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CN105121421B - 司普力西欧他汀类似物 - Google Patents

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CN105121421B CN201380069334.8A CN201380069334A CN105121421B CN 105121421 B CN105121421 B CN 105121421B CN 201380069334 A CN201380069334 A CN 201380069334A CN 105121421 B CN105121421 B CN 105121421B
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M·何
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Abstract

本发明涉及新的细胞毒性司普力西欧他汀类似物(I)和衍生物、其抗体药物缀合物，以及使用其来治疗包括癌症在内的医学病况的方法。
Figure DDA0000751870130000011

Description

司普力西欧他汀类似物
相关申请的交叉引用
本申请要求于2012年11月5日提交的第61/722,769号美国临时申请、于2012年11月7日提交的第61/723,645号美国临时申请以及于2013年5月31日提交的第61/829,409号美国临时申请的权益，所述申请均整体援引加入本文。
发明领域
本发明涉及用作抗体-药物-缀合物(ADC)中的有效负载(payload)的新的衍生自天然产物的和/或基于司普力西欧他汀(spliceostin)的化合物，以及与ADC一起使用的有效负载-连接基化合物。本发明还涉及包含上述有效负载、有效负载-连接基及ADC的组合物，以及使用这些有效负载、有效负载-连接基及ADC来治疗包括癌症在内的病理学病况的方法。
发明背景
药物与抗体的缀合(直接或经由连接基)涉及多种因素的考虑，包括供药物缀合的化学基团的识别和位置、药物释放机制、提供药物释放的结构要素以及对所释放的游离药物的结构修饰。此外，如果药物要在抗体内化之后释放，则药物释放机制必需与缀合物的细胞内运输相一致。
尽管一些不同的药物类别己尝试用于经由抗体递送，但仅有少数药物类别已证实为有效的抗体药物缀合物，尽管其具有适当的毒性谱。
天然产物FR901463、FR901464和FR901465经报告具有针对人类癌细胞系的有效抑制活性且在一些异种移植肿瘤模型中具有功效。(Journal of Antibiotics(1996),49(12),1204-1211.)最近报告天然产物FR901464及其甲基缩酮(命名为司普力西欧他汀A(spliceostatin A))通过与SF3b(其为必要子复合体(subcomplex)U2snRNA的组份)的相互作用而抑制剪接体。(Nature Chemical Biology(2007),3(9),576-583.；Nature(London,United Kingdom)(2010),468(7324),664-668)。
发明概述
本发明涉及化合物及包含其的药物组合物、其制备以及所述化合物主要且非排他地作为抗癌剂的用途。
根据一个方面，本发明涉及一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000751870110000021
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
R1选自：-R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基(alkylidene)，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
R13选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR、-(C(R)2)m-O-NRR和-S-S–C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自氢和-C1-6烷基；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
L-P
(II)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P结合；
P为式(I)的基团：
Figure BDA0000751870110000031
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9为-(C(R)2)m-C(O)-或-(C(R)2)m-；
L1选自：-卤素、-NR2、
Figure BDA0000751870110000041
Figure BDA0000751870110000042
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000051
Figure BDA0000751870110000052
中的一个或多个，
或L3不存在；
R13选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S–C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自氢和-C1-6烷基；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(II’)的化合物或其药学上可接受的盐：
L-P’
(II’)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P’结合；
P’为式(I’)的基团：
Figure BDA0000751870110000061
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-(C(R)2)m-、-OR”、-OCOR13’、-OC(O)NRR14’、-OCON(R)N(R)-和-NR-；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
L1选自：-卤素、-NR2、
Figure BDA0000751870110000071
Figure BDA0000751870110000072
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000081
中的一个或多个，或L3不存在；
R13’选自键、-C1-6亚烷基-、-C3-8碳环基-、-C3-8杂环基-、-C1-6烷基-C6-14芳基-、-C1-6烷基-C5-14杂芳基-；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S–C1-6烷基-NRR；
R14’各自独立地选自键、-NR-、-C3-10碳环基-、-C3-10杂环基-、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR’、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR-和-C1-6亚烷基-，
其中R14’任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-NRR或-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自：氢和-C1-6烷基；
R’各自独立地选自：-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基；
R”各自独立地选自：键和-C1-6亚烷基-；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据又一方面，本发明涉及一种或多种式(III)的化合物或其药学上可接受的盐：
(AB)-(L-P)b
(III)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P结合；
P为式(I)的基团：
Figure BDA0000751870110000091
其中：
虚线表示任选的键；
AB为抗体；
X1各自独立地选自-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9为-(C(R)2)m-C(O)-或-(C(R)2)m-；
L1选自与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000101
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000111
中的一个或多个，或L3不存在；
R13选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S–C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自：氢和-C1-6烷基；并且
b为1至20；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(III’)的化合物或其药学上可接受的盐：
(AB)-(L-P’)b
(III’)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P’结合；
P’为式(I’)的基团：
Figure BDA0000751870110000121
其中：
虚线表示任选的键；
AB为抗体；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-(C(R)2)m-C(O)-、-(C(R)2)m-、-OR”、-OCOR13’、-OCONRR14’、-OCON(R14)N(R15)-和-NR14-；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
L1选自与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000131
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；以及
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000141
中的一个或多个，或L3不存在；
R13’选自键、-C1-6亚烷基-、-C3-8碳环基-、-C3-8杂环基-、-C1-6烷基-C6-14芳基-、-C1-6烷基-C5-14杂芳基-；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S–C1-6烷基-NRR；
R14’各自独立地选自：键、-NR-、-C3-10碳环基-、-C3-10杂环基-、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR’、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR-和-C1-6亚烷基-；
其中R14’任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-NRR或-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自：氢和-C1-6烷基；
R’各自独立地选自：-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基；
R”各自独立地选自：键和-C1-6亚烷基-；并且
b为1至20；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
在另一方面，本发明涉及式III或III’的抗体药物缀合物化合物，其中抗体AB选自：曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体(例如在本文中或在国际专利申请PCT/IB2012/056234中公开的曲妥珠单抗突变体)、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿伦珠单抗、用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-HLA-Dr抗体、131I Lym-1、用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的鼠抗-HLA-Dr10抗体、用于治疗霍金奇氏病或非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-CD22mAb、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗、吉妥珠单抗、癌胚胎(oncofecal)蛋白受体5T4的人源化单克隆抗体和M1/70(CD11b受体的抗体)以及其他抗体。
曲妥珠单抗是指：(INN；商品名Herclon,Herceptin)是指干扰HER2/neu受体的单克隆抗体。
