CN109234229B

CN109234229B - 从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物

Info

Publication number: CN109234229B
Application number: CN201811130277.0A
Authority: CN
Inventors: 王正; 肖海蓉
Original assignee: BOYALIFE Inc
Current assignee: BOYALIFE Inc
Priority date: 2018-09-27
Filing date: 2018-09-27
Publication date: 2020-07-31
Anticipated expiration: 2038-09-27
Also published as: CN109234229A

Abstract

本发明涉及从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物。所述方法包括以下步骤：胎盘用酒精消毒；从胎盘剥离出胎盘血管；剪成碎块，用PBS清洗，滤除残留血污，得到胎盘血管组织；加混合酶液消化；终止消化，过滤收集组织液；离心所得细胞沉淀为原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM‑F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者继续进行传代和/或所得间充质干细胞进行细胞鉴定和/或检测、冻存、建库等操作。本发明方法可以有效的提高从胎盘的血管分离间充质干细胞的效率。

Description

从胎盘血管分离间充质干细胞的方法和所用消化酶组合物

技术领域

本发明涉及从胎盘的血管中分离干细胞的方法，特别涉及从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，更特别的是涉及一种使用本发明所述独特配方的消化酶组合物从而从胎盘的血管分离间充质干细胞的方法。使用本发明方法可以有效的提高从胎盘的血管分离间充质干细胞的效率。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)例如人类的间充质干细胞最早是从骨髓中分离出来的，来源于中胚层的一类具有多向分化潜能和自我更新能力的组织干细胞，在体内和体外特定条件下具有向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞、肌细胞、肝细胞等多种成体细胞分化的能力(Caplan AI.Mesenchymal stem cells.JOrthop Res.1991,9:641-650.Pittenger MF,Mackay AM,Beck SC,et al.Multilineagepotential of adult human mesenchymal stem cells.Science.1999；284:143-147)。最新的研究表明间充质干细胞具有免疫调节和造血支持作用，而且易于外源基因导入表达。因此间充质干细胞不但是组织工程化骨、软骨和心肌构建中的种子细胞，基因治疗中重要的载体细胞，而且由于间充质干细胞促进造血重建和抑制移植物抗宿主反应功能，在造血干细胞移植和器官移植中具有广泛的应用前景。间充质干细胞具有体外贴壁生长的特性，利用这种特性，人们已经成功从肝脏、肾脏、胰腺、肌肉、软骨、皮肤、外周血等多种组织中分离培养出间充质干细胞。

目前所报道的间充质干细胞主要来源于骨髓，采用密度梯度离心法获得。虽然分离方法简便，但供者取髓需要经历一个比较痛苦的手术，并在取材过程中及取材后会有很高的感染机会；由于人体骨髓中MSC的含量极其稀少，每10⁵～10⁶个单个核细胞中大约只有1个，而且随着年龄的增加，骨髓中间充质干细胞的数量、增殖和分化能力均显著下降，使其在研究和应用尤其是临床应用中受到限制。起源于胚胎发育期胚外中胚层的胎盘是由间质、血管及滋养细胞组成，含有大量的间充质成分。最新的研究表明胎盘中含有丰富的干细胞，从胎盘中分离培养出这些多能干细胞将为实验研究和临床应用开辟一个崭新而丰富的来源。

现有的从胎盘中分离干细胞从而建立胎盘干细胞库的方法尚有诸多缺点，例如纯度不足、和/或数量不高，进而显示出这些方法尚不能满足人们的期待。例如CN101270349A(中国专利申请号200810061267.6，公开日2008年9月24日)公开的题为“胎盘间充质干细胞分离和体外扩增培养方法”的发明；CN101693884A(中国专利申请号200910117522.9，公开日2010年4月14日)公开的题为“一种从胎盘、脐带或脂肪组织中分离提取干细胞的方法”的发明；CN102146359A(中国专利申请号201110005964.1，公开日2011年8月10日)公开的题为“从胎盘中提取原始间充质干细胞及无血清扩增的方法”的发明。另外，中国专利申请号201210044648X公开了一种从胎盘中分离间充质干细胞的方法。这些方法在提取物的纯度和/或回收率方面是有待进一步改善的。

间充质干细胞作为成体干细胞的一种，来源于发育早期中胚层，因具有高度自我更新、免疫调控和多向分化潜能而备受关注。间充质干细胞广泛存在于全身各种组织中，特别是骨髓、脂肪组织、脐血。临床研究中的间充质干细胞主要来自骨髓。目前传统的方法是在全麻或椎管内麻醉下从骨髓中取得干细胞，但每毫升的骨髓中仅能获取100～1000集落生成单位的骨髓间充质干细胞，且必须经过体外扩增才能获得临床需要的细胞数目，此方法不仅价格昂贵，增加患者痛苦，而且需消耗较长的治疗时间，限制了骨髓间充质干细胞的临床应用前景。

