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CN101312748A - 抗体-药物轭合物和使用方法 - Google Patents

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CN101312748A
CN101312748A CNA2006800440128A CN200680044012A CN101312748A CN 101312748 A CN101312748 A CN 101312748A CN A2006800440128 A CNA2006800440128 A CN A2006800440128A CN 200680044012 A CN200680044012 A CN 200680044012A CN 101312748 A CN101312748 A CN 101312748A
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alkyl
antibody
drug conjugates
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CNA2006800440128A
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S·E·博伊德
L·陈
S·甘格沃
V·盖拉瓦斯
K·赫尔甘
B·苏菲
H·黄
D·J·金
C·潘
J·M·卡达勒里
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Medarex LLC
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Abstract

本说明书披露了为有效细胞毒素的抗体－药物轭合物，其中所述的药物通过连接基与所述的抗体连接。本说明书还涉及包含所述抗体－药物轭合物的组合物和使用它们的治疗方法。

Description

抗体-药物轭合物和使用方法
相关申请的交叉参考
本申请请求2005年9月26日提交的美国临时申请顺序号US60/720,499的利益，此处在先申请日的利益在35U.S.C.§119(e)中请求保护，并且将该文献的全部内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明提供了在体内裂解的抗体-药物轭合物。该抗体-药物轭合物可以形成细胞毒素的前体药物和轭合物。
发明背景
许多治疗剂，特别是尤其有效用于癌症疗法的那些通常在体内表现出急性毒性，尤其是骨髓和粘膜毒性，以及慢性心脏和神经毒性。这类高毒性可能限制其应用。研发更多和更安全的特异性治疗剂，特别是抗肿瘤药是对肿瘤细胞的更大有效性和这些产品的副作用数量和严重性(毒性，非肿瘤细胞破坏等)降低是期望的。使用某些现存治疗剂的另一个困难在于其在血浆中低于最佳稳定性。添加官能团来稳定这些化合物导致活性显著降低。因此，期望降低稳定化合物，同时维持可接受的治疗活性水平的方式。
几十年来对更具有选择性的细胞毒性剂的探索极其活跃，剂量限制性毒性(即细胞毒素对正常组织的不期望的活性)是癌症疗法失败的主要原因之一。例如，已知CC-1065和多卡米星(duocarmycins)为极其有效的细胞毒素。
CC-1065首先由Upjohn Company在1981年分离自泽耳链霉菌(Streptomyces zelensis)(Hanka等，J.Antibiot.31：1211(1978)；Martin等，J.Antibiot.33：902(1980)；Martin等，J.Antibiot.34：1119(1981))，并且发现它在体外和实验动物中具有有效的抗肿瘤和抗微生物活性(Li等，Cancer Res.42：999(1982))。CC-1065使用5′-d(A/GNTTA)-3′和5′-d(AAAAA)-3′序列优选性结合小沟内的双链B-DNA(Swenson等，Cancer Res.42：2821(1982))，并且通过存在于分子中的其CPI左手单位使3′-腺嘌呤的N3位烷基化(Hurley等，Science 226：843(1984))。尽管其有效和广泛的抗肿瘤活性，但是CC-1065不能用于人，因为它在实验动物中导致延缓死亡。
CC-1065和多卡米星的许多类似物和衍生物为本领域中公知的。已经综述了对许多化合物的结构，合成和特性的研究。例如，参见，Boger等，Angew.Chem.Int.Ed.Engl.35：1438(1996)；和Boger等，Chem.Rev.97：787(1997)。
Kyowa Hakko Kogya Co.的小组已经制备了许多CC-1065衍生物。例如，参见，美国专利US5,101,038；5,641,780；5,187,186；5,070,092；5,703,080；5,070,092；5,641,780；5,101,038；和5,084,468；和公布的PCT申请WO96/10405和公布的欧洲申请EP0537575A1。
Upjohn Company(Pharmacia Upjohn)也积极地制备了CC-1065衍生物。例如，参见，美国专利US5,739,350；4,978,757，5,332,837和4,912,227。
研究还集中在研发为前体药物形式的新治疗剂，所述的前体药物即能够在体内通过对其结构的某些化学或酶修饰转化成药物的化合物(活性治疗化合物)。为了减轻毒性的目的，这种转化优选限于作用部位或靶组织而非循环系统或非靶组织。然而，甚至前体药物也存在在血液和血清中稳定性低的同样多的问题，这是因存在在前体药物在患者体内得到期望部位前降解或活化前体药物的酶所致。
Bristol-Myers Squibb已经描述了特定的溶酶体酶-可裂解的抗肿瘤药物轭合物。例如，参见，美国专利US6,214,345。该专利提供了氨基苄基氧基羰基。
Seattle Genetics已经公布了申请，即美国专利申请US2003/0096743和美国专利申请US2003/0130189，它们描述了在药物递送活性剂中的对-氨基苄基醚类。这些申请中所述的连接基限于氨基苄基醚组合物。
其他组也描述了连接基。例如，参见de Groot等，J.Med.Chem.42，5277(1999)；de Groot等，J.Org.Chem.43，3093(2000)；de Groot等，J.Med.Chem.66，8815，(2001)；WO02/083180；Carl等，J.Med.Chem.Lett.24，479，(1981)；Dubowchik等，Bioorg& Med.Chem.Lett.8，3347(1998)。这些连接基包括氨基苄基醚间隔基，延长的电子级联和环化间隔基系统，环化消去间隔基，诸如w-氨基氨基羰基和对氨基苄基氧基羰基连接基。
细胞毒性药物的稳定性，包括体内稳定性仍然是需要解决的重要问题。此外，许多化合物的毒性使得它们的有用性较低，由此需要减轻药物毒性，诸如形成可裂解的前体药物的组合物。因此，尽管本领域中有了进展，但是对研发治疗哺乳动物和人的改进的治疗剂持续存在需求，更具体地说，所述的改进的治疗剂为表现出比已知类似结构的化合物高的作用特异性，减轻的毒性和在血液中改善的稳定性。本发明解决了那些需求。
发明概述
本发明涉及抗体-药物轭合物，其中药物和抗体通过连接基，诸如肽基，肼或二硫化物连接基连接。这些轭合物为有效的细胞毒素，它们可以以活性形式被选择性地递送至所关注的作用部位且然后裂解而释放活性药物。本发明的连接基臂在体内可以通过例如，酶或还原方式从细胞毒性药物中裂解，从而从前体药物衍生物中释放活性药物部分。
一个实施方案为抗体-药物轭合物，其包括对至少一种类型的肿瘤具有特异性的抗体；药物；和使药物与抗体偶联的连接基。该连接基在有肿瘤存在下可裂解。所述的抗体-药物轭合物在以相当于1μmol/kg或1μmol/kg以下每日剂量的用量给药时延缓或阻止肿瘤生长。优选所述的抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于1μmol/kg或1μmol/kg以下(意指药物的摩尔数)每日剂量的用量给药时阻止肿瘤生长。至少在某些实施方案中，肿瘤为在SCID小鼠中的人类肿瘤。作为实例，SCID小鼠可以为CB17.SCID小鼠(购自Taconic，Germantown，NY)。
本发明还涉及用于稳定治疗剂和标记的基团。例如，选择稳定基团以便限制治疗剂或标记被存在于血液或非靶组织中的酶清除和代谢。稳定基团可以用于阻断活性剂或标记降解并且还可以起提供活性剂或标记的其它物理特性的作用，例如增加化合物的溶解性或减少化合物的聚集特性。稳定基团还可以改善配制或非配制形式储存过程中的活性剂或标记稳定性。
本发明在另一个方面中提供了具有式1-3中任意一种的结构的细胞毒性药物-配体化合物：
Figure A20068004401200192
Figure A20068004401200193
其中符号D为具有悬于其骨架上的化学反应性官能团的药物部分，所述的官能团选自伯或仲胺，羟基，巯基，羧基，醛和酮。
符号L1表示自我消除(self-immolative)间隔基，其中m为0，1，2，3，4，5或6的整数。
符号X4表示选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂中的成员。
符号L4表示连接基成员且p为0或1。L4为将增加的溶解性或减少的聚集性传递给轭合物的部分。L4部分的实例包括取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂烷基或未被取代的杂烷基，它们中的任意一种可以为直链，支链或环状的带正电荷或负电荷的氨基酸聚合物，诸如聚赖氨酸或聚精氨酸(polyargenine)或其它聚合物，诸如聚乙二醇。
符号F，H和J表示如本文进一步所述的连接基。
本发明在一个实施方案中涉及如下结构的肽连接基轭合物：
Figure A20068004401200201
其中
D为具有悬于其骨架上的化学反应性官能团的药物部分，所述的官能团选自伯或仲胺，羟基，巯基，羧基，醛和酮；
L1为自我消除连接基；
m为0，1，2，3，4，5或6的整数；
F为包含如下结构的连接基：
Figure A20068004401200202
或
Figure A20068004401200203
其中
AA1为独立地选自天然氨基酸或非天然α-氨基酸的一个或多个成员；
c为1-20的整数；
L2为自我消除连接基；
L3为包含伯或仲胺或羧基官能团的间隔基；其中如果L3存在，那么m为0且L3的胺与D的羧基官能团侧基形成酰胺键或L3的羧基与D的胺官能团侧基形成酰胺键；
o为0或1；
L4为连接基成员，其中L4不包含直接连接在(AA1)c的N-末端上的羧酸酰基；
p为0或1；且
X4为选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂中的成员。
在一个实施方案中，肽连接基轭合物包含如下结构：
Figure A20068004401200211
在另一个实施方案中，肽连接基轭合物包含如下结构：
Figure A20068004401200212
在一个优选的实施方案中，L3包含芳族基团。例如，L3可以包含苯甲酸基团，苯胺基团或吲哚基团。-L3-NH-的非-限制性实例包括选自下组的结构：
Figure A20068004401200221
其中Z为选自O，S和NR23中的成员，且
其中R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员。
在肽连接基的优选实施方案中，(AA1)c为可被肿瘤组织中表达的蛋白酶裂解的肽序列。优选的蛋白酶为溶酶体蛋白酶。在优选的实施方案中，c为2-6的整数，或c为2，3或4。在某些实施方案中，位于最接近药物部分的(AA1)c上的氨基酸选自：Ala，Asn，Asp，Cit，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。在优选的实施方案中，(AA1)c为选自Val-Cit，Val-Lys，Phe-Lys，Lys-Lys，Ala-Lys，Phe-Cit，Leu-Cit，Ile-Cit，Trp，Cit，Phe-Ala，Phe-N9-对甲苯磺酰基-Arg，Phe-N9-硝基-Arg，Phe-Phe-Lys，D-Phe-Phe-Lys，Gly-Phe-Lys，Leu-Ala-Leu，Ile-Ala-Leu，Val-Ala-Val，Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：1)，β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：2)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：3)的肽序列。在特别优选的实施方案中，(AA1)c为Val-Cit或Val-Lys。
在某些优选的实施方案中，肽连接基F包含如下结构：
其中
R24选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基；
K各自为独立地选自取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR21R22，NR21COR22，OCONR21R22，OCOR21和OR21中的成员
其中
R21和R22独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基；且
a为0，1，2，3或4的整数。
在其它优选的实施方案中，-F-(L1)m-包含如下结构：
Figure A20068004401200231
其中
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基中的成员。
本发明在另一个方面中涉及如下结构的肼连接基轭合物：
X4--(L4)p-H-(L1)m--D
其中
D为具有悬于其骨架上的化学反应性官能团的药物部分，所述的官能团选自伯或仲胺，羟基，巯基，羧基，醛和酮；
L1为自我消除连接基；
m为选自0，1，2，3，4，5或6的整数；
X4为选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂中的成员；
L4为连接基成员；
p为0或1；
H为包含如下结构的连接基：
Figure A20068004401200241
其中
n1为1-10的整数；
n2为0，1或2；
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基中的成员；且
I为键或：
Figure A20068004401200242
其中n3为0或1，条件是当n3为0时，n2不为0；且
n4为1，2或3，
其中当I为键时，n1为3和n2为1，D不能为
其中R为Me或CH2-CH2-NMe2。
在某些优选的实施方案中，苯环上的取代为对位取代。在某些优选的实施方案中，n1为2，3或4或n1为3或n2为1。
在某些实施方案中，I为键。在其它实施方案中，n3为0且n4为2。
本发明在不同方面中提供了肼连接基，H，其可以在裂解时形成6-元自我消除连接基，或在裂解时形成两个5-元自我消除连接基，或在裂解时形成单一5-元自我消除连接基，或在裂解时形成单一7-元自我消除连接基，或在裂解时形成5-元自我消除连接基和6-元自我消除连接基。
在一个优选的实施方案中，H包含偕二甲基取代。
在一个优选的实施方案中，H包含如下结构：
Figure A20068004401200251
优选n1为2，3或4，更优选n1为3。优选R24各自独立地选自CH3和H。在那些优选的实施方案中，R24各自为H。
在另一个优选的实施方案中，H包含如下结构：
优选n1为3。优选R24各自独立地选自CH3和H。
在其它优选的实施方案中，H包含如下结构：
Figure A20068004401200261
优选R24各自独立为H或取代或未被取代的烷基。
本发明在另一个方面中涉及如下结构的肼连接基轭合物：
X4--(L4)p-H-(L1)m-D
其中
D为具有悬于其骨架上的化学反应性官能团的药物部分，所述的官能团选自伯或仲胺，羟基，巯基，羧基，醛和酮；
L1为自我消除连接基；
m为选自0，1，2，3，4，5或6的整数；
X4为选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂中的成员；
L4为连接基成员；
p为0或1；且
H包含如下结构：
Figure A20068004401200262
其中q为0，1，2，3，4，5或6；且
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基中的成员。
本发明在另一个方面中涉及如下结构的二硫化物连接基轭合物：
Figure A20068004401200271
其中
D为具有悬于其骨架上的化学反应性官能团的药物部分，所述的官能团选自伯或仲胺，羟基，巯基，羧基，醛和酮；
L1为自我消除连接基；
m为选自0，1，2，3，4，5或6的整数；
X4为选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂中的成员；
L4为连接基成员；
P为0或1；
J为包含如下结构的连接基：
Figure A20068004401200272
其中
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基中的成员；
K各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR21R22，NR21COR22，OCONR21R22，OCOR21和OR21中的成员；
其中
R21和R22独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基和未被取代的杂环烷基；
a为0，1，2，3或4的整数；且
d为0，1，2，3，4，5或6的整数。
在不同的实施方案中，J可以包含如下结构之一：
Figure A20068004401200281
其中d为1或2；
或
Figure A20068004401200283
在所有上述连接基轭合物中，D优选为细胞毒性药物。在优选的实施方案中，D具有选自伯或仲胺，羟基，巯基和羧基的化学反应性官能团。优选药物的非-限制性实例D包括多卡米星和多卡米星类似物和衍生物，CC-1065，基于CBI的多卡米星类似物，基于MCBI的多卡米星类似物，基于CCBI的多卡米星类似物，多柔比星，多柔比星轭合物，吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，多拉司他汀，dolestatin-10，考布他汀，加利车霉素(calicheamicin)，美坦生，美坦生类似物，DM-1，auristatin E，auristatin EB(AEB)，auristatinEFP(AEFP)，单甲基auristatin E(MMAE)，5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)，tubulysins，disorazole，埃坡霉素，紫杉醇，多西他赛，SN-38，托泊替康，根霉素，棘霉素，秋水仙碱，长春碱，长春地辛，雌氮芥，西马多丁，eleutherobin，甲氨蝶呤，甲基叶酸，二氯甲氨喋呤，5-氟尿嘧啶，6-巯嘌呤，阿糖胞苷，美法仑，长春罗新，leurosideine，放线菌素，柔红霉素，柔红霉素轭合物，丝裂霉素C，丝裂霉素A，洋红霉素，氨基蝶呤，他利霉素，鬼臼毒素，鬼臼毒素衍生物，依托泊甙，磷酸依托泊苷，长春新碱，泰素，泰素帝视黄酸，丁酸，N8-乙酰基精脒和喜树碱。
在一个优选的实施方案中，D为包含如下结构的多卡米星类似物或衍生物：
其中环系A为选自取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基中的成员；
E和G为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，杂原子，单键，或E和G连接形成选自取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基的环系；
X为选自O，S和NR23中的成员；
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R3为选自(＝O)，SR11，NHR11和OR11中的成员，
其中
R11为选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，二磷酸酯类，三磷酸酯类，酰基，C(O)R12R13，C(O)OR12，C(O)NR12R13，P(O)(OR12)2，，C(O)CHR12R13，SR12和SiR12R13R14中的成员，
其中
R12，R13和R14为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和取代或未被取代的芳基，其中R12和R13与连接它们的氮或碳原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系具有4-6个成员的，任选地包含2个或2个以上杂原子中的成员；
R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，SR15，OR15，CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2中的成员；
其中
n为1-20的整数；
R15和R16独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基和取代或未被取代的肽基，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
R6为存在或不存在的单键，将当存在时，R6和R7连接形成环丙基环；且
R7为CH2-X1或在所述环丙基环中与R6连接的-CH2-，
其中
X1为离去基，
其中如果存在，R11，R12，R13，R15或R16的至少一个使所述的药物与L1或与F，H或J连接。
在一个优选的实施方案中，D具有如下结构：
Figure A20068004401200311
其中
Z为选自O，S和NR23中的成员；
其中
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，其中R8为选自取代的烷基，未被取代的烷基，NR9R10，NR9NHR10和OR9中的成员；
其中
R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；且
R2为H，取代的烷基或未被取代的低级烷基；
其中如果存在，R11，R12，R13，R15或R16中的至少一个使所述的药物与L1或与F，H或J裂解。
在上述一个优选的实施方案中，R2为未被取代的低级烷基。
在另一个优选的实施方案中，D具有如下结构：
其中
Z为选自O，S和NR23中的成员；
其中
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的成员，
其中
R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R1’为H，取代或未被取代的低级烷基或C(O)R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的成员，
其中
R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R2为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基或氰基或烷氧基；且
R2’为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基，
其中如果存在，R11，R12，R13，R15或R16中的至少一个使所述的药物与L1，或与F，H或J裂解。
在所有上述连接基轭合物结构中，L4优选包含非-环部分。L4与缺乏L4的化合物相比优选增加化合物的溶解度和/或与缺乏L4的化合物相比L4减少化合物的聚集。在一个优选的实施方案中，L4包含聚乙二醇部分。聚乙二醇部分可以包含，例如，3-12个重复单元或2-6个重复单元或更优选4个重复单元。
本发明在另一个方面中提供了具有下式的结构的细胞毒性药物-配体化合物：
Figure A20068004401200331
其中符号L1表示自我消除间隔基，其中m为0，1，2，3，4，5或6的整数。
符号X4表示选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂的成员。
符号L4表示连接基成员且p为0或1。L4为将增加的溶解性或减少的聚集性传递给所述的轭合物的部分。L4部分的实例包括取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂烷基或未被取代的杂烷基，它们中的任意一种可以为直链，支链或环状的带正电荷或负电荷的氨基酸聚合物，诸如聚赖氨酸或聚精氨酸或其它聚合物，诸如聚乙二醇。
符号Q表示任意可裂解的连接基，包括，但不限于本文所述的肽基，腙和二硫化物连接基中的任意一种。可裂解的连接基包括可以选择性地被化学或生物过程裂解并且在裂解时使药物D1与X4分离的那些。
符号D1表示具有下式的药物：
Figure A20068004401200332
其中X和Z为独立地选自O，S和NR23的成员
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，
R1’为H，取代或未被取代的低级烷基或C(O)R8，
其中R8为选自NR9R10和OR9的成员且R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R2为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基或氰基或烷氧基；
R2’为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基，
R3为选自SR11，NHR11和OR11，其中R11为选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，二磷酸酯类，三磷酸酯类，酰基，C(O)R12R13，C(O)OR12，C(O)NR12R13，P(O)(OR12)2，C(O)CHR12R13，SR12和SiR12R13R14中的成员，其中R12，R13和R14为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和取代或未被取代的芳基中的成员，其中R12和R13与连接它们的氮或碳原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基的环系，它具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
其中如果存在，R11，R12和R13中的至少一个使所述的药物与L1或与Q连接，
R6为存在或不存在的单键，并且在存在时R6和R7裂解成环丙基环；且
R7为CH2-X1或在所述环丙基环中与R6连接的-CH2-，
其中
X1为离去基，
R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，SR15，OR15，CR15＝NR16和O(CH2)nNR24R25中的成员，其中n为1-20的整数；
R15和R16为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基和取代或未被取代的肽基，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基的环系，它具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
且R24和R25独立地选自未被取代的烷基，且
其中R4，R4’，R5和R5’中的至少一个为O(CH2)nNR24R25。
本发明在另一个方面中涉及药物制剂。这类制剂一般包含本发明的轭合物化合物和药学上可接受的载体。
本发明在另一个方面中涉及使用本发明轭合物化合物的方法。例如，本发明提供了杀伤细胞的方法，其中将本发明的轭合物化合物以足以杀伤细胞的用量给予细胞。在一个优选的实施方案中，所述的细胞为肿瘤细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了阻止或终止哺乳动物受试者的肿瘤生长的方法，其中将本发明的轭合物化合物以足以阻止或终止肿瘤生长的用量给予受试者。
本发明的其它方面，优点和目的从下文详细描述的综述中显而易见。
附图简述
参照下列附图描述本发明的非-限制性和未-穷尽的实施方案。为了更好地理解本发明，参照下列详细描述并且结合附图阅读，其中：
图1为给予同种型对照抗体-药物轭合物，αPSMA抗体-药物轭合物或单独的轭合缓冲液(媒介物)的小鼠随时间变化的肿瘤体积改变示意图；
图2为给予不同量αPSMA抗体-药物轭合物或(媒介物)的小鼠随时间变化的肿瘤体积改变示意图；
图3为给予不同量同种型对照抗体-药物轭合物或(媒介物)的小鼠随时间变化的肿瘤体积改变示意图；
图4为给予不同量同种型对照抗体-药物轭合物或(媒介物)的小鼠随时间变化的体重改变示意图；
图5为给予不同量αPSMA抗体-药物轭合物或(媒介物)的小鼠随时间变化的体重改变示意图；
图6为给予同种型对照抗体-药物轭合物，αPSMA抗体-药物轭合物或单独的轭合缓冲液(媒介物)的小鼠随时间变化的肿瘤体积改变示意图，就所述的肿瘤而言具有240mm3的最初平均肿瘤体积；
图7为给予αPSMA抗体-药物轭合物或单独的轭合缓冲液(媒介物)的小鼠随时间变化的肿瘤体积改变示意图，就所述的肿瘤而言具有430mm3的最初平均肿瘤体积；
图8为比较给予同种型对照和毒素-抗体轭合物的小鼠随时间变化的肿瘤体积改变的示意图；且
图9为比较给予同种型对照和毒素-抗体轭合物的小鼠随时间变化的体重改变的示意图。
发明详述
缩写
本文所用的“Ala”意指丙氨酸。
“Boc”意指叔-丁氧羰基。
“CPI”意指环丙吡咯并吲哚(cyclopropapyrroloindole)。
“Cbz”为苄氧羰基。
本文所用的“DCM”意指二氯甲烷。
“DDQ”意指2，3-二氯-5，6-二氰基-1，4-苯醌。
“DIPEA”为二异丙基鲸蜡醇胺。
“DMDA”为N，N’-二甲基乙二胺。
“RBF”为圆底烧瓶。
“DMF”为N，B-二甲基甲酰胺。
“HATU”为N-[[(二甲氨基)-1H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-1-基]亚甲基]-N-甲基甲酰胺鎓六氟磷酸盐N-氧化物。
本文所用的符号“E”表示酶可裂解基团。
“EDCI”为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺。
本文所用的“FMOC”意指9-芴基甲氧羰基。
“FMOC”意指9-芴基甲氧羰基。
“HOAt”为7-氮杂-1-羟基苯并三唑。
“Leu”为亮氨酸。
“PABA”意指对-氨基苯甲酸。
“PEG”意指聚乙二醇。
“PMB”意指对-甲氧基苄基。
“TBAF”意指氟化四丁基铵。
缩写“TBSO”意指叔-丁基二甲基甲硅烷基醚。
本文所用的“TEA”意指三乙胺。
“TFA”意指三氟乙酸。
符号“Q”意指治疗剂，诊断试剂或可检测标记。
定义
除非另作陈述，否则本文所用的所有技术和科学术语一般具有与本发明所属技术领域通常理解的相同的含义。一般而言，本文所用的命名法和下述细胞培养，分子遗传学，有机化学和核酸化学和杂交的实验室操作步骤为本领域众所周知和常用的那些。标准技术用于核酸和肽合成。一般而言，按照制造商的说明书进行酶反应和纯化步骤。一般按照本领域中常用的方法和各种一般参考文献完成所述的技术和操作步骤(一般参见，Sambrook等，MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，2d ed.(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，将该文献引入本文自我参考)，在该对比文件中充分描述了它们。本文所用的命名法和下述分析化学和有机合成中的实验室操作步骤为本领域众所周知和常用的那些。标准技术或其改变用于化学合成和化学分析。
术语“治疗剂”指定意指当以治疗有效量存在时，对哺乳动物产生所需治疗作用的化合物。为了治疗癌，期望该治疗剂还能够进入靶细胞。
术语“细胞毒素”指定意指对癌细胞具有所需细胞毒性作用的治疗剂。细胞毒性意指活性剂阻止细胞生长或杀伤细胞。毒性的细胞毒素作为实例包括考布他汀，多卡米星，CC-1065抗肿瘤抗生素，蒽环类和相关化合物，但不限于它们。其它细胞毒素包括毒枝菌素，蓖麻蛋白及其类似物，刺孢霉素，多柔比星(doxirubicin)和美登木素生物碱。
术语“前体药物”和术语“药物轭合物”在本文中可以互换使用。两者均意指化合物，其对细胞相对无害，而仍然以轭合形式存在，但被例如位于靶细胞内的酶或接近靶细胞的酶这类条件选择性降解。
术语“标记”指定意指用于特征肿瘤或其它医学疾患，例如，诊断，肿瘤进程和肿瘤细胞分泌的因子的测定的化合物。将标记视为“诊断试剂”的亚组。
作为与酶裂解方式相关使用的术语“选择性”意指连接基部分的裂解速率高于具有氨基酸随机序列的肽的裂解速率。
术语“靶向基团”和“靶向剂”指定意指如下部分：(1)能够使连接的本体(例如治疗剂或标记)定向于靶细胞，例如具体的肿瘤细胞类型；或(2)优选在靶组织，例如肿瘤上活化。靶向基团或靶向剂可以为小分子，指定它包括非-肽类和肽类。靶向基团还可以为大分子，包括糖类，凝集素，受体，受体配体，蛋白质，诸如BSA，抗体等。在本发明的一个优选的实施方案中，靶向基团为抗体或抗体片段，更优选单克隆抗体或单克隆抗体片段。
术语“自我消除间隔基”意指能够使两个化学部分共价连接形成一般稳定的三联(tripartate)分子的双官能化学本体。如果与第一部分连接的键被裂解，那么自我消除间隔基能够自发从第二部分中分离。
术语“可检测标记”指定意指具有可检测物理或化学特性的部分。
术语“可裂解基团”指定意指在体内不稳定的部分。优选“可裂解基团”能够通过从轭合物的剩余部分上裂解标记或治疗剂而活化该标记或活性剂。可操作定义的连接基优选在体内被生物环境裂解。这种裂解可以来源于任意的过程，但不限于，例如酶，还原，pH等。优选选择可裂解基团，使得活化发生在期望的作用部位，它可以为靶细胞中或接近靶细胞(例如癌细胞)或组织的部位，诸如治疗作用或标记化学的部位。这类裂解可以为酶促的并且典型的，酶可裂解基团包括天然氨基酸或终止于天然氨基酸的肽序列并且使其羧基末端于连接基连接。尽管裂解速率的强化程度对本发明并不关键，但是可裂解基团的优选实例为至少约10％的可裂解基团在给药24小时内在血流中裂解的那些，最优选至少约35％。
术语“配体”意指特异性结合和或以反应方式结合或复合靶细胞或组织上的受体，底物，抗原决定簇或其它结合位点的任意分子。配体的实例包括抗体及其片段(例如单克隆抗体或其片段)，酶(例如纤维蛋白分解酶)，生物反应调节剂(例如白细胞介素，干扰素，红细胞生成素(erythropeoitin)或集落刺激因子)，肽激素及其抗原结合片段。
