CN101415451A - 在加大自体脂肪转移时使用来自脂肪组织的细胞的方法 - Google Patents

Abstract

描述了对患有像乳房加大、软组织缺陷和尿失禁那样的疾病的患者进行治疗的方法。该方法包括从患者身上将脂肪组织切除下来、处理脂肪组织的部分以得到被大致上隔离开来的可再生细胞的群体，将可再生细胞与脂肪组织的另一部分混合起来以形成组合物，并且将组合物给予从其身上将脂肪组织切除下来的患者。

Description

在加大自体脂肪转移时使用来自脂肪组织的细胞的方法

相关申请

本申请是于2002年12月9日提交的编号为10/316,127题目为“SYSTEMS AND METHODS FOR TREATING PATIENTS WITH PROCESSEDLIPOASPIRATE CELLS”的美国申请的部分继续申请，该美国申请要求于2001年12月7日提交的编号为60/338,856的美国临时申请的优先权。本申请也要求于2003年6月18日提交的编号为60/479,418题目为“METHODS OF USING ADIPOSE TISSUE DERIVED CELLS INAUGMENTING AUTOLOGOUS FAT TRANSFER”的美国临时申请的优先权。所有前述申请的内容都通过参考清楚地在此结合。

发明背景

1.技术领域

本发明大体上涉及来自脂肪组织的细胞，并且更特别地，涉及来自脂肪的可再生细胞(例如干细胞和/或祖细胞)、使用来自脂肪的可再生细胞的方法、包含来自脂肪的可再生细胞的组合物和用于准备和使用来自脂肪的可再生细胞的用来加大脂肪转移的系统。

2.背景技术

脂肪转移是相对普通的美容、治疗和结构过程，该过程包括从一个部位获取脂肪组织(脂肪)并且在另一个部位重新植入(Coleman1995；Coleman 2001)。尽管脂肪转移主要是用于像面部褶皱、皱纹、麻点和起皮那样的小的美容问题，但在美容方面，脂肪转移也可以用来进行乳房加大和再造(Bircoll和Novack 1987；Dixon 1988)。使用脂肪转移措施，臀部的加大也已经进行过(Cardenas-Camarena，Lacouture等1999；de Pedroza 2000；Peren Gomez等2000)。

然而，现有的脂肪转移方法所关联的严重副作用包括感染(Castello，Barros等1999；Valdatta，Thione等2001)和可能妨碍乳房X线照相术和其它乳房成像特性的钙化和结疤(Huch，Kunzi等1998)。当前的脂肪转移方法也常常关联了不相容的移植，例如在其中，所植入的材料被全部地或部分地再吸收，或被疤痕组织取代(Eremia和Newman 2000)。例如，在进行加大乳房的乳房成形术时，使用脂肪组织经常导致组织的功能的丢失，这可以部分地归结于，所植入的脂肪组织在用于新血管形成和供给植入物所花费时间期间发生坏死(Saunders，Keller等1981；Eppley，Smith等1990；Nishimura，Hashimoto等2000)。类似地，就对软组织缺陷进行长期矫正而言，许多材料，包括自体脂肪，已经被使用，用于填充疤痕、皱纹和其它软组织缺陷(Coleman 2001；Mass和Denton 2001)。然而，像在上面所描述的那样，这些脂肪组织移植物也难免新血管形成的缺失和坏死。

自体脂肪转移也已经被应用在需要软组织填充物或支撑结构的非美容的临床设施内。一个例子是应激性尿失禁，在该情况下，所移植的脂肪旨在支撑尿道壁和泌尿括约肌结构(Palma，Riccetto等1997；Lee，Kung等2001)。然而，所移植的脂肪缺乏耐久性，这阻碍了对该技术的广泛接受。大便失禁是另一种括约肌病症，在该情况下，类似的措施已经被使用(Shafik 1995；Bemardi，Favetta等1998)。脂肪转移已经被应用在非美容的临床设施内的其它例子包括声带麻痹、声带萎缩、插管创伤和半喉切除术后缺陷和声带植入(Koufman1991；Mikaelian，Lowry等1991；Hsiung，Woo等2000；Perie，Ming等2002)、修复由照射导致的软组织缺陷(Jackson，Simman等2001)和战伤(Ghobadi，Zangeneh等1995)、腰部椎间盘外科手术(Bemsmann，Kramer等2001；Kanamori，Kawaguchi等2001)和修复在脚底足垫内的萎缩组织(Chairman 1994；Lauf，Freedman等1998)。这些措施都已经遇到在上面就美容应用而描述的问题。

许多团队已经着眼于以改善长期存活和保持的方式对移植物进行增补。一个团队已经报导了使用无血清细胞培养介质以在动物模型内提高移植物存活的结果(Ullmann，Hyams等，1998)，而其它团队已经显示了加大所转移的带有生长因子的组织可以在另一个模型系统内提高移植物存活能力(Eppley，Snyders等1992；Yuksel，Weinfeld等2000；Yuksel，Weinfeld等2000)。

不同的措施已经由Schoeller等人提出，在该措施内，脂肪细胞前体细胞被包埋在纤维蛋白胶内，然后被植入，希望细胞经历刮擦而存活下来并且产生新的脂肪组织(Schoeller，Lille等2001)。其他人已经使用了类似的措施，包括用这些细胞播种人造聚合物(Patrick，Chauvin等1999)。与这些措施相关联的问题是，该措施可能只带来脂肪组织(脂肪细胞)的一个组分，而由内源性机制产生新血管(血管形成)。此外，如果前脂肪细胞的自我更新能力是有限的，那么它们就可能不能输送脂肪细胞的长期产物。

因此，需要对将脂肪组织给予患者的方法进行改进，其减小了与现有的方法相关联的问题。

发明内容

本发明至少部分地基于以下发现：本发明的来自脂肪的可再生细胞(例如内皮前体细胞)能够提供对血管形成的支持并且能够提供脉管内皮细胞和脂肪细胞的长期产物。因此，本发明提供了加大脂肪转移的方法，例如加大自体脂肪转移的方法。本发明也提供了用于在减少需要或不需要进行提取后操纵的情况下，以增加的产量、相容性和纯度从脂肪组织准备成熟的可再生细胞的迅速的并且可靠的设备、系统和方法。本发明还提供了用于使用来自脂肪组织的细胞的组合物、方法和系统，该细胞可能与完好的脂肪组织混合在一起并且与促进、产生或支持治疗、结构或美容益处所必需的添加剂一起直接放置到接受者体内。

在一个实施例中，根据本披露而准备的可再生细胞被准备好，随后与完好的(没有分解过的或没有处理过的)脂肪组织片段混合在一起，以形成组合物。这样，组合物就包括了由脂肪组织和可再生细胞组成的混合物。组合物可以植入到接受者体内，以提供自体软组织填充物，用于矫正轮廓缺陷(皱纹、“起皮”、麻点和较大的不足)或用于为像尿道那样的受到损害的结构提供支撑。在进行乳房加大过程的情况下和在软组织缺陷的情况下，组合物也可以用于乳房区域。

对脂肪组织的处理发生在维持封闭的、无菌的流体/组织路径的系统内。通过使用一套预先组装好的、联接起来的封闭的、无菌的容器和允许在封闭的路径内转移组织和流体成分的管路，这可以被实现。系统可以联接到处理设备，该处理设备可以自动地添加试剂、调整温度、设定处理时间安排，这样就使操作者不必对过程进行手动的管理。在优选实施例中，从组织提取通过处理并且放置到接受者体内的整个过程都在同一个设施内进行，实际上，甚至在接受该过程的患者的同一个房间内进行。

在某些实施例中，对患者进行治疗的方法包括以下步骤：a)提供组织切除系统；b)使用组织切除系统，将脂肪组织从患者身上切除下来，脂肪组织具有一定浓度的可再生细胞；c)至少对部分脂肪组织进行处理，以得到不同于在处理之前脂肪组织的可再生细胞的浓度的一定浓度的可再生细胞；和d)在将可再生细胞给予患者之前，不将可再生细胞从组织切除系统切除下来的情况下，将可再生细胞给予患者，由此对患者进行治疗。

在其它实施例中，对患者进行治疗的方法包括以下步骤：a)提供脂肪组织切除系统；b)使用脂肪组织切除系统，将脂肪组织从患者身上切除下来，脂肪组织具有一定浓度的可再生细胞；c)对脂肪组织进行处理，以提高在脂肪组织内的可再生细胞的浓度；d)将具有浓缩了的可再生细胞的脂肪组织与另一个脂肪组织单元部分混合起来；和e)将带有浓度提高的可再生细胞的脂肪组织给予患者，由此对患者进行治疗。

在特别实施例中，对患者的软组织缺陷进行治疗。在其它实施例中，对患者的乳房进行治疗。在另外的实施例中，对患者的尿失禁进行治疗。在这里所披露的治疗方法可以用于治疗任何需要进行自体的和非自体的脂肪转移的美容病症或非美容病症。

在优选实施例中，用于对患者进行治疗的可再生细胞是干细胞或祖细胞。在其它实施例中，可再生细胞是内皮祖细胞。在另外的实施例中，可再生细胞是像在这里所描述的那样的任何可再生细胞群体。此外，在本发明所包括的治疗方法中所使用的可再生细胞群体可以是同源的或异源的细胞群体。

根据本发明的又一个方面，可再生细胞与其它细胞、组织、组织片段或其它细胞生长和/或分化的刺激物质一起放置到接受者体内，例如，可再生细胞可以与像血管形成或动脉形成生长因子那样的生长因子和/或细胞活素组合起来。可再生细胞也可以与免疫抑制药物组合起来。在使用本发明的系统和方法，对可再生细胞进行浓缩期间或在此之后，这些添加剂可以被给予。在本发明的又一个方面内，在放置到接受者体内之前，可再生细胞被引导到像植入材料、外科手术设备、细胞培养设备或纯化设备那样的其它目标。在优选实施例中，在进行单一操作过程的情况下带有任何上述添加剂的细胞放置到它们从其得到的人体内，旨在使接受者得到治疗、结构或美容益处。

在这里所描述的任何特点或特点的组合被包括在本发明的范围内，只要在任何这样的组合内所包括的特点不是相互不容的，如从上下文、本说明书和本领域的一个普通技术人员是显而易见的。在接下来的详细描述中，本发明的额外的优点和方面是显而易见的。

附图说明

图1是用于从组织分离可再生细胞的包括一个过滤器组件的系统的示图。

图2是类似于图1的具有多个以串联构造的过滤器组件的系统的示图。

图3是类似于图1的具有多个以并联构造的过滤器组件的系统的示图。

图4是用于从组织分离可再生细胞的包括离心腔的系统的示图。

图5是包括预先固定好的过滤器的在用于从组织分离可再生细胞的系统内使用的收集腔的截面图。

图6是用于从组织分离可再生细胞的使用渗滤过滤系统的系统的处理腔的截面图。

图7是用于分离可再生细胞的使用离心设备用于浓缩可再生细胞的系统的处理腔的截面图。

图8是图7的处理腔的另一幅截面图。

图9.1、9.2和9.3图示了与本发明的系统一起使用的淘洗构件。

图10是用于从组织分离可再生细胞的使用真空压力以使流体移动经过系统的系统的示图。真空系统可以通过将真空泵或真空源应用到系统的出口而被构建，使用由活栓、开口和夹子组成的系统以控制流动的方向和时间安排，真空系统可以被控制成以预定的速率拉动组织和流体经过系统。

图11是用于从组织分离可再生细胞的使用正压以使流体移动经过系统的系统的示图。正压系统使用像蠕动泵那样的机械装置，使用阀门、活栓、开口和夹子以控制流动的方向和时间安排，以推动或驱使流体和组织以预定的速率经过系统。

图12A图示了流体的注入流切向地流动到过滤器的孔的过滤过程。图12B图示了流体的注入流垂直地流动到过滤器的孔的过滤过程。

图13是示范性的用于本发明的系统的一次性套件的示图。

图14是示范性的可再次使用的用于本发明的系统的构件的示图。

图15是使用类似于图13的一次性套件和类似于图14的可再次使用的构件组装起来的本发明的示范性的设备的示图。

图16A和16B描绘了通过所培养的来自脂肪的干细胞的VEGF(5A)和PIGF(5B)蛋白质的表达。

图17描绘了对在来自脂肪的干细胞群体内的内皮祖细胞的检测。

图18A和18B描绘了在正常小鼠(7A)和用链脲霉素治疗的小鼠(7B)体内的脉管结构的体外发育。

图19描绘了与负控制相比在用来自脂肪的干细胞进行治疗的后肢缺血小鼠体内的血流的增加的平均恢复。

图20A和20B显示了增加来自脂肪的干细胞剂量改善了移植存活和血管形成(20A)，并且在组织样本中描绘了脂肪组织体系的保持(20B)。

具体实施方式

本发明提供了使用来自脂肪的可再生细胞(“ADC”)加大自体脂肪转移的方法。例如，本发明表明，本发明的来自脂肪的可再生细胞(1)表达血管形成生长因子和细胞活素，包括PIGF、VEGF、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化蛋白、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α和血栓形成素，(2)包括在血管形成时具有非常确实的功能的内皮祖细胞(EPC)，(3)在体外发育成血管，并且(4)支撑在体内存活下来的缺血组织。因此，例如通过在给予位点促进新血管形成，可再生细胞能够加大自体脂肪转移。

为了使本发明可以更容易地被理解，某些术语首先被定义。贯穿详细描述进行额外的定义。

像在这里所使用的那样，“可再生细胞”指代任何使用本发明的系统和方法而被得到的，引起或促成器官、组织、生理单元或系统的结构或功能的完全的或部分的再生、恢复或代替，由此提供治疗、结构或美容益处的细胞。可再生细胞的例子包括：ASC、内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、周皮细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、分化了的或去分化了的脂肪细胞、角化细胞、单能性的和多能性的祖细胞和前体细胞(和它们的后代)和淋巴细胞。

可再生细胞可以提供治疗、结构或美容益处的一个机制是通过将它们自己或它们的后代合并到新生的、现有的或修复的组织或组织组分内。例如，ASC和/或它们的后代可以合并到新生的骨头、肌肉、或其它结构组织或功能组织内，由此引起或促成治疗、结构或美容改善。类似地，内皮细胞或内皮前体或祖细胞和它们的后代可以合并到现有的、新生的、修复的或扩张的血管内，由此引起或促成治疗、结构或美容益处。

可再生细胞可以提供治疗、结构或美容益处的另一个机制是通过表达和/或分泌像生长因子那样的促进所给予的组织或组织组分的结构或功能的生成、保持、恢复和/或再生的分子。例如，可再生细胞可以表达和/或分泌使得组织或细胞的生长得以增强的分子，然后，该组织或细胞直接地或间接地参与结构或功能的改善。可再生细胞可以表达和/或分泌生长因子和细胞活素，例如包括脉管内皮生长因子(VEGF)、胎盘生长因子(P1GF)，和它们的同形物，其可以执行一个或多个接下来的功能：刺激新血管的发育，即促进血管形成；通过扩大已有的小血管的血液运输能力而改善对已有的小血管(旁系)的氧供给；诱导可再生细胞从远离损伤位点的位点的运动，由此加强该细胞向损伤位点的导引和迁移；刺激生长和/或促进在损伤位点内的细胞的存活，由此促进功能或结构的保持；输送带有抗凋亡性质的分子，由此减小细胞死亡和功能的永久性丢失的速率或可能性；并且与内源性可再生细胞和/或其它生理机制发生相互作用。

以像处在组织内的形式或使用本发明的系统和方法从组织提取出来的形式那样的“本来的”形式，可再生细胞可以被使用，或通过用生长因子或其它生物响应调节剂进行刺激或起动，通过基因转移(短暂的或稳定的转移)，通过基于物理性质(例如大小或密度)、对固相材料的粘附性的差异、细胞表面分子或细胞内分子的表达、细胞培养或其它体外或体内操纵、改变或分离而对生成的群体进行进一步的亚分离，像在这里所进一步描述的那样，可再生细胞可以被改变。可再生细胞也可以与其它细胞或像合成的或生物的架子、材料或设备那样的设备组合起来而被使用，该细胞或设备输送改变或增强细胞的有关特征的因子、药物、化学物质或其它制剂，像在这里所进一步描述的那样。

像在这里所使用的那样，“可再生细胞组合物”指代在组织，例如脂肪组织被洗涤并且被至少部分地分解之后，典型地处在一定体积的液体内的细胞的组合物。例如，本发明的可再生细胞组合物包括多种不同类型的可再生细胞，包括ASC、内皮细胞、内皮前体细胞、内皮祖细胞、巨噬细胞、纤维原细胞、周皮细胞、平滑肌细胞、前脂肪细胞、分化了的或去分化了的脂肪细胞、角化细胞、单能性的和多能性的祖细胞和前体细胞(和它们的后代)和淋巴细胞。可再生细胞组合物也可以包含像可能处在组织片段内的胶原质、残留的胶原酶或其它酶或在于这里所描述的组织分解过程中所使用的或由这里所描述的组织分解过程产生的制剂那样的一种或多种污染物。