2003年，Mitchell等首先证实了从脐带提取的间充质干细胞具有多向分化潜能，随后又有多名学者从脐带华通胶中分离到成纤维样细胞，并证实其具有自我更新增殖及多向分化潜能，命名为人脐带间充质干细(hUC-MSCs)。人脐带间充质干细是指存在于脐带中的间充质干细胞，脐带作为分娩废弃物，相比其它间充质干细胞，人脐带间充质干细具有亚全能分化潜能，其获取简单、来源丰富、培植过程也比其它干细胞快约一倍，生长均匀，具有很多作为种子细胞的优良特性，如增殖活性高、免疫原性低、无致瘤性等，来源充足，无伦理问题等的优势。人脐带间充质干细在再生医学和组织工程学中的潜力，已经引起了人们很大兴趣，与来自骨髓的MSCs相比，人脐带间充质干细具有优越性，人脐带表面为羊膜被覆上皮，其中包含两个动脉和一个静脉，脐带血管周围环绕着粘液样结缔组织(称为华通氏胶，WJ)。

脐带间充质干细胞的来源包括羊膜、羊膜下层、华通氏胶、脐带血管、脐带血管周围组织和脐血。目前临床上广泛应用的是华通氏胶来源的间充质干细胞。目前人脐带间充质干细胞的研究方面尚有缺陷。主要包括：(1)脐带采集后脐静、动脉血液凝固，加大脐带处理的难度，同时血细胞过多增加干细胞污染的机会；(2)组织贴壁法是将脐带切割为细小组织块直接贴附于培养基上，一般15天左右可获得原代细胞；这种方法的缺点在于，周期长；组织块易漂起，使其丧失了长出细胞的能力，减少了细胞数量，此外细胞纯度不足；(3)酶消化法多采用胶原酶与胰蛋白酶并用，虽然周期短，但是费用高，条件不易掌握，常温消化时间长则可能损伤细胞，消化时间短则液体粘稠，难以通过离心获得足够量细胞，而且增加了临床应用过程中动物源性蛋白引起过敏反应和交叉感染的安全风险。

近年脐带血管周干细胞因其高增殖活性、高克隆形成力和多向分化潜能，被认为是间充质干细胞的祖细胞，具有广泛的临床应用前景。2013年，Tsang WP等研究指出，CD146+的血管周细胞可作为骨再生的细胞来源。

CN105695401A(CN201610189133.7)公开了一种脐带动脉和静脉血管周干细胞的制备和保存方法，通过细胞培养液(DMEM低糖、10％胎牛血清、1％青链霉素双抗)进行培养，比普通的贴片法获得更高纯度的脐带血管周来源的间充质干细胞；不采用消化酶，避免了动物源性蛋白引起的过敏反应和交叉感染，而且非酶原消化法分离得到的脐带血管周干细胞比华通氏胶来源的间充质干细胞CD146阳性率更高。

人们期望有新的人间充质干细胞的来源，例如从胎盘的血管中分离得到间充质干细胞，然而现有技术尚未见从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法。因此本领域仍然期待能够成功的从胎盘的血管中分离间充质干细胞。

发明内容

本发明的目的是解决现有获取胎盘间充质干细胞资源的不足，提供一种实用、简单、高效的从胎盘的血管中分离间充质干细胞并任选地建立干细胞库的方法。同时，本发明的另一目的在于为上述从胎盘血管中分离间充质干细胞的方法提供一种消化酶组合物。本发明人发现采用特别的操作方法以及特别组方的消化酶组合物，所获得的细胞纯度高和/或细胞回收率高。本发明基于此发现而得以完成。

因此，本发明第一方面提供了从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；

(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；

(3)将血管剪碎成1～2mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；

(4)加混合酶液消化；

(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；

(6)离心得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基培养；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞进行细胞鉴定和/或检测(例如，包括但不限于，成脂、成骨和成软骨性、流式检测、HLA鉴定、细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型)；

(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

(11)建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中所述混合酶液是添加了混合酶的PBS缓冲液。即，所述混合酶液是以PBS缓冲液为配液介质，向其中补充添加相应种类和量的消化酶，甚至在此基础上还可添加其它物质。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中所述混合酶液中包含：0.1～0.3％例如0.2％胶原酶II、0.1～0.2％例如0.15％胶原酶IV、0.05～0.15％例如0.1％脱氧核糖核酸酶I。