术语“肼连接基”和“自-环化肼连接基”在本文中可以互换使用。这些术语意指在条件改变，诸如pH偏移时进行环化反应并且形成一个或多个环的连接基部分。肼部分在裂解时被转化成腙。例如，这种连接可以通过与L4部分上的酮基反应进行。因此，因在连接时这种转化得到腙，所以术语腙连接基也可以用于描述本发明的连接基。
术语“5-元肼连接基”或“5-元肼连接基”意指在条件改变，诸如pH偏移时进行环化反应并且形成一个或多个5-元环的含肼的分子部分。可选择地，这种5元连接基可以类似地描述为5-元腙连接基或5-元腙连接基。
术语“6-元肼连接基”或“6-元肼连接基”意指在条件改变，诸如pH偏移时进行环化反应并且形成一个或多个6-元环的含肼的分子部分。可选择地，这种6元连接基可以类似地描述为6-元腙连接基或6-元腙连接基。
术语“环化反应”在指肽，肼或二硫化物连接基环化时表示该连接基环化成环并且启动药物-配体复合物分离。可以在非原位测定该速率并且在形成至少90％，95％或100％的产物时完成。
术语“多肽”，“肽”和“蛋白质”在本文中可以互换使用，意指氨基酸残基聚合物。该术语应用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基为相当于天然存在氨基酸的人工化学模拟物以及天然存在氨基酸的聚合物和非-天然存在氨基酸的聚合物。这些术语还包括术语“抗体”。
术语“氨基酸”意指天然存在或合成的氨基酸以及以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸为那些由遗传密码编码的氨基酸和那些随后修饰的氨基酸，例如羟脯氨酸，γ-羧基谷氨酸和O-磷酸丝氨酸。氨基酸类似物意指具有与天然存在氨基酸相同的基本化学结构的化合物，即，与氢，羧基，氨基和R基团结合的α碳，例如高丝氨酸，正亮氨酸，甲硫氨酸亚砜，甲硫氨酸甲基锍。这类类似物具有修饰的R基团(例如正亮氨酸)或修饰的肽骨架，但保持与天然存在氨基酸相同的基本化学结构。可以特别使用的一种氨基酸为瓜氨酸，其为精氨酸前体并且涉及肝中脲的形成。氨基酸模拟物意指具有不同于氨基酸一般化学结构，但以与天然存在氨基酸类似的方式起作用的结构的化学化合物。术语“非天然氨基酸”指定表示20种上述天然存在氨基酸的“D”立体化学形式。进一步理解术语非天然氨基酸包括天然氨基酸的同源物和天然氨基酸的合成修饰形式。合成修饰形式包括，但不限于具有缩短或延长达2个碳的亚烷基链的氨基酸，包含任选取代的芳基的氨基酸和包含卤代基团的氨基酸，优选卤代烷基和芳基。当与本发明的连接基或轭合物连接时，氨基酸为“氨基酸侧链”的形式，其中氨基酸的羧酸基团被酮(C(O))基取代。因此，例如，丙氨酸侧链为-C(O)-CH(NH2)-CH3等。
可以用封端基保护氨基酸和肽类。封端基为防止氨基酸或肽的N-末端发生不需要的反应并且可以在药物-配体轭合物合成中使用的原子或化学部分。应保持在合成自始至终与N-末端连接并且可以在完成药物轭合物合成后通过选择性将其除去的化学或其它条件除去。适合于N-末端保护的封端基为肽化学领域众所周知的。典型的封端基包括，但不限于氢，D-氨基酸和封端基(Cbz)氯。
“核酸”意指单-或-链形式的脱氧核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。该术语包括包含已知核苷酸类似物的磺酸或包含已知核苷酸类似物或修饰骨架残基或键的修饰骨架，它们为合成的，天然存在的和非-天然存在的，具有与参比核酸类似的结合特性并且以与参比核苷酸类似的方式被代谢。这类类似物的实例包括，但不限于硫代磷酸类，氨基磷酸酯类，膦酸甲酯类，手性-甲基膦酸酯类，2-O-甲基核糖核苷酸，肽-核核酸(PNAs)。
除非另作陈述，否则特定核酸序列也隐含地包括其保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列以及明确表示的序列。特别地，简并密码子取代可以通过产生序列实现，在所述的序列中，一种或多种选择的(或所有的)的第三位被混合-碱基和/或脱氧肌苷残基取代(Batzer等，Nucleic Acid Res.19：5081(1991)；Ohtsuka等，J.Biol.Chem.260：2605-2608(1985)；Rossolini等，Mol.Cell.Probes 8：91-98(1994))。术语核酸与基因，cDNA，mRNA，寡核苷酸和多核苷酸可以互换使用。
符号，无论是作为键使用还是表现为与键垂直均表示展示的部分与分子剩余部分，固相支持体等结合的点。
除非另作陈述，否则术语“烷基”作为自身或作为另一取代基的组成部分意指直链或支链或环烃基或其组合，其可以为完全饱和的，单-或多不饱和的，并且可以包括二-或多价基团，它们具有指定的碳原子数(即C1-C10意指1-10个碳)。饱和烃基的实例包括，但不限于基团，诸如甲基，乙基，正-丙基，异丙基，正-丁基，叔-丁基，异丁基，仲-丁基，环己基，(环己基)甲基，环丙基甲基，同源物和例如，正-戊基，正-己基，正-庚基，正-辛基的异构体成。不饱和烷基为具有一个或多个双键或三键的烷基。不饱和烷基的实例包括，但不限于，乙烯基，2-丙烯基，巴豆基，2-异戊烯基，2-(丁二烯基)，2，4-戊二烯基，3-(1，4-戊二烯基)，乙炔基，1-和3-丙炔基，3-丁炔基和高级同系物和异构体。除非另作陈述，否则术语“烷基”还意指包括下文更具体地定义的烷基的那些衍生物，诸如“杂烷基”。并不限于烃基的烷基称作“高烷基”。
术语“亚烷基”作为自身或作为另一取代基的组成部分意指来源于烷的二价基团，作为典型的，但不限于-CH2CH2CH2CH2-，且进一步包括如下如“杂亚烷基”所述的那些基团。一般而言，烷基(或亚烷基)具有1-24个碳原子，其中具有10个或10个以下碳原子的那些基团在本发明中为优选的。“低级烷基”或“低级亚烷基”为缩短链的烷基或亚烷基，一般具有8个或8个以下碳原子。
除非另作陈述，否则术语“杂烷基”作为自身或与另一术语组合意指稳定的直链或支链或环状烃基或其组合，它们由所述数量的碳原子和至少一个选自O，N，Si和S的杂原子组成，并且其中氮，碳和硫原子可以任选被氧化并且氮杂原子可以任选被季铵化。杂原子O，N和S和Si可以位于杂烷基的任意内部位置上或烷基与分子的剩余部分连接的位置上。实例包括，但不限于-CH2-CH2-O-CH3，-CH2-CH2-NH-CH3，-CH2-CH2-N(CH3)-CH3，-CH2-S-CH2-CH3，-CH2-CH2，-S(O)-CH3，-CH2-CH2-S(O)2-CH3，-CH＝CH-O-CH3，-Si(CH3)3，-CH2-CH＝N-OCH3和-CH＝CH-N(CH3)-CH3。至多2个杂原子可以为连续的，诸如，例如，-CH2-NH-OCH3和-CH2-O-Si(CH3)3。类似地，术语“杂亚烷基”作为自身或作为另一取代基的组成部分意指来源于杂烷基的二价基团，作为典型，但不限于-CH2-CH2-S-CH2-CH2-和-CH2-S-CH2-CH2-NH-CH2-。就杂亚烷基而言，杂原子也可以位于链末端的任一或两端上(例如亚烷氧基，亚烷二氧基，亚烷氨基，亚烷二氨基等)。术语“杂烷基”和“杂亚烷基”包括聚(乙二醇)及其衍生物(例如，参见，Shearwater PolymersCatalog，2001)。此外，就亚烷基和杂亚烷基，连接基的方向的含义是指书写连接基式的方向。例如，式-C(O)2R’-表示-C(O)2R’-和-R’C(O)2-。
术语“低级”与术语“烷基”或“杂烷基”意指具有1-6个碳原子的部分。
术语“烷氧基”，“烷氨基”，“烷基磺酰基”和“烷硫基”(或硫代烷氧基)以其常用的含义使用并且意指分别通过氧原子，氨基，SO2基团或硫原子与分子剩余部分连接的那些烷基。术语“芳基磺酰基”意指通过SO2基团与分子的剩余部分连接的芳基，并且术语“巯基”意指SH基团。
一般而言，“酰基取代基”也选自上述基团。本文所用的术语“酰基取代基”意指与直接或间接与本发明化合物的多核连接的羰基碳连接并且满足其化合价的基团。
除非另作陈述，术语“环烷基”和“杂环烷基”作为其自身或与其它术语组合分别表示取代或未被取代的“烷基”和取代的或未被取代的“杂烷基”的环状形式。另外，就杂环烷基而言，杂原子可以位于杂环与分子剩余部分连接的位置上。环烷基的实例包括，但不限于环戊基，环己基，1-环己烯基，3-环己烯基，环庚基等。杂环烷基的实例包括，但不限于1-(1，2，5，6-四氢吡啶基)，1-哌啶基，2-哌啶基，3-哌啶基，4-吗啉基，3-吗啉基，四氢呋喃-2-基，四氢呋喃-3-基，四氢噻吩-2-基，四氢噻吩-3-基，1-哌嗪基，2-哌嗪基等。环结构的杂原子和碳原子任选被氧化。
除非另作陈述，否则术语“卤代”或“卤素”作为自身或作为另一取代基的组成部分意指氟，氯，溴或碘原子。另外，术语诸如“卤代烷基”意指包括一卤代烷基和多卤代烷基。例如，术语“卤代(C1-C4)烷基”意指包括，但不限于三氟甲基，2，2，2-三氟乙基，4-氯丁基，3-溴丙基等。
除非另作陈述，否则术语“芳基”意指取代或未被取代的多不饱和芳族烃取代基，其可以为单环或多环(优选1-3个环)，它们保存稠合或共价连接。术语“杂芳基”意指包含1-4个选自N，O和S的杂原子的芳基(或环)，其中氮，碳和硫原子任选被氧化并且氮原子任选被季铵化。杂芳基可以通过杂原子与分子的剩余部分连接。芳基和杂芳基的非-限制性实例包括苯基，1-萘基，2-萘基，4-联苯基，1-吡咯基，2-吡咯基，3-吡咯基，3-吡唑基，2-咪唑基，4-咪唑基，吡嗪基，2-噁唑基，4-噁唑基，2-苯基-4-噁唑基，5-噁唑基，3-异噁唑基，4-异噁唑基，5-异噁唑基，2-噻唑基，4-噻唑基，5-噻唑基，2-呋喃基，3-呋喃基，2-噻吩基，3-噻吩基，2-吡啶基，3-吡啶基，4-吡啶基，2-嘧啶基，4-嘧啶基，5-苯并噻唑基，嘌呤基，2-苯并咪唑基，5-吲哚基，1-异吲哚基，5-异吲哚基，2-喹喔啉基，5-喹喔啉基，3-喹啉基和6-喹啉基。上述提及的芳基和杂芳基各自的取代基选自下述可接受的取代基组。“芳基”和“杂芳基”还包括环系，其中一个或多个非-芳族环系与芳基或杂芳基系统稠合，否则就是与之结合。
为方便起见，术语“芳基”在与其它术语组合使用时(例如芳氧基，芳硫氧基，芳基烷基)包括如上述定义的芳基和杂芳基环。因此，术语“芳基烷基”意指包括那些基团，其中芳基与烷基连接(例如苄基，苯乙基，吡啶基甲基等)，包括那些烷基，其中碳原子(例如亚甲基)被例如氧原子取代(例如苯氧基甲基，2-吡啶基氧基甲基，3-(1-萘氧基)丙基等)。
上述术语各自(例如“烷基”，“杂烷基”，“芳基”和“杂芳基”)包括所示基团的取代和未被取代的形式。下面提供了各基团类型的优选取代基。
烷基和杂烷基的取代基(包括那些通常称作亚烷基，烯基，杂亚烷基，杂烯基，炔基，环烷基，杂环烷基，环烯基和杂环烯基的基团)一般分别称作“烷基取代基”和“杂烷基取代基”，并且它们可以为各种基团中的一种或多种，所述的基团选自，但不限于：-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R’，-NR-C(NR’R”R’”)＝NR””，-NR-C(NR’R”)＝NR’”，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-NRSO2R’，-CN和-NO2，数值范围从0到(2m’+1)，其中m’为这类基团中的碳原子总数。R’，R”，R”’和R””各自优选独立地意指氢，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，例如被1-3个卤素取代的芳基，取代或未被取代的烷基，烷氧基或硫代烷氧基或芳基烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团各自独立地选作这些基团中的一种以上存在时的R’，R”，R’”和R””各基团。当R’和R”与同一氮原子连接时，它们可以与该氮原子合并成5-，6-或7-元环。例如，-NR’R”意指包括，但不限于1-吡咯烷基和4-吗啉基。从上述取代基讨论中，本领域技术人员可以理解术语“烷基”意指包括基团，其包括与非氢原子的基团结合的碳原子，诸如卤代烷基(例如-CF3和-CH2CF3)和酰基(例如-C(O)CH3，-C(O)CF3，-C(O)CH2OCH3等)。
与对烷基所述的取代基类似，芳基取代基和杂芳基取代一般分别称作“芳基取代基”和“杂芳基取代基”并且改变且选自：例如：卤素，-OR’，＝O，＝NR’，＝N-OR’，-NR’R”，-SR’，-卤素，-SiR’R”R”’，-OC(O)R’，-C(O)R’，-CO2R’，-CONR’R”，-OC(O)NR’R”，-NR”C(O)R’，-NR’-C(O)NR”R”’，-NR”C(O)2R’，-NR-C(NR’R”)＝NR’”，-S(O)R’，-S(O)2R’，-S(O)2NR’R”，-NRSO2R’，-CN和-NO2，-R’，-N3，-CH(Ph)2，氟(C1-C4)烷氧基和氟(C1-C4)烷基，其数值范围从0到芳族环系上的开放活化剂的总数；且其中R’，R”，R”’和R””优选独立地选自氢，(C1-C8)烷基和杂烷基，未被取代的芳基和杂芳基，(未被取代的芳基)-(C1-C4)烷基和(未被取代的芳基)氧基-(C1-C4)烷基。例如，当本发明的化合物包括一个以上R基团时，R基团各自独立地选作这些基团中的一种以上存在时的R’，R”，R’”和R””各基团。
芳基或杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的2个可以任选被式-T-C(O)-(CRR’)q-U-的取代基取代，其中T和U独立为-NR-，-O-，-CRR’-或单键，且q为0-3的整数。可选择地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的2个可以任选被式-A-(CH2)r-B-的取代基取代，其中A和B独立为-CRR’-，-O-，-NR-，-S-，-S(O)-，-S(O)2-，-S(O)2NR’-或单键，且r为1-4的整数。由此形成的新环的单键旨意可以任选被双键取代。可选择地，芳基或杂芳基环的相邻原子上的芳基取代基中的2个可以任选被式-(CRR’)s-X-(CR”R’”)d-的取代基取代，其中s和d独立为0-3的整数，且X为-O-，-NR’，-S-，-S(O)-，-S(O)2-或-S(O)2NR’-。取代基R，R’，R”和R’”优选独立地选自氢或取代的或未被取代的(C1-C6)烷基。
本文所用的术语“二磷酸盐酯”包括，但不限于包含两个磷酸酯基的磷酸的酯。术语“三磷酸酯”包括，但不限于包含三个磷酸酯基的磷酸的酯。例如，具有二磷酸酯或三磷酸酯的特定药物包括：
Figure A20068004401200461
二磷酸酯
Figure A20068004401200462
三磷酸酯
本文所用的术语“杂原子”包括氧(O)，氮(N)，硫(S)和硅(Si)。
符号“R”为表示取代基的一般缩写，所述的取代基选自取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代的或未被取代的杂环基。
本文所用的术语“药学上可接受的载体”意指药学上可接受的涉及携带或转运化学试剂的物质，组合物或媒介物，诸如液体或固体填充剂，稀释剂，赋形剂，溶剂或包囊材料。药学上可接受的载体包括药学上可接受的盐，其中术语“药学上可接受的盐”包括使用相对无毒性的酸或碱制备的活性化合物的盐，这取决于本文所述化合物上发现的特定取代基。当本发明的化合物包含相对酸性的官能团时，可以通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需碱以净的方式或在合适的惰性溶剂中获得碱加成的盐。药学上可接受的碱加成的盐的实例包括钠，钾，钙，铵，有机氨基或镁盐或类似的盐。当本发明的化合物包含相对碱性的官能团时，可以通过使这类化合物的中性形式接触足量的所需酸以净的方式或在合适的惰性溶剂中获得酸加成的盐。药学上可接受的酸加成的盐的实例包括来源于无机酸和来源于相对无毒性的有机酸的那些盐，所述的无机酸如盐酸，氢溴酸，硝酸，碳酸，一氢碳酸，磷酸，一氢磷酸，二氢磷酸，硫酸，一氢硫酸，氢碘酸或亚磷酸等，所述的相对无毒性有机酸如乙酸，丙酸，异丁酸，马来酸，丙二酸，苯甲酸，琥珀酸，癸二酸(suberic acid)，富马酸，乳酸，扁桃酸，苯二甲酸，苯磺酸，对-甲苯磺酸，柠檬酸，酒石酸，甲磺酸等。还包括氨基酸的盐，诸如精氨酸盐等和有机酸的盐，如葡糖醛酸或半乳糖醛酸等(例如，参见，Berge等，“Pharmaceutical Salts”，Journal of Pharmaceutical Science，1977，66，1-19)。本发明的某些具体化合物包含能够使该化合物转化成碱或酸加成的盐的碱性和酸性官能团。
化合物的中性形式优选通过使盐接触碱或酸并且按照常规方式分离母体化合物再生。化合物的母体形式在某些物理特性方面不同于各种盐形式，诸如在极性溶剂中的溶解度，否则，就本发明的目的而言，盐与化合物的母体形式等效。
除盐形式外，本发明提供了为前体药物形式的化合物。本文所述的化合物前体药物为易于在生理条件下发生化学改变而的本发明化合物的那些化合物。另外，可以在离体环境中通过化学或生化方法将前体药物转化成本发明的化合物。例如，在放入含有合适的酶或化学试剂的透皮贴剂储器中时，前体药物可以缓慢地被转化成本发明的化合物。
本发明的某些化合物可以以非溶剂化形式和溶剂化形式存在，包括水合形式。一般而言，溶剂化形式与非溶剂化形式等效并且包括在本发明范围内。本发明的某些化合物可以以多晶型或非晶形形式存在。一般而言，所有物理形式对本发明关注的应用而言等效，并且指定它们属于本发明范围内。
本发明的某些化合物具有不对称碳原子(光学中心)或双键；外消旋物，非对映体，几何异构体和各异构体包括在本发明范围内。
本发明的化合物还可以在构成这类化合物的原子中的一个或多个上包含非天然比例的原子同位素。例如，可以用放射性同位素对这些化合物进行放射性标记，诸如例如氚(3H)，碘-125(125I)或碳-14(14C)。本发明化合物的所有同位素变化形式，无论是否具有放射性，均属于本发明范围内。
术语“连接部分”或“连接靶向基团的部分”意指能够使靶向基团结合连接基的部分。典型连接基作为实例包括烷基，氨基烷基，氨基羰基烷基，羧基烷基，羟基烷基，烷基-马来酰亚胺，烷基-N-羟基琥珀酰亚胺，聚(乙二醇)-马来酰亚胺和聚(乙二醇)-N-羟基琥珀酰亚胺，但不限于它们，它们均可以进一步被取代。连接基还可以具有实际上悬于靶向基团上的部分。
本文所用的术语“离去基”意指在反应中从底物上裂解的底物部分。
本文涉及的术语“抗体”包括完整抗体和任意抗原结合片段(即“抗原-结合部分”)或其单链。“抗体”意指包含通过二硫键互联的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。各重链由重链可变区(VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三种结构域CH1，CH2和CH3组成并且可以具有μ，δ，γ，α或ε同种型。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一种结构域CL组成，可以具有κ或λ同种型。VH和VL区可以进一步再分成高变区，称作互补决定区(CDR)，其散布于更保守的称作构架区(FR)的区中。VH和VL各自由三种CDR和四种FR组成，其按照如下顺序从氨基-末端到羧基-末端排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链可变区包含与抗原发生相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子结合，包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和传统补体系统的第一种成分(Clq)。
本文所用的术语抗体的“抗体片段”或“抗原-结合部分”(或简称“抗体部分”)意指保持特异性结合抗原的抗体的一种或多种片段。已经证实抗体的抗原结合功能抗原可以由全长抗体的片段完成。术语抗体的“抗体片段”或“抗原-结合部分”中包括的结合片段的实例包括：(i)Fab片段，即由VL，VH，CL和CH1结构域组成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，即包含通过二硫桥连接在铰链区上的Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域组成的Fv片段；(v)由VH结构域组成的dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，尽管Fv片段的两种结构域VL和VH由单独基因编码，使用重组方法，由合成接头连接它们，所述的合成接头能够将其制成单一蛋白链，其中VL和VH区配对成一价分子(称作单链Fv(scFv)；例如，参见Bird等，(1988)Science 242：423-426；和Huston等，(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)。指定这类单链抗体包括在术语抗体的“抗原-结合部分”内。使用本领域技术人员公知的常规技术获得这些抗体片段，并且为应用以与完整抗体相同的方式筛选这些片段。
本文所用的术语“单克隆抗体”意指单分子组成的抗体分子制品。单克隆抗体组合物展示出单一结合特异性和对特定表位的亲和力。
为了制备单克隆或多克隆抗体，可以使用任意公知的技术(例如，参见Kohler & Milstein，Nature 256：495-497(1975)；Kozbor等，Immunology Today 4：72(1983)；Cole等，pp.77-96，MONOCLONALANTIBODIES AND CANCER THERAPY，Alan R.Liss，Inc.(1985))。
多克隆抗体的生产方法为本领域技术人员公知的。使用标准佐剂诸如弗氏佐剂和标准免疫接种方案给近亲繁殖系鼠(例如BALB/C小鼠)或家兔免疫接种蛋白质。通过采用试验放血并且测定对β亚单位的反应性滴度来监测动物对免疫原制品的免疫应答。当获得对免疫原的适当高滴度抗体时，从动物采血并且制备抗血清。如果需要，可以对抗血清进行进一步分级分离以便富集与蛋白质反应的抗体。
可以通过本领域技术人员熟知的各种技术获得单克隆抗体。简言之，通常通过与骨髓瘤细胞融合使来自免疫接种所需抗原的动物的脾细胞无限增殖化(参见Kohler & Milstein，Eur.J.Immunol.6：511-519(1976))。无限增殖化的备选方法包括使用EB病毒，癌基因或逆转录病毒或本领域众所周知的其它方法转化。
在一个优选的实施方案中，抗体为嵌合或人源化抗体。抗原基于鼠单克隆抗体的序列制备本发明的嵌合或人源化抗体。编码重链和轻链免疫球蛋白的DNA可以获自所关注的鼠杂交瘤并且使用标准分子生物学技术改造以便包含非-鼠(例如人)免疫球蛋白序列。例如，为了生成嵌合抗体，可以使用本领域各种的方法使鼠可变区可以与人恒定区连接(例如，参见Cabilly等的美国专利US4,816,567)。为了生成人源化抗体，可以使用本领域公知的方法将鼠CDR区插入人框架(例如，参见Winter的美国专利US5,225,539和Queen等的美国专利US5,530,101；5,585,089；5,693,762和6,180,370)。
在另一个优选的实施方案中，抗体为人抗体。这类人抗体可以通过免疫接种转基因或转染色体小鼠生成，其中内源性小鼠免疫球蛋白基因失活，并且导入了外源性人免疫球蛋白基因。这类小鼠为本领域公知的(例如，参见美国专利US5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,789,650；5,877,397；5,661,016；5,814,318；5,874,299；和5,770,429；所有专利均属于Lonberg和Kay；Kucherlapati等的美国专利US5,939,598；6,075,181；6,114,598；6,150,584和6,162,963；和Ishida等的PCT公开号WO02/43478)。还可以使用用于筛选人免疫球蛋白基因文库的噬菌体展示方法制备人抗体。用于分离人抗体的这类噬菌体展示方法为本领域公知的(例如，参见Ladner等的美国专利US5,223,409；5,403,484；和5,571,698；Dower等的美国专利US5,427,908和5,580,717；McCafferty等的美国专利US5,969,108和6,172,197；和Griffiths等的美国专利US5,885,793；6,521,404；6,544,731；6,555,313；6,582,915和6,593,081)。
本文所用的“固相支持体”意指基本上不溶于选择的溶剂相同或易于从可溶于的选择的溶剂系统中分离的物质(例如通过沉淀)。用于实施本发明的固相支持体可以包括活化或能够活化以使选择的种类结合固相支持体的基团。固相支持体还可以为底物，例如，芯片，晶片或孔，在其上结合有单个或一种以上化合物。
本文所用的“反应性官能团”意指基团，包括，但不限于烯烃类，乙炔类，醇类，酚类，醚类，氧化物，卤化物，醛类，酮类，羧酸类，酯类，酰胺类，氰酸酯类，异氰酸酯类，硫氰酸酯类，异硫氰酸酯类，胺类，肼类，腙类，酰肼类，重氮基(diazo)，重氮基(diazonium)，硝基，腈类，硫醇类，硫化物，二硫化物，亚砜类，砜类，磺酸类，亚磺酸类，缩醛类，缩酮类，酐类，硫酸酯类，次磺酸类，异腈类，脒类，酰亚胺类，亚氨酸酯类，硝酮类，羟基胺类，肟类，羟肟酸类，硫代异羟肟类，丙二烯类，原酯类，亚硫酸酯类，烯胺类，炔胺类，脲类，假脲类，氨基脲类，碳化二亚胺类，氨基甲酸酯类，亚胺类，叠氮化物，偶氮化合物，氧化偶氮化合物和亚硝基化合物。反应性官能团还包括用于制备生物轭合物的那些，例如N-羟基琥珀酰亚胺酯类，马来酰亚胺类等(例如，参见Hermanson，BIOCONJUGATE TECHNIQUES，Academic press，San Diego，1996)。用于制备这些官能团中的每一种的方法为本领域众所周知的并且其应用于特定目的或为特定目的的修饰属于本领域技术人员的能力范围(例如，参见Sandler和Karo，eds.ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS，Academic Press，SanDiego，1989)。可以保护或不保护反应性官能团。
将本发明的化合物制备成单一异构体(例如对映体，顺式-反式，位置，非对映体)或作为异构体混合物。在一个优选的实施方案中，将这些化合物制备成基本上单一异构体。制备基本上异构体纯的化合物的方法为本领域公知的。例如，可以通过使用合成中间体与反应制备对映体富集的混合物和纯的对映体化合物，所述的合成中间体为对映体纯的，并且所述的反应保持在手性中心上的立体化学不变或导致其全反转。可选择地，可以将终产物或沿合成途经的中间体拆分成单一立体异构体。用于使特定立体中心反转或保持不变的技术和那些拆分立体异构体混合物的技术为本领域众所周知的并且充分属于本领域技术人员选择和特定情况的适当方法的能力范围。一般参见Furniss等(eds.)，VOGEL’s ENCYCLOPEDIA OF PRACTICAL ORGANIC CHEMISTRY 5TH ED.，Longman Scientific and Technical Ltd.，Essex，1991，pp.809-816；和Heller，Acc.Chem.Res.23：128(1990)。
连接基
本发明提供了药物-配体轭合物，其中药物通过化学连接基与配体连接，所述的化学连接基包括，但不限于如下文献美国专利申请顺序号US11/134,826和美国林深专利申请顺序号US60/572,667和60/661,174中披露的那些，将所有这些文献引入本文作为参考。该连接基为肽基，肼或二硫化物连接基并且在本文中分别描述为(L4)p-F-(L1)m，(L4)p-H-(L1)m或(L4)p-J-(L1)m。除与药物连接的连接基外，本发明还提供了适合于连接基本上任意分子种类的可裂解连接基臂。本发明的连接基臂方面在本文中以涉及连接治疗部分的为典型。然而，本领域技术人员显而易见连接基可以与不同种类连接，包括，但不限于诊断试剂，分析试剂，生物分子，靶向剂，可检测标记等。
本发明在一个方面中涉及用于连接靶向基团与治疗剂和标记的连接基。本发明在另一个方面中提供了连接基，这些连接基将稳定性传递给化合物，减轻其体内毒性，否则有利于影响其药动学，生物利用度和/或药效学。一般优选在这类实施方案中，裂解连接基，从而一旦药物被递送至其作用部位就释放活性药物。因此，在本发明的一个实施方案中，本发明的连接基为无踪迹的，使得一旦从治疗剂或标记中除去(诸如活化过程中)，就没有连接基存在的踪迹保留。
在本发明的另一个实施方案中，连接基的特征在于其在靶细胞内或接近靶细胞的部位，诸如在治疗作用或标记活性部位上裂解的能力。这类裂解实际上可以为酶促的。该特征有助于减少治疗剂或标记的全身活化，减轻毒性和全身副作用。用于酶裂解的优选可裂解基团包括肽键，酯键和二硫键。在其它实施方案中，连接基对pH敏感并且通过pH的改变裂解。
本发明的重要方面在于控制连接基裂解速度的能力。例如，本文所述的肼连接基特别有用，因为根据所用特定结构的不同，可以改变连接基环化的速度且由此从配体上裂解药物。WO02/096910提供了具有肼连接基的几种具体的配体-药物复合物。然而，尚无根据所需环化速率的不同“调协”连接基组成的方式，并且所述的特定化合物以比优选用于许多药物-连接基轭合物缓慢的速率从药物上裂解配体。相反，本发明的肼连接基提供了一定范围的环化速率，从极为快速到极为缓慢，由此能够基于所需的环化速率选择特定的肼连接基。例如，可以使用在裂解时产生单一5-元环的肼连接基获得极为快速的环化。使用在裂解时产生由在偕上带有两个甲基的连接基产生的两个5-元环或单一6-元环的肼连接基实现用于将细胞毒性基靶向递送至细胞的优选环化速率。已经证实偕二甲基效应可比在偕上无两个甲基的单一6-元环加速环化反应速率。这一结果因在环上释放应变而产生。然而，有时，取代基可以减慢反应而非使其加速。通常这种延缓的原因可以追溯到位阻。正如实施例2.4中所示，偕二甲基取代能够使环化反应远比偕碳为CH2时快速。
不过，重要的是注意，在某些实施方案中，可以优选更缓慢裂解的连接基。例如，在缓释制剂或具有快速释放和缓慢释放成分的制剂中，有用的是提供缓慢裂解的连接基。在某些实施方案中，使用肼连接基获得缓慢环化速率，所述的肼连接基在裂解时产生没有偕二甲基取代的单一6-元环或单一7-元环。
连接基还用于稳定治疗剂或标记以防止在循环中降解。这一特征提供了显著有益性，因为这类稳定导致连接的活性剂或标记的循环半衰期延长。该连接基还用于减弱连接的活性剂或标记的活性，使得轭合物在循环的同时相对温和并且具有期望的作用，例如在所需作用部位上活化后的毒性。就治疗剂轭合物而言，这种连接基的特征用于改善活性剂的治疗指数。
优选选择稳定基团以便限制治疗剂或标记被存在于血液或非-靶组织中的酶清除和代谢，并且进一步选择它们以便将所述的活性剂或标记转运入细胞。稳定基团用于阻断活性剂或标记降解并且还在提供活性剂或标记的其它物理特性方面起作用。稳定基团还用于改善活性剂或标记在以配制或非-配制形式储存过程中的稳定性。
理想的情况是，稳定基团用于稳定治疗剂或标记，只要它在通过该活性剂或标记在37℃下的人血液中储存2小时测试时用于防止活性剂或标记发生降解，并且导致在指定测定条件下被存在于人血液中的酶裂解的活性剂或标记低于20％，优选低于10％，更优选低于5％且甚至更优选低于2％。
本发明还涉及包含这些连接基的轭合物。更具体地说，本发明涉及可以用于治疗疾病，尤其是用于癌症化疗的前体药物。特别地，本文所述连接基的应用提供了展示出高度作用特异性，比类似结构前体药物减轻的毒性和在血液中改善的稳定性的前体药物。
本文所述的本发明连接基可以存在于细胞毒性轭合物中的任意位置上。
因此，提供了可以包含各种基团中的任意一种的连接基，这些基团作为其链的组成部分可在体内，例如在血液中以相对于缺乏这类基团的构建体而言加速的速率裂解。还提供了连接基臂与治疗剂和诊断试剂的轭合物。连接基用于形成治疗剂的前体药物类似物并且可逆地裂解治疗剂或诊断试剂与靶向剂，可检测标记或固相支持体。可以将连接基掺入包括本发明细胞毒素的复合物。
除可裂解肽，肼或二硫化物基团外，细胞毒素与靶向剂之间任选引入一个或多个自我消除连接基L1。还可以将这些连接基描述为间隔基并且包含至少两个反应性官能团。一般而言，间隔基的一个化学官能团键合治疗剂，例如细胞毒素的化学官能团，而间隔基的其它化学官能团用于键合靶向剂或可裂解连接基的化学官能团。间隔基的化学官能团的实例包括羟基，巯基，羰基，羧基，氨基，酮和巯基。
由L1表示的自我消除连接基一般为取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基或取代或未被取代的杂烷基。在一个实施方案中，烷基或芳基可以包含1-20个碳原子。它们还可以包含聚乙二醇部分。
典型的间隔基包括，例如，6-氨基己醇，6-巯基己醇，10-羟基癸酸，甘氨酸和其它氨基酸，1，6-己二醇，β-丙氨酸，2-氨基乙醇，半胱胺(2-氨基乙硫醇)，5-氨基戊酸，6-氨基己酸，3-马来酰亚氨基苯甲酸，四氯苯酞，α-取代的四氯苯酞类，羰基，动物酯类，核酸，肽类等。
间隔基可以用于将额外的分子量和化学官能团引入细胞毒素-靶向剂复合物。一般而言，额外的分子量和官能团会影响复合物的血清半衰期和其它特性。因此，通过谨慎选择间隔基，可以产生具有一定范围血清半衰期的细胞毒素复合物。
直接位于与药物部分相邻的位置的间隔基还表示为(L1)m，其中m为选自0，1，2，3，4，5或6的整数。当多个L1间隔基存在时，可以使用相同或不同的间隔基。L1可以为任意的自我消除基团。在一个实施方案中，L1优选为取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基，未被取代的杂环烷基和取代的杂环烷基。当药物-配体轭合物包含肼连接基时，L1不含二硫键。
L4为连接基部分，它将增加的溶解性或减少的聚集特性传递给使用包含所述部分的连接基的轭合物。L4连接基不一定自我消除。在一个实施方案中，L4部分为取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂烷基或未被取代的杂烷基，它们中的任意一种可以为直链，支链或环状的。取代可以为，例如，低级(C1-C6)烷基，烷氧基，烷硫基，烷氨基或二烷氨基。在某些实施方案中，L4包含非-环状部分。在另一个实施方案中，L4包含任意的带正电荷或带负电荷的氨基酸聚合物，诸如聚赖氨酸或聚精氨酸。L4可以包含聚合物，诸如聚乙二醇部分。另外，L4连接基包含，例如，聚合物成分和小化学部分。
在一个优选的实施方案中，L4包含聚乙二醇(PEG)部分。L4的PEG部分可以为1-50个单元长。优选PEG具有1-12重复单元，更优选3-12重复单元，更优选2-6重复单元或甚至更优选3-5重复单元和最优选4重复单元。L4可以仅由PEG部分组成或它还可以包含额外的取代或未被取代的烷基或杂烷基。有用的是合并PEG作为L4部分的组成部分，以便增强复合物的水溶性。另外，PEG部分降低可以在药物与抗体轭合过程中发生的聚集度。
(1)肽连接基(F)
如上所述，本发明的肽基连接基可以由式(L4)p-F-(L1)m表示，其中F表示包含肽基部分的连接基部分。在一个实施方案中，F部分包含任选额外的自我消除连接基，L2和羰基羰基。在另一个实施方案中，F部分包含氨基和任选的间隔L3。
