DE69307320T2

DE69307320T2 - Pollen spezifische polygalacturonase gen aus mais

Info

Publication number: DE69307320T2
Application number: DE69307320T
Authority: DE
Inventors: Rebecca Allen; David Lonsdale
Original assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Current assignee: Pioneer Hi Bred International Inc
Priority date: 1992-07-09
Filing date: 1993-07-01
Publication date: 1997-08-07
Anticipated expiration: 2013-07-02
Also published as: EP0651814B1; CA2139661C; US5412085A; DE69307320D1; WO1994001572A2; AU4769693A; MX9304114A; BR9306689A; JPH08501684A; US5545546A; NZ255026A; DK0651814T3; AU669384B2; ATE147434T1; GR3023015T3; EP0651814A1; ES2099968T3; WO1994001572A3

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte, gereinigte DNA-Sequen zen, die als Promotoren in eukaryontischen Zellen wirken können. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung isolierte, gereinigte DNA-Sequenzen aus Mais, die als Pollen-spezifische Promotoren wirken und eine Rolle bei der Expression von Genen in Pollen spielen. Die vorliegende Erfindung ist auch auf ein Verfahren abgestellt, mit dem man einem Gen, das normalerweise in Pollen nicht exprimiert wird, die Fähigkeit verleiht, in Pollen-spezifischer Weise exprimiert zu werden.

Hintergrund der Erfindung

Die männliche Gametogenese in Mais wurde biochemisch und zytologisch gut charakterisiert, während zur Zeit die Kenntnisse über die molekularen Vorgänge, die diesen Schlüsselvorgang im Angiosperma-Lebenszyklus kontrollieren, minimal sind. Die komplexe Differenzierung einer Maispollen- Mutterzelle zum hochspezialisierten dreikernigen Pollenkorn läßt darauf schließen, daß die männliche Gametogenese die sequentielle Erzeugung von zahlreichen Genprodukten beinhaltet. Jedoch wurden nur einige Gene, die bei der männlichen Gametogenese von blühenden Pflanzen beteiligt sind, isoliert.
Hinweise auf die sequentielle Expression von Genen im Staubbeutel ergeben sich aus der Identifizierung von zwei Klassen von Transkripten, die im Verlauf der männlichen Gametogenese exprimiert werden (Mascarenhas, 1990). Die "frühen" Gene werden post-meiotisch exprimiert, wobei ihre Konzentrationen steigen, bevor sie bei der Reifung der Pollenkörner absinken. Die "späten" Gene werden nach der Mikrosporen-Mitose angeschaltet und erreichen ein Maximum im reifen Pollen. Es wurde festgestellt (Willing et al., 1988), daß etwa 20 000 Gene in Maispollen exprimiert werden und möglicherweise bis zu 10% Pollen-spezifisch sind (Stinson et al., 1987). Die einzigen aus Mais geklonten, Pollen-spezifischen Gene, über die berichtet wird, sind Zm13 (Hanson et al., 1989) und Zm58 (Mascarenhas, 1990). Die Expression dieser Gene kann erstmals im Anschluß an die Mikrosporen-Mitose nachgewiesen werden. In reifen Pollen erreichen sie ein Maximum. Zmc13 zeigt eine Homologie in seiner vorhergesagten Aminosäuresequenz mit Kunitz-Trypsin-Inhibitor-Proteinen und auch mit dem Tomaten-Staubbeutel-Expressionsgen LAT52 (Hanson et al., 1989). Zm58 zeigt eine Homologie in seiner vorhergesagten Aminosäuresequenz mit Pektat-Lyasen (Mascarenhas, 1990). Es wird angenommen, daß die Produkte von Genen in diesem Fall eine Rolle bei der Pollenentwicklung und/oder beim Pollenschlauch-Wachstum spielen, während es bei Produkten der "frühen" Gene wahrscheinlicher ist, daß sie an der Mikrosporen-Entwicklung beteiligt sind.
Sequenzvergleiche und Mutagenese-Experimente lassen auf bestimmte DNA-Sequenzmotive bei der Kontrolle der Pollen-Expression der LAT-Gene der Tomate schließen (Twell et al., 1991). Sequenzvergleiche allein wurden für die mutmaßliche Identifizierung einer Region, die bei einer Staubbeutel-spezifischen Expression von Petunien beteiligt ist, herangezogen (van Tunen et al., 1989).
Derzeit ist wenig bekannt über mögliche, cis-wirkende Sequenzen im Mais-Genom, die für die gewebespezifische Expression von für die Pollenentwicklung speziellen Funktionen verantwortlich sein können. Jedoch besitzt das Mais-Klon Zm13 mehrere Homologieregionen mit den vorgeschlagenen Pollen-Boxen, die in Tomaten-LAT-Genen identifiziert worden sind.
Rogers et al. (1991) beschreiben die Isolierung des cDNA-Klons 3C12 (an seinem 5'-Ende unvollständig) aus Mais, der eine Homologie in seiner vorhergesagten Aminosäuresequenz mit Polygalacturonasen (PG) sowohl aus eukaryontischen als auch aus prokaryontischen Spezies zeigt, einschließlich mit einer Pollen-exprimierten PG aus Oenothera organensis (Brown und Crouch, 1990). Polygalacturonase wurde in Pollen von Mais und anderen einkeimblättrigen Pflanzenspezies nachgewiesen (Pressey und Reger, 1939). Es ist möglich, daß die Funktion von Polygalacturonase im Pollenkorn im Wachstum des Pollenschlauchs in der Seide (Narbenf äden von blühendem Mais) nach unten besteht, indem Pektin hydrolysiert wird und Komponenten bereitgestellt werden, die als Vorläufer der Pollenschlauch-Zellwand verwendet werden können, oder Polygalacturonase kann am Abbau von zellulärem Material innerhalb der Seide beteiligt sein, um ein Eindringen in den Schlauch zu ermöglichen. Allen und Lonsdale (zur Veröffentlichung eingereicht) beschrieben auch die Isolierung von 4 genomischen PG-Klonen unter Verwendung des 5'-Endes des Maisklons 3012 als Sonde. Eine Analyse der Frequenz von drei der PG-genomischen Klone läßt darauf schließen, daß Polygalacturonasen Mitglieder einer Multigen-Familie sind (Allen und Lonsdale, zur Veröffentlichung eingereicht). Das aus Tomaten isolierte und bei der Fruchtreifung beteiligte Polygalacturonase-Gen (Grierson et al., 1986) ist im Tomaten-Genom in einer einzigen Kopie vorhanden. Brown und Crouch (1990) isolierten mindestens sechs besondere cDNA Klone mit Homologie zu Polygalacturonase aus einer Pollen-cDNA-Bibliothek von Oenothera organensis, was darauf schließen läßt, daß mehrfache PG-Gene im Pollen dieser Spezies exprimiert werden.
Von den 2000 möglichen Pollen-spezifischen Genen von Mais wurden nur zwei charakterisiert. Das US-Patent 5 086 169 ('169) beschreibt die Nucleotidsequenz eines isolierten Pollen-spezifischen Promotors mit der Bezeichnung Zm13 aus einem nicht-identifizierten, in Mais exprimierten Gen. Die Pollen-spezifische Promotorsequenz besteht aus 1315 Basenpaaren stromaufwärts von einer DNA-Region, die mit nur in Pollen gefundener mRNA hybridisiert. Es handelt sich um den gleichen Pollen-spezifischen Promotor, wie er von Hanson et al. (1989) beschrieben wurde.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, eine DNA-Sequenz zu isolieren und zu charakterisieren, die als Pollen-spezifischer Promotor wirken kann. Insbesondere ist es eine Aufgabe der Erfindung, eine Pollenspezifische Promotorregion aus einem Pollen-spezifischen Polygalacturonase-Gen zu isolieren und zu charakterisieren.

Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte, gereinigte DNA- Sequenz aus der Promotorregion eines Pollen-spezifischen Gens der Mais- Inzuchtlinie W22. Die isolierte, gereinigte DNA-Sequenz besteht im wesentlichen aus der in Fig. 3 dargestellten Sequenz. Die Erfindung betrifft ferner eine isolierte, gereinigte DNA-Sequenz, die der Pollen-spezifischen Promotorregion von Polygalacturonase entspricht. Ferner betrifft die Erfindung eine isolierte, gereinigte DNA-Sequenz aus der Promotorregion eines Pollen-spezifischen Gens der Mais-Inzuchtlinie W22 gemäß der Darstellung in Fig. 3 (SEQ ID NR: 1), wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:
a) ca. 1 bis ca. 80 Basen stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 2);
b) ca. 1 bis ca. 347 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 3);
c) ca. 1 bis ca. 377 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 4);
d) ca. 1 bis ca. 464 Basenpaaren der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 5);
e) ca. 1 bis ca. 595 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 6);
f) ca. 1 bis ca. 1579 Basenpaaren der DNA stromaufwärts vom 3'- Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 7) sowie
g) ca. 1 bis ca. 2687 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 8).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Pollen-spezifisches chimärisches Gen, enthaltend ein Gen, bei dem der Wildtyp-Promotor des Gens durch eine DNA-Sequenz ersetzt ist, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a) ca. 1 bis ca. 80 Basen stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 2);
b) ca. 1 bis ca. 347 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 3);
c) ca. 1 bis ca. 377 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 4);
d) ca. 1 bis ca. 464 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 5);
e) ca. 1 bis ca. 595 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 6);
f) ca. 1 bis ca. 1579 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 7) sowie
g) ca. 1 bis ca. 2687 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 8).
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Pollen-spezifisches, chimärisches Gen, das ferner einen Transfervektor enthält.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Übertragung einer Pollen-spezifischen Expression auf ein Gen, wobei das Verfahren folgendes umfaßt:
a) Ersatz einer Wildtyp-Promotor-Region eines Gens durch eine Pollen-spezifische Promotorregion, die im wesentlichen aus der in Figur 3 dargestellten Sequenz besteht, wodurch ein Pollen-spezifisches chimärisches Gen erzeugt wird;
b) Einbau des Pollen-spezifischen chimärischen Gens in einen Transfervektor;
c) Einbau des das Pollen-spezifische chimärische Gen enthaltenden Transfervektors in einen Pollen, der zur Assimilation und Expression des chimärischen Gens befähigt ist,
sowie
d) Nachweis der Expression des chimärischen Gens in dem Pollen.
Ferner betrifft die Erfindung ein Verfahren gemäß den vorstehenden Angaben, wobei die Pollen-spezifische Promotorregion zur Übertragung der Pollen-spezifischen Expression auf ein Gen aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a) ca. 1 bis ca. 80 Basen stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 2);
b) ca. 1 bis ca. 347 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 3);
c) ca. 1 bis ca. 377 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 4);
d) ca. 1 bis ca. 464 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 5);
e) ca. 1 bis ca. 595 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 6);
f) ca. 1 bis ca. 1579 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 7) sowie
g) ca. 1 bis ca. 2687 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 8).
Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft auch die Einführung eines erfindungsgemäßen chimärischen Gens in Tabakpollen. Ferner betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Einführung des erfindungsgemäßen chimänschen Gens, wobei es sich bei dem Gen um β-Glucuronidase handelt. Ferner betrifft das erfindungsgemäße Verfahren die Einführung des chimärischen Gens in Pollen und Pflanzen durch Mikroprojektilbombardement.
Die Erfindung betrifft auch einen transformierten Pollen, der eine DNA-Sequenz enthält, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a) ca. 1 bis ca. 80 Basen stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 2);
b) ca. 1 bis ca. 347 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 3);
c) ca. 1 bis ca. 377 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 4);
d) ca. 1 bis ca. 464 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 5);
e) ca. 1 bis ca. 595 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 6);
f) ca. 1 bis ca. 1579 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 7) sowie
g) ca. 1 bis ca. 2687 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 8).
Die Erfindung betrifft auch Tabakpollen, der mit einer DNA-Sequenz transformiert ist, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist:
a) ca. 1 bis ca. 80 Basen stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 2);
b) ca. 1 bis ca. 347 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 3);
c) ca. 1 bis ca. 377 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 4);
d) ca. 1 bis ca. 464 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 5);
e) ca. 1 bis ca. 595 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 6);
f) ca. 1 bis ca. 1579 Basenpaare der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 7) sowie
g) ca. 1 bis ca. 2687 Basenpaare stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID NR: 8).

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1

Northern-Blot von RNA aus verschiedenen Maisgeweben. 2 µg poly A&spplus;- RNA aus 1 Pollen; 2 emergenten Narbenfäden; 3 emergierenden Narbenfäden; 4 prä-emergenten Narbenfäden; 5 Keimblattscheide; 6 Blatt; 7 Wurzel; 8 Kolben; 9 Seide wurden einer Sondenbehandlung mit dem cDNA-Klon 3012 unterzogen.