根据本发明第一方面的方法，其中步骤(4)中加混合酶液消化0.5～2h，例如消化1h。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(6)中所述离心例如是以1000～2000rpm例如1500rpm离心3～7min例如5min。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(7)中接种密度为0.5～2x10^5/cm^2，例如接种密度为1x10^5/cm^2。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(7)中，所述完全培养基其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(7)中，所述培养是在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述细胞污染检测是利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(9)中，所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(10)中，所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(10)中，所述胎盘间充质干细胞存在于细胞冻存液中。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含50％低糖DMEM培养液、40％FBS、10％二甲基亚砜。

根据本发明第一方面的方法，在步骤(11)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

此外，在本发明第一方面方法中，获得了一种从胎盘血管分离得到的胎盘间充质干细胞。因此本发明第二方面提供了一种从胎盘血管分离得到的胎盘间充质干细胞。

根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其是根据本发明第一方面任一实施方案所述方法获得的。

根据本发明第二方面的胎盘间充质干细胞，其细胞纯度大于90％。在一个实施方案中，所述胎盘间充质干细胞经1代以上传代后，细胞纯度大于90％。

进一步，本发明第三方面提供了一种在从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，该含有组织消化酶的PBS缓冲液是在PBS缓冲液中添加选自下列的一种或多种消化酶：dispase、胰酶、脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、胶原酶II、胶原酶IV、透明质酸酶。在一个实施方案中，该消化酶组合物中包含下列的消化酶：脱氧核糖核酸酶I(DNase I)、胶原酶II、胶原酶IV。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有所述消化酶的PBS缓冲液。在一个实施方案中，含有所述消化酶的PBS缓冲液中包含：0.1～0.3％例如0.2％胶原酶II、0.1～0.2％例如0.15％胶原酶IV、0.05～0.15％例如0.1％脱氧核糖核酸酶I。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有所述消化酶的PBS缓冲液。在一个实施方案中，含有所述消化酶的PBS缓冲液中包含：0.2％胶原酶II、0.15％胶原酶IV、0.1％脱氧核糖核酸酶I。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，其中所述从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法，其包括以下步骤：

(1)将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；

(4)加混合酶液消化；

(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基培养；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

根据本发明第三方面的消化酶组合物，其中步骤(4)中所述混合酶液是添加了混合酶的PBS缓冲液。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，其中步骤(4)中所述混合酶液中包含：0.1～0.3％例如0.2％胶原酶II、0.1～0.2％例如0.15％胶原酶IV、0.05～0.15％例如0.1％脱氧核糖核酸酶I。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，其中步骤(4)中加混合酶液消化0.5～2h，例如消化1h。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(6)中所述离心例如是以1500rpm离心5min。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(7)中接种密度为0.5～2x10^5/cm^2，例如接种密度为1x10^5/cm^2。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(7)中，所述完全培养基其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF)。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(7)中，所述培养是在37℃、5％CO₂培养箱中进行培养。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(9)中，所述细胞活性检测是利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(9)中，所述细胞污染检测是利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。在一个实施方案中，所述细胞污染检测是利用病原学方法，检测细胞是否受到选自下列的一项或多项的感染：乙肝两对半、丙肝、艾滋病毒、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(9)中，所述遗传病检测是利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(9)中，所述HLA-ABC/DR配型是检测细胞HLA-ABC/DR表型。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(10)中，所述胎盘间充质干细胞是经程序降温过程冻存于液氮中。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(10)中，所述胎盘间充质干细胞存在于细胞冻存液中。在一个实施方案中，该细胞冻存液包含50％低糖DMEM培养液、40％FBS、10％二甲基亚砜。

根据本发明第三方面的消化酶组合物，在步骤(11)中，所述数据库中包括与所保存的细胞所有相关的数据，包括但不限于：细胞的生物学特性检测结果、多向分化潜能鉴定结果、细胞分子遗传学诊断结果、胎儿及其父母的详细资料。

下面对本发明作进一步的说明。本发明所引用的文献，以及该文献中所引用的文献，它们的全部内容通过引用并入本文。

在本发明中，本发明任一方面的任一技术方案中，其任一技术特征同样适用于本发明的任一方面的任一实施方案，只要它们不会引起矛盾，并且这种相互适用在必要时可以作适当的修改。

在本发明中，术语“胎盘间充质干细胞”是指来源于胎盘的间充质干细胞。因此在本发明中，特别是涉及本发明的语境中，术语“胎盘间充质干细胞”可以与“胎盘干细胞”、“干细胞”、“间充质干细胞”互换使用，除非另有明确指明。另外，本发明涉及的方法是从胎盘血管分离获得胎盘间充质干细胞，因此更具体地说，本发明胎盘间充质干细胞是指来源于胎盘血管的胎盘间充质干细胞。

