CN101502585B - 花椒属植物提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种花椒属植物提取物及其制备方法和用途。该花椒属植物提取物是从花椒属植物(Zanthoxylum L.)的果皮中提取、精制而得，其总多酚含量为50～80％，其中原花青素多聚体ZP-CT-A含量达5～15％。该花椒属植物提取物与药学上可接受的载体或其它适宜的赋形剂相结合，按照常规方法制成经口服、注射或其它剂型，可用于预防和治疗脑卒中、帕金森氏综合症、高血压、高血脂、动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病。

Description

花椒属植物提取物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及花椒属植物提取物、及其制备方法和用途，属于中药制药领域。 

背景技术

花椒属(Zanthoxylum L.)系芸香科(Rutaceae)植物的灌木或小乔木，全世界约250种，我国约45种，13变种，在我国大部分地区均有分布，其果实、根、茎、叶在国内外均作药用，具有镇痛、麻醉、抑菌、杀虫、抗肿瘤等作用。本草记载果皮为“椒红”，具温中散寒、止痛止痒、杀虫燥湿之功效；种子称“椒目”，具平喘利水之功效。我国花椒属植物的主要品种有花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)、青椒(Z.schinifolium Sieb.et Zucc.)、竹叶椒(Z.armatum DC)、野花椒(Z.simulans Hance)、勒欓(Z.avicennae(Lam.)DC.)、椿叶花椒(Z.ailantholides Sieb.et Zucc.)、朵椒(Z.molle Rehd)、两面针(Z.nitidum(Roxb.)DC.)等。中国药典2005年版收载的中药花椒为青椒(Z.schinifolium Sieb.et Zucc.)或花椒(Z.bungeanum Maxim.)的干燥成熟果皮，秋季采收成熟果实，晒干，除去种子及杂质。其功能主治为：温中止痛，杀虫止痒，用于脘腹冷痛，呕吐泄泻，虫积腹痛，蛔虫症；外用治湿疹瘙痒。 

传统花椒作为食品调味料广泛应用于食品工业，已开发出花椒油树脂、花椒油树脂微胶囊、花椒调味油、花椒精等这一类以脂溶性成分为主的深加工产品。人们对花椒属植物的果皮的脂溶性成分及其药理学作用方面已作了很多研究，这些化学成分主要有挥发油、生物碱、酰胺、香豆素和脂肪酸等(孙小文，段志兴，花椒属药用植物研究进展，药学学报，1996，31(3)：231-240)，花椒属的药物作用主要有四个方面：(1)对神经系统的麻醉与镇痛作用：临床上用花椒乙醚提取物或花椒挥发油作为口腔科的安抚剂，代替丁香油对龋齿进行消炎止痛。局部麻烦可产生镇痛效果，花椒中所含有茵芋碱可能是其镇痛的活性成分之一(常志青，王树玲，郝长源.茵芋碱的镇痛、解痉和镇静作用[J].中国药理学报，1982，3：163(66).)。(2)对消化系统疾病：花椒可治疗多种胃虚寒症，也可治疗胃溃疡、肝损害、炎症性和胃肠道功能紊乱性腹痛。(3)抗癌活性：其中主要是花椒中生物碱或挥发性成分花椒精油发挥的作用，如：花椒宁碱提高白血病小鼠的生命延长率(Barret Y，韩淑萍.花椒宁碱—一种新的抗白血病生物碱[J].国外医药：植 物药分册，1993，8(1)：19-21)；花椒粗油对油脂的过氧化反应和四氯化碳对小鼠肝脏的破坏均有明显的抑制作用(Mun S I，Ryu H S，Choi J S，Inhibitioneffects of Zanthoxylum schinifolium and its active principle on lipid peroxidationand liver damage in carbon tetrachloride-treated mice[J]，Han’guk Sikp’umYongyang Kwahak Hoechi(Korean)，1997，26(5)：943-951)香豆素有抗血小板聚集的作用(花椒的活性成分与应用研究.中国食品添加剂，2004；(2)：75-78；Chemical Constituents and Biological Activities of the Fruit of Zanthoxylumintegrifoliolum.J.Nat.Prod.，1999；62：833-837)。对于花椒属植物中水溶性部分(占总提取物的70％)的化学成分及药理作用，现代研究较少。日本学者Kusuda M.等从秦椒(Z.piperitum)分离到10种多酚类化合物(采用秦椒甲醇提取物通过HP-20柱层析，然后依次用0％、20％、40％、60％、80％、100％的水-甲醇溶液梯度洗脱，不同的洗脱部分进一步进行分离纯化得到10种化合物)，发现其中原花青素多聚体ZP-CT-A对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)具有抗菌活性(Polyphenolic Constituent Structures ofZanthoxylum piperitum Fruit and the Antibacterial Effects of Its PolymericProcyanidin on Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus.Biosci.Biotechnol.Biochem.，2006；70(6)：1423-1431)。 

发明内容

本发明的技术方案是提供了一种花椒属植物提取物，本发明的另一技术方案提供了该植物提取物的制备方法和用途。 

本发明提供了一种花椒属植物提取物，该提取物中总多酚重量百分比为50～80％。进一步优选地，总多酚重量百分比为65％～80％。 

其中，总多酚中含有原花青素多聚体ZP-CT-A，其中，原花青素多聚体ZP-CT-A在提取物中的重量百分含量为5％～15％。进一步优选地，所述的原花青素多聚体ZP-CT-A在提取物中的重量百分含量为8％～15％。 

