AAW33880	银白杨×欧洲山杨(Populus alba×Populus tremula)	50.50％
			AAM61585	拟南芥	37.40％

表8

BN46735603(SEQ ID NO：12)与已知RING-H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			AAM65773	拟南芥	55.00％
AAC77829	拟南芥	54.40％
			NP_188294	拟南芥	53.70％
AAM61585	拟南芥	47.70％
			NP_567480	拟南芥	47.70％

表9

GM52504443(SEQ ID NO：14)与已知RING-H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABE77983	蒺藜苜蓿	66.10％
ABD32383	蒺藜苜蓿	59.20％
			AAO45753	甜瓜(Cucumis melo)	53.80％
AAF27026	拟南芥	42.20％
			AAL86301	拟南芥	41.50％

表10

GM47122590(SEQ ID NO：16)与已知RING-H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_192753	拟南芥	44.90％
Q570X5	拟南芥	41.90％
			NP_192754	拟南芥	40.40％
NP_001047138	水稻	39.5％
			NP_174614	拟南芥	21.90％

表11

GM52750153(SEQ ID NO：18)与已知RING-H2锌指蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001053607	水稻	33.00％
CAH67054	水稻	33.00％
			NP_001047725	水稻	31.60％
AAX92760	水稻	24.50％
			ABA95805	水稻	19.40％

小立碗藓GTP结合蛋白的全长DNA序列(SEQ ID NO：20)针对卡诺拉油菜、大豆、稻、玉蜀黍、亚麻子、向日葵和小麦cDNA专有数据库以e^-10的e值进行blast(Altschul等人，1997，Nucleic Acids Res.25：3389-3402)。对所有重叠群命中事件进行推定全长序列的分析，并对代表推定全长重叠群的最长克隆进行全长测序。鉴定到来自大麦的三个同源物、来自芸苔属的三个同源物、来自大豆的两个同源物、来自小麦的两个同源物、来自亚麻子的九个同源物、来自稻的三个同源物以及来自向日葵的六个同源物。这些序列与最接近的已知公开序列的氨基酸同一性和相似性程度示于表12-39(与Align和默认设置一起使用两两比较)。

表12

GM50181682(SEQ ID NO：22)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_190556	拟南芥	92.90％
NP_569051	拟南芥	91.30％
			NP_001049292	水稻	87.50％
BAB08464	拟南芥	82.10％
			NP_568553	拟南芥	81.00％

表13

HV62638446(SEQ ID NO：24)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001065511	水稻	96.90％
ABE90431	蒺藜苜蓿	87.40％
			BAD07876	水稻	87.10％
AAW67545	胡萝卜(Daucus carota)	86.50％
			NP_186962	拟南芥	83.90％

表14

TA56528531(SEQ ID NO：26)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001051716	水稻	93.00％
AAS88430	水稻	92.10％
			NP_001059259	水稻	92.10％
CAA04701	胡萝卜	89.80％
			BAB84323	烟草	89.80％

表15

HV62624858(SEQ ID NO：28)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001061368	水稻	98.40％
ABE83396	蒺藜苜蓿	92.30％
			NP_850057	拟南芥	90.70％
Q96361	欧洲油菜	90.10％
			XP_416175	红原鸡(Gallus gallus)	64.30％

表16

LU61640267(SEQ ID NO：30)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABB03801	胡萝卜	99.40％
AAF65512	辣椒(Capsicum annuum)	98.90％
			AAI22856	黄牛(Bos taurus)	98.90％
AAR29293	紫花苜蓿(Medicago sativa)	98.30％
			ABA40446	马铃薯(Solanum tuberosum)	98.30％

表17

LU61872929(SEQ ID NO：32)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			O04266	欧洲油菜	95.30％
NP_001042942	水稻	93.30％
			NP_191815	拟南芥	93.30％
ABA81873	马铃薯	93.30％
			O04267	欧洲油菜	92.80％

表18

LU61896092(SEQ ID NO：34)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_188935	拟南芥	91.80％
NP_001068170	水稻	85.90％
			NP_648201	黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)	59.00％
XP_623433	西方蜜蜂(Apis mellifera)	58.50％
			XP_645417	盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)	58.10％

表19

LU61748785(SEQ ID NO：36)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_191815	拟南芥	94.30％
ABA81873	马铃薯	94.30％
			O04266	欧洲油菜	94.30％
CAA69699	皱叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)	93.80％
			AAF17254	烟草	93.30％

表20

OS34706416(SEQ ID NO：38)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABA81873	马铃薯	94.30％
NP_001042942	水稻	93.30％
			AAC32610	野燕麦(Avena fatua)	92.70％
BAA13463	烟草	92.70％
			CAA69699	皱叶烟草	92.20％

表21

GM49750953(SEQ ID NO：40)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABA81873	马铃薯	94.30％
NP_001042942	水稻	93.30％
			AAC32610	野燕麦	92.70％
BAA13463	烟草	92.70％
			CAA69699	皱叶烟草	92.20％

表22

HA66696606(SEQ ID NO：42)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABB03801	胡萝卜	99.40％
AAR29293	紫花苜蓿	99.40％
			ABA40446	马铃薯	99.40％
NP_001044599	水稻	98.90％
			AAF65512	辣椒	98.90％

表23

HA66783477(SEQ ID NO：44)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABA81873	马铃薯	96.40％
CAA69699	皱叶烟草	95.30％
			BAA13463	烟草	94.80％
ABA46770	马铃薯	93.30％
			NP_001042942	水稻	92.70％

表24

HA66705690(SEQ ID NO：46)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			CAA98161	日本百脉根(L.japonicus)	91.10％
CAA98162	日本百脉根	90.60％
			BAA02117	豌豆(P.sativum)	90.10％
BAA02118	豌豆	90.10％
			AAB97115	大豆	89.20％

表25

TA59921546(SEQ ID NO：48)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001061368	水稻	97.30％
ABE83396	蒺藜苜蓿	92.30％
			NP_850057	拟南芥	89.60％
Q96361	欧洲油菜	89.00％
			XP_636876	盘基网柄菌	64.50％

表26

HV62657638(SEQ ID NO：50)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_001055761	水稻	95.80％
NP_001059259	水稻	94.00％
			NP_001051716	水稻	93.50％
ABE82101	蒺藜苜蓿	92.10％
			AAS88430	水稻	91.60％

表27

BN43540204(SEQ ID NO：52)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			AAB04618	欧洲油菜	99.00％
NP_187779	拟南芥	98.10％
			AAD10389	腋花矮牵牛×膨大矮牵牛(Petunia axillaris×Petunia integrifolia)	85.90％
AAA80679	番茄(Solanum lycopersicum)	85.90％
			CAA66447	日本百脉根(Lotus japonicus)	84.00％

