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CN101473030A - 含有来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞的整容或整形组合物 - Google Patents

含有来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞的整容或整形组合物 Download PDF

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CN101473030A
CN101473030A CNA2007800223436A CN200780022343A CN101473030A CN 101473030 A CN101473030 A CN 101473030A CN A2007800223436 A CNA2007800223436 A CN A2007800223436A CN 200780022343 A CN200780022343 A CN 200780022343A CN 101473030 A CN101473030 A CN 101473030A
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RNL Bio Co Ltd
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Abstract

本发明涉及一种用于整容或整形外科手术的组合物及其制备方法，所述组合物含有来自人类脂肪组织的成人干细胞、成纤维细胞以及脂肪或脂肪细胞。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过下列方法制备：培养通过抽脂术得到的含有脂肪的悬浮液，然后收集含有附着在培养瓶表面上的来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞两者的细胞层，接着将脂肪细胞加入到收集的细胞层中。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物对于整容目的来说是有用的，诸如皮肤紧密度的提高，皱纹及松弛皮肤的改善，以及由整形外科手术降低的区域的恢复，而且对于新的乳房组织的形成也是有用的。

Description

含有来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞的整容或整形组合物
技术领域
本发明涉及一种用于整容或整形外科手术的组合物及其制备方法，所述组合物含有来自人类脂肪组织的成人干细胞、成纤维细胞以及脂肪或脂肪细胞(Adiopocyte)。
背景技术
干细胞指的是既具有自我复制能力又具有分化成至少两种细胞能力的细胞，其可被分为全能干细胞(totipotent stem cell)、多能干细胞(pluripotent stem cells)以及多塑性干细胞(multipotent stem cells)。
近来，发现脂肪组织是新的多塑性干细胞源(Cousin等人，BBRC.，301：1016，2003；Miranville等人，Circulation，110：349，2004；Gronthos等人，J.Cell Physiol.，189：54，2001；Seo等人，BBRC.，328：258，2005)。也就是说，报道了通过抽脂术得到的人类脂肪组织含有一组未分化的细胞，它们具有分化成脂肪形成细胞、成骨细胞、肌源细胞和成软骨细胞的能力(Zuk等人，Tissue Eng.，7：211，2001；Rodriguez等人，BBRC.，315：255，2004)。而且通过动物模型实验已经知道，来自脂肪组织的细胞具有再生肌肉和刺激分化成神经血管的能力。由于这种脂肪组织具有的优点在于其可以被大规模提取，其作为克服现有缺点的新的干细胞源已经引起瞩目。