在本发明中，术语“PBS缓冲液”或者“PBS”是指磷酸盐缓冲液。本领域技术人员熟知在本发明情形下使用的PBS的一般性配方和配制方法以及它们的一般性质例如pH值或pH范围，并且这些PBS缓冲液通常是可以通过商业途径获得的预配液(或预配粉)，例如用于本发明领域的PBS通常是pH7.4(±0.1)的商品化缓冲液，例如HyClone品牌的PBS缓冲液；本领域经典的应用时的PBS缓冲液组成中包括137mM氯化钠、2.7nM氯化钾和10mM磷酸根，在本发明中如未另外特别说明，所用PBS使用时的组成均为该组成。

在本发明中，术语“胎盘”是指新生儿胎盘，特别是指产后4小时之内的胎盘。

根据本发明任一方面的方法，其中所述混合酶液中还添加0.02～0.05％谷氨酸钠和0.05～0.1％海藻酸钠，例如所述混合酶液中包含：0.1～0.3％例如0.2％胶原酶II、0.1～0.2％例如0.15％胶原酶IV、0.05～0.15％例如0.1％脱氧核糖核酸酶I、0.02～0.05％例如0.03％谷氨酸钠和0.05～0.1％例如0.075％海藻酸钠。例如该混合酶液中含有约0.02％、约0.03％、约0.04％、或约0.05％的谷氨酸钠以及约0.05％、约0.06％、约0.075％、或约0.1％的海藻酸钠。已经出人意料的发现，向含有组织消化酶的PBS缓冲液中同时添加少量谷氨酸钠和海藻酸钠能够显著提高细胞收率，这将是具有极其重要意义的。这一提高细胞收率的试验是如下实现的。如下文实施例1～实施例3，其中步骤(3)所示量的胎盘血管组织得到步骤(6)所示数量的有核细胞，每1克胎盘血管组织能够收获1.93～2.10×10^7个有核细胞，此数据作为P0代细胞的收率，可以反映步骤(6)之前的操作过程的MSC制备效率；本发明人已经尝试在本发明实施例1方法步骤(4)中采用若干现有技术公开的消化酶配方替换本发明消化酶，结果P0代细胞收率均小于0.1×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织，远低于本发明收率，例如采用中国专利申请号201710454588.1之实施例1所用消化酶(含有0.1mg/mL dispase、0.25mg/mL胰酶、0.25mg/mL DNase I、1mg/mL胶原酶IV、1mg/mL透明质酸酶的PBS缓冲液)的P0代细胞收率均小于0.087×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织。尽管本发明上述混合消化酶已经获得了相当满意的收率，然而本领域技术人员仍然期待提高这种收率。在本发明的一个补充实例即补充实施例A中，分别参照实施例1～实施例3的方法，不同的仅是在混合酶液中补充添加0.03％谷氨酸钠和0.075％海藻酸钠，结果显示，三个补充实例中步骤(1)至步骤(6)的有核细胞收率分别为9.26×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、9.57×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、9.36×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织，表明在混合酶液中补充添加谷氨酸钠和海藻酸钠后能显著提高P0代细胞的收率。在本发明的一个补充实例即补充实施例B中，分别参照实施例1的方法，不同的仅是在混合酶液中补充添加0.02％谷氨酸钠/0.075％海藻酸钠组合、或者补充添加0.03％谷氨酸钠/0.1％海藻酸钠组合、或者补充添加0.04％谷氨酸钠/0.05％海藻酸钠组合、或者补充添加0.05％谷氨酸钠/0.06％海藻酸钠组合结果显示，四个补充实例中步骤(1)至步骤(6)的有核细胞收率分别为9.33×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、10.37×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、10.02×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、9.87×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织，表明在混合酶液中补充添加谷氨酸钠和海藻酸钠后能显著提高P0代细胞的收率。在本发明的一个补充实例即补充实施例C中，分别参照实施例1的方法，不同的仅是在混合酶液中补充添加0.03％谷氨酸钠、或者补充添加0.075％海藻酸钠、或者补充添加0.03％谷氨酸钠和0.075％甘露醇，结果显示，三个补充实例中步骤(1)至步骤(6)的有核细胞收率分别为1.86×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、1.94×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织、1.73×10^7个有核细胞/g胎盘血管组织，表明仅添加上述一种增补剂或者改用甘露醇不能有效提高P0代细胞的收率。