表28

BN45139744(SEQ ID NO：54)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_171715	拟南芥	96.60％
AAB97115	大豆	93.10％
			BAA00832	拟南芥	92.60％
BAA02118	豌豆(Pisum sativum)	92.20％
			CAA98161	日本百脉根	90.20％

表29

BN43613585(SEQ ID NO：56)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_200792	拟南芥	56.40％
CAA98173	日本百脉根	56.00％
			ABE82101	蒺藜苜蓿	52.80％
BAB84326	烟草	52.30％
			BAB84324	烟草	52.30％

表30

LU61965240(SEQ ID NO：58)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			CAA98160	日本百脉根	92.60％
BAA02116	豌豆	92.10％
			BAA76422	鹰嘴豆(Cicer arietinum)	90.60％
NP_193486	拟南芥	90.60％
			ABD65068	羽衣甘蓝(Brassica oleracea)	90.60％

表31

LU62294414(SEQ ID NO：60)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			NP_568121	拟南芥	81.10％
CAA98163	日本百脉根	79.70％
			NP_187602	拟南芥	73.60％
NP_001048954	水稻	71.20％
			NP_001064756	水稻	68.50％

表32

LU61723544(SEQ ID NO：62)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABE82101	蒺藜苜蓿	97.70％
BAB84324	烟草	94.90％
			CAA90080	豌豆	94.40％
BAB84326	烟草	94.40％
			BAB84323	烟草	94.40％

表33

LU61871078(SEQ ID NO：64)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			CAA66447	日本百脉根	91.50％
AAD10389	腋花矮牵牛×膨大矮牵牛	90.60％
			BAA02115	豌豆	90.50％
AAA80679	番茄	90.10％
			AAA34003	大豆	89.60％

表34

LU61569070(SEQ ID NO：66)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			CAA98160	日本百脉根	93.60％
BAA02116	豌豆	93.10％
			BAA76422	鹰嘴豆	91.60％
NP_001042202	水稻	91.10％
			CAC39050	水稻	91.10％

表35

OS34999273(SEQ ID NO：68)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			BAA02117	豌豆	97.00％
CAA98161	日本百脉根	95.60％
			CAA98162	日本百脉根	95.10％
AAB97115	大豆	92.10％
			BAA02118	豌豆	91.10％

表36

HA66779896(SEQ ID NO：70)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			CAA98160	日本百脉根	93.10％
CAA69701	皱叶烟草	92.10％
			AAA80678	番茄	92.10％
BAA76422	鹰嘴豆	91.60％
			ABD65068	羽衣甘蓝	91.10％

表37

OS32667913(SEQ ID NO：72)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABD59352	甘蔗(Saccharum officinarcum)	90.00％
ABD59353	甘蔗	89.50％
			P16976	玉蜀黍	86.10％
1707300A	玉蜀黍	85.20％
			CAA66447	日本百脉根	78.50％

表38

HA66453181(SEQ ID NO：74)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			ABK96799	马铃薯	89.20％
CAA51011	烟草	89.20％
			BAA76422	鹰嘴豆	89.20％
CAA98160	日本百脉根	89.20％
			CAA69701	皱叶烟草	88.70％

表39

HA66709897(SEQ ID NO：76)与已知GTP结合蛋白的比较

公共数据库登录号	物种	序列同一性(％)
			AAD10389	腋花矮牵牛×膨大矮牵牛	94.10％
AAA80679	番茄	93.10％
			CAA66447	日本百脉根	93.00％
BAA02115	豌豆	89.60％
			AAA34003	大豆	89.60％

实施例3

胁迫耐受性拟南芥植物

将含有小立碗藓多核苷酸的片段连入含可选择标记基因的二元载体中。得到的重组载体含有处于组成型超启动子控制下的有义方向的相应基因。按照标准条件将重组载体转化到根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)C58C1和PMP90植物中。拟南芥生态型C24植物按照标准条件生长和转化。对T1植物进行由可选择标记基因所赋予的针对选择剂的抗性筛选，并收集T1种子。

小立碗藓多核苷酸在组成型启动子的控制下在拟南芥中超量表达。在盘中对T2和/或T3种子进行由可选择标记基因所赋予的针对选择剂的抗性筛选，将阳性植物移植到土壤中，并在生长箱中生长3周。在此期间土壤湿度自始至终维持在大约土壤最大保水能力的50％。

在此期间测量植物总水分损失(蒸发蒸腾作用)。3周后，收集全部地上植物材料，65℃干燥2天并称重。地上植物干重(DW)与植物水利用之间的比值为水利用效率(WUE)。表40-43显示了超量表达小立碗藓多核苷酸的转基因植物的独立转化事件(株系)的WUE和DW。显示了来自方差分析的与野生型对照相比的株系最小二乘方均值(LSM)、标准误差和显著性值(P)。还显示了与野生型对照植物相比较的各转基因株系的WUE和DW提高百分比。

表40

超量表达EST462(SEQ ID NO：2)的拟南芥株系

表41

超量表达EST329(SEQ ID NO：4)的拟南芥株系

表42

超量表达EST373(SEQ ID NO：6)的拟南芥株系

表43

超量表达EST548(SEQ ID NO：20)的拟南芥株系

实施例4

胁迫耐受性油菜籽/卡诺拉油菜植物

利用4日龄幼苗卡诺拉油菜子叶柄作为外植体按照EP1566443进行组织培养和转化。商业栽培种Westar(Agriculture Canada)是转化所用的标准品种，但是可使用其他品种。利用含二元载体的根癌农杆菌GV3101：pMP90RK进行卡诺拉油菜转化。转化所用的标准二元载体是pSUN(WO02/00900)，但是用于植物转化的许多不同二元载体系统已有描述(例如，An，G.in Agrobacterium Protocols，Methods in Molecular Biology44卷，47-62页，Gartland KMA和MR Davey编辑Humana Press，Totowa，New Jersey)。采用的植物基因表达盒含有可选择标记基因和调控编码多核苷酸的cDNA转录的植物启动子。可利用多种可选择标记基因，包括美国专利No.5,767,366和6,225,105中公开的突变的乙酰羟酸合酶(AHAS)基因。利用适宜的启动子调控性状基因，以提供基因转录的组成型、发育型、组织型或环境型调控。

