CN115807016B - 甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用，在植物中过表达Arf蛋白激酶编码基因使植株叶片数目增加，叶面积增加，生物量增加，因此可将Bna.Arf用于调控植物生物量，将植物中过表达Bna.Arf编码基因使其蛋白激酶活性增加获得生物量增加的植物，对提高农作物产量具有重要意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用。
背景技术
随着国民经济水平提高，我国对优质的脂质和蛋白质的需求愈发旺盛，而油菜、大豆、芝麻等油料作物是脂质和蛋白质最重要的来源，在保证脂质和蛋白质的有效供给、改善食物结构、促进养殖业和加工业发展等诸方面均居重要地位。但是由于耕地资源紧张、品种品质良莠不齐、研发水平相对落后，我国油料的生产在质量和数量上都难以满足日益增长的需求。在实际生产中，我国油菜产量较低，生产成本却较高，超过百分之六十依赖进口，并且种植面积和单位面积产量都停滞不前。因此，探究有效提高油菜生物量积累的机制，培育油菜理想株型，对于提高油菜产量和保障我国作物食用油的供给安全具有重要意义。Arf蛋白(ADP-ribosylation factor，ADP核糖基化因子)是一类在真核生物囊泡运输过程中具有重要作用的调节因子，并参与植物的生物和非生物胁迫响应。Arf蛋白属于Ras超家族，根据氨基酸序列同源性，将Arf基因家族分为Arf和Arf-like(ARL)基因，拟南芥中共鉴定出11个Arf蛋白及21个ARL蛋白，Arf蛋白高度保守(>相似度60％)，具有相似的生物活性，而ARL蛋白高度分化(40-60％相同)，在包括分泌在内的不同途径中发挥作用。前期研究发现Arf在真核细胞中参与信号转导、细胞增殖、囊泡运输等多种生物学过程：Pimpl通过体外复制囊泡生成实验发现花椰菜中Arf1A和γ-COPI可完成从细胞质到内质网/高尔基混合膜的转移；Lee等利用GDP、GTP结合拟南芥Arf1A突变体进行瞬时表达，发现细胞中内质网到高尔基体运输的中断,而GFP标记的高尔基膜标记蛋白重新进入内质网；Myung Ki等在拟南芥的高尔基体中沉默表达Arf1，发现蛋白质运输受到抑制，同时植物的生长发育受到抑制；以上研究说明Arf在植物生长发育和生物量形成过程中具有重要作用，但其具体调控途径，分子调控网络没有得到清晰的研究。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用
所述甘蓝型油菜Bna.Arf基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明优选的，所述植物为甘蓝型油菜或拟南芥。
本发明优选的，通过在植物中过表达甘蓝型油菜Bna.Arf基因来提高植物的生物量。
本发明优选的，所述生物量包括叶片面积、莲座叶数目、植株高度、有效分枝数、角果数、鲜重、干重。
本发明优选的，在植物中过表达甘蓝型油菜Bna.Arf基因的方法为将过表达载体pEarleyGate101-Bna.Arf通过农杆菌介导转化植物。
本发明进一步优选的，所述过表达载体pEarleyGate101-Bna.Arf的构建过程为：将SEQ IDNO.3所示的甘蓝型油菜Bna.Arf基因构建到pENTR/D-TOPO入门载体上，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取得到中间载体，将其与pEarleyGate101表达载体进行LR重组反应，得到过表达载体pEarleyGate101-Bna.Arf。
本发明优选的，在植物中过表达甘蓝型油菜Bna.Arf基因，能激活淀粉合成途径、蔗糖运输途径上相关基因的表达，提高能量物质的积累，从而提高植物的生物量。
本发明优选的，在植物中过表达甘蓝型油菜Bna.Arf基因，能激活激素代谢途径中生长素合成相关基因的表达，从而提高植物的生物量。