像在这里所使用的那样，“可再生医学”指代由将可再生细胞直接地或间接地放置到对象体内而得到的任何治疗、结构或美容益处。像在这里所使用的那样，短语“脂肪转移”是可再生医学的一种形式，并且旨在包括过剩的脂肪细胞从身体的一个区域被切除下来，并且被重新植入到身体的另一个区域内的所有过程。脂肪转移包括自体的和非自体的脂肪转移。短语“自体脂肪转移”旨在包括脂肪切除和重新植入在同一个对象身上进行的所有过程。示范性的美容的脂肪转移过程包括脂肪移植到或植入到嘴唇、鼻唇(嘴到鼻子的褶皱)、皱纹和其它面部褶皱(在眼睛周围的、在眉毛之间的及在脸的其余部位上的凹陷)、眼袋、脸颊、下巴、颞部、乳房、大腿、小腿、臂、腹部、臀部及身体的任何其它区域。美容的脂肪转移过程可以与像面部植入、睑整形、眉毛拉皮、面部拉皮、颈部拉皮、肉毒毒素应用、化学脱皮和激光表面再造那样的其它美容的应用组合起来。非美容的脂肪转移过程包括植入物，以治疗括约肌病症，该植入物包括在胃食管括约肌、尿道括约肌和直肠括约肌内的脂肪植入物。脂肪转移过程也可以被用于治疗由创伤(例如辐射)或疾病引起的软组织缺陷(例如腹部疝)、半侧颅面矮小、声带损伤和腰椎病症。脂肪转移过程也可以被用于治疗与脂肪相关的疾病或病症，包括血脂异常、低脂联素血症、高脂质血症、脂肪萎缩和脂肪增生，但不局限于此。

像在这里所使用的那样，“干细胞”指代带有分化成多种其它细胞类型的潜力的多能性的可再生细胞，该多种其它细胞类型执行一个或多个特殊的功能并且具有自我更新的能力。在这里所披露的一些干细胞可以是多能的。

像在这里所使用的那样，“祖细胞”指代带有分化成多于一种细胞类型的潜力的多能性的可再生细胞。像在这里所使用的那样，“祖细胞”也指代带有只分化成单一的细胞类型的潜力的单能性的可再生细胞，该单一的细胞类型执行一个或多个特殊的功能并且具有有限的自我更新的能力或不具有自我更新的能力。特别地，像在这里所使用的那样，“内皮祖细胞”指代带有分化成脉管内皮细胞的潜力的多能性的或单能性的细胞。

像在这里所使用的那样，“前体细胞”指代带有分化成一种细胞类型的潜力的单能性的可再生细胞。前体细胞和它们的后代可以保留大量增殖的能力，例如在适当的条件下可以增殖的淋巴细胞和内皮细胞。

像在这里所使用的那样，术语“血管形成”指代从现有的脉管系统和组织生成新血管的过程(Folkman，1995)。短语“修复或再造”指代对现有的脉管系统进行重新形成。组织缺血的缓解决定性地有赖于血管形成。在缺血区域内，以及在缺血区域周围，新血管的自发生长提供了侧支循环，改善了血液流动，并且缓解了由缺血引起的症状。血管形成所调解的疾病和病症包括急性心肌梗死、缺血性心肌症、外周脉管疾病、缺血性中风、急性肾小管坏死、缺血性的伤口-包括AFT、脓血症、缺血性肠疾病、由糖尿病引起的视网膜病、神经病、肾病、vasculitidies、缺血性脑病、生理性勃起功能障碍、缺血性或创伤性脊髓损伤、多器官系统衰竭、缺血性牙龈疾病和与移植相关的缺血。

像在这里所使用的那样，术语“血管形成因子”或“血管形成蛋白质”指代任何已知的能够从现有的脉管系统促进新血管的生长(“血管形成”)的蛋白质、肽或其它制剂。用于在本发明中使用的合适的血管形成因子包括胎盘生长因子(Luttun等，2002)、巨噬细胞集群刺激因子(Aharinejad等，1995)、粒细胞巨噬细胞集群刺激因子(Buschmann等，2003)、脉管内皮生长因子(VEGF)-A、VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E(Mints等，2002)、neuropilin(Wang等，2003)、纤维原细胞生长因子(FGF)-1、FGF-2(bFGF)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6(Botta等，2000)、血管生长素1、血管生长素2(Sundberg等，2003)、促红细胞生成素(Ribatti等，2003)、BMP-2、BMP-4、BMP-7(Carano和Filvaroff，2003)、TGF-β(Xiong等，2002)、IGF-1(Shigematsu等，1999)、骨桥蛋白(Asou等，2001)、Pleiotropin(Beechen等，2000)、活化素(Lamouille等，2002)、内皮素-1(Bagnato和Spinella，2003)及其组合，但不局限于此。血管形成因子可以独立地发挥作用，或彼此组合在一起而发挥作用。当组合在一起的时候，血管形成因子也可以相互协同地发挥作用，由此，因子的组合效果大于各个因子分别起作用时的效果的总和。术语“血管形成因子”或“血管形成蛋白质”也包括了这样的因子的功能相似物。例如，功能相似物包括因子的功能部分。功能相似物也包括结合到因子的受体的抗独特型抗体，这样就模仿了因子的促进血管形成和/或组织再造的活性。在本领域中，用于生成该抗独特型抗体的方法是众所周知的，并且例如在WO 97/23510中，对该方法进行了描述，在这里通过参考，合并了该WO 97/23510的内容。

在本发明中所使用的血管形成因子可以从任何合适的来源产生或得到。例如，因子可以从它们的本来的来源纯化，或合成地产生或通过重组表达产生。作为蛋白质组合物，因子可以被给予患者。可选择地，以表达质粒编码因子的形式，因子可以被给予。在本领域中，合适的表达质粒的构造是众所周知的。例如，构建表达质粒的合适的载体包括腺病毒载体、逆转录酶病毒载体、与腺体相关联的病毒载体、RNA载体、脂质体、阳离子脂质、慢病毒载体和转位子。

像在这里所使用的那样，“干细胞数量”或“干细胞频率”指代在克隆形成检定中所观察到的集群的数量，在该克隆形成检定中，来自脂肪的细胞(ADC)以低细胞密度(<10,000细胞/格)平铺，并且在支持MSC生长的生长介质(例如增补了10％的胎牛血清、5％的马血清和抗菌/抗真菌剂的DMEM/F12介质)内生长起来。细胞生长两个星期，在此之后，培养物用苏木精染色，并且由多于50个细胞组成的集群被计数成CFU-F。干细胞频率被计算成在每100个平铺的有核的细胞中所观察到的CFU-F的数量(例如，在初始带有1,000个有核的ADC细胞的平板内计数的集群数量为15个，则干细胞频率为1.5％)。干细胞数量被计算成干细胞频率乘以所得到的有核的ADC细胞的总数量。从ADC细胞生长起来的高百分比(约100％)的CFU-F表达细胞表面分子CD 105，其也由来自骨髓的干细胞表达(Barry等，1999)。CD 105也由来自脂肪组织的干细胞表达(Zuk等，2002)。

像在这里所使用的那样，术语“脂肪组织”指代包括贮存脂肪的结缔组织的脂肪。脂肪组织包含多种可再生细胞类型，包括ASC、内皮祖细胞和内皮前体细胞。

像在这里所使用的那样，术语“脂肪组织单元”指代一定量的不连续的或可测量的脂肪组织。通过测定单元的重量和/或体积，脂肪组织单元可以被测量。基于在上面所确定的数据，当从患者身上切除下来的时候，处理过的脂肪组织单元具有至少0.1％的细胞组分是干细胞的细胞组分；即像在上面所测定的那样，它具有至少0.1％的干细胞频率。在这里就本披露而言，脂肪组织单元可以指代从患者身上切除下来的全部量的脂肪组织，或指代少于从患者身上切除下来的全部量的脂肪组织的一定量的脂肪组织。这样，脂肪组织单元就可以与另一个脂肪组织单元组合起来，以形成重量或体积为各个单元加和的脂肪组织单元。

像在这里所使用的那样，术语“部分”指代少于全部的一定量的材料。较小部分所指代的量是少于50％的，而较多部分所指代的量是多于50％的。这样，少于从患者身上切除下来的脂肪组织的全部量的脂肪组织单元就是所切除的脂肪组织的部分。

像在这里所使用的那样，术语“处理过的吸脂物质”指代已经处理过以将活性细胞组分(例如包含干细胞和祖细胞的组分)与成熟的脂肪细胞和结缔组织分开的脂肪组织。在这里，该部分被指代成“来自脂肪的细胞”或“ADC”。典型地，ADC指代由通过从脂肪组织洗涤和分离细胞而得到的可再生细胞组成的小球。典型地，通过对细胞的悬浮液进行离心从而使细胞聚集在离心腔或细胞浓缩器的底部，小球被得到。

像在这里所使用的那样，术语“给予”、“引入”、“输送”、“放置”和“移植”在这里可互换地被使用，并且指代通过至少部分地在想要的位点确定ADC的位置的方法或途径而将本发明的ADC放置到对象体内。通过任何适当的输送到在对象体内的想要的至少部分细胞或细胞组分保持存活的部位的途径，ADC可以被给予。在给予对象之后，细胞的存活期可以是像几小时那样短，例如24个小时，到几天，到像若干年那样长。

像在这里所使用的那样，术语“对象”包括温血动物、优选地是包括人的哺乳动物。在优选实施例中，对象是灵长类动物。在更加优选的实施例中，对象是人。

现在，将要对本发明的现在优选实施例做出详细的介绍，在附图中图示了该现在优选实施例的例子。无论在哪里可能的是，在附图和描述中，相同的或类似的参考数字被使用，以指代相同的或相似的部分。应该注意的是，附图的形式是简化的，并且附图的比例不是准确的。在这里，就所披露的东西而言，只是为了方便和明了，像顶部、底部、左、右、上、下、上面、之上、下面、之下、后、前那样的方向术语是相对于附图使用。该方向术语不应该被解释成以任何方式限制本发明的范围。

虽然所披露的东西在这里指代所图示的某些实施例，但应该理解的是，所提出的这些实施例是例子而不是限制。虽然所讨论的是示范性的例子，但接下来的详细描述的意图是被解释成覆盖实施例的所有像附加的权利要求书所限定的那样的可以落在本发明的主旨和范围内的改变、可选择的东西和等效的东西。本发明可以与多种在本领域中常规使用的细胞或组织分离技术一起被实施，并且在这里，只包括了理解本发明所必需的普遍实施的处理步骤。

像先前在这里所陈述的那样，可再生细胞，例如干细胞和祖细胞，可以从很多种组织获取。本发明的系统可以被用于所有这样的组织。然而，脂肪组织是可再生细胞的非常丰富的来源。因此，在这里所图示的本发明的使用脂肪组织作为可再生细胞的来源的系统是例子而不是限制。

通过本领域的普通技术人员所已知的任何方法，脂肪组织可以被得到。例如，通过吸脂(注射器辅助的或动力辅助的)或通过脂肪切除，例如通过抽吸辅助的脂肪整形、超声辅助的脂肪整形和切除性脂肪切除或其组合，脂肪组织可以从患者身上切除下来。为了对可再生细胞进行分离和浓缩，通过在这里所描述的本发明的系统，脂肪组织被切除、收集并且处理。所收集的组织的量基于许多因素，包括捐赠者的身体质量指标和年龄、可用于收集的时间、可接近的脂肪组织获取位点的可用性、伴随的和已有的药物和条件(例如抗凝血剂治疗)和所收集的组织的临床目的。例如，在每100毫升从瘦的个体身上提取出来的脂肪组织中的干细胞百分比大于在每100毫升从胖的捐赠者身上提取出来的脂肪组织中的干细胞百分比(表1)。这可能反应在胖的个体内的增加的脂肪内容物的稀释效果。因此，根据本发明的一个方面，与从较瘦的患者抽取的量相比，从超重的捐赠者身上得到较大的组织，这可能是人们所想要的。该意见也指示出本发明的使用不局限于带有大量脂肪组织的个体。

表1：身体质量指标对组织和细胞产量的影响

在脂肪组织被处理之后，所得到的可再生细胞大致上没有成熟的脂肪细胞和结缔组织。因此，本发明的系统产生了多种异源的来自脂肪的可以用于研究和/或治疗目的的可再生细胞。在优选实施例中，细胞适合于放置或重新注入在接受者的体内。在其它实施例中，细胞可以用于研究，例如细胞可以用于建立可以存活延长时间并且可以用于进一步研究的干细胞系或祖细胞系。

现在，将要对本发明的现在优选实施例做出详细的介绍，在附图中图示了该现在优选实施例的例子。无论在哪里可能的是，在附图和描述中，相同的或类似的参考数字被使用，以指代相同的或相似的部分。应该注意的是，附图的形式是简化的，并且附图的比例不是准确的。在这里，就所披露的东西而言，只是为了方便和明了，像顶部、底部、左、右、上、下、上面、之上、下面、之下、后、前、远侧和近侧那样的方向术语是相对于附图使用。该方向术语不应该被解释成以任何方式限制本发明的范围。

虽然所披露的东西在这里指代所图示的某些实施例，但应该理解的是，所提出的这些实施例是例子而不是限制。虽然所讨论的是示范性的例子，但接下来的详细描述的意图是被解释成覆盖实施例的所有像附加的权利要求书所限定的那样的可以落在本发明的主旨和范围内的改变、可选择的东西和等效的东西。本发明可以与多种在本领域中常规使用的医疗过程一起被实施。

现在参考附图，本发明的系统10大体上包括一个或多个组织收集腔20、处理腔30、废物腔40、输出腔50和样品腔60。多种腔经由一条或多条管道12而连结在一起，从而使包含生物材料的流体可以从一个腔到达另一个腔，同时维持了封闭的、无菌的流体/组织路径。管道可以包括刚性的或柔性的在这里被可互换地指代成管腔或管路的主体。在某些实施例中，管道的形式是柔性的管路，例如在临床设施内常规使用的聚乙烯管路。在其它实施例中，管路可以由硅树脂构建。所使用的柔性的管路应该能够经受住负压，以减小收缩的可能性。所使用的柔性的管路也应该能够经受住例如由可以在系统内使用的正排量泵产生的正压。

系统的所有腔可以包括一个或多个接受标准的IV、注射器和抽吸管路连接装置的端口，例如出口22端口或进口21端口。端口可以是像用橡胶隔膜封闭的注射器针进入端口51那样的密封的端口。入口端口可以通过管道而连结到一个或多个套管(未显示)。例如，组织进口端口21可以连结到集成的单一用途的吸脂套管，并且管道可以是柔性的管路。管道大体上被定位，以提供从系统的一个腔到另一个腔的流体通路。为此，例如，管道和端口可以连结到可以手动操作或自动操作的抽吸设备(未显示)。例如，抽吸设备可以是注射器或电动泵。抽吸设备应该能够提供足够的负压，以从患者身上吸取组织。大体上，本领域的普通技术人员，例如外科医生，所已知的任何合适的抽吸设备可以被使用。

管道12还可以包括一个或多个夹子(未显示)，以控制在系统的多种构件之间的材料的流动。对于通过有效地密封系统的不同区域而维持系统的无菌状态，夹子是有用的。可选择地，管道12可以包括一个或多个对经过系统的材料的流动进行控制的阀门14。在附图中，阀门14被标识成空白的圆圈。在优选实施例中，阀门可以是机电节流阀门。在另一个实施例中，阀门可以是气动阀门。在其它实施例中，阀门可以是液压阀门或机械阀门。优选地通过可以连结到杠杆的控制系统，该阀门被激活。杠杆可以手动地操纵，从而使杠杆被激活。在自动化的实施例中，控制系统可以连结到可以在预定的激活条件下激活阀门的杠杆及处理设备。在某些自动化的实施例中，阀门的激活可以部分地是自动化的，并且部分地受制于使用者的偏好，从而使过程可以被优化。在其它实施例中，某些阀门可以被手动地激活，而另一些阀门经过处理设备而被自动地激活。阀门14也可以与一个或多个泵，例如蠕动泵34或正排量泵(未显示)一起被使用。管道12和/或阀门14也可以包括传感器29，例如光学传感器、超声传感器、压力传感器或在本领域中已知的其它形式的能够辨别多种流动经过系统的流体组分和流体水平的监测器。在优选实施例中，传感器29可以是光学传感器。

系统也可以包括多个过滤器36。在某些实施例中，过滤器可以在系统的腔28内。在系统内的不同的腔可以包括不同的过滤器。对于将可再生细胞，例如干细胞和/或祖细胞，与不想要的细胞和根据系统而可以使用的分解剂分开，过滤器是有效的。在一个实施例中，过滤器组件36包括中空纤维过滤设备。在另一个实施例中，过滤器组件36包括可以与或可以不与沉淀过程一起使用的渗滤过滤设备。在再一个实施例中，过滤器组件36包括可以与或可以不与淘洗设备和过程一起使用的离心设备。在又一个实施例中，系统包括这些过滤设备的组合。本发明的过滤功能可以是双倍的，使得一些过滤器从最终浓缩物中去除像胶原质、游离脂质、游离脂肪细胞和残留的胶原酶那样的东西，并且其它过滤器用于浓缩最终的产物。系统的过滤器可以包括多个直径和/或长度为20微米到800微米的孔。在优选实施例中，收集腔20具有带有范围从80到400微米的多个孔的预先固定好的过滤器28。在另一个优选实施例中，收集腔20具有带有多个265微米的孔的预先固定好的过滤器28。在其它实施例中，过滤器可以是可拆卸的和/或是一次性的。

系统也可以包括一个或多个被定位以调整包含在系统的一个或多个腔内的材料的温度的温度控制设备(未显示)。温度控制设备可以是加热器、冷却器或加热-冷却器，即它可以能够在加热器和冷却器之间转换。温度设备可以调整任何通过系统的材料的温度，包括组织、分解剂、再悬浮剂、漂洗剂、洗涤剂或添加剂。例如，对脂肪组织进行加热有助于分解，而对于维持存活能力，冷却可再生细胞输出是所想要的。此外，如果需要将预先加热的试剂用于最佳的组织处理，那么温度设备的作用就应该是维持预定的温度，而不是升高或降低温度。