因此，在一个实施方案中，包含肽基连接基的轭合物包含式4的结构：
Figure A20068004401200561
在该实施方案中，L1为如上所述的自我消除连接基，且L4为如上所述传递增加的溶解性或减少的聚集特性的部分。L2表示自我消除连接基。m为0，1，2，3，4，5或6；o和p独立为0或1。在一个实施方案中，m为3，4，5或6。AA1表示一个或多个天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸；c为1-20的整数。
在上述式4的本发明的肽连接基中，AA1在其氨基末端上直接连接L4，或当L4不存在时，直接连接X4基团(即靶向剂，可检测标记，被保护的反应性官能团或未被保护的反应性官能团)。在某些实施方案中，当L4存在时，L4不含直接与(AA1)c的N-末端连接的羧酸酰基。因此，在这些实施方案中没有必要如同美国专利US6,214,345中的肽连接基必需存在的在L4或X4与AA1之间直接存在羧酸酰基单元。
在另一个实施方案中，包含肽基连接基的轭合物包含式5的结构：
Figure A20068004401200571
在该实施方案中L4为如上所述传递增加的溶解性或减少的聚集特性的部分；L3为包含伯或仲案或羧基官能团的间隔基，并且L3的胺与D的羧基官能团侧基形成酰胺键，或L3的羧基与D的胺官能团侧基形成酰胺键；且o和p独立为0或1。AA1表示一个或多个天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸；c为1-20的整数。在该实施方案中，L1不存在(即式中m为0)。
在上述式5的本发明肽连接基中，AA1在其氨基末端上直接连接L4，或当L4不存在时，直接连接X4基团(即靶向剂，可检测标记，被保护的反应性官能团或未被保护的反应性官能团)。在某些实施方案中，当L4不存在时，L4不含直接连接(AA1)c的N-末端的羧酸酰基。因此，在这些实施方案中没有必要如同美国专利US6,214,345中的肽连接基必需存在的在L4或X4与AA1之间直接存在羧酸酰基单元。
自我消除连接基L 2
自我消除连接基L2为能够将两个间隔化学部分彼此共价连接形成一般稳定的三联分子的双官能化学部分，从而通过酶裂解方式从三联分子上释放所述间隔化学部分旨意；并且在所述的酶裂解后，从该分子的剩余部分上自发裂解以便释放所述间隔化学部分的另一部分。本发明的自我消除间隔基在其末端上与肽部分共价连接并且在另一端上与药物部分的化学反应位置共价连接，其衍生抑制药理学活性，以便使肽部分和药物部分间隔并且彼此共价连接形成三联分子，它是稳定的并且在没有靶酶存在下在生理学上为失活的，但在共价连接间隔基部分和肽部分的键上可被这类靶酶酶裂解，由此从三联分子上有效释放肽部分。这类酶裂解由此活化间隔基部分的自我消除特性并且启动共价连接间隔基部分与药物部分的键自发裂解，由此有效释放药理学活性形式的药物。
自我消除间隔基L2可以为任意的自我消除间隔基。优选L2为取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，未被取代的杂环烷基，取代的杂环烷基，取代的和未被取代的芳基和取代的和未被取代的杂芳基。
一种特别优选的自我消除间隔基L2可以由式6表示：
Figure A20068004401200581
氨基苄基的芳族环可以被一个或多个“K”基团取代。“K”基团为芳族环上的取代基，否则，它取代为环结构组成部分的4个非-取代碳之一连接。“K”基团可以为单原子，诸如卤素或可以为多-原子基团，诸如烷基，杂烷基，氨基，硝基，羟基，烷氧基，卤代烷基和氰基。K各自独立地选自取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR21R22，NR21COR22，OCONR21R22，OCOR21和OR21，其中R21和R22独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基和未被取代的杂环烷基。典型的K取代基包括，但不限于F，Cl，Br，I，NO2，OH，OCH3，NHCOCH3，N(CH3)2，NHCOCF3和甲基。就“Ka”而言，a为0，1，2，3或4的整数。在一个优选的实施方案中，a为0。
上述所示结构的醚氧原子与羰基连接。从NR24官能团进入芳族环的线表示胺官能团可以与构成环和未被-CH2-O-基团取代的5个碳中的任意个键合。优选X的NR24官能团在相对于-CH2-O-基团而言对位上与芳族环共价结合。R24为选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基的成员。在一个具体的实施方案中，R24位氢。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了上述式(4)的肽连接基，其中F包含如下结构：
Figure A20068004401200591
其中
R24选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基；
各自K为独立地选自取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR21R22，NR21COR22，OCONR21R22，OCOR21和OR21中的成员；
其中
R21和R22独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基；且
a为0，1，2，3或4的整数。
在另一个实施方案中，上述式(4)的肽连接基包含-F-(L1)m-，其包含如下结构：
其中
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基的成员。
间隔基L 3
间隔基L3的特征在于它包含伯或仲胺或羧基官能团，并且L3基团的胺与D的羧基官能团侧基形成酰胺键，或L3的羧基与D的胺官能团侧基形成酰胺键。L3可以选自取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代的或未被取代的杂(htero)芳基或取代或未被取代的杂环烷基。在一个优选的实施方案中，L3包含芳族基团。更优选L3包含苯甲酸基团，苯胺基团或吲哚基。可以用作-L3-NH-的间隔基的非-限制性实例包括如下结构：
Figure A20068004401200602
Figure A20068004401200611
其中Z为选自O，S和NR23中的成员，且
其中R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基的成员。
在包含L3的本发明连接基裂解时，L3部分保持与药物D连接。因此，选择L3部分，使得其与D连接的存在不会显著改变D的活性。在另一个实施方案中，药物D自身的部分作为L3间隔基起作用。例如，在一个实施方案中，药物D为多卡米星衍生物，其中药物的部分作为L3间隔基起作用。这类实施方案的非-限制性实例包括这类实施方案，其中NH2-(L3)-D具有选自如下的结构：
Figure A20068004401200612
Figure A20068004401200621
和
Figure A20068004401200622
其中Z为选自O，S和NR23的成员，
其中R23为选自H，取代或未被取代的烷基，
取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；且
其中各结构上的NH2基团与(AA1)c反应而形成-(AA1)c-NH-。
肽序列AA 1
基团AA1表示单一氨基酸或彼此提供酰胺键连接的多个氨基酸。氨基酸可以为天然氨基酸和/或非天然α-氨基酸。
肽序列(AA1)c在功能上单一氨基酸的酰胺化残基(当c＝1时)或多个彼此提供酰胺键连接的氨基酸。选择本发明的肽是为了指导生物系统中所关注位置上的酶对肽进行酶催化的裂解。例如，就使用靶向剂靶向至细胞且然后被细胞吸收的轭合物而，选择被一种或多种溶酶体蛋白酶裂解的肽，使得该肽在溶酶体内发生胞内裂解。肽内的氨基酸数量可以在1-20；而更优选存在包含(AA1)c的2-8个氨基酸，2-6个氨基酸或2，3或4个氨基酸。对特异性酶或酶类型裂解敏感的肽序列为本领域众所周知的。
被血清，肝，肠等中的酶切割的许多肽序列为本领域中公知的。本发明的典型肽序列包括被蛋白酶切割的肽序列。继续使用蛋白酶敏感性序列讨论的焦点在于清楚地解释并且不用于限制本发明的范围。
当切割肽的酶为蛋白酶时，连接基一般包括包含蛋白酶的切割识别序列的肽。蛋白酶的切割识别序列为在蛋白酶剪切过程中由蛋白酶识别的特异性氨基酸序列。许多蛋白酶切割位点为本领域公知的并且它们和其它切割位点可以包括在连接基部分中。例如，参见Matayoshi等，Science 247：954(1990)；Dunn等，Meth.Enzymol.241：254(1994)；Seidah等，Meth.Enzymol.244：175(1994)；Thornberry，Meth.Enzymol.244：615(1994)；Weber等，Meth.Enzymol.244：595(1994)；Smith等，Meth.Enzymol.244：412(1994)；Bouvier等，Meth.Enzymol.248：614(1995)，Hardy等，AMYLOID PROTEINPRECURSOR IN DEVELOPMENT，AGING AND ALZHEIMER′S DISEASE，ed.Masters等，pp.190-198(1994)。
肽序列的氨基酸(AA1)c基于其对特定分子，诸如肿瘤-相关蛋白酶选择性酶切割的适合性。所用的氨基酸可以为天然或非天然氨基酸。它们可以为L或D构型。在一个实施方案中，使用至少三种不同的氨基酸。在另一个实施方案中，仅使用两种氨基酸。
在一个优选的实施方案中，肽序列(AA1)c基于其被溶酶体蛋白酶切割的能力选择，所述的溶酶体蛋白酶的非-限制性实例包括组织蛋白酶B，C，D，H，L和S。优选肽序列(AA1)c能够被组织蛋白酶B在体外裂解，可以使用本领域公知的体外蛋白酶切割测定法测试。
在另一个实施方案中，肽序列(AA1)c基于其对肿瘤-相关蛋白酶切割的能力选择，所述的肿瘤-相关蛋白酶诸如在邻近肿瘤细胞处的胞外发现的蛋白酶，其非-限制性实例包括巯基和金属依赖性寡肽酶(TOP)和CD10。可以使用本领域公知的体外蛋白酶切割测定法测试TOP或CD10切割肽的能力。
适用于本发明轭合物的肽序列的合适的，但非-限制性实例包括Val-Cit，Val-Lys，Phe-Lys，Lys-Lys，Ala-Lys，Phe-Cit，Leu-Cit，Ile-Cit，Trp，Cit，Phe-Ala，Phe-N9-对甲苯磺酰基-Arg，Phe-N9-硝基-Arg，Phe-Phe-Lys，D-Phe-Phe-Lys，Gly-Phe-Lys，Leu-Ala-Leu，Ile-Ala-Leu，Val-Ala-Val，Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ ID NO：1)，β-Ala-Leu-Ala-Leu(SEQ IDNO：2)和Gly-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：3)。优选的肽序列为Val-Cit和Val-Lys。
在另一个实施方案中，位于接近药物部分的氨基酸选自：Ala，Asn，Asp，Cit，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Lys，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。在另一个实施方案中，位于最接近药物部分的氨基酸选自：Ala，Asn，Asp，Cys，Gln，Glu，Gly，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Ser，Thr，Trp，Tyr和Val。
蛋白酶涉及癌症转移。蛋白酶尿激酶合成增加与许多癌症中的转移能力相关。尿激酶从纤溶酶原活化纤维蛋白溶酶，它遍在位于细胞外隙，并且其活化可以导致胞外基质中的蛋白质降解，通过这种方式转移瘤细胞侵入。纤维蛋白溶酶还可以活化胶原酶，由此促进毛细血管和淋巴系统周围的基膜降解，由此使肿瘤细胞侵入靶组织(Dano等Adv.Cancer.Res.，44：139(1985))。因此，在本发明范围内使用被尿激酶切割的肽序列作为连接基。
本发明还提供了对类胰蛋白酶切割敏感的肽序列的应用。人肥大细胞表达至少四种不同的类胰蛋白酶，称作αβI，βII和βIII。这些酶不受血浆蛋白酶抑制剂控制并且在体外仅裂解少量生理底物。丝氨酸蛋白酶的类胰蛋白酶家族涉及各种涉及肥大细胞过敏性和炎性疾病，这是因从患有这些病症的患者的生物流体中发现升高的类胰蛋白酶水平所致。然而，类胰蛋白酶在疾病病理生理学中的确切作用持续得以描述。类胰蛋白酶的生物功能范围和相应的生理学后果基本上由其底物特异性确定。
类胰蛋白酶为尿激酶前体纤溶酶原激活物(uPA)的有效激活物，即与肿瘤转移和侵入相关的蛋白酶酶原形式。导致细胞渗出和迁移的胞外基质破坏的纤溶酶原级联活化可以为尿激酶前体纤溶酶原激活物在Pro-Arg-Phe-Lys(SEQ ID NO：4)的P4-P1序列上类胰蛋白酶活化的功能(Stack等，Journal of Biological Chemistry 269(13)：9416-9419(1994))。血管作用肠肽，即涉及血管通透性的神经肽也由类胰蛋白酶主要在Thr-Arg-Leu-Arg(SEQ ID NO：5)序列上切割(Tam等，Am.J.Respir.Cell Mol.Biol.3：27-32(1990))。G-蛋白偶联受体PAR-2被类胰蛋白酶在Ser-Lys-Gly-Arg(SEQ ID NO：6)序列上切割和活化以便驱动成纤维细胞增殖，而凝血酶活化受体PAR-1被类胰蛋白酶在Pro-Asn-Asp-Lys(SEQ ID NO：7)序列上失活(Molino等，Journal of Biological Chemistry 272(7)：4043-4049(1997))。这一证据彼此提示了作为疾病后果的类胰蛋白酶在组织重建中的中心作用。这一结果与在几种肥大细胞-介导的病症中观察到的深度改变一致。慢性哮喘和其它长期呼吸系统疾病疾病的一个标志在于可以为其生理学靶标的类胰蛋白酶活化结果的基础组织纤维化和增厚。类似地，一系列报导证实了各种癌症中与肥大细胞密度，类胰蛋白酶活性和预后差相关的血管发生(Coussens等，Genes和Development 13(11)：1382-97(1999))；Takanami等，Cancer 88(12)：2686-92(2000)；Toth-Jakatics等，Human Pathology 31(8)：955-960(2000)；Ribatti等，International Journal of Cancer 85(2)：171-5(2000))。
本领域中已知用于评价特定蛋白酶是否切割选择的肽序列的方法。例如，7-氨基-4-甲基香豆素(AMC)荧光肽底物的应用为用于测定蛋白酶特异性的充分确立的方法(Zimmerman，M.等，(1977)Analytical Biochemistry 78：47-51)。酰基苯胺键的特异性裂解释放荧光AMC离去基，从而能够简便地确定各底物的裂解速率。更近来，AMC肽底物文库的阵列(Lee，D.等，(1999)Bioorganic and MedicinalChemistry Letters 9：1667-72)和位置-扫描文库(Rano，T.A.等，(1997)Chemistry and Biology 4：149-55)已经用于快速描绘蛋白酶N-末端特异性的特性，通过在单一实验中对广泛底物取样来进行。因此，本领域技术人员易于评价肽序列的阵列以便在无需借助于过度实验的情况下确定其在本发明中的有用性。
(2)肼连接基(H)
在第二个实施方案中，本发明的轭合物包含肼自我消除连接基，其中该轭合物具有如下结构：
X4--(L4)p-H-(L1)m--D
其中D，L1，L4和X4如上述所定义并且在本文中进一步描述，且H为包含如下结构的连接基：
Figure A20068004401200661
其中
n1为1-10的整数；
n2为0，1或2；
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基中的成员；且
I为键(即骨架碳与相邻氮之间的键)或：
Figure A20068004401200671
其中n3为0或1，条件是当n3为0时，n2不为0；且
n4为1，2或3，
其中当I为键时，n1为3且n2为1，D不能为：
Figure A20068004401200672
其中R为Me或CH2-CH2-NMe2。
在一个实施方案中，苯基环上的取代为对位取代。在优选的实施方案中，n1为2，3或4或n1为3。在优选的实施方案中，n2为1。在优选的实施方案中，I为键(即骨架碳与相邻氮之间的键)。在一个方面中，例如，当n3为0且n4为2时，肼连接基H可以在裂解时形成6-元自我消除连接基。在另一个方面中，肼连接基H在裂解时可以形成两个5-元自我消除连接基。在其它方面中，在裂解时，H形成5-元自我消除连接基，H形成7-元我消除连接基或H形成5-元我消除连接基和6-元我消除连接基。裂解速率受裂解时消除的环的大小影响。因此，根据所需裂解速率的不同，可以选择在裂解时形成的适当大小的环。
5元肼连接基
在一个实施方案中，肼连接基包含5-元肼连接基，其中H包含如下结构：
Figure A20068004401200681
在一个优选的实施方案中，n1为2，3或4。在另一个优选的实施方案中，n1为3。
在上述结构中，R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基的成员。在一个实施方案中，R24各自独立地H或C1-C6烷基。在另一个实施方案中，R24各自独立地H或C1-C3烷基，更优选H或CH3。在另一个实施方案中，至少一个R24为甲基。在另一个实施方案中，R24各自为H。R24各自选择以便构成化合物的位阻效应和改变溶解性。
5-元肼连接基可以进行一种或多种药物从连接基上分离的环化反应，并且例如，可以描述为：
Figure A20068004401200682
用于制备本发明5元连接基的典型合成途经为：
Figure A20068004401200691
使Cbz-被保护的DMDA b与2，2-二甲基-丙二酸a在含有亚硫酰氯的溶液中反应而生成Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸c。使化合物c与Boc-N-甲基肼d在有氢存在下反应而生成DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N-甲基肼e。
6元肼连接基
在另一个实施方案中，肼连接基包含6-元肼连接基，其中H包含如下结构：
Figure A20068004401200692
在一个优选的实施方案中，n1为3。在上述结构中，R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基的成员。在一个实施方案中，R24各自独立为H或C1-C6烷基。在另一个实施方案中，R24各自独立为H或C1-C3烷基，更优选H或CH3。在另一个实施方案中，至少一个R24为甲基。在另一个实施方案中，R24各自为H。R24各自选择以便构成化合物的位阻效应和改变溶解性。在一个优选的实施方案中，H包含如下结构：
Figure A20068004401200701
在一个实施方案中，H包含偕二甲基取代。在上述结构的一个实施方案中，R24各自独立为H或取代或未被取代的烷基。
6-元肼连接基进行药物从连接基上分离的环化反应，并且可以描述为：
用于制备本发明6元连接基的典型合成途经为：
Figure A20068004401200703
使在含有二氯甲烷的溶液中的Cbz-被保护的二甲基丙氨酸a与HOAt和CPI反应而生成Cbz-被保护的二甲基丙氨酸肼b。通过甲醇的作用使肼b脱保护而形成化合物c。
其它肼连接基
关注本发明包含具有7个成员的连接基。该连接基不能与5或6元连接基同样快速地环化，但可以优选将其用于某些药物-配体轭合物。类似地，肼连接基可以包含2个6元环或具有1个6元和1个5元环化产物的肼连接基。还关注5和7元连接基以及6和7元连接基。
另一种肼结构H具有下式：
Figure A20068004401200711
其中q为0，1，2，3，4，5或6；且
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基的成员。该肼结构还可以形成5-，6-或7-元环，并且可以添加额外的成分以便形成多环。
(3)二硫化物连接基(J)
在另一个实施方案中，连接基包含酶可裂解的二硫化物基团。在一个实施方案中，本发明提供了具有式3的结构的细胞毒性药物-配体化合物：
Figure A20068004401200712
其中D，L1，L4和X4如上述所定义且在本文中进一步描述，并且J为包含具有如下结构的基团的连接基：
Figure A20068004401200713
其中
R24各自为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基和未被取代的杂烷基中的成员；
K各自为独立地选自取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR21R22，NR21COR22，OCONR21R22，OCOR21和OR21中的成员；
其中
R21和R22独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基和未被取代的杂环烷基；
a为0，1，2，3或4的整数；且
d为0，1，2，3，4，5或6的整数。
二硫化物连接基的芳族环可以被一个或多个“K”基团取代。“K”基团为芳族环上的取代基，它取代了氢，所述氢否则与环结构组成部分的4个非-取代碳之一连接。“K”基团可以为单原子，诸如卤素或可以为多-原子基团，诸如烷基，杂烷基，氨基，硝基，羟基，烷氧基，卤代烷基和氰基。典型的K取代基独立地包括，但不限于F，Cl，Br，I，NO2，OH，OCH3，NHCOCH3，N(CH3)2，NHCOCF3和甲基。就“Ka”而言，a为0，1，2，3或4的整数。在一个具体的实施方案中，a为0。
在一个优选的实施方案中，连接基包含酶可裂解的下式的二硫化物基团：
Figure A20068004401200721
在该实施方案中，如上所述鉴定L4，X4，p和R24，并且d为0，1，2，3，4，5或6。在一个具体的实施方案中，d为1或2。
更具体的二硫化物连接基如下式中所示：
Figure A20068004401200731
该实施方案的具体实例如下：
Figure A20068004401200732
优选d为1或2。
另一种二硫化物连接基如下式中所示：
Figure A20068004401200733
该实施方案的具体实例如下：
Figure A20068004401200734
优选d为1或2。
在不同的实施方案中，二硫化物位于胺的邻位。在另一个具体的实施方案中，a为0。在优选的实施方案中，R24独立地选自H和CH3。
用于制备本发明二硫化物连接基的典型合成途经如下：
Figure A20068004401200741
使3-巯基丙酸a的溶液与2，2′-二吡啶基二硫化物(aldrithiol-2)反应而生成3-甲基苯并噻唑鎓碘化物b。使3-甲基苯并噻唑鎓碘化物c与氢氧化钠反应而生成化合物d。使化合物d与甲醇的溶液进一步与化合物b反应而生成化合物e。通过乙酰氯和甲醇的作用使化合物e脱保护而形成化合物f。
本发明的药物-配体轭合物可以任选地包含两个或多个连接基。这些连接基可以相同或不同。例如，肽基连接基可以用于连接药物与配体，且第二个肽基连接基可以连接诊断试剂与复合物。可选择地，肽基，肼或二硫化物连接基中的任意一种可以连接药物和配体复合物，并且肽基，肼或二硫化物连接基中的任意一种可以连接诊断试剂与复合物。额外连接基的其它应用包括连接分析试剂，靶向剂和可检测标记与药物-配体复合物。
在本发明范围内还有为多(poly)-或多(multi)-价种类的本发明化合物，包括，例如，种类，诸如本发明化合物的二聚体，三聚体，四聚体和高级同系物或其反应类似物。多(poly)-或多(multi)-价种类可以由本发明单一种类或一种以上的种类构成。例如，二聚化构建体可以为“同-二聚化”或“异二聚化”的。此外，多(poly)-或多(multi)-价构建体属于本发明的范围，其中本发明的化合物或其反应类似物与寡聚或聚合构架连接(例如聚赖氨酸，葡聚糖，羟乙基淀粉等)。构架优选多功能(即具有大量用于连接本发明化合物的反应位置)。此外，该构架可以使用本发明的单一种类或本发明一种以上种类衍生。
此外，本发明包括化合物，使其官能化而得到具有比未类似地官能化的类似化合物增强的水溶性的化合物。因此，本文所述取代基中的任意一种可以被具有增强水溶性的类似基团取代。例如，在本发明范围内，例如用二醇取代羟基或用季胺，羟基胺或类似更具水溶性的部分取代胺。在一个优选的实施方案中，通过用增强母体化合物水溶性的部分在对本文所述化合物离子通道的活性而言并非必需的位置上取代传递额外的水溶性。增强有机化合物水溶性的方法为本领域公知的。这类方法包括，但不限于使用永久电荷部分，例如季铵或在生理学相关pH下带电荷的基团，例如羧酸，胺使有机核官能化。其它方法包括在有机核上悬有含羟基或胺的侧基，例如醇类，多元醇类，聚醚类等。有的代表性的实例包括，但不限于聚赖氨酸，聚乙烯亚胺，聚(乙二醇)和聚(丙二醇)。用于这些化合物的合适的官能化化学和策略为本领域公知的。例如，参见，Dunn，R.L.等，Eds.POLYMERIC DRUGS AND DRUGDELIVERY SYSTEMS，ACS Symposium Series Vol.469，American ChemicalSociety，Washington，D.C.1991。
药物
在本发明中将本文描述为“D”的药物提供为药物-配体轭合物的组成部分，其中药物与配体提供肽基，肼或二硫化物连接基连接。该药物必须具有所需的生物活性并且包含反应性官能团以便连接配体。期望的生物活性包括诊断，治愈，减轻，治疗或预防动物，诸如人的疾病。因此，只要它具有必需的反应性官能团，那么术语“药物”就意指识别为官方美国药典，官方美国顺势疗法药典或官方国家处方集或其任意的增刊中的药物。典型药物描述在Physician′s DeskReference(PDR)和美国食品与药品监督管理局(FDA)控制的OrangeBook中。新药正在持续被发现和研发，且本发明提供了还可以将这些新药物掺入本发明的药物-配体复合物。
优选的官能团包括伯或仲胺类，羟基，巯基，羧基，醛类和酮类。更优选的官能团包括羟基，伯或仲胺类，巯基和羧酸官能团。甚至更优选的官能团包括羟基，伯和仲胺类和羧酸官能团。药物必须具有至少1个，但可以具有2，3，4，5，6或6个以上反应性官能团。另外，可以在药物的反应性官能团与肽，肼或二硫化物连接基之间引入自我消除连接基L1。
药物-配体轭合物有效用于常用目的，就这些目的而言，相应的药物有效，但因配体内在的将药物转运至所需细胞的能力而具有优良功效，在所需的细胞中，药物具有特定的有益性。
典型药物包括包含连接配体的官能团的蛋白质，肽类和小分子药物。更具体地说，这些药物包括，例如：酶抑制剂，诸如二氢叶酸还原酶抑制剂和胸苷酸合酶抑制剂，DNA嵌入剂，DNA切割剂，拓扑异构酶抑制剂，蒽环族药物，长春胺药物，丝裂霉素，博莱霉素，细胞毒性核苷，蝶啶族药物，二炔类，鬼臼毒素，分化诱导物和泰素。
本发明优选的药物包括用于癌症疗法的细胞毒性药物和其它具有所需生物活性的小分子，蛋白质或多肽类，诸如毒素。可以选择药物以便通过轭肿瘤-特异性配体在肿瘤细胞处活化。这些肿瘤特异性药物-配体轭合物具有来源于配体特异性的肿瘤特异性。其实例为对肿瘤特异性酶具有高度选择性的底物的药物-配体轭合物，其中这些酶以足以在肿瘤邻近处产生细胞毒性食品的游离药物的量存在于肿瘤附近。这些肿瘤-特异性药物-配体复合物的一个优点在于它们对人血清中的外来蛋白酶而言是稳定的。该药物-配体复合物的另一个优点在于它们的毒性低于相应的游离药物；另外，该复合物的特异性能够使所用的总浓度低于游离药物，因为增加的特异性导致该复合物在肿瘤部位上存在的百分比较高。
细胞毒素
用于本发明的细胞毒性药物包括，例如，多卡米星和CC-1065及其类似物，包括多卡米星和CC-1065的CBI(基于1，2，9，9a-四氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮)的类似物，MCBI(基于7-甲氧基-1，2，9，9a-四-氢环丙[c]苯并[e]吲哚-4-酮)的类似物和CCBI(基于7-氰基-1，2，9，9a-四-氢环-丙[c]苯并[e]-吲哚-4-酮)的类似物，多柔比星和多柔比星轭合物，诸如吗啉代-多柔比星和氰基吗啉代-多柔比星，多拉司他汀，诸如dolestatin-10，考布他汀，加利车霉素，美坦生，美坦生类似物，DM-1，auristatin E，auristatin EB(AEB)，auristatin EFP(AEFP)，单甲基auristatin E(MMAE)，5-苯甲酰基戊酸-AE酯(AEVB)，tubulysins，disorazole，埃坡霉素，紫杉醇，多西他赛，SN-38，托泊替康，根霉素，棘霉素，秋水仙碱，长春碱，长春地辛，雌氮芥，西马多丁，eleutherobin，甲氨蝶呤，甲基叶酸，二氯甲氨喋呤，5-氟尿嘧啶，6-巯嘌呤，巯嘌呤，美法仑，长春罗新，leurosideine，放线菌素，柔红霉素和柔红霉素轭合物，丝裂霉素C，丝裂霉素A，洋红霉素，氨基蝶呤，他利霉素，鬼臼毒素和鬼臼毒素衍生物，诸如依托泊甙或磷酸依托泊苷，长春新碱，泰素，泰素帝视黄酸，丁酸，N8-乙酰基精脒，喜树碱及其类似物。可以修饰其它已知的药物以便提供用于轭合本文所述连接基的官能团。这类化学修饰为本领域中公知的。
用于本发明的优选细胞毒包括：多卡米星和CC-1065及其基于CCBI和基于MCBI的类似物，吗啉代-多柔比星，氰基吗啉代-多柔比星，多拉司他汀-10，考布他汀，加利车霉素，美坦生，DM-1，auristatinE，AEB，AEFP，MMAE，Tubulysin A，Disorazole，埃霉素A和埃霉素B。
本发明特别优选的细胞毒素为活性的有效多卡米星衍生物和CC-1065。母体活性剂为格外有效的抗肿瘤抗生素，它们通过DNA的可逆立体电控制序列选择性烷基化衍生其生物作用(Boger等，J.Org.Chem.55：4499(1990)；Boger等，J.Am.Chem.Soc.112：8961(1990)；Boger等，J.Am.Chem.Soc.113：6645(1991)；Boger等，J.Am.Chem.Soc.115：9872(1993)；Boger等，Bioorg.Med.Chem.Lett.2：759(1992))。在最初披露多卡米星后，广泛的努力致力于阐明多卡米星及其结构来源的DNA烷基化选择性。
本发明特别优选的方面提供了具有式7的结构的细胞毒性化合物：
其中环系A为选自取代或未被取代的芳基取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基的成员。典型的环系包括苯基和吡咯。
符号E和G独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，杂原子，单键或E和G任选地连接形成选自取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基的环系。
符号X表示选自O，S和NR23的成员。R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基的成员。
符号R3表示选自(＝O)，SR11，NHR11和OR11中的成员，其中R11为H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，二磷酸酯类，三磷酸酯类，酰基，C(O)R12R13，C(O)OR12，C(O)NR12R13，P(O)(OR12)2，C(O)CHR12R13，SR12或SiR12R13R14。符号R12，R13和R14独立地表示H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和取代或未被取代的芳基，其中R12和R13与连接它们的氮或碳原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子。R12，R13或R14中的一个或多个可以包括在其结构中可裂解的基团。
R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，SR15，OR15，CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2中的成员，其中n为1-20的整数。R15和R16独立地表示H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基和取代或未被取代的肽基，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子。一个典型的结构为苯胺。
R4，R4’，R5，R5’，R11，R12，R13，R15和R16任选在其结构中包含一个或多个可裂解基团。典型的可裂解基团包括，但不限于肽类，氨基酸，肼类和二硫化物。
R11，R12，R13，R15和R16中的至少一个用于如本文所述使药物与部分的连接基连接，例如如果存在与L1连接或与F，H或J连接。
在本发明的另一个典型实施方案中，R4，R4’，R5，R5’，R11，R12，R13，R15和R16中的至少一个具有适合于轭合化合物的反应基。在另一个典型的实施方案中，R4，R4’，R5，R5’，R11，R12，R13，R15和R16独立地选自H，取代的烷基和取代的杂烷基并且在烷基或杂烷基部分的游离末端上具有反应性官能团。R4，R4’，R5，R5’，R11，R12，R13，R15和R16中的一个或多个可以与另一种类，例如靶向剂，可检测标记，固相支持体等轭合。
正如从本文讨论部分中显而易见的，当R15和R16中的至少一个包含反应性官能团时，该基团可以为药物与另一分子之间的键成分。在一个典型的实施方案中，其中R15和R16中的至少一个包含药物与另一种类之间的键，R15和R16中的至少一个为被酶裂解的部分。
在另一个典型的实施方案中，R4，R4’，R5和R5’中的至少一个为：
Figure A20068004401200801
在式8中，符号X2和Z1表示独立地选自O，S和NR23中的成员。基团R17和R18独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR19R20，NC(O)R19，OC(O)NR19，OC(O)OR19，C(O)R19，SR19或OR19，条件是R12，R13，R19或R20中的至少一个包含如本文披露的本发明的连接基。