到目前为止，已知的来自脂肪组织的干细胞包括能够分化成上皮细胞的人类脂肪来源的成人干细胞(Brzoska等人，BBRC，330：142，2005)，能够分化成成骨细胞和脂肪形成细胞的人类脂肪来源的成人干细胞(Cao等人，BBRC，332：370，2005)，能够分化成神经细胞的人类脂肪来源的成人干细胞(Safford等人，BBRC，294：371，2002)，能够分化成脂肪形成细胞的鼠脂肪来源的干细胞(Ogawa等人，BBRC，319：511，2004)，能够分化成成骨细胞和成软骨细胞的鼠脂肪来源的干细胞(Ogawa等人，BBRC，313：871，2004)，能够分化成成软骨细胞的人类脂肪来源的干细胞(Awad等人，Biomaterials，25：3211，2004)，能够分化成神经细胞的鼠脂肪来源的干细胞(Fujimura等人，BBRC，333：116，2005)，和能够分化成成骨细胞、成软骨细胞和神经细胞或者肌肉细胞的脂肪来源的干细胞(美国专利6,777,231)。
虽然到目前为止已经付出了许多努力将脂肪来源的干细胞用于医学领域包括治疗不可治愈性的疾病，但较少努力去尝试使用干细胞进行整容和整形外科手术。
因此，本发明的发明人付出了极大的努力在整容和整形外科手术领域(包括皱纹改善、松弛皮肤的保护及类似问题)中使用干细胞，通过培养通过抽脂术得到的含有脂肪细胞的悬浮液，收集含有成人干细胞和成纤维细胞的细胞层，并将它们与脂肪细胞混合来进行实验，并发现得到的组合物对于整容治疗和整形外科手术是有用的，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于整容或者整形外科手术的组合物及其制备方法，所述组合物含有来自人类脂肪组织的成人干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞。
为了实现上述目的，本发明提供一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法，所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的成人干细胞，(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞，所述方法包括下列步骤：(a)在培养瓶中培养通过抽脂术从人类脂肪组织得到的含有脂肪的悬浮液以收集含有来自脂肪的附着在培养瓶上的成人干细胞和成纤维细胞的细胞层；以及(b)将含有来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞的收集细胞层与脂肪或者脂肪细胞混合。
本发明还提供一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法，所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的成人干细胞，(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞，所述方法包括下列步骤：(a)通过在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培养基中培养人类脂肪组织来源的微粒制备来自脂肪的成人干细胞，以收集来自脂肪的干细胞和成纤维细胞；以及(b)将所选来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞与脂肪或者脂肪细胞混合。
此外，本发明提供一种用于整容或整形外科手术的组合物，所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的成人干细胞，(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞。
通过下列详细描述和所附的权利要求书，本发明的其他特征和实施方式将更加清楚。
附图说明
图1显示了附着在培养瓶上的细胞的图片，其中含有根据本发明的来自人类脂肪组织的多塑性干细胞、成纤维细胞以及类似物(原始放大倍数100×)。
图2示出了使用免疫染色在含有CORM-2的MEBM培养基中球形培养的(sphere-cultured)来自人类脂肪组织的多塑性干细胞中Nestin、Oct4、SH2、SH3/4的表达结果(原始放大倍数100×)。
图3显示了由根据本发明的来自人类脂肪组织的多塑性干细胞分化成的脂肪细胞的图片(A：分化状态的相差；和B：使用油红O染色法染色的脂肪细胞，原始放大倍数200×)。
具体实施方式
在一个方面，本发明涉及一种用于整容或整形外科手术的组合物，其含有来自人类脂肪组织的干细胞、成纤维细胞和脂肪或脂肪细胞。