为了维持封闭的、无菌的流体/组织路径，所有端口和阀门可以包括维持系统的密封构造的封闭装置。封闭装置可以是流体、空气和其它污染物不可透过的膜，或它可以是任何其它合适的在本领域中已知的封闭装置。此外，系统的所有端口可以被设计为使它们可以容纳注射器、针或其它设备，用于在不破坏系统的无菌状态的情况下收回在腔内的材料。

像在这里所陈述的那样，经由任何技术被认可的方法，组织可以从患者身上提取出来。所吸取的组织经由像12a那样的管道而转移到收集腔20，在该收集腔20内，所吸取的组织被漂洗并且被煮解(digest)。典型地，所吸取的组织经由像用橡胶隔膜封闭的注射器针进入端口(在收集腔上未显示)那样的密封的进入端口而进入收集腔20。

收集腔20可以包括多个柔性的或刚性的罐或缸或其组合。例如，收集腔20可以包括一个或多个刚性的尺寸变化的罐。收集腔20也可以包括一个或多个柔性的袋。在该系统内，袋优选地配备了像内部框架或外部框架那样的支撑装置，该支撑装置有助于减小在对袋进行抽吸时袋发生收缩的可能性。收集腔20的尺寸被确定为保持需要量的盐水，以在于处理腔30内进行的过程的洗涤和浓缩阶段之前对组织进行适当的漂洗和煮解。优选地，对于肉眼，处于收集腔20内的组织或流体的体积是可容易地确定的。例如，合适的收集腔具有保持800毫升吸脂物质和1200毫升盐水的容量，以从脂肪组织分离并且浓缩可再生细胞。因此，在一个实施例中，收集腔20具有至少2升的容量。在另一个实施例中，收集腔20具有至少1.5升的容量，以从血液分离并且浓缩红细胞。大体上，收集腔20的尺寸基于从患者身上收集到的组织的类型和量而发生变化。收集腔20的尺寸可以被确定为保持像大约5毫升那样少的到大约2升的组织。对于较小的组织体积，例如5毫升到100毫升，组织可以在转移到收集腔20之前，被聚集在注射器内。

使用任何合适的生物相容的可以被消毒的材料，收集腔20可以被构建。在优选实施例中，收集腔20由一次性材料构建，该一次性材料满足像在ISO 10993标准中所描述的那样的对血管内接触的生物相容性要求。例如，聚碳酸酯丙烯酸或ABS可以被使用。收集腔20的流体路径优选地是没有热原的，即适合于血液使用而没有传播疾病的危险。在一个实施例中，收集腔20由允许使用者以视觉确定处于腔内的组织的大概体积的材料构建。在其它实施例中，通过自动化的传感器29，在收集腔20内的组织和/或流体的体积被确定。收集腔20优选地被设计为使自动化的系统可以以合理的精确程度确定在腔内的组织和/或流体的体积。在优选实施例中，系统以正负15％的精度感测在收集腔内的体积。

在只是作为例子而被提供的特别实施例中，收集腔20的形式是刚性的腔，例如是由医用级别的聚碳酸酯构建的腔，其包含由带有尺寸为265微米的网眼的医用级别的聚酯形成的粗略地为圆锥形的预先固定好的过滤器28。刚性的组织收集容器可以具有高大概为8英寸并且直径大概为5英寸的尺寸，壁厚度可以大约是0.125英寸。例如，经过一个或多个用于抽吸管路的端口、一个或多个带有用于经过无菌衔接技术而进行连接的管路的端口和/或一个或多个用于使针经过橡胶隔膜而刺破进入的端口，可以进入缸的内部。在收集腔20的内部内的预先固定好的过滤器28优选地构造为例如当组织从患者身上切除下来的时候，保留脂肪组织并且使非脂肪组织通过。更明确地，在初始获取脂肪组织期间，或在另一个实施例中在初始获取脂肪组织之后，过滤器28可以允许游离的脂质、血液和盐水通过，而保留脂肪组织的片段。就此而言，过滤器28包括多个尺寸相同的或不同的孔，但尺寸的范围是从大约20微米到5毫米。在优选实施例中，过滤器28包括多个400微米的孔。在优选实施例中，过滤器28是厚度大约为200微米的带有尺寸大约为265微米的孔和大约47％的开孔面积的医用级别的聚酯网眼。该材料在漂洗期间保持组织，但允许细胞在进行组织分解之后，通过网眼出来。这样，当组织从患者身上吸取出来的时候，非脂肪组织就可以与脂肪组织分离开来。用不同的材料、网眼尺寸和孔的数量和类型，相同的功能性可以被实现。例如，小于100微米的或像几千微米那样大的网眼孔尺寸可以实现相同的允许盐水和血细胞通过而保留脂肪组织聚集物和片段的目的。类似地，通过使用可选择的刚性的塑料材料或通过本领域的技术人员所已知的许多其它改变，相同的目的可以被实现。

收集腔20还可以包括用于对组织进行洗涤的装置及用于对组织进行混合和/或分解的装置。通过搅动，组织可以被洗涤、被混合或被分解，以使细胞生存能力最大化，并且使所输送的游离的脂质的量最小化。在一个实施例中，通过以变化的速度，例如大约每分钟30转，使整个收集腔20转动经过度数变化的弧线(例如经过大约45度到大约90度的弧线)，组织被搅动。在其它实施例中，通过以变化的速度，例如大约每分钟30转，使整个收集腔20转动经过度数变化的弧线(例如经过大约45度到大约90度的弧线)，组织被搅动，在其中，收集腔20包括一个或多个刚性地接附到收集腔的内侧表面的桨或突出物。在某些实施例中，刚性地接附了桨25a或突出物的收集腔20的内侧表面是预先固定好的过滤器28。在其它实施例中，刚性地接附了桨25a或突出物的收集腔20的内侧表面是预先固定好的过滤器28的过滤器笼27。

通过接附到收集腔20的或在收集腔20附近的驱动机构，收集腔20的转动可以被实现。驱动机构可以是简单的皮带、齿轮或其它在本领域中已知的驱动机构。例如，转动的速度可以是每分钟30转。大体上，已经发现的是，较高的速度产生较大体积的游离的脂质并且可能不是最佳的。在其它实施例中，通过将可转动的轴25放置在收集腔20内，组织被搅动，在其中，可转动的轴包括一个或多个刚性地接附到可转动的轴25的桨25a或突出物，当轴转动的时候，该桨25a或突出物通过混合物。在某些实施例中，带有刚性接附的桨25a的可转动的轴25可以位于收集腔20的底部。例如，通过将桨状设备放置到旋转磁场(例如磁搅拌器)内，这可以被实现。可选择地，使用在本领域中已知的简单的搅动器，即进行上下震动而不进行转动的设备，对组织的搅动可以被实现。

在图5中所图示的系统的示范性的收集腔20包括可以用于将空气从腔排出来的真空管线11，这允许使用者用提供给使用者的套管将组织切除下来；进口端口21；用于排放或清除废物的出口端口22；和带有桨状设备的可转动的轴25，在其中，一个或多个桨25a刚性地接附到预先固定好的过滤器28的过滤器笼27，用于使用磁搅拌器(未显示)对组织进行搅动。

系统10也可以包括一个或多个洗涤溶液源22。洗涤溶液源22可以包括盐水23的源和像胶原酶那样的组织分解剂24的源。洗涤溶液可以是任何本领域的技术人员所已知的溶液，包括盐水或任何其它缓冲的或非缓冲的电解质溶液。可以使用的分解剂包括中性蛋白酶、胶原酶、胰岛素、脂肪酶、透明质酸酶、脱氧核糖核酸酶、Blendzyme酶混合物族的成员例如Liberase H1、胃蛋白酶和/或其组合。所处理的组织的类型规定了所使用的洗涤溶液的类型或组合。典型地，像盐水那样的洗涤溶液在脂肪组织已经从患者身上切除下来之后进入收集腔20。然而，洗涤溶液可以在脂肪组织被提取出来之前输送到收集腔20，或可以与脂肪组织一起同时输送到收集腔20。在收集腔20内，通过任何方式，包括在上面所描述的方法，洗涤溶液和所提取的脂肪组织可以被混合起来。

用于盐水23和/或分解剂24的容器可以是任何合适的可以以无菌方式保持其内容物的容器，例如像在临床设施内所使用的IV袋那样的可收缩的袋。这些容器可以具有像管道12e那样的连结到收集腔20的管道12，从而使盐水和/或分解剂可以输送到收集腔20的内部。经过任何技术被认可的方式，包括将简单的重力压力应用到盐水23和/或分解剂24的容器的外侧，或通过将正排量泵放置在管道上，例如在图4中放置在管道12d上，盐水和/或分解剂可以输送到收集腔20的内部。

在收集腔内的组织和/或流体的温度应该维持在从30摄氏度到40摄氏度的范围内。在优选实施例中，在收集腔内的悬浮液的温度维持在37摄氏度。在某些实施例中，如果外科手术或治疗应用需要延迟，那么所选的组织就可以贮存在收集腔内，用于稍后使用。组织可以以室温或大约室温或以大约4摄氏度贮存96小时。

为了有助于分离和浓缩过程，收集腔20允许对在腔内的有浮力的液体和没有浮力的液体进行区别。在系统的自动化的实施例中，收集腔可以包括传感器29，该传感器29可以检测何时已经到达在有浮力的液体和没有浮力的液体之间的界面。例如，传感器29可以是能够检测流出物的光折射的变化的光学传感器，该流出物在收集腔的出口流体路径内流动并且将信号发送到系统的处理设备，由此根据与系统相关联的处理设备，激活或去激励一个或多个泵和/或阀门。

由于有浮力的层包括需要进一步洗涤和浓缩的可再生细胞，所以收集腔20优选地包括在腔的最低点的出口端口22，从而使血液和其它没有浮力的组织组分可以排放到废物容器。因此，经由一条或多条在这里所描述的管道12，收集腔20可以连结到一个或多个废物容器40，以允许从系统将来自收集腔的废物排放出来或清除出来。排放可以是被动的或是主动的。例如，使用重力、通过应用正压或负压、通过使用泵34或通过使用开口32，在上面所描述的没有浮力的组分可以排放出来。收集腔可以被定位为使出口端口22被定位在收集腔的底部或被定位在收集腔的底部附近。收集腔优选地被定位在该方位，以允许脂肪组织片段漂浮例如15秒到若干分钟或更长时间。在自动化的实施例中，基于使用者初始录入的信息(例如所处理的组织的体积)，系统的处理设备对多种参数进行计算，例如洗涤组织所需要的盐水的体积和洗涤组织所需要的时间。基于处理设备的控制逻辑，某些阀门和/或泵可以被激活或去激励，从而使来自收集腔20的废物从系统清除出来。像光学传感器那样的传感器29可以被放置为使它们能够发信号给系统的处理设备，以在对组织进行处理时，继续进行接下来的步骤。

在优选实施例中，收集腔20包括允许以无菌的方式将盐水和试剂添加到组织的封闭的流体路径。因此，收集腔20还包括适当确定尺寸为允许组织和液体自由通过的管道12，例如柔性的或刚性的管道。在优选实施例中，管道12的形式是管路。基于是否希望流体或组织通过，管道12的尺寸可以发生变化。基于循环经过系统的组织或流体的量，管道12的尺寸也可以发生变化。例如，为了使流体通过，管道的直径的范围可以是从大约0.060英寸到大约0.750英寸，而为了使组织通过，管道的直径的范围可以是从大约0.312英寸到大约0.750英寸。大体上，管道的尺寸被选择为平衡管道可以容纳的体积和传送组织或流体经过所述的管道所需要的时间。在系统的自动化的实施例中，前述的参数，即用于进行传送的体积和时间，必须被确定，从而使适当的信号可以被发送到系统的处理设备。这允许设备将精确体积的液体和组织从一个腔移动到另一个腔。

收集腔20也允许将洗涤过的脂肪组织移动到处理腔30。因此，收集腔20必须连接到必需的管路12、阀门14和泵34，以移动并且贮存洗涤过的脂肪组织。另外，收集腔20典型地包括一个或多个端口21，以允许将洗涤溶液输送到腔的内部，并且包括一个或多个端口22以允许将废物和其它材料从收集腔20引导出来。例如，像在这里所描述的那样，收集腔可以包括一个或多个密封的进入端口。收集腔20也可以包括一个或多个像顶部罩和底部罩那样的罩(未显示)，以当洗涤溶液输送到收集腔内的时候和/或当废物传送出来的时候，进一步确保系统保持无菌。端口21可以配备在收集腔的罩上或配备在收集腔的侧壁上。

可以重复用新鲜的洗涤溶液进行洗涤的过程，直到在溶液内的没有浮力的污染物的残留内容物达到预定水平。换言之，在收集腔20内的包括在上面所描述的混合物的有浮力的材料的剩余材料，包括脂肪组织片段，可以被额外地洗涤一次或多次，直到不想要的材料的量减小到想要的预定水平。一种检测洗涤终点的方法是对在组织溶液内的红细胞的量进行测量。通过对在540纳米波长上所吸收的光进行测量，这可以被实现。在优选实施例中，在大约0.546和大约0.842之间的范围被认为是可接受的。

在进行想要的量的洗涤周期之后，组织分解剂可以输送到收集腔20，以对剩余脂肪组织组分进行煮解。例如，盐水，例如从像在上面所描述的那样的盐水源23输送的盐水，可以与添加胶原酶，例如从像在上面所描述的那样的胶原酶源24输送的胶原酶一起，或紧随其后，被添加到脂肪组织。然后，以类似于在上面所描述的搅动方法的方式，洗涤过的脂肪组织和组织分解剂可以被搅动，直到洗涤过的脂肪组织被分解。例如，通过使整个收集腔转动经过大概90度的弧线，通过具有包含一个或多个当轴转动的时候通过溶液的桨的轴，和/或通过使包含在收集腔的内侧表面上的桨或突出物的整个收集腔转动，洗涤过的脂肪组织和组织分解剂可以被搅动。

在一个实施例中，脂肪组织片段在37摄氏度或在37摄氏度左右，与包含胶原酶的酶溶液混合在一起，持续大约20分钟到60分钟。在其它实施例中，较高浓度的胶原酶或类似的制剂可以被添加，以减少煮解时间。然后，类似于在上面所描述的情况，收集腔20可以放置在直立的位置，从而使出口端口22位于收集腔的底部，持续一段足够的时间，以允许有浮力的细胞和组织片段漂浮上来。典型地，时间的范围可以从15秒到若干分钟，但在改变的实施例中，其它时间可以被实现。

基于使用来自脂肪的细胞而要实现的目的，脂肪组织可以被部分地分解，或被完全地分解。例如，在来自脂肪的细胞将要与脂肪组织单元组合起来的实施例中，对所获取的脂肪组织进行部分的分解，以清除部分分解的脂肪组织的部分，然后继续对剩余在收集腔内的脂肪组织的剩部分进行分解，这可能是人们所想要的。可选择地，在进行任何煮解之前，洗涤过的脂肪组织的部分可以被清除并且在样品容器内被放在一边。在另一个实施例中，所获取的脂肪组织被部分地分解，以在细胞被重新引入回到患者体内之前，对细胞进行浓缩。在一个实施例中，脂肪组织与组织分解剂混合起来，持续一段大体上少于大约20分钟的时间。然后，部分分解的组织的部分可以从收集腔清除出来，而剩余的部分分解的组织可以通过将脂肪组织与组织分解剂混合起来再持续40分钟而被进一步地分解。当来自脂肪的细胞将要被用作基本上纯的可再生细胞群体的时候，脂肪组织可以被完全地分解。

在洗涤和/或分解期间，当需要添加剂以提高结果的时候，一种或多种添加剂可以被添加到各种容器。添加剂的一些例子包括对洗涤和分解进行优化的制剂、在处理期间提高活性细胞群体的存活能力的添加剂、抗微生物剂(例如抗生素)、使脂肪细胞和/或红细胞溶解的添加剂或使感兴趣的细胞群体富集起来的添加剂(通过对固相部分进行有差异的粘附或另外促进细胞群体的相当大的减少或富集)。其它可能的添加剂包括那些促进可再生细胞的恢复和存活能力的添加剂(例如半胱氨酸蛋白酶抑制剂)或那些在灌注或放置时减少发生逆反应的可能性的添加剂(例如细胞或结缔组织重新聚集的抑制剂)。

在足够的沉淀时间已经过去之后，洗涤过的脂肪组织片段和组织分解剂的所得到的混合物的没有浮力的部分包含可再生细胞，例如干细胞和其它来自脂肪的祖细胞。像在这里所讨论的那样，包含可再生细胞的没有浮力的部分转移到处理腔30，在这里，像来自脂肪的干细胞那样的感兴趣的可再生细胞与处在混合物的没有浮力的部分内的其它细胞和材料分离开来。

因此，处理腔30被定位在系统内，从而通过管路12、阀门14和泵34，使漂洗过的并且煮解过的组织悬浮物从收集腔20移动到处理腔30。处理腔的尺寸被确定为容纳范围在10毫升到1.2升之间的组织/流体混合物。在优选实施例中，处理腔的尺寸被确定为容纳800毫升。在某些实施例中，来自收集腔20的所有可再生细胞组合物被引导到处理腔30。然而，在其它实施例中，可再生细胞组合物的部分被引导到处理腔30，而另一部分被引导到系统的不同区域，例如样品腔60，以稍后重新与在处理腔30内处理过的细胞组合起来。像先前在这里所陈述的那样，本发明的可再生细胞组合物是在组织，例如脂肪组织，被洗涤并且被至少部分地分解之后，由典型地处在一定体积的液体内的细胞组成的组合物。换言之，在与组织分解剂混合之后从收集腔20转移出来的可再生细胞组合物包括多个不同类型的细胞，包括干细胞、祖细胞、内皮前体细胞、脂肪细胞和在这里所描述的其它可再生细胞。可再生细胞组合物也可以包含像处在脂肪组织片段内的胶原质和其它结缔组织蛋白质及其片段或来自组织分解过程的残留的胶原酶那样的一种或多种污染物。