符号R19和R20独立地表示取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基，取代或未被取代的肽基，其中R19和R20与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子，条件是当Z1为NH时，R17和R18均不为H且R17不为NH2。在本说明书的上下文中，符号R19和R20还包括对R4和R5所述的基团。因此，例如，在本发明范围内提供了具有如上所述串连连接的稠合苯基-杂环系中的两个或多个或与连接基组合的稠合环的化合物。此外，在那些其中存在连接基的实施方案中，接基可以作为R4，R4’，R5或R5’取代基或作为R17或R18取代基存在。
R6为可以存在或不存在的单键。当R6存在时，R6和R7连接形成环丙基环。R7为CH2-X1或-CH2-。当R7为-CH2-时，其为环丙烷环的成分。符号X1表示离去基，诸如卤素，例如Cl，Br或F。以不违反化合价原理的方式解释R6和R7的组合。
6-元环内的弯曲线表示环可以具有一个或多个不饱和度并且可以为芳族的。因此，诸如如下所示的环结构和相关结构属于式(9)的范围：
Figure A20068004401200811
和
在一个典型的实施方案中，环系A为取代的或未被取代的苯基环。环系A优选被一个或多个如本文定义部分在所述的芳基取代基取代。在一个优选的实施方案中，苯基环被CN或甲氧基部分取代。
在另一个典型的实施方案中，本发明提供了具有式10的结构的化合物：
Figure A20068004401200813
在该实施方案中，基团R3，R4，R4’，R5，R5’，R6，R7和X的鉴定基本上如上所述。符号Z为独立地选自O，S和NR23的成员。符号R23表示选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基的成员。R23各自独立地选择。符号R1表示H，取代或未被取代的低级烷基或C(O)R8或CO2R8。R8为选自取代的烷基，未被取代的烷基，NR9R10，NR9NHR10和OR9的成员。R9和R10独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基。基团R2为H或取代或未被取代的低级烷基。一般优选当R2为取代的烷基时，它不为氟烷基，例如CF3。在一个实施方案中，R2为取代的烷基，其中取代不为卤素。在另一个实施方案中，R2为未被取代的烷基。
如上所述，X1可以为离去基。有用的离去基包括，但不限于卤素，叠氮化物，磺酸酯类(例如烷基磺酰基，芳基磺酰基)，氧鎓离子，高氯酸烷基酯类，铵基烷磺酸酯类，烷基氟磺酸酯类和氟化化合物(例如三氟甲磺酸酯类，nonaflates，tresylates)等。用作离去基的特定卤素为F，Cl和Br。这些和其它适合于特定反应条件组的离去基的选择属于本领域技术人员的能力范围(例如，参见，March J，ADVANCED ORGANICCHEMISTRY，2nd Edition，John Wiley & Sons，1992；Sandler SR，Karo W，ORGANIC FUNCTIONAL GROUP PREPARATIONS，2nd Edition，AcademicPress，Inc.，1983；和Wade LG，COMPENDIUM OF ORGANIC SYNTHETIC METHODS，John Wiley & Sons，1980)。
在一个典型的实施方案中，R1为酯部分，诸如CO2CH3。在另一个典型的实施方案中，R2为低级烷基，其可以为取代的或未被取代的。目前优选的低级烷基为CH3。在另一个实施方案中，R1为CO2CH3且R2为CH3。
在另一个典型的实施方案中，R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，卤素，NH2，OMe，O(CH2)2N(Me)2和NO2的成员。
在一个实施方案中，选择药物，使得离去基X1为选自卤素，烷基磺酰基，芳基磺酰基和叠氮化物的成员。在另一个实施方案中，Z为O。在某些实施方案中，R1可以为CO2CH3或R2可以为CH3；另外，R1可以为CO2CH3和R2可以为CH3。R4，R4’，R5或R5’这一可以为C(O)R15，且R4，R4’，R5和R5’中的另外3个为H。另外，R4，R4’，R5和R5’中的至少一个可以为非选自H和OCH3的成员。在一个实施方案中，R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，卤素，NH2，O(CH2)2N(Me)2和NO2的成员。
在一个优选的实施方案中，R4，R4’，R5或R5’之一为O(CH2)2N(Me)2且R4，R4’，R5和R5’中的其它成员为H。在另一个实施方案中，R7为CH2-X1，其中X1为F，Cl或Br且R6不存在。
在另一个典型的实施方案中，本发明提供了具有式11和12的结构的化合物：
Figure A20068004401200831
和
Figure A20068004401200832
在上述式的一个实施方案中，X优选为O；且Z优选为O。在另一个实施方案中，Z为NR23或O。可选择地，R4，R4’，R5或R5’之一可以为O(CH2)2N(Me)2，而R4，R4’，R5或R5’中的另外3个为H。在一个实施方案中，R4，R4’，R5或R5’可以为选自R29，COOR29，C(O)NR29和C(O)NNR29，其中R29选自H，OH，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的环烷基，未被取代的环烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，取代的环杂烷基，未被取代的环杂烷基，取代的杂芳基和未被取代的杂芳基。
在上述式的另一个实施方案中，X优选为O，Z优选为O，R1优选为CO2CH3，R7优选为CH2-Cl，R2优选为CH3，R3优选为OH。可选择地，R4，R4’，R5或R5’之一可以为NHC(O)(C6H4)NH2，而R4，R4’，R5或R5’中的另外3个为H。
在一个实施方案中，R29可以选自：
Figure A20068004401200841
和
Figure A20068004401200842
在药物的另一个实施方案中，一个选自R4和R5的成员为：
Figure A20068004401200843
其中X2和Z1为独立地选自O，S和NR23中的成员；R17和R18为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR19R20，NC(O)R19，OC(O)NR19，OC(O)OR19，C(O)R19，OR19和O(CH2)nN(CH3)2的成员。在该实施方案中，n为1-20的整数；R19和R20独立地选自取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基，其中R19和R20与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子，其中如果存在，R11，R12，R13，R15，R16，R19或R20之一使所述药物与L1连接或与F连接。在一个优选的实施方案中，X2为O且Z1为O或NR23。
式7的多卡米星类似物的另一种优选结构为环系A为未被取代的或取代的苯基环的结构。上文对式7结构所述的药物分子上的优选取代基在环系A为吡咯时也为优选的取代基，此时环系A为未被取代的或取代的苯基环。
例如，在一个优选的实施方案中，药物(D)包含结构：
Figure A20068004401200851
在该结构中，R3，R6，R7，X如上述对式7所述。此外，Z为选自O，S和NR23中的成员，其中R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的成员，其中R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R1’为H，取代或未被取代的低级烷基或C(O)R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的成员，其中R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R2为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基或氰基或烷氧基；且R2’为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基。
如果存在，R11，R12，R13，R15或R16中的至少一个使药物与L1或与F，H或J连接。
在一个优选的实施方案中，R4，R4’，R5或R5’之一为O(CH2)2N(Me)2，且R4，R4’，R5和R5’中的其它成员为H。在另一个实施方案中，R7为CH2-X1，其中X1为F，Cl或Br且R6不存在。
在一个实施方案中，本发明提供了具有下式的结构的细胞毒性药物-配体化合物：
Figure A20068004401200861
其中符号L1表示自我消除间隔基，其中m为0，1，2，3，4，5或6的整数。
符号X4表示选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂的成员。
符号L4表示连接基成员且p为0或1。L4为将增加的溶解性或减少的聚集特性传递给轭合物的部分。L4部分的实例包括取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂烷基或未被取代的杂烷基，其中的任意一种可以为直链，支链或环状的带正电荷或带负电荷氨基酸聚合物，诸如聚赖氨酸或聚精氨酸或其它聚合物，诸如聚乙二醇。
符号Q表示任意的可裂解连接基，包括，但不限于本文所述的肽基，腙和二硫化物连接基中的任意一种。其它合适的连接基包括，但不限于下列文献中所述的那些：美国专利US6,214,345；美国专利申请公开号US2003/0096743，2003/0130189和2004/121940；PCT专利申请公开号WO03/026577和WO04/043493；和欧洲专利申请公开号EP1243276和EP1370298，将所有这些文献引入本文作为参考。可裂解连接基包括被化学或生物过程选择性裂解并且在裂解时使药物D1与X4分离的那些。裂解可以沿连接基的长度上的任意处或在连接基的任一末端上发生。
符号D1表示具有下式的药物：
Figure A20068004401200871
其中X和Z为独立地选自O，S和NR23中的成员；
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，
R1’为H，取代或未被取代的低级烷基或C(O)R8，
其中R8为选自NR9R10和OR9的成员且R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R2为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基或氰基或烷氧基；
R2’为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基，
R3为选自SR11，NHR11和OR11中的成员，其中R11为选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，二磷酸酯类，三磷酸酯类，酰基，C(O)R12R13，C(O)OR12，C(O)NR12R13，P(O)(OR12)2，C(O)CHR12R13，SR12和SiR12R13R14中的成员，其中R12，R13和R14为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和取代或未被取代的芳基中的成员，其中R12和R13与连接它们的氮或碳原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
其中如果存在，R11，R12和R13中的至少一个使所述药物与L1或与Q连接，
R6为可以存在或不存在的单键，并且当存在时，R6和R7连接形成环丙基环；且
R7为CH2-X1或在所述环丙基环中与R6连接的-CH2-，
其中
X1为离去基，
R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，SR15，OR15，CR15＝NR16和O(CH2)mNR24R25中的成员，其中n为1-20的整数；
R15和R16独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基和取代或未被取代的肽基，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
且R24和R25独立地选自未被取代的烷基，且
其中R4，R4’，R5和R5’中的至少一个为O(CH2)nNR24R25。
在某些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，R24和R25为甲基。在某些实施方案中，R4为O(CH2)nNR24R25和R4’，R5和R5’为H。在某些实施方案中，R4为O(CH2)2N(CH3)2且R4’，R5和R5’为H。在某些实施方案中，Q为如上所述选自F，H和J的连接基。在某些实施方案中，R1，R1’，R2和R2’为H。
药物D1的优选式如下：
Figure A20068004401200891
药物D1的另一个优选的实施方案如下：
Figure A20068004401200892
药物D1的额外优选的实施方案如下：
Figure A20068004401200893
和
Figure A20068004401200901
在本发明的另一个典型的实施方案中，细胞毒性药物可以为tubulysin类似物或相关化合物，诸如式13结构所述的化合物：
Figure A20068004401200902
其中R1和R2为H或低级烷基或更具体地说为异丁基，乙基，丙基或叔-丁基，且R3为H或OH。Tubulysin及其在治疗癌症中的应用于描述在，例如，PCT公开文献WO2004/005327和WO2004/005326中。化合物的生产描述在DE10008089中。可以为用于连接tubulysin与本发明的各种连接基的方法提供在实施例中。优选的tubulysin类似物为Tubulysin A-F。
优选的多卡米星和CBI轭合物
本发明的肽，肼或二硫化物连接基可以用于包含多卡米星或CBI类似物作为细胞毒性剂的轭合物中。本发明优选的轭合物在下文中进一步详细描述。除非另作陈述，否则取代基如上述在有关细胞毒素，肽连接基，肼连接基和二硫化物接基的部分中定义。
A.肽连接基轭合物
本发明在一个优选的实施方案中提供了具有如下结构的肽连接基轭合物：
Figure A20068004401200911
或
Figure A20068004401200912
其中X1为卤素；
X为选自O，S和NR23中的成员；
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；且
R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，OR15和O(CH2)nN(CH3)2中的成员；
其中
n为1-20的整数；且
R15和R16独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代的或未被取代的，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员的，任选地包含2个或2个以上杂原子。
这类轭合物的非-限制性实例包括如下结构：
Figure A20068004401200921
和
Figure A20068004401200932
其中X1为Cl或Br；
且其中Ab为抗体或其片段。
本发明在另一个优选的实施方案中提供了具有如下结构的轭合物：
Figure A20068004401200933
或
Figure A20068004401200934
其中X1为离去基；
Z和X为独立地选自O，S和NR23中的成员，
其中R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；且
R3选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，OR15和O(CH2)nN(CH3)2；
其中
n为1-20的整数；
R15和R16独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代的或未被取代的，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子。
这类轭合物的非-限制性实例包括如下结构：
Figure A20068004401200941
Figure A20068004401200951
和
Figure A20068004401200952
其中b各自独立为0-20的整数且Ab为抗体或其片段。
本发明在其它优选的实施方案中提供了选自如下结构的肽连接基轭合物：
Figure A20068004401200953
Figure A20068004401200961
和
Figure A20068004401200962
其中X1为Cl或Br且Ab为抗体或其片段。
本发明在其它实施方案中提供了选自如下结构的肽连接基轭合物：
和
Figure A20068004401200971
其中X1为Cl或Br且Ab为抗体或其片段。
本发明在其它实施方案中提供了选自如下结构的肽连接基轭合物：
Figure A20068004401200972
其中X1为Cl或Br且Ab为抗体或其片段。
其它化合物包括如下，它们可以与，例如，抗体或其片段轭合：
Figure A20068004401200973
Figure A20068004401200981
Figure A20068004401200991
和
Figure A20068004401200992
其中r为0-24的整数。在一个实施方案中，r为4。
B.肼连接基轭合物
本发明在一个优选的实施方案中提供了具有如下结构的肼连接基轭合物：
Figure A20068004401201001
本发明在另一个优选的实施方案中提供了具有如下结构的肼连接基轭合物：
Figure A20068004401201002
和
Figure A20068004401201003
本发明在其它优选的实施方案中提供了具有选自如下结构的肼连接基轭合物：
Figure A20068004401201004
Figure A20068004401201011
和
Figure A20068004401201012
其中PEG为聚乙二醇部分且X1为Cl或Br。
本发明在其它优选的实施方案中提供了具有选自如下结构的肼连接基轭合物：
Figure A20068004401201013
和
其中X1为Cl或Br且Ab为抗体或其片段。
在另一个优选的实施方案中，为选自如下结构的肼连接基轭合物：
和
Figure A20068004401201023
C.二硫化物连接基轭合物
本发明在一个优选的实施方案中提供了具有如下结构的二硫化物连接基轭合物：
Figure A20068004401201031
和
这类结构的非-限制性实例包括如下：
Figure A20068004401201033
Figure A20068004401201041
和
Figure A20068004401201042
其中X1为Cl或Br且Ab为抗体或其片段。
配体
将本发明的配体描述为“X4”。在本发明中，X4表示选自被保护的反应性官能团，未被保护的反应性官能团，可检测标记和靶向剂的成员。优选的配体为靶向剂，诸如抗体及其片段。
在一个优选的实施方案中，将基团X4描述为选自R29，COOR29，C(O)NR29和C(O)NNR29中的成员，其中R29为选自取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和取代或未被取代的杂芳基的成员。在另一个典型的实施方案中，R29为选自H；OH；NHNH2中的成员；
Figure A20068004401201051
和
Figure A20068004401201052
其中R30表示以反应性官能团终止的取代或未被取代的烷基，以官能团终止的取代或未被取代的杂芳基。上述结构作为反应保护基起作用，所述的反应保护基可以与，例如靶向剂，诸如抗体的氨基酸的侧链反应，由此使靶向剂与连接基-药物部分连接。
靶向剂
本发明的连接基臂和细胞毒素可以连接将有效负荷选择性递送至身体细胞，器官或区域的靶向剂。在本领域中公认典型的靶向剂，诸如抗体(例如嵌合，人源化和人)，受体配体，凝集素，糖类，抗体等，并且用于实施本发明，但不限于此。其它靶向剂包括一类不包括特异性分子识别基元的化合物，包括添加分子量到细胞毒素的大分子，诸如聚(乙二醇)，多糖，聚氨基酸等。额外的分子量影响细胞毒素的药动学，例如血清半衰期。
在一个典型的实施方案中，本发明提供了细胞毒素，连接基或细胞递送-连接基与靶向剂的轭合物，所述的靶向剂为生物分子，例如抗体，受体，肽，凝集素，糖，核酸或其组合。获得本发明的典型轭合物的途经如上述方案中所述。
用于实施本发明的生物分子可以来源于任意来源。可以从天然来源分离生物分子或可以通过合成方法生产。蛋白质可以为天然蛋白或突变蛋白。可以通过化学诱变，定点诱变或本领域技术人员公知的其它诱导突变方式进行突变。用于实施本发明的蛋白质包括，例如酶，抗原，抗体和受体。抗体可以为多克隆或单克隆抗体，而最优选为单克隆抗体。可以从天然来源分离肽类和核酸或这些肽和核酸可以完全或部分为合成来源。
在一个优选的实施方案中，靶向剂为所关注的抗体或抗体片段，它们基于其对在靶细胞上靶位点上表达的抗原的特异性选择。已经鉴定了各种肿瘤-特异性或其它疾病-特异性抗原，并且使用了针对那些抗原的抗体或提出它们用于治疗这类肿瘤或其它疾病。本领域中已知的抗体可以用于本发明的轭合物，特别是用于治疗与靶抗原相关的疾病。本发明抗体-连接基-药物靶向的靶抗原的非-限制性实例(及其相关疾病)包括：Her2(乳腺癌)，CD20(淋巴瘤)，EGFR(实体瘤)，CD22(淋巴瘤，包括非-何杰金淋巴瘤)，CD52(慢性淋巴性白血病)，CD33(急性髓性白血病)，CD4(淋巴瘤，自身免疫疾病，包括类风湿性关节炎)，CD30(淋巴瘤，包括非-何杰金淋巴瘤)，Muc18(黑素瘤)，黑素瘤(实体瘤)，PSMA(前列腺癌，良性前列腺增生症)，CEA(结肠直肠癌)，CD11a(银屑病)，CD80(银屑病)，CD23(哮喘)，CD40L(免疫血小板减少性紫癜)，CTLA4(T细胞淋巴瘤)和BLys(自身免疫疾病，包括系统性红斑狼疮)。
在识别部分为蛋白质或抗体的那些实施方案中，蛋白质被束缚于表面或自装配单层(SAM)成分或通过间隔基臂连接蛋白质表面上可利用的任意反应肽残基。在优选的实施方案中，反应基团为胺类或羧酸酯类。在特别优选的实施方案中，反应基团为赖氨酸残基的ε-胺基。此外，这些分子可以通过非-特异性相互作用(例如化学吸附，物理吸附)被吸附在底物或SAM表面。
为抗体的识别部分可以用于识别分析物，其为蛋白质，肽类，核酸，糖类或小分子，诸如药物，除草剂，农药，工业化学品和战争用试剂。对特异性分子增加抗体方法为本领域技术人员众所周知的。参见，于1992年9月15日授权的Feng等的美国专利US5/147,786；于1994年8月2日授权的Stanker等的US5/334,528；于1997年11月11日授权的Al-Bayati，M.A.S.的US5/686,237；和于1996年11月12日授权的Hoess等的US5/573,922。用于连接抗体于表面的方法也为本领域公知的。参见，Delamarche等，Langmuir 12：1944-1946(1996)。
靶向剂可以通过任意可利用的反应基连接本发明的连接基。例如，肽类可以通过胺，羧基，巯基或羟基连接。这类基团可以存在于肽末端或位于肽链内的位置上。核酸可以通过反应基连接在碱基(例如环外胺)或糖部分上可利用羟基(例如3’-或5’-羟基)上。肽和核酸链可以进一步在一个或多个位置上衍生以便使合适的反应基连接在链上。参见，Chrisey等，Nucleic Acids Res.24：3031-3039(1996)。
当肽或核酸为完全或部分合成的分子时，可以在合成过程中掺入反应基或掩蔽反应基。适合于掺入肽类和核酸的反应基的许多衍生单体为本领域技术人员公知的。例如，参见，THE PEPTIDES：ANALYSIS，SYNTHESIS，BIOLOGY，Vol.2：“Special Methods in Peptide Synthesis”，Gross，E.和Melenhofer，J.，Eds.，Academic Press，New York(1980)。许多有用的单体为商购的(Bachem，Sigma等)。然后在合成和解除对这一掩蔽基团的掩蔽，此时可利用它域本发明化合物的成分进行反应。
典型核酸靶向剂包括适体，反义化合物和构成三重螺旋的核酸。一般而言，糖残基的羟基，来自碱性残基的氨基或核苷酸的磷酸氧用作用于偶联基于核苷酸的靶向剂与细胞毒素的所需化学官能团。然而，本领域技术人员易于理解可以通过常规技术使其它“非-天然”反应性官能团悬于核酸侧。例如，可以使用本领域众所周知的技术将糖残基的羟基转化成巯基或氨基。
适体(或核酸抗体)为结合特异性分子靶标的单-或双-链DNA或单-链RNA分子。一般而言，适体通过经结合血液中循环的靶标库而抑制分子靶标，例如蛋白质的作用起作用。适体具有化学功能性且由此可以如上所述共价结合细胞毒素。
尽管各种分子靶标能够与适体非共价，但为特异性的结合，所述的适体包括小分子药物，代谢物，辅因子，毒素，基于糖的药物，基于核苷酸的药物，糖蛋白等，所述的分子靶标一般包含蛋白质或肽，包括血清蛋白，激肽类，类花生酸类，细胞表面分子等。适体的实例包括Gilead′s抗凝血酶抑制剂GS 522及其衍生物(Gilead Science，Foster City，Cailf.)。另外，参见Macaya等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：3745-9(1993)；Bock等，Nature(London)355：564-566(1992)和Wang等，Biochem.32：1899-904(1993)。
可以使用本领域公知的技术鉴定对指定生物分子具有特异性的适体。例如，参见，Toole等，(1992)PCT公开号WO92/14843；Tuerk和Gold，(1991)PCT公开号WO91/19813；Weintraub和Hutchinson，(1992)PCT公开号92/05285；和Ellington和Szostak，Nature346：818(1990)。简言之，这些技术一般包括使分子靶标与寡核苷酸随机混合物复合。从未复合的寡核苷酸中分离适体-分子靶标复合物。从分离的复合物中回收适体并且扩增。重复这种循环以便鉴定那些对分子靶标具有最高亲和力的适体序列。
就因基因的不适当表达导致的疾病而言，这类基因表达的特异性预防或减少表示理想的疗法。一般而言，可以通过使互补的单链脱氧核苷酸或脱氧核糖核苷酸(ribodeoxynucleotide)与mRNA中的可及序列或预-mRNA加工所必需的转录物内的序列或基因自身内的序列杂交抑制，减少或切断特定基因产物产生。这种遗传控制的范例通常称作反义或反义基因抑制。通过与烷基化试剂的核酸，诸如本发明的那些轭合传递额外的功效。
反义化合物为结合设计的核酸并且使导致特定蛋白质生成的mRNA不能产生或防止其产生。反义化合物包括反义RNA或DNA，单或双链，寡核苷酸或其类似物，它们可以与各mRNA种类特异性杂交和防止mRNA种类转录和/或RNA加工和/或编码的多肽翻译，且由此影响相应编码的多肽量的减少。Ching等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86：10006-10010(1989)；Broder等，Ann.Int.Med.113：604-618(1990)；Loreau等，FEBS Letters 274：53-56(1990)；Holcenberg等，WO91/11535；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；WO91/13080，WO91/06629和EP386563)。反义寡核苷酸由于其精确的靶标敏感性和选择性而用于将治疗剂，诸如本发明的细胞毒素递送至期望的分子靶标。
其他人已经报导了核酸可以通过三链螺旋形成结合双链DNA，并且抑制转录和/或DNA合成。三链螺旋化合物(也称作三链药物)为寡核苷酸，它们结合双链DNA并且指定用于选择性抑制产生疾病的基因，诸如病毒基因，例如HIV和单纯疱疹病毒和癌基因的转录，即它们终止细胞核处蛋白质产生。这些药物直接结合细胞基因组中的双链DNA，以便形成三链螺旋并且防止细胞形成靶蛋白。例如，参见，PCT公开号WO92/10590，WO92/09705，WO91/06626和美国专利US5,176,996。因此，本发明的细胞毒素还与形成三链螺旋的核酸序列轭合。
通过修饰磷酸二酯键或通过修饰寡核苷酸末端并非显著影响核酸(例如反义化合物和三链螺旋药物)的位点特异性。因此，可以通过化学方式修饰这些核酸；从而促进总体结合稳定性，增加相对于化学降解而言的稳定性，增加寡核苷酸转运入细胞的速率和赋予分子化学反应性。van der Krol等，Biotechniques 6：958-976(1988)和Stein等，Cancer Res.48：2659-2668(1988)已经综述了构建用于反义疗法的各种格斯的一般手段。因此，在一个典型的实施方案中，本发明的细胞毒素通过修饰磷酸二酯键与核酸轭合。
此外，具有本发明细胞毒素的适体，反义化合物和三链螺旋药物还可以包括核苷酸取代，添加，缺失或置换，只要与相关靶序列特异性杂交或与之结合保持为寡核苷酸的功能特性。例如，某些实施方案使用硫代磷酸类似物，它们比天然存在的磷酸二酯负体更耐受核酸酶导致的降解，且由此预计它们具有较高的体内持久性和较高的功效(例如，参见Campbell等，J.Biochem.Biophys.Methods 20：259-267(1990))。还已知寡核苷酸的氨基磷酸酯衍生物结合互补多核苷酸并且具有适应共价结合的配体种类的额外能力，且适合于本发明的方法。例如，参见，Froehler等，Nucleic Acids Res.16(11)：4831(1988)。
在某些实施方案中，适体，反义化合物和三链螺旋药物包含O-甲基核糖核苷酸(EP公开号360609)。还可以使用嵌合寡核苷酸(Dagle等，Nucleic Acids Res.18：4751(1990))。就某些应用而言，反义寡核苷酸和三链螺旋可以包含聚酰胺核酸(Nielsen等，Science254：1497(1991)和PCT公开号WO90/15065)或其它阳离子衍生物(Letsinger等，J.Am.Chem.Soc.110：4470-4471(1988))。其它应用可以使用寡核苷酸，其中磷酸二酯键中的一个或多个已经被等电子排列基团取代，诸如PCT公开号WO92/05186和91/06556中所述的2-4个原子长的核苷酸间键或formacetal基团(Matteucci等，J.Am.Chem.Soc.113：7767-7768(1991))或酰胺基(Nielsen等，Science254：1497-1500(1991))。
此外，核苷酸类似物，例如，其中糖或碱基以化学方式被修饰，可以用于本发明。嘌呤类和嘧啶类的“类似”形式为本领域中一般公知的那些，其中的许多用作化疗剂。典型，但并未穷经的例子包括4-乙酰胞嘧啶，5-(羧基羟甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴脲嘧啶，5-羧基甲氨基甲基-2-硫脲嘧啶，5-羧基甲氨基甲基尿嘧啶，二氢尿嘧啶，肌苷，N6-异戊烯腺嘌呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基假尿嘧啶，1-甲基鸟嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鸟嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鸟嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌呤，7-甲基鸟嘌呤，5-甲氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫脲嘧啶，β-D-mannosylqueosine，5′甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5-甲氧基尿嘧啶，2-甲硫基-N6-异戊烯腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，wybutoxosine，假尿嘧啶，queosine，2-巯基胞嘧啶，5-甲基-2-硫脲嘧啶，2-硫脲嘧啶，4-硫脲嘧啶，5-甲基尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧基乙酸甲酯，尿嘧啶-5-氧基乙酸(v)，假尿嘧啶，queosine，2-巯基胞嘧啶和2，6-二氨基嘌呤。此外，常用碱基为卤化碱基。此外，碱基上的2′-呋喃糖位置可以具有不带电荷的大基团取代。不带电荷的大基团的实例包括支链烷基，糖类和支链糖类。
末端修饰还提供了使细胞毒素与核酸轭合，改变细胞类型特异性，药动学，核通透性和用于寡核苷酸药物活性剂的绝对细胞摄取速率的有用操作步骤。例如，已知包括反应基的5′和3′末端上的大量取代，它们允许共价结合细胞毒素。例如，参见OLIGODEOXYNUCLEOTIDES：ANTISENSEINHIBITORS OF GENE EXPRESSION，(1989)Cohen，Ed.，CRC Press；PROSPECTSFOR ANTISENSE NUCLEIC ACID THERAPEUTICS FOR CANCER AND AIDS，(1991)，Wickstrom，Ed.，Wiley-Liss；GENE REGULATION：BIOLOGY OF ANTISENSE RNAAND DNA，(1992)Erickson和Izant，Eds.，Raven Press；和ANTISENSERNA AND DNA，(1992)，Murray，Ed.，Wiley-Liss。就涉及反义化合物的一般方法而言，参见，ANTISENSE RNA AND DNA，(1988)，D.A.Melton，Ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)。
可检测标记
结合本发明化合物和方法使用的特定标记或可检测基团一般并非本发明的关键方面，只要他不会显著干扰本发明化合物的活性或应用。可检测基团可以为具有可检测物理或化学特性的任意物质。这类可检测标记已经在免疫测定领域得到充分发展，并且一般而言，用于这类方法的任意绝大部分标记均可以应用于本发明。因此，标记为可通过光谱测定，光化学，生物化学，免疫化学，电，光学或化学方式检测的任意组合物。用于本发明的有用标记包括磁珠(例如DYNABEADSTM)，荧光染料(例如异硫氰酸荧光素，德克萨斯红，若丹明等)，放射性标记(例如3H，125I，35S，14C或32P)，酶(例如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶和常用于ELISA的其它酶)和比色标记，诸如胶体金或碱性磷酸酶或塑料珠(例如聚苯乙烯，聚丙烯，胶乳等)。