在另一方面，本发明涉及一种或多种式II、II’、III或III’的化合物，其中L包括一个或多个独立选择的氨基酸双基团(di-radical)，优选地包括选自缬氨酸、瓜氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸、丙氨酸和甘氨酸的一个或多个独立选择的氨基酸双基团。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式III或III’的化合物，其中L能够通过细胞内蛋白酶而从P或从包含P的基团中裂解。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式III或III’的化合物，其中所述抗体经由所述抗体的半胱氨酸残基通过硫或硫-硫键、经由所述抗体的赖氨酸残基通过酰胺键、或经由谷氨酰胺残基通过酰胺键而与氨基酸双基团连接。优选地，所述抗体为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或抗体片段。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式I、I’、II、II’、III或III’的化合物和/或其一种或多种盐的药物组合物，其包含有效量的所述一种或多种化合物或盐以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。此类药物组合物可额外地包含治疗有效量的选自微管蛋白形成抑制剂、拓朴异构酶抑制剂和DNA结合剂的化学治疗剂。
根据另一方面，本发明涉及杀灭肿瘤细胞或癌细胞或者抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖的方法，其包括使用一定量的式I、I’、II、II’、III或III’的化合物和/或其一种或多种盐来治疗患者的肿瘤细胞或癌细胞，所述量有效地杀灭肿瘤细胞或癌细胞或者抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖。
本发明的另一方面涉及使用有效量的任一种前述化合物和/或任一种前述抗体药物缀合物来治疗癌症的方法，其是通过向有此需要的患者给药有效量的所述化合物和/或缀合物来进行的。
附图简述
图1是用FERM BP-3421的近乎完整的16S rRNA序列测定的与其他伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia spp)的系统发生关系(phylogenetic relationship)的示意图。
图2是司普力西欧他汀(spliceostatin)的生物合成基因簇以及强调通过细胞色素P450Fr9R和Fe(II)/α-酮戊二酸盐依赖性加双氧酶Fr9P催化的羟基化步骤的所提议的生物合成路径。
图3是示出ADC3、4和5的异种移植数据的图。
图4是示出ADC14和18的异种移植数据的图。
发明详述
本发明涉及包括细胞毒性司普力西欧他汀类似物在内的细胞毒性天然产物、包含所述包括细胞毒性司普力西欧他汀类似物在内的细胞毒性天然产物的抗体药物缀合物、以及使用其来治疗癌症及其他病理学病况的方法。本发明还涉及体外、原位和体内使用此类化合物和/或缀合物来检测、诊断或治疗哺乳动物细胞或相关的病理学病况的方法。
定义及缩写
除非另外规定，则本文所用的下列术语和措辞旨在具有以下含义。除非上下文另外指出，当在本文中使用商品名时，商品名包括产品配方、非专利药以及商品名产品的活性药物成分。
本文中术语"抗体"(或"Ab"或"AB")以最广义的含义使用且特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单一特异性抗体、多重特异性抗体(例如双特异性抗体)以及表现出期望的生物学活性的抗体片段。完整的抗体主要具有两个区域：可变区和恒定区。可变区结合至目标抗原并与之相互作用。可变区包括互补决定区(CDR)，其识别特定抗原上的特异性结合位点并与之结合。恒定区可被免疫系统识别并与之相互作用(参见例如Janeway等人，2001,Immuno.Biology,第5版,Garland Publishing,New York)。抗体可为任何类型或类别(例如IgG、IgE、IgM、IgD和IgA)或亚类别(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2)。抗体可源自任何适当的物种。在一些实施方案中，抗体为人类或鼠类来源。抗体可(例如)为人类抗体、人源化抗体或嵌合抗体。
术语"特异性地结合"和"特异性结合"是指与预定抗原结合的抗体。通常，抗体以至少约1×107M-1的亲和力结合，并且以比其结合至除预定抗原或密切相关的抗原之外的非特异性抗原(例如BSA、酪蛋白)的亲和力高至少2倍的亲和力与预定抗原结合。
本文所用的术语"单克隆抗体"是指从基本同质性抗体的族群获得的抗体，即，包含该族群的各抗体除了可能的天然存在的突变(其可少量存在)之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一的抗原基。修饰词"单克隆"表示从抗体的基本同质性族群获得的抗体的特性，而不应解释成需要通过任何特定方法来产生该抗体。
术语"单克隆抗体"特别包括"嵌合"抗体(其中一部分重链和/或轻链与源自特定物种或属于特定抗体类别或亚类别的抗体的相应序列相同或同源，而其余的链则与源自另一物种或属于另一抗体类别或亚类别的抗体的相应序列相同或同源)以及此类抗体的片段，只要其表现出期望的生物学活性即可。
"完整抗体"为包含抗原结合可变区以及轻链恒定结构域(CL)和重链恒定结构域CH1、CH2、CH3和CH4的抗体，视抗体类别而定。恒定结构域可为天然序列恒定结构域(例如人类天然序列恒定结构域)或其氨基酸序列变体。
完整抗体可具有一个或多个"效应子功能"，其意指可归因于抗体的Fc区(例如天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物学活性。抗体效应子功能的实例包括补体依赖性细胞毒性、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)以及抗体依赖性细胞介导的吞噬作用。
"抗体片段"包含完整抗体的一部分，优选包含其抗原结合或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')2、及Fv片段、双特异抗体、三特异抗体、四特异抗体、线性抗体、单链抗体分子、scFv、scFv-Fc、由一个或多个抗体片段形成的多重特异性抗体片段、由Fab表达库产生的一个或多个片段、或上述中任一种的表位结合片段，其免疫特异性地与目标抗原(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)结合。
在抗体上下文中的术语"可变"是指抗体的可变结构域的某些部分，其在序列方面普遍不同且用于每一特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。这种可变性集中在轻链和重链可变结构域中称为"高变区"的三个片段中。可变结构域的更高度保守的部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包括通过三个高变区连接的四个FR。
当用于本文时，术语"高变区"是指负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区通常包含来自"补体决定区"或"CDR"的氨基酸残基(例如轻链可变结构域中的24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(L3)；Kabat等人，(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))和/或来自"高变环(hypervariable loop)"的那些残基(例如轻链可变结构域中的26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(142)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,1987,J.Mol.Biol.196:901-917)。FR残基为除了本文所定义的高变区之外的那些可变结构域残基。
"单链Fv"或"scFv"抗体片段包括抗体的V.sub.H和V.sub.L结构域，其中这些结构域存在于单一多肽链中。通常，Fv多肽还包括在V.sub.H与V.sub.L结构域之间的多肽连接基，其可使scFv形成用于抗原结合的期望结构。对于scFv，参见Pluckthun in ThePharmacology of Monoclonal Antibodies,vol.113,Rosenburg and Moore eds.,Springer-Verlag,New York,pp.269-315(1994)。
术语"双特异抗体"是指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段包含与相同的多肽链中可变轻结构域(VL)连接的可变重结构域(VH)。通过使用过短以致于不能在同一链上的两个结构域之间进行配对的连接基，结构域被迫与另一链的互补结构域配对并产生两个抗原结合位点。双特异抗体更完整地描述于例如EP 0404097；WO 93/11161；以及Hollinger等人,1993,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448。
非人(例如啮齿目动物)抗体的"人源化"形式为嵌合抗体，其含有衍生自非人免疫球蛋白的最小序列。在很大程度上，人源化抗体为人免疫球蛋白(受者抗体)，其中来自受者的高变区的残基被具有期望的特异性、亲和力和能力的来自非人物种(供者抗体)如小鼠、大鼠、兔或非人灵长目动物的高变区的残基替代。一些情况下，人免疫球蛋白的框架区(FR)残基被相应的非人残基替代。此外，人源化抗体可包括受者抗体或供者抗体中未发现的残基。这些修饰用于进一步改进抗体性能。通常，人源化抗体会包含基本所有的至少一种且通常两种的可变结构域，其中所有的或基本所有的高变环对应于非人免疫球蛋白的那些高变环，并且所有或基本所有的FR为人免疫球蛋白序列的那些FR。人源化抗体还任选地包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常为人免疫球蛋白的恒定区(Fc)。对于进一步详情，参见Jones等人，1986,Nature 321:522-525；Riechmann等人，1988,Nature 332:323-329；和Presta,1992,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596。
如本文所用，"分离"意指从(a)天然来源如植物或动物细胞或细胞培养物，或(b)合成有机化学反应混合物的其他组份中分离。如本文所用，"纯化"意指当分离时，该分离物含有占所述分离物重量的至少95％(另一方面至少98％)的化合物(例如缀合物)。
"分离"的抗体为已从其天然环境的组份中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组份为会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素及其他蛋白质或非蛋白质溶质。在优选实施方案中，所述抗体会被(1)纯化至大于95重量％，最优选大于99重量％的抗体(如通过Lowry法测定的)，(2)纯化至足以获得至少15个N端残基或内部氨基酸序列残基的程度(通过使用旋转杯序列分析仪)，或(3)纯化成同质(通过在还原或非还原条件下使用考马斯蓝或优选使用银染色的SDS-PAGE)。分离的抗体包括在重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种组份将不存在。然而，通常通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
"诱导细胞凋亡"的抗体为诱导程序性细胞死亡的抗体，如通过膜联蛋白V结合、DNA片段化(fragmentation)、细胞皱缩、内质网扩张、细胞片段化和/或膜囊泡(称为凋亡小体)形成而测定的。所述细胞为肿瘤细胞，例如乳房细胞、卵巢细胞、胃细胞、子宫内膜细胞、唾液腺细胞、肺细胞、肾细胞、结肠细胞、甲状腺细胞、胰脏细胞或膀胱细胞。多种方法可用于评估与细胞凋亡有关的细胞事件。例如，磷脂酰丝氨酸(PS)易位可通过膜联蛋白结合而测量；DNA片段化可经由DNA梯度化(DNA laddering)而评估；并且核/染色质凝聚连同DNA片段化可通过亚二倍体细胞的任何增加而评估。
术语"治疗有效量"是指药物有效地治疗哺乳动物的疾病或病症的量。对于癌症，药物的治疗有效量可降低癌细胞数；降低肿瘤大小；抑制(即某种程度上减缓且优选中止)癌细胞浸润至周边器官中；抑制(即某种程度上减缓且优选中止)肿瘤转移；某种程度上抑制肿瘤生长；和/或某种程度上减轻与癌症有关的一种或多种症状。在药物可抑制癌细胞生长和/或杀灭现存的癌细胞的程度上，其可能为细胞抑制性或细胞毒性的。对于癌症疗法，可例如通过评价疾病进展时间(TTP)和/或测定应答率(RR)来测量功效。
术语"大量"是指大多数，即大于50％的族群、混合物或样品。
术语"细胞内代谢物"是指由细胞内部对抗体-药物缀合物(ADC)的代谢过程或反应所产生的化合物。代谢过程或反应可为酶促过程如ADC的肽连接基的蛋白水解性裂解。细胞内代谢物包括但不限定于在进入、扩散、摄取或运送到细胞中之后经历细胞内裂解的抗体和游离药物。
术语"细胞内裂解的"和"细胞内裂解"是指在细胞内部对ADC等的代谢过程或反应，从而药物部分与抗体之间的共价连接(例如连接基)被破坏，导致游离药物或缀合物的其他代谢物从细胞内部的抗体中解离。ADC的裂解部份因此为细胞内代谢物。
术语"生物利用度"是指向患者给药的规定量的药物的全身利用度(即血液/血浆水平)。生物利用度为绝对术语，其表示药物从所给药的剂型到达一般循环的时间(速率)和总量(程度)的测量值。
术语"细胞毒性活性"是指ADC或所述ADC的细胞内代谢物的细胞杀灭、细胞抑制或抗增殖作用。细胞毒性活性可以IC50值表示，其为一半细胞活存时每单位体积的浓度(摩尔或质量)。
"病症"为会因为使用药物或抗体-药物缀合物的治疗而获益的任何病况。其包括慢性和急性病症或疾病，包括使哺乳动物易患所涉及的病症的那些病理学病况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括良性和恶性癌症；白血病和淋巴恶性肿瘤；神经元病症、神经胶质病症、星形胶质细胞病症、下丘脑病症及其他腺的病症、巨噬细胞病症、上皮病症、基质病症和囊肧腔病症；以及炎性病症、血管生成病症和免疫学病症。