使用任何合适的生物相容的可以被消毒的材料，处理腔30可以被构建。在优选实施例中，处理腔30由一次性材料构建，该一次性材料满足像在ISO 10993标准中所描述的那样的对血管内接触的生物相容性要求。例如，聚碳酸酯、丙烯酸、ABS、乙烯-醋酸乙烯共聚物或苯乙烯-丁二烯共聚物(SBC)可以被使用。在另一个实施例中，一次性处理腔的流体路径是没有热原的。处理腔的形式可以是塑料袋，例如那些在血库内在处理血液时常规使用的塑料袋；或在其它实施例中，它可以是刚性结构的(图6)。在一个实施例中，处理腔30可以类似于在共同拥有的编号为10/316,127、于2001年12月7日提交的美国申请和编号为10/325,728、于2002年12月20日提交的美国申请中所披露的处理腔，由此通过参考，合并了这两项申请的全部内容。

在某些实施例中，来自收集腔20的可再生细胞组合物被引入到处理腔30内，在这里，溶液可以被过滤，以对特别的可再生细胞组合物进行分离和/或浓缩。细胞过滤是将特别的组分和细胞与其它不同的组分或其它类型的细胞分离开来的方法。例如，本发明的可再生细胞组合物包括多个不同类型的细胞，包括干细胞、祖细胞和脂肪细胞及像处在脂肪组织片段内的胶原质或来自组织分解过程的残留的胶原酶那样的一种或多种污染物。处在处理腔30内的过滤器36可以允许对特别的可再生细胞亚群体，例如干细胞或内皮祖细胞等的亚群体，进行分离和浓缩。

与从液体过滤细胞相关联的一些变量包括过滤器介质的孔尺寸、孔的几何形状(形状)、过滤器的表面面积、所过滤的溶液的流动方向、跨膜压力、特别的细胞群体的稀释度、微粒尺寸和形状及细胞尺寸和细胞存活能力，但不局限于此。根据在这里所披露的东西，希望被分离或被过滤的特别的细胞典型地是来自脂肪的干细胞。然而，在某些实施例中，特别的细胞可以包括来自脂肪的祖细胞，例如单独的或与干细胞组合在一起的内皮前体细胞。

可再生细胞组合物可以被引导经过像过滤器组件36那样的过滤器组件。在某些实施例中，过滤器组件36包括多个被建造成执行不同的功能并且将可再生细胞组合物分离成不同的部分或组分的过滤器。例如，过滤器中的一个可以被构造成将胶原质与可再生细胞组合物分离开来，过滤器中的一个可以被构造成将脂肪细胞和/或脂质组分与可再生细胞组合物分离开来，并且过滤器中的一个可以被构造成将像组织分解剂那样的残留的酶与可再生细胞组合物分离开来。在某些实施例中，过滤器中的一个能够执行两项功能，例如将胶原质和组织分解剂与组合物分离开来。典型地，多个过滤器串联排列；然而，过滤器的至少部分也可以并联地排列。在图2中，显示了过滤器组件36的过滤器的串联排列。在图3中，显示了过滤器组件36的过滤器的并联排列。

在一个实施例中，过滤器组件36包括第一过滤器、第二过滤器和第三过滤器。第一过滤器被构造成清除处在可再生细胞组合物内的胶原质颗粒。典型地，这些胶原质颗粒的直径大概是0.1微米，并且可以达到20微米长。基于煮解，胶原质颗粒的尺寸可以发生变化。它们也可以是原纤维，这意味着它们是扭曲的和弯曲的。任何在这里所描述的过滤器可以由聚醚砜、聚酯、PTFE、聚丙烯、PVDF制造或可能由纤维素制造。对于过滤胶原质，有两种可能性。一种可能性是，首先试图清除较大的颗粒，使细胞通过，这需要例如范围可能在10微米内的过滤器。第二种方法是，使用尺寸较小的例如4.5微米的过滤器，意图胶原质被很好地煮解，从而捕获细胞而使胶原质通过。这需要一种装置来使细胞漂浮退出过滤器。也可以存在实现吸引并且保持胶原质纤维的过滤器的可能性。

第二过滤器被构造成清除游离的不成熟的脂肪细胞，其在可再生细胞组合物内是没有浮力的。在一个实施例中，第二过滤器可以由聚酯构建，并且具有在大约30微米和大约50微米之间的孔尺寸，优选的孔尺寸大约是40微米。虽然被指代成第二过滤器，但该设备可以放置在第一位置，而不是第二位置，以有助于对较大的细胞和颗粒进行初始清除。第三过滤器被构造成清除处在组合物内的未使用的或残留的胶原酶或其它组织分解剂。在优选实现中，胶原酶可以随时间而发生变性。在一个实施例中，第三过滤器包括多个具有小于1微米的直径或长度的孔。在某些实施例中，孔可以具有小于1微米的直径。在其它实施例中，孔具有在10千道尔顿和5微米之间的直径。在某些实施例中，像在这里所讨论的那样，第三过滤器可以被构造成将可再生细胞群体浓缩到小体积的盐水或其它洗涤溶液内。像现在优选的那样，只有最终过滤器是中空纤维单元。对于过滤器的任何一个，中空纤维类型不是必需的。在优选实现中，中空纤维单元用于最终过滤器，因为在清除胶原酶时，它是最有效的，伴有对可再生细胞的有害影响是最小的。在设备是现成的物品的收集装置的实施例中，三个过滤器处在分开的壳内。如果中空纤维单元用于第三过滤器，那么将第一过滤器和第二过滤器组合到一个壳内，这是可行的。如果最终过滤器不是中空纤维结构，那么所有三个过滤器就可以包含在一个壳内。

过滤器组件36的过滤器可以处在处理腔30内，或配备成与处理腔30分离开来的构件。另外，过滤器组件36的过滤器可以配备在多个处理腔内或配备在管线内。在某些实施例中，管道或管路可以作为处理腔或多个处理腔。处理腔的尺寸可以被减小，从而使它成为连接过滤器的管道的内部体积。如果组织溶液的体积被适当地确定大小，那么这种类型的系统就将要正确地执行功能。这样，当带有细胞的流体通过过滤器的时候，通过包含带有细胞的流体，管道就可以作为处理腔。应该注意的是，使管道的体积最小化，从而在系统起动和运行过程中，使细胞/组织不会发生不必要的丢失。

参考在上面所描述的实施例，包含洗涤过的细胞和残留的胶原质、脂肪细胞和/或未煮解的组织分解剂的可再生细胞组合物可以被引导经过第一过滤器，以从组合物清除胶原质颗粒的至少部分，并且优选地清除胶原质颗粒的大致上所有部分，从而使胶原质颗粒较少处在过滤过的溶液内，并且优选地使胶原质颗粒不处在过滤过的溶液内。然后，包含脂肪细胞和/或未煮解的组织分解剂的过滤过的可再生细胞组合物可以被引导经过第二过滤器，以从过滤过的可再生细胞组合物清除游离的脂肪细胞的至少部分，并且优选地清除游离的脂肪细胞的大致上所有部分。随后，像在这里所讨论的那样，过滤两次的包含未煮解的组织分解剂的可再生细胞组合物可以被引导经过第三过滤器，例如中空纤维过滤设备，以从可再生细胞组合物清除或减少未煮解的组织分解剂。

然后，过滤三次的可再生细胞组合物(即在通过第一、第二和第三过滤器之后剩余的组合物)可以被引导到多个出口，其可以包括包含多个出口的处理腔30的部分。这些出口可以用于维持必要的压力及用于提供经由管道到其它容器的连接，该其它容器可以包括收集腔20、输出腔50和/或废物容器40。

在一个实施例中，过滤器组件36的过滤器包括中空纤维过滤部件。或换言之，过滤器包括由过滤器介质形成的中空管的集合。可以与所披露的系统10一起使用的过滤器介质的例子包括聚砜、聚醚砜或混合的酯材料及类似的东西。过滤器介质的这些中空过滤器或中空管可以包含在过滤器组件36的圆筒内。典型地，过滤器介质的各个管或纤维具有范围从大约0.1毫米到大约1毫米的内径，优选值大约是0.5毫米。合适的圆筒的直径和长度将要确定可以放置在筒内的过滤器介质的各个管的数量。合适的中空纤维过滤器筒的一个例子是

切向流过滤器，目录#M-C-050-K(Minntech，Minneapolis，Minnesota)。过滤器介质的孔尺寸的范围可以在大约10千道尔顿和大约5微米之间，优选的孔尺寸大约是0.5微米。

在中空纤维过滤器内，每个中空管具有带有第一端、第二端和管腔的主体，该管腔位于主体内并且在第一端和第二端之间延伸。每个中空管的主体包括多个孔。孔被大体上定向在主体内，从而通过流动经过主体的管腔，使可再生细胞组合物被过滤，并且使要被过滤的产物切向地通过孔，像在图12A中所显示的那样。换言之，在液体内的较小的颗粒相对于流动经过主体的管腔的流体，切向地通过孔。当组合物正在被过滤的时候，带有可再生细胞的组合物通过每个中空管的管腔。优选地，组合物的流动是切向于每个中空管的主体的孔的。

通过使用流体的切向流动，相对于其它过滤技术，过滤干细胞的效率可以被提高。例如，根据一些过滤技术，过滤器介质的孔以过滤器被定向成垂直于流体的流动的方式被放置，从而像在图12B中所图示的那样，使过滤器介质阻塞所过滤的流体的路径。在进行这种类型的过滤时，从像干细胞那样的可再生细胞组合物过滤出来的颗粒趋向于在过滤器的一侧集结，并且阻塞流体流动经过孔。这种阻塞可能减小过滤器的效率。另外，通过流体流动的压力及在过滤器的上游侧积累起来的细胞的重量，细胞被不断地压缩。这可能导致干细胞溶解的增加。这样，在该流体的流动平行于在过滤器内的孔的定向的过滤技术中，当流体通过孔的时候，大的细胞和小的颗粒都可能被不想要地引导靠在过滤器介质上。因此，在液体内的像细胞那样的较大的产物可能阻塞孔，由此降低过滤效果并且增加细胞破裂或受损的发生。

相反地，在本系统10的中空纤维构造内，所过滤的流体在中空管的管腔内流动。在流体在主体的内侧的正压及应用到主体的外侧的负压的帮助下，具有通过过滤器的主体的孔的能力的流体的部分通过过滤器的主体的孔。在该实施例中，细胞典型地不受到流体流动的压力或其它细胞的重量的影响，因此在干细胞上的剪切力被减小。这样，通过减少堵塞发生率并且减少可再生细胞溶解，过滤的效率和有效性就可以被提高。在过滤期间，由于盐水和不想要的蛋白质分子的尺寸，这些分子和其它小的组分通过中空管的主体的孔，到达中空管的外侧，并且被引导到废物容器40。在一个实施例中，通过在中空管过滤器介质的外侧产生真空，过滤被提高。由于像干细胞或祖细胞那样的可再生细胞的尺寸，这些细胞典型地不能通过主体的孔，因此保留在中空管过滤器的内侧(例如在管的管腔内)，并且经由在过滤器和处理腔之间的管道而被引导回到处理腔30，或到达输出腔50。

在一个特殊实施例中，中空纤维过滤器具有尺寸大约为0.05微米的孔，并且包含表面面积大概为550平方厘米的过滤器介质。单个介质管典型地具有大约0.5mm直径。在处理130毫升的可再生细胞组合物时，大概为120毫升的额外盐水可以被添加到组合物。处理时间或过滤器时间大概可以是8分钟。在中空纤维管的主体的任一侧的压力(例如主体的管腔内侧的压力和外侧的压力)的差别被认为是跨膜压力。跨膜压力的范围可以是从大约1毫米汞柱到大约500毫米汞柱，优选的压力大约是200毫米汞柱。使用中空纤维过滤，平均的有核细胞的恢复和存活能力大概可以是存活细胞的80％。

在该系统内被典型地清除的胶原酶的量等于减小了1000倍。例如，如果在从收集腔转移到处理腔的可再生细胞组合物内的胶原酶的初始浓度是0.078U/ml，那么最终的可再生细胞组合物的胶原酶浓度就是0.00078U/ml。在中空纤维过滤器内，胶原酶被清除，并且中空纤维过滤器相应于在上面所讨论的第三过滤器。

在附图中，特别是在图1到3中，显示了处理腔，该处理腔图示了在上面所描述的一种或多种细胞过滤方法。参考图1到3，在处理腔30和过滤器组件36的过滤腔之间，可以配备像泵34那样的泵。另外，像开口32和压力传感器39那样的开口和压力传感器可以配备成与处理腔30和过滤器组件36在管线内相联。也可以配备用于输出腔50的配件。这些可选择的构件(例如泵34、开口32、压力传感器39和用于输出腔50的配件)可以配备在处理腔30和过滤器组件36之间，从而使包含在处理腔30内的液体可以在流动经过过滤器组件36之前，流动到这些可选择的构件中的一个或多个。例如，液体可以在它通过到达过滤器组件36之前，流动经过泵34。或者，液体可以在经过过滤器组件之前，经过压力传感器39，以得到在系统内的预过滤器液体压力。在某些情况下，这些构件中的一个或多个也可以配备成处理腔30的元件，例如像在图6中所图示的那样的开口32。在所图示的实施例中，压力传感器39在管线内，以当可再生细胞组合物进入过滤器组件36的过滤腔的时候，确定由泵34产生的可再生细胞组合物的压力。该结构可以有助于对穿过滤器膜的跨膜压力进行监测。额外的盐水或其它缓冲和洗涤溶液可以被添加到可再生细胞组合物，以当组合物被过滤经过过滤器组件36的时候，有助于清除不想要的蛋白质。该重复的洗涤可以进行多次，以提高可再生细胞组合物的纯度。在某些实施例中，当被认为是提高过滤所必需的时候，盐水可以在任何步骤被添加。

在一个特殊实施例中，不想要的蛋白质和盐水或其它洗涤溶液以接下来的方式被清除，所提出的该特殊实施例是例子而不是限制。带有可再生细胞及胶原质和结缔组织颗粒或片段、脂肪细胞和胶原酶的组合物循环经过一系列过滤器，直到达到最小体积。最小体积是系统的总滞留体积和一些预定的常数的函数。滞留体积是如果所有处理腔都是空的而包含在管路和管道内的液体的体积。在一个实施例中，最小体积是15毫升。当达到最小体积的时候，预定体积的洗涤溶液被引入到系统内，以与可再生细胞组合物混合在一起。然后，该洗涤溶液和可再生细胞组合物的混合物循环经过过滤器，直到再次达到最小体积。该循环可以重复多次，以提高可再生细胞的纯度，或换言之，以增加在组合物内的可再生细胞与在组合物内的其它材料的比例。查看图10和11。

在已经确定可再生细胞组合物已经被除去了不想要的蛋白质和被充分地浓缩(在示范性实施例中，范围在大约1×10⁵个细胞/毫升到大约1×10⁷个细胞/毫升内的最小浓度可以被使用，并且在优选实施例中，最小浓度大约可以是1×10⁷个细胞/毫升)之后，基于特殊实施例，像输出袋那样的输出腔50可以连接到处理腔30和/或过滤器组件36的输出端口。然后，像开口32那样的开口可以被开放，以有助于浓缩的可再生细胞的输出。在一个实现中，在实验已经运行起来并且编程到设备的电子控制装置之后，凭经验确定何时最小浓度已经被达到。该确定可以是输入到有关想要产出什么，即想要多少干细胞/祖细胞，或细胞浓度的范围的过程的输入量。基于科学的数据，预定量的脂肪组织需要被得到并且被放置在系统内，以获得想要的输出结果。通过开口32开放，像泵34那样的泵可以执行功能，以将浓缩的可再生细胞转移到输出袋内。在一个实施例中，输出袋50类似于具有在一端带有配件的管的空的血袋。以无菌的方式，在输出袋上的配件可以接附到输出端口，并且浓缩的可再生细胞可以被转移到输出袋。

像在图1到3中所图示的那样，真空泵26可以配备在系统10内，以其中改变在系统内的压力。例如，经由像管道12b那样的管道，真空泵26可以连结到收集腔20，以降低在收集腔20内的压力。通过像管道12g那样的管道，真空泵26也可以连结到处理腔30。就真空泵26连同泵34的操作而言，两个分开的真空泵或源可以被实现，或通过使用将真空拉力引导到在过程中的特殊点需要真空拉力的不同的管道的阀门，单一的真空泵可以被实现。另外，经由像管道12f那样的管道，真空泵26可以连结到废物容器40。

参考图10和11，由真空泵26产生的压力可以用于引导包括可再生细胞的流体流动经过管道12。例如，通过在系统10内自动地或手动地控制一个或多个阀门14的位置，该压力可以在多个方向上供给。通过使用正压或经过使用负压或其组合，可以使得系统10适当地执行功能。例如，可再生细胞可以被拉动经过在上面所描述的第一和第二过滤器而进到连接到第三过滤器的有软侧的容器内。有软侧的容器可以在连接在第三过滤器前面的管线内(串联的)。最终的输出腔可以是在第三过滤器的另一侧(例如下游侧)的有软侧的容器。在该实施例中，压力用于将可再生细胞从一个有软侧的容器移动经过过滤器而到达第二有软侧的容器。