Fig. 2

In situ-Hybridisierung der 3C12-cDNA mit Schnitten von Mais-Staubbeuteln und -Blüten nach Sondenbehandlung mit antisense- (i) und sense- Sonden (ii). (A) Schnitt durch ein Mais-Ährchen mit Staubbeuteln im prämeiotischen Stadium (PM) und im meiotischen Stadium (M) . (B) Schnitt durch einen Mais-Staubbeutel bei der ersten Polleh-Mitose. (0) Schnitt durch einen Mais-Staubbeutel unmittelbar vor dem Platzen.

Fig. 3

(A) Nucleotidsequenz von stromaufwärtigen 2,87kbp von W 2247 (SEQ ID NR: 1). Der ATG-Start und die mutmaßliche 'TATA'-Box sind unterstrichen. Die Homologien zum PB-Kernmotiv und zur LAT 56/59-Box sind mit einem darüberliegenden Strich versehen. Die Transkriptionsstartstelle ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die angegebenen Ziffern stellen die Positionen in bezug zur Transkriptionsstartstelle dar.
(B) Homologie zwischen dem stromaufwärtigen Bereich von Mais- (SEQ ID NR: 10) und Tabak- (SEQ ID NR: 9) -PG-Genen.

Fig. 4

Primererweiterung unter Verwendung des Primers (SEQ ID NR: 11) 'GTTGCCTGGGGACTAGG' an (1) poly A&spplus;-RNA aus Pollen, (2) gesamter Pollen- RNA, (3) poly A&spplus;-RNA aus dem Kolben und (4) tRNA.
Die Sequenzleiter wurde unter Verwendung des gleichen Primers an W2247 erhalten. Der Stern bezeichnet den Haupttranskriptionsstart und der Punkt ein untergeordnetes Produkt. SEQ ID NR: 12 ist in dieser Figur dargestellt.

Fig. 5

Southern-Blot von genomischer DNA aus Mais, der mit Ncoi und BamHI verdau und einer Sondenbehandlung mit einer 1,3kbp-NcoI-Sonde aus dem Klon B7317 unterzogen worden ist. Bei den Kopienzahl-Standards handelte es sich um einen linearisierten 3,3kbp-Subklon von W2247.

Fig. 6

Homologien im stromaufwärtigen Bereich von W2247 mit dem PB-Kernmotiv und der LAT 56/59-Box. In dieser Figur sind SEQ ID NR: 13-19 dargestellt.

Fig. 7

Translationale Fusionen der stromaufwärtigen Region von W2247 mit der β-Glucuronidase-Kodierungs region.

Fig.8

5'-Deletionsderivate von p47.427.

Fig. 9

Relative Promotoraktivitäten von p47.427 voller Länge (SEQ ID NR: 8) und von 5'-Deletionsderivaten in einem vorübergehenden Testsystem. Drei Wiederholungsbombardements wurden für jedes getestete Plasmid durchgeführt. Die Ergebnisse sind als Verhältnis von GUS zur Luciferase-Aktivität angegeben. Die Größen der stromaufwärtigen Region 5' zum Transkriptionsstart sind dargestellt.

Fig. 10

Gewebe von Mais und Tabak wurden mit transkriptionalen und translationalen Fusionen und mit den Deletionsderivaten bombardiert. Nach Färben mit X-Gluc wurde die Aktivität als Vorliegen oder Fehlen von blauen Flecken angegeben. NT bedeutet nicht getestet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Materialien und Methoden

RNA-Isolierung und Northern-Analyse

Gewebe wurden aus Gewächshauspflanzen gewonnen, rasch in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -70ºC gelagert. Keimblattscheiden und Wurzeln wurden durch 4- bis 5-tägiges Keimen von Körnern im Dunkeln bei 22ºC gewonnen, wonach sich die vorstehend beschriebene Einfrierbehandlung anschloß. Poly A&spplus;-RNA wurde gemäß dem Verfahren von Baulcombe und Buffard (1983) isoliert. Eine Northern-Übertragung aus Formaldehyd enthaltenden Gelen wurde gemäß Maniatis et al. (1982) auf Genescreen-plus-Membranen (Dupont Wilmington&sub1; Delaware) durchgeführt und mit einer willkürlich vorbereiteten Sonde (Feinberg und Vogelstein, 1987) des cDNA-Klons 3012 (Rogers et al., 1991) einer Sondenbehandlung unterworfen. Filter wurden in einer Lösung von 50% Formamid; 5xSSC (20x SSC 3M Na&sub2;-citrat 2H&sub2;O, pH-Wert 7,0; 10x Denhardt-Lösung (Denhardt-Lösung = 20 giliter Ficoll 400, 20 g/Liter Polyvinylpyrrolidon, 10 g Rinderserumalbumin [Fraktion V]); 100 µg/ml Heringsperma-DNA bei 42ºC und in 0,1xSSC gewaschen; 0,1% SDS bei 6500 hybridisiert.
Southern-Analyse
Genomische DNA wurde gemäß dem Verfahren von Dhillon et al., (1980) isoliert und mit Restriktionsendonucleasen verdaut, durch Elektrophorese aufgetrennt und durch das alkalische Übertragungsverfahren von Rigaud et al. (1987) auf eine Nylon-Membran übertragen. Die DNA wurde durch UV-Bestrahlung mit der Membran vernetzt. Die Filter wurden mit willkürlich vorbereiteten ³²P-markierten DNA-Fragmenten einer Sondenbehandlung unterworfen (Feinberg und Vogelstein, 1987), wobei eine Hybridisierung bei 65ºC in einer Lösung von 5xSSC, 5x Denhardt-Lösung, 0,1% SDS und 100 µg/ml einer Scherbehandlung und Denaturierung unterworfenen Heringsperma- DNA durchgeführt wurde. Waschvorgänge wurden bei 65ºC in 0,1x SSC, 0,1% SDS durchgeführt. Die Filter wurden einer Autoradiographie bei -70ºC unter zogen.

Sequenzierung

Eine Sequenzierung wurde gemäß dem Didesoxy-Kettenterminationsverfahren von Sanger et al. (1977), das für doppelsträngige Matrizen gemäß Murphy und Kavanagh (1988) angepaßt war, durchgeführt. Ein verschachtelter Satz von Matrizen wurde durch Verdauung mit Exonudease III und S1- Nuclease gemäß dem Verfahren von Henikoff (1987) erzeugt. Die Sequenzierungsreaktionen wurden einem Priming unter Verwendung der M13-Primer unterzogen.