卡诺拉油菜种子在70％乙醇中表面消毒2分钟，在55℃的温自来水中孵育15分钟，然后在1.5％次氯酸钠中孵育10分钟，接着用灭菌蒸馏水漂洗3次。然后将种子置于不含激素、含Gamborg B5维生素、3％蔗糖和0.8％Oxoidagar的MS培养基上。种子在24℃下低光照(＜50μMol/m²s，16小时光照)萌发4天。从体外幼苗切下附着子叶的子叶柄外植体，并通过将子叶柄外植体的切端浸在细菌悬液中来接种农杆菌。外植体随之在包括维生素、含有3.75mg/l BAP、3％蔗糖、0.5g/l MES pH 5.2，0.5mg/lGA3、0.8％Oxoidagar的MS培养基上于24℃、16小时光照培养3天。在与农杆菌共培养3天之后，将子叶柄外植体转移到含3.75mg/l BAP、0.5mg/lGA3、0.5g/l MES pH 5.2、300mg/l特美汀和选择剂的再生培养基中，直至芽(shoot)再生。外植体一开始发育出芽，就将其转移到芽伸长培养基(A6，含全浓度MS培养基，包括维生素、2％蔗糖、0.5％Oxoidagar、100mg/l肌醇、40mg/l腺嘌呤硫酸盐、0.5g/l MES pH 5.8、0.0025mg/l BAP、0.1mg/lIBA、300mg/l特美汀和选择剂)中。

来自原代转基因植物(T0)体外和温室材料的样品均利用TaqMan探针通过qPCR进行分析，以确认T-DNA的存在并确定T-DNA的整合数。

通过自花授粉由原代转基因植物产生种子。第二代植物在温室条件下生长并自花授粉。植物利用TaqMan探针通过qPCR进行分析，以确认T-DNA的存在并确定T-DNA的整合数。在例如实施例3所述的测定中比较纯合转基因、杂合转基因和不成对(无效转基因)植物的胁迫耐受性，并对温室和田间研究的产率均进行比较。

实施例5

筛选胁迫耐受性稻植物

利用已知方法生成含有本发明多核苷酸的转基因稻植物。生成了大约15-20个独立的转化株(T0)。将原代转化株从组织培养箱中转移到温室中进行生长，并收获T1种子。保留T1子代中发生转基因存在/缺失3∶1分离的五个事件。对于这些事件中的每一个，通过可视标记筛选来选择10个含转基因(杂合及纯合)的T1幼苗以及10个缺失转基因的T1幼苗(无效合子)。将所选择的T1植物转移到温室。每株植物接受独特的条形码标记，以使表型分型数据与对应的植物明确地联系在一起。所选择的T1植物在10cm直径盆中的土壤中在如下环境设置条件下生长：光周期＝11.5h，日光强度＝30,000lux或更强，日间温度＝28℃或更高，夜间温度＝22℃，相对湿度＝60-70％。转基因植物和相应的无效合子并排生长在随机位置上。从播种期直至成熟期，使植物数次通过数码成像箱。在每个时间点，从至少6个不同的角度对每株植物采集图像(2048×1536像素，1600万色)。

第一次实验中用T1植物获得的数据在第二次实验中用T2植物验证。选择具有正确表达模式的株系进行进一步分析。通过监控标记表达对来自T1阳性植物(既有杂合子又有纯合子)的种子批次进行筛选。对于每个所选的事件，随后保留杂合种子批次进行T2评价。在各种子批次内，相等数目的阳性和阴性植物在温室中生长进行评价。

利用例如实施例3所述的测定对转基因植物提高的生长和/或产率和/或胁迫耐受性进行筛选，并对温室和田间研究的产率均进行筛选。

实施例6

胁迫耐受性大豆植物

利用共同拥有的共同未决国际申请WO 2005/121345(其内容并入本文作为参考)中所述的方法，将表1和2的多核苷酸转化到大豆中。

然后利用例如实施例3所述的测定对生成的转基因植物在限水条件下提高的生长和/或干旱、盐和/或冷耐受性进行筛选，并对温室和田间研究的产率均进行筛选。

实施例7

胁迫耐受性小麦植物

小麦的转化利用Ishida等人，1996，Nature Biotech.14745-50所述的方法进行。未成熟的胚与携带“超级二元”载体的根癌农杆菌共培养，并通过器官发生回收转基因植物。此方法提供2.5％-20％的转化效率。然后利用例如实施例3所述的测定对转基因植物在限水条件下提高的生长和/或产率和/或胁迫耐受性进行筛选，并对温室和田间研究的产率均进行筛选。

实施例8

胁迫耐受性玉米植物

在同一质粒上携带所述基因和玉蜀黍ahas基因的的农杆菌细胞在补加适当抗生素的YP培养基上生长1-3天。收集一环农杆菌细胞，悬浮于1.5ml M-LS-002培养基(LS-inf)中，并使含农杆菌细胞的试管在摇床上1,000转/分钟保持1-4小时。

在授粉后7-12天收获玉米棒[基因型J553×(HIIIA×A188)]。玉米棒在20％Clorox溶液中消毒15分钟，接着用无菌水彻底漂洗。将大小0.8-2.0mm的未成熟胚切到LS-inf溶液中的含农杆菌细胞的试管中。

通过使试管在层流室中水平室温放置30分钟进行农杆菌感染。将农杆菌感染混合物倾至含共培养培养基(M-LS-011)的平板中。在吸出液体农杆菌液之后，将胚转移到置于琼脂共培养培养基上的滤纸表面。用移液管吸去过量菌液。将胚置于共培养培养基上，盾片侧朝上，22℃暗培养2-4天。

将胚转移至不带选择的M-MS-101培养基。7-10天后，将胚转移至含0.50μM咪草烟(imazethapyr)的M-LS-401培养基，并生长4周(两次2周转移)以选择转化的胼胝体细胞。通过将抗性胼胝体转移至补加0.75μM咪草烟的M-LS-504培养基起始植物再生，并在光照条件下25-27℃生长2-3周。然后将再生的芽转移至具有M-MS-618培养基(0.5μM咪草烟)的生根箱中。将带根的小植株转移至温室小盆的盆栽混合物中，并在适应环境后随之移植到更大的盆中，并保持在温室中直至成熟。

各小植株中的转基因拷贝数利用基因组DNA的Taqman分析测定，而转基因表达利用分离自叶样品的总RNA的qRT-PCR测定。

利用诸如实施例3所述测定的测定法对这些植物中的每一株进行独特标记、采样并分析转基因拷贝数。标示出转基因阳性和阴性植物，以相似大小进行组对，一起移植到大盆中。这为转基因阳性和阴性植物提供了一致的竞争环境。大盆根据期望的水胁迫严重程度而浇水至土壤田间含水量的一定百分比。通过隔天浇水维持土壤水含量水平。生长期间测量植物生长和生理学性状，如株高、茎直径、叶翻卷、植株萎蔫、叶伸长率、叶含水状态、叶绿素含量和光合作用速率。在一段生长之后，收获植物地上部分，并测量每株植物的鲜重和干重。然后对转基因阳性和阴性植物之间的干旱耐受性表型进行比较。