在系统10的另一个实施例中，使用渗滤过滤和沉淀的组合，对干细胞和/或来自脂肪的祖细胞的过滤可以被实现。例如，该系统使用通过组织可再生细胞组合物(例如包含干细胞和/或来自脂肪的祖细胞的组合物)然后通过过滤器的盐水。与从可再生细胞组合物进行渗滤过滤细胞相关联的变量的一些包括过滤器介质的孔尺寸、孔的几何形状或形状、过滤器的表面面积、所过滤的可再生细胞组合物的流动方向、所灌注的盐水的流动速率、跨膜压力、细胞群体的稀释度、细胞尺寸和存活能力，但不局限于此。

在系统10的一个实施例中，处理腔30使用实现渗滤过滤和沉淀以对可再生细胞进行分离和浓缩的过滤器组件36。作为例子而不是限制，像在图6中所显示的那样，处理腔30被限定成大体上为圆柱形的具有侧壁30a、顶部表面30b和底部表面30c的主体。无菌的开口32配备在顶部表面30b内。

在图6的实施例中，处理腔30被图示成包括过滤器组件36，该过滤器组件36包括像大孔过滤器36a和小孔过滤器36b那样的两个过滤器。典型地，过滤器36a和36b的孔尺寸的范围在大约0.05微米和大约10微米之间。大孔过滤器36a可以包括直径大约为5微米的孔，而小孔过滤器36b可以包括直径大约为1微米到3微米的孔。在一个实施例中，过滤器的表面面积大约为785平方毫米。过滤器36a和36b将处理腔30的内部隔开，以包括第一腔37a、第二腔37b和第三腔37c。像在图6中所显示的那样，第一腔37a位于第二腔37b和第三腔37c之间。另外，第一腔37a被显示成是具有进口端口31a和出口端口31b的处理腔30的区域。所图示的处理腔30包括多个提供从处理腔30的外部到处理腔30的内部的连通路径的端口，例如端口31a、31b和31c。端口31a、31b和31c被图示成布置在处理腔30的主体的侧壁30a内。然而，端口31a、31b和31c也可以被定位在其它区域内。端口31a被图示成样品进口端口，该样品进口端口被构建成连结到管道，从而使包含可再生细胞的组合物可以进到处理腔30的内部内。端口31b被图示成出口端口，该出口端口被构建成连结到管道，从而使分离的并且浓缩的细胞可以从处理腔30的内部清除出来。端口31c被图示成进口端口，该进口端口被构建成连结到管道，用于将像盐水那样的新鲜的洗涤溶液输送到处理腔30的内部内。

在使用时，经由进口端口31a，可再生细胞可以被引入到中心腔37a内。经过进口端口31c，盐水或其它缓冲溶液被引入到底部腔37b内。盐水可以以大约为10毫升/分钟的速率，被引导经过在腔37a内的可再生细胞组合物。盐水的流动速率是这样的，从而使它抵消了重力。盐水的流动将给予在腔内的细胞基于细胞密度分离的能力。典型地，当盐水被促使向上经过组合物的时候，在组合物内的较大的细胞将要沉淀到中心腔37a的底部，而较小的细胞和蛋白质将要被携带走经过第二过滤器36b而进到顶部腔37c内。通过调整盐水的流动速率，从而在允许较小的颗粒释出并且用盐水携带走的位置，使较大的细胞滚动，该过滤可以被实现。无菌的开口32被包括在腔30内，以确保在处于处理单元内的三个腔内，正确的压力梯度被维持。上部腔37c可以包括吸收介质33。吸收介质的目的是捕获在溶液内的不想要的蛋白质，以确保例如如果盐水流动速率降低，在溶液内的不想要的蛋白质不会穿越过滤器介质回到处理溶液内。吸收介质可以是对要被过滤出来的材料或组分进行吸收或吸引的过滤器材料类型。在顶部过滤器之上，流出端口可以被添加，以有助于将废物排出来。该排放废物的另一个实施例可以是从顶部应用平缓的真空，以有助于将废物拉出来。像在所图示的实施例中那样，当流动速率是相对小的时候，吸收介质可以被实现。然后，多余的盐水和蛋白质被携带走到达废物容器。

像在这里所讨论的那样，当较大的细胞(例如来自脂肪的干细胞和/或祖细胞)已经与较小的细胞和蛋白质充分地分离开来的时候，包含所分离的细胞的组合物可以被浓缩。在经过出口端口31b组合物已经从腔37a清除出来之后，或当组合物在腔37a内的时候，组合物可以被进一步浓缩。在一个实施例中，以接下来的方式，在组合物内的细胞的浓度被增加。在细胞已经被充分地分离之后，像过滤器36a和36b那样的过滤器可以朝向彼此移动。该移动的作用是减小在两个过滤器之间的体积(例如腔37a的体积)。振动部件也可以与处理器30结合配备，以有助于浓缩在组合物内的细胞。在一个实施例中，振动部件可以连结到过滤器36b(例如小孔过滤器)。振动可以减小细胞被捕获在过滤器内的发生率。组合物体积的减小允许当废物和要被浓缩的细胞在较小的体积内的时候，多余的盐水被清除。

在另一个实施例中，以接下来的方式，对可再生细胞的浓缩被实现。在细胞已经被充分地分离之后，可再生细胞组合物可以转移到另一个使用重力以将多余的盐水过滤出来的腔(未显示)。在优选实施例中，沉淀可以与渗滤同时发生。通过在具有范围从大约10千道尔顿到大约2微米的孔尺寸的过滤器的顶部上引入组合物，该沉淀可以被实现。在一个实施例中，合适的过滤器具有大约1微米的孔尺寸。重力将要允许盐水和较小的颗粒通过过滤器，同时防止在组合物内的细胞流动经过过滤器。在对细胞的想要的浓缩已经被得到之后，并且在所过滤的较小的颗粒已经从过滤器下面清除出来之后，可再生细胞组合物可以被搅动，以从过滤器将细胞清除出来，随后，所浓缩的可再生细胞可以转移到输出袋。作为废物，较小的颗粒可以通过出口被排出来。

在本发明的特别实施例中，处理腔包括有助于将可再生细胞与可再生细胞组合物分离开来的离心腔或细胞浓缩器(图4、7和8)。例如，细胞浓缩器可以是例如基于尺寸或密度而将可再生细胞与可再生细胞组合物分离开来的离心设备或离心设备的部分(图7和8)。细胞浓缩器也可以是旋转膜过滤器。

在本领域中，离心被认可是对具有多个密度变化的组分的溶液进行分离和浓缩的方式。通过将例如高于重力的离心力施加在溶液上，这可以实现。基于细胞和/或颗粒密度，所施加的力引起组织溶液的分离。在细胞已经被充分地浓缩之后，多余的盐水和蛋白质可以被清除。与将细胞从溶液离心分离出来相关联的变量的一些包括转子的速度、溶液距转动中心的距离和时间，但不局限于此。

离心设备可以是处理腔30的构件，或可以与处理腔分开。离心设备也可以部分地在处理腔内；并且部分地与处理腔分开(查看图14和15)。典型地，离心设备使得包含细胞溶液的容器，例如输出腔50，围绕轴线旋转，由此增加在处于溶液内的细胞上的力以使之大于重力。典型地，在溶液内的较稠的或较重的材料沉淀到输出腔50的一端，以形成小球。然后，小球可以再次悬浮，以得到带有想要的细胞浓度和/或想要的细胞和介质体积的溶液。

在其它实施例中，处理腔30自身的形式可以是离心腔或细胞浓缩器。大体上，该处理腔被构建成使用离心力和重力对细胞进行分离和浓缩。具体地，在离心期间，离心力引导可再生细胞组合物的较稠的组分，例如可再生细胞，朝向离心腔的最外端。当离心腔慢下来并且最终停止的时候，重力帮助可再生细胞保留在离心腔的最外端，并且形成细胞小球。因此，在不扰乱细胞小球的情况下，可再生细胞组合物的不想要的组分，即废物，可以被清除。

在离心过程的又一个实施例中，离心淘洗也可以被应用。在该实施例中，基于单个细胞沉淀速率，从而使由离心施加的定向(例如向外)力使得细胞和溶质以不同的速率沉淀，细胞可以被分离。在淘洗时，目标细胞群体的沉淀速率受到通过在相反于离心力的方向上泵送溶液而被施加的相反的(例如向内)流动速率的反抗。逆向流动被调整，从而使在溶液内的细胞和颗粒被分离。在许多进行细胞分离的情况下，淘洗已经被应用(Inoue，Carsten等1981；Hayner，Braun等1984；Noga 1999)，并且在这里，根据本披露，用于优化流动和离心参数的原理和实践可以由本领域的一个技术人员应用。

根据本发明，图9图示了与淘洗实现相关联的原理。在使用旋转转子将力应用到溶液的程度上，淘洗实施例可以类似于离心实现。与现在所体现的淘洗分离相关联的变量的一些包括旋转腔的尺寸和形状、转子的直径、转子的速度、逆向流动管路的直径、逆向流动的流动速率及要从溶液清除出来的颗粒和细胞的尺寸和密度，但不局限于此。当进行离心的时候，基于单个细胞密度，可再生细胞可以被分离。

像在图9.1中所显示的那样，在一个实施例中，可再生细胞组合物，例如包含可再生细胞和胶原酶的溶液，被引入到旋转转子的腔内。在溶液被添加到腔之后，额外的盐水以预定的流动速率被添加到腔。盐水的流动速率可以作为转子速度、细胞直径和已经凭经验确定的腔常数的函数被预先确定。流动速率例如用类似于IV泵的设备进行控制。像在图9.2中所图示的那样，额外的盐水的目的是在转子腔内提供条件，其中，较大的颗粒将移动到腔的一侧，而较小的颗粒将移动到另一侧。像在图9.3中所显示的那样，在该应用中，流动被调整，从而使较小的颗粒离开腔并且移动到废物容器。该移动使得在转子腔内的溶液具有大致上同源的细胞群体，例如大致上同源的干细胞群体。

在已经确定干细胞已经与在溶液内的其余物品(带有已经从腔清除出来的不想要的蛋白质和游离的脂质)分离开来之后，逆向流动被停止。然后，在腔内的细胞将要在腔的外侧壁上形成浓缩的小球。逆向流动被反转，并且细胞小球转移到输出袋。

在图7和8中所显示的以离心腔或细胞浓缩器为形式的示范性处理腔30包括转动密封装置30.1，该转动密封装置30.1包括外部壳30.2、一个或多个密封装置30.3、一个或多个轴承30.4和用于将处理腔接附到系统的离心设备的接附点30.6；以从转动密封装置延伸出来并且终止在处在每端的离心腔内的管道为形式的一条或多条流体路径30.5，该离心腔以容纳在框架53内的输出腔50为形式，在其中，框架包括一个或多个端口52和一个或多个把手，以手动地对输出腔50进行重新定位。

在某些实施例中，以离心腔为形式的处理腔30包括一条或多条通到处理腔例如输出腔50的多种构件内和从处理腔例如输出腔50的多种构件出来的流体路径30.5。在一个实施例中，一条流体路径30.6从处理腔30的中心轴线向外放射出来，并且结束在处理腔30的外部端附近，即在容纳输出腔50的离心腔内。例如，该流体路径可以用于从收集腔20将可再生细胞组合物传送到处理腔30。流体路径也可以用于使在离心之后形成的细胞小球重新悬浮。因此，必须对流体路径的放置和尺寸进行优化。处理腔也可以包括结束在处理腔的底部中心部分的流体路径30.5。该流体路径可以用于从输出腔50将浮在表面的东西或废物清除出来。可选择地，处理腔包括结束在处理腔的底部中心部分的流体路径，其用于清除由处理腔30自身产生的浮在表面的东西或废物。

在某些实施例中，处理腔30具有两条流体路径。两条流体路径都通过处理腔的顶部(即在转动密封装置内的轴的中心)。一条流体路径向下一直延伸到处理腔的底部，而另一条流体路径分开成两条并且延伸到处理腔的外部端，即朝向容纳输出腔的离心腔。在重新构造的实施例中，处理腔30具有大体上相同的形状，但流体路径中的一条发生移动或改变。在该实施例中，一条流体路径从在转动密封装置内的轴一直延伸到处理腔的底部。然而，第二流体路径在处理腔外侧分开，然后连接到处理腔的外部端。在该实施例中，当流体路径可以用于将添加剂和重新悬浮溶液直接添加到离心腔和/或输出腔的时候，大的输出体积可以被产生。

在图4、7到9和14到15中，显示了包括在上面所描述的离心设备的处理腔。参考图4和7到9，泵34和一个或多个阀门14可以配备在收集腔20和处理腔30之间。在优选实施例中，阀门14是机电阀门。另外，像压力传感器29那样的传感器可以配备成与处理腔30和收集腔36在管线内。使用在图7和8中所显示的处理腔30，可再生细胞组合物可以沿着经过包括外部壳30.2、一个或多个密封装置30.3(例如唇状密封装置)和一个或多个轴承30.4的转动密封网络30.1的路径从收集腔20被泵送出来。

在优选实施例中，包括转动轴的转动密封网络30.1还包括两个或多个轴承30.4、三个或多个唇状密封装置30.3和外部壳30.2。在该实施例中，轴承30.4还包括在这里被指代成座圈的外部轴和内部轴(未显示)。通过精确研磨的球体，这些座圈可以被分开。包括轴承的座圈和球体优选地用适合于与体液接触的材料制成，或涂有适合于与体液接触的材料。在优选实施例中，例如使用氮化硅树脂或氧化锆，座圈和球体被制成。此外，在该实施例中，三个唇状密封装置包括圆形的“U”形通道(未显示)及圆形的弹簧(未显示)。使用柔性的材料，圆形的“U”形通道被优选地制成，从而使与转动密封网络30.1的转动轴的防泄漏联结被形成。另外，唇状密封装置以这样的方式被优选地定向，从而使来自流动经过处理腔的可再生细胞组合物的压力使得密封组件通过增加的张力而收紧它与转动轴的联结。通过当需要的时候能够膨大和/或收缩以接合在转动密封网络30.1的外部壳30.2内的凹槽的一个或多个圆形的夹具(未显示)，密封装置可以被固定在适当的位置。大体上，转动密封网络30.1被优选地设计，从而使多条流体路径，例如流体路径30.5，可以被维持在无菌的环境下，并且当处理腔的离心腔正在旋转的时候，可以被到达。因此，该实施例的优点是，在系统的分离和浓缩阶段期间，在任何给定的时间，在图7和8中所图示的处理腔的所有区域可以被到达。最后，由转动密封网络30.1产生的或在转动密封网络30.1附近产生的热必须被控制，以防止在移动经过通路的溶液内的细胞发生溶解。例如，通过选择硬的材料用于构建转动轴、抛光与密封装置接触的转动轴区域并且使在转动轴和密封装置之间的接触最小化，这可以被实现。

在一个实施例中，转动密封网络30.1包括单一的橡胶密封装置30.3和空气垫圈(未显示)。该密封装置和垫圈提供了用于任何可能危害系统的无菌性的生物物质的弯曲路径。在另一个实施例中，转动密封网络30.1包括隔离了单个流体路径的多个弹簧加载的密封装置30.3。密封装置30.3由可以被消毒并且可以在没有滑润剂的情况下密封转动轴的材料制成。在另一个实施例中，转动密封网络30.1包括一对形成不同的流体路径并且可以经受住系统的转动并且不会引起细胞溶解的陶瓷盘(未显示)。在另一个实施例中，流体路径是柔性的，并且被允许相对于处理腔缠绕和展开。通过使柔性的流体路径对于处理腔30的每两圈转动一圈，这可以被实现。这完全地免除了对转动密封装置的需要。

在一个实施例中，处理腔30被设计为使流体路径经过转动密封网络30.1的转动轴线进入，然后分成最小两条流体路径30.5，该流体路径30.5中的每条通到朝向输出腔50的相反的处理腔30的末端。因此，像在图7和8中所显示的那样，在优选实施例中，处理腔30包括两个或多个输出腔50。这些输出腔50被定位为使它们在处理期间处在一个方位30.7，并且为了使浓缩的可再生细胞回收而处在另一个方位30.8。经过从处理腔30突出出来的把手53，输出腔50两个位置可以被手动地操纵。一旦可再生细胞组合物转移到图4的处理腔，组合物就经受例如大概是重力的400倍的负荷，持续的时段大概为5分钟。输出腔50被构建为使腔的外部末端形成用于稠颗粒和细胞的小的贮备处。当允许经过第二流体路径(未显示)将较轻的浮在表面的东西清除的时候，输出腔50保留术语称之为“细胞小球”的稠颗粒。输出腔还被构建为使得在不扰乱细胞小球的情况下将浮在表面的东西清除。经由用有助于清除浮在表面的东西的阀门14和泵34控制的流体路径，这可以被实现。该第二流体路径沿着转动密封网络30.1的转动轴线。该流体路径从在处理腔30的中心内的低点行进经过转动密封装置而到达废物容器40。

细胞小球包括本发明的浓缩的可再生细胞。在一些实施例中，在浮在表面的东西被清除并且被引导到废物腔40之后，以在上面所描述的方式，额外的溶液和/或其它添加剂可以从收集腔20被添加到处理腔30，由此使细胞小球重新悬浮。以该方式的细胞小球重新悬浮允许进一步对可再生细胞进行洗涤，以清除不想要的蛋白质和化学化合物，及允许增加流动到细胞的氧气。所得到的悬浮液可以经受另一个大概是重力的400倍的负荷，持续的另一个时段大概为5分钟。在第二“细胞小球”被形成并且所得到的浮在表面的东西被清除到废物腔40之后，以在上面所描述的方式，最终的洗涤可以用盐水或一些其它适当的缓冲溶液进行。然后，在输出腔50被定位在适合于清除细胞的方位之后，使用适当的注射器，处在输出腔50内的最终的小球可以被回收。在其它实施例中，最终的小球可以自动地移动到在输出腔50内的容器，根据需要，该最终的小球可以被清除和被贮存或被使用。该容器可以是任何适当的形式或尺寸。例如，容器可以是注射器。在所有实施例中，以无菌的方式，最终的小球被清除。例如，像在这里所描述的那样，输出容器50可以自动地热密封并且与处理腔的其它构件隔离开来，用于随后在专有的治疗应用中进行回收和使用。