更进一步的，所述的花椒属植物提取物中还含有3-氧-咖啡酰奎宁酸(化合物2)，4-氧-咖啡酰奎宁酸(化合物3)，原花青素B1(化合物4)，金丝桃苷(化合物5)中的一种或几种。 

其中，所述的花椒属植物提取物，是从花椒Zanthoxylum bungeanumMaxim.、青椒Z.schinifolium Sieb.et Zucc.竹叶椒Z.armatum DC、野花椒Z.simulans Hance、勒欓Z.avicennae(Lam.)DC.、椿叶花椒Z.ailantholides Sieb.et Zucc)、朵椒Z.molle Rehd、或两面针Z.nitidum(Roxb.)DC.等的果皮中提取获得。优选的是，从中药花椒中提取获得。 

本发明还提供了花椒属植物提取物的制备方法，包括以下步骤： 

(1)提取：将花椒属植物的果皮用水或含水乙醇或含水丙酮提取，原料 与提取液重量/体积比为1∶5～20； 

(2)浓缩：将步骤(1)得到的提取液经真空浓缩至无醇味或无丙酮味； 

(3)大孔吸附树脂或聚酰胺树脂吸附、洗脱：将步骤(2)得到的浓缩液加适量水溶散后上大孔吸附树脂柱或聚酰胺树脂，先用水洗脱，然后用20％-95％乙醇或丙酮洗脱，洗脱剂用量为5-10倍量树脂柱床体积，收集洗脱液，浓缩； 

(4)醇沉：将步骤(3)得到的药液用3-5倍量的95％乙醇进行沉淀，弃沉淀，得上清液； 

(5)浓缩、干燥：步骤(4)所得上清液经浓缩、干燥，即得花椒属植物提取物。 

其中步骤(1)中所述的含水乙醇或含水丙酮浓度为20-90％，优选丙酮；提取方式为浸渍、渗漉或回流；选用回流提取方式时，以70％丙酮提取3次时的效果为最佳； 

步骤(3)中的大孔吸附树脂选自D系列、HPD系列、HP系列、XAD系列或AB-8型大孔吸附树脂。优选的是：D系列的大孔吸附树脂为D-101型；HPD系列的大孔吸附树脂为HPD-500型；HP系列的大孔吸附树脂为HP-20型；XAD系列的大孔吸附树脂为XAD-4型。 

花椒属植物提取物进一步经Diaion HP-20，Toyopearl HW-40C，MCI gelCHP-20P，ODS等柱层析分别获得五个化合物，经化学和波谱方法测定、解析出各个化合物结构如下所示： 

花椒属植物提取物是花椒属植物果皮水溶性酚性成分的混合物，其总多酚含量为50～80％，其中一种原花青素多聚体ZP-CT-A(化合物1)的含量为5～15％。 

花椒多酚为水溶性成分，本发明用水或含水乙醇作提取剂比用甲醇作提取剂更为适宜，含量测定结果表明，水或含水乙醇提取物中多酚含量明显高于甲醇提取物。 

不同聚合度的原花青素其药理活性强弱也不一样，例如有研究表明，二聚体的抗氧化活性比单体儿茶素的活性强(Oxygen free radical scavengercapacity in aqueous models of different procyanidins from grape seeds.J.Agric.Food Chem.，1991，39：1549-1552)，聚合度2-5范围内其对氧自由基清除能力随聚合度增加而增加(Free radical scavenging activity of grape seed extractand antioxidants by electron spin resonance spectrometry in anH₂O₂/NaOH/DMSO system.Agric.Food Chem.，1999，47：2544-2548)。 

进一步的，本发明提供了该花椒属植物提取物在制备神经细胞保护剂、抗心肌缺血或脑缺血类药物、抗凝血剂、中性内肽酶抑制剂及抗高血脂类药 物中的应用。 

本发明还提供了一种药物组合物，是由有效量的花椒属植物提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。 

其中所述的药剂包括口服制剂和注射用制剂，口服制剂包括片剂、胶囊、软胶囊、颗粒剂、滴丸等，注射用制剂包括注射剂、注射用粉针剂等。 

体外或体内药效学试验结果表明，本发明花椒属植物提取物能保护神经细胞免受缺氧损伤和6羟基多巴胺致损伤，保护血管内皮细胞免受缺氧损伤，抑制中性内肽酶活性、上调高密度脂蛋白受体SR-B I表达，且具有抗凝血作用。 

神经细胞和血管内皮细胞缺氧保护剂可以用于脑缺血和心肌缺血的治疗，6羟基多巴胺致神经细胞损伤保护剂可用于帕金森氏综合症的治疗。中性内肽酶是近年来才发现的高血压治疗重要靶点，研究表明，中性内肽酶抑制剂可以有效地治疗高血压；高密度脂蛋白受体SR-B I是一个与高血脂和动脉粥样硬化相关的重要靶点，已有的研究表明，促进高密度脂蛋白受体SR-BI表达可以防治高血脂和动脉粥样硬化。抗凝血物质可用于多种心脑血管疾病的治疗，如脑卒中、动脉粥样硬化和冠心病等。 

以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述发明内容做进一步详细说明，但不应理解为本发明的发明内容仅限于以下实施例，凡基于本发明上述内容所做出的发明均属于本发明的范围。 