术语"癌症"和"癌"是指或描述哺乳动物的生理学病况或病症，其典型特征为失调细胞生长。"肿瘤"包括一种或多种癌细胞。
"患者"的实例包括(但不限制于)人类、大鼠、小鼠、豚鼠、猴、猪、山羊、母牛、马、狗、猫、鸟和家禽。在示例性实施方案中，患者为人类。
除非上下文另外指出，否则术语"治疗"是指治疗性治疗和预防复发的预防性措施，其中目标是抑制或减缓(减轻)不期望的生理学变化或病症，诸如癌症的产生或扩散。出于本发明的目的，有益的或期望的临床结果包括但不限定于症状的减轻、疾病程度的减小、疾病的稳定化(即未恶化)状态、疾病进展的延缓或减缓、疾病状态的改善或缓和、以及缓解(无论是部分或全部)，无论是可检测出或不可检测出的。“治疗”还可以表示与未接受治疗的情况下的预期存活相比延长存活。需要治疗的个体包括已患有病况或病症的个体以及易于患有病况或病症的个体。
在癌症的情形下，术语"治疗"包括以下中的任一种或全部：抑制肿瘤细胞、癌细胞的生长或肿瘤的生长；抑制肿瘤细胞或癌细胞的复制、减轻整体肿瘤负担或降低癌细胞数目、以及改善与该疾病有关的一种或多种症状。
在自身免疫疾病的情形下，术语"治疗"包括以下中的任一种或全部：抑制与自身免疫疾病状态有关的细胞(包括但不限定于产生自身免疫抗体的细胞)的复制、减轻自身免疫抗体负担及改善自身免疫疾病的一种或多种症状。
在感染疾病的情形下，术语"治疗"包括以下中的任一种或全部：抑制导致感染疾病的病原体的生长、增殖或复制，以及改善感染疾病的一种或多种症状。
术语"药品说明书"用于指治疗产品的商业包装内通常包括的使用说明，其包括与适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或关于使用此类治疗产品的警告相关的信息。
如本文所用，术语"细胞"、"细胞系"以及"细胞培养物"可互换地使用并且所有此类指代均包括后代。词语"转化体"和"转化细胞"包括初代个体细胞和培养物或由其衍生的后代而无关于转移次数。还应理解，所有后代由于有意或无意的突变而可能在DNA成分方面未必精确相同。包括具有与在原始转化的细胞中所筛选的相同功能或生物学活性的突变后代。当意欲不同的指代时，其根据上下文会变得明确。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"烷基"是指具有指定碳原子数的直链或支链的饱和烃(例如"C1-C8"烷基是指具有1至8个碳原子的烷基)。当碳原子数未指定时，则烷基具有1至8个碳原子，优选1至6个碳原子。典型的直链C1-C8烷基包括但不限定于甲基、乙基、正丙基、正丁基、正戊基、正己基、正庚基和正辛基；而支链C1-C8烷基包括但不限定于-异丙基、-仲丁基、-异丁基、-叔丁基、-异戊基和-2-甲基丁基；不饱和C2-C8烃基包括但不限定于乙烯基、烯丙基、1-丁烯基、2-丁烯基、异丁烯基、1-戊烯基、2-戊烯基、3-甲基-1-丁烯基、2-甲基-2-丁烯基、2,3-二甲基-2-丁烯基、1-己烯基、2-己烯基、3-己烯基、乙炔基、丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基和3-甲基-1-丁炔基。
除非另有指定，否则本身或作为其他术语一部分的"亚烷基"是指具有规定数量的碳原子(通常1至18个碳原子)且具有通过从母体烷烃的同一碳原子或两个不同的碳原子中移除两个氢原子而衍生的两个单价基团中心的饱和支链或直链或环状烃基团。典型的亚烷基包括但不限定于：亚甲基(-CH2-)、1,2-亚乙基(-CH2CH2-)、1,3-亚丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-亚丁基(-CH2CH2CH2CH2-)等。"C1-C10"直链亚烷基为式-(CH2)1-10-的直链饱和烃基。C1-C10亚烷基的实例包括亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基、亚己基、亚庚基、亚辛基、亚壬基以及亚癸基。在本发明的某些实施方案中，亚烷基具有1至9个、1至8个、1至7个以及1至6个碳。
除非另外指出，否则本身或与其他术语组合使用的术语"杂烷基"是指稳定的直链或支链烃或其组合，其是完全饱和的或具有1至3不饱和度，由规定数量的碳原子和1至3个选自O、N、Si、S和/或P的杂原子组成，并且其中氮和硫原子可任选地被氧化且氮杂原子可任选地被季铵化。杂原子O、N和S可以位于杂烷基的任何内部位置。杂原子Si可位于杂烷基的任何位置，包括烷基连接至分子其余部分的位置。至多两个杂原子可以是连贯的。
“卤代”或“卤素”是指氟代、氯代、溴代或碘代。
"卤代(C1-6-烷基)"是指被1至3个或1至2个卤代基团取代的C1-6-烷基，其中C1-6-烷基和卤代为本文所定义。该术语包括例如CF3。
本领域技术人员已知的术语"环氧"或"环氧基"或"环氧残基"是指如下的包含通过单键连接的碳原子和氧原子的三元环：
Figure BDA0000751870110000231
因此，术语"环氧化物"是指包含至少一个前文所定义的环氧基的化合物。
除非另外指出，否则本身或作为其他取代基一部分的术语"亚杂烷基"是指由杂烷基(如上所讨论)衍生的二价基团。对于亚杂烷基，杂原子还可以占据链端的一端或两端。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"芳基"是指具有6至20个碳原子、优选6至14个碳原子的，通过从母体芳族环体系的单个碳原子中移除一个氢原子而衍生的取代或未取代的单价芳族烃基团。典型的芳基包括但不限定于由苯、取代的苯、萘、蒽、联苯等衍生的基团。取代的芳族基团(例如芳基)可被1个或多个、优选1至5个下列基团取代：C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中R'各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基，优选未取代的芳基。一些实施方案中，取代的芳族基团可进一步包含-NHC(＝NH)NH2、-NHCONH2、-S(＝O)2R'及-SR'中的一个或多个。
本文所用的术语"杂芳基"是指具有至少一个选自氮、氧和硫的杂原子且含有至少1个碳原子的5至14元(例如5至6元)芳族杂环。杂芳基可为单环、二环或三环体系。典型的杂芳基为三唑基、四唑基、噁二唑基、吡啶基、呋喃基、苯并呋喃基、噻吩基、苯并噻吩基、喹啉基、吡咯基、吲哚基、噁唑基、苯并噁唑基、咪唑基、苯并咪唑基、噻唑基、苯并噻唑基、异噁唑基、吡唑基、异噻唑基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基、噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、嘧啶基、吖庚因基、氧杂卓基以及喹啉基。杂芳基可任选地被取代。典型的取代基包括但不限定于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O2)R、-OS(＝O2)OR、-S(＝O2)NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)OR2、-P(＝O)OR2、-PO3 2-、PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2、C1-C20杂烷基、C6-C20芳基、C3-C8杂环基、保护基或前药部分，其中X各自独立地为卤素：-F、-Cl、-Br或-I；且R各自独立地为-H或C1-C6烷基。
术语"亚芳基"、"亚杂芳基"分别是指"芳基"和"杂芳基"以及并入"芳基"和"杂芳基"的其他术语的二价版本。
"羟基"是指-OH基团。
"取代的烷基"意指其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基替代的烷基。典型的取代基包括但不限定于-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、＝NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N＝C＝O、-NCS、-NO、-NO2、＝N2、-N3、-NRC(＝O)R、-C(＝O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(＝O2)R、-OS(＝O2)OR、-S(＝O2)NR、-S(＝O)R、-OP(＝O)OR2、-P(＝O)OR2、-PO3 2-、PO3H2、-AsO2H2、-C(＝O)R、-C(＝O)X、-C(＝S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(＝S)OR、-C(＝O)SR、-C(＝S)SR、-C(＝O)NR2、-C(＝S)NR2、-C(＝NR)NR2、C1-C20杂烷基、C6-C20芳基、C3-C8杂环基、保护基或前药部分，其中X各自独立地为卤素：-F、-Cl、-Br或-I；且R各自独立地为-H或C1-C6烷基。被卤素取代的取代烷基在本文中有时称为卤代烷基。芳基、亚烷基、亚杂烷基及其他如本文所述的含有或未含有烷基或亚烷基部分的基团也可类似地被取代。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"芳烷基"意指被如上所定义的芳基取代的如上所定义的烷基。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"C3-C8杂环基"是指具有3至8个碳原子(也称为环成员)以及1至4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员，且通过从母体环系统的环原子中移除一个氢原子而衍生的单价或二价取代或未取代的芳族或非芳族单环或二环体系。同样地，除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"C3-C10杂环基"是指具有3至10个碳原子(也称为环成员)以及1至4个独立地选自N、O、P或S的杂原子环成员，且通过从母体环系统的环原子中移除一个氢原子而衍生的单价或二价取代或未取代的芳族或非芳族单环或二环体系。杂环基中的一个或多个N、C或S原子可被氧化。包含杂原子的环可为芳族或非芳族的。当所用的术语“杂环基”未提及具体碳数时，具有多于10个碳原子的杂环基，例如具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳的环或环体系也是可能的，且与C3-C10杂环基一起涵盖在内。同样地，当所用的术语"杂环基"未提及具体碳数时，具有少于3个碳的杂环例如具有1或2个碳的环是可能的，且涵盖在内。在所有碳原子为饱和(即，结合至氢或如下所提及的其他取代基，而没有双键或叁键)的情况下，术语"杂环烷基"是指非芳族杂环或环体系。某些实施方案中，杂环烷基通常具有3至5个成员以及1至2个杂原子。在某些实施方案中，杂环烷基可以是环氧基。
除非另外提及，否则杂环基在任何杂原子或碳原子处连接至其侧基而产生稳定的结构。C3-C8杂环基的典型实例包括但不限定于四氢呋喃基、氧杂环丁烷基、吡喃基、吡咯烷基、哌啶基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、吲哚基、苯并吡唑基、吡咯基、噻吩基(噻吩)、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、哒嗪基、异噻唑基、异噁唑基和四唑基。C3-C8杂环基或C3-C10杂环基可被至多7个基团取代，所述基团包括但不限定于C1-C8烷基、C1-C8杂烷基、-OR'、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(＝O)2R'、-S(O)R'、卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中R'各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基。在一些实施方案中，取代的杂环基也可包含-NHC(＝NH)NH2、-NHCONH2、-S(＝O)2R'和-SR'中的一个或多个。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"杂芳烷基"意指被如上所定义的芳族杂环基取代的如上所定义的烷基。
除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"C3-C8碳环基"为通过从母体环体系的环原子中移除一个氢原子或两个氢原子而衍生的3-、4-、5-、6-、7-或8-元单价或二价、取代或未取代、饱和或不饱和的非芳族单环或二环碳环。同样地，除非另外指出，否则本身或作为其他术语一部分的"C3-C10碳环基"是通过从母体环体系的环原子中移除一个氢原子而衍生的3-、4-、5-、6-、7-、8-、9-或10-元单价或二价、取代或未取代、饱和或不饱和的非芳族单环或二环碳环。典型的C3-C8碳环基包括但不限定于环丙基、环丁基、环戊基、环戊二烯基、环己基、环己烯基、1,3-环己二烯基、1,4-环己二烯基、环庚基、1,3-环庚二烯基、1,3,5-环庚三烯基、环辛基、环辛二烯基、二环(111)戊烷和二环(222)辛烷。C3-C8碳环基或C3-C10碳环基可是未取代的或被至多7个基团取代，所述基团包括但不限定于C1-C8烷基、C1-C8杂烷基、OR'、芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(＝O)2R'、-S(＝O)R'、-OH、-卤素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2和-CN；其中R'各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基。当所用的术语"碳环基"未提及具体碳数时，具有多于10个碳的碳环基，例如具有11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个碳的环体系也是可能的，且与C3-C10碳环基一起涵盖在内。在所有碳原子为饱和(即，结合至氢或如下所提及的其他取代基，而没有双键或叁键)的情况下，术语"环烷基"是指碳环或环体系。