利用诸如实施例3所述测定的测定法，盆用允许幼苗生长穿过但最小化水损失的盖子盖上。定期称重各盆，并加水以维持最初的水含量。在实验结束时，测量各盆的鲜重和干重，计算每株植物消耗的水，并计算每株植物的WUE。实验期间测量植物生长和生理学性状，如WUE、株高、茎直径、叶翻卷、植株萎蔫、叶伸长率、叶含水状态、叶绿素含量和光合作用速率。然后对转基因阳性和阴性植物之间的WUE表型进行比较。

利用诸如实施例3所述测定的测定法，将这些盆置于温室中具有一致环境条件的区域，并进行最佳栽培。对这些植物中的每一株进行独特标记、采样并分析转基因拷贝数。使植物在这些条件下生长直至其达到预定生长阶段。然后停水。随着胁迫强度增加，测量植物生长和生理学性状，如株高、茎直径、叶翻卷、植株萎蔫、叶伸长率、叶含水状态、叶绿素含量和光合作用速率。然后对转基因阳性和阴性植物之间的干燥耐受性表型进行比较。

在小盆中种植转化事件中分离的转基因玉米种子，以在循环干旱测定中进行测试。将这些盆置于温室中具有一致环境条件的区域，并进行最佳栽培。对这些植物中的每一株进行独特标记、采样并分析转基因拷贝数。使植物在这些条件下生长直至其达到预定生长阶段。然后以固定的时间间隔向植物重复浇水至饱和。在实验持续时间重复此浇水/干旱循环。生长期间测量植物生长和生理学性状，如株高、茎直径、叶翻卷、叶伸长率、叶含水状态、叶绿素含量和光合作用速率。实验结束时收获植物，用于测量地上部分鲜重和干重。然后对转基因阳性和阴性植物之间的循环干旱耐受性表型进行比较。

为了测试分离的转基因玉米在无雨条件下的干旱耐受性，单地点或多地点应用可控制的干旱胁迫。通过在降雨量小于10cm且最低温度比为期5月季的平均值高5℃的地点、或在由能够在不需要时缩回而提供露天田间条件的自动“防雨棚”拦截预期当季降水量的地点，应用滴灌带或喷灌来控制作物水利用率。遵循该地区的标准农事实践进行整地、种植、施肥和虫害控制。每一小块土地播种发生了单个转基因插入事件而存在分离的种子。对叶样品应用Taqman转基因拷贝数测定以区分转基因种及无效分离种对照植物。还对已经以这种方式进行了基因分型的植物就有关干旱耐受性、生长和产率的一系列表型进行记分。这些表型包括植株高度、每株植物的谷粒重量、每株植物的谷粒数量、每株植物的谷穗(ear)数量、地上干重、水汽的叶传导、叶CO₂吸收、叶的叶绿素含量、光合作用相关的叶绿素荧光参数、水利用效率、叶水势能、叶相对水含量、茎汁流速、茎水压传导性、叶温度、叶反射比(reflectance)、叶的光吸收、叶面积、开花所需时日、开花-抽丝时间间隔、谷粒饱满持续时间、渗透势能、渗透调节、根大小、叶伸长率、叶角度、叶翻卷和存活。所有测量用可商购的田间生理学仪表设备利用生产商提供的标准方法进行。个体植物用作为每个事件的重复单位。

为了测试不分离转基因玉米在无雨条件下的干旱耐受性，单地点或多地点应用可控制的干旱胁迫。通过在降雨量小于10cm且最低温度比为期5月季的平均值高5℃的地点、或在由能够在不需要时缩回而提供露天田间条件的自动“防雨棚”拦截预期当季降水量的地点，应用滴灌带或喷灌来控制作物水利用率。遵循该地区的标准农事实践进行整地、种植、施肥和虫害控制。试验田规划设计为使含不分离转基因事件的小块土地与邻近的无效分离种对照小块土地组对。无效分离种是由于孟德尔分离而不含转基因的转基因植物子代(或源于所述子代的株系)。其他重复组对的特定事件的小块土地分布在试验田周围。在组对的小块土地中就有关干旱耐受性、生长和产率的一系列表型进行记分，并以小块土地的水平进行估算。当测量技术仅能适用于个体植物时，每次在小块土地的范围内随机选择这些植物。这些表型包括植株高度、每株植物的谷粒重量、每株植物的谷粒数量、每株植物的谷穗数量、地上干重、水汽的叶传导、叶CO₂吸收、叶的叶绿素含量、光合作用相关的叶绿素荧光参数、水利用效率、叶水势能、叶相对水含量、茎汁流速、茎水压传导性、叶温度、叶反射比、叶的光吸收、叶面积、开花所需时日、开花-抽丝时间间隔、谷粒饱满持续时间、渗透势能、渗透调节、根大小、叶伸长率、叶角度、叶翻卷和存活。所有测量用可商购的田间生理学仪表设备利用生产商提供的标准方法进行。个体小块土地用作为每个事件的重复单位。

为进行转基因玉米干旱耐受性和产率的多地点测试，选择涵盖主要玉米生长区的5-20个地点。这些地点分布广泛，以基于平均温度、湿度、降水量和土壤类型提供一系列预期的作物水利用率。作物水利用率与标准农事实践并无变更。试验田规划设计为使含不分离转基因事件的小块土地与邻近的无效分离种对照小块土地组对。在组对的小块土地中就有关干旱耐受性、生长和产率的一系列表型进行记分，并以小块土地的水平进行估算。当测量技术仅能适用于个体植物时，每次在小块土地的范围内随机选择这些植物。这些表型包括植株高度、每株植物的谷粒重量、每株植物的谷粒数量、每株植物的谷穗数量、地上干重、水汽的叶传导、叶CO₂吸收、叶的叶绿素含量、光合作用相关的叶绿素荧光参数、水利用效率、叶水势能、叶相对水含量、茎汁流速、茎水压传导性、叶温度、叶反射比、叶的光吸收、叶面积、开花所需时日、开花-抽丝时间间隔、谷粒饱满持续时间、渗透势能、渗透调节、根大小、叶伸长率、叶角度、叶翻卷和存活。所有测量用可商购的田间生理学仪表设备利用生产商提供的标准方法进行。个体小块土地用作为每个事件的重复单位。

附录

来自小立碗藓的EST462 cDNA序列(SEQ ID NO：1)：

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EST 462 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：2)：

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来自小立碗藓的EST329 cDNA序列(SEQ ID NO：3)：

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EST329 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：4)：

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来自小立碗藓的EST 373c DNA序列(SEQ ID NO：5)：

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EST373 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：6)：