附图说明

图1花椒属植物提取物对血管内皮细胞物理性缺氧的保护作用 

其中图1A：正常组、图1B模型组、图1C实施例1组、图1D实施例2组、图1E实施例3组、图1F实施例4组、图1G实施例5组。 

图2花椒属植物提取物对神经细胞物理性缺氧的保护作用 

其中图2A：正常组、图2B模型组、图2C实施例1组、图2D实施例2组、图2E实施例3组、图2F实施例4组、图2G实施例5组。 

图3花椒多酚对PC12神经细胞6-OHDA损伤的保护作用 

其中图3A：正常组、图3B模型组、图3C实施例1组、图3D实施例2组、图3E实施例3组、图3F实施例4组、图3G实施例5组。 

图4RT-PCR检测花椒属植物提取物对SR-B I mRNA表达的影响 

其中，a为GAPDH；b为SR-B I。 

具体实施方式

实施例1花椒属植物提取物的制备 

取青椒(Z.schinifolium Sieb.et Zucc.)果皮1000g，用70％丙酮10L进行回流提取3次；提取液经真空浓缩至无丙酮味后上HPD500型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除掉糖分等杂质，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.10后用5倍量的95％乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕色粉末状花椒属植物提取物62g，经检测总多酚的重量百分含量为80％，其中ZP-CT-A的重量百分含量为15％。 

实施例2花椒属植物提取物的制备 

取竹叶椒(Z.armatum DC)果皮1000g，用20L水进行回流提取3次；提取液直接上D101型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除掉糖分等杂质，然后用20％丙酮洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.20后用4倍量的95％乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕褐色粉末状花椒属植物提取物92g，经检测总多酚的重量百分含量为50％，其中ZP-CT-A的重量百分含量为5％。 

实施例3花椒属植物提取物的制备 

取花椒(Z.bungeanum Maxim.)果皮1000g，用70％乙醇18L进行渗漉提取；提取液经真空浓缩至无乙醇味后上HP20型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除掉糖分等杂质，然后用60％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.15后用3倍量的95％乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕色粉末状花椒属植物提取物43g，经检测总多酚的重量百分含量为74％，其中ZP-CT-A的重量百分含量为12％。 

实施例4花椒属植物提取物的制备 

取椿叶花椒(Z.ailantholides Sieb.et Zucc.)果皮1000g，用40％乙醇5L进行回流提取3次；提取液经真空浓缩至无乙醇味后上AB-8型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除掉糖分等杂质，然后用40％丙酮洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.20后用5倍量的95％乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕色粉末状花椒属植物提取物52g，经检测总多酚的重量百分含量为65％，其中ZP-CT-A的重量百分含量为8％。 

实施例5花椒属植物提取物的制备 

取两面针(Z.nitidum(Roxb.)DC.)果皮1000g，用90％乙醇10L进行回流提取3次；提取液经真空浓缩至无乙醇味，补加适量水溶散均匀后上聚酰胺吸附树脂柱，先用水洗脱除掉非酚类杂质，然后用95％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.10后用4倍量的95％乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕色粉末状花椒属植物提取物66g，经检测总多酚的重量百分含量为66％，其中ZP-CT-A的重量百分含量为8％。 

总多酚和ZP-CT-A的含量测定方法： 

总多酚的含量测定主要参照《中国药典》(2005年版)附录X B进行，具体如下： 

磷钼钨酸试液的制备：在1000ml烧瓶中加入350ml水、50g钨酸钠(Na₂WO₄·2H₂O)、12.5g钼酸钠(Na₂MoO₄·2H₂O)、25ml 50％H₃PO₄水溶液、50ml浓盐酸，加几粒沸石，在电炉上加热回流10hr，再用50ml水洗出冷凝管上残留物，加入75g Li₂SO₄，再滴加几滴溴水，开口煮沸15min，颜色最终变为黄色，冷至室温定容到500ml。 

对照品溶液的制备：精密称取没食子酸对照品50mg置100ml色中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含没食子酸0.05mg)。 

标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，分别置25ml棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1ml，再分别加水11.5ml、11ml、10ml、9ml、8ml、7ml，用29％碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置30分钟，以相应的试剂为空白，以紫外-可见分光光度法，在760nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。 

样品溶液的制备：精密称取花椒多酚样品50mg置100ml棕色瓶中，加水溶解并稀释至刻度，精密量取5ml，置50ml棕色量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得(每1ml中含花椒属植物提取物0.05mg)。 

总酚测定：精密量取供试品溶液2ml，置25ml棕色量瓶中，照标准曲线的制备项下的方法，自“加入磷钼钨酸试液1ml”起，加水10ml，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量(mg)，计算，即得。 

ZP-CT-A的含量测定方法(HPLC法)： 

仪器：Waters 2690 HPLC，Waters-996二极管正列检测器；waters symmetryC-18色谱柱，4.6×250mm，5μm； 

条件：检测波长：λ＝280nm，流速：1.0mL/min，流动相：A：2％乙酸，B：乙腈；梯度洗脱条件： 

实施例6花椒多酚提取物的制备 

取野花椒(Z.simulans Hance)果皮1000g，用20％乙醇5L进行回流提取3次；提取液经真空浓缩至无乙醇味后上XAD-4型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除掉糖分等杂质，然后用40％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.20后用5倍量的乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕色粉末状花椒多酚提取物49g，经检测总多酚含量为62％，其中ZP-CT-A含量为6％。 

实施例7花椒多酚提取物的制备 

取勒欓(Z.avicennae(Lam.)DC.)果皮1000g，用20％丙酮5L进行回流提取3次；提取液经真空浓缩至无乙醇味后上HP-20型大孔吸附树脂柱，先用水洗脱除掉糖分等杂质，然后用20％乙醇洗脱，洗脱液浓缩至相对密度为1.20后用5倍量的乙醇进行沉淀，弃沉淀，上清液经真空浓缩、喷雾干燥，即得棕色粉末状花椒多酚提取物42g，经检测总多酚含量为51％，其中ZP-CT-A含量为5％。 