术语"手性"是指具有与镜像分子不可重合的性质的分子，而术语"非手性"是指可与其镜像分子重合的分子。
术语"立体异构体"是指具有相同的化学构造，但原子或基团在空间中的排列不同的化合物。
"非对映异构体"是指具有二个或更多个手性中心，且其分子彼此不为镜像的立体异构体。非对映异构体具有不同的物理性质，例如熔点、沸点、波谱性质和反应性。非对映异构体混合物可在高分别率分析操作下(诸如电泳和色谱法)分离。
本文所用的立体化学定义和惯例通常遵循S.P.Parker,Ed.,McGraw-HillDictionary of Chemical Terms,McGraw-Hill Book Company,New York(1984)；以及Eliel和Wilen,Stereochemistry of Organic Compounds,John Wiley&Sons,Inc.,NewYork(1994)。许多有机化合物以旋光形式存在，即，它们具有将平面偏振光的平面旋转的能力。在描述旋光化合物时，前缀D和L、或R和S用于表示分子关于其手性中心的绝对构型。前缀d和l或(+)和(-)用于指示平面偏振光被化合物旋转的现象，并且(-)或l意指化合物为左旋的。以(+)或d为前缀的化合物则为右旋的。对于给定的化学结构，这些立体异构体为相同的，但它们彼此为镜像的除外。特异性立体异构体也称为对映异构体，并且此类异构体的混合物通常称为对映异构体混合物。对映异构体的50:50混合物称为外消旋混合物或外消旋物，其可发生在化学反应或过程中没有立体选择或立体特异性的情况下。术语"外消旋混合物"和"外消旋物"是指两种对映异构体物质的等摩尔混合物，其没有旋光性。
氨基酸"衍生物"包括具有通过母体氨基酸的共价连接(例如通过烷基化、糖基化、乙酰化、磷酸化等)而进行的取代或修饰的氨基酸。"衍生物"的定义范围内进一步包括例如具有取代的连接以及本领域已知的其他修饰的一种或多种氨基酸类似物。
除非上下文另外指出，否则"天然氨基酸"是指精氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、赖氨酸、甘氨酸、丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、脯氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸和缬氨酸。
如本文所用，措辞"药学上可接受的盐"是指化合物的药学上可接受的有机盐或无机盐。化合物通常含有至少一个氨基，因此酸加成盐可以与该氨基形成。示例性盐包括但不限定于硫酸盐、柠檬酸盐、乙酸盐、草酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸氢盐、磷酸盐、酸性磷酸盐、异烟碱酸盐、乳酸盐、水杨酸盐、酸性柠檬酸盐、酒石酸盐、油酸盐、鞣酸盐、泛酸盐、酒石酸氢盐、抗坏血酸盐、琥珀酸盐、马来酸盐、龙胆酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、葡萄糖醛酸盐、糖质酸盐、甲酸盐、苯甲酸盐、谷氨酸盐、甲磺酸盐、乙磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐和双羟萘酸盐(即1,1'-亚甲基-双-(2-羟基-3-萘甲酸盐))。药学上可接受的盐可涉及到包含另一分子，例如乙酸根离子、琥珀酸根离子或其他抗衡离子。抗衡离子可为可使母体化合物上的电荷稳定化的任何有机部分或无机部分。此外，药学上可接受的盐可在其结构中具有多于一个的带电原子。多个带电原子为药学上可接受的盐的一部分的情况可具有多个抗衡离子。因此，药学上可接受的盐可具有一个或多个带电原子和/或一个或多个抗衡离子。
术语"负载"或"药物负载"或"有效负载"表示或是指ADC分子中每个抗体的平均有效负载(在本文中"有效负载(payload)"和"多个有效负载(payloads)"可与"药物(drug)"和"多个药物(drugs)"互换使用)数。药物负载可为1至20个药物/抗体。这有时称为DAR，或药物/抗体比。本文所述的ADC的组合物通常具有1至20的DAR，并且在某些实施方案中为1至8、2至8、2至6、2至5和2至4。典型的DAR值为2、4、6和8。每个抗体的药物平均数(或DAR值)可以由常规方法如UV/可见光谱法、质谱法、ELISA测定和HPLC来表征。还可测定定量的DAR值。一些情况下，具有特定DAR值的同质ADC的分离、纯化和表征可通过诸如逆相HPLC或电泳等方法实现。DAR可被抗体上的连接位点的数量所限制。例如，在连接为半胱氨酸硫醇的情况下，抗体可仅具有一个或数个半胱氨酸硫醇基团，或者可仅具有一个或数个具有足够反应性的硫醇基团，连接基单元可经由所述硫醇基团连接。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇为半胱氨酸残基的硫醇基团，其形成链间二硫键。在一些实施方案中，半胱氨酸硫醇为半胱氨酸残基的硫醇基团，其不形成链间二硫键。通常，少于理论最大值的药物部分在缀合反应期间与抗体缀合。抗体可含有例如许多不与连接基或连接基中间体反应的赖氨酸残基。仅有最具反应性的赖氨酸基团可与反应性连接基试剂反应。
通常，抗体不包含许多(若有的话)可经由连接基与药物连接的游离和反应性半胱氨酸硫醇基团。抗体中大多数的半胱氨酸硫醇残基以二硫桥形式存在且必须被还原剂如二硫苏糖醇(DTT)还原。抗体可经历变性条件以显出反应性亲核基团，例如赖氨酸或半胱氨酸。ADC的负载(药物/抗体比)可以多种不同方式控制，包括：(i)限制药物-连接基相对于抗体的摩尔过量，(ii)限制缀合反应时间或温度，以及(iii)用于半胱氨酸硫醇修饰的部分或限制性还原条件。在多于一个的亲核基与药物-连接基反应的情况下，所得的产物为具有一个或多个药物部分/抗体的分布的ADC混合物。每个抗体的药物平均数可通过例如双重ELISA抗体测定(对抗体具特异性且对药物具特异性)从混合物中计算。各ADC可通过质谱法在混合物中鉴定出，并且通过HPLC(例如疏水性相互作用色谱法)分离。
以下是本申请中可能不另外定义或说明的缩写和定义的列表：DMSO(是指二甲亚砜)，HRMS(是指高分辨率质谱法)，DAD(是指二极管阵列检测)，TFA(是指2,2,2-三氟乙酸或三氟乙酸)，TFF(是指切向流过滤)，EtOH(是指乙醇)，MW(是指分子量)，HPLC(是指高效液相色谱法)，prep HPLC(是指制备型高效液相色谱法)，etc.(是指等等)，trityl(是指三苯甲基)，THF(是指四氢呋喃)，NHS(是指1-羟基-2,5-吡咯烷二酮)，Cbz(是指羧苄基)，eq.(是指当量)，n-BuLi(是指正丁基锂)，OAc(是指乙酸酯)，MeOH(是指甲醇)，i-Pr(是指异丙基或丙-2-基)，NMM(是指4-甲基吗啉)，并且"-"(在表格中是指此时无数据可得)。
如本文所用，"H/C"是指这样的曲妥珠单抗(商标名
Figure BDA0000751870110000291
)，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其半胱氨酸残基之一而结合(至连接基或本发明的化合物)。
如本文所用，"H/K"是指这样的曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其赖氨酸残基之一而结合(至连接基或本发明化合物)。
如整个本申请所用，氨基酸残基编号(例如：在114位的丙氨酸)基于Kabat法的EU指数。
如本文所用，"H/TG1-(Q)"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其天然或工程化谷氨酰胺残基(其位于包埋在抗体内的转谷氨酰胺酶肽(TG1)底物标签中)之一而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-A114C/C114"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸(其取代重链114位的丙氨酸)之一而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-K392C+L443C/C392+C443"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸残基(其取代重链392位的赖氨酸和重链443位的亮氨酸)之一或二者而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-E388C+N421C/C388+C421"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸残基(其取代重链388位的谷氨酸和重链421位的天冬酰胺)之一或二者而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-Q347C+K392C/C347+C392"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸残基(其取代重链347位的谷氨酰胺和重链392位的赖氨酸)之一或二者而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-L443C+kK183C/C443+kC183"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸(其取代重链443位的亮氨酸和轻(κ)链183位的赖氨酸)之一或二者而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-Q347C+L443C/C347+C443"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸(其取代重链347位的谷氨酰胺和重链443位的亮氨酸)之一或二者而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-kK183C/kC183"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸(其取代轻(κ)链183位的赖氨酸)而结合(至连接基或本发明化合物)。
如本文所用，"H-N421C/C421"是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化半胱氨酸(其取代重链421位的天冬酰胺)而结合(至连接基或本发明化合物)。
通常，如本文所用，“H-(AA1)###(AA2)/(AA2)###”(其中(AA1)和(AA2)为第一和第二氨基酸)是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化(AA2)(其取代重链###位的(AA1))而结合至本发明化合物，其中###表示一个或多个相关氨基酸的位置。类似的标记"k"或κ"会指代轻链上的取代。
同样地，如本文所用，“H-(AA1)###(AA2)+(AA3)####(AA4)/(AA2)###+(AA4)####”(其中(AA1)、(AA2)、(AA3)和(AA4)为第一、第二、第三和第四氨基酸)是指这样的工程化曲妥珠单抗，其为干扰HER2/neu受体的单克隆抗体，经由其工程化(AA2)(其取代重链###位的(AA1))而结合至本发明化合物(其中###表示一个或多个相关氨基酸的位置)，并且也经由其工程化(AA4)(其取代重链####位的(AA3))而结合至本发明化合物(其中####表示相关氨基酸的位置)。类似的标记"k"或κ"会指代轻链上的取代。
如本文所用，“-PABC-”或“PABC”是指下述结构或其变体：
Figure BDA0000751870110000311
如本文所用，“-PABA-”或“PABA”是指下述结构或其变体：
Figure BDA0000751870110000312
化合物及其抗体药物缀合物
根据一个方面，本发明涉及一种或多种式(I)的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure BDA0000751870110000313
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
R1选自：-R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
R13独立地选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR、-(C(R)2)m-O-NRR和-S-S-C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自氢和-C1-6烷基；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(II)的化合物或其药学上可接受的盐：
L-P
(II)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P结合；
P为式(I)的基团：
Figure BDA0000751870110000331
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9为-(C(R)2)m-C(O)-或-(C(R)2)m-；
L1选自：-卤素、-NR2、
Figure BDA0000751870110000341
Figure BDA0000751870110000342
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000351