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来自大麦的HV62561245 cDNA序列(SEQ ID NO：7)：

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HV62561245 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：8)：

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来自芸苔的BN43173847 cDNA序列(SEQ ID NO：9)：

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BN43173847cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：10)：

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来自芸苔的BN46735603 cDNA序列(SEQ ID NO：11)：

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BN46735603 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：12)：

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来自大豆的GM52504443 cDNA序列(SEQ ID NO：13)：

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GM52504443 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：14)：

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来自大豆的GM47122590 cDNA序列(SEQ ID NO：15)：

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GM47122590 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：16)：

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此为来自大豆的GM52750153 cDNA序列(SEQ ID NO：17)：

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此cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：18)：

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来自小立碗藓的EST 548 cDNA序列(SEQ ID NO：19)：

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EST 548 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：20)：

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来自大豆的GM50181682 cDNA序列(SEQ ID NO：21)：

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GM50181682 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：22)：

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来自大麦的HV62638446 cDNA序列(SEQ ID NO：23)：

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HV62638446 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：24)：

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来自小麦的TA56528531 cDNA序列(SEQ ID NO：25)：

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TA56528531 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：26)：

maappararadydylikllligdsgvgksclllrfsdgsfttsfittigidfkirtveldgkriklqiwdtagqerfrtittayyrgamgillvyd

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来自大麦的HV62624858 cDNA序列(SEQ ID NO：27)：

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HV62624858 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：28)：

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来自亚麻子的LU61640267 cDNA序列(SEQ ID NO：29)：

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LU61640267 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：30)：

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来自亚麻子的LU61872929 cDNA序列(SEQ ID NO：31)：

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LU61872929 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：32)：

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来自亚麻子的LU61896092 cDNA序列(SEQ ID NO：33)：

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LU61896092 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：34)：

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来自亚麻子的LU61748785 cDNA序列(SEQ ID NO：35)：

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LU61748785 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：36)：

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来自稻的OS34706416 cDNA序列(SEQ ID NO：37)：

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OS34706416 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：38)：

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来自大豆的GM49750953 cDNA序列(SEQ ID NO：39)：

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GM49750953cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：40)：

mflwdwfygilaslglwqkeakilflgldnagkttllhmlkderlvqhqptqyptseelsigkikfkafdlgghqiarrvwkdyyaqv

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来自向日葵的HA66696606 cDNA序列(SEQ ID NO：41)：

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HA66696606cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：42)：

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来自向日葵的HA66783477 cDNA序列(SEQ ID NO：43)：

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tcaattcaacgatgtttttgttcgattggttctacggcatccttgcgtcactcggtttatggcagaaggaagcgaagatcttgttccttg

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HA66783477 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：44)：

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来自向日葵的HA66705690 cDNA序列(SEQ ID NO：45)：

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HA66705690 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：46)：

mnheydylfkllligdsgvgksclllrfaddsyidsyistigvdfkirtveqdgktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiiivydvtdl

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来自小麦的TA59921546 cDNA序列(SEQ ID NO：47)：

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TA59921546 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：48)：

mgivftrlfssvfgnrearilvlgldnagkttilyrlqmgevvstiptigfnvetvqynnikfqvwdlggqtsirpywrcyfpntqaiiyvv

dssdtdrlvtakeefhsileedelkgavvlvyankqdlpgalddaaiteslelhkiksrqwaifktsaikgegffeglnwlsnalksg

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来自大麦的HV62657638 cDNA序列(SEQ ID NO：49)：

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HV62657638 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：50)：

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来自芸苔属的BN43540204 cDNA序列(SEQ ID NO：51)：

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BN43540204 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：52)：

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来自芸苔属的BN45139744 cDNA序列(SEQ ID NO：53)：

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BN45139744 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：54)：

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masqpagniarpptvqirgqpvaqkngccst

来自芸苔属的BN43613585 cDNA序列(SEQ ID NO：55)：

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BN43613585 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：56)：

mgillvydvtdessfnsnfcfclsidifyfiyifalfwtcfldlvadirnwirnieqhasdnvnkilvgnkadmdeskravptskgqala

deygikffetsaktnlnveevffsiakdikqrltdtdsraepatirisqtdqaagagqatqksaccgt

来自亚麻子的LU61965240 cDNA序列(SEQ ID NO：57)：

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LU61965240 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：58)：

mnteydylfkllligdsgvgksclllrfaddsyldsyistigvdfkirtveqdgktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiivvydvtdq

esfnnvkqwlneidryasehvnkllvgnksdltsnkvvsyetgkaladelgipfmetsaknasnvedafmamsaaiktrmas

qptnnakpptvqirgepvnqksgccss

来自亚麻子的LU62294414 cDNA序列(SEQ ID NO：59)：

ccgaaattgaccccgttctgtttgtgagatctttttgatcattattagccagacagaaacggtgcattaacagttgttgagaggaaa

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The LU62294414c DNA is translated into the following amino acid sequence(SEQ IDNO：60)：

mgsssgssgydlsfkllligdssvgkssllvsfisttsaeedlaptigvdfkikqltvagkrlkltiwdtagqerfrtltssyyrnaqgiilv

ydvtrretftnlsdvwakevelyctnqdcvkmlvgnkvdkdsdrtvtreegmelakergclflecsaktrenveqcfeelaqkikd

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来自亚麻子的LU61723544 cDNA序列(SEQ ID NO：61)：

ggtacctgaagaagaaggcctttccctcttcattctgcattttcttttcctctttggcttttccattagatcttcctcttctgcttcttcctgatct

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The LU61723544 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：62)：

maappararadydylikllligdsgvgksclllrfsdgsfttsfittigidfkirtieldgkriklqiwdtagqerfrtittayyrgamgillvyd

vtdessfnnirnwirnieqhasdnvnkilvgnkadmdeskravptakgqaladeygikffetsaktnlnveevffsiardikqrla

dtdsksepqtikinqpdqaggsnqaaqksaccgs

来自亚麻子的LU61871078 cDNA序列(SEQ ID NO：63)：

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LU61871078 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：64)：

mgteydylfkllligdssvgksclllrfaddsyvdsyistigvdfkirtveldgktvklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiiivydvtd

mdsfnnvkqwlneidryandtvckllvgnkcdlvenkvvdtqtakaladelgipfletsakdsinveqafltmaaeikkkmgnq

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来自亚麻子的LU61569070 cDNA序列(SEQ ID NO：65)：

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LU61569070 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：66)：

mnseydylfkllligdsgvgksclllrfaddsyldsyistigvdfkirtveqdgktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiivvydvtd

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sqpvsgtarpptvqirgepvnqksgccss