按照本领域众所周知的方法，标记可以直接或间接与本发明的化合物偶联。如上所述，可以使用各种标记，其中标记的选择取决于所需的敏感性，与化合物轭合的便利性，稳定性要求，可利用的手段和处理设备。
当本发明的化合物与可检测标记轭合时，该标记优选为选自放射性同位素，荧光剂，荧光剂前体，发色团，酶及其组合的成员。用于使各种基团与抗体轭合的方法为本领域众所周知的。例如，通常与抗体轭合的可检测标记为酶，诸如辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶和葡糖氧化酶。
非-放射性标记通常通过间接方式连接。一般而言，配体分子(例如生物素)与轭合物的成分共价结合。然后配体与另一种分子(例如链霉抗生物素)结合，该分子本身为可检测的或与信号系统，诸如可检测酶，荧光化合物或化学发光化合物共价结合。
本发明轭合物的成分还可以直接与信号产生化合物轭合，例如通过与酶或荧光团轭合。关注为标记的酶主要为水解酶，特别是磷酸酶，酯酶和糖苷酶或氧化酶(oxidotases)，特别是过氧化物酶。荧光化合物包括荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮等。化学发光化合物包括萤光素和2，3-二氢酞嗪二酮类，例如鲁米诺。就可以使用的各种标记或信号产生系统综述而言，参见，美国专利US4,391,904。
检测标记的方式为本领域技术人员众所周知的。因此，例如，如果标记为放射性标记，检测装置包括闪烁计数器或作为放射自显影的胶卷。如果标记为荧光标记，可以通过使用适当波长的光激发荧光染料并且检测产生的荧光检测它。可以通过摄影胶片，通过使用电子检测器，诸如电荷耦合器件(CCDs)或光电倍增管等可视地检测荧光。类似地，可以通过提供用于酶的适当底物并且检测所得反应产物检测酶标记。最终可以通过观察与标记相关的颜色简便地检测简单的比色标记。因此，在不同的浸渍片测定中，轭合的金通常显粉红色，而各种轭合的珠显珠的颜色。
目前优选荧光标记，因为它们具有几乎不需要操作谨慎性和适合于高流通量显影技术的优点(光学分析，包括在包含计算机的集成系统中用于分析的影像数字化)。优选的标记一般的特征在于如下中的一种或多种：高灵敏度，高稳定性，低背景，低环境敏感性和标记中的高度特异性。许多荧光标记购自SIGMA化学公司(Saint Louis，MO)，Molecular Probes(Eugene，OR)，R&D系统(Minneapolis，MN)，Pharmacia LKB Biotechnology(Piscataway，NJ)，CLONTECHLaboratories，Inc.(Palo Alto，CA)，Chem Genes Corp.，AldrichChemical Company(Milwaukee，WI)，Glen Research，Inc.，GIBCOBRL Life Technologies，Inc.(Gaithersburg，MD)，FlukaChemica-Biochemika Analytika(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)和Applied Biosystems(Foster City，CA)，以及本领域技术人员已知的许多其它商品来源。此外，本领域技术人员认识到如何选择用于特定应用的合适的荧光团，并且如果不易于商购获得，那么本领域技术人员能够重新合成必要的荧光团或以合成方式修饰商购的荧光化合物以便获得期望的荧光标记。
除小分子荧光团外，天然存在的荧光蛋白和这类蛋白的改造的类似物也用于本发明。这类蛋白包括，例如，刺胞动物的绿色荧光蛋白(Ward等，Photochem.Photobiol.35：803-808(1982)；Levine等，Comp.Biochem.Physiol.，72B：77-85(1982))，来自费希尔弧菌(Vibrio fischeri)菌株的黄色荧光蛋白(Baldwin等，Biochemistry29：5509-15(1990))，来自甲藻Symbiodinium sp.的多甲藻素-叶绿素(Morris等，Plant Molecular Biology 24：673：77(1994))，来自海洋蓝藻细菌，诸如聚球藻属(Synechococcus)的藻胆蛋白，例如藻红蛋白和藻青蛋白(Wilbanks等，J.Biol.Chem.268：1226-35(1993))等。
一般而言，在细胞毒素与靶向(或其它)试剂和任选间隔基之间形成键前，化学官能团中的至少一个被活化。本领域技术人员可以理解可以使用各种标准方法和条件活化各种化学官能团，包括羟基，氨基和羧基。例如，可以通过用光气处理活化细胞毒素或靶向剂的羟基以便形成相应的氯甲酸酯或对-硝基苯基氯甲酸酯，以便形成相应的碳酸酯。
在一个典型的实施方案中，本发明利用了包括羧基官能团的靶向剂。例如，可以通过转化成酰基卤或活性酯活化羧基。该反应可以在如March，文献同上pp.388-89中例示各种条件下进行。在一个典型的实施方案中，通过使含羧基的基团与草酰氯反应制备酰基卤。使活化的试剂与细胞毒素或细胞毒素-连接基臂组合反应而生成本发明的轭合物。本领域技术人员可以理解含羧基的靶向剂的应用仅为例示性的，并且具有许多其它官能团的试剂可以与本发明的连接基轭合。
反应性官能团
为清楚地解释，成功的讨论集中于本发明细胞毒素于靶向剂轭合。焦点以本发明的一种实施方案为典型，其它实施方案易于由本领域技术人员推断。作为对单一实施方案的讨论并不意味着限制本发明。
本发明的典型化合物具有反应性官能团，它一般位于取代或未被取代的烷基或杂烷基链上，从而能够使其与另一种类便利地连接。反应基团的便利位置为链的末端位置。
用于实施本发明的反应基团和反应类型一般为生物轭合物化学领域众所周知的那些。反应性官能团可以被保护或未被保护并且基团被保护的性质可以通过有机合成领域公知的方法改变。目前有利的可利用与反应性细胞毒素类似物反应的类型为在相对适度条件下进行的那些。它们包括，但不限于亲核取代(例如胺类和醇类与酰基卤，活性酯类的反应)，亲电取代(例如烯胺反应)和加成到碳-碳和碳-杂原子重键上(例如迈克尔(Michael)反应，第尔斯-阿尔德加成)。这些和其它有用的反应在如下文献中讨论，例如，March，ADVANCED ORGANIC CHEMISTRY，3rd Ed.，John Wiley & Sons，New York，1985；Hermanson，BIOCONJUGATETECHNIQUES，Academic Press，San Diego，1996；和Feeney等，MODIFICATIONOF PROTEINS；Advances in Chemistry Series，Vol.198，AmericanChemical Society，Washington，D.C.，1982。
典型反应类型包括反应羧基及其各种衍生物的反应，包括，但不限于N-羟基琥珀酰亚胺酯类，N-羟基苯并三唑酯类，酰基卤，酰基咪唑类，硫酯类，p-硝基苯基酯类，烷基，烯基，炔基和芳族种类。可以将羟基转化成酯类，醚类，醛类等。通过与例如胺，羧酸盐阴离子，硫氢基阴离子，负碳离子或醇盐离子反应将卤代烷基转化成新的种类。二烯亲合物(例如马来酰亚胺)基团参与第尔斯-阿尔德(Diels-Alder)反应。可以将醛或酮基转化成亚胺类，腙类，缩氨基脲类或肟类或通过诸如格利雅(Grignard)加成或烷基锂加成这类机制。例如，磺酰基卤易于与胺类反应而生成磺酰胺类。例如，使胺或巯基酰基化，烷基化或氧化。可以使用环加成，酰化，迈克尔加成等将烯烃类转化成大量新的种类。环氧乙烷易于与胺类和羟基化合物反应。
本领域技术人员易于理解可以按照许多方式并且使用各种条件产生这些键中的许多。为了制备酯类，例如，参见March文献同上的1157页；为了制备硫酯类，参见，March，文献同上的362-363页，491，720-722，829，941和1172；为了制备碳酸酯类，参见，March，文献同上的346-347页；为了制备氨基甲酸酯类，参见，March，文献同上的1156-57页；为了制备酰胺类，参见，March文献同上的1152页；为了制备脲类和硫脲类，参见，March文献同上的1174页；为了制备缩醛类和缩酮类，参见，Greene等，文献同上的178-210和March文献同上的1146页；为了制备酰氧基烷基衍生物，参见，PRODRUGS：TOPICALAND OCULAR DRUG DELIVERY，K.B.Sloan，ed.，Marcel Dekker，Inc.，New York，1992；为了制备烯醇酯类，参见，March文献同上的1160页；为了制备N-磺酰基亚氨酸酯类，参见，Bundgaard等，J.Med.Chem.，31：2066(1988)；为了制备酸酐类，参见，March文献同上的355-56，636-37，990-91和1154页；为了制备N-酰基酰胺类，参见，March文献同上的379页；为了制备N-Mannich碱，参见，March文献同上的800-02和828页；为了制备羟甲基酮酯类，参见，Petracek等，Annals NY Acad.Sci.，507：353-54(1987)；为了制备二硫化物，参见，March文献同上的1160页；且为了制备膦酸酯类和膦酸亚氨酸酯类。
反应性官能团可以未被保护并且可以选择，使得它们不参与或干扰反应。可选择地，反应性官能团可以因存在保护基而不参与反应。本领域技术人员理解如何防止特定的官能团干扰选择的一组反应条件。就有用的保护基的实例而言，参见Greene等，PROTECTIVE GROUPS INORGANIC SYNTHESIS，John Wiley & Sons，New York，1991。
一般而言，使用标准化学技术，通过其相应的化学官能团使靶向剂与细胞毒素共价连接。任选使连接基或试剂通过一个或多个间隔基与活性剂偶联。间隔基在以组合形式使用时可以相同或不同。
一般而言，在细胞毒素与反应性官能团之间形成键且任选间隔基前，化学官能团中的至少一个被活化。本领域技术人员可以理解可以使用各种标准方法和条件活化各种化学官能团，包括羟基，氨基和羧基。在一个典型的实施方案中，本发明包含羧基官能团作为反应性官能团。羧基可以如上文所述被活化。
药物制剂和给药
在另一个优选的实施方案中，本发明提供了包含本发明化合物和药学上可接受的载体的药物制剂。
可以使用各种给药途径或方式给患者递送本文所述的化合物，包括药学上可接受的载体，诸如加成盐或其水合物。合适的给药途径包括，但不限于吸入，透皮，口服，直肠，跨粘膜，肠和非肠道给药，包括肌内，皮下和静脉内注射。优选通过非肠道，更优选通过静脉内给予包含抗体或抗体片段作为靶向部分的本发明轭合物。
指定本文所用的术语“给予”或“给药”包括易于直接和间接将化合物递送至其指定作用部位的所有方式。
可以单独，与本发明其它的化合物和/或以与其它治疗剂合并的混合物的形式给予本文所述的化合物或其药学上可接受的盐和/或水合物。当然，可以与本发明化合物共同给药的治疗剂的选择部分取决于所治疗的疾患。
例如，当对患有因依赖于自诱导物的生物体导致的疾病状态的患者给药时，可以将本发明的化合物以包含用于治疗疼痛，感染和其它症状以及通常与疾病相关的副作用的活性剂的混合物形式给药。这类活性剂包括，例如止痛药，抗生素等。
当对进行癌症治疗的患者给药时，可以将所述的化合物以包含抗癌药和/或补充增效剂的混合物的形式给药。还可以将所述的化合物以与包含治疗放疗，诸如催吐药，放射保护剂等的副作用的活性剂的混合物的形式给药。
可以与本发明化合物共同给药的补充增效剂包括，例如三环抗抑郁药(例如丙米嗪，地昔帕明，阿米替林，氯米帕明，曲米帕明，多塞平，去甲替林，普罗替林，阿莫沙平和马普替林)；非-三环和抗抑郁药(例如舍曲林，曲唑酮和西酞普兰)；Ca+2拮抗剂(例如维拉帕米，硝苯地平，尼群地平和卡罗维林)；两性霉素；曲帕拉醇类似物(例如他莫昔芬)；抗心律失常药(例如奎尼丁)；抗高血压药(例如利血平)；硫醇消除剂(例如buthionine和sulfoximine)；和甲酰四氢叶酸钙。
可以将本发明的活性化合物自身或以药物组合物的形式给药，其中将活性化合物与一种或多种药学上可接受的载体，赋形剂或稀释剂混合。一般使用一种或多种生理学可接受的载体以常规方式配制用于本发明的药物组合物，所述的生理学可接受的载体包含赋形剂和助剂，它们有助于将活性化合物加工成可以在药学上使用的制剂。适当的制剂取决于选择的给药途径。
就跨粘膜给药而言，适合于透过屏障的穿透剂用于制剂中。这类穿透剂一般为本领域中公知的。
就口服给药而言，易于通过将活性化合物与本领域众所周知的药学上可接受的载体合并配制化合物。这类载体能够将本发明的化合物配制成片剂，丸剂，胶囊，液体，凝胶，糖浆剂，膏剂，混悬液等，它们由所治疗的患者口服摄入。可以获得口服应用的药物制剂，其中使用固体赋形剂，任选研磨所得混合物，且如果需要，在基团合适的助剂后加工颗粒混合物，从而得到片芯或锭芯。合适的赋形剂特别为填充剂，诸如糖类，包括乳糖，蔗糖，甘露糖醇或山梨醇；纤维素制品，诸如，例如玉米淀粉，小麦淀粉，稻米淀粉，马铃薯淀粉，明胶，黄蓍胶，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，羧甲基纤维素钠和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果需要，可以加入崩解剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻酸或其盐，诸如藻酸钠。
可以给锭芯涂布合适的包衣层。为了这一目的，可以使用浓糖溶液，其任选可以包含阿拉伯树胶，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，卡波普凝胶，聚乙二醇和/或二氧化钛，漆溶液和合适的有机溶剂或溶剂混合物。可以向片剂或锭剂包衣层中加入染料或羧酸以便鉴定或表征活性化合物剂量的不同组合。
可以口服使用的药物制剂包括由明胶制成的推入配合式胶囊以及由明胶和增塑剂，诸如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。推入配合式胶囊可以包含活性组分与填充剂，诸如乳糖，粘合剂，诸如淀粉和/或乳化剂，诸如滑石粉或硬脂酸镁和任选的稳定剂的混合物。在软胶囊中，可以将活性化合物任一或悬浮于合适的液体，诸如脂肪油，液体石蜡或液体聚乙二醇类中。此外，可以加入稳定剂。所有口服给药用制剂均应为适合于这类给药的剂量。
就口含给药而言，组合物可以采用以常规方式配制的片剂或锭剂形式。
就通过吸入给药而言，便利地以来自加压药包或喷雾器的气雾剂形式递送用于本发明的化合物，所述的加压药包或喷雾器中使用合适的抛射剂，例如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合适的气体。就加压气溶胶而言，可以通过安装递送可计量用量的阀门测定剂量单位。可以配制包含化合物与合适的粉末基质，诸如乳糖或淀粉的粉末混合物的用于吸入器或吹入器的例如明胶胶囊和药筒。
可以配制用于通过注射，例如通过快速浓注或连续输注进行非肠道给药的化合物。注射为本发明组合物的优选给药方法。可以将注射用制剂配制成单位剂型，例如在添加了防腐剂的安瓿或多剂量容器中。这些组合物可以采用诸如在油或含水媒介物中的混悬液，溶液或乳剂的形式，并且可以包含配制试剂，诸如可以加入悬浮剂，稳定剂和/或分散剂，诸如交联聚乙烯吡咯烷酮，琼脂或藻酸或其盐，诸如藻酸钠。
用于非肠道给药的药物制剂包括水溶性形式的活性化合物的水溶液。另外，可以将活性化合物的混悬液制备成适当的油注射混悬液。合适的脂溶性溶剂或媒介物包括脂肪油，诸如芝麻油或合成脂肪酸酯类，诸如油酸乙酯或甘油三酯类或脂质体。含水注射混悬液可以包含增加该混悬液粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠，山梨醇或葡聚糖。任选该混悬液还可以包含合适的稳定剂和增加化合物溶解度以便制备高浓溶液的试剂。为了注射，可以将本发明的活性剂配制成水溶液，优选在生理学相容性缓冲液，诸如Hanks′s溶液，林格液或生理盐水缓冲液中的水溶液。
可选择地，活性组分可以为在使用前使用合适的媒介物，例如无菌无热原水溶解的粉末形式。
还可以将化合物配制成直肠用组合物，诸如栓剂或保留灌肠剂，例如其包含常用的栓剂基质，诸如可可脂或其它甘油酯类。
除上述制剂外，还可以将所述的化合物配制成长效制剂。可以通过植入或经皮递送(例如皮下或肌内)，肌内注射或透皮贴剂给予这类长效制剂。因此，例如，可以使用合适的聚合或疏水性材料(例如作为在可接受的油中的乳剂)或离子交换树脂配制化合物或配成难溶性衍生物，例如配成难溶性盐。
药物组合物还可以包含合适的固体或凝胶相载体或赋形剂。这类载体或赋形剂的实例包括，但不限于碳酸钙，磷酸钙，各种糖类，淀粉，纤维素衍生物，明胶和聚合物，诸如聚乙二醇类。
优选的药物组合物为为注射，诸如静脉内注射配制的组合物，并且包括约0.01％-约100％重量的药物-配体轭合物，以100％重量的总药物组合物为基准。药物-配体轭合物可以为抗体-细胞毒素轭合物，其中选择靶向特定癌症的抗体。
文库
本发明范围内还有细胞毒素，细胞毒素-连接基和细胞毒素和本发明连接基的活性剂-连接基轭合物。典型文库包括至少10种化合物，更优选至少100种化合物，甚至更优选至少1000种化合物且更优选至少100,000种化合物。文库的形式易于查询具体特性，例如细胞毒性，酶或其它裂解试剂对连接基的裂解。典型形式包括芯片形式，微阵列等。
平行或组合合成具有其作为生成不同分子文库的主要目的，所述的不同分子均共有常用特征，在本说明书上下文中称作骨架。通过在骨架分子的不同部分各自上取代不同部分，文库中的空间可探测量增长。理论和现代药物化学支持了占据作为测定指定化合物对指定生物靶标的功效的关键因素的概念。通过生成探查大百分比的靶向空间的分子的不同文库，研发高效前导化合物的优势显著增加。
平行合成一般在固相支持体，诸如聚合树脂上进行。骨架或其它合适的中间体可裂解地被化学连接基束缚于树脂上。进行反应以便在束缚于颗粒的同时改变骨架。试剂和/或反应条件的变化产生了结构多样性，它是每种文库的标志。
在1990年前几乎没有尝试“小”分子的平行合成(具有200-1000分子量的非-寡聚体)。例如，参见Camps.等，Annaks de Quimica，70：848(1990)。近来，Ellmann披露了11种苯并二吖庚因类似物于某些前列腺素和β-转角模拟物的固相-支持的平行(也称作“组合”)合成。这些披露的内容以美国专利US5,288,514中为典型。小分子的平行合成的另一种相关披露内容可以在美国专利US5,324,483中找到。该专利中披露了16种不同骨架每一种中4-40种化合物的平行合成。Chen等还应用有机合成策略，使用多-步骤方法在聚合物支持体上研发了非-肽文库(Chen等，J.Am.Chem.Soc.，116：2661-2662(1994))。
一旦制备了唯一化合物文库，就可以使用自诱导物文库作为起点并且使用本文所述的方法制备免疫连接物或抗体的文库。
试剂盒
本发明在另一个方面中提供了包含本发明的一种或多种化合物或组合物以及使用该化合物或组合物的说明书的试剂盒。在一个典型的实施方案中，本发明提供了用于使本发明的连接基臂于另一种分子轭合的试剂盒。该试剂盒包括连接基和使连接基于特定官能团结合的说明书。该试剂盒还可以包括细胞毒性药物，靶向剂，可检测标记，药用盐或缓冲液中的一种或多种。该试剂盒还可以包括容器且任选包括一个或多个小瓶，试管，烧瓶，瓶或注射器。其它试剂盒的形式对本领域技术人员而言显而易见并且属于本发明的范围。
纯化
本发明在另一个典型的实施方案中提供了分离本发明配体-细胞毒素的结合配体X4的分子靶标的方法。该方法优选包含使包括靶标的细胞制品接触免疫接种的化合物，由此在受体与免疫接种化合物之间形成复合物。
可以通过公认的方式将本发明的细胞毒素固定在亲和支持体上。可选择地，可以使用本发明连接基中的一种或多种固定细胞毒素。
在另一个典型的实施方案中，本发明提供了包括本发明连接基的亲和纯化基质。
本发明用于分离靶标的方法一般使用一种或多种亲和色谱技术。亲和色谱能够有效分离诸如生物分子或生物聚合物这类种类，通过使用其针对某些支持的具有高度选择性的化学结构的识别位点来进行。文献中充分存在有关亲和色谱主题的文章，转体论文和书籍，包括诸如亲和色谱支持体，交联成员，配体及其制备和应用这类主题。那些参考文献的抽样包括：Ostrove，Methods Enzymol.182：357-71(1990)；Ferment，Bioeng.70：199-209(1990)。Huang等，J.Chromatogr.492：431-69(1989)；“Purification of enzymes byheparin-Sepharose affinity chromatography”，J.Chromatogr.，184：335-45(1980)；Farooqi，Enzyme Eng.，4：441-2(1978)；Nishikawa，Chem.Technol.，5(9)：564-71(1975)；Guilford等，PRACT.HIGH PERFORM.LIQ.CHROMATOGR.，Simpson(ed.)，193-206(1976)；Nishikawa，Proc.Int.Workshop Technol.Protein Sep.Improv.Blood Plasma Fractionation，Sandberg(ed.)，422-35；(1977)“Affinity chromatography of enzymes”，AffinityChromatogr.，Proc.Int.Symp.25-38，(1977)(Pub.1978)；和AFFINITY CHROMATOGRAPHY：A PRACTICAL APPROACH，Dean等(ed.)，IRL PressLimited，Oxford，England(1985)。本领域技术人员具有使用本发明的物质研发特定亲和色谱法的丰富指导原则。
在本发明的方法中，可以将改变化学结构的亲和色谱介质用作支持体。例如，琼脂糖凝胶和交联琼脂糖凝胶用作支持体材料，因为其亲水性使得它们相对不含非特异性结合。其它有用的支持包括，例如，可控孔度玻璃(CPG)珠，纤维素颗粒，聚丙烯酰胺凝胶珠和由葡聚糖和表氯醇制成的Sephadex凝胶珠。
药物-配体轭合物使用方法
除上述组合物和构建体外，本发明还提供了可以使用本发明化合物和轭合物实施的大量方法。使用本发明药物-配体轭合物的方法包括：杀伤或抑制肿瘤细胞或癌细胞甚至或复制，治疗癌症，治疗癌前期情况，杀伤或抑制表达自身免疫抗体的细胞生长或复制，治疗感染性疾病，预防肿瘤细胞或癌细胞繁殖，预防癌症，预防表达自身免疫抗体的细胞复制，预防自身免疫疾病和预防感染性疾病。这些使用方法包含对有此需要的动物，诸如哺乳动物或人给予有效量的药物-配体轭合物。用于本文所述使用方法中的许多的优选配体包括靶向肿瘤细胞，癌细胞或其它靶区域的抗体和抗体片段。
本发明的药物-配体复合物用于治疗动物癌症，自身免疫疾病和感染性疾病。提供了通过以药学上可接受方式使用本发明药学有效量的组合物给受试者提供该组合物治疗肿瘤的组合物和方法。
本发明特别用于治疗动物癌症和用于抑制动物肿瘤细胞或癌细胞繁殖。癌症或癌前期情况包括，但不限于肿瘤，转移或特征在于细胞不受控制地生长的任何疾病或病症，可以通过给予本发明的药物-配体复合物治疗或预防它们。该复合物将所述的药物递送至肿瘤细胞或癌细胞。在一个实施方案中，配体特异性结合或连接癌细胞或肿瘤细胞伴随抗原。药物因其接近配体而可以通过例如受体介导的胞吞作用被吸收入肿瘤细胞或癌细胞。抗原可以与肿瘤细胞或癌细胞结合或可以为结合了肿瘤细胞或癌细胞胞外基质蛋白。一旦在细胞内部，连接基被肿瘤细胞或癌细胞伴随蛋白酶裂解，由此释放药物。释放的药物随后游离以便快速并且诱导细胞毒性活性。在一个可选择的实施方案中，在肿瘤细胞或癌细胞外部药物从药物-配体复合物中裂解，且随后药物透入细胞。
例如，配体可以结合肿瘤细胞或癌细胞，位于肿瘤细胞或癌细胞表面上的肿瘤细胞或癌细胞抗原，或为结合肿瘤细胞或癌细胞的胞外基质蛋白的肿瘤细胞或癌细胞抗原。可以特别为特定肿瘤细胞或癌细胞类型设计配体。因此，可以通过改变选择的配体改变可有效肿瘤的肿瘤或癌症类型。
可以由药物-配体轭合物靶向的癌前期情况的有代表性的实例包括，但不限于：化生，增生，发育不良，结肠直肠息肉，光化性角化病(ketatosis)，光化性唇炎，人乳头瘤病毒，黏膜白斑病，扁平苔藓(lychen planus)和鲍文病。
可以由药物-配体轭合物靶向的癌症或肿瘤的有代表性的实例包括，但不限于：肺癌，结肠癌，前列腺癌，淋巴瘤，黑素瘤，乳腺癌，卵巢癌，睾丸癌，CNS癌，肾癌(renal cancer)，肾癌(kidneycancer)，胰腺癌，胃癌，口腔癌，鼻癌，宫颈癌和白血病。本领域技术人员显而易见可以选择用于轭合物的特定靶向配体，使得它使药物靶向至该药物治疗的肿瘤组织(即选择对肿瘤特异性抗原具有特异性的靶向剂)。这类靶向配体的实例为本领域众所周知的，其非-限制性实例包括用于治疗乳腺癌的抗-Her2，用于治疗淋淋巴瘤的抗-CD20，用于治疗淋前列腺癌的抗-PSMA和用于治疗淋巴瘤，包括非何杰金淋巴瘤的抗-CD30。
本发明在一个实施方案中提供了杀伤细胞的方法。该方法包括对所述的细胞给予足以杀伤该细胞的用量的本发明化合物。在一个典型的实施方案中，将化合物给予具有所述细胞的受试者。在另一个典型的实施方案中，给药用于延缓或终止包括所述细胞(例如该细胞可以为肿瘤细胞)的肿瘤生长。就延缓生长的给药而言，细胞生长速率应低于给药前的生长速率至少10％。优选生长速率被延缓至少20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，90％或完全终止。
有效剂量
适用于本发明的药物组合物包括组合物，其中以治疗有效量，即有效实现其指定目的的用量包含活性组分。有效用于特定应用的实际用量特别依赖于所治疗的疾患。确定有效量充分属于本领域技术人员的能力范围，尤其是根据本文的详细披露内容。
就本文所述的任意化合物而言，最初可以根据细胞培养试验确定治疗有效量。目标血浆浓度为那些化学化合物能够抑制细胞生长或分裂的浓度。在优选的实施方案中，细胞化学被抑制至少25％。目前优选能够诱导至少约50％，75％，乃至90％或90％以上细胞活性抑制的化学化合物的目标血浆浓度。可以检测细胞活性抑制百分比以便评价获得的血药浓度的适合性，并且可以向上或向下调整以便获得期望的抑制百分比。
正如本领域众所周知的，还可以骨架动物模型测定用于人的治疗有效量。例如，可以配制人用剂量以便获得已经发现在动物中有效的循环浓度。在人中的剂量可以通过如上所述监测细胞抑制和向上或向下剂量来调整。
还可以根据已知表现出类似药理学活性的化合物的人体数据测定治疗有效剂量。可以基于与已知化合物相比的相对生物利用度和给予化合物的功效调整施用剂量。
作为本领域众所周知的，基于上述方法和其它方法调整获得最大功效的剂量充分属于本领域技术人员的能力范围。
就绝版给药而言，给予化合物的全身循环浓度并不具有特别的重要性。在这类情况中，给予化合物以便在局部区域有效实现指定结果的浓度。
为了用于预防和/或治疗与异常细胞增殖相关的疾病，优选约0.001μM-20μM的给予化合物的循环浓度，优选约0.01μM-5μM。
本文所述化合物的口服给药的患者剂量一般在约1mg/天-约10,000mg/天，更一般地约10mg/天-约1,000mg/天且最一般地约50mg/天-约500mg/天。根据患者体重所述的典型剂量范围在约0.01-约150mg/kg/天，更一般地约0.1-约15mg/kg/天和最一般地约1-约10mg/kg/天，例如5mg/kg/天或3mg/kg/天。
在至少某些实施方案中，延缓或抑制肿瘤生长的患者剂量可以1μmol/kg/天或1μmol/kg/天以下。例如，患者剂量可以为0.9，0.6，0.5，0.45，0.3，0.2，0.15或0.1μmol/kg/天或0.1μmol/kg/天以下(涉及药物的摩尔数)。优选在至少5天期限内以每日剂量给药时，抗体-药物轭合物延缓肿瘤生长。在至少某些实施方案中，肿瘤为SCID小鼠中的人类肿瘤。作为实例，SCID小鼠可以为CB17.SCID小鼠(购自Taconic，Germantown，NY)。
就其它给药方式而言，可以各自调整剂量和间隔以便提供有效用于特定所治疗的临床适应征的给予化合物的血浆水平。例如，在一个实施方案中，每天以相对高的浓度多次给予本发明的化合物。可选择地，更需要以最低有效浓度并且使用最低频率的给药方案给予本发明的化合物。这会提供与个体疾病严重性相当的治疗方案。
使用本文提供的教导，可以计划有效治疗方案，它不会导致显著毒性并且仍完全有效治疗患者表现出的临床适应征。这种计划应包括根据考虑因素谨慎选择活性化合物，诸如化合物功效，相对生物利用度，患者体重，不良副作用的存在和严重性，优选的给药方式和选择的活性剂的毒性特性。
可以通过如下实施例进一步例示本发明的化合物，组合物和方法。提供这些实施例例示，但不限制请求保护的本发明。
实施例
材料和方法
除非另作陈述，否则以摄氏度给出温度(℃)；在室温或环境温度下进行操作(一般在约18-25℃的范围；在减压下使用旋转蒸发器与达60℃的浴温进行溶剂蒸发(一般4.5-30mmHg)；反应过程一般遵循TLC且提供反应时间仅用于例示；熔点未校准；产物表现出令人满意的1H-NMR和/或显微分析数据；提供产率仅用于例示；并且还使用如下常用缩写：mp(熔点)，L(升)，mL(毫升)，mmol(毫摩尔)，g(克)，mg(毫克)，min(分钟)，LC-MS(液相色谱-质谱)和h(小时)。
用Varian Mercury 300MHz光谱仪测定1H-NMR光谱并且与指定结构一致。以来自四甲基硅烷的低场的百万中的份数(ppm)报导化学位移。用Perkin Elmer Sciex API 365质谱仪记录电喷射质谱。由Robertson Microlit Laboratories，Madison，NJ进行元素分析。用于快速色谱法的硅胶为E.Merck级(230-400目)。用HP 1100或VarianProStar 210仪与Phenomenex Luna 5μm C-18(2)150mm x 4.6mm柱或Varian Microsorb-MV 0.1mm C-18150mm x 4.6mm柱进行反相分析型HPLC。使用1mL/分钟的流速与15分钟内的0％-50％缓冲液B或10分钟内的10％-100％缓冲液B的梯度，用UV在254nm处检测。缓冲液A，20mM甲酸铵+20％乙腈或0.1％在乙腈中的三氟乙酸；缓冲液B，20mM甲酸铵+80％乙腈或0.1％三氟乙酸水溶液。用Varian ProStar 215仪与Waters Delta Pak 15μm C-18300mm x 7.8mm柱进行反相制备型HPLC。
实施例1：肽连接基轭合物的合成
1.1a合成方法
方案1
Figure A20068004401201261
方案2
Figure A20068004401201271
方案3
Figure A20068004401201272
方案4
Figure A20068004401201281
方案5
方案6
Figure A20068004401201301
1.1b化合物1的合成：N-[2’-(N’-叔丁氧羰基-氨基(animo))- 乙基]-缬氨酸叔丁酯。向2-(N-叔丁氧羰基-氨基)-乙基溴(1g，4.5mmol)和缬氨酸叔丁酯(0.936g，4.5mmol)在DMF(10ml)中的溶液中加入碳酸钾(1.85g，13.5mmol)。将由此获得的混合物在100℃下搅拌过夜。浓缩该反应混合物并且提供硅胶快速色谱法纯化残余物，使用乙酸乙酯/己烷(3/7)作为洗脱液，从而得到标题化合物，为油状物(0.16g，12％)。1H NMR(CDCl3)δ0.94(ft，6H)，1.44(s，9H)，1.473和1.475(2s，9H)，1.88(m，1H)，2.51(m，1H)，2.78(m，2H)，3.11(m，1H)，3.22(m，1H)，3.39和4.13(2b t，1H)，5.00(b s，1H)ppm；LC-MS(ESI)205(M+H+-112)，261(M+H+-Bu)，317(M+H+)。
1.1c化合物2的合成：N-(2-氨基乙基)-缬氨酸。在室温下将化合物1(137mg，0.43mmol)溶于TFA/二氯甲烷的溶液(2ml，1/1)。将由此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。将该反应混合物浓缩至干而得到标题化合物，为油状物(0.18g，95％)1H NMR(CD3OD)δ1.07和1.16(2d，6H)，2.35(m，1H)，3.2(m，1H)，3.38(m，4H)ppm；LC-MS(ESI)217(M+H+)。
1.1d化合物3的合成。向马来酰亚胺-dPEG4-NHS酯(61mg，0.16mmol)在二氯甲烷(2ml)中的溶液中滴加在二氯甲烷(1ml)中的化合物2(80.7mg，0.16mmol)和二异丙基乙胺(55.5μl，0.32mmol)。将由此获得的混合物疾病过夜。用旋转蒸发器除去溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷，随后使用5％在二氯甲烷中的甲醇且最终使用100％甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为无色油状物(87mg，97％)。1H NMR(CDC13)δ1.08(dd，6H)，2.25(m，1H)，2.49(t，2H)，2.52(t，2H)，3.10-3.79(m，25H)，6.82(s，2H)ppm；LC-MS(ESI)559(M+H+)。
1.1e化合物4的合成：Fmoc-Cit-PABOH。向Fmoc-Cit-OH(1.0g，2.52mmol)和4-氨基苄醇(341mg，2.77mmol)在二氯甲烷(10ml)和甲醇(5ml)中的溶液中一次加入2-乙氧基-1-乙氧基羰基-1，2-二氢喹啉[EEDQ](1.24g，5.04mmol)。将该混合物在黑暗处搅拌16小时。用旋转蒸发器除去溶剂并且将白色固体与乙醚(100ml)一起研磨。将所得混悬液超声处理5分钟且然后保持稳定30分钟。通过过滤收集白色固体，用乙醚洗涤并且在真空中干(1.23g，97％)。1H-NMR(DMSO)δ1.32-1.52(m，2H)，1.52-1.74(dm，2H)，2.86-3.06(dm，2H)，4.1(M，1H)，4.42(d，2H)，5.07(t，1H)，5.40(b s，2H)，5.97(t，1H)，7.19-7.95(m，12H)，8.10(d，1H)，9.97(s，1H)ppm；LC-MS(ESI)503.1(M+H+)。
1.1f化合物5的合成：Fmoc-Cit-PABC-PNP。向化合物4(309mg，0.62mmol)和对-硝基苯基氯甲酸酯(372mg，1.85mmol)在四氢呋喃(30ml)和1-甲基-2-吡咯烷(1ml)中的溶液中一次加入吡啶(100μL，1.23mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。用旋转蒸发器除去溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷，随后使用3％在二氯甲烷中的甲醇且最终使用10％二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为白色固体(97.9mg，70％)。LC-MS(ESI)668(M+H+)。