Figure BDA0000751870110000352
中的一个或多个，
或L3不存在；
R13选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S–C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自氢和-C1-6烷基；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(II’)的化合物或其药学上可接受的盐：
L-P’
(II’)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P’结合；
P’为式(I’)的基团：
Figure BDA0000751870110000361
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-(C(R)2)m-、-OR”、-OCOR13’、-OC(O)NRR14’、-OCON(R)N(R)-和-NR-；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
L1选自：-卤素、-NR2、
Figure BDA0000751870110000371
Figure BDA0000751870110000372
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000381
中的一个或多个，或L3不存在；
R13’选自键、-C1-6亚烷基-、-C3-8碳环基-、-C3-8杂环基-、-C1-6烷基-C6-14芳基-、-C1-6烷基-C5-14杂芳基-；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R14’各自独立地选自：键、-NR-、-C3-10碳环基-、-C3-10杂环基-、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR’、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR-和-C1-6亚烷基-；
其中R14’任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-NRR或-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自：氢和-C1-6烷基；
R’各自独立地选自：-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基；
R”各自独立地选自：键和-C1-6亚烷基-；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据又一方面，本发明涉及一种或多种式(III)的化合物或其药学上可接受的盐：
(AB)-(L-P)b
(III)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P结合；
P为式(I)的基团：
Figure BDA0000751870110000391
其中：
虚线表示任选的键；
AB为抗体；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自-：R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9为-(C(R)2)m-C(O)-或-(C(R)2)m-；
L1选自与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000401
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000411
中的一个或多个，或L3不存在；
R13独立地选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自氢和-C1-6烷基；并且
b为1至20；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
根据另一方面，本发明涉及一种或多种式(III’)的化合物或其药学上可接受的盐：
(AB)-(L-P’)b
(III’)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P’结合；
P’为式(I’)的基团：
Figure BDA0000751870110000421
其中：
虚线表示任选的键；
AB为抗体；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-(C(R)2)m-C(O)-、-(C(R)2)m-、-OR”、-OCOR13’、-OCONRR14’、-OCON(R14)N(R15)-和-NR14-；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5烷-1-亚基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
L1选自与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000431
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；并且
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000432
中的一个或多个，或L3不存在；
R13’选自键、-C1-6亚烷基-、-C3-8碳环基-、-C3-8杂环基-、-C1-6烷基-C6-14芳基-、-C1-6烷基-C5-14杂芳基-；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R14’各自独立地选自键、-NR-、-C3-10碳环基-、-C3-10杂环基-、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR’、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR-和-C1-6亚烷基-；
其中R14’任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-NRR或-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R各自独立地选自：氢和-C1-6烷基；
R’各自独立地选自-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基；
R”各自独立地选自：键和-C1-6亚烷基-；并且
b为1至20；并且
m各自独立地为0、1、2或3。
应注意，以上所述的二价变量用于描述在适当情况下，此类基团在分子内以多重方向定位。因此，例如(引用但为单个实例)，在L1与L3之间的L2部分"-PABC-Cit-Val-C(O)-C1-6烷基-"可定位成L1-PABC-Cit-Val-C(O)-C1-6烷基-L3或L1-C1-6烷基-C(O)-Val-Cit-PABC-L3。同样地，L2在本文中定义成包含L2A-L2B-L2C，其架构同样可以多重方向定位。
因此，在某些实施方案中，提供了式III或III’的ADC，其具有下列组份顺序：
AB-L1-L2-L3-P；
AB-L1-L2-L3-P’；
AB-L1-L2A-L2B-L2C-L3-P；或
AB-L1-L2C-L2B-L2A-L3-P。
根据情况，本文所述的某些化学基团和部分是优选的。因此，在本发明的某些实施方案中，包括有关本文所述和所要求保护的各种有效负载、连接基-有效负载及ADC，下列中的一种或多种(或所有、或无一)可以适用：
在本发明的某些实施方案中，X1优选为-O-。
在本发明的某些实施方案中，X2优选为-NR-。
在本发明的某些实施方案中，R1优选地选自：-OR、-OCOR13、-OCONR14R15和-NR14R15。
在本发明的某些实施方案中，R2优选为C1-6烷基，且更优选为甲基。
在本发明的某些实施方案中，R3优选为C1-6烷基，且更优选为甲基。
在本发明的某些实施方案中，R4优选为氢或-OR。
在本发明的某些实施方案中，R5优选为氢或-OR。
在本发明的某些实施方案中，优选地，R6和R7各自独立地选自：羟基和任选地被1至3个独立地选自卤素的取代基取代的C1-6烷基，或者R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代。
在本发明的某些实施方案中，R8优选为氢或-OR。
在本发明的某些实施方案中，R9独立地选自-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15和-(C(R)2)m-N(R)COR13。
在本发明的某些实施方案中，R13优选地选自：氢、C1-6烷基。
在本发明的某些实施方案中，优选地，R14和R15各自独立地选自：氢、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环；其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR、-(C(R)2)m-O-NRR和-S-S-C1-6烷基-NRR。
在本发明的某些实施方案中，优选地m为0。在本发明的某些实施方案中，优选地m为1。在本发明的某些实施方案中，优选地m为2。在本发明的某些实施方案中，优选地m为3。
在本发明的某些实施方案中，优选地，X2为-NH-，X1为-O-，R1为-OCOR13、-OH或-OCONR14R15，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7一起形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-CO-，R13为C1-6烷基(更优选地为甲基)，R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
L1为
Figure BDA0000751870110000461
并且L2A、L2B、L2C和L3均不存在。或者，R6为-OH且R7为任选地被1至3个独立地选自卤素(氯是更优选的)的取代基取代的C1-6烷基。
在本发明的某些实施方案中，优选地，X2为-NH-，X1为-O-，R1为-OCOR13、-OH或-OCONR14R15，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7一起形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，R13为C1-6烷基(更优选地为甲基)，R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，L1为卤素，L3为-NR-C1-6烷基-NR(其中R更优选地为氢且所述烷基更优选地为乙基)，L2A为-C(O)-C1-6烷基-且L2B和L2C不存在。
在本发明的某些实施方案中，优选地，X2为-NH-，X1为-O-，R1为-OCOR13(其中R13更优选地为氢)，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7一起形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，R13为C1-6烷基(更优选地为甲基)，R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，L1为卤素，L3为-NR-C1-6烷基-NR(其中R更优选地为氢且所述烷基更优选地为乙基)，L2A为-C(O)-C1-6烷基-且L2B和L2C不存在。
在本发明的某些实施方案中，优选地，R1为-OCOR13或-OR，其中R更优选地为氢，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，L3为-NR-NR-(其中每个R更优选地为氢或甲基或者所述两个R取代基一起形成6元环)，L1为卤素、-NR2或
Figure BDA0000751870110000471
L2C为PABC，L2B为-Cit-Val-，L2A为-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-。
在本发明的某些实施方案中，优选地，R1为-OCOR13或-OR，其中R更优选地为氢，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，L3为-NR-NR-(其中每个R更优选地为氢或甲基或者所述两个R取代基一起形成6元环)，L1为卤素、-NR2或
Figure BDA0000751870110000472
L2C不存在；L2B为-Ala-Val-，并且L2A为-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-或-C(O)C1-6烷基-。
在本发明的某些实施方案中，优选地，L1选自：-卤素、-NR2、
Figure BDA0000751870110000481
在本发明的某些实施方案中，优选地，R1为-OCOR13’，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R9为-(C(R)2)m-C(O)NR14R15，其中R14和R15更优选地为氢，R13’为键，L3为
Figure BDA0000751870110000482
其中m为0，X'为N，X"为-N-且X”'不存在，L1为卤素，L2C为PABC，L2B为-Cit-Val-且L2A为-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-。