本发明公开了一种从胎盘血管中以高收率分离间充质干细胞的方法，并利用这种方法保存胎盘间充质干细胞并建立胎盘干细胞库。本发明的发明人在总结以往分离培养间充质干细胞的基础上，利用多种组织消化酶混合消化组织块，结合贴壁培养法，成功自胎盘的血管中分离得到大量间充质干细胞。本发明方法得到的间充质干细胞纯度高、数量多，具有与骨髓间充质干细胞相同的生物学特性，能向成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、内皮细胞、神经细胞等分化。由于胎盘中干细胞较成体干细胞幼稚，含量丰富，在临床上具有广泛的应用前景，我们运用常规的细胞冻存方法将来源于胎盘血管的胎盘间充质干细胞像脐血一样冻存起来，建立胎盘干细胞库，为以后干细胞的深入研究和临床治疗奠定基础。

由于脐血中含有丰富的造血干细胞，人们建立脐血库把脐血造血干细胞这一重要的生物资源储存起来，为多种血液系统疾病和免疫系统疾病提供一种治疗手段。同样胎盘间充质干细胞作为一种更加重要的干细胞资源，我们运用常规的细胞冻存方法将其冷冻在-196摄氏度的深低温液氮中长期保存，建立胎盘干细胞库，为日后的干细胞治疗保存种子。

本发明的目的是提供一种实用简单的从胎盘血管中以高收率分离获取间充质干细胞并建立胎盘干细胞库的方法，包括如下步骤：(1)在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；(3)将血管剪碎成约1.5mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；(4)加混合酶液(其中包含：0.2％胶原酶II、0.15％胶原酶IV、0.1％脱氧核糖核酸酶I，于PBS缓冲液中)消化1h；(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；(6)离心(以1500rpm离心5min)得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心(以1500rpm离心5min)，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基(其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF))培养(37℃、5％CO₂培养箱)；(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞。

本发明的目的是提供一种实用简单的从胎盘血管中以高收率分离获取间充质干细胞并建立胎盘干细胞库的方法，包括如下步骤：(1)在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；(3)将血管剪碎成1mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；(4)加混合酶液(其中包含：0.3％胶原酶II、0.1％胶原酶IV、0.15％脱氧核糖核酸酶I，于PBS缓冲液中)消化0.5h；(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；(6)离心(以1000rpm离心7min)得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心(以1000rpm离心7min)，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；(7)使细胞接种至T75培养瓶(接种密度为：2*10^5/cm^2)，添加完全培养基(其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF))培养(37℃、5％CO₂培养箱)；(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞。

本发明的目的是提供一种实用简单的从胎盘血管中以高收率分离获取间充质干细胞并建立胎盘干细胞库的方法，包括如下步骤：(1)在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；(2)从胎盘的脐带根处剥离出胎盘血管，用手术镊挤压血管以清除血污；(3)将血管剪碎成2mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；(4)加混合酶液(其中包含：0.1％胶原酶II、0.2％胶原酶IV、0.05％脱氧核糖核酸酶I，于PBS缓冲液中)消化2h；(5)添加血清终止消化，再用300目滤网过滤，收集组织液，PBS洗涤，合并清洗液；(6)离心(以2000rpm离心3min)得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心(以2000rpm离心3min)，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基(其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF))培养(37℃、5％CO₂培养箱)；(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞。

本发明操作简单，方便实用，能得从胎盘血管分离获得大量的胎盘间充质干细胞，这些胎盘间充质干细胞分化性能好，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、内皮细胞、神经细胞等细胞分化的能力。与现有方法的比较：目前MSC主要采用手术法抽取供者骨髓或灌流法分离胎盘，贴壁培养获得。该法分得细胞数量少，而且供者在取髓中和取髓后均有感染的可能。本发明成功自胎盘血管中分离获得大量纯度较高的间充质干细胞，并运用此法建立胎盘干细胞库来储备这种极具应用前景的干细胞。该法简便易行，且由于胎盘与脐血一样，细胞成份较幼稚，来源广泛，方便易得，因此本发明的方法在干细胞的临床应用上将具有广泛的前景。

附图说明

图1之A、B、C、D、E为流式细胞术鉴定MSC表面标志结果；其中，如图B、D、E所示，CD73、CD90、CD105阳性率均大于98％，如图C所示，CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR阳性率均小于2％。

具体实施方式

通过下面的实施例可以对本发明进行进一步的描述，然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细的描述。

实施例1、胎盘MSC的分离、传代培养、冻存

(1)在产后四小时之内，在无菌条件下将胎盘浸泡于75％酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；

(3)将血管剪碎成约1.5mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织(本实施例一个胎盘获得5.8g胎盘血管组织)；

(4)加混合酶液(其中包含：0.2％胶原酶II、0.15％胶原酶IV、0.1％脱氧核糖核酸酶I，于PBS缓冲液中)消化1h；

(6)离心(以1500rpm离心5min)得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心(以1500rpm离心5min)，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率(得到1.22×10^8左右的有核细胞数，活性在90％以上)；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶(接种密度为：1*10^5/cm^2)，添加完全培养基(其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF))培养(37℃、5％CO₂培养箱)；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上(通常10天左右即可)，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞(由此收获高达2.54×10^8数量的间充质干细胞，活性可达95％以上)。