1.1g化合物6的合成：Fmoc-Lys(Boc)-PABOH。如上述对化合物4所述制备化合物6，产率为98％。1H NMR(DMSO)δ1.40(s，9H)，1.38(m，2H)，1.50-1.74(dm，2H)，3.04(t，2H)，3.30(q，3H)，4.19-4.31(m，2H)，4.41(d，2H)，4.55(s，2H)，7.28-7.68(m，12H)，8.00(d，1H)ppm；LC-MS(ESI)574(M+H+)。
1.1h化合物7的合成：Fmoc-Lys(Boc)-PABC-PNP。如上述对化合物5所述制备化合物7，产率为70％。1H NMR(CD3Cl)δ1.44(s，9H)，1.49-1.60(m，6H)，1.73(m，1H)，2.00(m，1H)，3.11(m，1H)，3.20(bs，1H)，4.23(m，2H)，4.46(bs，2H)，4.67(bs，1H)，5.56(bs，1H)，7.28(m，2H)，7.36-7.41(m，6H)，7.59(m，4H)，7.76(d，2H)，8.26(dd，2H)，8.45(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)639(M+H+-Boc)，684(M+H+-Bu)，739(M+H+)，778(M+K+)。
1.1i化合物8的合成：Boc-Val-Cit-OH。向瓜氨酸(2.54g，14.50mmol)和碳酸氢钠(1.28g)在水(40ml)中的溶液在加入溶于二甲氧基乙烷(DME)中的Boc-Val-OSu(4.34g，13.81mmol)。为了有助于该混合物溶解，加入四氢呋喃(10ml)。将由此获得的混合物在室温下疾病过夜。加入柠檬酸水溶液(15％，75ml)并且用10％2-丙醇/乙酸乙酯(2x 100ml)萃取该混合物。用盐水(2x 150ml)洗涤有机层并且用旋转蒸发器除去溶剂。在真空中将所得白色固体干燥5小时且然后用乙醚(100ml)处理。在简单超声处理和研磨后，通过过滤收集白色固体产物(1.39g，27％)。1H NMR(CD3OD)δ0.91(dd，3H)，0.98(dd，3H)，1.44(s，9H)，1.70(m，2H)，1.87(m，2H)，2.02(m，2H)，3.11(t，2H)，3.89(t，1H)，4.39(q，1H)，8.22(d，1H)ppm；LC-MS(ESI)375(M+H+)。
1.1j化合物9的合成：Boc-Val-Cit-PABOH。如上述对化合物4所述制备化合物9，产率为71％。1H NMR(CD3OD)δ0.93和0.97(2d，6H)，1.44(s，9H)，1.58(m，2H)，1.75(m，1H)，1.90(m，1H)，2.05(m，1H)，3.10(m，1H)，3.19(m，1H)，3.91(d，1H)，4.52(m，1H)，5.25(s，2H)，7.40(d，2H)，7.45(dd，2H)，7.64(d，4H)，8.29(dd，2H)ppm；LC-MS(ESI)480(M+H+)。
1.1k化合物10的合成：Boc-Vak-Cit-PABC-PNP。将Boc-Val-Cit-PABOH(178mg，0.370mmol)在CH2Cl2(4ml)中的THF(8ml)中的溶液在室温下与PNP氯甲酸酯(160mg，0.80mmol)和吡啶(65μl，0.80mmol)搅拌3小时。向该反应混合物中加入乙酸乙酯(100ml)和10％柠檬酸水溶液(50ml)并且用以上洗涤有机层，干燥且浓缩并且通过硅胶快速色谱法纯化残余物，使用5％甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为白色固体(165mg，70％)。1H NMR(CD3OD)δ0.93(dd，3H)，0.97(dd，3H)，1.44(s，9H)，1.58(m，2H)，1.75(m，1H)，1.89(m，1H)，2.05(m，1H)，3.10(m，1H)，3.20(m，1H)，3.90(d，1H)，4.51(m，1H)，4.55(s，2H)，7.29(d，2H)，7.55(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)545(M+H+-Boc)，645(M+H+)，667(M+Na+)，683(M+K+)。
1.1l化合物12a的合成。用HCl气体使化合物11(20mg，0.078mmol)在乙酸乙酯(5ml)中的混悬液发泡20分钟(截止到此时该混悬液变澄清溶液)。将该反应混合物再搅拌5分钟，然后将该混合物浓缩至干而得到标题化合物，为黄色固体(26mg，100％)，将其不经进一步纯化用于下一步。LC-MS(ESI)260(M+H+-Cl)，295(M+H+)。
1.1m化合物12b的合成。用HBr气体使化合物11(20mg，0.078mmol)在乙酸乙酯(5ml)中的混悬液发泡20分钟(截止到此时该混悬液变澄清溶液)。将该反应混合物再搅拌5分钟，然后将该混合物浓缩至干而得到标题化合物，为黄色固体(33mg，100％)，将其不经进一步纯化用于下一步。LC-MS(ESI)260(M+H+-Br)，339(M+H+)，341(M+H++2)。
1.1n化合物13b的合成。向化合物12a(26mg，0.078mmol)在DMF(2ml)中的溶液中加入5-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯并呋喃-2-甲酸(44mg，0.155mmol)和EDC(30mg，0.155mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。浓缩该混合物并且将残余物溶于H2O/CH3CN/TFA(4/1.5/0.5，6ml)并且将其放入冷藏箱3小时。通过过滤收集黄色固体(35mg，85％)。1H NMR(CD3OD)δ2.67(s，3H)，3.01(s，6H)，3.34(m，2H)，3.63(ft，1H)，3.89(s，3H)，3.91(m，1H)，4.41(m，3H)，4.54(m，1H)，4.65(m，1H)，7.20(dd，1H)，7.36(d，1H)，7.54(s，1H)，7.59(d，1H)，7.73(b s，1H)，11.75(s，1H)ppm；LC-MS(ESI)490(M+H+-Cl)，526(M+H+)。
1.1o化合物13c的合成。向化合物12b(19mg，0.0387)在DMF(2ml)中的溶液中加入5-(2-二甲氨基-乙氧基)-苯并呋喃-2-甲酸HBr盐(25mg，0.0775mmol)和PS-碳二亚胺(82mg，mmol/g：0.94，0.0775mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌24小时。在过滤后，浓缩滤液并且将残余物溶于H2O/CH3CN/TFA(2/0.75/0.25，3ml)并且将其放入冷藏箱3小时。通过过滤收集黄色固体并且干燥而得到标题化合物(18mg，82％)。LC-MS(ESI)490(M+H+-Br)，570(M+H+)，572(M+H++2)。
1.1p化合物14a的合成。在-78℃下向化合物13a(48mg，0.10mmol)在二氯甲烷(4ml)中的混悬液中加入氯甲酸对-硝基苯酯(80mg，0.40mmol)和三乙胺(56μl，0.40mmol)。将该混合物缓慢温至室温并且再持续搅拌30分钟。向该反应混合物中加入化合物N-Boc-N，N’-二甲基乙二胺(166mg，0.80mmol)并且搅拌过夜。浓缩该混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用1.25％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为白色固体(71mg，100％)1HNMRδ1.45-1.47(m，9H)，2.69(s，3H)，2.97(s，3H)，3.14-3.34(m，4H)，3.81-3.92(m，8H)，4.38-4.47(m，3H)，4.70(d，1H)，7.05(dd，1H)，7.11(d，1H)，7.45(s，1H)，7.48(d，1H)，7.99(s，1H)，10.43(s，1H)ppm.LC-MS(ESI)710(M-H+)。
1.1q化合物14b的合成。在0℃下向化合物13b(48mg，0.075mmol)在二氯甲烷(2ml)中的混悬液中加入氯甲酸4-硝基苯酯(80mg，0.4mmol)和三乙胺(40mg，0.4mmol，56μl)。将该混合物缓慢温至室温并且再持续搅拌6小时。蒸发溶剂并且用乙醚洗涤残余物而得到中间体。将该中间体溶于二氯甲烷(2ml)并且将该反应溶液中加入N-Boc-N，N’-二甲基乙二胺(44mg，0.2mmol)和三乙胺(20mg，0.2mmol，28μl)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。浓缩该混合物并且通过使用C-18柱进行HPLC纯化残余物，使用甲酸铵(20mM，pH7.0)和乙腈作为洗脱液而得到标题化合物，为白色固体(31mg，54％)。LC-MS(ESI)755(M+H+)。
1.1r化合物14c的合成。在0℃下向化合物13c(24mg，0.04mmol)在CH2Cl2(2ml)中的混悬液中加入氯甲酸对-硝基苯酯(64mg，0.32mmol)三乙胺(22μl，0.16mmol)。将如此获得的反应混合物在室温下搅拌18小时。向该反应混合物中加入N-Boc-N，N’-二甲基乙二胺(94mg，0.50mmol)并且再持续搅拌50分钟。浓缩该混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用5％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为白色固体(28mg，83％)。LC-MS(ESI)490，570，684(M+H+-Boc)，784(M+H+)，805(M+Na+)，722(M+K+)。
1.1s化合物15a的合成。将化合物14a(70mg，0.10mmol)溶于三氟乙酸(5ml)并且将该混合物在室温下搅拌30分钟并且浓缩至干并且将产物(72mg，100％)不经进一步纯化用于下一步。HPLC显示出其＞95％纯度。1H NMRδ2.64(s，3H)，2.93(s，3H)，3.19(s，3H)，3.30(t，1H)，3.79(s，3H)，3.85(s，3H)，3.81-3.85(m，1H)，4.27-4.49(m，3H)，4.59(d，1H)，4.68(d，1H)，6.97(dd，1H)，7.03(d，1H)，7.38(s，1H)，7.41(d，1H)，8.00(br s，1H)，10.61(br s，1H)ppm。LC-MS(ESI)612(M+H+)，634(M+Na+)。
1.1t化合物15b的合成。如上述对化合物15a所述制备化合物15b，产率为100％。1H NMR(CD3OD)δ2.69(s，3H)，2.76(s，3H)，2.83(bs，1H)，3.01(s，6H)，3.08(bs，1H)，3.24(bs，2H)，3.42(m，2H)，3.63(bs，3H)，3.74(bs，1H)，3.91(s，3H)，3.92(m，1H)，4.40(b s，2H)，4.57(bs，2H)，4.71(bs，1H)，7.22(bd，1H)，7.36(s，1H)，7.56(s，1H)，7.59(d，1H)，8.04(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)490，526，640(M+H+)，678(M+K+)。
1.1u化合物15c的合成。如上述对化合物15a所述制备化合物15c，产率为100％。LC-MS(ESI)490，570，684(M+H+)，722(M+K+)。
1.1v化合物16a的合成。向化合物5(12.5mg，0.019mmol)和化合物15a(10mg，0.014)在二甲基甲酰胺(200μL)中的溶液中加入三乙胺(6μL，0.044mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。向该混合物中加入乙醚(5ml)并且白色固体从溶液中析出。过滤该固体并且通过快速硅胶色谱法纯化，使用二氯甲烷，随后使用1％在二氯甲烷中的甲醇，2％在二氯甲烷中的甲醇，3％在二氯甲烷中的甲醇和最终4％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为白色固体(8.7mg，56％)。LC-MS(ESI)470，1112(M+H+)，1134(M+Na+)，1150(M+K+)。
1.1w化合物16b的合成。向化合物15b(5mg，0.0056mmol)在DMF(0.35ml)中的溶液中加入化合物5(3.8mg，0.0056mmol)和DIEA(2μl，0.011mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌5小时。浓缩该混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用10％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为固体(3mg，45％)。LC-MS(ESI)490，526，1169(M+H+)，1208(M+K+)。
1.1x化合物16c的合成。如上述对化合物16b所述制备化合物16c，产率为50％。LC-MS(ESI)490，570，1212(M+H+)，1250(M+K+)。
1.1y化合物17a的合成。向化合物16a(8.7mg，0.008mmol)在二甲基甲酰胺(500μL)中的溶液中一次加入哌啶(100μL)。将由此的混合物在室温下搅拌20分钟。用旋转蒸发器除去溶剂并且放置坐在高度真空中1.5小时。将残余物溶于少量二氯甲烷(100μL)并且向该溶液中加入己烷(3ml)，白色固体从溶液整个析出，将其过滤并且干燥(6.7mg，96.7％)。MS(ES)470，890.1(M+H+)，912(M+Na+)，928(M+K+)。
1.1z化合物17b的合成。如上述对化合物17a所述制备化合物17b，产率为95％。LC-MS(ESI)947(M+H+)。
1.1aa化合物17c的合成。如上述对化合物17a所述制备化合物17c，产率为95％。LC-MS(ESI)1015(M+H+)。
1.1bb化合物18a的合成。向化合物17a(4.2mg，0.005mmol)和化合物3(2.64mg，0.005mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中一次加入PyBOP(3.7mg，0.007mmol)，随后加入二异丙基乙胺(1μL)。将由此的混合物在室温下搅拌过夜。用旋转蒸发器除去溶剂。通过制备型HPLC纯化残余物而得到淡棕色固体(2.6mg，38.7％)。MS(ES)470，1431(M+H+)，1453(M+Na+)，1469(M+K+)。
1.1cc化合物18b的合成。向化合物17b(2.2mg，0.0025mmol)和化合物3在5％在二氯甲烷中的甲醇(400μl)中的溶液中加入HBTU(9mg，0.0046mmol)和DIEA(1.4μl，0.0046mmol)。将由此的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物，使用10mM甲酸铵和乙腈作为洗脱液而得到标题化合物，为油状物(1.1mg，30％)。LC-MS(ESI)490，526，1488(M+H+)，1527(M+K+)。
1.1dd化合物18c的合成。向化合物17c(6.5mg，0.0065mmol)和化合物3(5.5mg，0.0097mmol)在5％在二氯甲烷中的甲醇(0.5ml)中的溶液中加入HBTU(3.7mg，0.0097mmol)和DIEA(3.4μL，0.0194mmol)。将由此的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用30％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为油状物(4mg，30％)。LC-MS(ESI)1532(M+H+)，1554(M+Na+)，1570(M+K+)。
1.2含多卡米星的不含自我消除间隔基的肽连接基的合成方法
Figure A20068004401201391
1.2a反应A：使干燥HBr气流缓慢通过烷基化核7mg在2mL乙酸，直到形成澄清溶液，需要约15分钟。浓缩该反应混合物并且在高度真空中干燥过夜。
1.2b反应B：向步骤A中制备的溴甲基开环化合物在DMF中的混悬液加入EDC(10mg，0.054mmol)和5-硝基苯并呋喃甲酸(12mg，0.054mmol)并且将该体系搅拌6小时。然后向该反应混合物中加入乙酸乙酯和盐水。在用乙酸乙酯进行三次萃取后浓缩合并的有机层并且用硅胶，使用MeOH/DCM与增加量的MeOH过滤。通过质谱证实产物，M+1＝530。
1.2c反应C：使用在2mL DCM，200μL烯丙基醇和吡啶(21μL)中的甲基哌嗪羰基氯(11mg，0.054mmol)保护4’-OH 2小时。通过硅胶柱色谱法纯化产物并且通过质谱鉴定，MS+1＝654。
1.2d反应D：通过在40PSI中用在DCM/MeOH(2∶1)中的Pd/C氢化45分钟对硝基进行还原。过滤产物并且浓缩滤液且在高度真空中干燥。通过质谱分析MS+1＝证实产物且不经进一步纯化用于下一步。
1.2e反应E：向上述化合物(18mg，0.024mmol)在MeOH/DCM(2∶1，3ml)中的溶液中加入Fmoc-Val-瓜氨酸(29mg，0.06mmol)，将所得混合物搅拌10分钟，直到所有酸溶解。加入15mg，0.06mol EEDQ并且将该反应混合物在黑暗中搅拌过夜。然后浓缩该反应混合物，用乙醚冲洗并且通过反相制备型HPLC纯化残余物而得到产物，通过质谱鉴定M+1＝1103。
1.2f反应F：使用在1mL DMF中5％的哌啶(pipiridine)对Fmoc保护基进行脱保护10分钟。浓缩该反应混合物，随后用乙醚冲洗固体残余物。通过质谱证实产物，MS+1＝880和M+K＝919。
1.2g反应G：向步骤F中制备的游离胺在DMF(1.5ml)中的溶液中加入Mal-(PEG)4-NHS-酯(20mg)并且将该反应混合物搅拌1小时。浓缩，随后进行反相制备型HPLC纯化而得到2.8mg(11％总产率，从烷基化核开始)，通过质谱证实MS+1＝2178，M+Na＝1300和M+K＝1316。
1.3 与Tubulysine A轭合的肽连接基的合成
Figure A20068004401201411
可以使配体通过如下所示的合成与PEG和肽连接基连接。
具有肽连接基的中间体和配体-药物轭合物的合成如上文所示，其中药物为Tubulysine A。该基本方法可以用于其它药物。
1.4a肽-连接基轭合物111的合成
Figure A20068004401201421
1.4b肽-连接基轭合物112的合成
Figure A20068004401201431
1.4c肽-连接基轭合物113的合成
实施例2：6-元肼连接基轭合物的合成
2.1与多卡米星衍生物细胞毒素轭合的6-元偕-二甲基肼连接 基的合成
2.1a化合物109的合成方案
Figure A20068004401201451
2.1b化合物110的合成
向在冰浴温度下Cbz-二甲基丙氨酸(1g，3.98mmol)在30mL DCM中的混悬液中加入HOAT(催化剂，0.25当量)，DIPEA(2.8ml，16mmol)，随后加入2-氯-1，3-二甲基咪唑烷鎓六氟磷酸盐(CIP)(1.2g，4.4mmol)。然后向该反应混合物中加入Boc-NN(Me)(643mol，4.4mmol)。将该反应混合物在室温下搅拌过夜。向该反应混合物中加入10％柠檬酸溶液(100ml)并且用DCM萃取。用水且然后用饱和碳酸氢钠，随后再用水洗涤有机相。然后浓缩有机相并且通过用硅胶柱，使用增加极性的在己烷中的乙酸酯纯化而得到860mg，产率为57％的107，将其通过质谱鉴定，M+1＝380和M+NH4 +＝397。
通过使用在MeOH中的Pd/C催化氢化除去Cbz保护基而得到化合物108，将其通过MS证实。
向PNPC-1918(10mg，0.1mmol)在2mL DCM中的溶液中滴加化合物108(60mg，0.25mmol)下8mL DCM中的溶液并且将该反应混合物搅拌2天，直到所有原料消失。将该反应混合物通过短硅胶垫过滤且然后浓缩并且通过反相制备型HPLC纯化而得到4.2mg化合物109。将其通过质谱鉴定M+1＝740。使用纯TFA将化合物109进行Boc脱保护20分钟而得到化合物110。通过质谱证实产物，M+1＝640。
Figure A20068004401201461
2.1c  化合物111的合成
合并Mal-PEG4-苯乙酮和化合物110(3mg，.005mmol)，浓缩并且在高度真空中干燥过夜。向该混合物中加入在先每天制备的1mL 5％乙酸溶液并且用分子筛干燥。腙在1小时内完全形成。此后浓缩该反应混合物并且通过反相制备型HPLC纯化(甲酸铵Ph＝7)而得到2.8mg化合物111(产率60％)。通过质谱鉴定产物，MS+1＝1129，M+NH4＝1146和M+K＝1168
2.2与tubulysin细胞毒素轭合的6-元偕-二甲基肼连接基的合 成的合成
Figure A20068004401201471
可以将如实施例2.1中所示类似的方法可以应用于所示与药物，诸如tubulysin A复合的偕二甲基6-元肼连接基的合成。
2.3与多卡米星类似物轭合的肼连接基的合成
Figure A20068004401201481
向溴甲基开环化合物(0.074mmol)在3mL DMF中的溶液中加入5-乙酰基吲哚-2-甲酸酯(30mg，0.15mmol)和EDC(28mg，0.15mmol)并且将所得混合物搅拌过夜。浓缩该反应混合物并且通过使用5％在DCM中的MeOH的根据色谱法纯化而得到(Tt)29mg(产率74％)产物，通过质谱证实M+1＝523。
向步骤C中合成的化合物在5mL DCM和300μL烯丙基醇中的溶液中加入甲基哌嗪羰基氯(22mg，0.11mmol)和44μL吡啶。将该反应混合物在室温下搅拌5小时。浓缩，缩合通过硅胶色谱法纯化，使用5％MeOH/DCM作为洗脱液而得到48mg所需产物(产率73％)。通过质谱证实产物M+1＝650。
在室温下将上述化合物(8.2mg，0.012mmol)和Mal-PEG4-肼在5％在无水DCM中的乙酸中的溶液在室温下搅拌20分钟，随后脂肪溶剂并且进行使用乙腈和甲酸铵缓冲水相的反相制备型HPLC而得到2.5mg所需产物，将其通过质谱证实，M+1＝1063。
2.4a二甲基6-元肼连接基的环化速率
将与二甲基6-元肼连接基轭合的多卡米星类似物在pH7.4的缓冲液中孵育24小时并且评价随时间变化的因肼连接基环化产生的环化产物，由此释放游离多卡米星类似物。
Figure A20068004401201491
在pH＝7.4下的24小时内检测最少量的环化产物，表明这种6-元肼连接基的形式表现出相对缓慢的环化速率。
2.4b偕-二甲基6-元肼连接基的环化速率
将与偕-二甲基6-元肼连接基轭合的多卡米星类似物在pH7.4的缓冲液中孵育并且评价随时间变化的因肼连接基环化产生的环化产物，由此释放游离多卡米星类似物。
Figure A20068004401201492
使用6-元偕-二甲基连接基，环化反应十分快速，在几分钟内进行至完全。因此，偕-二甲基6-元肼连接基的环化速率以远快于不含偕-二甲基部分的6-元连接基的速率进行。
实施例3：5-元肼连接基轭合物的合成
3.1化合物4的合成方法
Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸(1)
在安装了搅棒，温度探头和回流冷凝器的25mL烧瓶中向2，2-二甲基-丙二酸(2.0gm，0.0151mol)，亚硫酰氯(1.35ml，0.0182mol)在THF(15ml)中的溶液中加入1滴DMF并且将该反应混合物加热至回流2小时，然后冷却至室温。0℃下将该反应混合物以滴加方式转入Cbz-DMDA(4gm，0.0182mol)和三乙胺(4ml，0.0287mol)在THF(5ml)中的溶液并且在该温度下搅拌30分钟。真空中除去溶剂并且将残余物溶于1N HCl(50ml)并且用DCM(2 x 25ml)促去。用1N NaOH(2 x 25ml)萃取合并的有机层并且用浓HCl酸化合并的水层(pH＜1)并且用EtOAc(2 x 25ml)萃取，用MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩至得到黄白色粘性固体，3.44gm，产率68％。通过质谱证实化合物1：m/z 337.0[M+1]+
HPLC保留时间：3.77分钟(质谱)
Cbz-DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc-N’-甲基肼(2)
在安装了搅棒，温度探头和回流冷凝器的50ml 3N RBF中向化合物1(3.0gm，0.0089mol)，亚硫酰氯(0.78ml，0.0107mol)在THF(25ml)中的溶液中加入1滴DMF并且将该反应混合物加热至回流2小时，然后冷却至室温。0℃下将该反应混合物滴入Boc-N-甲基肼(1.33gm，0.091mol)和三乙胺(3ml，0.0215mol)在THF(25ml)中的溶液并且搅拌30分钟。真空中除去溶剂并且将残余物溶于EtOAc(50ml)，用MgSO4干燥，过滤并且在真空中浓缩至得到棕色油状物。将该油状物溶于EtOA并且通过柱色谱法(100％EtOAc)纯化而得到3.45gm，产率为83％的澄清油状物。通过质谱证实化合物2：m/z 465.2[M+1]
HPLC保留时间：3.97分钟(质谱)
DMDA-2，2-二甲基丙二酸-Boc N’-甲基肼(3)
向化合物2(0.5gm，0.0011mol)在MeOH(30ml)中的溶液中加入10％Pd/C(15mg)并且将该反应体系放在Parr氢化器上30分钟。过滤出催化剂并且在真空中浓缩滤液而得到澄清油状物至得到化合物3(0.38gm)。通过NMR证实产物(1H，CDCl3)：δ1.45(s，15H)2.45(s，3H)2.85(s，6H)，3.16(s，3H)4.64(m，1H)10.6(bs，1H)；NMR(13C，CDCl3)δ24.1，28.57，35.15，35.58，36.66，47.01，48.51，81.11，155.17，173.56，176.24
化合物4的合成
向安装了搅棒的15ml RBF中合并化合物3(50mg，0.1513mmol)，PNPC-1918(20mg，0.0315mmol)和DCM(5ml)。将该溶液搅拌30分钟，然后加入三乙胺(25μL，0.1794mmol)并且将该亮黄色溶液搅拌1小时。在真空中浓缩该溶液至得到黄色油状物并且通过柱色谱法纯化(100％DCM-1∶1 EtOAc/DCM)而得到化合物4，为黄白色固体，22mg，(84％)。通过质谱证实产物：m/z 825.7[M+1]+
HPLC保留时间：7.65分钟(质谱)
3.2具有5-元肼连接基的抗体-药物轭合物的合成
Figure A20068004401201521
该方案表示了抗体连接基-药物复合物的轭合。这些方法为制药领域众所周知的。其它反应位置的实例包括马来酰亚胺类，在配体上带有巯基的卤代乙酰胺类，与配体上的二氯甲烷反应的硫醇类，与配体上的醛类和酮类反应的酰肼类和羟基琥珀酰亚胺类，异氰酸酯类，异硫氰酸酯类和与配体上的氨基反应的酸酐。
实施例4：二硫化物成员连接基轭合物的合成
Figure A20068004401201531
方案1
方案2
Figure A20068004401201541
方案3
4.1a化合物1的合成。向包含PEG4(3.88g，20mmol)的烧瓶中加入氚核B(40％在甲醇中的溶液，1.08ml，0.25mmol)并且在15分钟后丙烯酸叔丁酯(3.62ml，24mmol)。将该混合物在室温下搅拌过夜。在真空中浓缩该混合物并且通过硅胶快速色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为无色油状物(2.35g，36％)。1H NMRδ1.45(s，9H)，2.5(t，2H)，3.65(m，18H)。
4.1b化合物2的合成。向化合物1(1.17g，3.6mmol)在二氯甲烷(10ml)中的溶液中加入三乙胺(532μl，4mmol)和甲磺酰氯(309μl，4mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过硅胶快速色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(1.3g，89％)。1H NMRδ1.43(s，9H)，2.48(t，2H)，3.07(s，3H)，3.62-3.70(m，14H)，3.76(m，2H)，4.37(m，2H)。
4.1c化合物3的合成。向化合物2(1.3g，3.25mmol)在乙醇(10ml)中的溶液中加入叠氮化钠(423mg，6.5mmol)。将由此获得的混合物搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过硅胶快速色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(1.01g，90％)。1H NMRδ1.45(s，9H)，2.50(t，2H)，3.40(t，2H)，3.62-3.73(m，16H)。
4.1d化合物4的合成。向化合物3(470mg，1.35mmol)在包含H2O(25μl)的乙醚(5ml)中的溶液中加入三苯膦(391mg，1.48mmol)。将由此获得的混合物搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过硅胶快速色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(325mg，75％)。1H NMRδ1.45(s，9H)，2.24(bs，2H)，2.51(t，2H)，2.91(t，2H)，3.56(m，2H)，3.63-3.66(m，12H)。3.72(m，2H)。
4.1e化合物5的合成。向3-巯基丙酸(1.22g，11.5mmol)在甲醇(10ml)中的溶液中加入2，2′-二吡啶基二硫化物(3.78g，17.25mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂并且通过硅胶快速色谱法纯化残余物，使用30％在己烷中的乙酸乙酯作为洗脱液而得到标题化合物，为油状物(2.44g，98％)。1H NMRδ2.8(t，2H)，3.05(t，2H)，7.14(m，1H)，7.67(m，2H)，8.48(m，1H)。
化合物5b：1H NMRδ1.43(d，3H)，2.61(m，1H)，2.76(m，1H)，3.40(m，1H)，7.17(m，1H)，7.66(m，2H)，8.45(m，1H)。
4.1f化合物6的合成。将3-甲基苯并噻唑鎓碘化物(1g，3.6mmol)溶于2N氢氧化钠水溶液(10ml)并且将该混合物在100℃下搅拌6小时，然后用6N盐酸水溶液酸化至pH4并且用乙醚萃取。用干燥有机层Na2SO4，在真空中旋转脂肪并且将残余物溶于甲醇(10ml)且加入化合物5a(776mg，3.6mmol)。将该混合物在室温下搅拌1小时。将该混合物浓缩至干并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(482mg，55％)。1H NMR 2.85(m，2H)，2.95(m，5H)，6.64(m，2H)，7.3(m，1H)，7.4(dd，1H)；MS (ES)244(M+H+)，487(2M+H+)。
化合物6b：1H NMRδ1.35(d，3H)，2.48(m，1H)，2.92(s，3H)，3.02(m，1H)，3.34(m，1H)，6.62(m，2H)，7.28(m，1H)，7.44(m，1H)；MS (ES)258(M+H+)。
化合物6c：1H NMRδ1.45(s，6H)，2.70(s，2H)，2.93(s，3H)，6.62(m，2H)，7.24(m，1H)，7.51(m，1H)；MS (ES) 272(M+H+)，294(M+Na+)，310(M+K+)。
4.1g化合物7的合成。向化合物6a(28mg，0.115mmol)在无水甲醇(1ml)中的溶液中加入乙酰氯(13μl，0.173mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用10％在己烷中的乙酸乙酯作为洗脱液而得到标题化合物，为油状物(24mg，83％)。1H NMRδ2.08(m，2H)，2.93(s，3H)，2.95(m，2H)，3.70(s，3H)，6.63(m，2H)，7.28(m，2H)，7.40(m，2H)；MS(ES)258(M+H+)，280(M+Na+)，296(M+K+)。
化合物7b：1H NMRδ1.32(d，3H)，2.45(m，1H)，2.92(s，3H)，2.93(m，1H)，3.35(m，1H)，3.67(s，3H)，6.62(m，2H)，7.26(m，1H)，7.44(m，1H)；MS (ES) 272(M+H+)。
化合物7c：1H NMRδ1.42(s，6H)，2.66(s，2H)，2.93(s，3H)，3.62(s，3H)，6.62(m，2H)，7.24(m，1H)，7.51(m，1H)；MS (ES)286(M+H+)，308(M+Na+)，324(M+K+)。
4.1h化合物8的合成。在0℃下向化合物7a(24mg，0.093mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入三光气(28mg，0.093mmol)和三乙胺(37μl，0.28mmol)。将该混合物搅拌1小时。将该混合物浓缩至干并且将残余物不经进一步纯化用于下一步。
将粗物质溶于二氯甲烷(1ml)和并且加入化合物8a(35mg，0.074mmol)和DMAP(23mg，0.190mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(53mg，76％)。1H NMRδ2.70(s，3H)，2.74(m，2H)，3.06(m，2H)，3.34(m，1H)，3.35和3.36(2s，3H)，3.63和3.64(2s，3H)，3.86(m，1H)，3.88(s，3H)，3.93和3.94(2s，3H)，4.48(m，1H)，4.55(m，1H)，4.79(m，1H)，7.05(m，1H)，7.11(m，1H)，7.26-7.52(m，5H)，7.85(d，1H)，8.1(b s，1H)，8.98和9.08(2s，1H)；MS(ES)753(M+H+)。
化合物8b：1H NMRδ1.38(m，3H)，2.52(m，1H)，2.69(m，3H)，2.79(m，1H)，3.33(m，1H)，3.37(2s，3H)，3.64(m，3H)，3.88(s，3H)，3.84-3.90(m，1H)，3.93(2s，3H)，4.48(m，1H)，4.57(m，1H)，4.78(m，1H)，7.06(m，1H)，7.12(m，1H)，7.26-7.43(m，3H)，7.50(m，2H)，7.86(m，1H)，8.1(bs，1H)，8.99，9.08，9.13和9.22(4s，1H)；MS (ES) 767(M+H+)。