在本发明的某些实施方案中，优选地，X2为-NH-，X1为-O-，R1为-OCOR13、-OH或-OCONR14R15，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7一起形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-CO-，R13为C1-6烷基(更优选地为甲基)，R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，L1选自与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000483
并且L2A、L2B、L2C和L3均不存在。或者，R6为-OH且R7为任选地被1至3个独立地选自卤素(氯是更优选的)的取代基取代的C1-6烷基。
在本发明的某些实施方案中，优选地，X2为-NH-，X1为-O-，R1为-OCOR13、-OH或-OCONR14R15，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7一起形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-CO-，R13为C1-6烷基(更优选地为甲基)，R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，L1选自与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000491
为-NR-C1-6烷基-NR(其中R更优选地为氢且所述烷基更优选地为乙基)，L2A为-C(O)-C1-6烷基-且L2B和L2C不存在。
在本发明的某些实施方案中，优选地，X2为-NH-，X1为-O-，R1为-OCOR13(其中R13更优选地为氢)，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7一起形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，R13为C1-6烷基(更优选地为甲基)，R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，L1选自：与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000492
为-NR-C1-6烷基-NR(其中R更优选地为氢且所述烷基更优选地为乙基)，L2A为-C(O)-C1-6烷基-且L2B和L2C不存在。
在本发明的某些实施方案中，优选地，R1为-OCOR13或-OR(其中R更优选地为氢)，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，L3为-NR-NR-(其中每个R更优选地为氢或甲基或者所述两个R取代基一起形成6元环)，L1选自：与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000493
为PABC，L2B为-Cit-Val-，L2A为-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-。
在本发明的某些实施方案中，优选地，R1为-OCOR13或-OR(其中R更优选地为氢)，R2为甲基，R3为甲基，R4为-OH，R5为氢，R8为氢，R6和R7形成环氧化物，R9为-(C(R)2)m-C(O)-，L3为-NR-NR-(其中每个R更优选地为氢或甲基或者所述两个R取代基一起形成6元环)，L1选自：与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000501
不存在，L2B为-Ala-Val-且L2A为-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-。
在本发明的某些实施方案中，优选地，L1选自：与AB连接的键、-NR-(与AB结合)和
Figure BDA0000751870110000502
在本发明的某些实施方案中，优选地，所述抗体选自曲妥珠单抗、(C392+L443)曲妥珠单抗突变体以及(C392+C443)曲妥珠单抗突变体。
在本发明的某些实施方案中，优选地，所述抗体在转谷氨酰胺酶的存在下经由用含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如含Gln的肽标签或Q-标签)工程化的含Fc或含Fab的多肽或通过多肽工程化(例如经由在多肽上的氨基酸删除、插入、取代、突变、或其组合)而产生反应性的内源性谷氨酰胺(即在胺和转谷氨酰胺酶的存在下作为酰基供体形成共价键的能力)结合。
在某些实施方案中，本发明涉及任何前述的抗体药物缀合物以及随附的定义，其中所述抗体药物缀合物包含2、3、4、5、6、7、8、9或10个本发明的化合物。
在某些实施方案中，本发明涉及任何前述的抗体药物缀合物以及随附的定义，其中所述抗体药物缀合物包含3或4个本发明的化合物。
典型地，本发明的含羧基和/或氨基的化合物相对于不含羧基的化合物具有明显且独特的优点。一个这样的优点为改善的水溶性。另一优点为在水中及在生物学流体如血清、血液、脑脊髓液中及在药物制剂中的改善的化学稳定性。又一优点为通过将其与适当的阴离子如氯离子、乙酸根和其他抗衡离子配对以容易地制备羧酸酯化合物的盐形式的能力。此外，本发明的羧酸酯化合物可容易地用于制备针对癌细胞系和癌症具有有效且改善的细胞毒性的酰胺和酯衍生物。含羧酸酯的化合物额外地具有的优点为其与抗体连接的能力，因为羧酸基团可与经适当修饰的带有胺、醇及其他基团的连接基分子反应以获得有效负载-连接基。羧酸化合物也可被直接官能化以获得活化的羧酸衍生物，其可随后在不附加额外的连接基的情况下与抗体缀合。例如，本发明的含羧酸的化合物可与N-羟基琥珀酰亚胺反应以获得活化的羧基-NHS酯。因此，所制得的羧基-NHS酯和有效负载-连接基可接着与抗体反应以产生抗体药物缀合物。
抗体单元(Ab或AB)
如上所述，本文中术语"抗体"(或"Ab"或"AB")以最广义的含义使用且特别涵盖完整的单克隆抗体、多克隆抗体、单特异性抗体、多重特异性抗体(例如双特异性抗体)以及表现出期望的生物学活性的抗体片段。此外，虽然本文所述的本发明的某些方面是指抗体药物缀合物，但进一步设想到缀合物中的抗体部分可被特异性地同受体、抗原或与给定靶标细胞族群相关的其他各部分结合或反应性联合或复合的任何事物所替代。例如，本发明的缀合物会含有靶向分子而非含有抗体，所述靶向分子可与受体、抗原或寻求治疗修饰或其他生物学修饰的细胞族群的其他接受性部分结合、复合或反应。此类分子的实例包括较小分子量的蛋白质、多肽或肽、凝集素、糖蛋白、非肽、维生素、营养物运输分子(诸如但不限定于转铁蛋白)、或任何其他细胞结合分子或物质。在某些方面，抗体或其他此类靶向分子用于将药物递送至与抗体或其他靶向分子相互作用的特定靶标细胞族群。
在另一方面，本发明涉及式III或III’的抗体药物结合化合物，其中抗体AB选自：曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体(例如在本文中或在国际专利申请PCT/IB2012/056234中公开的曲妥珠单抗突变体)、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿伦珠单抗、包括用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗体在内的抗-HLA-DR抗体、131I Lym-1、包括用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的鼠抗-HLA-Dr10抗体的抗-HLA-Dr10抗体、抗-cd33抗体、包括用于治疗霍金奇氏病或非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-CD22mAb在内的抗-cd22抗体、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗和吉妥珠单抗。
可存在于抗体单元上的杂原子包括硫(在一个实施方案中，来自抗体的巯基)、氧(在一个实施方案中，来自抗体的羰基、羧基或羟基)以及氮(在一实施方案中，来自抗体的伯氨基或仲氨基)。这些杂原子可存在于处于抗体自然状态的抗体(例如天然存在的抗体)上，或者可经由化学修饰而引入抗体中。
在一实施方案中，抗体单元具有巯基且抗体单元经由巯基的硫原子结合。
在另一实施方案中，所述抗体具有赖氨酸残基，其可与活化酯(此类酯包括但不限定于，N-羟基琥珀酰亚胺、五氟苯酯和对硝基苯酯)反应，因此形成由抗体单元的氮原子与羰基组成的酰胺键。
在又一方面，抗体单元具有一个或多个赖氨酸残基，其可经化学修饰以引入一个或多个巯基。可用于修饰赖氨酸的试剂包括但不限定于N-琥珀酰亚胺基S-乙酰基硫代乙酸酯(SATA)和2-亚氨基硫烷盐酸盐(特劳特试剂(Traut's Reagent))。
在另一实施方案中，抗体单元可具有一个或多个糖基(carbohydrate group)，其可经化学修饰以具有一个或多个巯基。
在又一实施方案中，抗体单元可具有一个或多个糖基，其可经氧化以提供醛基(例如参见Laguzza等人，1989,J.Med.Chem.32(3):548-55)。相应的醛可与反应位点如肼和羟胺形成键。用于蛋白质修饰以供药物连接或联合的其他方案描述于Coligan等人，CurrentProtocols in Protein Science,vol.2,John Wiley&Sons(2002)中(援引加入本文)。
当所述缀合物包含非免疫反应性蛋白质、多肽或肽单元以代替抗体时，可用的非免疫反应性蛋白质、多肽或肽单元包括但不限定于转铁蛋白、表皮生长因子("EGF")、铃蟾素、胃泌素、胃泌素释放肽、血子板衍生性生长因子、IL-2、IL-6、转化生长因子("TOP")如TGF-α和TGF-β、牛痘生长因子("VGF")、胰岛素和类胰岛素生长因子I和II、生长激素抑制素、凝集素以及源自低密度脂蛋白的脱辅基蛋白。
可用的多克隆抗体为由受免疫的动物的血清中衍生的异质性抗体分子族群。可用的单克隆抗体为针对特定抗原决定位(例如癌细胞抗原、病毒抗原、微生物抗原、蛋白质、肽、糖、化学物、核酸或其片段)的同质性抗体族群。针对所关注的抗原的单克隆抗体(mAb)可通过使用本领域已知的提供通过培养物中的连续细胞系来产生抗体分子的任何技术而制备。
可用的单克隆抗体包括但不限定于人类单克隆抗体、人源化单克隆抗体、抗体片段或嵌合单克隆抗体。人类单克隆抗体可通过本领域已知的许多技术中的任一种而制得(例如，Teng等人，1983,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.80:7308-7312；Kozbor等人，1983,Immunology Today 4:72-79；以及Olsson等人，1982,Meth.Enzymol.92:3-16)。
抗体还可以为双特异性抗体。制备双特异性抗体的方法是本领域已知的并且在下文讨论。
抗体可为免疫特异性地结合至靶标细胞(例如癌细胞抗原、病毒抗原或微生物抗原)的抗体或其他结合至肿瘤细胞或基质的抗体的功能活性片段、衍生物或类似物。对此，"功能活性"意指该片段、衍生物或类似物能够引起抗-抗-个体基因型抗体，其识别与衍生该片段、衍生物或类似物的抗体所识别的抗原相同的抗原。具体地，在示例性实施方案中，免疫球蛋白分子的个体基因型的抗原性可通过删除框架以及CDR序列(其为特异性地识别抗原的CDR序列的C端)而增强。为了测定那个CDR序列结合抗原，可将含CDR序列的合成肽与抗原通过本领域已知的任何结合测定法(例如BIA核测定)一起用于结合测定中(对于CDR序列的位置，参见，例如Kabat等人,1991,Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,Md.；Kabat E等人,1980,J.Immunology 125(3):961-969)。
其他可用的抗体包括抗体的片段，诸如但不限定于F(ab')2片段、Fab片段、Fvs、单链抗体、双特异抗体、三特异抗体、四特异体、scFv、scFv-FV或具有与抗体相同的特异性的任何其他分子。
另外，重组抗体(诸如嵌合和人源化单克隆抗体(包含人和非人部分，其可通过使用标准重组DNA技术制得))是有用的抗体。嵌合抗体为其中不同部分由不同的动物物种衍生(例如具有由鼠单克隆和人免疫球蛋白恒定区衍生的可变区)的分子。(参见，例如，第4,816,567号美国专利；以及第4,816,397号美国专利，其整体援引加入本文。)人源化抗体为来自非人物种的抗体分子，其具有一个或多个来自非人物种的互补决定区(CDR)以及具有来自人免疫球蛋白分子的框架区。(参见，例如，第5,585,089号美国专利，其整体援引加入本文。)此类嵌合和人源化单克隆抗体可通过本领域已知的重组DNA技术而制备，例如使用第WO 87/02671号国际公开；第0 184 187号欧州专利公开；第0 171 496号欧州专利公开；第0 173 494号欧州专利公开；第WO 86/01533号国际公开；第4,816,567号美国专利；第012023号欧州专利公开；Berter等人,1988,Science 240:1041-1043；Liu等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:3439-3443；Liu等人,1987,J.Immunol.139:3521-3526；Sun等人,1987,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:214-218；Nishimura等人,1987,Cancer.Res.47:999-1005；Wood等人,1985,Nature 314:446-449；以及Shaw等人,1988,J.Natl.CancerInst.80:1553-1559；Morrison,1985,Science 229:1202-1207；Oi等人,1986,BioTechniques 4:214；第5,225,539号美国专利；Jones等人,1986,Nature 321:552-525；Verhoeyan等人,1988,Science 239:1534；以及Beidler等人,1988,J.Immunol.141:4053-4060中所述的方法；其各自整体援引加入本文。