然后如步骤(8)的方法继续进行传代至需要的代次。所得MSC进行后续实验例测定。

实施例2、胎盘MSC的分离、传代培养、冻存

(3)将血管剪碎成1mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织(本实施例一个胎盘获得5.5g胎盘血管组织)；

(4)加混合酶液(其中包含：0.3％胶原酶II、0.1％胶原酶IV、0.15％脱氧核糖核酸酶I，于PBS缓冲液中)消化0.5h；

(6)离心(以1000rpm离心7min)得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心(以1000rpm离心7min)，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率(得到1.06×10^8左右的有核细胞数，活性在90％以上)；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶(接种密度为：2*10^5/cm^2)，添加完全培养基(其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF))培养(37℃、5％CO₂培养箱)；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上(通常10天左右即可)，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞(由此收获高达2.18×10^8数量的间充质干细胞，活性可达95％以上)。

实施例3、胎盘MSC的分离、传代培养、冻存

(3)将血管剪碎成2mm^3碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织(本实施例一个胎盘获得4.7g胎盘血管组织)；

(4)加混合酶液(其中包含：0.1％胶原酶II、0.2％胶原酶IV、0.05％脱氧核糖核酸酶I，于PBS缓冲液中)消化2h；

(6)离心(以2000rpm离心3min)得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心(以2000rpm离心3min)，得到原始的胎盘间充质干细胞(P0代)，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率(得到0.93×10^8左右的有核细胞数，活性在90％以上)；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶(接种密度为：0.5*10^5/cm^2)，添加完全培养基(其组成为：DMEM-F12+15％FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(BFGF))培养(37℃、5％CO₂培养箱)；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80％以上(通常10天左右即可)，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞(由此收获高达1.83×10^8数量的间充质干细胞，活性可达95％以上)。

试验例1、胎盘MSC的生物学特性鉴定

通过实施例1的操作，可以：

针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞进行细胞鉴定和/或检测(例如，包括但不限于，成脂、成骨和成软骨性、流式检测、HLA鉴定、细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型)；

将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；和/或

建立包含以上信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与冻存细胞进行关联。

1、细胞生长及其形态学特点

通过实施例1的分离培养，胎盘单个核细胞培养72小时后在显微镜下可明显见到梭形贴壁细胞，10天左右会形成涡轮状细胞克隆，消化传代后会形成80％左右融合的贴壁层。培养过程中，发现这种细胞形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，易被胰酶消化，传代至15代以上，其形态及生长特点亦无明显改变。

2、流式细胞术鉴定MSC表面标志

通过实施例1的分离培养，分别取第0、1、3、6代细胞，流式细胞术检测细胞表面标志，动态观察培养过程中细胞表面标志的变化。消化收集细胞，计数后取8×10⁶个细胞，分装16管；PBS洗一次，1500rpm离心10min；弃上清，残留100～200μl，吹打混匀细胞；加入PE标记的CD14、CD29、CD31、CD34、CD44、CD54、CD73、CD80、CD86、CD166抗体以及FITC标记的CD45、CD105、HLA-ABC、HLA-DR、UEA-1抗体各10μl，并设一管为空白对照；在4℃下，避光反应30min；PBS洗一次，1500rpm离心10min；直接标记的细胞弃上清，加入200μl的PBS吹打混匀细胞，200μl的1％多聚甲醛固定，置4℃待测，3天内上流式细胞仪检测。

流式细胞仪检测细胞的表面标志，动态观察第0、1、3、6代的细胞，无明显改变。流式检测结果显示CD73、CD90、CD105阳性率均大于98％，CD11b、CD34、CD45、CD19、HLA-DR阳性率均小于2％，具体结果如图1。

3、流式细胞术检测胎盘MSC的细胞周期

通过实施例1的分离培养，细胞长至80％左右融合时，消化收集细胞约1×10⁶个，PBS洗一次，加入70％的乙醇固定，4℃待测。检测时，先离心去乙醇，再用PBS洗一次，加入RNase I 500u，37℃反应30min，PBS洗一次，加入碘化丙啶(PI，终浓度50μg/ml)1ml，室温避光反应20min，上机检测细胞DNA含量。结果显示体外培养的细胞具有典型的干细胞增殖特点，即只有少数细胞处于活跃的增殖期(<1.5％)，大部分的细胞处于静息期(>95％)。