化合物8c：1H NMRδ1.44(m，6H)，2.63(d，2H)，2.70(s，3H)，3.35(m，1H)，3.38和3.39(2s，3H)，3.63和3.64(2s，3H)，3.87(m，1H)，3.88(s，3H)，3.93和3.94(2s，3H)，4.48(m，1H)，4.55(m，1H)，4.79(m，1H)，7.05(m，1H)，7.12(m，1H)，7.31-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.89(d，1H)，8.1(bs，1H)，9.12和9.23(2s，1H)；MS (ES) 781(M+H+)。
4.li化合物9和10的合成。向化合物8a(0.1mg)在PBS缓冲溶液(pH7.2)/甲醇(300μl，2/1)中的溶液中加入20mM DTT溶液(100μl，15当量)并且通过HPLC监测反应进程。反应进行过快而难以检测，几秒钟后反应已经完成而定量得到产物化合物10。未检测到反应中间体化合物9。
4.1j化合物11的合成。向化合物6a(66mg，0.2mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入DCC(47mg，0.22mmol)，HOBt(31mg，0.22mmol)和化合物4(50mg，0.2mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(70mg，62％)。1HNMRδ1.44(s，9H)，2.51(t，1H)，2.63(t，2H)，2.93(d，3H)，3.01(t，2H)，3.45(m，2H)，3.55(m，2H)，3.64(m，12H)，3.71(t，2H)，5.01(bs，1H)，6.38(bt，1H)，6.62(m，2H)，7.27(m，1H)，7.43(dd，1H)。MS(ES) 491(M-56+H+)，513(M-56+Na+)，547(M+H+)，569(M+Na+)
化合物11b：1H NMRδ1.34(d，3H)，1.45(s，9H)，2.30(m，1H)，2.5(t，2H)，2.69(m，1H)，2.93(d，3H)，3.37-3.55(m，5H)，3.63(m，12H)，3.71(t，2H)，4.99(bs，1H)，6.13(bt，1H)，6.62(m，2H)，7.25(m，1H)，7.48(dd，1H)。MS (ES) 505(M-56+H+)，527(M-56+Na+)，543(M-56+K+)，561(M+H+)，583(M+Na+)。
化合物11c：1.43(s，3H)，1.45(s，9H)，2.46(s，2H)，2.5(t，2H)，2.92和2.94(2s，3H)，3.33(m，2H)，3.47(t，2H)，3.63(m，12H)，3.70(t，2H)，6.06(bt，1H)，6.63(m，2H)，7.25(m，1H)，7.54(d，1H)；MS(ES)519(M-56+H+)，541(M-56+Na+)，575(M+H+)，597(M+Na+)。
4.1k化合物12的合成：在0℃下向化合物11a(20mg，0.037mmol)在二氯甲烷(1ml)中的混悬液中加入三乙胺(15μl，0.11mmol)和2N光气在甲苯中的溶液(55μl，0.11mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌1小时。浓缩该混合物并且将残余物溶于二氯甲烷(1ml)且加入化合物10(14mg，0.030mmol)和DMAP(9mg，0.076mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到标题化合物，为黄色油状物(23mg，74％)。1H NMRδ1.44(s，9H)，2.49(t，2H)，2.67(m，2H)，2.65和2.67(2s，3H)，3.07(m，2H)，3.33(s，3H)，3.40(m，3H)，3.51(m，2H)，3.60(m，12H)，3.69(m，2H)，3.87(s，3H)，3.92(s，3H)，3.93(m，1H)，4.52(m，2H)，4.78(m，1H)，6.65，6.74和6.97(3b t，1H)，7.06(d，1H)，7.12(s，1H)，7.29-7.42(m，3H)，7.50(m，2H)，7.87(d，1H)，8.10和8.15(2b s，1H)，9.79和9.58(2s，1H)；MS (ES)986(M+H+-56)，1042(M+H+)。
化合物12b：1H NMRδ1.32(m，3H)，1.44(s，9H)，2.39(m，1H)，2.48(m，2H)，2.60(m，1H)，2.67和2.69(2s，3H)，3.32和3.35(2s，3H)，3.38-3.72(m，20H)，3.88(s，3H)，3.93(s，3H)，3.94(m，1H)，4.52(m，2H)，4.77(m，1H)，6.53，6.67和6.72(3bt，1H)，7.06(d，1H)，7.12(s，1H)，7.29-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.88(d，1H)，8.12和8.25(2bs，1H)，9.13，9.36，10.08和10.21(4s，1H)；MS(ES) 1000(M+H+-56)，1056(M+H+)，1078(M+Na+)，1084(M+K+)。
化合物12c：1H NMRδ1.30-1.42(m，3H)，1.44(s，9H)，2.45-2.52(m，4H)，2.69和2.72(2s，3H)，3.34和3.35(2s，3H)，3.39-3.72(m，19H)，3.88(s，3H)，3.925和3.93(2s，3H)，3.94(m，1H)，4.53(m，2H)，4.80(m，1H)，6.63(m，1H)，7.06(dd，1H)，7.13(d，1H)，7.25-7.39(m，3H)，7.50(m，2H)，7.89(d，1H)，8.10和8.27(2bs，1H)，9.99和10.191(2s，1H)；MS(ES)1014(M+H+-56)，1070(M+H+)，1108(M+K+)。
4.1l化合物13的合成。将化合物12a(23mg，0.022mmol)溶于三氟乙酸和二氯甲烷的溶液(1ml，1/1)并且将该混合物在室温下搅拌30分钟并且浓缩至得到产物(21mg，100％)1H NMRδ2.60(t，2H)，2.67和2.68(2s，3H)，2.75(m，2H)，3.07(m，2H)，3.34(s，3H)，3.38-3.64(m，21H)，3.76(t，2H)，3.88(s，3H)，3.92(s，3H)，3.93(m，1H)，4.53(m，2H)，4.78(m，1H)，7.06(d，1H)，7.13(s，1H)，7.31-7.43(m，3H)，7.49(m，2H)，7.87(d，1H)，8.10和8.15(2bs，1H)，9.44和9.65(2s，1H)；MS(ES) 986(M+H+)，1008(M+Na+)，1024(M+K+)。
化合物13b：1H NMRδ1.34(m，3H)，2.56(m，1H)，2.62(m，2H)，2.68(m，3H)，2.8(m，1H)，3.35-3.36(2s，3H)，3.40-3.70(m，18H)，3.77(t，2H)，3.88(s，3H)，3.93和3.95(2s，3H)，3.94(m，1H)，4.54(m，2H)，4.79(m ，1H)，7.07(d，2H)，7.13(s，1H)，7.30-7.42(m，3H)，7.49(m，2H)，7.88(d，1H)，8.11和8.25(2bs，1H)，9.22，9.37，9.80和9.92(4s，1H)；MS(ES)1000(M+H+)，1022(M+Na+)，1038(M+K+)。
化合物13c：1H NMR δ1.30-1.45(m，6H)，2.54(m，2H)，2.61(m，2H)，2.68和2.69(2s，3H)，3.35-3.36(2s，3H)，3.40-3.70(m，17H)，3.77(t，2H)，3.88(s，3H)，3.92和3.93(2s，3H)，3.94(m，1H)，4.50(m，2H)，4.80(m，1H)，7.08(m，2H)，7.12(d，1H)，7.29-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.89(m，1H)，8.10和8.25(2bs，1H)，9.88和10.04(2s，1H)；MS(ES)1014(M+H+)，1036(M+Na+)，1054(M+K+)。
4.1m化合物14a的合成。向化合物13a(5.4mg，0.0054mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入PS-碳二亚胺(11.5mg，0.94mmol/g，0.0108mmol)和PS-DMAP(7.2mg，1.49mmol/g，0.0108mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜并且浓缩至得到产物。MS(ES)1082(M+H+)。
4.2与Tubulysin A轭合的二硫化物连接基的合成
Figure A20068004401201621
可以使用上文所示的机制使药物Tubulysin A与本发明的二硫化物连接基轭合。可以使用类似的反应方案合成本发明的其它药物和其它连接基。
4.3二硫化物连接基的环化速率
Figure A20068004401201631
向化合物8a(0.1mg)在PBS缓冲溶液(pH7.2)/甲醇(300μl，2/1)中的溶液中加入20mM DTT溶液(100μl，15当量)并且通过HPLC监测反应进程。反应进行快速环化，几秒钟后反应已经完成而定量得到产物10。未检测到反应中间体化合物9。
实施例5
Figure A20068004401201632
Figure A20068004401201641
化合物32的合成。使HCl气体通过化合物30(120mg，0.28mmol)在乙酸乙酯(10ml)中的溶液中发泡5分钟。将该反应混合物在RT下再搅拌30分钟且然后浓缩该混合物。向该反应混合物中加入乙醚并且用过滤漏斗收集白色沉淀。将固体在真空中干燥过夜而得到100mg所需产物，通过LC-MS(ESI)324(M+H+)证实并且不经进一步纯化用于下一步。向该化合物(100mg，0.24mmol)在DMF(5ml)中的溶液中加入化合物31(65mg，0.26mmol)，HATU(100mg，0.26mmol)和TEA(91uL，0.52mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂并且用半制备型HPLC纯化残余物，使用0.1％在水和乙腈中的TFA作为洗脱液而得到化合物32，为油状物(110mg，80％)。通过LC-MS(ESI)555(M+H+)证实所需产物。
化合物33的合成。将化合物32(110mg，0.2mmol)和钯/活性炭(20mg)在DCM(10ml)和甲醇(5ml)中的溶液在氢气压力中和室温下搅拌12小时。过滤出钯并且浓缩该反应混合物且用半制备型HPLC纯化残余物，使用0.1％在水和乙腈中的TFA作为洗脱液而得到化合物，为油状物(80mg，78％)LC-MS(ESI)465(M+H+)。在0℃下向残余物(80mg，0.17mmol)在二氯甲烷(10ml)和THF(5ml)中的溶液中加入PNPCl(氯甲酸4-硝基苯酯)(137mg，0.68mmol)和三乙胺(144uL，1.02mmol)。将由此获得的混合物在0℃下搅拌30分钟且然后在室温下搅拌12小时。在真空中浓缩该反应混合物并且使用乙醚(100ml)沉淀残余物而得到化合物33，为黄色固体(90mg，82％)，将其在真空中干燥并且通过LC-MS(ESI)631(M+H+)证实。
化合物34的合成：向2-溴乙胺溴化物(5g，24.4mmol)在DMF(50ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(8.5ml，48.8mmol)和氯甲酸苄酯(3.48ml，24.4mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。浓缩该反应混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用乙酸乙酯/己烷(3/7)作为洗脱液而得到所需化合物34，为油状物(4g，64％)。1HNMR(CDCl3)δ3.54(bs，2H)，3.61(bs，2H)，5.12(s，2H)，7.36(m，5H)。
化合物35的合成：向化合物34(3.34g，12.99mmol)和缬氨酸叔丁酯(3.27g，15.59mmol)在DMF(50ml)中的溶液中加入碳酸钾(5.39g，38.97mmol)和碘化钾(2.59g，15.59mmol)。将由此获得的混合物在100℃下搅拌过夜。浓缩该反应混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物。使用乙酸乙酯/己烷(2/8)作为洗脱液而得到所需化合物35，为油状物(3.12g，69％)。1H NMR(CDCl3)δ0.92(m，6H)，1.46(s，9H)，1.86(m，1H)，2.53(m，1H)，2.80(m，2H)，3.18(m，1H)，3.31(m，1H)，5.10(s，2H)，5.25(bs，1H)，7.36(m，5H)；LC-MS(ESI)296(M+H-叔丁基+)，352(M+H+)。
化合物36的合成。将化合物35(3.4g，9.72mmol)和钯/活性炭(200mg)在甲醇(30ml)中的溶液放入在氢气压力中和室温下。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。过滤出钯并且将该反应混合物浓缩至干而得到所需化合物36，为油状物(2.1g，98％)
化合物37的合成。在0℃下向化合物36(2.1g，9.72mmol)在二氯甲烷(30ml)中的溶液中加入FmocOSu(9-芴基甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)(3.28g，9.72mmol)。将由此获得的混合物在0℃下搅拌2小时。用旋转蒸发器除去溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷，随后使用0.5％在二氯甲烷中的甲醇且最终使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到所需化合物37，为无色油状物(2.55g，60％)。1H-NMR(CDCl3)δ0.95(ft，6H)，1.48(s，9H)，1.90(m，1H)，2.55(m，1H)，2.82(m，2H)，3.18(m，1H)，3.32(m，1H)，4.24(m，1H)，4.37(m，2H)，5.40(bs，1H)，7.30(m，2H)，7.39(m，2H)，7.60(d，2H)，7.75(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)383(M+H-叔丁基+)，440(M+H+)，462(M+Na+)，478(M+K+)。
化合物38的合成。使HCl气体通过化合物37(177mg，0.4mmol)在四氢呋喃-水(3/1，8ml)中的溶液发泡5分钟。将该反应混合物在37℃下搅拌过夜，然后将该混合物浓缩至干而得到所需化合物38，为固体(168mg，98％)，将其通过LC-MS(ESI)383(M+H+)，405(M+Na+)证实并且不经进一步纯化用于下一步。LC-MS(ESI)383(M+H+)，405(M+Na+)。
化合物39的合成。向化合物5(525mg，0.79mmol)在DMF(5ml)中的溶液中加入N-Boc-N，N’-二甲基乙二胺(177mg，0.94mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。除去溶剂并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用二氯甲烷，随后使用2％在二氯甲烷中的甲醇且最终使用5％在二氯甲烷中的甲醇作为洗脱液而得到所需化合物39，为无色油状物(364mg，65％)。1H-NMR(CD3oD)δ1.39(s，9H)，1.56(m，2H)，1.70(m，1H)，1.82(m，1H)，2.70和2.82(2s，3H)，2.90(s，3H)，3.09(m，1H)，3.17(m，1H)，3.30-3.37(m，4H)，4.16(t，1H)，4.27(m，1H)，4.33(d，2H)，5.02(bs，2H)，7.24-7.36(m，6H)，7.51-7.65(m，4H)，7.74(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)618(M+H-Boc+)，662(M+H-叔丁基+)，718(M+H+)，740(M+Na+)，1435(2M+H+)。
化合物40的合成。如上述对化合物17a所述制备化合物40，产率为98％。LC-MS(ESI)396(M+H-Boc+)，496(M+H+)，517(M+Na+)，533(M+K+)，992(2M+H+)。
化合物41的合成。向化合物40(138mg，0.28mmol)在DMF(4ml)中的溶液中加入化合物38(110mg，0.28mmol)，HOBt(36mg，0.28mmol)和EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(50mg，0.28mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物，使用0.1％在水和乙腈中的TFA作为洗脱液而得到所需化合物41，为油状物(178mg，70％)。1H-NMR(CD3OD)δ1.04和1.11(2d，6H)，1.40(s，9H)，1.58(m，2H)，1.77(m，1H)，1.88(m，1H)，2.24(m，1H)，2.72和2.84(2s，3H)，2.92(s，3H)，3.10-3.18(m，4H)，3.35-3.46(m，6H)，3.82(d，1H)，4.22(t，1H)，4.41(m，2H)，4.59(m，1H)，5.04(bs，2H)，7.28-7.40(m，6H)，7.55(m，2H)，7.63(m，2H)，7.78(d，2H)ppm；LC-MS(ESI)760(M+H-Boc+)，804(M+H-叔丁基+)，860(M+H+)，882(M+Na+)，899(M+K+)。
化合物42的合成。如上述对化合物17a所述制备化合物42，产率为98％。LC-MS(ESI)538(M+H-Boc+)，582(M+H-叔丁基+)，638(M+H+)，660(M+Na+)。
化合物43的合成。在0℃下向化合物42(23mg，0.036mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入GMBS(N-(马来酰亚氨基丁酰氧基)琥珀酰亚胺酯)(14mg，0.05mmol)和二异丙基乙胺(8.4μl，0.05mmol)。将该混合物缓慢温至室温并且再持续搅拌30分钟。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物，使用0.1％在水和乙腈中的TFA作为洗脱液而得到所需化合物43，为油状物(26mg，79％)。1H-NMR(CD3OD)δ1.06和1.12(2d，6H)，1.41(s，9H)，1.59(m，2H)，1.78(m，1H)，1.86-1.93(m，3H)，2.24(m，3H)，2.74和2.84(2s，3H)，2.93(bs，3H)，3.13-3.22(m，4H)，3.40-3.60(m，8H)，3.82(d，1H)，4.60(m，1H)，5.05(bs，2H)，6.80(s，2H)，7.32(m，2H)，7.57(d，2H)，8.78(d，1H)ppm；LC-MS(ESI)703(M+H-Boc+)，747(M+H-叔丁基+)，803(M+H+)，825(M+Na+)，841(M+K+)。
化合物44的合成。如上述对化合物15a所述制备化合物44，产率为98％。LC-MS(ESI)703(M+H+)，725(M+Na+)。
化合物45的合成。在室温下向化合物44(15mg，0.016mmol)和化合物33(10mg，0.016mmol)在DMF(0.8ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(5.5μl，0.032mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌过夜。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物，使用0.1％在水和乙腈中的TFA作为洗脱液而得到所需化合物45，为油状物(10mg，45％)。1H-NMR(CD3OD)δ1.02-1.13(m，6H)，1.55(m，2H)，1.74(m，1H)，1.84-1.92(m，3H)，2.20-2.27(m，3H)，2.95-3.14(m，16H)，3.47-3.84(m，12H)，3.98(m，1H)，4.2-4.34(m，3H)，4.57(m，1H)，4.69(m，2H)，5.07-5.17(m，2H)，6.78(s，2H)，7.16-7.23(m，3H)，7.30(m，1H)，7.38-7.47(m，3H)，7.52-7.58(m，3H)，7.81-7.92(m，2H)，8.25(bs，1H)ppm；LC-MS(ESI)1194(M+H+)，1215(M+Na+)，1233(M+K+)。
实施例6
Figure A20068004401201691
化合物(2)的合成。在真空中给1(100mg，0.24mmol)和10％Pd-C(35mg)在MeOH/CH2Cl2(1/2，10ml)中的溶液脱气40s。将所得混合物放入氢气环境中并且在25℃下搅拌7小时。将该反应混合物通过C盐过滤(CH2Cl2洗涤)。在真空中除去溶剂。进行硅胶色谱，使用EtOAc/己烷(2/8)洗脱而得到2(77mg，98％)。1NMR DMSO-d6)δ10.36(s，1H)，8.04(d，1H，J＝8.2Hz)，7.72(d，1H，J＝8.2Hz)，7.61(br s，1H)，7.45(t，1H，J＝8.4Hz)，7.261(t，1H，J＝8.4Hz)，4.06(m，4H)，3.73(m，1H)，1.52(s，9H)。
化合物(4)的合成。将2(35mg，0.1mmol)在4M HCl-EtOAc(5ml)中的溶液在25℃下和Ar环境中搅拌30分钟。在真空中除去溶剂。向残余物中加入5-乙酰基二氢茚酮-2-甲酸(24.4mg，0.12mmol)。加入EDC(22.9mg，0.12mmol)在DMF(3ml)中的溶液并且将该法语化合物在25℃下搅拌5小时。除去溶剂。对粗产物进行硅胶色谱，使用10％在CH2Cl2中的MeOH洗脱而得到4(40.7mg，93％)。1HNMR DMSO-d6)δ12.13(s，1H)，10.47(s，1H)，8.45(s，1H)，8.10(d，1H，J＝8.4Hz)，7.96(br s，1H)，7.85(d，2H，J＝8.4Hz)，7.54(d，1H，J＝8.4Hz)，7.51(t，1H，J＝8.2Hz)，7.36(t，1H，J＝7.6)，7.35(s，1H)，4.81(t，1H，11.2Hz)，4.54(dd，1H，8.8Hz)，4.23(m，1H)，4.01(dd，1H，J＝10.2Hz)，3.86(dd，1H，J＝10.7Hz)，2.61(s，3H)。
化合物(5)的合成。将4-甲基-1-哌嗪羰基氯盐酸盐(19.9mg，0.1mmol)加入到4(20mg，0.05mmol)和无水吡啶(25μml，0.3mmol)在3％干二氯甲烷中的烯丙基醇(4ml)中的溶液中并且将该混合物搅拌16小时。对粗产物进行硅胶纯化而得到5(23.6mg，91％)。1NMR DMSO-d6)δ12.03(s，1H)，8.41(s，1H)，8.21(s，1H)，8.01(d，1H，J＝8.4Hz)，7.88(d，1H，J＝8.4Hz)，7.82(dd，1H，J＝8.4Hz)，7.58(t，1H，J＝8.1Hz)，7.51(d，1H，J＝8.4Hz)，7.46(t，1H，J＝7.6Hz)，7.37(s，1H)，4.86(t，1H，J＝10.8Hz)，4.57(dd，1H，J＝10.8Hz)，4.38(m，1H)，4.06(dd，1H，J＝10.8Hz)，3.86(dd，1H，J＝11Hz)，3.41(br，4H)，3.29(br，4H)，2.82(s，3H)，2.57(s，3H)。
化合物(7)的合成。将5(13mg，24μmol)和连接物6(16.9mg，31μmol)在5％干二氯甲烷中的乙酸(1ml)中的溶液在25℃下搅拌30分钟。在真空中完全除去溶剂并且通过HPLC纯化(SymmetryPrep C18，7μm，19 x 150mm柱)而得到7(18.5mg，81％)。对计算C48H57ClN8O11的分析值MS：(M+H)m/z 958.38，测定值958.10。
实施例7
Figure A20068004401201711
Figure A20068004401201721
化合物1的合成
向2-溴乙胺溴化物(5g，24.4mmol)在DMF(50ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(8.5ml，48.8mmol)和氯甲酸苄酯(3.48ml，24.4mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。浓缩该反应混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用乙酸乙酯/己烷(3/7)作为作为梯度而得到所需化合物1，为油状物(4g，64％)。1H NMR(CDCl3)δ3.54(bs，2H)，3.61(bs，2H)，5.12(s，2H)，7.36(m，5H)。
化合物2的合成
向化合物1(3.34g，12.99mmol)和缬氨酸叔丁酯(3.27g，15.59mmol)在DMF(50ml)中的溶液中加入碳酸钾(5.39g，38.97mmol)和碘化钾(2.59g，15.59mmol)。将由此获得的混合物在100℃下搅拌过夜。浓缩该反应混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物。使用乙酸乙酯/己烷(2/8)作为梯度而得到所需化合物2，为油状物(3.12g，69％)。1H NMR(CDCl3)δ0.92(m，6H)，1.46(s，9H)，1.86(m，1H)，2.53(m，1H)，2.80(m，2H)，3.18(m，1H)，3.31(m，1H)，5.10(s，2H)，5.25(bs，1H)，7.36(m，5H)；LC-MS(ESI)296(M+H-叔丁基+)，352(M+H+)。
化合物3的合成
将化合物2(3.4g，9.72mmol)和钯/活性炭(200mg)在甲醇(30ml)中的溶液放入在氢气压力中和室温下。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。过滤出钯并且将该反应混合物浓缩至干而得到所需化合物3，为油状物(2.1g，98％)。1H NMR(CD3OD)δ0.94(m，6H)，1.47(s，9H)，1.63(bs，2H)，1.90(m，1H)，2.47(m，1H)，2.73(m，2H)。
化合物4的合成
在0℃下向化合物3(2.1g，9.72mmol)在二氯甲烷(30ml)中的溶液中加入FmocOSu(9-芴基甲氧羰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)(3.28g，9.72mmol)。将由此获得的混合物在0℃下搅拌2小时。将该混合物浓缩至干并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用100％二氯甲烷，随后使用0.5％在二氯甲烷中的甲醇且最终使用1％在二氯甲烷中的甲醇作为梯度而得到所需化合物4，为无色油状物(2.55g，60％)1H-NMR(CDCl3)δ1.03(d，3H)，1.14(d，3H)，1.52(s，9H)，2.28(m，1H)，3.14(m，2H)，3.46(m，2H)，3.89(d，1H)，4.24(m，1H)，4.44(m，2H)，7.29(m，2H)，7.40(m，2H)，7.64(m，2H)，7.80(d，2H)；LC-MS(ESI)383(M+H-叔丁基+)，440(M+H+)，462(M+Na+)，478(M+K+)。
化合物5的合成
使HC l气体通过化合物4(177mg，0.4mmol)在四氢呋喃-水(3/1，8ml)中的溶液发泡5分钟。将该反应混合物在37℃下搅拌过夜，然后将该混合物浓缩至干而得到所需化合物5，为固体(168mg，98％)，将其不经进一步纯化用于下一步。1H-NMR(CDCl3)δ1.04(d，3H)，1.14(d，3H)，2.32(m，1H)，3.18(m，2H)，3.46(m，2H)，3.95(d，1H)，4.22(m，1H)，4.42(m，2H)，7.29(m，2H)，7.39(m，2H)，7.64(m，2H)，7.79(d，2H)；LC-MS(ESI)383(M+H+)，405(M+Na+)。
化合物23的合成
将乙基-5-硝基吲哚-2甲酸酯(2g，8.5mmol)和钯/活性炭(200mg)在50％二氯甲烷中的甲醇(100ml)中的溶液放入在氢气压力中和室温下。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。过滤出钯并且将该反应混合物浓缩至干而得到化合物23，为无色油状物(1.68g，97％)。1HNMR(CD3OD)δ1.38(t，3H)，4.34(q，2H)，6.86(dd，1H)，6.95(d，1H)，6.98(d，1H)，7.25(d，1H)。
化合物24的合成
向化合物23(300mg，1.47mmol)在二氯甲烷(5ml)中的溶液中加入Boc2O(385mg，1.76mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌2小时。浓缩该反应混合物并且通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用10％在己烷中的乙酸乙酯梯度而得到化合物24，为白色固体(272mg，61％)。1H NMR(CD3OD)δ1.39(t，3H)，1.52(s，9H)，4.37(q，2H)，7.07(s，1H)，7.23(dd，1H)，7.34(d，1H)，7.68(bs，1H)。
化合物25的合成
将化合物24(100mg，0.33mmol)在乙醇(3ml)中的溶液加入到LiOH(12mg，0.49mmol)在水(1ml)中的溶液中。将由此获得的混合物在50  C下搅拌2小时。浓缩该反应混合物至干而得到油状物。将残余物溶于水并且用10％HCl酸化至pH3，随后用EtOAc萃取。用干燥有机溶液Na2SO4，过滤并且浓缩至干而得到化合物25，为无色油状物(85mg，92％)。1H NMR(CD3OD)δ1.51(s，9H)，7.07(d，1H)，7.23(dd，1H)，7.33(d，1H)，7.68(bs，1H)。
化合物26的合成
在室温下向Fmoc-Cit-OH(206mg，0.52mmol)在30％二氯甲烷中的DMF(3ml)中的溶液中加入EDC(120mg，0.62mmol)，HOBt(84mg，0.62mmol)和苯甲酸叔丁基-4-氨基酯(120mg，0.62mmol)。将由此获得的混合物搅拌10分钟，然后向该混合物中加入氯化铜(84mg，0.62mmol)。将该混合物搅拌过夜。将该混合物浓缩至干且然后通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用5％在二氯甲烷中的甲醇作为梯度为得到化合物26，为无色油状物(184mg，62％)。1H NMR(CD3OD)δ1.53-1.58(m，2H)，1.57(s，9H)，1.71(m，1H)，1.82(m，1H)，3.08(m，1H)，3.19(m，1H)，4.21(m，1H)，4.28(m，1H)，4.38(m，2H)，7.28-7.39(m，3H)，7.49(m，2H)，7.56-7.86(m，5H)，7.89(m，2H)；LC-MS(ESI)，573(M+H+)，595(M+Na+)，611(M+K+)。
化合物27的合成
在室温下向化合物26(1g，1.75mmol)在DMF(18ml)中的溶液中加入哌啶(2ml)。将由此获得的混合物在室温下搅拌1小时。将该混合物浓缩至干且然后通过快速色谱法纯化残余物，使用100％二氯甲烷，随后使用5％在二氯甲烷中的甲醇且最终使用20％在二氯甲烷中的甲醇作为梯度而得到无色油状物(561mg，92％)。
在室温下向该油状物(561mg，1.6mmol)在DMF(10ml)中的溶液中加入二异丙基乙胺(679μL，3.9mmol)，化合物5(509mg，1.3mmol)(参见用于制备的实施例1)和HATU(494mg，1.3mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌3小时。将该混合物浓缩至干且然后通过快速硅胶色谱法纯化残余物，使用5％在二氯甲烷中的甲醇作为梯度而得到化合物27，为无色油状物(691mg，65％)。1H NMR(CD3OD)δ1.36(dd，6H)，1.58-1.62(m，2H)，1.6(s，9H)，1.71(m，1H)，1.82(m，1H)，2.00(m，1H)，2.65(m，2H)，3.2-3.3(m，4H)，3.70(m，1H)，4.21(m，1H)，4.28(m，2H)，4.38(m，2H)，4.60(m，1H)，7.28-7.39(m，4H)，7.60-7.70(m，4H)，7.8(d，2H)，7.89(d，2H)；LC-MS(ESI)，716(M+H+)，737(M+Na+)，753(M+K+)。
化合物28的合成
在室温下向化合物27(300mg，0.45mmol)在DMF(9ml)中的溶液中加入哌啶(1ml)。将由此获得的混合物在室温下搅拌1小时。然后将该混合物浓缩至干而得到油状物，从乙醚(20ml)中析出。过滤该物质而得到白色固体(186mg，84％)。
向游离胺(32mg，0.065mmol)在二氯甲烷(1ml)中的溶液中加入MAL-PEG4-NH酯(50mg，0.097mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌4小时。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物而得到化合物28，为油状物(47mg，95％)。1H NMR(CD3OD)δ1.10和1.15(2d，6H)，1.58-1.62(m，2H)，1.6(s，9H)，1.75(m，1H)，1.90(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(t，2H)，2.5(t，2H)，3.10-3.25(m，4H)，3.30(m，2H)，3.45-3.65(m，16H)，3.75(m，4H)，3.85(d，1H)，4.65(m，1H)，6.80(s，2H)，7.67(d，2H)，7.90(d，2H)，8.80(d，1H)，10.20(s，1H)；LC-MS(ESI)，891(M+H+)，913(M+Na+)，929(M+K+)。