实施例8本发明花椒多酚类化合物的分离鉴定 

55g花椒属植物提取物(由实施例4制得)上Diaion HP-20层析柱(12×55cm，1000g)，依次用水、20％、40％、60％、80％、100％甲醇洗脱(各1500mL)；将40％甲醇洗脱部分(6.3g)上Toyopearl HW-40C层析柱(7×12cm，250g)，依次用10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％甲醇水溶液洗脱(各500mL)得到7段(FrC1-7)；将FrC2(0.3g)上MCI gel CHP-20P层析柱(4×9cm，25g)，依次用水、10％、20％、30％、100％甲醇洗脱(各50mL)，得到3-氧-咖啡酰奎宁酸(2)(26mg)和4-氧-咖啡酰奎宁酸(3)(7.6mg)；将FrC6(120mg)上MCI gel CHP-20P层析柱(1×20cm，10g)，依次用水、5％、10％、100％甲醇洗脱(各30mL)，得到原花青素B1(4)(16mg)；Diaion HP-20层析柱上60％甲醇洗脱部分(11g)上Toyopearl HW-40C层析柱(7×30cm，500g)，先后用70％乙醇水溶液、70％丙酮水溶液洗脱(各1000mL)，将其中70％乙醇洗脱部分(0.3g)上YMC gel ODS AQ 120-S50层析柱(4×9cm，25g)，依次用水、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、100％甲醇洗脱(各50mL)，从30％甲醇洗脱物中得到金丝桃苷(5)(31mg)，从70％丙酮水溶液洗脱部分中直接得到ZP-CT-A(1)(6.4g)。 

3-氧-咖啡酰奎宁酸(2)，C₁₆H₁₈O₉；mp 202-204℃；UVλ_max＝325，299，245nm；APCI MS，m/z 355[M+1]⁺；¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)：δ：1.95(1H，dd，J＝9，14Hz，H-6ax)，2.13(2H，m，H-2eq and 6eq)，2.20(1H，dd，J＝4，15Hz，H-2ax)，3.63(1H，dd，J＝3，9Hz，H-4)，4.14(1H，ddd，J＝3，9，9Hz，H-5)，5.34(1H，ddd，J＝3，3，4Hz，H-3)，6.30(1H，d，J＝16Hz，H-8′)，6.76(1H，d，J＝8Hz， H-5′)，6.93(1H，dd，J＝2，8Hz，H-6′)，7.04(1H，d，J＝2Hz，H-2′)，7.58(1H，d，J＝16Hz，H-7′)；¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)：δ：36.7(C-2)，41.5(C-6)，68.3(C-5)，73.0(C-3)，74.8(C-4)，75.4(C-1)，115.1(C-2′)，115.8(C-8′)，116.4(C-5′)，122.9(C-6′)，127.9(C-1′)，146.79(C-3′)，146.80(C-7′)，149.4(C-4′)，169.0(C-9′)，178.3(C-7).以上数据与文献报道的数据一致(Nobuji Nakatani，Shin-ichiKayano et al.Identification，quantitative determination，and antioxidativeactivities of chlorogenic acid isomers in Prune(Prunus domestica L.).J.Agric.Food Chem.2000；48：5512-5516)。 

4-氧-咖啡酰奎宁酸(3)，C₁₆H₁₈O₉；mp 203-205℃；UVλ_max＝326，300，245nm；APCI MS，m/z 355[M+1]⁺；¹H-NMR(600MHz，CD₃OD)：δ：2.00(1H，dd，J＝11，13Hz，H-6ax)，2.06(1H，ddd，J＝3，4，14Hz，H-2eq)，2.17(1H，dd，J＝4，14Hz，H-2ax)，2.20(1H，ddd，J＝3，5，13Hz，H-6eq)，4.27(1H，ddd，J＝4，9，11Hz，H-5)，4.28(1H，ddd，J＝3，3，4Hz，H-3)，4.79(1H，dd，J＝3，9Hz，H-4)，6.37(1H，d，J＝16Hz，H-8′)，6.77(1H，d，J＝8Hz，H-5′)，6.96(1H，dd，J＝2，8Hz，H-6′)，7.06(1H，d，J＝2Hz，H-2′)，7.65(1H，d，J＝16Hz，H-7′)；¹³C-NMR(150MHz，CD₃OD)：δ：38.4(C-2)，42.7(C-6)，65.5(C-5)，69.6(C-3)，76.6(C-1)，79.3(C-4)，115.1(C-2′)，115.4(C-8′)，116.5(C-5′)，123.0(C-6′)，127.8(C-1′)，146.8(C-3′)，147.1(C-7′)，149.6(C-4′)，169.0(C-9′)，177.3(C-7).以上数据与文献报道的数据一致(Nobuji Nakatani，Shin-ichi Kayano et al.Identification，quantitative determination，and antioxidative activities of chlorogenic acidisomers in Prune(Prunus domestica L.).J.Agric.Food Chem.2000；48：5512-5516)。 