Primererweiterung

Eine Primererweiterung von Pollen-RNA wurde gemäß standardmäßigen Vorgehensweisen durchgeführt (Ausubel et al., 1987). Das gamma-markierte Oligonucleotid wurde unter Verwendung von Polynucleotid-kinase gemäß Maniatis et al. (1982) erzeugt. 4x10&sup5; cpm Sonde wurden bei der Reaktion eingesetzt. Die Erweiterungsprodukte wurden durch Elektrophorese an 6% Polyacrylamid-Sequenzierungsgel unter anschließender Autoradiographie bei -70ºC analysiert.

In situ-Hybridisierung

Ribosonden zur Verwendung bei der in situ-Hybridisierung wurden aus der in pUBS3 geklonten cDNA 3C12 erzeugt. pUBS3 wurde durch Entfernung einer DraI-Stelle von pUC18 durch Verdau mit AatII und NdeI unter anschließender Abstumpfung mit T4-Polymerase, Ligation der stumpfen Enden und Transformation hergestellt. Das erhaltene Plasmid wurde mit PvuII verdaut, um das Polylinker-Fragment zu entfernen. Das entsprechende PvuII-Fragment aus dem Stratagene-Vektor Bluescriptr KS (Stratagene, La Jolla, CA) wurde inseriert (Murphy et al., 1992).
Das die 3C12-cDNA enthaltende Plasmid PUBS3 wurde linearisiert. 1 µg wurde in vitro unter Verwendung von T3- und T7-Polymerasen in einem Reaktionsgemisch transkribiert, das 4 mM Tris-HCL; 8 mM MgCl&sub2;; 2 mM Spermidin; 50 mM NaCl; 1 mM ATP, GTP und CTP; 0,65 mM UTP; 0,35 mM DIG-UTP (Boehringer Mannheim Cat Nr. 1209 256); 25 U RNase-Inhibitor enthielt, um die sense- bzw. antisense-Sonden zu bilden. Beide mit Digoxigenin (DIG)- markierten und ³&sup5;S-markierten Sonden wurden verwendet. Gewebe wurden in Formaldehyd fixiert, in Paraffinwachs eingebettet, in einer Dicke von 15 µm geschnitten und gemäß den Angaben von Jackson (1991) hybridisiert. Mit radioaktiven Sonden markierte Schnitte wurden zwei Wochen der Emulsion ausgesetzt. Der Nachweis der DIG-markierten Sonden wurde unter Verwendung des Nucleinsäure-Nachweiskits der Fa. Boehringer Mannheim (Cat Nr. 1175 041) unter folgenden Modifikationen durchgeführt: 100 µl einer 1:3000- Verdünnung von (DIG)-alkalische Phosphatase(AP)-Konjugat wurden pro objektträger zugesetzt und über Nacht bei 4ºC inkubiert. Die Farbnachweisreaktion wurde 4-5 Stunden durchgeführt, wonach mit TE (10 mM Tris-HCl, pH-Wert 7,5; 1 mM EDTA) gestoppt wurde.

Mikroprojektilbombardement

Zum Bombardement von Tabak-Pollenkörnern wurde das Verfahren von Twell et al. (1989) herangezogen. Die Plasmid-DNA wurde an Wolfram-Mikroprojektilen in Gegenwart von Spermidin gemäß den Angaben von Lonsdale et al. (1990) adsorbiert. Bei den bei diesem Versuch verwendeten Reporter- Genen handelte es sich um die Gene von E. coli-ß-Glucuronidase (GUS) und Leuchtkäfer-Luciferase. 10 mg Pollen wurden pro Platte bombardiert. Die bombardierten Platten wurden über Nacht bei 25ºC unter Licht inkubiert, bevor die Tests auf β-Glucuronidase- und Luciferase-Aktivität durchgeführt wurden. Die GUS-Aktivität wurde unter Anwendung eines fluorimetrischen Tests gemäß dem Verfahren von Jefferson (1987) bestimmt. Die Luciferase-Aktivität wurde gemäß Ow et al. (1986) bestimmt und an einem Berthold-Luminometer gemessen. Für das Bombardement von vollständigen Geweben wurde das Gewebe in MS-Medium, das mit Saccharose und 1% Agar ergänzt war, auf ein Stück Whatman Nr. 1-Papier gelegt und mit dem Deletionsderivat allein bombardiert. Die Platten wurden über Nacht bei 25ºC unter Licht 2 Tage inkubiert. Sodann wurde das Gewebe in eine Lösung von 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-glucuronsäure (X-Gluc) (1 mg/ml); 50 mM Natriumphosphat, pH-Wert 7,0; 0,1 mM Ferricyanid; 0,1% Triton X-100 übertragen und 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Für Pollenproben wurde die Nylonmembran auf ein Stück Whatman-Filterpapier Nr. 1, das in der X-Gluc- Lösung eingeweicht war, übertragen und auf die vorstehend beschriebene Weise inkubiert. Gewebe, die GUS exprimieren, färben sich in diesem System blau.