本发明的有益效果在于：本发明公开了甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用，通过利用GUS组织化学染色发现Bna.Arf基因在各个组织中都有表达，但在叶片、角果及花中表达量最高；利用扫描电镜探究了Bna.Arf过表达植株的叶片细胞大小与数量，发现过表达转基因植株的叶片细胞较野生型细胞面积显著增大；结合对转基因植株的农艺性状考察及转录组分析等结果，发现转基因Bna.Arf与野生型植株差异表达基因主要涉及生长素、细胞分裂素、脱落酸等激素相关的代谢途径，与淀粉合成、蔗糖转运等能量代谢相关途径，这些结果表明Bna.Arf能影响植株生物量大小，因此可将Bna.Arf用于调控植物生物量，将植物中过表达Bna.Arf基因使Arf蛋白激酶活性增加，对植株生物量的增加具有重要意义。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Bna.Arf启动子在拟南芥中的表达情况(a-c为拟南芥营养生长期整株及根和叶的表达情况，d-g为抽薹以后在茎、花、角果皮中的表达情况，标尺长度为500μm)；
图2为营养生长时期转基因农艺性状考察(A：拟南芥种子比较；B-D：拟南芥植株叶片面积，叶片数目比较；E-G:分别为过表达株系与野生型种子面积，叶片面积，莲座叶数目的生物统计学分析)；
图3为生殖生长时期转基因农艺性状考察(A-C：生殖生长时期拟南芥生长情况比较；D-F：分别为过表达株系与野生型植株高度，有效分枝数，角果数的生物统计学分析；G-H:分别为过表达株系与野生型不同时期的鲜重，干重的生物统计学分析)；
图4为差异表达基因KEGG富集Top 20点状图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明使用材料如下试验材料：植株材料野生型拟南芥Col-0，过表达Bna.Arf拟南芥转基因植株、实验所用菌株大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101，载体pEarleyGate101、pCAMBIA1305.1。
转录组材料：将过表达拟南芥及野生型拟南芥消毒点播于1/2MS培养基中，4℃冰箱放置两天使种子处于相同的生长状态后置于组培间16小时黑暗，8小时光照培养至四叶期，整个植株装入2mL无RNA酶的离心管(每个材料取三个重复)迅速置于液氮中，冻存于-80℃备用。
实施例1、Bna.Arf基因克隆及表达情况
使用EZ-10DNA away RNA Mini-Preps Kit试剂盒按照说明书提取样品总RNA，用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测样品RNA质量并检测RNA浓度，使用US EVERBRIGHT INC.的反转录试剂盒进行反转cDNA的合成。
利用油菜基因组网站Brassica napus database(http://www.genoscope.cns.fr/brassicanapus/)获取ARF家族成员染色体位置信息，并根据Bna.Arf基因的ORF序列设计引物，具体引物如下：
上游引物：5’-ATGGGTTTGTCTTTCGCCAAGTTGTTTAG-3’(SEQ ID NO.1)；
下游引物：5’-CTACGCCTTGCCGGCAATGTTGTTGGAC-3’(SEQ ID NO.2)；
然后以提取的cDNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物经测序得到543bp的cDNA序列，具体序列如SEQ ID NO.3所示。
利用pENTR/D-TOPO Cloning Kit，将扩增的Bna.Arf基因cDNA序列重组到pENTR/D-TOPO入门载体，转化大肠感受态DH5α。利用引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2鉴定阳性克隆后，使用EasyPure Plasmid MiniPrep Kit提取质粒，将其与pEarleyGate101表达载体进行LR重组反应，形成用于过量表达和亚细胞定位的pEarleyGate101-Bna.Arf载体。
根据Bna.Arf基因启动子序列，设计特异性引物(SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5)扩增启动子上游2000bp序列，具体序列如SEQ ID NO.6所示，通过重组法将其重组在pCAMBIA1305.1载体上得到重组载体pCAMBIA1305.1-Bna.Arf，获得重组载体转化农杆菌GV3101并侵染野生型拟南芥获得T2代转基因植株，利用GUS组织化学染色法对其进行染色，结果显示，在拟南芥生长的各个时期各个组织部位都有一定的表达，且表达情况和BrassicaEDB网站(https://brassica.biodb.org/)预测结果一致：根据GUS组织化学染色结果可以看出Bna.ARf具有组成型表达的特征，在各个时期各个部位都存在表达，但是表达量高低存在差异；在营养生长期中，叶片及根部存在少量表达；在生殖生长期间，叶片，茎，角果和花中均有较高表达量(如图1所示)。