原花青素B1(4)，C₃₀H₂₆O₁₂；白色无定型粉末，茴香醛-浓硫酸显桔黄色；[α]_D ²⁰：+14.0°(c 0.55，in MeOH)；APCI MS(positive)m/z 579[M+1]⁺；(negative)m/z 577[M-1]^-；¹H-NMR(CD₃OD)：δ：2.82(d，J＝15.0Hz)，2.92(dd，J＝15.0，4.0Hz)，3.88(s)，4.30(s)，4.62(s)4.80(s)，5.79(d，J＝2.0Hz)，5.83(d，J＝2.0Hz)，5.89(d，J＝2.5Hz)，5.93(d，J＝2.5Hz)，6.61(d，J＝7.0Hz)，6.67(dd，J＝7.0Hz)，6.72(d，J＝2.0Hz)，6.79(d，J＝7.5Hz)，6.85(dd，J＝7.5，2.0Hz)，7.08(d，J＝2.0Hz).¹³C-NMR(CD₃OD)：δ：29.6，37.1，66.9，73.4，77.0，79.7，96.1，96.5，97.2，100.5，101.3，107.4，115.6-115.9，119.3，119.4，132.0，132.6，145.5-145.8，156.3-158.0.以上数据与文献报道的数据一致(R.S.Thompson，D.Jacques et al.，Plant proanthocyanidins.Part I.Introduction；the isolation，structure，and distribution in nature of plant procyanidins.J.Chem.Soc.，PerkinTrans.1，1972，1387-1399；张朝凤，孙启时等，乌药茎中鞣质类成分及其抗HIV-1整合酶活性研究.中国药学杂志.2003；38(12)：911-914)。 

金丝桃苷(5)，C₂₁H₂₀O₁₂；黄色颗粒状结晶，镁粉-盐酸反应显红色，三氯化铁反应显绿色，α-萘酚反应阳性；mp 232-233℃；[α]_D ²⁰：-83°(c 0.2，inpyridine)；UV λ_max＝363nm；¹H-NMR(DMSO-d₆)：δ：12.63(1H，s，OH-5)，10.86(1H，s，OH-7)，9.64(1H，s，OH-4′)，9.35(1H，s，OH-3′)，7.54(1H，d，J＝1.2Hz，H-2′)，7.46(1H，dd，J＝1.2，8.4Hz，H-6′)，6.84(1H，d，J＝8.4Hz，H-5′)，6.40(1H，d，J＝1Hz，H-8)，6.19(1H，d，J＝1Hz，H-6)，5.42(1H，d，J＝1.2Hz)，3.30-4.28(5H，糖环上质子)。以上数据与文献报道的数据一致(于德权，杨峻山.分析化学手册·核磁共振波谱分析[M].第2版.北京：化学工业出版社，1999：825；姚新生.天然药物化学[M].第2版.北京：人民卫生出版社，1998：102)。 

ZP-CT-A的结构确证： 

ZP-CT-A(1)，浅棕色粉末，¹³C-NMR[150MHz，Me₂CO-d₆-D₂O(7∶3)；40℃]：δ：26-39(C-4，C-3)，68-81(C-3，C-2)，95-112(C-4a，C-6，C-8)，113-122(C-2′，C-5′，C-6′)，128-134(C-1′)，143-147(C-3′，C-4′)，151-159(C-5，C-7，C-8a)；元素分析结果：C，54.37％；H，5.33％，接近C₁₅H₁₂O₆·2.5H₂O的计算值：C，54.06％；H，5.14％。 

ZP-CT-A的¹³C-NMR数据与文献报道的以儿茶素和/或表儿茶素为单元的多聚原花青素的相似(Czochanska，Z.，Foo，L.Y.et al.，Polymericproanthocyanidins：stereochemistry，structural units，and molecular weight.J.Chem.Soc.，Perkin Trans.1980；1：2278-2286)。 

高效体积排阻色谱法(HP-SEC)测定ZP-CT-A分子量：采用TSK gelSuperAW3000色谱柱(6.0×150mm；Tosoh)，流动相为N，N-二甲基甲酰胺(DMF)，其中含0.5％的3M甲酸铵(HCOONH₄)，柱温40℃，流速0.5mL/min，检测波长280nm，以表儿茶素、原花青素B1、桂皮鞣质A2为分子量计算的对照，由体积排阻色谱图计算ZP-CT-A的重均分子量(M_w)和数均分子量(M_n)(Bae，Y.S.，Foo，L.Y.et al.，GPC of natural procyanidinoligomers and polymers.Holzforschung，1994；48：4-6)，结果分别为M_w＝6.4×10³，M_n＝5.0×10³，由此可知ZP-CT-A为17-mer的多聚原花青素。 

ZP-CT-A聚合单元可进一步通过测定ZP-CT-A的硫解产物来确定： 

ZP-CT-A的硫解(采用含1-十二烷基硫醇的乙酸)：分别取10mgZP-CT-A、50μL 1-十二烷基硫醇、125μL乙酸和1.25mL乙醇于5mL玻璃安瓶中，混匀，用酒精喷灯封口，置于100℃水浴中反应6hr，反应产物用HPLC分析，具体方法如下： 

仪器：Waters 2690 HPLC，Waters-996二极管正列检测器；waters symmetryC-18色谱柱，4.6×250mm，5μm； 

条件：柱温：40℃，检测波长：λ＝280nm，流速：1.0mL/min，流动相：A：0.01M H₃PO₄-0.01M KH₂PO₄-CH₃CN(45.25∶45.25∶9.5)，B：0.01MH₃PO₄-0.01M KH₂PO₄-CH₃CN(15∶15∶70)；梯度洗脱条件：0-20min，100％ A，20-50min，100％B。 

HPLC分析结果表明，反应产物中含儿茶素、表儿茶素、儿茶素-4α-十二烷基硫醚(6)、表儿茶素-4β-十二烷基硫醚(7)，其中6、7是主要衍生产物。由相对于儿茶素的峰面积可确定6、7的摩尔比率为1∶5.1。 