在所图示的图4的实施例中，压力传感器29在管线内，以确定当可再生细胞组合物进入处理腔30的时候由泵34产生的可再生细胞组合物的压力。额外的盐水或其它缓冲和洗涤溶液可以被添加到可再生细胞组合物，以当溶液在处理腔30内被处理的时候，有助于清除不想要的蛋白质。该重复的洗涤可以进行多次，以提高可再生细胞溶液的纯度。在某些实施例中，当被认为是提高处理所必需的时候，盐水可以在任何步骤被添加。

在其它实施例中，处理腔30或输出腔50可以包括一个或多个端口，例如端口51或52。这些端口中的一个或多个可以被设计成将可再生细胞或其部分引导到其它像植入材料(例如架子或骨头碎片)、外科手术设备、细胞培养设备或纯化设备那样的目标。在这些实施例中，处理腔30或输出腔50可以包括额外的设备，以将可再生细胞和添加剂混合起来。通过本领域的那些技术人员所已知的任何方式，包括搅动、摇动、倒置，但不局限于此，或通过压缩脉冲或移动滚筒，混合可以被实现。端口也可以用于添加一种或多种添加剂，例如生长因子、重新悬浮流体、细胞培养试剂、细胞膨大试剂、细胞保存试剂或包括将基因转移到细胞的制剂的细胞改变试剂。添加剂的其它例子包括对洗涤和分解进行优化的制剂、在处理期间提高活性细胞群体的存活能力的添加剂、抗微生物剂(例如抗生素)、使脂肪细胞和/或红细胞溶解的添加剂或使感兴趣的细胞群体富集起来的添加剂(通过对固相部分进行有差异的粘附或另外促进细胞群体的相当大的减少或富集)。

例如，为了得到同源的可再生细胞群体，任何用于分离特别的可再生细胞类型的合适的方法可以被使用，例如使用特定细胞的抗体，其对现有的抗原进行识别并且使现有的抗原结合在例如像内皮前体细胞那样的干细胞或祖细胞上。这些包括正选择(选择目标细胞)、负选择(选择性地清除不想要的细胞)或其组合。在使用当受到特殊酶的作用的时候发荧光的分子进行选择时，像酶那样的细胞内标志也可以被使用。另外，带有粘附性质的固相材料可以插入到系统的输出腔内，该带有粘附性质的固相材料被选择以允许对在最终的细胞小球内的特别的可再生细胞的群体进行有差异的粘附和/或洗脱。

该有差异的粘附措施的可替换的实施例可以包括使用对在目标可再生细胞和不想要的细胞上所不同表达的表面分子进行识别的抗体和/或抗体的组合。基于特殊细胞表面标志(或其组合)的表达的选择是另一项普遍应用的技术，在该技术中，抗体(直接地或间接地)接附到固相支撑结构(Geiselhart等，1996；Formanek等，1998；Graepler等，1998；Kobari等，2001；Mohr等，2001)。

在另一个实施例中，细胞小球可以重新悬浮起来、在流体材料之上(或在流体材料之下)分层形成连续的或不连续的密度梯度并且放置在用于基于细胞密度对细胞群体进行分离的离心装置内。在类似的实施例中，连续的流动措施也可以被使用，例如血液分离(Smith，1997)和淘洗(带有逆流或不带有逆流)(Lasch等，2000)(Ito和Shinomiya，2001)。

在所有前述的实施例中，像在编号为10/242,094、题目为“PRESERVATION OF NON EMBRYONIC CELLS FROM NON HEMATOPOIETICTISSURES”、于2002年9月12日提交的美国专利申请中所描述的那样，所分离的来自脂肪的细胞的至少部分可以被冷藏，该美国专利申请要求编号为60/322,070的于2001年9月14日提交的共同转让的美国临时专利申请的优先权，且在这里通过参考将它们的全部内容确切地合并。

在优选实施例中，整个系统是自动化的。在另一个实施例中，系统具有自动化的构件和手动的构件。系统可以包括一个或多个安装在可再次使用的硬件构件或模块上的一次性构件。本发明的自动化的系统配备了有助于对系统进行适当操作的屏幕显示器(查看图16)。自动化的系统也可以配备提供过程状态和/或关于适当地设置系统的一次性构件的逐步说明的屏幕。屏幕也可以指示在系统内的问题或故障，如果它们发生的话，并且如果合适的话，屏幕也可以提供“故障检修”指导。在一个实施例中，允许使用者与系统交互的屏幕是触摸屏。

部分自动化的系统和完全自动化的系统可以包括处理设备(例如微处理器或个人电脑)和所关联的软件程序，该所关联的软件程序提供了用于系统的控制逻辑，以基于使用者的选择，操作一个或多个过程步骤并且使之自动化。处理设备可以可操作地联接到系统的一个或多个构件或步骤。作为例子，可服从于该自动化的步骤包括：通过控制系统或处理设备的泵和阀门，控制沿着特别的管路路径的流体和组织的进出；控制激活的适当顺序和/或方向；用压力传感器检测阻塞；混合机构，使用体积测定机构，测量沿着特别的路径要被移动的组织和/或流体的量；使用热控制设备，维持多种构件的温度；对细胞进行洗涤和浓缩，以及将过程与定时和软件机构整合起来，但不局限于此。自动化的系统也可以包括用于对阻塞进行检测的压力传感器和类似的安全和质量控制机构。在一个实施例中，软件可以对过程的参数进行控制，以允许生产按操作者所限定的特殊参数而准备的细胞群体。例如，基于正在处理的组织类型和/或正在获取的细胞群体或亚群体，处理设备可以控制离心速度。这样，自动化设备或多个自动化设备就改善了过程的进行，并且提供了对脂肪组织的自动获取和对脂肪组织的自动处理，用于给予患者。处理设备也可以包括标准的并口或串口或其它与其它电脑或网络连通的装置。因此，处理设备可以是单独的单元，或可以与另一个设备关联起来。

在某些实施例中，经由处在处理设备内的软件，系统的一个或多个方面是使用者可编程的。处理设备可以在只读存储器(ROM)内具有一个或多个预先编程的软件程序。例如，处理设备可以具有预先编程的适合于处理血液的软件、用于处理脂肪组织以得到小体积的可再生细胞的另一个程序和用于处理脂肪组织以得到较大体积的可再生细胞的另一个程序。处理设备也可以具有基于使用者输入的有关信息，例如所需要的可再生细胞的量、所处理的组织的类型、所需要的处理后操纵的类型、治疗应用的类型等，为使用者提供合适的参数以对过程进行优化的预先编程的软件。软件可以允许对“运行数据”进行自动化的收集，例如包括一次性构件的批号、温度和体积测量结果、组织体积和细胞数量参数、所应用的酶的剂量、培育时间、操作者身份、数据和时间、患者身份等。

在设备的优选实施例中，条码阅读系统可以被整合，以允许将这些变量的数据(例如一次性套件批号和有效期、胶原酶的批号和有效期、患者/样品标识符等)录入到处理设备内，作为过程文件的部分。这可以减小数据录入错误的机会。使用USB或其它本领域已知的接口和系统，该条码阅读系统可以容易地包括到处理设备内。这样，设备就可以提供对数据录入和过程文件的整合控制。这些参数的打印报告可以是系统编程操作的使用者所限定的参数的部分。自然地，这应该需要整合打印机构件(硬件和驱动程序)或在软件内整合打印机驱动程序加上在设备的硬件内整合用于打印机的接口输出连接器(例如USB端口)。

在某些实施例中，系统是单一的整合的系统，该单一的整合的系统不需要使用者介入来进行分离和浓缩过程的各种步骤，也不需要分开的设备。在其它实施例中，在没有使用者输入的情况下，系统可以按全自动模式运行。系统也可以按半自动模式运行，在该半自动模式期间，在没有使用者介入的情况下，系统进行某些步骤，但在某些过程可以发生之前，系统需要使用者介入。在其它实施例中，系统是单一的整合的系统，该单一的整合的系统显示说明，以指导使用者在预定的时间进行预定的操作。例如，处理设备可以有助于使用者经过系统的管路、腔和其它构件的适当插入所必须的步骤。因此，使用者可以确保操作以适当的顺序被进行。该系统还可以需要使用者对每个操作步骤进行确认，以防止在过程中疏忽地激活或结束步骤。在又一个实施例中，系统可以开始进行自动化的检查，以确认管路、腔的插入是正确的、确认没有阻塞等。在再一个实施例中，本发明的系统能够被编程，以通过对经过系统的组织流动进行自动化的控制，进行多个分离和浓缩过程。例如，在对患者进行否则可能丢失的组织被收集到系统内并且来自组织的可再生细胞被分离和浓缩并且重新返回到患者的外科手术期间，该特点可能是重要的。

像在上面所阐明的那样，系统的构件可以是一次性的(在这里被指代成“一次性套件(多个一次性套件)”)，从而使系统的部分可以在单一使用之后被处理掉。该实现可以有助于确保任何与患者的组织发生接触的表面在使用之后被适当地处理掉。在图13中，图示了示范性的一次性套件。在优选实施例中，系统的一次性构件被预先消毒并且封装起来，从而是“现货供应”可使用的，该一次性构件是容易使用的并且是容易加载的，并且该一次性构件免除了对许多管路连接和管路连接的复杂铺设的需要。该一次性构件生产起来是相对廉价的，因此不会由于它们是一次性的而产生相当大的费用。在一个实施例中，一次性系统(在这里被可互换地指代成“一次性套件(或多个一次性套件)”)包括、基本上包含或包含收集腔20、处理腔30、废物腔40、输出腔50、过滤器组件36、样品袋60和所关联的管道12或管路。在系统的一次性套件的优选实施例中，收集腔20和处理腔30通过容纳在刚性框架内的管道12连接起来。处理腔30的转动密封网络(图7和8)也可以容纳在同一刚性框架内。在另一个优选实施例中，一次性套件的各种腔和容器包括能够与系统的处理设备连通所必须的接口，从而当需要的时候，在没有使用者介入的情况下，使泵、阀门、传感器和其它使系统自动化的设备被适当地激活或去激励。接口也减少了设置系统所需要的时间和技能，并且通过指示如何正确地设置系统并且在设置错误的情况下警告使用者，接口也减少了错误。

一次性套件还可以包括一个或多个适合于从患者身上得到脂肪或其它组织并且使可再生细胞返回到患者的针或注射器。所包括的针和注射器的类型数量和种类将要基于所处理的组织的类型和量。一次性套件还可以包括一个或多个刚性的或柔性的容器，以保持洗涤流体和在系统内所使用的其它处理试剂。例如，一次性套件可以包括容器，以保持盐水、酶和过程所需要的任何其它治疗或置换流体。另外，可以为一次性套件提供合适的洗涤溶液、重新悬浮流体、添加剂、制剂或移植材料，用于与本发明的系统和方法一起使用。

系统的可再次使用的构件包括、基本上包含或包含用于收集腔的搅动机构、泵和所匹配的激活阀门和泵控制的传感器、离心马达、离心马达的转动框架、使用者界面屏幕和USB端口和所关联的其它设备。在图14中，图示了示范性的可再次使用的构件。可再次使用的硬件可以与多种一次性套件一起使用。例如，像在这里所描述的那样，可再次使用的硬件可以与一次性套件一起使用，用于从很多种组织分离和浓缩可再生细胞。

在一个实施例中，用于在系统内使用的一次性套件包括可以容纳大约800毫升的组织的收集腔20；可以处理由大约800毫升的在收集腔20内被洗涤并且被煮解的组织产生的可再生细胞组合物的处理腔30；可以容纳至少0.5毫升的可再生细胞的输出腔50；和可以容纳大约10升的废物的废物容器40。在该实施例中，硬件设备不大于24”长×18”宽×36”高。一次性套件及硬件设备的各种构件的可选择的尺度可以根据需要构建，并且在没有限制的情况下，旨在被本发明包含。

系统的一次性构件是容易放置在设备上的。在图15中，图示了所使用的与相应的可再次使用的构件组装在一起的一次性套件的示图。系统被优选地设计为使它可以对加载不当的一次性构件进行检测。例如，每个一次性套件的构件可以具有用颜色进行指导的标志，以将管路、腔等适当地排列并且插入到在系统内的合适的位置。在额外的实施例中，在这里所披露的系统是便携式单元。例如，便携式单元能够从一个已经发生脂肪组织获取的地点移动到另一个用于脂肪组织获取的地点。在某些实现中，便携式单元适合于由患者的床边获取和处理脂肪组织。这样，便携式单元就可以是系统的部分，其可以从患者移动到患者。因此，便携式单元可以在锁定在适当的位置的轮上，这样贯穿过程，便携式单元就可以在方便的地点，在稳定的并且安全的位置，被容易地放置和使用。在其它实施例中，便携式单元被设计成用于设置在像桌子顶部那样的平坦表面上并且在像桌子顶部那样的平坦表面上进行操作。便携式单元也可以被包围在壳单元内。便携式单元还可以包括挂架、吊钩、标签、刻度和其它设备，以在过程中有所帮助。所有在这里所描述的可再次使用的系统的构件，例如离心装置、处理设备、显示屏幕，可以安装在系统的便携式单元上。

可替换的用于得到可再生细胞的手动的实施例也在本发明的范围内。例如，在一个实施例中，使用在这里所描述的系统的构件、装备和/或供给源的任何组合，脂肪组织可以被处理。

由前述方法得到的可再生细胞可以与脂肪组织片段混合起来，并且在不做进一步处理的情况下，被给予患者，或可以在与其它组织、细胞、植入物或设备混合在一起之后，被给予患者。在某些实施例中，可再生细胞与一个或多个还没有被类似地处理过的脂肪组织单元混合在一起。这样，通过实践本发明的方法，包括带有浓度提高的可再生细胞的脂肪组织的组合物就可以被给予患者。脂肪组织的各种单元的体积可以是不同的。例如，一个体积可以比另一个脂肪组织单元的体积至少大25％。此外，一个体积可以比另一个脂肪组织单元的体积至少大50％，例如至少大100％，甚至大150％或大更多。另外，通过将带有可以是包含可再生细胞的细胞小球的浓缩的可再生细胞群体的第一脂肪组织单元与一个或多个其它脂肪组织单元混合起来，想要的组合物可以被得到。在某些实施例中，这些其它单元不具有浓度增加的可再生细胞，或换言之，与包含在第一脂肪组织单元内的可再生细胞浓度相比，这些其它单元具有较小的可再生细胞浓度。在其它实施例中，单元中的一个是例如包含浓度增加的可再生细胞的冷藏的材料。

在处理终点，浓缩的细胞可以被加载到像注射器那样的输送设备内，用于通过皮下技术、肌肉内技术或其它允许将细胞/组织混合物输送到在患者体内的目标位点例如尿道周围区域、在皱纹下的或在乳房内的皮下空间的技术，放置到接受者体内。换言之，通过任何本领域的普通技术人员所已知的方式，细胞可以被放置到患者体内。优选实施例包括通过针或导管或通过直接外科手术植入进行放置。在外科手术植入的实施例中，细胞和组织混合物可以与像预先形成的基质那样的添加剂联合应用。

活性细胞群体可以单独应用，或可以与其它细胞、组织、组织片断、像VEGF和其它已知的血管形成或动脉形成生长因子那样的生长因子、生物活性的或生物惰性的化合物、可再吸收的塑料架子或其它旨在提高群体的输送、功效、耐受性或功能的添加剂组合应用。通过插入DNA或通过以这样的方式放置在细胞培养物内，以为了实现结构目的或治疗目的而使细胞的功能发生变化、提高或增补，细胞群体也可以发生改变。例如，像在(Morizono等，2003；Mosca等，2000)中所披露的那样的用于干细胞的基因转移技术是本领域的普通技术人员所已知的，并且可以包括病毒转染技术，并且更具体地包括像在(Walther和Stein，2000)和(Athanasopoulos等，2000)中所披露的那样的与腺关联的病毒基因转移技术。像在(Muramatsu等，1998)中所披露的那样的非基于病毒的技术也可以被进行。

在另一个方面，细胞可以与可以允许细胞作为它们自己的生长因子来源的基因编码的生长因子例如血管形成生长因子(或多种血管形成生长因子)组合起来。通过在本领域中已知的任何技术，包括腺病毒转导、“基因枪”、脂质体介导的转导和逆转录酶病毒或慢病毒介导的转导、质粒、与腺关联的病毒，但不局限于此，基因(或基因的组合)的添加可以被进行。细胞可以与载有基因输送媒介物的载体材料一起被植入，该基因输送媒介物能够随时间将基因输送到细胞和/或将基因呈送给细胞，从而使转导可以继续或在原处开始。

当细胞和/或包含细胞的组织被给予的患者不是从其得到细胞和/或组织的患者的时候，一种或多种免疫抑制剂可以被给予接收细胞和/或组织的患者，以减小并且优选地避免移植排斥。当在这里被使用的时候，术语“免疫抑制药物或制剂”旨在包括抑制或妨碍正常免疫功能的药学制剂。适合于在这里所披露的方法的免疫抑制剂的例子包括抑制T-细胞/B-细胞协同刺激路径的制剂，例如像在编号为20020182211的美国专利出版物中所披露的那样妨碍经由CTLA4和B7路径的T-细胞和B-细胞的结合的制剂。优选的免疫抑制剂是环孢霉素A。其它例子包括myophenylate mofetil、雷伯霉素和抗胸腺细胞球蛋白。在一个实施例中，免疫抑制药物与至少一种其它治疗制剂一起被给予。免疫抑制药物以与给药途径相容的配方被给予，并且以足以达到想要的疗效的剂量被给予对象。在另一个实施例中，免疫抑制药物被瞬时地给予，持续足够的时间，以诱导出对本发明的可再生细胞的耐受性。