Räumliche spezifität der Polygalacturonase-Expression

Die vorstehend beschriebene Polygalacturonase-3C12-cDNA wurde zur Sondenbehandlung von Northern-Blots mit einem Gehalt an Mais-poly A&spplus;-MRNA verwendet, die aus Staubbeuteln, Narbenfäden in unterschiedlichen Reifungsstadien, Pollen, Seide, Kolben, Blättern, Wurzeln und Keimblattscheiden isoliert worden waren. Ein Transkript von etwa 1,5kbp wurde in sämtlichen Staubbeutel-mRNA-Präparaten in reifem Pollen nachgewiesen (Fig. 1). Das Transkript war in geringen Konzentrationen in unreifen Staubbeuteln vorhanden und nahm in reifem Pollen auf ein Maximum zu. Mit keiner der aus vegetativen Gewebeproben isolierten m-RNA-Präparate wurde eine Hybridisierung festgestellt.
Um die zelluläre Spezifität des Transkripts innerhalb des Staubbeutels zu bestimmen, wurden in situ-Hybridisierungen unter Verwendung sowohl der sense- als auch der antisense-Ribosonden, die aus 3C12-cDNA synthetisiert und mit Digoxigenin-UTP markiert worden waren, durchgeführt. In Ubereinstimmung mit den Ergebnissen der Northern-Hybridisierung wurde keine Hybridisierung der sense- oder antisense-Sonden in Schnitten von Kolben, Blättern, Seide oder Wurzeln festgestellt. Schnitte von Staubbeuteln in verschiedenen Entwicklungsstadien gemäß der Beurteilung durch Staubbeutelfärbung, Verhältnis von Staubbeutellänge zu Spelzenlänge und Narbenfadenposition an der Pflanze (Chang und Neuffer, 1989) wurden ebenfalls einer Sondenbehandlung mit den sense- und antisense-Sonden unterzogen. Jedes Maisblütchen innerhalb eines Ährchens enthält 2 Sätze von 3 Staubbeuteln, wobei sich die 2 Sätze in unterschiedlichen Entwicklungsstadien befinden. Ein transversaler Schnitt durch ein Blütchen, das 3 prämeiotische Staubbeutel und 3 meiotische Staubbeutel enthielt, zeigte keine Hybridisierung mit den sense- oder antisense Sonden (Fig. 2A). Jedoch zeigte ein transversaler Schnitt durch einen Staubbeutel bei der ersten Pollenmitose eine Hybridisierung nur der antisense-Sonde allein mit den reifenden Mikrosporen (Fig. 2B). Es gab keine Hybridisierung mit der Staubbeutelwand oder Tapetum-Zellschicht. Ein transversaler Schnitt durch einen Staubbeutel mit einem Gehalt an reifem Pollen unmittelbar vor dem Platzen zeigte das gleiche Hybridisierungsmuster wie bei der ersten Pollenmitose (Fig. 2C). Die Verwendung von ³&sup5;S-markierten Ribosonden zeigten ebenfalls, daß die Expression auf das Pollenkorn und nicht auf eines der untersuchten sporophytischen Gewebe lokalisiert war. Diese Daten belegen sicher, daß die Expression dieses speziellen Polygalacturonase-Gens Pollen-spezifisch ist.

Isolierung von PG-Genomklonen

Vier Genomklone wurden aus in EMBL3 hergestellten Bibliotheken von Mais isoliert (Allen und Lonsdale, zur Veröffentlichung vorgelegt) . Zwei der Klone, die aus einer Bibliothek der Varietät B73, B7317 und B7339 isoliert worden waren, wiesen die volle Länge auf. Die anderen beiden, die aus einer Bibliothek der Varietät W22, W2247 und W2265 isoliert worden waren, waren an ihren 3'-Enden unvollständig. Eine DNA-Sequenzanalyse ergab, daß diese vier Klone in ihren Kodierungssequenzen eine hochgradige Homologie 099%) aufwiesen und sie offensichtlich Mitglieder einer Genfamihe sind. Die Klone voller Länge enthalten keine Introns. Die Nucleotidsequenz mit 2,87kbp DNA stromaufwärts vom vorhergesagten ATG-Start des Klons W2247 wurde bestimmt (Fig. 3). Eine begrenzte Sequenzierung der übrigen drei Klone zeigt, daß die stromaufwärtigen Regionen der 4 Klone eine ebenso starke Homologie in ihrer Nucleotidsequenz wie in ihren Kodierungsregionen aufweisen.

Kartierung der Transkriptionsstartstelle des Klons W2247

Die Transkriptionsstartstelle des Klons W2247 (SEQ ID NR: 1) wurde durch Primererweiterung von Pollen-RNA kartiert. Ein Primer (SEQ ID NR: 20) (GTTGCCTGGGCACTAGG) bei -53bp relativ zum mutmaßlichen Transkriptionsinitiationscodon wurde mit poly A&spplus;-RNA anelliert und gemäß den Angaben unter Materialien und Methoden erweitert. Es wurde ein Hauptprodukt mit 155bp erhalten (Fig. 4). Ein untergeordnetes Produkt von 158bp wurde ebenfalls erhalten, was darauf schließen läßt, daß entweder das Gen 2 Transkriptionsinitiationspunkte aufweist oder das untergeordnete Produkt eine transkriptionelle Initiation von anderen Mitgliedern der Genfamihe darstellt. Primererweiterungen unter Verwendung der gesamten RNA als Substrat anstelle einer poly A&spplus;-RNA ergaben Produkte von 155bp, 158bp und mehrere größere Produkte. Diese können auf eine Hybridisierung des Oligonucleotids mit anderen nicht-verwandten non-poly A&spplus;-Transkripten zurückzuführen sein. Ferner wurde ein Produkt von 116bp erzeugt. Dieses letztgenannte Produkt stellt vermutlich einen Artefakt dar, da es auch synthetisiert wurde, wenn TRNA als Substrat verwendet wurde. Das 155bp-Produkt bestätigte, daß die Initiation der Transkriptionen ausgehend vom 'A'-Rest bei 188bp relativ zum vorhergesagten ATG-Translationsstart erfolgte. Ein mutmaßliches TATA-Motiv, 'TATTTAA', befindet sich bei -35bp zu diesem Transkriptionsstart. Eine identische Sequenz wurde im Zm13-Pollen-spezifischen Gen von Mais bei -34bp zum Transkriptionsstart gefunden (Hamilton et al., 1989).

Gen-Kopienzahl

Die Kopienzahl des Polygalacturonase-Gens wurde durch Southern-Blot- Analyse gemäß den Angaben in Materialien und Methoden bestimmt. Die gesamte Genom-DNA aus Mais B73 wurde mit NcoI und BamHI verdaut, durch Elektrophorese getrennt, einem Blotting auf eine Nylon-Membran unterzogen und einer Sondenbehandlung mit einem 1,3kbp NcoI-Fragment des Klons B7317 unterzogen. Diese Sonde hybridisierte mit Mehrfachbanden (Fig. 5). Ein Vergleich dieser Banden mit Gen-Kopienzahl-Standards läßt darauf schließen, daß sie in mehr als 5 Kopien pro Zelle vorhanden waren, was darauf hinweist, daß dieses Gen vermutlich ein Mitglied einer Genfamihe ist. Die schwächeren Hybridisierungsbanden können Mitglieder der PG-Genfamilie repräsentieren, die nicht Pollen-spezifisch sind und eine geringere Homologie mit dem als Sonde verwendeten Pollen-spezifischen Klon aufweisen.
Die Annahme, daß das Pollen-spezifische Mais-PG-Gen ein Mitglied einer Multigenfamilie ist, steht in Übereinstimmung mit den Ergebnissen, die mit dem Pollen-spezifischen PG-cDNA-Klon von O. organensis erhalten wurden (Brown und Crouch, 1990), und auch mit unseren Ergebnissen, die aus einem Vergleich von Restriktionskarten und der Nucleotidsequenz von 3 Genomklonen von Mais-PG erhalten wurden (Allen und Lonsdale, zur Veröffentlichung vorgelegt).