实施例2、Bna.Arf对拟南芥生物量的影响
为了探究转基因拟南芥发生的变化，将pEarleyGate101-Bna.Arf通过农杆菌介导转化拟南芥，将过表达Bna.Arf拟南芥与野生型拟南芥在相同情况下培养后，对其株高、有效分枝数，角果数等性状进行考察。
在拟南芥从1/2MS培养基移栽在土里及后续的营养生长阶段，过表达植株叶片面积明显大于野生型植株，莲座叶数目多余野生型植株(如图2所示)；在拟南芥生殖生长时期，过表达拟南芥植株显著高于野生型植株，其有效分枝数，角果数目显著增多；分别测量不同时期过表达与野生型植株的鲜重和干重，发现过表达植株的生物量较野生型显著增多。结果表明，过表达拟南芥植株生物量显著大于野生型(如图3所示)。
实施例3、转录组结果分析
为了分析过表达Bna.Arf转基因植株的分子机制，揭示其生物量增加的原因，对抽薹前期的过表达Bna.Arf转基因植株以及突变体Atarf进行转录组测序，以同一时期野生型的转录组数据作为对照。研究利用相应的分析流程对转录组的测序结果进行分析；结果显示，在同一时期野生型拟南芥和过表达Bna.Arf转基因拟南芥植株中共鉴定出90个差异表达基因，对差异基因进行KEGG富集分析，总共富集到了32个KEGG条目共90个差异基因，富集的前20个主要可能调控的KEGG通路，其中包括植物激素信号转导通路(Plant hormonesignal transduction)、蛋白质转运(Protein export)、氮代谢途径(Nitrogenmetabolism)及丝裂原活蛋白激酶级联途径(MAPK signaling pathway)等(如图4所示)。测序结果显示，过表达植株中，能量代谢途径相关基因表达量显著上调，说明在拟南芥中过量表达Bna.Arf能够激活淀粉合成途径，蔗糖运输途径以提高能量物质的积累来增加植物生物量。
在差异基因的KEGG中，还富集到了植物激素信号转导通路(Plant hormonesignal transduction)，这个通路中相关的激素主要包括生长素、细胞分裂素、脱落酸等，富集的差异基因主要参与生长素代谢通路。这些基因主要调控细胞分裂、细胞增大等植株发育过程。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (4)
1.甘蓝型油菜Bna.Arf基因在提高植物生物量中的应用，其特征在于：通过在植物中过表达甘蓝型油菜Bna.Arf基因来提高植物的生物量，所述甘蓝型油菜Bna.Arf基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述植物为甘蓝型油菜或拟南芥。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述生物量包括叶片面积、莲座叶数目、植株高度、有效分枝数、角果数、鲜重、干重，所述植物为拟南芥。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：在植物中过表达甘蓝型油菜Bna.Arf基因的方法为将过表达载体pEarleyGate101-Bna.Arf通过农杆菌介导转化植物。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：所述过表达载体pEarleyGate101-Bna.Arf的构建过程为：将SEQ ID NO.3所示的甘蓝型油菜Bna.Arf基因构建到pENTR/D-TOPO入门载体上，并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆，提取得到中间载体，将其与pEarleyGate101表达载体进行LR重组反应，得到过表达载体pEarleyGate101-Bna.Arf。
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