在本发明的某些实施例中，细胞与一种或多种像细胞活素和生长因子那样的细胞分化剂一起被给予患者。在(Gimble等，1995；Lenmon等，1995；Majumdar等，1998；Caplan和Goldberg，1999；Ohgushi和Caplan，1999；Pittenger等，1999；Caplan和Bruder，2001；Fukuda，2001；Worster等，2001；Zuk等，2001)中，披露了各种细胞分化剂的例子。

在另一个方面，细胞群体可以被放置到接受者体内，并且被可再吸收的塑料套或其它材料包围，例如由MacroPore Biosurgery，Inc.生产的材料(例如编号为6,269,716、5,919,234、6,673,362、6,635,064、6,653,146、6,391,059、6,343,531、6，280,473的美国专利)。在该设施内，套可以防止肌肉和其它软组织下垂到用来自脂肪组织的细胞处理的缺陷的区域内，以有助于对缺陷进行控制修复。该措施可以在套可以被预先模制成想要的最终形式的再造外科手术中使用，该最终形式允许组织在体内被模制成想要的形状。在该方面，通过增补像前脂肪形成或血管形成蛋白质生长因子或生物的或人工的支架那样的额外组分，有益的作用可以被提高。

像在这里所描述的那样，许多缺陷和病症可以用使用本发明的系统和方法得到的可再生细胞进行治疗。例如，在进行加大乳房的乳房成形术、软组织缺陷矫正和/或治疗尿失禁时，用可再生细胞提高的脂肪组织可以改善新血管形成并且减小植入物的坏死，由此使得移植改善并且使得形成脂坏死拟孢囊的风险减小。像在上面所描述的那样，可再生细胞被提高的脂肪组织可以用于矫正软组织缺陷和相似的情况。将该浓缩的可再生细胞群体添加到正常的脂肪组织移植物，这可以通过提供支持的微环境而改善移植物的寿命。另外，在这里所描述的组合物也可以用于提供对下部的食管括约肌及外部的肛门括约肌的结构支撑，以分别治疗胃食管回流疾病(GERD)和大便失禁(Bemardi，Favetta等，1998)。

典型地，被认为是传统的加大乳房成形术的候选者的人是通过用来自脂肪组织的细胞加大的自体脂肪转移进行乳房加大的候选者。除了那些被认为适合进行传统的加大乳房成形术的候选者以外，这些方法还可以应用到试图进行乳房或两个乳房的小/中等增大、形状变化或轮廓改变的人群，而用现有的植入技术，这在技术上可能是不可能的或在美容上可能是不可接受的。类似地，软组织加大的候选者是使用细胞被提高的自体脂肪组织的自体脂肪转移过程的候选者。软组织加大过程的例子包括：包括面部(例如眉间、鼻唇)褶皱、口周细纹、提线木偶(marionette)细纹、皮肤起皮但不局限于此的面部；臀部；小腿；生殖器；后眼窝和脚底脂垫的轮廓变形，但不局限于此。被认为是尿道膨胀注射的候选者的人也是用在这里所披露的细胞被提高的脂肪组织进行自体脂肪移植的候选者。这些过程可以包括在女性体内的经尿道的注射及在尿道周围的注射及在男性体内的经尿道的注射或前行性注射。除了披露了过程的所有有关风险和好处的完全知情同意以外，术前评价还典型地包括即往病史和体检。

典型地，在确认了患者的候选者身份之后，患者经历脂肪组织收集。为了确定适合进行脂肪组织收集的位点，患者的体质可以被检查。通过适合于患者临床状态的血液动力学监测，过程可以在床边或在操作间内进行。一些优选的获取位点(多个获取位点)的特征在于：由正常的解剖学结构限制的潜在空间(多个潜在空间)，没有主要脉管结构或内脏结构受到损害威胁并且容易到达。虽然原始的获取位点典型地是优选的，但是先前的获取位点不会排除额外的脂肪组织获取。这些优选的位点包括接下来的部位：双侧下肢的大腿侧面区域和中间区域、前腹壁血管翳和双侧腰窝区域，但不局限于此。这些过程可以与脂肪塑形术相伴频繁地进行。通过患者的美容意愿及像由医师确定的安全状况，收集脂肪组织的位点也可以被确定。

例如，要被获取的区域被皮下注射标准的肿胀性流体溶液，该标准的肿胀性流体溶液可以包含在不同的标准化剂量体制中的利多卡因、盐水和/或肾上腺素的组合，也可以不包含这些东西。使用11-刀片的手术刀(或其它标准刀片)，小的切破伤口被制造，以横过在获取区域附近的真皮。刀片被转动，例如被旋转360度，以完成伤口。然后，钝尖端的14-规格的(或尺寸合适的)套管可以插入到皮下脂肪组织平面内。套管可以连接到动力辅助的抽吸设备或连接到用于手动吸取的注射器。然后，套管在平面内到处移动，以破坏结缔组织体系。所得到的吸取物的体积的范围可以是从大约0立方厘米到大约1500立方厘米。为了使用在这里所描述的方法对可再生细胞进行隔离和浓缩，以该方式收集的脂肪组织的片段或部分要被处理。为了根据当前所接受的照管标准重新植入到患者体内，脂肪组织的剩余物可以被处理。可选择地，经过脂肪切除过程，患者可以使脂肪被清除。在清除脂肪组织之后，用标准的外科手术技术，止血要被实现，并且伤口可以被根本上闭合。

对脂肪组织的收集可以发生在移植过程之前1小时到2小时。然而，收集的时间安排可以发生变化，并且可以基于质量照管标准。最后，负责执行照管患者的从事者确定收集的时间安排。在另一个实施例中，已经被冷藏在来自脂肪组织的细胞的储存机构内的来自脂肪组织的细胞可以被使用。

典型地，所收集的脂肪组织的体积从大约1立方厘米变化到大约1500立方厘米。收集组织的优选方法遵循所接受的质量照管标准。对于不同的患者，脂肪清除的体积将要发生变化，并且可能基于许多因素，包括：加大乳房成形术所需要的脂肪组织的量、美容意愿、年龄、身体体质、凝血状况、血液动力学稳定性、复合病变和医师偏好，但不局限于此。

在组织处理完成之后，患者可以准备经历与加大乳房成形术、软组织加大和/或尿失禁治疗相关的脂肪组织移植。一些围绕移植的事宜包括：时间安排、细胞剂量、途径、方法、部位和监测。

在本发明的某些实施例中，在进行移植过程时，可再生细胞被提高的脂肪组织被给予患者。这些方法不排斥随时间需要对材料进行多次注射。最后，所使用的时间安排将要遵循质量照管标准。在额外的实施例中，像在上面所讨论的那样，如果要被应用的细胞经历变化、纯化、刺激或其它操纵，那么可选择的时间安排方式就可以存在。

典型地，从在脂肪组织处理之后的细胞产量确定要被输送到个体患者的细胞剂量。对于特别的过程，可能不需要所获取的所有细胞，细胞的剩余部分可以像在这里所描述的那样冷藏。在一个实施例中，要被输送到患者的细胞的最小数量预期是5.5×10⁵个每50立方厘米所移植的脂肪。然而，这个值可以预期随数量的量级发生改变，以达到想要的作用。当所注射的体积的百分比预期随时间而倒退的时候，注射额外的加大的脂肪组织(过矫正)不是不平常的做法。另外，因为在这里所披露的方法不排斥对一系列剂量的需要，所以与在上面所指出的相比，更多的细胞可以被给予患者。

在乳房加大过程中，输送途径可以包括经过通过腋窝、乳晕周围、乳房下而插入到乳房组织内的标准的14-规格的钝尖端的套管的开放输送。在软组织加大过程中，输送途径可以包括经过通过位置适当的切口而插入到软组织内的标准的14-规格的钝尖端的套管的开放输送。在尿失禁过程中，输送途径可以包括经过膀胱镜可视化在膀胱颈和尿道附近的直接注射。可选择地或另外，经由前行性途径，移植物可以被输送。可选择地或另外，细胞被提高的组织可以被输送经过经由当前所接受的方法被到达的静脉内途径。在静脉内的方法中，经过由通过外科手术介入引发的炎症过程引起的内分泌和旁分泌交换，控制所移植的材料的定向流动可以被实现。在这里所讨论的途径不排斥使用多个途径以达到想要的临床作用或实现脐切口。可选择地或另外，经过穿过腋窝的内窥镜胸下措施，细胞被提高的组织可以被输送。

在一个实施例中，从脂肪处理得到的可再生细胞以在上面所描述的比例，与要被移植的脂肪混合在一起。经过自动化的装置(例如设备被控制的搅动装置或离心装置)或经过手动的方法(例如1???uer锁定的注射器、漩涡)，该混合可以发生。优选地，可再生细胞被提高的脂肪组织以泪滴状的形式被给予，以使表面面积与体积的比例最大化。在另一个实施例中，在人工的或天然的介质或组织支架内，可再生细胞可以被重新悬浮起来，然后，该人工的或天然的介质或组织支架插入到植入区域内，例如乳房区域和/或内在的括约肌区域，以达到想要的作用。在优选实施例中，按着通常被指代成“科尔曼技术”的过程(Coleman 1991；Coleman 1995；Coleman 2001)，组合起来的细胞和组织被注射。

脂肪组织收集可以发生在任何合适的临床设施内，例如接下来的地点：门诊部、临床办公室、急救部门、医院病房、重症监护室、手术室、导管插入间和放射间。典型地，加大乳房成形术在门诊设施内进行，但也可以在住院环境内进行。典型地，尿道膨胀注射在门诊设施内进行，但也可以在住院环境内进行。

在乳房加大过程中，通过接下来的临床测量结果中的一项或多项，可再生细胞被加大的自体脂肪转移的作用可以表现出来：增加的乳房尺寸、改变的乳房形状、改变的乳房轮廓、持久的移植、降低的脂坏死囊形成速率、改善的患者满意度和降低的可植入的外来材料的使用。在其它软组织加大过程中，通过接下来的临床测量结果中的一项或多项，可再生细胞被加大的自体脂肪转移的作用可以表现出来：改善的软组织形状、改善的组织功能、改善的软组织轮廓、持久的移植、改善的患者生活质量和降低的可植入的外来材料的使用。在尿失禁过程中，通过接下来的临床测量结果中的一项或多项，用于支撑括约肌的可再生细胞被加大的自体脂肪转移的作用可以表现出来：降低的失禁频率、持久的移植、改善的患者生活质量和降低的可植入的外来材料的使用。典型地，经过几天或几周，出现了细胞治疗的作用。然而，有益的作用可能早在若干小时就被观察到，并且可能持续几年。

在输送所移植的脂肪组织之前、在此期间和在此之后的患者监测可以包括接下来的事宜：凝血研究、氧饱和度、血液动力学监测和伤口状态，但不局限于此。当考虑到形成的钙化可能歪曲检测乳房恶性钙化的能力的时候，可以建议患者他们应该接受术前诊断过程，例如乳房X线照相术。然而，建议可以是可选择的，因为使用磁共振成像可以克服该局限性。对于想要的临床作用，额外的监测是特殊的。在输送所移植的脂肪组织之前、在其期间和在其之后的患者监测可以包括接下来的事宜：尿分析、骨盆检查、膀胱镜检查和尿动力学评价、凝血研究、氧饱和度、血液动力学监测和伤口状态。对于想要的临床作用，额外的监测是特殊的。

接下来的例子被提供以表明可以应用该技术的特别情况和设施，并且不是旨在约束本发明和包括在本披露中的权利要求书的范围。

例子

例1：通过ADC表达血管形成生长因子-VEGF

脉管内皮生长因子(VEGF)是血管形成的重要调节剂中的一种(Nagy等，2003；Folkman 1995)。胎盘生长因子，VEGF族中的另一成员，在血管形成及动脉形成中发挥类似的作用。特殊地，将野生类型(P1???GF+/+)的细胞移植到分离P1GF的小鼠体内，这恢复了使得从后肢缺血快速痊愈的能力(Scholz等，2003)。

假设血管形成及动脉形成对于血管重新形成过程是重要的，那么使用ELISA检定(R & D System，Minneapolis，MN)，通过本发明的可再生细胞的P1GF和VEGF表达被检查，该ELISA检定使用来自三名捐赠者的来自脂肪的可再生细胞。一名捐赠者具有高血糖症和2型糖尿病病史(与微血管疾病和大血管疾病高度关联的状态)。在增补了10％的FCS和5％的HS的DMEM/F-12介质内，来自每个捐赠者的可再生细胞被平铺成1,000个细胞/平方厘米，并且生长起来，直到融合在一起。浮在表面的样品被取走并且就P1GF和VEGF蛋白质的表达进行检定。像在图16A和16B中所显示的那样，结果表明，通过本发明的来自脂肪的可再生细胞，VEGF(图16A)和P1GF(图16B)的表达是旺盛的。

在单独的研究中，由来自正常成年小鼠的所培养的可再生细胞分泌的与血管形成相关的细胞活素的相对数量被测量。在带有10％的FBS的α-MEM内，可再生细胞被培养超过了细胞融合5天，在此时，细胞培养介质被获取并且通过抗体阵列分析(

小鼠细胞活素抗体阵列II，RayBiotech，Inc.)进行评价。接下来的与血管形成相关的生长因子被检测：脉管内皮生长因子(VEGF)、bFGF、IGF-II、嗜酸性粒细胞趋化蛋白、G-CSF、GM-CSF、IL-12p40/p70、IL-12p70、IL-13、IL-6、IL-9、瘦素、MCP-1、M-CSF、MIG、PF-4、TIMP-1、TIMP-2、TNF-α和血栓形成素。

这些数据表明，本发明的可再生细胞表达广泛阵列的血管形成和动脉形成生长因子。而且，糖尿病患者以与正常患者的水平相当的水平表达VEGF和P1GF，该发现暗示，糖尿病患者可以是通过自体的来自脂肪的可再生细胞进行血管形成治疗的候选者。

例2：ADC包含参与血管形成的细胞群体

内皮细胞和它们的前体，内皮祖细胞(EPC)参与血管形成，这是已知的。为了确定EPC是否处在来自脂肪的可再生细胞内，来自人脂肪的可再生细胞对于EPC细胞表面标志例如CD-34评价。

通过人皮下脂肪组织的酶煮解，ADC被隔离。在包含0.2％的胎牛血清(FBS)的磷酸盐盐水缓冲剂(PBS)内，ADC(100微升)被培育，并且以4摄氏度的温度，被培育20分钟到30分钟，使得用荧光标记的抗体被引导朝向人内皮标志CD-31(分化的内皮细胞的标志)和CD-34(EPC标志)及选择性地表达在多能性细胞上的人ABCG2(ATP结合盒转运子)。在洗涤之后，细胞在FACSAria分类器上被分析(BecktonDickenson-Immunocytometry)。然后，通过FACSDiva软件(BD-Immunocytometry，CA)进行数据获得和分析。结果(未显示)显示，来自健康成年的来自脂肪的可再生细胞表达EPC标志CD-34和ABCG2，但不表达内皮细胞标志CD-31。在来自带有糖尿病史的捐赠者的可再生细胞内，以类似的频率，检测到表达EPC标志CD-34的细胞。

为了在对在内皮细胞分化介质内的来自人脂肪的可再生细胞进行培养之后，确定在来自人脂肪的可再生细胞内的EPC的频率，ADC被平铺到涂有纤维结合蛋白的板上，并且在内皮细胞介质内培养三天，以清除成熟的内皮细胞。不粘附的细胞被清除并且被重新平铺。在14天之后，通过用FITC-共轭Ulex europaeus凝集素-1(Vector Labs，Burlingame，CA)和稀释标记的(Dil-labeled)乙酰化的LDL(MolecularProbes，Eugene，OR)进行染色，集群被识别。像在图17中所显示的那样，结果表明，EPC频率大概为500EPC/10⁶ADC细胞。

EPC存在于来自脂肪组织的可再生细胞内，这表明这些细胞可以直接参与新血管的发育，并且提高血管形成和重新灌注。

例3：在ADC内的脉管结构的体外发育

技术被认可的用于血管形成的检定是一种在纤维原细胞的滋养层上生长起来的内皮细胞发育成使人联想到初生毛细管网络的由CD-31阳性的管组成的复杂网络(Donovan等，2001)的检定。由于来自脂肪的可再生细胞包含内皮细胞、EPC和其它基质细胞前体，所以我们测试这些可再生细胞在没有滋养层的情况下形成毛细管状结构的能力。从正常小鼠的腹股沟脂肪垫得到的可再生细胞在培养之后两周时间发育成毛细管网络(图18A)。值得注意地，来自带有用链脲霉素(STZ)诱导的1型糖尿病的高血糖小鼠的可再生细胞，在给予STZ之后8周时间形成了像由来自正常小鼠的细胞形成的那些毛细管网络那样的同等的毛细管网络(图18B)。

在随后的研究中，在全培养介质(增补了10％的FCS的α-MEM)内，并且在没有任何额外的生长因子的情况下，来自脂肪的可再生细胞被培养。这些可再生细胞也形成了毛细管网络。此外，对于内皮细胞标志CD31、CD34、VE-钙粘附蛋白和von Willebrand因子/因子VIII，形成的脉管结构是染色阳性的，但对于全淋巴细胞标志CD45，不是染色阳性的。