Sequenzanalyse

Die 2,87kbp der stromaufwärtigen Sequenz des Klons W2247 (SEQ ID NR: 1) wurden gemäß den in Materialien und Methoden gemachten Angaben sequenziert und auf Homologien mit potentiellen cis-wirkenden Sequenzen, die in anderen Staubbeutel- und Pollen-spezifischen Genen identifiziert worden waren, analysiert. Die Sequenz ist in Fig. 3 (SEQ ID NR: 1) dargestellt. Eine Analyse der stromaufwärtigen Regionen der 3 Pollen-exprimierten Gene der Tomate (Twell et al., 1991) ergab 2 cis-wirkende Sequenzen, die für die Expression in Pollen wichtig sind. Es handelte sich um 'TGTGGTT', bezeichnet als das PB-Kernmotiv, und um 'GAAPUTTGTGA', die LAT 56/59-Box. Die Motive 'GTGG' und 'GTGA', deren Mutation zu einer verminder'en Aktivität der Promotoren führt, sind ebenfalls in den stromaufwärtigen Regionen von Zm13 und dem Petunia-CHIAPA2-Gen vorhanden (van Tunen et al., 1989). In der 2,87kbp stromaufwärtigen Region des Mais-PG-Gens fanden wir sieben Sequenzen mit mindestens 5/7 Übereinstimmungen mit dem PB-Kernmotiv unter Einschluß des 'GTGG'-Motivs (Fig. 6). Sechs Sequenzen mit mindestens 7/10 Übereinstimmungen zur LAT 56/59-Box unter Einschluß des 'GTGA'-Motivs wurden gefunden.
Der vorgeschlagene ATG-Start weist eine 67%ige Homologie zur Konsensus-Pflanzen-Translationsinitiationsregion gemäß dem Vorschlag von Lutcke (1987) auf und gilt als der korrekte ATG-Start, da er das erste Methionin-Codon im Raster ist.
Ein Vergleich der stromaufwärtigen Region des Klons W2247 (SEQ ID NR: 1) mit dem von Zm13 ergab einige Homologien, diese befanden sich aber in unterschiedlichen Abständen von den Transkriptionsstarts in den beiden Genen. Es gibt eine Reihe von direkten Wiederholungen in der stromaufwärtigen Region des Klons W2247 (SEQ ID NR: 1), die ähnlich mit den in der stromaufwärtigen Sequenz von Zm13 vorhandenen Strukturen sind. Die etwaige Funktion dieser Strukturen ist noch unbekannt. Die einzige signifikante Homologie zwischen ihnen bestand in einer identischen mutmaßlichen TATA-Box 'TATTTAA'. Dieser Mangel an Homologie in den stromaufwärtigen Regionen von Genen aus der gleichen Spezies, die im gleichen Gewebe in gewebespezifischer Art und Weise exprimiert worden sind, wurde auch für andere Sets von Genen beschrieben (McCormick 1991). Einige Sequenzhomologien zu den von Hamilton et al. (1989) in den stromaufwärtigen Regionen von einigen Staubbeutel- und Pollen-exprimierten Genen identifizierten Motiven wurden gefunden. Jedoch gibt es keine Anzeichen dafür, daß diese Sequenzen an der Expression beteiligt sind. Es gibt keine auffallenden Homologien zwischen der stromaufwärtigen Region des Klons W2247 und den konservierten Sequenzen in den stromaufwärtigen Regionen der beiden Pollen-spezifischen Gene aus Brassica napus (Albani et al., 1991).
Das Tabak-Gen für Polygalacturonase (PG) wurde geklont und sequenziert (Tebbutt und Lonsdale, unveröffentlicht). Ein Vergleich der Nucleotidsequenzen der Tabak- und Mais-PGs stromaufwärts von der Kodierungsregion ergibt mit Ausnahme einer Region eine geringe Homologie. Diese Sequenz ist in der stromaufwärtigen Region von beliebigen anderen veröffentlichten, Pollen-spezifischen Genen nicht vorhanden und stellt somit offensichtlich keine absolute Voraussetzung für eine Pollen-spezifische Expression dar. Sie tritt an ähnlichen Positionen in bezug auf die jeweiligen Transkriptionsstarts auf, und zwar bei -117bp bei Mais und bei -l4obp bei Tabak. Die konservierten 9bp innerhalb dieser Sequenz sind auch in der stromaufwärtigen Region der bei der Fruchtreifung der Tomate beteiligten PG bei -700bp vorhanden. Die Beteiligung dieser Sequenz bei der Pollen-spezifischen Expression der Mais- und Tabak-PG-Gene wird derzeit untersucht.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen

Promotoraktivität des Klons w2247 und von Deletionsderivaten

Die gesamte stromaufwärtige Region des Klons W2247 (SEQ ID NR: 1) wurde mit der kodierenden Region des Escherichia coli-β-Glucuronidase (GUS) -Gens unter Bildung von chimärischen Genen für den Test der effektiven Genexpression durch diesen Mais-Promotor fusioniert (Fig. 7). Ein translationales Fusionsprodukt, p47.427 (SEQ ID NR: 8), wurde durch Fusion eines stumpfendig gemachten APALI-Fragments von 2,7skbp aus dem Klon W2247 mit einer stumpfendig gemachten BAMHI-Stelle von PTAK1 (Jefferson et al., 1987), einem Vektor auf pUC-Basis mit einem Gehalt an einem promotorfreien GUS-Gen und der nos-Terminatorsequenz, erzeugt. p47.427 (SEQ ID NR: 8) wurde somit bei +10bp zum nativen ATG fusioniert und enthielt 3 Codons aus dem Klon W2247 und 8 Codons aus dem Vektor, der dem ATG der GUS-Kodierungsregion vorausgeht. Ein reverses transiationales Fusionsprodukt, p47.430, wurde erzeugt durch Fusion des SmaI/SalI-Fragments von p47.427, das die gesamte stromaufwärtige Region enthielt, stumpfendig gemacht und in entgegengesetzter Orientierung in PTAK1, das mit 5mai und SalI geschnitten und stumpfendig gemacht war, inseriert.
Um die Bereiche der stromaufwärtigen Region, die für eine Pollenspezifische Expression verantwortlich sind, zu begrenzen, wurde ein verschachtelter Satz von Deletionsderivaten von p47.427 (SEQ ID NR: 8) vom 5'-Ende des Inserts (Fig. 8) gemäß dem Verfahren von Henikoff (1989) erzeugt. Deletionsderivate wurden auf Promotoraktivität unter Verwendung eines vorübergehenden Testsystems auf der Grundlage des Mikroprojektilbombardements von Tabakpollen (Twell et al., 1990) gemäß den Angaben unter Materialien und Methoden getestet. Tabak-Transformationsversuche ergaben, daß die 2,687kbp der stromaufwärtigen Region des Klons W2247 die Expression des GUS-Gens in analoger Weise zu ihrer Aktivität im nativen Hintergrund aktivieren können (Allen und Lonsdale, unveröffentlicht). Tabakpollen wurde gleichzeitig mit den Deletionsmolekülen und einem Referenzplasmid bombardiert. Das Referenzplasmid wurde verwendet, um eine Standardisierung zwischen den Bombardements zu erreichen. Es bestand aus der stromaufwärtigen Region eines Pollen-exprimierten Actin-Gens, das mit der Leuchtkäfer-Luciferase-Kodierungsregion und dem nos-Terminator fusioniert war. Die Aktivität wurde als die relative Aktivität von GUS zu Luciferase bei jedem Bombardement gemessen. Drei Wiederholungsbombardements wurden für jedes der getesteten Plasmide durchgeführt.
Fig. 8 zeigt bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung in graphischer Darstellung. Das Deletionsderivat D16.6 (SEQ ID NR: 5) stellt eine stärker bevorzugte Ausführungsform der Erfindung dar. Fig. 9 zeigt die Aktivitäten der Deletionsderivate beim Test im vorstehend beschriebenen vorübergehenden Expressionssystem. Sämtliche Deletionsderivate wiesen ähnliche Aktivitäten wie die Sequenz voller Länge p47.427 (SEQ ID NR: 8) auf. Jedoch zeigte die stärker bevorzugte Ausführungsform D16.6 (SEQ ID NR: 5), die die 464bp stromaufwärtige Region enthielt, das 9- bis 18-fache des Expressionsniveaus des Klons voller Länge p47.427 (SEQ ID NR: 8). Die Deletionsderivate wurden auch durch Mikroprojektilbombardement einer Reihe von Mais- und Tabakgeweben unter anschließender Färbung mit X-Gluc getestet, um festzustellen, ob sie ihre Pollen-Spezifität behielten. Die Anwesenheit von blauen Flecken zeigt die Expression der Deletionsderivate an. Der CAMV (Blumenkohl-Mosaikvirus)-355-Promotor, fusioniert mit dem Mais-Adh1-Intron und der GUS-Kodierungsregion (CAMV ADH: GUS) wurde als positive Kontrolle für die Expression herangezogen. Er erwies sich in sämtlichen getesteten Mais- und Tabakgeweben als aktiv. Bei diesen Versuchen behielten die Deletionsderivate ihre Gewebespezifität, da sie GUS-Aktivität nur in Tabakpollen und nicht in Tabakblättern oder beliebigen anderen getesteten Maisgeweben aufwiesen (Fig. 10). Das Deletionsderivat D17.12 (SEQ ID NR: 2), das nur 80bp der Sequenz stromaufwärts vom Transkriptionsstart enthielt&sub1; zeigte eine gewisse schwache Expression. Diese war vergleichbar mit der Expression durch das CAMV ADH::GUS-Konstrukt und p46.430.
Berichte darüber, daß die Gewebespezifität von Mais-Einkeimblatt- Promotoren in transgenen zweikeimblättrigen Pflanzen zuverlässig erhalten bleibt (Guerrero et al., 1990) lassen auf eine Sequenzkonservierung der Bindungsstellen für die beteiligten mutmaßlichen Transaktionsfaktoren schließen. Andere Arbeitsgruppen identifizierten sogenannte "Pollen- Boxen", von denen in einem Fall gezeigt werden konnte, daß sie die Expression in Pollen beeinflussen. Ähnliche Motive, wie das PB-Kernmotiv, das von Twell et al. (1991) in der stromaufwärtigen Region der LAT-Gene identifiziert worden war, wurden in der stromaufwärtigen Region W2247 gefunden, jedoch treten alle diese Motive, mit Ausnahme des Motivs bei -8 bis -14, mindestens 1kb stromaufwärts vom Transkriptionsstart auf, einer Region, die für die Pollen-spezifische Expression nicht erforderlich ist.
Im LATS2-Gen reicht der minimale Promotor, der für die Pollenexpression erforderlich ist, von -71 bis +110 (Twell et al., 1991). Wir konnten zeigen, daß in einem Tabak-semi-in-vivo-System die Region von -80 bis +5 eine schwache Pollen-spezifische Expression aufweist. Innerhalb der 87bp zwischen dem 5'-Ende von D16.6 (SEQ ID NR: 5) und D18.5 (SEQ ID NR: 4) tritt offensichtlich eine Region auf, die die Expression ausgehend vom Mais-PG-Promotor in Tabakpollen im Vergleich zum Klon in voller Länge in wesentlich stärkerem Maße fördert. Diese Aktivität wird durch die Anwesenheit von weiteren stromaufwärtigen Sequenzen erheblich verringert; vgl. Fig. 9.