4、胎盘MSC生长曲线的绘制及对数生长期倍增时间的测定

通过实施例1的分离培养，取对数生长期细胞，消化计数，以10％FBS的LG-DMEM培养基制成细胞悬液(2×10⁴/ml)，24孔板中每孔接种0.5ml，37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养。每天取3复孔，台盼蓝染色后计数活细胞数，计算平均值，连续观察7天。以培养时间为横轴，细胞数为纵轴，绘制细胞生长曲线。以Patterson公式计算细胞在对数生长期的倍增时间，即Td＝Tlg2/Lg(Nt/No)，Td：倍增时间(h)，T：细胞由No增至Nt所用的时间(h)，N：细胞数。通过每天细胞计数的结果绘制细胞生长曲线，计算倍增时间。由细胞生长曲线可以看出，细胞在第2-4天处于指数生长期。

5、胎盘MSC多向分化潜能的鉴定

(1)成骨诱导

通过实施例1的分离培养，3代以上MSC，按1×10⁵/孔接种六孔板，放于37℃、5％CO₂、饱和湿度下，MSC培养基中培养24h后，换用含10％经筛选FBS的DMEM-HG并加入地塞米松0.1μM、抗坏血酸磷酸盐50μM、β-磷酸甘油10mM，放于37℃、5％CO₂、在饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2-4周。碱性磷酸酶染色鉴定成骨细胞形成，Von Kossa染色鉴定骨结节形成。

在含10％经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松0.1μM、抗坏血酸磷酸盐50μM、β-磷酸甘油10mM培养1周，细胞形态发生明显的改变，由纺锤形的成纤维细胞样变为多角形，类似于神经元细胞样，细胞周边出现长丝状突出，并可向周围延伸。继续培养2周以上后，细胞基质中出现钙化斑，矿化物逐渐出现，并且开始形成多层小结结构，至培养4周后，可见明显钙化结节。2周时碱性磷酸酶染色呈强阳性反应，达到95％以上，而未加以诱导的对照组则大部分为阴性，只有不到5％显示为弱阳性，表明细胞已向成骨细胞转化。von Kossa染色可将骨结节中沉积的钙染成黑色，诱导组可见大量的黑色骨结节，有明显的立体结构，而对照组在任何时间都没有阳性反应。

(2)成脂肪诱导

通过实施例1的分离培养，3代以上MSC，按1×10⁵/孔接种于六孔板，放于37℃、5％CO₂、饱和湿度下，在MSC培养基中培养24h后，换用含10％经筛选FBS的高糖DMEM，并加入地塞米松1μM、消炎痛60μM、IBMX 0.5mM、胰岛素5μg/ml，放于37℃，5％CO₂，饱和湿度下培养，每3天半量换液，共诱导2周，油红染色鉴定脂滴形成。

在含10％经筛选FBS的DMEM-HG，加入地塞米松1μM、消炎痛200μM、IBMX 0.5mM、胰岛素10μg/ml培养3天，细胞即发生形态改变，由纺锤形的成纤维细胞样逐渐收缩变短，90％以上细胞成为立方形或多角形；连续培养7天，镜下可见细胞内有微小脂滴出现，随着培养时间的延长，脂滴逐渐增大并融合，至培养2周时，可见融合成团的脂滴充满整个细胞。油红O染色可见细胞内产生的脂肪被特异性染成红色。

(3)成软骨诱导

通过实施例1的分离培养，3代以上细胞，按照每管2×10⁵细胞分装到15ml聚丙烯离心管，低速离心使细胞在试管中形成微团，在含2.5％FBS的DMEM-HG中加入胰岛素、转铁蛋白、亚硒酸钠各6.25μg/ml，BSA 1.25μg/ml，丙酮酸钠1mM/L，抗坏血酸磷酸37.5μg/ml，TGF-β₁ 50ng/ml，放于37℃、5％CO₂、饱和湿度下培养，每3天半量换液，连续培养2周。

诱导2周后将细胞微团打散涂片，阿辛蓝(Alcian blue)染色可见II型胶原形成细胞外基质呈蓝色，对照组无蓝染。

6、RT-PCR检测胎盘MSC多向分化潜能

收集诱导后的细胞，应用Trizol试剂提取细胞总RNA，以之为模板进行RT-PCR，反转录以及PCR操作按照RT-PCR试剂盒说明书进行，引物名称、引物序列、PCR产物大小、特异性等如CN102676451A之[0086]～[0087]之表1所示。结果显示，体外诱导后细胞能表达系列特异性mRNA：成脂肪诱导后细胞表达PPAR-γ，成骨诱导后细胞表达骨桥蛋白(Osteopontin)，成软骨诱导后细胞表达胶原II(Collagen II)，说明所得到的MSC细胞具有成骨、成脂肪、成软骨分化能力，符合公认的MSC标准。