为了比较来自年轻小鼠和年老小鼠的可再生细胞形成毛细管网络的能力，在全培养介质(增补了10％的FCS的α-MEM)内，并且在没有任何额外的生长因子的情况下，来自年轻小鼠和年老小鼠(年龄为1个月、12个月或18个月)的可再生细胞被培养两周。在来自所有捐赠者的可再生细胞的培养物内，同等的毛细管状网络被观察到(未显示)。

前述数据表明，来自正常患者和糖尿病患者及年轻患者和年老患者的来自脂肪的可再生细胞可以形成与初生毛细管网络的形成一致的脉管结构。因此，本发明的可再生细胞可以用于治疗血管形成不足。

例4：在ADC内的脉管结构的体内发育

如果细胞不能发挥体内血管形成活性，那么体外血管形成潜力就是没有意义的，虽然是有希望的。外科手术引起后肢缺血是能够验证给定的治疗的血管形成潜力的体内模型。该模型在免疫缺陷的(NOD-SCID)小鼠体内发育起来，其中，人细胞驱动重新灌注的能力可以被观察到。

像在下面所描述的那样，两条后肢的术前血流值被确定。在接下来的位点，麻醉小鼠的脉管系统用4-0丝带打结：1)在髂动脉分叉附近的髂动脉，2)恰好在深股动脉起源的远端，3)恰好在浅股动脉分支的附近。在结扎之后，脉管系统被全部清除。在伤口闭合之前，可粗略观察到的来自所结扎的股动脉的旁系分支也被结扎。24小时过后，经过尾静脉，129S小鼠被注射了5×10⁶个来自同源小鼠脂肪的可再生细胞，而NOD SCID小鼠被注射了来自人脂肪的可再生细胞。在紧接着外科手术之后并且在处理后的间隔，使用激光多普勒流动成像仪(Moor Instruments Inc.，Wilmington，DE)，流动被成像。每周3次持续24天采集到的测量结果以该肢的术前值被归一化，并且相对于对照(未手术的)肢被呈现。

后肢缺血模型对所使用的小鼠的品种是及其敏感的。NOD SCID小鼠是免疫缺陷动物，缺乏激起急性炎症反应的能力。对于这些小鼠，该手术措施产生严重的缺血，从而使三分之二的未处理的动物损失在大腿切口位点之下的后肢结构。细胞处理的动物没有损失在脚趾之上的任何结构。然而，对于有免疫活性的129S小鼠，未处理的动物不会损失在趾骨之上的任何结构，并且显示部分地重新形成重新灌注的内生能力。这可能归结于与急性炎症反应相关联的内在的血管形成。这可以解释为什么当比较不同品种的被处理的动物和对照动物的时候重新灌注不是很极端的。

然而，结果显示，当与未处理的两种品种的小鼠比较的时候，用来自脂肪的可再生细胞处理的小鼠显著地显示了改善的灌注。到第12天，当与在未处理的小鼠体内的10±10％比较的时候，在用人可再生细胞处理的NOD-SCID小鼠体内，血流恢复到50±11％(p<0.05)。类似地，在第14天，当与在未处理的小鼠体内的56±4％比较的时候，有免疫活性的129S小鼠显示的流动恢复为80±12％。

另外，对小鼠的粗略解剖显示，在用可再生细胞处理的小鼠的后肢内，出现了旁系血管，但在那些来自未处理的小鼠的后肢内或在任何小鼠的健康后肢内，没有出现旁系血管。

例5：增加ADC剂量是与改善的移植存活和血管形成相关联的

在进行塑形和再造外科手术时，自体脂肪组织的移植是相对普遍的过程{Fulton，1998；Shiffman，2001}。然而，该过程受到以下事实的限制：在没有脉管供给的情况下，脂肪组织片段被转移，因此移植存活基于新血管形成(Coleman，1995；Eppley等，1990)。这样，以受限的方式，所移植的组织就重新呈现了缺血组织。

对Fisher大鼠的研究被进行，在该研究中，脂肪组织片段被移植到在外部大腿的肌肉之上的皮下空间内。右腿只被移植了0.2克脂肪组织片段，左腿被移植了通过以三个不同的剂量(1.7×10⁵-1.3×10⁶个细胞/移植；每个剂量三只动物)添加来自脂肪的干细胞而得以增补的0.2克脂肪组织片段；以该方式，对侧腿作为对照。然后，动物被饲养一个月，在此之后，动物被无痛处死，而移植物被取回、被称重、被固定在福尔马林内并且被包埋在石蜡内，用于进行组织学分析。

像在图9A中所显示的那样，结果显示，在对照腿内，所移植的组织的保持是最小的，而在被处理的腿内，移植物重量的保持是基于剂量而增加的。此外，对移植物的免疫组织化学分析显示，在用来自脂肪的干细胞处理的移植物内，新血管形成和灌注是相当可观的(图20B，箭头)。这也是与脂肪组织形态学的保持相关联的(图20B)。

因此，例1到5表明，本发明的来自脂肪的可再生细胞分泌血管形成和动脉形成生长因子；在体外形成初生毛细管网络；提高脂肪移植物的存活；并且提高缺血的重新灌注。这样，本发明的可再生细胞就能够促进血管形成和动脉形成，并且在治疗多种带有潜在循环不足的疾病时，是可以发挥功能的。

例6：在小鼠体内通过来自脂肪的可再生细胞加大自体脂肪转移

在小鼠体内，来自脂肪的可再生细胞(ADC)加大自体脂肪转移的潜力被测试。从携带1acZ转移基因的小鼠(Rosa 26小鼠(B6；129S-Gt(ROSA)26Sor)；通常已知为Rosa 26小鼠)，ADC被得到。根据在这里所披露的方法，ADC与从组织相容的C57 B16/S129 F1小鼠的腹股沟脂肪垫得到的脂肪组织混合在一起，并且被植入到在额外的F1小鼠的头骨后部的皮下空间内。

在一个月之后，植入物被取回，并且在X-ga1溶液内被染色一整夜。当暴露给X-ga1时，表达1acZ转移基因的细胞(ADC)染成蓝色。移植物显示遍布组织各处的蓝色染色。然后，移植物被包埋在石蜡内，进行切片并且用小鼠脉管内皮生长因子1(VEGFR1)的受体的抗体进行染色。

图19显示了染色的结果，在其中，移植物显示为包含许多圆形结构，该圆形结构包括包含蓝色粒子(箭头)并且也是VEGFR1阳性(细胞质是黑色着色)的细胞。该数据确认了处理过的吸脂在移植物内诱导新血管形成的能力。

例7：在大鼠体内通过来自脂肪的可再生细胞加大自体脂肪转移

根据在这里所披露的方法，从近亲繁殖的Wistar大鼠提取出来的脂肪组织片段与来自脂肪的可再生细胞混合在一起。然后，该组合物被皮下植入到接受大鼠的大腿内，并且在其头皮之下。作为对照，相等数量的动物在头皮之下只接受脂肪组织(没有ADC)，而在大腿内接受移植物的动物的对侧腿只被植入脂肪组织。在移植之后一个月，移植物被获取。

结果(图20)显示，随着增加来自脂肪的可再生细胞的剂量，大腿植入物的移植物重量有增加的趋势。对植入物的组织学检查显示，增补了ADC的移植物改善了血管分布。类似的相关性通过头皮植入物观察到，虽然由于在这些大鼠体内，背部头骨的脉管分布是低的，所以总保持是较低的。

例8：在进行乳房加大乳房成形术时的自体脂肪转移

人希望她的乳房的形状发生改变。除了披露了过程的所有有关风险和好处的完全知情同意以外，对患者的术前评价还包括即往病史和体检。

为了使过程开始，患者经历脂肪组织收集。为了确定适合进行脂肪组织收集的位点，患者的体质被检查。过程可以在患者的床边进行。脂肪组织被选择，以从患者的大腿侧面区域和中间区域进行获取。要被获取的区域被皮下注射标准的肿胀性流体溶液，该标准的肿胀性流体溶液可以包含在不同的标准化剂量体制中的利多卡因、盐水和/或肾上腺素的组合，也可以不包含这些东西。

使用11-刀片的手术刀(或其它标准刀片)，小的切破伤口被制造，以横过真皮。刀片被旋转360度，以完成伤口。然后，钝尖端的14-规格的(或尺寸合适的)套管插入到皮下脂肪组织平面内。套管可以连接到动力辅助的抽吸设备或连接到用于手动吸取的注射器。然后，套管在平面内到处移动，以破坏结缔组织体系。所得到的吸取物的体积在700立方厘米和1000立方厘米之间。为了使用在上面所描述的方法，对来自脂肪组织的可再生细胞进行隔离和浓缩，以该方式收集的脂肪组织的部分被处理。为了重新植入到乳房内，脂肪组织的剩余物被处理。可选择地，经过脂肪切除过程，患者可以使脂肪组织被清除。

在清除脂肪组织之后，用标准的外科手术技术实现对患者的止血，并且伤口被根本上闭合。在临床办公室内，对脂肪组织的收集大约发生在加大乳房成形术之前1小时到2小时。然而，收集的时间安排预期发生变化，并且将要基于质量照管标准。最后，负责执行照管患者的从事者确定收集的时间安排。

从脂肪组织处理得到的可再生细胞与要被移植的脂肪组织单元(大概为100立方厘米到300立方厘米)以在上面所描述的比例混合在一起。在组织处理完成之后，患者准备经历加大乳房成形术。从在脂肪组织处理之后的细胞产量，确定输送到患者的细胞剂量。大概为5.5×10⁵个细胞每50立方厘米的自体脂肪被移植到乳房内。经过通过乳晕周围切口而插入到乳房组织内的标准的14-规格的钝尖端的套管，组合物被输送。可再生细胞被提高的脂肪组织以泪滴状的形式被给予，以增加表面面积与体积的比例。

患者被监测，并且在过程之后大概7天，移植物看起来已经被成功地移植，对于主治医师，细胞治疗的作用变得明显起来。

例9：自体脂肪转移与软组织缺陷

患者希望进行软组织加大，尤其希望对皮肤起皮进行治疗。通过询问病史和身体评价，医师对患者进行评价，并且确定患者是自体脂肪转移的候选者。

为了使过程开始，患者经历脂肪组织收集。为了确定适合进行脂肪组织收集的位点，患者的体质被检查。过程可以在患者的床边进行。从患者的前腹壁血管翳获取脂肪组织。要被获取的区域被皮下注射标准的肿胀性流体溶液，该标准的肿胀性流体溶液可以包含在不同的标准化剂量体制中的利多卡因、盐水和/或肾上腺素的组合，也可以不包含这些东西。

使用11-刀片的手术刀(或其它标准刀片)，小的切破伤口被制造，以横过真皮。刀片被旋转360度，以完成伤口。然后，钝尖端的14-规格的(或尺寸合适的)套管插入到皮下脂肪组织平面内。套管可以连接到动力辅助的抽吸设备或连接到用于手动吸取的注射器。然后，套管在平面内到处移动，以破坏结缔组织体系。所得到的吸取物的体积的范围是从大约400立方厘米到大约800立方厘米。为了使用在上面所披露的方法，对细胞进行隔离和浓缩，以该方式收集的脂肪组织的部分被处理。为了重新植入到软组织内，剩余物被处理。

在清除脂肪组织之后，用标准的手术技术实现对患者的止血，并且伤口被根本上闭合。收集可以发生在软组织加大之前1小时到2小时。

从脂肪组织处理得到的可再生细胞与要被移植的脂肪组织单元以在上面所描述的方式和比例混合在一起。在组织处理被完成之后，患者准备经历软组织加大。从在脂肪组织处理之后的细胞产量，确定输送到患者的细胞剂量。大概为5.5×10⁵个每50立方厘米的自体脂肪被移植到软组织内。经过通过位置适当的切口而插入到软组织内的标准的14-规格的钝尖端的套管，组合物被输送。可再生细胞被提高的脂肪组织优选地以泪滴状的形式被给予，以增加表面面积与体积的比例。

在输送所移植的脂肪组织之前，在此期间和在此之后，患者被监测。在2天之后，患者注意到，皮肤起皮几乎完全消除了。

例10：用于应激性尿失禁的自体脂肪转移

患有尿失禁的人需要来自医师的治疗。除了披露了过程的所有有关风险和好处的完全知情同意以外，对患者的术前评价还包括即往病史和体检。

为了使过程开始，患者经历脂肪组织收集。为了确定适合进行脂肪组织收集的位点，患者的体质被检查。过程可以在操作间内进行，具有适合于患者临床状态的血液动力学监测。从患者的双侧下肢的大腿侧面区域和中间区域和前腹壁血管翳，脂肪组织被获取。要被获取的区域被皮下注射标准的肿胀性流体溶液，该标准的肿胀性流体溶液可以包含在不同的标准化剂量体制中的利多卡因、盐水和/或肾上腺素的组合，也可以不包含这些东西。

使用11-刀片的手术刀(或其它标准刀片)，小的切破伤口被制造，以横过真皮。刀片被旋转360度，以完成伤口。然后，钝尖端的14-规格的(或尺寸合适的)套管插入到皮下脂肪组织平面内。套管可以连接到动力辅助的抽吸设备或连接到用于手动吸取的注射器。然后，套管在平面内到处移动，以破坏结缔组织体系。所得到的吸取物的体积大约是1200立方厘米。为了使用在上面所描述的方法，对可再生细胞进行隔离和浓缩，以该方式收集的脂肪组织的部分被处理。为了在患者的膀胱颈附近并且在尿道附近重新植入，脂肪组织的剩余物被处理。可选择地，经过脂肪切除过程，患者可以使脂肪被清除。在清除脂肪组织之后，用标准的外科手术技术实现止血，并且伤口被根本上闭合。对脂肪组织的收集大约发生在过程之前1小时到2小时。

从脂肪组织处理得到的可再生细胞与要被移植的脂肪组织单元以在上面所描述的比例混合在一起。在组织处理被完成之后，患者准备经历移植。尤其从在脂肪组织处理之后的细胞产量确定输送到患者的细胞剂量。在患者的膀胱颈附近并且在尿道附近，经过膀胱镜可视化，大概为5.5×10⁵个细胞每50立方厘米的自体脂肪被移植。

在过程之后，患者被监测。在移植之后大概三天，患者的失禁频率降低了。在过程之后大概一个月，患者表示，他的生活质量改善了。医师对被移植的组织进行评价，并且确定长期移植是成功的。

在上文中，许多出版物和专利已经被引用。在这里，通过参考，所引用的出版物和专利中的每篇都被完全地合并。

等价物

本领域的那些技术人员将要认可在这里所描述的本发明的特殊实施例的许多等价物，或只使用常规实验就能够确定这些等价物。该等价物旨在被接下来的权利要求书包括。

Claims (28)

1.一种对患者进行治疗的方法，其包括：

将脂肪组织从患者身上切除下来；

处理脂肪组织的第一部分，以得到被大致上隔离开来的可再生细胞的群体；

将脂肪组织的第二部分与被大致上隔离开来的可再生细胞的群体混合起来，以形成脂肪-组织组合物；以及

将脂肪-组织组合物给予从其身上将脂肪组织切除下来的患者，由此对患者进行治疗。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物被给予患者的乳房。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物被给予患者的软组织区域，以对软组织缺陷进行治疗。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物被给予患者的尿道区域，以对尿失禁进行治疗。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可再生细胞包括干细胞。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可再生细胞包括祖细胞。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，可再生细胞包括干细胞和祖细胞的组合。

8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，该方法包括给予多个剂量的脂肪-组织组合物。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物还包括一种或多种血管形成因子。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物还包括一种或多种动脉形成因子。

11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物还包括一种或多种免疫抑制药物。

12.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在与脂肪组织的第二部分混合之前，可再生细胞在细胞培养物内生长起来。

13.如权利要求12所述的方法，其特征在于，细胞培养条件促进朝向内皮表现型的分化。

14.如权利要求12所述的方法，其特征在于，细胞培养在支架材料上进行，以产生可以放置在患者身上或放置在患者体内的二维或三维构造。

15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，支架材料在体内是可再吸收的。

16.如权利要求1所述的方法，其特征在于，通过基因转移，可再生细胞发生改变，从而使在发生改变的可再生细胞内的一种或多种基因的表达发生变化。

17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，改变导致在对象体内的血管形成的水平发生变化。

18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，改变导致在对象体内的动脉形成的水平发生变化。

19.如权利要求16所述的方法，其特征在于，改变导致在对象体内的凋亡的水平发生变化。

20.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物的给予促进新血管形成。

21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，在所给予的脂肪-组织组合物不再存在之后，新血管形成保持稳定。

22.如权利要求1所述的方法，其特征在于，脂肪-组织组合物的给予使坏死减少。

23.如权利要求1所述的方法，其特征在于，对象是人。

24.一种用于准备用于给予患者的包括可再生细胞的组合物的过程，其包括：

将脂肪组织从患者身上切除下来；以及

将处在脂肪组织内的可再生细胞与脂肪组织的细胞组分和脂质组分分离开来，以形成包括可再生细胞的组合物，用于立即给予从其身上将脂肪组织切除下来的患者。

25.如权利要求24所述的过程，其特征在于，患者需要或想要进行脂肪移植过程。

26.一种用于准备用于给予患者的包括可再生细胞的组合物的设备，其包括：

用于保持、漂洗和煮解从患者身上切除下来的脂肪组织的组织收集腔；和

用于从脂肪组织的细胞组分和脂质组分分离并且浓缩可再生细胞由此形成包括可再生细胞的组合物用于立即给予从其身上将脂肪组织切除下来的患者的处理腔。

27.如权利要求26所述的设备，其特征在于，设备是自动化的。

28.如权利要求27所述的设备，其特征在于，患者需要或想要进行脂肪移植过程。

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