根据本发明的组合物优选可被用于通过形成新的乳房组织的乳房增大或者皱纹去除，但不局限于这种目的。例如，其可通过微量脂注射和自体脂肪移植用于保持面部皮肤的紧致以及去除眉间的皱眉线和鼻唇沟的。理想的是在根据本发明的组合物中含有的来自人类脂肪组织的成人干细胞是自体来源细胞。
根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过培养通过抽脂术得到的来自人类脂肪组织的含有脂肪的悬浮液，并将得到的来自脂肪组织的成人干细胞和成纤维细胞与其他细胞或组织混合来制备。
在一种实施方式中，根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过下列步骤制备：(a)在培养瓶中培养通过抽脂术从人类脂肪组织得到的含有脂肪的悬浮液以收集含有来自脂肪的附着在培养瓶上的成人干细胞和成纤维细胞的细胞层；以及(b)将含有来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞的收集细胞层与脂肪或者脂肪细胞混合。
具体地，所述组合物通过下列方式制备：培养通过抽脂术得到的悬浮在生理盐水中的含有脂肪的悬浮液，并在洗涤附着在培养容器诸如培养瓶中的干细胞和成纤维细胞之后收集，在收集它们之前，使用生理盐水将它们洗涤1次以便除去上清液中残余的脂肪和血细胞，并胰蛋白酶化包括附着在底部的干细胞和成纤维细胞的细胞层，通过刮下细胞层直接收集被悬浮在少量生理盐水中的细胞，或者通过离心收集离心的细胞，接着将收集的细胞与脂肪混合。
在本发明中，成人干细胞优选为来自中胚层的细胞，来自中胚层的细胞优选为脂肪形成细胞。
在本发明中，成人干细胞优选在含有地塞米松、消炎痛、胰岛素和IBMX的a-MEM培养基中培养以分化成脂肪形成细胞。
在另一种实施方式中，根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物可通过下列步骤制备：(a)通过在含有N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)的培养基中培养人类脂肪组织来源的微粒制备来自脂肪的成人干细胞，以收集来自脂肪的干细胞和成纤维细胞；以及(b)将所选来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞与脂肪或者脂肪细胞混合。
抽脂术作为用于脂肪去除的整容或整形外科手术的技术，指的是通过真空泵或者真空注射器经由供体区域中的切口抽取脂肪。
在本发明中，对于脂肪或脂肪细胞来说，可以使用通过抽脂术附带从人类脂肪组织中获得的脂肪或脂肪细胞，但并不限于此。在本发明中，脂肪包括脂肪组织。
当脂肪被用作用于根据本发明的整容或整形外科手术的组合物时，优选每1ml脂肪组织含有1×104～1×107个来自于脂肪的干细胞和成纤维细胞，但是当使用脂肪细胞时，优选使用比来自脂肪的干细胞和成纤维细胞的总细胞数目多1-50倍的脂肪细胞。
此外，成纤维细胞是构成纤维连接组织的重要组分的细胞，也被称为纤维细胞。成纤维细胞的组织切片为扁平长条状，通常具有不规则膨胀。成纤维细胞具有含有线粒体、高尔基复合体、中心体、小的基体等的细胞质，但除它们之外不显示其他专一性分化。细胞核为染色弱的椭圆形并含磷。它们被命名为成纤维细胞是因为它们聚集在胶原纤维周围并被认为与胶原纤维的形成有关。在本发明中，成纤维细胞可通过将干细胞从脂肪组织中分离的步骤分离。
同时，从得到的来自人类脂肪组织的干细胞肉汤获得表达目标细胞表面抗原的多塑性干细胞包括使用具有分选功能的流式细胞计的方法(Int.Immunol.，10(3)：275，1998)，使用磁珠的方法以及使用抗体专一性识别多塑性干细胞的淘选法(panning method)(J.Immunol.，141(8)：2797，1998)。而且，从大量培养肉汤中得到多塑性干细胞的方法包括其中在细胞表面表达的抗体专一性识别分子(这里被称为“表面抗原”)被单独使用或者与柱结合使用的方法。
流式细胞计分选法包括水滴电荷法和细胞捕获法以及类似方法，专一性识别细胞表面上的抗原的抗体被荧光标记并且来自被标记抗原-抗体复合物的荧光强度被转换成电信号，从而对表达的抗原量进行定量。还能够通过将使用的荧光类型组合来分离表达多种表面抗原的细胞。可在这种情况下使用的荧光物质包括FITC(异硫氰酸酯)，PE(藻红蛋白)、APC(异藻青蛋白)、TR(Texas Red)、Cy3、CyChrome，Red 613，Red670，TRI-Color，Quantum Red等等。