化合物29的合成
在室温下向化合物28(47mg，0.062mmol)在氯甲烷(0.5ml)中的溶液中加入三氟乙酸(0.5ml)。将由此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。然后将该混合物浓缩至干而得到化合物29，为油状物，将其不经进一步纯化用于下一步(40mg，92％)。1H NMR(CD3OD)δ1.10和1.15(2d，6H)，1.60(m，2H)，1.80(m，1H)，1.90(m，1H)，2.25(m，1H)，2.45(t，2H)，2.5(t，2H)，3.10-3.25(m，4H)，3.30(m，2H)，3.45-3.65(m，16H)，3.75(m，4H)，3.85(d，1H)，4.65(m，1H)，6.80(s，2H)，7.67(d，2H)，7.95(d，2H)，8.80(d，1H)；LC-MS(ESI)，836(M+H+)，858(M+Na+)，874(M+K+)。
化合物31的合成
在室温下向30(100mg，0.2mmol)在EtOAc(2ml)中的溶液中加入浓HBr在EtOAc中的溶液(3ml)。1小时后Boc脱保护完成。过滤沉淀的物质(定量产率)。然后将TFA盐化的胺溶于DMF(3ml)。向该溶液中加入化合物25(55mg，0.2mmol)，二异丙基乙胺(173μL，1mmol)和HATU(79mg，0.2mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌3小时。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物而得到化合物31，为白色固体(86mg，57％)。1H NMR(CD3OD)δ1.54(s，9H)，2.91(s，3H)，3.10-3.60(m，8H)，3.72(m，1H)，3.97(m，1H)，4.30-4.60(m，3H)，6.94(b s，1H)，7.05(m，1H)，7.12(d，1H)，7.45(m，2H)，7.68(d，1H)，7.75(bs，1H)，7.86(d，1H)，8.23(bs，1H)；LC-MS(ESI)，562(M+H-100+)，606(M+H-56+)，662(M+H+)，685(M+Na+)，701(M+K+)。
化合物32的合成
在室温下向化合物31(30mg，0.039mmol)在二氯甲烷(0.5ml)中的溶液中加入茴香醚(100μL)和三氟乙酸(0.4ml)。将由此获得的混合物在室温下搅拌30分钟。然后将该混合物浓缩至干而得到油状物，将其不经进一步纯化用于下一步。
向该油状物在DMF(1ml)中的溶液中加入化合物29(36mg，0.039mmol)，二异丙基乙胺(40μL，0.23mmol)和HATU(15mg，0.039mmol)。将由此获得的混合物在室温下搅拌1小时。蒸发溶剂并且通过半制备型HPLC纯化残余物而得到化合物32，为油状物(36mg，60％)。1H NMR(CD3OD)δ1.09和1.15(2d，6H)，1.62(m，2H)，1.81(m，1H)，1.93(m，1H)，2.27(m，1H)，2.45(t，2H)，2.51(t，2H)，2.98(s，.3H)，3.13-3.25(m，4H)，3.47-3.62(m，24H)，3.76(m，4H)，3.82(m，1H)，3.85(d，1H)，4.20(m，1H)，4.55-4.70(m，4H)，6.79(s，2H)，7.06(s，1H)，7.36(bs，1H)，7.43-7.54(m，2H)，7.72-7.81(m，3H)，7.91(m，3H)，8.05(s，1H)，8.25(bs，1H)，8.82(d，1H)，10.25(s，1H)；LC-MS(ESI)，691(M+2H+)/2，1381(M+H+)，1419(M+K+)。
实施例8：增殖测定
使用充分建立的3H-胸苷增殖测定法测定本发明细胞毒性化合物的生物活性。这是一种对细胞增殖定量的便利方法，因为它通过测定掺入的外源性放射性标记的3H-胸苷来评价DNA合成。该测定法高度可再现并且可以适应于大量化合物。
为了进行本测定，在包含10％加热灭活的胎牛血清(FCS)的RPMI中培养前髓细胞性白血病细胞HL-60。在本研究的当天，收集细胞，洗涤并且以0.5 x 106个细胞/ml的浓度重新悬浮于包含10％FCS的RPMI中。将100μl细胞混悬液加入到96孔平板中。制备多柔比星(作为阳性对照)或测试化合物的顺序稀释液(3-倍递增)并且每孔加入100μl化合物。最终每孔加入10μl 100μCi/ml 3H-胸苷并且将平板孵育24小时。使用96孔采集器(Packard Instruments)收集平板并且用Packard Top Count计数器计数。使用Prism软件使4参数逻辑曲线与作为药物摩尔浓度的函数的3H-胸苷掺入量拟合以便测定IC50值。
本发明的化合物在上述测定中一般具有约1pM-约100nM，优选约10pM-约10nM的IC50值。
实施例9：药物-连接基分子与抗体的轭合
本实施例描述了使本发明药物-连接基分子(任选包括其它基团，诸如间隔基，反应性官能团等)与作为靶向剂X4的抗体轭合的反应条件和方法。指定所述的条件和方法仅为典型的而非限制性的。其它用于轭合药物-连接基分子与抗体的手段为本领域中公知的。
本文所述的轭合方法基于通过抗体的赖氨酸与2-亚氨基硫戊环，随后使药物-连接基分子与活性马来酰亚胺基反应将游离巯基引入抗体。最初将轭合的抗体与包含50mM NaCl，2mM DTPA，pH8.0的pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液进行缓冲液交换并且浓缩至5-10mg/ml。通过将2-亚氨基硫戊环添加到抗体中进行硫戊环化。在预实验中测定加入的2-亚氨基硫戊环的量并且根据抗体与抗体的不同而改变。在预实验中，将滴定增加量的2-亚氨基硫戊环加入到抗体中并且在与抗体在室温下孵育1小时后，使用Sephadex G-25柱使抗体脱盐入50mM pH6.0的HEPES缓冲液，且通过与二硫代二吡啶(DTDP)反应快速测定引入的巯基数量。巯基与DTDP反应导致硫代吡啶释放，在324nm处监测。使用蛋白质浓度为0.5-1.0mg/ml的样品。将280nm处的吸收度用于精确测定样品中蛋白质的浓度且然后在室温下将样品的等分部分(0.9ml)各自与0.1ml DTDP(5mM在乙醇中从储备溶液)一起孵育10分钟。在旁边同时孵育单独缓冲液+DTDP的空白样品。在10分钟后，测定324nm处的吸收度并且使用19800M-1的硫代吡啶的消光系数对存在的巯基数量定量。
一般而言，每个抗体中三个巯基的硫戊环化水平是期望的。例如，使用一种特定抗体，通过添加15倍摩尔过量的2-亚氨基硫戊环，随后在室温下孵育1小时达到这一目的。由此将轭合的抗体与2-亚氨基硫戊环以所需摩尔比孵育且然后脱盐入轭合缓冲液(包含5mM甘氨酸，3％甘油和2mM DTPA的pH6.0的50mM HEPES缓冲液)。将硫戊环化物质维持在冰上，同时如上所述对引入的巯基数量进行定量。
在验证引入的巯基数量后，加入每个巯基3-倍摩尔过量的包含活性马来酰亚胺基的药物-连接基分子。轭合反应在还包含5％终浓度的乙二醇二甲醚(或合适的可选择溶剂)的轭合缓冲液中进行。通常将药物-连接基储备溶液溶于90％乙二醇二甲醚，10％二甲亚砜。为了加入到抗体中，可以将储备溶液直接到具有足够添加的乙二醇二甲醚的硫戊环化抗体中而使终浓度达到5％或在包含终浓度为10％的乙二醇二甲醚的轭合缓冲液中预稀释，随后添加到等体积的硫戊环化抗体中。
将轭合反应体系在混合的同时在室温下孵育2小时。在孵育后，将该反应混合物以14000RPM离心15分钟，并且如果不即刻纯化，那么将pH调整至7.2。使用许多方法，通过色谱对轭合物进行纯化。可以使用应用Sephacryl S200柱的尺寸排阻色谱法纯化轭合物，所述的Sephacryl S200柱预先用50mM pH7.2的HEPES缓冲液平衡，该缓冲液包含5mM甘氨酸，50mM NaCl和3％甘油。以28cm/h的线性流速进行色谱。收集，集合和浓缩包含轭合物的级分。可选择地，可以通过离子交换色谱法进行纯化。条件根据抗体与抗体的不同而改变并且在每种情况中均需要最优化。例如，使抗体-药物轭合物反应混合物上预先用pH6.0的50mM HEPES，5mM甘氨酸，3％甘油平衡的SP-琼脂糖柱。使用0-1M在平衡缓冲液中的NaCl的梯度洗脱抗体轭合物。集合包含轭合物的级分，将pH调整至7.2并且根据需要浓缩样品。
实施例10：体内研究
A.体内肿瘤异种移植物的治疗
将抗-PSMA(2A10，参见共同拥有的美国专利申请顺序号US60/654,125，2005年2月18日提交，引入本文作为参考)和同种型对照抗体(抗-CD70 IgGl克隆2H5，(参见共同拥有的美国专利申请顺序号US60/720,600，引入本文作为参考)各自与包含50mM NaCl和2mMDTPA的pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液交换并且浓缩至6mg/ml。然后通过下列步骤使两种抗体硫戊环化：与25-倍摩尔过量的2-亚氨基硫戊环一起在室温下孵育1小时，随后使用Sephadex G-25柱脱盐入包含50mM NaCl和2mM DTPA缓冲液的pH6.0的0.1M磷酸盐缓冲液。然后将硫戊环化抗体维持在冰上，同时测定引入的巯基数量。通过硫戊环化抗体样品与二硫代吡啶(DTDP)反应实现这一目的。测定在280nm处的吸收度以便确定样品中蛋白质的浓度且然后在室温下将样品的等分部分(0.9ml)各自与0.1ml DTDP(5mM在乙醇中从储备溶液)一起孵育10分钟。在旁边同时孵育单独缓冲液+DTDP的空白样品。测定324nm处的吸收度并且使用19800M-1的硫代吡啶的消光系数对每一抗体中存在的巯基数量定量。就抗-PSMA而言，每个抗体中有5.3个巯基，而就同种型对照而言，为6.0个。
然后将硫戊环化抗体与超过巯基摩尔浓度3倍摩尔过量的化合物A一起孵育。
化合物A
将5mM化合物A在DMSO中的储备溶液与足量的DMSO加入到硫戊环化抗体中而使DMSO终浓度达到10％(v/v)。在室温下孵育3小时后，使用三乙醇胺使孵育混合物的pH升至7.0。然后通过使用SephacrylS200柱的尺寸排阻色谱法纯化抗体-化合物A轭合物，所述的Sephacryl S200柱预先用包含50mM NaCl和5％(v/v)DMSO的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.2)平衡。收集和集合包含单体轭合物的级分。然后在氮气环境中使用10kDa截止膜在搅拌池中浓缩所得的纯化轭合物。使用在280nm和340nm处的吸收度，通过参照在如上所述各自波长处测定的抗体和化合物A的消光系数来测定轭合物的浓度和取代比(每个抗体分子中连接的药物分子数量)。
对为生长在雄性CB17.SCID小鼠(购自Taconic，Germantown，NY)中的人前列腺癌异种移植物的LNCaP测试与化合物A轭合的抗-PSMA(2A10克隆)的抗-肿瘤功效。表达高水平PSMA的LNCaP前列腺癌细胞获自ATCC(Cat# CRL-1740)并且按照ATCC的说明在体外扩充。对来自Taconic的8周龄雄性CB17.SCID小鼠的每只小鼠皮下右侧腹植入在0.2ml PBS/基质胶(1∶1)中的2.5 x 106 LNCaP细胞。称重小鼠并且使用电子测径器三维测量肿瘤，从植入后3周开始每周2次。将各肿瘤体积计算为高x宽x长。将具有适当大小的血管化肿瘤的小鼠(根据肿瘤外观确定)随机分入治疗组并且在第0天时对每一个体体重给药。监测小鼠给药后60天左右的肿瘤生长并且在本研究结束时终止。当肿瘤达到肿瘤终点(1500mm3)时，对小鼠实施安乐死。
表1.LNCaP异种移植物研究概述
  治疗   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组N只   给药途径  1天时的平均肿瘤体积
媒介物 - 3 ip 100
同种型Ab-化合物A轭合物 0.3 3 ip 100
2A10-化合物A轭合物 0.3 3 ip 100
如图1中所示，0.3μmol/kg(涉及细胞毒性化合物A的摩尔数)的2A10-化合物A轭合物诱导所有三种建立的小LNCaP肿瘤完全退化。
B.剂量-响应研究
将抗-PSMA(2A10)与包含50mM NaCl和2mM DTPA的pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液进行缓冲液交换并且浓缩至5.6mg/ml。然后通过下列步骤使抗体硫戊环化：与7.5-倍摩尔过量的2-亚氨基硫戊环一起在室温下孵育1小时，随后使用Sephadex G-25柱脱盐入包含5mM甘氨酸，2mM DTPA和3％(v/v)甘油的pH6.0的50mM HEPES缓冲液。将硫戊环化抗体维持在冰上，同时测定引入的巯基数量。通过硫戊环化抗体样品与二硫代吡啶(DTDP)反应实现这一目的。测定在280nm处的吸收度以便确定样品中蛋白质的浓度且然后在室温下将样品的等分部分(0.9ml)各自与0.1ml DTDP(5mM在乙醇中从储备溶液)一起孵育10分钟。在旁边同时孵育单独缓冲液+DTDP的空白样品。在10分钟后，测定324nm处的吸收度并且使用19800M-1的硫代吡啶的消光系数对每一抗体中存在的巯基数量定量。
然后将硫戊环化抗体与超过巯基摩尔浓度2-倍摩尔过量的化合物A一起孵育。将化合物A，即5mM在10％(v/v)DMSO/90％(v/v)乙二醇二甲醚中的储备溶液与足量的乙二醇二甲醚加入到硫戊环化抗体中以使终浓度达到5％(v/v)。在室温下孵育2小时后，通过离子交换色谱法纯化抗体-化合物A轭合物。使该反应混合物上用缓冲液A(50mMHEPES，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH6.0)预平衡的SP-琼脂糖柱。用缓冲液A，然后用95％缓冲液A，5％缓冲液B(50mM HEPES，1M NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH7.2)洗涤柱，且然后用10％缓冲液B，90％缓冲液A洗脱抗体-化合物A轭合物。收集包含单体轭合物的级分并且集合且通过添加一乙醇胺将pH调整至7.2。然后将所得纯化的轭合物透析入pH7.2的50mM HEPES，100mM NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油且然后在氮气环境中使用10kDa截止膜在搅拌池中浓缩。使用在280nm和340nm处的吸收度，通过参照在如上所述各波长处测定的抗体和化合物A的消光系数来测定轭合物的浓度和取代比(每个抗体分子中连接的药物分子数量)。使用相同方法制备同种型对照(抗-CD702H5)轭合物，但使用15％缓冲液B，85％缓冲液A从离子交换柱上洗脱轭合物。
如上所述使用生长在雄性CB17.SCID小鼠中的LNCaP人前列腺癌异种移植物测定轭合物的功效和选择性。将这一异种移植物研究设计概括在表2中。
表2.LNCaP异种移植物研究概述
治疗   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组N只   给药途径  1天时的平均肿瘤体积
  媒介物   -   9 ip   160
同种型Ab-化合物A   0.05，0.15，0.30，0.45，0.60，0.90 9 ip 160
2A10-化合物A   0.05，0.15，0.30，0.45，0.60，0.90 9 ip 160
正如表2和图2-3中所示，0.15μmol/kg的抗-PSMA-化合物A(图2)具有优于0.90μmol/kg同种型对照-化合物A的抗-肿瘤功效，表明至少＞6x选择性(图3)。0.90μmol/kg的抗-PSMA-化合物A仅表现出短暂的毒性(图5)并且低于最高耐受剂量。因此，在具有LNCaP-肿瘤的小鼠中鉴定了抗-PSMA-化合物A的超过6-倍的治疗指数。
C.对大肿瘤的功效
将抗-PSMA(2A10)与包含50mM NaCl和2mM DTPA的pH8.0的0.1M磷酸盐缓冲液进行缓冲液交换并且浓缩至5.6mg/ml。然后通过下列步骤使抗体硫戊环化：与9-倍摩尔过量的2-亚氨基硫戊环一起在室温下孵育1小时，随后使用Sephadex G-25柱脱盐入包含5mM甘氨酸，2mMDTPA和3％(v/v)甘油的pH6.0的50mM HEPES缓冲液。将硫戊环化抗体维持在冰上，同时测定引入的巯基数量。通过硫戊环化抗体样品与二硫代吡啶(DTDP)反应实现这一目的。测定在280nm处的吸收度以便确定样品中蛋白质的浓度且然后在室温下将样品的等分部分(0.9ml)各自与0.1ml DTDP(5mM在乙醇中从储备溶液)一起孵育10分钟。在旁边同时孵育单独缓冲液+DTDP的空白样品。测定324nm处的吸收度并且使用19800M-1的硫代吡啶的消光系数对每一抗体中存在的巯基数量定量。
然后将硫戊环化抗体与超过巯基摩尔浓度2-倍摩尔过量的化合物A一起孵育。将化合物A，即5mM在10％(v/v)DMSO/90％(v/v)乙二醇二甲醚中的储备溶液与足量的乙二醇二甲醚加入到硫戊环化抗体中以使终浓度达到5％(v/v)。在室温下孵育2小时后，通过离子交换色谱法纯化抗体-化合物A轭合物。使该反应混合物上用pH6.0的50mMHEPES，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油(缓冲液A)预平衡的SP-琼脂糖柱。用缓冲液A，然后用95％缓冲液A，5％缓冲液B(50mM HEPES，1M NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油，pH7.2)洗涤柱，且然后用10％缓冲液B，90％缓冲液A洗脱抗体-化合物A轭合物。收集包含单体轭合物的级分并且集合且通过添加一乙醇胺将pH调整至7.2。然后将所得纯化的轭合物透析入pH7.2的50mM HEPES，100mM NaCl，5mM甘氨酸，3％(v/v)甘油且然后在氮气环境中使用10kDa截止膜在搅拌池中浓缩。使用在280nm和340nm处的吸收度，通过参照在如上所述各波长处测定的抗体和化合物A的消光系数来测定轭合物的浓度和取代比(每个抗体分子中连接的药物分子数量)。使用相同方法制备同种型对照(抗-CD702H5)轭合物，但使用15％缓冲液B，85％缓冲液A从离子交换柱上洗脱轭合物。
如上所述使用生长在雄性CB17.SCID小鼠中的LNCaP人前列腺癌异种移植物测定轭合物的功效和选择性。将这一异种移植物研究设计概括在表3 & 4中。
表3.LNCaP异种移植物研究概述
  治疗   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组N只   给药途径  1天时的平均肿瘤体积
媒介物 -   8   iv   240
同种型Ab-化合物A   0.15   8   iv   240
2A10-化合物A   0.15   8   iv   240
正如表3和图6中所示，单一低剂量的0.15μmol/kg抗-PSMA-化合物A显著抑制了建立的平均大小为240mm3的大LNCaP肿瘤生长。相反，0.15μmol/kg的同种型对照-化合物A具有最低的抗-肿瘤功效。正如表4和图7中所示，单剂量的0.30μmol/kg抗-PSMA-化合物A诱导平均大小为430mm3的极大LNCaP肿瘤退化并且抑制其生长。
表4.LNCaP异种移植物研究概述
  治疗   剂量(μmol/kg细胞毒素)   每组N只   给药途径   1天时的平均肿瘤体积
媒介物 - 6 ip 4.30
2A10-化合物A 0.15，0.30，0.45 6 ip 4.30
实施例11：体内研究
一般按照上述提供的实施例制备下列样品。
组 测试物质   浓度(mg/ml) 取代比 储存
  1   IgG1同种型对照   5.00   -   4℃
2   抗-CD70抗体(CD70.1) 5.00 - 4℃
3   脱岩藻糖基化的抗-CD70抗体(CD70.1df) 5.30 - 4℃
4   毒素1-轭合的抗-CD70抗体(CD70.1-毒素1) 3.00 1.7 -80℃
5   毒素1-轭合的脱岩藻糖基化抗-CD70抗体(CD70.1df-毒素1) 2.98 1.7 -80℃
6   毒素2-轭合的抗-CD70抗体(CD70.1-毒素2) 2.50 1.8 -80℃
Figure A20068004401201861
毒素1
Figure A20068004401201862
毒素2
从健康志愿者供体中获得五(5)种新鲜采集的血沉棕黄层样品。使用梯度离心，按照Ficoll-Paque
Figure A20068004401201871
+操作(Ref 07907，StemCellTechnologies，Meylan，France)纯化外周血单环细胞(PBMC)。通过0.25％锥虫蓝排除法评价PBMC细胞存活力，此后进行FACS分析和体内注射。
分析列在下表中的5种CD标记：
  抗原   主要抗原表达
  CD3   T细胞
  CD14   单核细胞，巨噬细胞，郎格尔汉斯细胞
  CD16b   仅嗜中性粒细胞
  CD20   前体B细胞亚群，B细胞
  CD56   NK细胞，T细胞亚群
使用两种不同的PBMC样品，第一种用于1-3组(裸抗体研究)且第二种用于4-6组(毒素-轭合的抗体的研究)。选择标准为总细胞数，最高CD56百分比和细胞存活率。
通过经皮下经在200μl RPMI 1640中的5 x 106 786-O细胞注入78只NOD-SCID的右侧腹诱发肿瘤。通过使用与体内实验中的这些相同的抗体的FACS证实这些786-O细胞表达靶抗原CD70。当平均肿瘤体积达到80mm3(约15天)时开始治疗。在治疗开始前，将78只移植中具有肿瘤的48只小鼠随机分成8只动物的&6个组。各组中的平均肿瘤体积相差无几并且与其它组相比不具有显著性差异(方差分析)。48只随机化小鼠接受人PBMC样品单一IP注射，其中就1-3组而言，每只小鼠3.6 x 107个细胞(相当于每只小鼠4.81 x 106个CD56阳性细胞)，而就4-6组而言，每只小鼠4.5 x 107个细胞(相当于每只小鼠4.79 x 106个CD56阳性细胞)。
治疗方案如下：
  组   小鼠数量   治疗   剂量(mg/kg/inj)   治疗体积(ml)(25g小鼠)   给药途径   治疗方案
  1   8   IgG1同种型对照   15   0.250   IP   Q4Dx
  2   8   抗-CD70抗体   15   0.250   IP   Q4Dx
  3   8   抗-CD70脱岩藻糖基化抗体   15   0.250   IP   Q4Dx
  组   小鼠数量   治疗   剂量(μg/kg/inj)   治疗体积(ml)(25g小鼠)   给药途径   治疗方案
  4   8   CD70.1-毒素1   0.3   0.226   IV   Q14Dx2
  5   8   CD70.1df-毒素1   0.3   0.424   IV   Q14Dx2
  6   8   CD70.1-毒素2   0.3   0.085   IV   单一
来自1组的小鼠接受按照方案Q4Dx的15rng/kg/inj的IgG1同种型对照的反复IP注射；
来自2组的小鼠接受按照方案Q4Dx的15mg/kg/inj的抗-CD70抗体的反复IP注射；
来自3组的小鼠接受按照方案Q4Dx的15mg/kg/inj的脱岩藻糖基化抗体的反复IP注射抗-CD70；
来自4组的小鼠接受按照方案Q14Dx2的两次毒素1-轭合的抗-CD70抗体的IV注射；
来自5组的小鼠接受按照方案Q14Dx2的两次毒素1-轭合的抗-CD70脱岩藻糖基化抗体的IV注射；
来自6组的小鼠接受毒素2-轭合的抗-CD70抗体的单一IV注射。
图8例示了研究过程中的肿瘤大小。特别是与不使用毒素的生长相比，抗体轭合的毒素各自导致肿瘤大小减小。图9例示了研究过程中的体重。
将本说明书提及或涉及的专利申请，专利，公开文献和其它公布的对比文件各自完整地引入作为参考，其引入程度与将专利申请，专利，公开文献和其它公布的对比文件特别和各自引入作为参考的程度相同。
尽管参照具体实施方案描述了本发明，但是本领域技术人员应理解可以在不脱离本发明和待批权利要求精神和范围的情况下进行各种改变并且可以替代等效方案。此外，可以进行许多改变以使特定的情况，物质，物质组合物，方法，方法步骤或多个步骤适应于本发明的目的，精神和范围。指定所有这类变型均属于待批权利要求范围内。

Claims (24)

1.抗体-药物轭合物，包含：
对至少一种类型的肿瘤具有特异性的抗体；
药物；和
使药物与抗体偶联的连接基，其中该连接基在有肿瘤存在下可裂解；
其中所述的抗体-药物轭合物在以相当于1μmol/kg或1μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时延缓肿瘤生长。
2.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于1μmol/kg或1μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时延缓肿瘤生长。
3.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中所述的肿瘤为SCID小鼠中的人类肿瘤。
4.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于0.6μmol/kg或0.6μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时延缓肿瘤生长。
5.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于0.3μmol/kg或0.3μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时延缓肿瘤生长。
6.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于0.15μmol/kg或0.15μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时延缓肿瘤生长。
7.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于1μmol/kg或1μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时阻止肿瘤生长。
8.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于0.6μmol/kg或0.6μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时阻止肿瘤生长。
9.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于0.3μmol/kg或0.3μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时阻止肿瘤生长。
10.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物在至少5天期限内以相当于0.15μmol/kg或0.15μmol/kg以下的每日剂量的用量给药时阻止肿瘤生长。
11.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中所述的连接基包含在有肿瘤存在下可裂解的肼部分。
12.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中所述的连接基包含在有肿瘤存在下可裂解的多肽部分。
13.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中所述的肿瘤为癌瘤。
14.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中所述的肿瘤为前列腺癌瘤。
15.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中药物选自：多卡米星，CC-1065，基于CBI的多卡米星类似物，基于MCBI的多卡米星类似物，基于CCBI的多卡米星类似物，多拉司他汀，dolestatin-10，考布他汀，加利车霉素，美坦生，美坦生类似物，DM-1，auristatin E，auristatin EB(AEB)，auristatin EFP(AEFP)，单甲基auristatin E(MMAE)，tubulysins，disorazole，埃坡霉素，紫杉醇，多西他赛，托泊替康，棘霉素，雌氮芥，西马多丁，eleutherobin，甲基叶酸，放线菌素，柔红霉素，柔红霉素轭合物，丝裂霉素C，丝裂霉素A，长春新碱，泰素，泰素帝视黄酸和喜树碱。
16.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中所述的药物具有如下结构：
Figure A2006800440120004C1
其中环系A为选自取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基中的成员；
E和G为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，杂原子，单键中的成员，或E和G连接形成选自取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基和取代或未被取代的杂环烷基的环系；
X为选自O，S和NR23中的成员；
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R3为选自(＝O)，SR11，NHR11和OR11中的成员；
其中
R11为选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的杂烷基，未被取代的杂烷基，二磷酸酯类，三磷酸酯类，酰基，C(O)R12R13，C(O)OR12，C(O)NR12R13，P(O)(OR12)2，C(O)CHR12R13，SR12和SiR12R13R14中的成员；
其中
R12，R13和R14为独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和取代或未被取代的芳基中的成员，其中R12和R13与连接它们的氮或碳原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
R4，R4’，R5和R5’为独立地选自H，取代的烷基，未被取代的烷基，取代的芳基，未被取代的芳基，取代的杂芳基，未被取代的杂芳基，取代的杂环烷基，未被取代的杂环烷基，卤素，NO2，NR15R16，NC(O)R15，OC(O)NR15R16，OC(O)OR15，C(O)R15，SR15，OR15，CR15＝NR16和O(CH2)nN(CH3)2中的成员；
其中
n为1-20的整数；
R15和R16独立地选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基，取代或未被取代的芳基，取代或未被取代的杂芳基，取代或未被取代的杂环烷基和取代或未被取代的肽基，其中R15和R16与连接它们的氮原子一起任选地连接形成取代或未被取代的杂环烷基环系，所述杂环烷基环系具有4-6个成员，任选地包含2个或2个以上杂原子；
R6为存在或不存在的单键，并且在存在时，R6和R7连接形成环丙基环；且
R7为CH2-X1或在所述环丙基环中与R6连接的-CH2-，
其中
X1为离去基，
其中R11，R12，R13，R15或R16中的至少一个与连接基偶联，或所述的药物为其药学上可接受的盐。
17.权利要求16所述的抗体-药物轭合物，其中所述的药物具有如下结构：
其中
Z为选自O，S和NR23中的成员；
其中
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的成员；
其中
R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R1’为H，取代或未被取代的低级烷基或C(O)R8，其中R8为选自NR9R10和OR9中的成员，
其中
R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；
R2为H，或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基或氰基或烷氧基；且
R2’为H或取代或未被取代的低级烷基或未被取代的杂烷基，
其中R11，R12，R13，R15或R16中的至少一个与连接基偶联，或所述的药物为其药学上可接受的盐。
18.权利要求16所述的抗体-药物轭合物，其中所述的药物具有如下结构：
Figure A2006800440120007C1
其中
Z为选自O，S和NR23中的成员；
其中
R23为选自H，取代或未被取代的烷基，取代或未被取代的杂烷基和酰基中的成员；
R1为H，取代或未被取代的低级烷基，C(O)R8或CO2R8，其中R8为选自取代的烷基，未被取代的烷基，NR9R10，NR9NHR10和OR9中的成员；
其中
R9和R10为独立地选自H，取代或未被取代的烷基和取代或未被取代的杂烷基中的成员；且
R2为H，取代的烷基或未被取代的低级烷基；
其中R11，R12，R13，R15或R16中的至少一个与连接基偶联，或所述的药物为其药学上可接受的盐。
19.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物选自：
Figure A2006800440120008C1
Figure A2006800440120011C1
其中Ab为抗体，X1为Cl或Br且PEG为聚乙二醇部分。
20.权利要求1所述的抗体-药物轭合物，其中该抗体-药物轭合物选自：
21.药物制剂，包含权利要求1的抗体-药物轭合物和药学上可接受的载体。
22.杀伤肿瘤细胞的方法，该方法包含对所述的肿瘤细胞给予足以杀伤该细胞的用量的权利要求1的抗体-药物轭合物。
23.延缓或终止哺乳动物受试者肿瘤生长的方法，包含对所述受试者给予足以延缓或终止所述生长的用量的权利要求1的抗体-药物轭合物。
24.化合物，选自：
Figure A2006800440120013C1
Figure A2006800440120014C1
Figure A2006800440120015C1
其中r为0-24的整数。
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