100mg ZP-CT-A经上述方法降解后的反应混合物上Sephadex LH-20(Sephadex，Columbia，MD)层析柱，用[CHCl₃-EtOH(1∶1)→EtOH]梯度洗脱，再进一步用YMC A324色谱柱在半制备HPLC上进行纯化，可得到儿茶素-4α-十二烷基硫醚(6)(2.2mg)、表儿茶素-4β-十二烷基硫醚(7)(16.3mg)。 

儿茶素-4α-十二烷基硫醚(6)：浅棕色无定型粉末，ESI-MS：m/z：491(M+H)⁺.HR-ESI-MS m/z：491.2458(C₂₇H₃₈O₆S+H计算值为491.2467)。 ¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆)：δ：0.83(3H，t，J＝7Hz，H-12″)，1.25(16H，br，H-4″-H-11″)，1.36(2H，m，H-3″)，1.60(2H，m，H-2″)，2.73，2.84(1H，each，dt，J＝12，7Hz，H-1″)，4.04(1H，dd，J＝4，10Hz，H-3)，4.29(1H，d，J＝4Hz，H-4)，4.86(1H，d，J＝10Hz，H-2)，5.78，6.01(1H each，d，J＝2Hz，H-6，H-8)，6.75(2H，m，H-5′，H-6′)，6.88(1H，s，H-2′). 

表儿茶素-4β-十二烷基硫醚(7)，浅棕色无定型粉末，ESI-MS：m/z：491(M+H)⁺.HR-ESI-MS m/z：491.2446(C₂₇H₃₈O₆S+H计算值为491.2467)。 ¹H-NMR(600MHz，DMSO-d₆)：δ：0.81(3H，t，J＝7Hz，H-12″)，1.22(16H，br，H-4″-H-11″)，1.3-1.4(2H，m，H-3″)，1.62(2H，m，H-2″)，2.6-2.7(2H，m，H-1″)，3.93(2H，s，H-3，H-4)，5.22(1H，s，H-2)，5.86，5.95(1H each，d，J＝2.5Hz，H-6，H-8)，6.7-6.4(2H，m，H-5′，H-6′)，7.01(1H，br s，H-2′).¹³C NMR：δ：13.8(C-10″)， 23.0(C-9″)，28.5-32.4(C-1″-C-8″)，42.9(C-4)，71.2(C-3)，74.9(C-2)，95.1，96.3(C-6，C-8)，99.7(C-10)，114.8，115.1(C-2′，C-5′)，118.8(C-6′)，131.5(C-1′)，144.9，145.0(C-3′，C-4′)，156.5，158.0，158.4(C-5，C-7，C-9). 

综合上述分析可以确定ZP-CT-A(1)即为图示中的结构，其聚合单元主要为表儿茶素，末尾单元为儿茶素和表儿茶素(摩尔比率为1∶0.8)。 

实施例9片剂制备 

将本发明花椒属植物提取物100g(实施例1方法制得)，淀粉80g，糊精5g混合均匀，加入10％淀粉浆制软材，用14目尼龙筛网制粒，60-70℃通风干燥，16目筛整粒，加硬脂酸镁1.5g，羧甲基淀粉钠5g混匀，压制成1000片，包衣即得。每片含花椒属植物提取物100mg。成人口服每日2次，每次2片。 

实施例10胶囊制备 

取本发明花椒属植物提取物100g(实施例2方法制得)，加入淀粉78g，硬脂酸镁2g混匀，直接用全自动胶囊填充机填充成1000粒，抛光即得。成人口服每日2次，每次2粒。 

实施例11滴丸制备 

取本发明花椒属植物提取物10g(实施例3方法制得)，投入32g加热熔融的聚乙二醇6000中，搅拌至溶解，转移至贮液瓶中，密闭并保温在80-90℃，调节滴丸机液滴定量阀门，由上往下滴入10-15℃的液体石蜡中，共制1000粒，将形成的丸滴沥干并擦除液体石蜡，干燥即得。每粒含花椒属植物提取物10mg。成人口服每日3次，每次10-15粒。 

实施例12口服液制备 

取本发明花椒属植物提取物20g(实施例4方法制得)，与蜂蜜300g、蔗糖50g、苯甲酸钠2g及蒸馏水300ml混合，加热至85-90℃，搅拌使溶解，保温30min，滤过，滤液加水稀释至1000ml，搅匀，灌封(每支10ml)，灭菌即得。成人口服每日2次，每次1支。 

实施例13颗粒剂制备 

取本发明花椒属植物提取物10g(实施例5方法制得)、糊精20g、蔗糖100g及乙醇适量，混匀，过10目筛制成颗粒，于60-70℃干燥，整粒，分装即得，每包重5g，成人口服每日1次，每次1包。 

实施例14注射液制备 

取本发明花椒属植物提取物100g(实施例3方法制得)，加入注射用水适量使溶解，加配制量的0.02％的活性炭搅拌5-10min，过滤，滤液稀释至10升左右，加氯化钠调节渗透压至等渗，调节pH7.5-8.0，超滤，灌封成1000支(10mL/支)。100℃30min灭菌即得。成人静脉或肌肉注射给药，每日2 次，每次1支。 

实施例15粉针剂制备 

取本发明花椒属植物提取物100g(实施例1方法制得)，加注射用水及稀氢氧化钠适量使溶解，加配制量的0.02％的活性炭搅拌5-10min，滤过，滤液稀释至1升，调节pH6.5-7.8，超滤，喷雾干燥，干粉无菌分装即得。每支100mg，临用前加注射用水适量使溶解，用氯化钠输液250-500mL稀释后缓慢静脉滴注。成人每日2次，每次1支。 