完全的人类抗体是特别期望的，并且可使用不能表达内源性免疫球蛋白重链和轻链基因但可表达人类重链和轻链基因的转基因小鼠产生。转基因小鼠以正常方式使用经选定的抗原如本发明的所有或一部分多肽进行免疫。针对该抗原的单克隆抗体可使用常用的杂交瘤技术而获得。转基因小鼠所携带的人免疫球蛋白转基因在B细胞分化期间重新排列，随后经历类别转换和体细胞突变。因此，使用此类技术，可能制备治疗上有用的IgG、IgA、IgM和IgE抗体。对于制备人类抗体的这种技术，参见Lonberg和Huszar,1995,Int.Rev.Immunol.13：65-93。对于制备人类抗体和人类单克隆抗体的这种技术以及制备此类抗体的方案的详细讨论，参见例如第5,625,126、5,633,425、5,569,825、5,661,016、5,545,806号美国专利，其各自整体援引加入本文。其他人类抗体可购自例如Abgenix,Inc.(现在的Amgen,Freemont,Calif.)和Medarex(Princeton,N.J.)。
识别所选定的抗原决定位的完全人类抗体可使用称为"导向选择"的技术而生成。在该方法中，所选定的非人类单克隆抗体(例如小鼠抗体)用于引导认识相同表位的完全人类抗体的选择。(参见，例如，Jespers等人,1994,Biotechnology 12:899-903)。人类抗体也可使用本领域已知的各种技术制备，包括噬菌体展示库(例如，参见，Hoogenboom和Winter,1991,J.Mol.Biol.227:381；Marks等人.,1991,J.Mol.Biol.222:581；Quan和Carter,2002,The rise of monoclonal antibodies as therapeutics,In Anti-IgE和AllergicDisease,Jardieu and Fick,eds.,Marcel Dekker,New York,N.Y.,Chapter 20,pp.427-469)。
在另一实施方案中，所述抗体为抗体的融合蛋白，或其功能活性片段，例如其中抗体在N端或C端经由共价键(例如肽键)融合至非来自抗体的另一蛋白质的氨基酸序列(或其部分，优选地蛋白质的至少10、20或50个氨基酸部分)的那些。优选地，抗体或其片段在恒定结构域的N端共价连结至其他蛋白质。
抗体包括经修饰(即通过分子的任何类型的共价连接，只要这样的共价连接允许抗体保留其抗原结合免疫特异性即可)的类似物和衍生物。例如但非限制地，抗体的衍生物和类似物包括已进一步例如通过糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、已知的保护基/阻断基的衍生化、蛋白水解性裂解、与细胞抗体单元或其他蛋白质连接等修饰的那些。诸多化学修饰中的任一种可通过已知技术进行，包括但不限定于特异性化学裂解、乙酰化、甲酰化、在衣霉素存在下的代谢合成等。另外，类似物或衍生物可含有一种或多种非天然氨基酸。
抗体可在与Fc受体相互作用的氨基酸残基中具有修饰(例如取代、删除或增加)。特别地，抗体可在经鉴定涉及抗-Fc结构域与FcRn受体之间的相互作用的氨基酸残基中具有修饰(参见，例如，第WO 97/34631号国际公开，其整体援引加入本文)。
对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体可商业获得或可通过本领域技术人员已知的任何方法如化学合成法或重组表达技术制备。编码对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可由例如GenBank数据库或与其类似的数据库、文献公开、或通过常规克隆和测序而获得。
在一特定实施方案中，可使用用于治疗癌症的已知抗体。对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体可商业获得或可通过本领域技术人员已知的任何方法如重组表达技术制备。编码对癌细胞抗原有免疫特异性的抗体的核苷酸序列可由例如GenBank数据库或与其类似的数据库、文献公开、或通过常规克隆和测序而获得。可用于治疗癌症的抗体的实例包括但不限定于：OVAREX，其为用于治疗卵巢癌的鼠抗体；PANOREX(Glaxo Wellcome,NC)，其为用于治疗结肠直肠癌的鼠IgG2a抗体；Cetuximab ERBITUX(Imclone Systems Inc.,NY)，其为用于治疗表皮生长因子阳性癌症如头颈癌的抗-EGFR IgG嵌合抗体；Vitaxin(MedImmune,Inc.,MD)，其为用于治疗肉瘤的人源化抗体；CAMPATH I/H(Leukosite,MA)，其为用于治疗慢性淋巴球性白血病(CLL)的人源化IgG1抗体；SMART ID10(Protein Design Labs,Inc.,CA)，其为用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-HLA-DR抗体；ONCOLYM(Techniclone,Inc.,CA)，其为用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的放射性标记的鼠抗-HLA-Dr10抗体；ALLOMUNE(BioTransplant,CA)，其为用于治疗霍金奇氏病或非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-CD2mAb；以及CEACIDE(Immunomedics,NJ)，其为用于治疗结肠直肠癌的人源化抗-CEA抗体。
尝试发现用于癌症诊断和治疗的有效细胞靶标，研究者已寻求鉴别跨膜或其他的肿瘤相关性多肽，所述多肽与一种或多种正常非癌性细胞相比在一个或多种特定类型的癌细胞的表面上特异性地表达。通常，与在非癌性细胞的表面上相比，此类肿瘤相关性多肽更为丰富地在癌细胞的表面上表达。此类肿瘤相关性细胞表面抗原多肽的鉴别产生了特异性地靶向癌细胞以经由基于抗体的疗法进行破坏的能力。
连接基单元(L)
连接基(本文有时称为“[连接基]”)为双官能化合物，其可用于连接药物和抗体以形成抗体药物缀合物(ADC)。此类缀合物可用于例如形成针对肿瘤相关性抗原的免疫缀合物。此类缀合物使细胞毒性药物选择性地递送至肿瘤细胞。
在ADC中，连接基用于将有效负载连接至抗体。
在一方面，连接基单元的第二区段被引入，其具有第二反应位点，例如亲电子基，可与抗体单元(例如抗体)上存在的亲核基团反应。抗体上可用的亲核基团包括但不限定于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接基单元上的亲电子基团反应且形成与连接基单元的共价键。可用的亲电子基团包括但不限定于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。亲电子基团提供用于抗体连接的便利位点。
在另一实施方案中，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上可用的亲电子基团包括但不限定于醛和酮羰基。连接基单元的亲核基的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体的共价键。连接基单元上可用的亲核基团包括但不限定于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲(thiosemicarbazone)、肼羧酸盐以及芳基酰肼。抗体上的亲电子基提供了用于与连接基单元连接的便利位点。
氨基官能基也是连接基单元可用的反应位点，因为它们可与化合物的羧酸或活化酯反应以形成酰胺键。通常，基于肽的本发明化合物可通过在二个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。此类肽键可例如根据肽化学领域中公知的液相合成法(参见，例如，Schroder和Lubke,"The Peptides",volume 1,pp 76-136,1965,Academic Press)制备。
在本发明的上下文中，特别是但不限定于连接基组份如L1、L2(包括L2A、L2B和L2C)以及L3，语言"选自...中的一个(种)或多个(种)"或"一个(种)或多个(种)"表示多种组份，其可相同或不同，为或可为连续排列的。因此，例如，L3可为-C1-6烷基-、-NR-或其他个别列出的组份，但也可为-C1-6烷基-NR-，或2个或更多个所列组份的任意其他组合。
化合物及其抗体药物缀合物的合成
本发明的化合物和缀合物可使用以下在实例中所述的合成步骤制得。如以下更详细地描述，本发明的化合物和缀合物可使用具有用于与化合物结合的反应位点的连接基单元区段来制备。在一方面，连接基单元的第二区段被引入，其具有第二反应位点，例如亲电子基，可与抗体单元(例如抗体)上存在的亲核基团反应。抗体上可用的亲核基团包括但不限定于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接基单元上的亲电子基团反应且形成与连接基单元的共价键。可用的亲电子基团包括但不限定于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。亲电子基团提供用于抗体连接的便利位点。
在另一实施方案中，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上可用的亲电子基团包括但不限定于醛和酮羰基。连接基单元的亲核基的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体的共价键。连接基单元上可用的亲核基团包括但不限定于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲、肼羧酸盐以及芳基酰肼。抗体上的亲电子基提供了用于与连接基单元连接的便利位点。
氨基官能基也是连接基单元可用的反应位点，因为它们可与化合物的羧酸或活化酯反应以形成酰胺键。通常，基于肽的本发明化合物可通过在二个或更多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键而制备。此类肽键可例如根据肽化学领域中公知的液相合成法(参见，例如，Schroder和Lubke,"The Peptides",volume 1,pp 76-136,1965,Academic Press)制备。
如以下更详细地描述，缀合物可使用具有用于与本发明化合物结合的反应位点的连接基区段以及引入具有用于抗体的反应位点的连接基单元的另一区段来制备。在一方面，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体单元(诸如抗体)上存在的亲核基团反应的亲电子基团。亲电子基团提供用于抗体连接的便利位点。抗体上可用的亲核基团包括但不限定于巯基、羟基和氨基。抗体的亲核基团的杂原子与连接基单元上的亲电子基团反应且形成与连接基单元的共价键。可用的亲电子基团包括但不限定于马来酰亚胺和卤代乙酰胺基团。
在另一实施方案中，连接基单元具有反应位点，其具有与抗体单元上存在的亲电子基团反应的亲核基团。抗体上的亲电子基提供了用于与连接基单元连接的便利位点。抗体上可用的亲电子基团包括但不限定于醛和酮羰基。连接基单元的亲核基的杂原子可与抗体上的亲电子基反应且形成与抗体的共价键。连接基单元上可用的亲核基团包括但不限定于酰肼、肟、氨基、肼、缩氨硫脲、肼羧酸盐以及芳基酰肼。
与转谷氨酰胺酶的缀合
在某些实施方案中，本发明的化合物可在转谷氨酰胺酶的存在下共价交联至用含酰基供体谷氨酰胺的标签(例如含Gln的肽标签或Q-标签)工程化的含Fc或含Fab的多肽、或通过多肽工程化(例如经由在多肽上的氨基酸删除、插入、取代、突变或其任何组合)而有反应性的内源性谷氨酰胺(即，在胺和转谷氨酰胺酶的存在下作为酰基供体形成共价键的能力)，条件是本发明的化合物包含胺供体物质(例如包含或连接至反应性胺的小分子)，由此与胺供体物质形成工程化含Fc的多肽缀合物的稳定且同质的族群，其中所述胺供体物质以位点特异性方式通过含酰基供体谷氨酰胺的标签或暴露/可进入/有反应性的内源性谷氨酰胺而缀合至含Fc或含Fab的多肽。例如，本发明的化合物可如第PCT/IB2011/054899号国际专利申请所述的那样缀合，其全部内容援引加入本文。在某些实施方案中，为了促进本发明的化合物在转谷氨酰胺酶的存在下缀合于用含酰基供体谷氨酰胺的标签工程化的含Fc或含Fab的多肽、或通过多肽工程化而有反应性的内源性谷氨酰胺，Z为NH2。
与人类轻链κ结构域恒定区的缀合
在某些实施方案中，本发明的化合物可共价连接至人类轻链κ结构域恒定区(CLκ)的K188侧链(根据Kabat的全轻链编号)。例如，本发明的化合物可如第13/180,204号美国申请所述的那样缀合，其全部内容援引加入本文。在某些实施方案中，为了促进与K188CLκ的结合，Z为
Figure BDA0000751870110000591
R7每次出现时独立地选自：F、Cl、I、Br、NO2、CN和CF3；并且h为1、2、3、4或5。
在某些实施方案中，本发明提供包含与抗体(或其抗原结合部分)共价缀合的本发明化合物的组合物，其中所述组合物中至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％的本发明化合物与抗体或其抗原结合部分在K188CLκ处缀合。
在某些实施方案中，本发明的化合物可缀合至催化性抗体如醛缩酶抗体或其抗原结合部分的结合位点。醛缩酶抗体包含结合位点部分，其在不受阻碍(例如通过缀合)时催化脂族酮供体与醛受体之间的醛醇加成反应。第US 2006/205670号美国专利申请公开的内容援引加入本文，特别是描述连接基的第78-118页，以及描述抗体、其可用的片段、变体和修饰、h38C2、结合位点和互补决定区(CDR)以及相关抗体技术的段落[0153]-[0233]。术语"结合位点"包括(CDR)和涉及抗原结合的邻近框架残基。