来自稻的OS34999273 cDNA序列(SEQ ID NO：67)：

ttttcccttccgttggtgccattcgtgcagcaccggatcctctcatttctccggcgataactctcccttttccggcgaattcaccgcttcct

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OS34999273 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：68)：

mnpeyhylfkllligdsgvgksclllrfaddsyiesyistigvdfkirtveqdgktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiiivydvtde

dsfnnvkqwlseidryasdnvnkllvgnksdltanrvvsydtakefadqigipfmetsakdatnvedafmamsaaiknrmas

qpsannarpptvqirgqpvgqksgccss

来自向日葵的HA66779896 cDNA序列(SEQ ID NO：69)：

gccacctgcaacaaaatctccacaaatctttcactcaaccgatcacaactccacacacaaacaaagatgaatcccgaatacg

actatctgttcaagcttttactcattggagattcaggagttggaaaatcatgtctcctattgcgttttgctgatgattcgtacttggaaagt

tacattagcaccattggggttgactttaaaattcgcactgtggaacaagatggcaaaacaattaagcttcaaatttgggatacag

ctggacaagaacgtttcaggaccatcactagcagctactatcgtggagctcatggcattattgttgtttatgacgtgacagatcaa

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cggcaatgaacaatgctagaccgctaactgttgaaatccgaggtcaaccggtcaaccaaaagtcaggatgctgctcttcttga

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atcgccaaacttttgtcattcttttcgatgaattcggggaccttttgtacaaagtaggataagactgttgaatgtgtattatgttatactgt

tttgctgtttgcatttcctttacattttaatgacatttcaagtgtgt

HA66779896 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：70)：

mnpeydylfkllligdsgvgksclllrfaddsylesyistigvdfkirtveqdgktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiivvydvtd

qesfnnvkqwlseidryasenvnkllvgnkcdltsqkavsyetgkafadeigipfletsaknstnveeafmamtaeiknrmas

qpamnnarpltveirgqpvnqksgccss

来自稻的OS32667913 cDNA序列(SEQ ID NO：71)：

ctcaccaccttcttgttcctggagaacctcctctccagctctgtccaagcatcaattctctttcttttgcttcctgctgatacctttgatcctg

agcagaagaagctgcagaagtgggttaaggcaggaagagccatgaacaacgaatttgattacctgttcaagctgctcctcat

cggcgactcctcggtcggcaagtcatgcttcctcctccgattcgcggacgactcctacgtcgacagctacatcagcacgatcgg

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gattcagaaccatcaccagtagctactaccggggagctcatgggataattatcgtctatgacattacggatatggagagcttcaa

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ttgagcactttagttactgcaaggtgtcgccacatctgttgaaaatcgagtcaagaacctaatttcctgtctttgatgattctctaataa

acattgcatctagaaagttgtaccatatttaatagatacatgtagtttccagtctgaaaggtcg

OS32667913 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：72)：

mnnefdylfkllligdssvgkscfllrfaddsyvdsyistigvdfkirtiemdgktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiiivyditdm

esfnnvkewmseidkyandsvckllvgnkcdlaesrvvetavaqayadeigipfletsakdsinveeaflamcaaikkqksg

sqaalerkasnlvqmkgqpiqqqqqpqkssccss

来自向日葵的HA66453181 cDNA序列(SEQ ID NO：73)：

tgtcccccaattctctctctctctctctctctcatcggagcttcaccaccgccggtgatccacaacattcgctatatacctttctccgatc

actatcaacagccatgactcctgagtatgactacctgttcaagcttttgctcattggagattcgggtgtaggaaagtcatgtctactt

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ctttttactttctttgtttcagattgtttgcattgtataaaattcaagaattcttttt

HA66453181 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：74)：

mtpeydylfkllligdsgvgksclllrfaddsyldsyistigvdfkirtveqdakviklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiivvydvtd

qesfnnvkqwlseidryasenvnkilvgnkcdlvankvvstetakafadeigipfletsakdatnveqafmamtasikdrmas

qpnlntskpptvnirgqpvsqnsgccs

来自向日葵的HA66709897 cDNA序列(SEQ ID NO：75)：

agaaaccaatcatccaccgacaccgtcacaatgagcaacgaatacgattatctcttcaaacttttactcatcggtgactcctccgt

cggaaaatcatgccttcttctccgatttgctgatgattcttatgtggatagttacataagcacaattggagttgactttaaaattagga

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gttactacagaggagcacatggaataattatcgtgtatgatgtgactgagatggagagcttcaacaatgtgaagcaatggctga

gtgaaatcgacagatatgcaaatgaatcagtctgcaagcttcttgttggaaacaaatgtgatctagttgagaacaaggttgttga

cacacaaacagctaaggcatttgcagatgagctcgggatccctttcctcgagaccagtgcaaaagactccgtaaacgtggaa

caggctttcttgacaatggctgcagagataaagaaaaaaatgggtaaccagccaacgggcgacaagagcatagttcaaatc

aaagggcagccgattgagcagaagagcaattgttgtggttaatactgttaaggtccgcaggacaactggtaaaaatgtttgtaa

aatgttgttggcttttaattagcttcatggacttttttgtatcatctgatttcaactacgggtaattttctgcatcaaattactttgaaaggtg

gcaaaatgagcatggttgtgtgacgggtcacaacaggttaaaaaggtcgggccgccgacttgaaacgcttttgatctagttttcg

ttctattacactttgaaatactatcccaataattttttttggattaattagattataagcttacattgctcgacgttggtttatatc

HA66709897 cDNA翻译为如下氨基酸序列(SEQ ID NO：76)：

msneydylfkllligdssvgksclllrfaddsyvdsyistigvdfkirtveqdrktiklqiwdtagqerfrtitssyyrgahgiiivydvte

mesfnnvkqwlseidryanesvckllvgnkcdlvenkvvdtqtakafadelgipfletsakdsvnveqafltmaaeikkkmgn

qptgdksivqikgqpieqksnccg

EST443氨基酸序列(SEQ ID NO：77)：

mvmrkvgkyevgrtigegtfakvkfaqntetgesvamkvldrqtvlkhkmveqirreisimklvrhpnvvrlhevlasrckiyiile

fvtggelfdkivhqgrlnendsrkyfqqlmdgvdychskgvshrdlkpenllldsldnlkisdfglsalpqqvredgllhttcgtpny

vapevlndkgydgavadiwscgvilfvlmagflpfdeadlntlyskireadftcppwfssgaktlitnildpnpltrirmrgirddewf

kknyvpvrmyddedinlddvetafddskeqfvkeqrevkdvgpslmnafelislsqglnlsalfdrrqdhvkrqtrftskkpardii