下面以试验例的形式证明本发明的有益效果。 

试验例1花椒属植物提取物对中性内肽酶(NEP)的抑制作用 

NEP为目前已公认的抗高血压药物重要靶点，抑制其活性，可以有效的降低血压。以下实验证明，花椒属植物提取物具有抑制NEP的活性，从而可以降低血压。200μl反应体系中含适量中性内肽酶(从家兔肾组织中提取)、pH7.4 Tris-HCl缓冲液、ACE抑制剂Captopril(SIGMA)、APN抑制剂Bestatin(SIGMA)和样品，同时设立空白对照(不含酶和样品)和阴性对照(不含样品)，37℃反应30min，加入中性内肽酶底物DAGNPG(SIGMA)溶液，37℃再反应60min，测定荧光强度F，激发波长355nm，发射波长560nm。根据荧光强度F值计算抑制率，抑制率＝[1-(F样品-F空白)/(F阴性-F空白)]×100％。结果显示花椒属植物提取物对NEP均有抑制作用.实施例1-5制备的花椒属植物提取物对NEP的IC₅₀分别为：90μg/ml，112μg/ml，96μg/ml，107μg/ml，101μg/ml。 

试验例2花椒属植物提取物对血管内皮细胞物理性缺氧的保护作用。 

培养人血管内皮细胞株Eahy926细胞，接种细胞至96孔板中，培养过夜，吸弃培养基，正常对照组加入Glucose-Hanks，37℃，CO₂孵箱过夜培养；缺氧模型组加入Hanks，药物处理组加入Hanks和花椒多酚(50μg/ml)，二者均放入密闭盒中，通95％N₂，5％CO₂，持续5分钟(5L/min)后，37℃培养过夜。然后以MTT法测定细胞密度，计算药物对损伤的抑制率，抑制率＝(药物组-模型组)/(正常组-模型组)。结果(表1、图1)表明，实施例1-5制备的花椒属植物提取物对Eahy926血管内皮细胞物理性缺氧所致损伤均有保护作用，各药物组与模型组相比均有统计学差异(P＜0.05)。 

表1花椒属植物提取物对血管内皮细胞物理性缺氧的保护作用。 

组别	浓度(μg/ml)	细胞密度  (OD值)	损伤抑制率  (％)
				正常组		0.422±0.011	/
模型组		0.179±0.039**	/
				实施例1花椒多酚	50	0.337±0.008△	65.02±6.03
实施例2花椒多酚	50	0.275±0.01△	39.55±4.44
				实施例3花椒多酚	50	0.318±0.004△	57.20±5.66
实施例4花椒多酚	50	0.282±0.022△	42.66±4.75
				实施例5花椒多酚	50	0.300±0.032△	49.91±4.89

注：^**表示与正常组比较P＜0.01；^△表示与模型组比较P＜0.05。 

试验例3花椒属植物提取物对神经细胞物理性缺氧的保护作用。 

培养鼠嗜铬细胞瘤神经细胞株PC12细胞，接种细胞至96孔板中，培养过夜，吸弃培养基，正常对照组加入Glucose-Hanks，37℃，CO₂孵箱过夜培养；缺氧模型组加入Hanks，药物处理组加入Hanks和花椒多酚(50μg/ml)，二者均放入密闭盒中，通95％N₂，5％CO₂，持续5分钟(5L/min)后，37℃培养过夜。然后以SRB法测定细胞密度，计算药物对损伤的抑制率，抑制率＝(药物组-模型组)/(正常组-模型组)。结果(表2和图2)表明，实施例1-5制备的花椒属植物提取物对PC12神经细胞物理性缺氧所致损伤均有保护作用，各药物组与模型组相比均有统计学差异(P＜0.05) 

表2花椒属植物提取物对神经细胞物理性缺氧的保护作用 

组别	浓度(μg/ml)	细胞密度  (OD值)	损伤抑制率  (％)
				正常组		0.251±0.006	/15
模型组		0.124±0.002*	/
				实施例1花椒多酚	50	0.212±0.01△	69.44±6.03
实施例2花椒多酚	50	0.166±0.008△	33.41±3.23
				实施例3花椒多酚	50	0.195±0.004△	56.03±6.66
实施例4花椒多酚	50	0.179±0.022△	43.91±3.75
				实施例5花椒多酚	50	0.184±0.018△	47.29±3.89

注：^*表示与正常组比较P＜0.05，^△表示与模型组比较P＜0.05。 

试验例4花椒属植物提取物对神经细胞6-OHDA损伤的保护作用 

培养鼠嗜铬细胞瘤神经细胞株PC12细胞，接种至96孔板，培养过夜，吸弃培养基，进行6-OHDA损伤实验。以加正常培养基组为正常对照，以含60uM 6-OHDA为模型组，药物组各孔为60uM 6-OHDA+花椒属植物提取物(50μg/ml)，37℃孵育过夜，以SRB法测定细胞密度，计算药物对细胞损 伤的抑制率，抑制率＝(药物组-模型组)/(正常组-模型组)。结果如表3和图3所示，可见，实施例1-5制备的花椒属植物提取物对PC12神经细胞6-OHDA所致损伤均有明显的保护作用，各药物组与模型组相比均有统计学差异(P＜0.05)。 