Einführung von Pollen-spezifischen, chimärischen Genen in Pflanzen, Pflanzenzellen und/oder Pflanzenprotoplasten

Nachdem der erfindungsgemäße Pollen-spezifische-PG-Promotor definiert worden ist und die Fähigkeit der isolierten Sequenzen zur Veranlassung der Expression eines exogenen Gens (β-Glucuronidase) in Tabakpollen nachgewiesen worden ist, ist es nunmehr möglich, diese Sequenzen zur Erleichterung der Einführung und Expression von chimärischen Genen in Pflanzen und in Pollen heranzuziehen.
Auf dieser Basis betrifft die vorliegende Erfindung auch ein chimärisches Gen und einen Transfervektor, der im wesentlichen aus der in Fig. 3 dargestellten PG-Promotorregion oder einem der Deletionsderivate der Figuren 8 und 9 und einem exogenen Gen (dem der Wildtyp-Promotor fehlt), dessen Expression durch eine beliebige der vorstehend beschriebenen Sequenzen reguliert werden kann, besteht.
Techniken für die Einführung von Vektoren in Pflanzen oder Pflanzenzellen sind aus dem Stand der Technik bekannt. Zu derartigen Verfahren gehören (ohne Beschränkung hierauf) Calciumphosphat - Kopräzipitationstechniken, die Protoplastenfusion, die Elektroporation, die Übertragung durch Vermittlung von Mikroprojektilen, die Infektion mit Viren und die Infektion mit Bakterien (z. B. Agrobacteriurn turnifaciens) (Jones, 1985).
Ein Beispiel dafür, wie eine pollenspezifische Chirnäre in diesem Zusammenhang verwendet werden kann, ist vorstehend beschrieben, wobei ein E. coli-β-Glucuronidase-Gen in erfolgreicher Weise in Tabakpollen und Tabakblattgewebe übertragen und exprimiert werden konnte.
Als ein weiteres Beispiel kann das Bakterium Agrobacterium tumifaciens zur Einführung der erfindungsgemäßen chimärischen Gene in Pflanzen, Pflanzenzellen oder Protoplasten verwendet werden. Dabei können insbesondere die erfindungsgemäßen Promotorsequenzen mit einem Reporter-Gen, wie dem vorstehend beschriebenen β-Glucuronidase-Gen verknüpft und dann in ein Ti-Plasmid, wie pBI101.2 eingebaut und nach standardmäßigen Verfahren in Agrobacterium tumifaciens eingeführt werden (Horsh et al., 1985). Dieses Bakterium kann sodann zur Einführung des Plasmids in Pflanzen nach bekannten Techniken herangezogen werden (Horsh et al., 1985).
Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Einführung von Genen in Pollen mit dem Ziel verwendet werden, die Pollenentwicklung zu stoppen und dadurch eine Pflanze in bezug auf die männliche Funktion steril zu machen. Zu derartigen Genen gehören solche, die für Proteine kodieren, die für Pollen toxisch sind. Es kommt auch in Betracht, chimäre Plasmide zu konstruieren, die die Expression von antisense-MRNAS ermöglichen, die zur Hemmung der Expression von Genen, die eine Rolle bei der Pollenentwicklung spielen, befähigt sind.
Ferner kommt es in Betracht, daß die erfindungsgemäßen Vektoren sich zur Einführung von wertvollen phänotypischen Eigenschaften in Pollen eignen, wozu (ohne Beschränkung hierauf) Pestizidresistenzen, eine Resistenz oder Toxizität gegenüber Insektenschädlingen oder eine Optimierung von anderen Pollenfunktionen gehören.

Literatur

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Claims

1. Isolierte, gereinigte DNA-Sequenz aus der Promotorregion eines Pollen-spezifischen Gens der Mais-Inzuchtlinle W22, wobei die Sequenz im wesentlichen aus der in Figur 3 (SEQ ID Nr.: 1) dargestellten Sequenz besteht.

2. DNA-Sequenz nach Anspruch 1 bei der das Pollen-spezifische Gen Polygalacturonase ist.

3. Isolierte, gereinigte DNA-Sequenz aus der Promotorregion eines Pollen-spezifischen Gens der in Figur 3 (SEQ ID Nr.: 1) dargestellten Mais- Inzuchtlinie W22, wobei die Sequenz ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

a) ca. 1 bis ca. 80 Basen stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 2);

b) ca. 1 bis ca. 347 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 3);

c) ca. 1 bis ca. 377 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 4);

d) ca. 1 bis ca. 464 Basenpaaren der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 5);

e) ca. 1 bis ca. 595 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 6);

f) ca. 1 bis ca. 1579 Basenpaaren der DNA stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 7) sowie

g) ca. 1 bis ca. 2687 Basenpaaren stromaufwärts vom 3'-Ende der Promotorregion (SEQ ID Nr.: 8).

4. Pollen-spezifisches chimärisches Gen, enthaltend ein Gen, bei dem der Wildtyp-Promotor des Gens durch eine DNA-Sequenz aus der Gruppe, bestehend aus den DNA-Sequenzen nach Anspruch 3 (SEQ ID Nr.: 2-8) ersetzt ist.

5. Pollen-spezifisches chimärisches Gen nach Anspruch 4, ferner enthaltend einen Transfervektor.

6. Verfahren zur Übertragung Pollen-spezifischer Expression auf ein Gen in einem Pollen, enthaltend:

a) Ersatz eines Wildtyp-Promotors eines Gens, dem Pollenspezifische Expression verliehen werden soll, durch eine Pollen-spezifische Promotorregion, die im wesentlichen aus der in Figur 3 (SEQ ID Nr.: 1) dargestellten DNA-Sequenz besteht, wodurch ein Pollen-spezifisches chimänsches Gen erzeugt wird;

b) Einbau des Pollen-spezifischen chimärischen Gens in einen Transfervektor;

c) Einbau des das Pollen-spezifische chimärische Gen enthaltenden Transfervektors in einen Pollen, der zur Assimilation und Expression des chimärischen Gens befähigt ist, sowie

d) Nachweis der Expression des chimärischen Gens in dem Pollen.

7. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Pollen-spezifische Promotorregion im wesentlichen aus der DNA-Sequenz nach Anspruch 1 oder 3 (SEQ ID Nr.: 1-8) besteht.

8. Verfahren nach Anspruch 71 bei dem der Pollen ein Tabakpollen ist.

9. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem die Pollen-spezifische Chimäre mittels Mikroprojektilbombardement in Pflanzen eingebaut wird.

10. Verfahren nach Anspruch 6, bei dem das Gen nach Schritt (a) für β-Glucuronidase codiert.

11. Transformierter Pollen, enthaltend eine DNA-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus D17.12 (SEQ ID Nr.: 2), D17.2 (SEQ ID

Nr.: 3), D18.5 (SEQ ID Nr.: 4), D16.6 (SEQ ID Nr.: 5), D16.4 (SEQ ID Nr.: 6), D10.2 (SEQ ID Nr.: 7) sowie p47.427 (SEQ ID Nr.: 8).

12. Transformierter Pollen nach Anspruch 11, bei dem der Pollen ein Tabakpollen ist.