nrmetaaksmgfgvgtrnykmrleaasecrisqhlavaievyevapslfmievrkaagdtleyhkfyksfctrlkdiiwttavdkd

evktltpsvvknk

ABJ91230氨基酸序列(SEQ ID NO：78)：

msssrsggsgsrtrvgryelgrtlgegtfakvkfarnvetgenvaikildkekvlkhkmigqikreistmklirhpnvvrmyevma

sktkiyivlefvtggelfdkiaskgrlkedearkyfqqlinavdychsrgvyhrdlkpenllldasgflkvsdfglsalpqqvredgllht

tcgtpnyvapevinnkgydgakadlwscgvilfvlmagylpfeesnlmalykkifkadftcppwfsssakklikrildpnpstritis

elienewfkkgykpptfekanvslddvdsifnesmdsqnlvverreegfigpmapvtmnafelistsqglnlsslfekqmglvkr

etrftskhsaseiiskieaaaaplgfdvkknnfkmklqgekdgrkgrlsvstevfevapslymvevrksdgdtlefhkfyknlstgl

kdivwktideeeeeeaatng

ABJ91231氨基酸序列(SEQ ID NO：79)：

msssrsggggggggggsgsktrvgryelgrtlgegnfakvkfarnvetkenvaikildkenvlkhkmigqikreistmklirhpn

vvrmyevmasktkiyivlqfvtggelfdkiaskgrlkedearkyfqqlicavdychsrgvyhrdlkpenllmdangilkvsdfglsa

lpqqvredgllhttcgtpnyvapevinnkgydgakadlwscgvilfvlmagylpfeeanlmalykkifkadftcppwfsssakkli

krildpnpstritiaelienewfkkgykppafeqanvslddvnsifnesvdsrnlvverreegfigpmapvtmnafelistsqglnls

slfekqmglvkresrftskhsaseiiskieaaaaplgfdvkknnfkmklqgdkdgrkgrlsvateifevapslymvevrksggdtl

efhkfyknlstglkdivwktideekeeeeaatng

NP_001058901氨基酸序列(SEQ ID NO：80)：

msvsggrtrvgryelgrtlgegtfakvkfarnadsgenvaikildkdkvlkhkmiaqikreistmklirhpnvirmhevmasktkiy

ivmelvtggelfdkiasrgrlkeddarkyfqqlinavdychsrgvyhrdlkpenllldasgtlkvsdfglsalsqqvredgllhttcgtp

nyvapevinnkgydgakadlwscgvilfvlmagylpfedsnlmslykkifkadfscpswfstsakklikkildpnpst ritiaelinn

ewfkkgyqpprfetadvnlddinsifnesgdqtqlvverreerpsvmnafelistsqglnlgtlfekqsqgsvkretrfasrlpaneil

skieaaagpmgfnvqkrnyklklqgenpgrkgqlaiatevfevtpslymvelrksngdtlefhkfyhnisnglkdvmwkpessi

iagdeiqhrrsp

NP_171622氨基酸序列(SEQ ID NO：81)：

msgsrrkatpasrtrvgnyemgrtlgegsfakvkyakntvtgdqaaikildrekvfrhkmveqlkreistmklikhpnvveiiev

masktkiyivlelvnggelfdkiaqqgrlkedearryfqqlinavdychsrgvyhrdlkpenlildangvlkvsdfglsafsrqvred

gllhtacgtpnyvapevlsdkgydgaaadvwscgvilfvlmagylpfdepnlmtlykrickaefscppwfsqgakrvikrilepn

pitrisiaelledewfkkgykppsfdqddeditiddvdaafsnskeclvtekkekpvsmnafelissssefslenlfekqaqlvkke

trftsqrsaseimskmeetakplgfnvrkdnykikmkgdksgrkgqlsvatevfevapslhvvelrktggdtlefhkfyknfssgl

kdvvwntdaaaeeqkq

ABJ91219氨基酸序列(SEQ ID NO：82)：

msvkvpaartrvgkyelgktigegsfakvkvaknvqtgdvvaikildrdqvlrhkmveqlkreistmklikhpnvikifevmaskt

kiyiviefvdggelfdkiakhgrlkedearryfqqlikavdychsrgvfhrdlkpenllldsrgvlkvsdfglsalsqqlrgdgllhtacg

tpnyvapevlrdqgydgtasdvwscgvilyvlmagflpfsesslvvlyrkicradftfpswfssgakklikrildpkpltritvseiled

ewfkkgykppqfeqeedvniddvdavfndskehlvterkvkpvsinafelisktqgfsldnlfgkqagvvkrethiashspanei

msrieeaakplgfnvdkrnykmklkgdksgrkgqlsvatevfevapslhmvelrkiggdtlefhkfyksfssglkdvvwksdqti

eglr

BAD12177氨基酸序列(SEQ ID NO：83)：

maestreenvymaklaeqaeryeemvefmekvaktvdveeltveernllsvayknvigarraswriissieqkeesrgnedh

vssikeyrgkieaelskicdgilnlleshlipvastaeskvfylkmkgdyhrylaefktgaerkeaaentllayksaqdialaelapt

hpirlglalnfsvfyyeilnssdracnlakqafddaiaeldtlgeesykdstlimqllrdnltlwtsdstddagdeikeaskresgdge

q

AAY67798氨基酸序列(SEQ ID NO：84)：

mlptessreenvymaklaeqaeryeemvefmekvaktvdveeltveernllsvayknvigarraswriissieqkeesrgne

dhvsiikeyrgkieaelskicdgilslleshlipsassaeskvfylkmkgdyhrylaefktaaerkeaaestllayksaqdialadla

pthpirlglalnfsvfyyeilnspdracnlakqafdeaiseldtlgeesykdstlimqllrdnltlwtsditdeagdeikdaskresgeg

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BAD12176氨基酸序列(SEQ ID NO：85)：

maestreenvymaklaeqaeryeemvefmekvaktvdveeltveernllsvayknvigarraswriissieqkeesrgnedh

vssikeyrgkieaelskicdgilnlleshllpvastaeskvfylkmkgdyhrylaefktgaerkeaaentllayksaqdialaelapt

hpirlglalnfsvfyyeilnssdracnlakqafddaiaeldtlgeesykdstlimqllrdnltlwtsdttddagdeikeaskresgege

q

AAC04811氨基酸序列(SEQ ID NO：86)：

mspaepsreenvymaklaeqaeryeemvefmekvartvdteeltveernllsvayknvigarraswriissieqkeesrgne

dhvalikdyrgkieaelskicdgilklldshlvpsstaaeskvfylkmkgdyhrylaefksgaerkeaaestllayksaqdialaela

pthpirlglalnfsvfyyeilnspdracnlakqafdeaiseldtlgeesykdstlimqllrdnltlwtsdineeagdeikeaskagegq