使用流式细胞计的FACS法包括：其中上述干细胞肉汤被收集的方法，通过该方法通过诸如离心并直接对抗体进行染色分离细胞；以及其中细胞在合适的培养基中培养并增殖然后对抗体进行染色的方法。细胞的染色通过将识别表面抗原的初级抗体与靶细胞样品混合并将混合物在冰上培养30分钟到1小时来进行。当初级抗体被荧光标记后，细胞在洗涤后用流式细胞计分离。当初级抗体没有被荧光标记时，细胞与初级抗体反应并且将荧光标记的对初级抗体具有结合活性的第二抗体在洗涤后混合，并在冰水上培养30分钟到1小时。洗涤后，具有染色的初级抗体和第二抗体的细胞用流式细胞计分离。
由于具有提高皮肤紧致度，改善皱纹诸如鼻唇沟和眉间皱眉线以及松弛的皮肤的功能，并通过整形外科手术恢复凹陷区域，含有来自人类脂肪组织的成人干细胞、成纤维细胞和脂肪的本发明的组合物对于整容目的来说是有用的。此外，由于来自人类脂肪组织的成人干细胞可分化成脂肪细胞，根据本发明的组合物对于新的乳房组织形成而言是有用的。
实施例
此后，将通过实施例对本发明进行详细描述。但对本领域技术人员来说显而易见的是，这些实施例仅仅用于说明的目的，而不构成本发明的范围的限制。
实施例1：来自脂肪组织的多塑性成人干细胞的分离和用于整形外科手术的组合物的制备
制备实施例1
将悬浮在生理盐水中的通过抽脂术附带得到的含有脂肪细胞的悬浮液使用合适量的生理盐水均匀地再悬浮，并将足够量的再悬浮的悬浮液置于细胞培养瓶中或者摇瓶中静置或摇动培养。对于静置培养来说至少需要6-12小时。接着，附着在培养瓶表面上的细胞层(来自脂肪的MSC、成纤维细胞)通过用胰蛋白酶处理来收集(图1)。此时，悬浮在少量生理盐水中的细胞直接被收集以便使用，或者从生理盐水收集的细胞层在1000rpm下离心10分钟以便仅仅使用其中细胞层的体积应当被减小的情况下的沉淀小球。分离的细胞层含有成人干细胞和成纤维细胞。根据本发明的含有成人干细胞、成纤维细胞、脂肪和脂肪细胞的用于整容或整形外科手术的组合物通过将分离的细胞层与脂肪混合来制备。
制备实施例2
多塑性干细胞从人类脂肪组织分离并纯化。也就是说，将分离的人类脂肪组织用PBS洗涤3次然后精细切割。切割的组织以1：3的比例(脂肪组织：DMEM)在添加了1型胶原酶(1mg/ml)的DMEM-LG(低糖)培养基中在37℃下消化1小时。在用PBS洗涤被消化组织之后，在1000rpm下离心5分钟。吸去上清液，并用10％的FBS和DMEM-LG(低糖)以1：1的比例混合的混合液洗涤底部上残余的小球，接着以1000rpm再离心5分钟。得到的小球通过100μm网过滤以除去残渣并用PBS洗涤。得到的细胞在DMEM培养基(10％ FBS，2mM NAC，0.2mM抗坏血酸)中培养。一夜后，用PBS洗涤未附着的细胞，并在K-NAC培养基(角化细胞-SFM培养基+2mM NAC+0.2mM抗坏血酸+0.09mM钙+5ng/mlrEGF+50μg/ml BPE+5μg/ml胰岛素+74ng/ml氢化可的松)中培养附着的细胞，在培养过程中每两天更换一次培养基，从而得到来自人类脂肪组织多塑性干细胞和成纤维细胞。通过将得到的细胞与脂肪混合，制备了根据本发明含有成人干细胞、成纤维细胞和制成或者脂肪细胞的用于整容或整形外科手术的组合物。
实施例2：来自脂肪的多塑性干细胞的免疫特性
在实施例1中得到的来自脂肪组织的成人干细胞用PBS洗涤并用胰蛋白酶处理。处理的细胞被收集并在4℃下以1000rpm离心5分钟。在弃去上清液并且细胞用2％的溶于PBS中的FBS洗涤后，在4℃下以1000rpm离心5分钟。弃去上清，并且微粒用PBS悬浮使每个样品中含有1×105个细胞，之后在4℃下以1000rpm离心5分钟。弃去上清，并将细胞与150μl封闭液(5％的溶于PBS中的FBS)混合，并在4℃下以1000rpm离心5分钟再次弃去上清并将细胞与100μl封闭液(5％的溶于PBS中的FBS)混合以便将它们在4℃下培养30分钟。之后，将溶液在4℃下1000rpm离心5分钟并除去上清液，接着将150μl封闭液(5％的溶于PBS中的FBS)加入到混合孔中。将抗体(R-藻红蛋白结合的鼠抗人单克隆抗体)置入每个孔中并在4℃下培养30分钟。培养后，将它们在4℃下以1000rpm离心5分钟。除去上清液，并将细胞用PBS洗涤并在4℃下以1000rpm离心5分钟。再次除去上清液，将细胞用PBS洗涤并在4℃下以1000rpm离心5分钟。在弃去上清液之后，将细胞与200μlPBS混合并用1％多聚甲醛固定，最后使用流式细胞计进行分析。
表1：来自脂肪的干细胞的表面抗原的FACS分析
 