表3花椒多酚对PC12神经细胞6-OHDA损伤的保护作用 

组别	浓度(μg/ml)	细胞密度(OD值)	损伤抑制率(％)
				正常组		0.274±0.009	/
模型组		0.172±0.008**	/
				实施例1花椒多酚	50	0.239±0.006△	66.47±4.63
实施例2花椒多酚	50	0.210±0.007△	37.32±3.40
				实施例3花椒多酚	50	0.231±0.002△	57.37±6.80
实施例4花椒多酚	50	0.219±0.021△	46.09±4.45
				实施例5花椒多酚	50	0.222±0.01△	49.36±3.49

注：^**表示与正常组比较P＜0.01；^△表示与模型组比较P＜0.05。 

试验例5花椒属植物提取物增加肝细胞高密度脂蛋白受体SR-B I表达 

目前已知SR-B I是治疗高血脂和动脉粥样硬化药物作用的重要靶点，促进其表达可以升高血液中的高密度脂蛋白，降低血液粘度。以下实验证明花椒多酚可以促进SR-B I表达，从而可以高血脂和治疗动脉粥样硬化。培养HepG2肝癌细胞，加入100μg/mL实施例2制备的竹叶椒多酚提取物，作用24hr，应用半定量RT-PCR检测高密度脂蛋白受体的表达。琼脂糖凝胶电泳拍照(如图4)后应用KODAK 1D软件分析，根据SR-B I目的条带和内参照GAPDH的光密度(OD)值，以SR-B I/GAPDH的相对比值表示SR-BI表达量，结果，空白组和给药组比值分别为：0.47、0.64，说明该花椒属植物提取物可以增强高密度脂蛋白受体SR-B I mRNA的表达。 

试验例6花椒属植物提取物的抗凝血作用 

昆明种小鼠18-20g，随机分为正常组和实施例1-5提取物(60mg/kg)各组，花椒属植物提取物灌胃给药，给药时间为21天，分别在给药后10、14、21天以毛细管法检测动物的凝血时间。实验数据用T检验进行统计分析。结果如表3所示，从表3可以看出给药14天、21天后，各实施例提取物组凝血时间较正常组均有延长作用，且与正常组相比有统计学差异(P＜0.05)，说明各提取物均有抗凝血作用。 

表4各实施例花椒属植物提取物对正常小鼠凝血时间的影响 

注：与正常组比较，^*表示P＜0.05，^**表示P＜0.01。 

上述药效学试验说明，本发明花椒属植物提取物药效以总多酚和原花青素多聚体ZP-CT-A为指标进行限定，在总多酚含量为50～80％、原花青素多聚体ZP-CT-A在提取物中的重量百分含量为5％～15％时，具有确切的药效，尤其是总多酚重量百分比为65％～80％，原花青素多聚体ZP-CT-A在提取物中的重量百分含量为8％～15％时，有稳定的药效，且药效具有显著的统计学差异。 

上述药效学试验结果表明，本发明花椒属植物提取物能保护神经细胞免受缺氧损伤和6羟基多巴胺致损伤，保护血管内皮细胞免受缺氧损伤，抑制中性内肽酶活性、上调高密度脂蛋白受体SR-B I表达，且具有抗凝血作用，可以作为制备神经细胞保护剂、抗心肌缺血或脑缺血类药物、抗凝血剂、中性内肽酶抑制剂及抗高血脂类药物的一种新选择。 

Claims (7)

1.花椒属植物果皮提取物在制备保护神经细胞免受缺氧损伤和6羟基多巴胺致损伤，保护血管内皮细胞免受缺氧损伤，上调高密度脂蛋白受体SR-B

I表达、抗凝血剂、中性内肽酶抑制剂药物中的应用；

所述的花椒属植物果皮提取物的制备方法包括下列步骤：

a、提取：将花椒属植物的果皮用水或含水乙醇或含水丙酮提取，原料与提取液重量体积比为1∶5～20；

b、浓缩：将提取液经真空浓缩至无醇味或丙酮味；

c、大孔吸附树脂吸附、洗脱：将上述浓缩液加水溶散后上大孔吸附树脂柱或聚酰胺树脂，先用水洗脱，然后用20％-95％乙醇或丙酮洗脱；

d、醇沉：洗脱液浓缩后用3～5倍量的乙醇进行沉淀，弃沉淀；

e、浓缩、干燥：上清液浓缩、干燥，即得花椒属植物果皮提取物；

所述的花椒属植物果皮提取物是从花椒(Zanthoxylum bungeanum Maxim.)、青椒(Z.schinifolium Sieb.et Zucc.)、竹叶椒(Z.armatum DC)、野花椒(Z.simulans Hance)、勒欓(Z.avicennae(Lam.)DC.)、椿叶花椒(Z.ailantholides Sieb.et Zucc)、朵椒(Z.molle Rehd)、或两面针(Z.nitidum(Roxb.)DC.)的果皮中提取获得。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述果皮提取物中含有总多酚重量百分比为50％～80％。

3.根据权利要求2所述的用途，其特征在于：总多酚重量百分比为65％～80％。

4.根据权利要求2或3所述的用途，其特征在于：总多酚中含有原花青素多聚体ZP-CT-A，其中，原花青素多聚体ZP-CT-A在果皮提取物中的重量百分含量为5％～15％。

5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于：所述的原花青素多聚体ZP-CT-A在果皮提取物中的重量百分含量为8％～15％。

6.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：所述的药物是以有效量的花椒属植物果皮提取物为活性成分，加上药学上可接受的辅料或辅助性成分制备而成的药剂。

7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于其中所述的药剂为口服制剂、注射用制剂。 

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