Q9SP07氨基酸序列(SEQ ID NO：87)：

mspaepsreenvymaklaeqaeryeemvefmekvartvdteeltveernllsvayknvigarraswriissieqkeesrgne

dhvalikdyrgkieaelskicdgilklldshlvpsstapeskvfylkmkgdyhrylaefksgaerkeaaestllayksaqdialaela

pthpirlglalnfsvfyyeilnspdracnlakqafdeaiseldtlgeesykdstlimqllrdnltlwtsdineeagdeikeaskavegq

EST217氨基酸序列(SEQ ID NO：88)：

Mstekeresyvymaklaeqaerydemvesmkkvakldveltveernllsvgyknvigarraswrimssieqkeeskgneq

nvkrikdyrhkveeelskicndlisiidghlipssstgestvfyykmkgdyyrylaefktgnerkeaadqslkayqaasstavtdla

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Claims (12)

1.用含有编码CBL相互作用蛋白激酶的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物，所述蛋白激酶具有如SEQ ID NO：2所示的序列。

2.用含有编码14-3-3蛋白的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物，所述14-3-3蛋白具有如SEQ ID NO：4所示的序列。

3.用含有编码RING H2锌指蛋白或RING H2锌指蛋白锌指C3HC4型结构域的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物。

4.权利要求3的转基因植物，其中RING H2锌指蛋白包含选自以下的序列：SEQ ID NO：6氨基酸1-381；SEQ ID NO：8氨基酸1-199；SEQ IDNO：10氨基酸1-268；SEQ ID NO：12氨基酸1-164；SEQ ID NO：14氨基酸1-320；SEQ ID NO：16氨基酸1-219和SEQ ID NO：18氨基酸1-177。

5.权利要求3的转基因植物，其中锌指C3HC4型结构域选自：SEQ IDNO：6氨基酸88-129；SEQ ID NO：8氨基酸98-139；SEQ ID NO：10氨基酸121-162；SEQ ID NO：12氨基酸123-164；SEQ ID NO：14氨基酸84-125；SEQ ID NO：16氨基酸117-158；SEQ ID NO：18氨基酸80-121。更优选此实施方案的转基因植物含有编码RING H2锌指蛋白的多核苷酸，所述RING H2锌指蛋白具有的序列包含SEQ ID NO：6氨基酸1-381；SEQ IDNO：8氨基酸1-199；SEQ ID NO：10氨基酸1-268；SEQ ID NO：12氨基酸1-278；SEQ ID NO：14氨基酸1-320；SEQ ID NO：16氨基酸1-219；SEQ ID NO：18氨基酸1-177。

6.用含有编码GTP结合蛋白或GTP结合蛋白Ras家族结构域的分离的多核苷酸的表达盒转化的转基因植物。

7.权利要求6的转基因植物，其中GTP结合蛋白是选自以下的GTP结合蛋白：其具有的序列包含SEQ ID NO：20氨基酸1-216；SEQ ID NO：22氨基酸1-184；SEQ ID NO：24氨基酸1-191；SEQ ID NO：26氨基酸1-214；SEQ ID NO：28氨基酸1-182；SEQ ID NO：30氨基酸1-181；SEQID NO：32氨基酸1-193；SEQ ID NO：34氨基酸1-183；SEQ ID NO：36氨基酸1-193；SEQ ID NO：38氨基酸1-193；SEQ ID NO：40氨基酸1-193；SEQ ID NO：42氨基酸1-181；SEQ ID NO：44氨基酸1-193；SEQ ID NO：46氨基酸1-204；SEQ ID NO：48氨基酸1-182；SEQ ID NO：50氨基酸1-214；SEQ ID NO：52氨基酸1-206；SEQ ID NO：54氨基酸1-204；SEQID NO：56氨基酸1-158；SEQ ID NO：58氨基酸1-202；SEQ ID NO：60氨基酸1-212；SEQ ID NO：62氨基酸1-216；SEQ ID NO：64氨基酸1-201；SEQ ID NO：66氨基酸1-203；SEQ ID NO：68氨基酸1-203；SEQ ID NO：70氨基酸1-203；SEQ ID NO：72氨基酸1-209；SEQ ID NO：74氨基酸1-202；和SEQ ID NO：76氨基酸1-199。

8.权利要求6的转基因植物，其中Ras家族结构域是选自以下的结构域：其具有的序列包含SEQ ID NO：20氨基酸17-179；SEQ ID NO：22氨基酸21-182；SEQ ID NO：24氨基酸19-179；SEQ ID NO：26氨基酸17-179；SEQ ID NO：28氨基酸19-179；SEQ ID NO：30氨基酸19-179；SEQ ID NO：32氨基酸22-193；SEQ ID NO：34氨基酸19-179；SEQ ID NO：36氨基酸22-193；SEQ ID NO：38氨基酸22-193；SEQ ID NO：40氨基酸22-193；SEQ ID NO：42氨基酸19-179；SEQ ID NO：44氨基酸22-193；SEQ ID NO：46氨基酸10-171；SEQ ID NO：48氨基酸19-179；SEQ ID NO：50氨基酸17-179；SEQ ID NO：52氨基酸10-171；SEQ ID NO：54氨基酸11-172；SEQ ID NO：56氨基酸1-137；SEQ ID NO：58氨基酸10-171；SEQ ID NO：60氨基酸15-179；SEQ ID NO：62氨基酸17-195；SEQ ID NO：64氨基酸10-171；SEQ ID NO：66氨基酸10-171；SEQ ID NO：68氨基酸10-171；SEQ ID NO：70氨基酸10-171；SEQ ID NO：72氨基酸10-171；SEQ ID NO74氨基酸10-171；和SEQ ID NO：76氨基酸10-171。

9.分离的多核苷酸，其具有选自表1所示多核苷酸序列的序列。

10.分离的多肽，其具有选自表1所示多肽序列的序列。

11.产生含有至少一种表1所列多核苷酸的转基因植物的方法，其中多核苷酸在植物中的表达导致与植物野生型品种相比，植物在正常或限水条件下生长和/或产率增加，和/或环境胁迫耐受性增加，所述方法包括步骤：

(a)向植物细胞中引入含有至少一种表1所列多核苷酸的表达载体，和

(b)从所述植物细胞生成表达所述多核苷酸的转基因植物，

其中所述多核苷酸在转基因植物中的表达导致与植物野生型品种相比，所述植物在正常或限水条件下生长和/或产率增加，和/或环境胁迫耐受性增加。

12.增加植物在正常或限水条件下的生长和/或产率和/或增加植物环境胁迫耐受性的方法，其包括增加植物中至少一种表1所列多核苷酸的表达的步骤。

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