通过以上一系列数据指标的检测，显示出应用本发明方法分离得到的MSC，具有向成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞分化的能力，证实本发明方法获得的MSC具有干细胞特性。

实施例2和实施例3所得胎盘间充质干细胞亦照本试验例方法测定/处理，结果与实施例1细胞结果基本相同。

试验例2、胎盘干细胞库的建立

1、细胞活性的检测

利用台盼蓝染色法计数冻存前后活细胞的数目。

2、细胞污染的检测

利用少量细胞培养，检测细胞是否受到真菌和细菌的污染。利用病原学方法，检测细胞是否受到乙肝两对半、丙肝、艾滋、巨细胞病毒、EB病毒和梅毒、HbsAg、HbsAb、HBcAb、HbeAg、HbeAb、HCVAb、HIV-1/2Ab、CMV-IgM和EBV-IgA、TRUST感染。

3、遗传病的检测

利用分子遗传学的方法，检测冻存细胞是否存在遗传病。

4、HLA-ABC/DR配型

检测细胞HLA-ABC/DR表型，并记录在案。实施例1所得细胞的HLA检测结果如下表，显示MSC同脐血细胞一致。

HLA-A*	HLA-B*	HLA-DRB1*
			26:01，33:03	15:01，58:01	03:01，04:03

5、细胞来源的调查

记录胎儿及其父母的详细资料，并记录在案。

6、胎盘干细胞数据库的建立

在保存正常的胎盘干细胞后，建立胎盘干细胞的数据库，其中包括前六项资料，并建立与冻存细胞的关联。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

Claims

1.从胎盘的血管中分离间充质干细胞的方法，该方法包括以下步骤：

(1)将胎盘浸泡于75%酒精消毒30秒，然后用PBS冲洗两遍；

(3)将血管剪碎成1~2mm³碎块，用PBS清洗，再用300目滤网过滤去除残留血污，得到胎盘血管组织；

(4)加混合酶液消化；该混合酶液是添加了混合酶的PBS缓冲液，混合酶由以下三者组成：0.1~0.3%胶原酶II、0.1~0.2%胶原酶IV、0.05~0.15%脱氧核糖核酸酶I，该混合酶液中还包含0.02~0.05%谷氨酸钠和0.05~0.1%海藻酸钠；

(6)离心得到细胞沉淀，用PBS清洗一遍，离心，得到原始的胎盘间充质干细胞，用DMEM-F12基础培养基重悬，取样并计数有核细胞的数量和活率；所得细胞用冻存保护液冻存以便使用前再复苏培养，或者所得细胞接着进行下面步骤的操作；

(7)使细胞接种至T75培养瓶，添加完全培养基培养；

(8)培养过程中每3天换液一次，直至细胞融合率达80%以上，传代，得到P1代胎盘间充质干细胞；

以及任选的下列一个或多个步骤：

(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞进行细胞鉴定和检测；

(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存；

(11)建立包含以上步骤(9)细胞鉴定和检测的信息的胎盘干细胞的数据库，并使该数据库与步骤(10)的冻存细胞进行关联。

2.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中所述混合酶液中由以下三者组成： 0.2%胶原酶II、0.15%胶原酶IV、0.1%脱氧核糖核酸酶I。

3.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中加混合酶液消化0.5~2h。

4.根据权利要求1的方法，其中步骤(4)中加混合酶液消化1h。

5.根据权利要求1的方法，在步骤(6)中所述离心是以1000~2000rpm离心3~7min。

6.根据权利要求1的方法，在步骤(6)中所述离心是以1500rpm离心5min。

7.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中接种密度为0.5~2x10⁵/cm²。

8.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中接种密度为1x10⁵/cm²。

9.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，所述完全培养基其组成为：DMEM-F12+15% FBS+10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子。

10.根据权利要求1的方法，在步骤(7)中，所述培养是在37℃、5%CO₂培养箱中进行培养。

11.根据权利要求1的方法，所述混合酶液中还包含0.03%谷氨酸钠和0.075%海藻酸钠。

12.一种在从胎盘血管分离胎盘间充质干细胞的方法中使用的消化酶组合物，该消化酶组合物是含有组织消化酶的PBS缓冲液，所述消化酶由以下三者组成：0.1~0.3%胶原酶II、0.1~0.2%胶原酶IV、0.05~0.15%脱氧核糖核酸酶I；该消化酶组合物中还包含0.02~0.05%谷氨酸钠和0.05~0.1%海藻酸钠。

13.根据权利要求12的消化酶组合物，所述消化酶由以下三者组成：0.2%胶原酶II、0.15%胶原酶IV、0.1%脱氧核糖核酸酶I。

14.根据权利要求12的消化酶组合物，其中还包含0.03%谷氨酸钠和0.075%海藻酸钠。