抗原 AD-MSCs
CD73 +
CD90 +
CD29 +
CD44 +
CD105 +
CD33 -
CD34 -
CD45 -
CD4 -
CD31 -
CD62p -
 
CD14 -
HLA-DR -
结果，如表1中所示，根据本发明的来自脂肪的成人干细胞显示对CD73的91％、对CD90的97％，对CD29的96％，对CD44的83％，以及对CD105的80％阳性应答。而且，对其他抗原的FACS分析的结果表明，本发明的干细胞显示对所有CD33，CD34，CD45，CD4，CD31，CD62p，CD14和HLA-DR的阴性免疫应答。
实施例3：来自脂肪组织的干细胞的免疫染色分析
将在实施例1中得到的来自脂肪组织的干细胞用PBS洗涤3次并用含有4％多聚甲醛的PBS固定30分钟。细胞用PBS洗涤3次并用含有0.1％Triton-X100渗透10分钟。在使用PBS洗涤3次后，将细胞用10％NGS培养1小时，然后用含有初级抗体的PBS培养过夜。将细胞再用PBS洗涤3次，并允许其在暗室中与第二抗体反应1小时。在用PBS洗涤3次之后，将细胞固定(mounted)。
结果，如图2所示，根据本发明的多塑性干细胞球体显示了对所有可被认为是未分化细胞的标记物的Oct4和作为间叶细胞干细胞的标记物的SH2(CD105)和SH3/4(CD73)的阳性应答。
实施例4：来自脂肪的多塑性干细胞分化成脂肪细胞
将在实施例1中得到的来自脂肪组织的多塑性成人干细胞在含有5％ FBS，1μM地塞米松，200μM消炎痛，10μg/ml胰岛素和0.5mM IBMX(3-异丁基-1-甲基黄嘌呤)的α-MEM培养基中培养两周，诱导脂肪形成分化，然后使用油红O染色法进行分析。结果，如图3所示，发现来自人类脂肪组织的多塑性干细胞分化成脂肪形成细胞。
实施例5：使用来自脂肪的多塑性干细胞的动物分析
使用老鼠检测由来自脂肪的干细胞保持脂肪组织量的能力。使用12只老鼠作为对照组，12只老鼠作为实验组。在实验组中将脂肪(1ml)+来自脂肪组织的多塑性干细胞和成纤维细胞(5×105/200μl盐)注射到头部真皮中，老鼠中不存在皮下脂肪组织，而将脂肪(1ml)+赋形剂(200μl盐)注射到对照组中。
注射15天后，通过鼠的头部切口分离脂肪组织，并测定脂肪组织的量。结果，在对照组中注射的脂肪量减少了31％，而在其中注射了通过实施例1制备的组合物的实验组中注射的脂肪量的45％得到保持。通过该结果发现，根据本发明的来自脂肪组织的干细胞和成纤维细胞具有减少由抽脂术产生的脂肪量降低的效果。
工业实用性
如上详细描述的那样，本发明具有提供一种用于整容或者整形外科手术的组合物的效果，所述组合物含有来自人类脂肪组织的成人干细胞、成纤维细胞和脂肪或者脂肪细胞。根据本发明的用于整容或整形外科手术的组合物不仅对于整容目的来说是有用的，诸如提高皮肤的紧致度，改善皱纹及松弛的皮肤，以及恢复通过整形外科手术降低的区域，而且对于新的乳房组织的形成也是有用的，因为来自人类脂肪组织的成人干细胞可分化成脂肪细胞。
虽然已经参照特定特征对本发明进行了详细描述，对本领域技术人员来说显而易见的是，该描述仅仅用于优选实施方式，而不是限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附的权利要求书及其等同物来限定。

Claims (6)

1、一种用于整容或整形外科手术的组合物，其含有(i)来自人类脂肪组织的成人干细胞，(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞。
2、根据权利要求1所述的组合物，其特征在于，组合物用于新的乳房组织的形成或者皱纹去除。
3、一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法，所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的成人干细胞，(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞，所述方法包括下列步骤：
(a)在培养瓶中培养通过抽脂术从人类脂肪组织得到的含有脂肪的悬浮液以收集含有来自脂肪的附着在培养瓶上的成人干细胞和成纤维细胞的细胞层；以及
(b)将含有来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞的收集细胞层与脂肪或者脂肪细胞混合。
4、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，成人干细胞是来自中胚层的细胞。
5、根据权利要求3所述的方法，其特征在于，来自脂肪的成人干细胞在含有地塞米松、消炎痛、胰岛素和IBMX的α-MEM培养基中培养。
6、一种制备用于整容或整形外科手术的组合物的方法，所述组合物含有(i)来自人类脂肪组织的成人干细胞，(ii)成纤维细胞以及(iii)脂肪或者脂肪细胞，所述方法包括下列步骤：
(a)通过在含有N-乙酰-L-半胱氨酸的培养基中培养人类脂肪组织来源的微粒制备来自脂肪的成人干细胞，然后收集来自脂肪的干细胞和成纤维细胞；以及
(b)将收集的来自脂肪的成人干细胞和成纤维细胞与脂肪或者脂肪细胞混合。
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