组合物及给药方法
在其他实施方案中，本发明的另一方面涉及药物组合物，其包含有效量的本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物以及药学上可接受的载体或载剂。在某些实施方案中，所述组合物适于兽医学或人类给药。
本发明的药物组合物可为允许组合物向患者给药的任何形式。例如，所述组合物可以为液体或固体形式。典型的给药途径包括(非限制)肠胃外、眼部和肿瘤内。肠胃外给药包括皮下注射、静脉内、肌内或胸骨注射或输注技术。在一方面，将所述组合物肠胃外给药。在一特定实施方案中，将所述组合物静脉内给药。
药物组合物可经配制以使本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物在将组合物给药患者后成为生物可利用的。所述组合物可采用一种或多种剂量单位的形式，其中例如，片剂可为单一剂量单位，并且液态形式的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物的容器则可容纳多个单位剂量。
用于制备药物组合物的物质在所用的量下可为无毒的。本领域普通技术人员清楚，药物组合物中活性成分的最佳剂量会取决于多种因素。相关的因素包括(但非限制)动物类型(例如人类)、本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物的特定形式、给药方式、以及所用的组合物。
药学上可接受的载体或载剂可为固体或颗粒，以使所述组合物为例如片剂或散剂形式。所述载体可以为液体。此外，所述载体可以为颗粒。
所述组合物可为液体形式，例如溶液剂、乳胶剂混悬剂。在通过注射来给药所述组合物时，也可包含一种或多种表面活性剂、防腐剂、湿润剂、分散剂、助悬剂、缓冲剂、稳定剂和等渗剂。
无论液体组合物是溶液剂、混悬剂还是其他类似形式，其也可包含下列中的一种或多种：无菌稀释剂，例如注射用水、盐水溶液，优选生理盐水、林格氏溶液、等渗氯化钠、非挥发油如合成的单酸和二酸甘油酯(其可用作溶剂或悬浮介质)、聚乙二醇、甘油、环糊精、丙二醇或其他溶剂；抗菌剂，例如苄醇或对羟苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；缓冲剂，例如乙酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐或氨基酸及用于调整张度的试剂如氯化钠或右旋糖。肠胃外组合物可包封在由玻璃、塑料或其他材料制成的安瓶、一次性注射器或多剂量小瓶中。生理盐水是示例性辅剂。可注射组合物优选是无菌的。
本发明化合物和/或其抗体药物缀合物在特定病症或病况的治疗中的有效量会取决于病症或病况的性质，并且可通过标准临床技术而确定。此外，体外或体内测定可任选地用于辅助鉴定最佳剂量范围。组合物中所用的精确剂量也会取决于给药途径以及疾病或病症的严重性，并且应根据医师的诊断及每个患者的情况而确定。
所述组合物包含有效量的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物，从而会获得适当的剂量。通常，该量以组合物重量计为至少约0.01％的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。在示例性实施方案中，制备药物组合物，以使肠胃外单位剂量包含约0.01重量％至约2重量％的的量本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。
对于静脉内给药，所述组合物可包含每公斤患者体重约0.01mg至约100mg本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。在一方面，所述组合物可包含每公斤患者体重约1mg至约100mg本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。在另一方面，所给药的量会为约0.1mg/kg至约25mg/kg体重的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。
通常，向患者给药的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物的剂量通常为约0.01mg/kg至约20mg/kg患者体重。在一方面，向患者给药的剂量为约0.01mg/kg至约10mg/kg患者体重。在另一方面，向患者给药的剂量为约0.1mg/kg至约10mg/kg患者体重。在又一方面，向患者给药的剂量为约0.1mg/kg至约5mg/kg患者体重。在又一方面，所给药的剂量为约0.1mg/kg至约3mg/kg患者体重。在又一方面，所给药的剂量为约1mg/kg至约3mg/kg患者体重。
本发明化合物和/或其抗体药物缀合物可通过任何便利的途径来给药，例如通过输注或快速浓注(bolus injection)。给药可以为全身或局部的。各种递送系统是已知的，例如封装在脂质体、微粒、微囊、胶囊等中，并且可用于给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。在某些实施方案中，向患者给药多于一种的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物。
在特定实施方案中，期望向需要治疗的区域局部给药一种或多种本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。这可通过以下实现：例如但非限制地，外科手术期间的局部输注；外科手术后的局部施用，例如与伤口敷料一起局部施用；通过注射；通过导管；或通过植入物，该植入物为多孔的、无孔的、或凝胶状材料，包括膜如硅橡胶膜或纤维。在一实施方案中，给药可通过在癌症、肿瘤或癌变组织或癌变前组织的部位(或较早的部位)处直接注射。在另一实施方案中，给药可通过自身免疫疾病表现的部位(或较早部位)处的直接注射。
在又一实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物可经控释系统而递送，诸如但不限定于，可以使用泵或各种聚合物材料。在又一实施方案中，控释系统可放置在本发明化合物和/或其抗体药物缀合物的靶标(例如肝脏)附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson的Medical Applications of Controlled Release,supra,vol.2,pp.115-138(1984))。可以使用由Langer(Science 249：1527-1533(1990))的综述中所讨论的其他控释系统。
术语"载体"是指可与化合物或其抗体药物缀合物一起给药的稀释剂、辅剂或赋形剂。此类药物载体可为液体，诸如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。载体可为盐水等。此外，可以使用辅剂、稳定剂及其他物质。在一个实施方案中，当向患者给药时，化合物或缀合物以及药学上可接受的载体为无菌的。当静脉内给药化合物或缀合物时，水为示例性载体。盐水溶液和右旋糖水溶液以及甘油溶液也可用作液体载体，尤其用于注射液。如有需要，本发明的组合物也可包含少量的湿润剂或乳化剂、或pH缓冲剂。
本发明的组合物可采用溶液剂、丸剂、散剂、缓释制剂形式、或任何其他适于使用的形式。合适的药物载体的其他实例描述于E.W.Martin的"Remington's PharmaceuticalSciences"中。
在一实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物根据常规操作而配制成适合于向动物(尤其是人类)静脉内给药的药物组合物。通常，用于静脉内给药的载体或载剂为无菌等渗缓冲水溶液。当需要时，所述组合物也可包含增溶剂。用于静脉内给药的组合物可任选地包含局部麻醉剂如利诺卡因以减轻注射部位的疼痛。通常，各成分被分别供应或一起混合于单位剂型中，例如作为在指示活性剂的量的诸如安瓶或药囊的密封容器中的干燥冻干粉末或不含水的浓缩物。当本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物要通过输注来给药时，其可例如使用含无菌药物等级的水或盐水的输注瓶来分配。当本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物要通过注射来给药时，可提供无菌注射用水或盐水的安瓶以便将各成分在给药前混合。
所述组合物可包含多种改变固体或液体剂量单位的物理形式的物质。例如，所述组合物可包含在活性成分周围形成包衣壳的材料。形成包衣壳的材料通常为惰性的，并可选自例如糖、虫胶或其他肠溶衣剂。或者，活性成分可以包封在明胶胶囊中。
无论处于固体或液体形式，本发明的组合物可包含用于治疗癌症的药剂。
化合物及其抗体药物缀合物的治疗用途
本发明的另一方面涉及使用本发明的化合物及其抗体药物缀合物来治疗癌症的方法。
本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物可用于抑制肿瘤细胞或癌细胞的增殖，导致肿瘤或癌细胞的细胞凋亡，或用于治疗患者的癌症。因此可在治疗动物癌症的多种情况下使用本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。所述缀合物可用于将本发明的化合物递送至肿瘤细胞或癌细胞。不受理论所束缚，在一实施方案中，所述缀合物的抗体与癌细胞或肿瘤细胞相关性抗原结合或联合，并且可通过受体介导的内吞作用或其他内化机制而在肿瘤细胞或癌细胞的内部摄取(内化)缀合物。抗原可连接至肿瘤细胞或癌细胞，或可为与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。在某些实施方案中，一旦在细胞内部，则一种或多种特异性肽序列通过一种或多种肿瘤细胞或癌细胞相关性蛋白酶而酶促裂解或水解裂解，导致本发明的化合物从缀合物中释放。所释放的本发明化合物随后自由地在细胞内迁移并诱导细胞毒性或细胞抑制活性。所述缀合物也可通过细胞内蛋白酶而裂解，以释放本发明的化合物。在又一实施方案中，本发明的化合物从肿瘤细胞或癌细胞外部的缀合物中裂解，并且本发明的化合物随后穿透细胞。
在某些实施方案中，所述缀合物提供缀合特异性肿瘤或癌症药物靶向，从而降低了本发明化合物的全身毒性。
在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞结合。
在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞抗原结合，所述抗原位于肿瘤细胞或癌细胞的表面上。
在另一实施方案中，抗体单元与肿瘤细胞或癌细胞抗原结合，所述抗原为与肿瘤细胞或癌细胞相关的细胞外基质蛋白。
抗体单元对特定肿瘤细胞或癌细胞的特异性对于确定最有效地治疗的那些肿瘤或癌症而言可为重要的。
可用本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物治疗的特定类型的癌症包括但不限定于：膀胱、乳房、子宫颈、结肠、子宫内膜、肾、肺、食道、卵巢、前列腺、胰脏、皮肤、胃和睪丸的癌症；以及血液癌症，包括但不限定于白血病和淋巴瘤。
癌症的多模式疗法：包括但不限于肿瘤、转移或以不受控的细胞生长为特征的其他疾病或病症的癌症可通过给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物而得到治疗或抑制。
在其他实施方案中，提供了治疗癌症的方法，其包括向有此需要的患者给药有效量的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物以及化学治疗剂。在一实施方案中，所述化学治疗剂为这样的化学治疗剂，即，使用其治疗癌症未被发现是难治的。在另一实施方案中，所述化学治疗剂为这样的化学治疗剂，即使用其治疗癌症已被发现是难治的。可向也经历作为癌症治疗的外科手术的患者给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物。
在一些实施方案中，患者也接受额外的治疗，诸如放射疗法。在一特定实施方案中，本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物与化学治疗剂或与放射疗法同时给药。在另一特定实施方案中，化学治疗剂或放射疗法在给药本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物之前或之后给药。
化学治疗剂可在一系列疗程(session)内给药。可以给药化学治疗剂中的任一种或组合，诸如标准护理化学治疗剂。
另外，在化疗或放射疗法已证实或可证实毒性过大(例如对被治疗的患者产生不可接受或不能忍受的副作用)的情况下，可提供使用本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物治疗癌症的方法以作为化疗或放射疗法的替代方案。被治疗的患者可任选地用另一癌症治疗如外科手术、放射疗法或化疗法治疗，这取决于发现治疗为可接受或可忍受的。
本发明的化合物和/或其抗体药物缀合物也可以体外或间接体外的形式使用，诸如用于治疗某些癌症，包括但不限定于白血病和淋巴瘤，此类治疗涉及自体干细胞移植。这可涉及多步骤过程，其中获取动物自体造血干细胞并清除所有癌细胞，然后经由给药高剂量的本发明化合物和/或其抗体药物缀合物(具有或不具有伴随的高剂量放射疗法)将动物的剩余骨髓细胞族群根除，并将干细胞移植物输注回动物。然后，在骨髓功能恢复且患者复原时提供支持性护理。
在下列实例中进一步描述本发明，其不旨在限制本发明的范围。
释放的物质
本发明的其他实施方案包括在癌细胞或肿瘤细胞之内或附近通过被认为是经由一种或多种癌细胞或肿瘤细胞相关性蛋白酶进行的酶裂解和/或水解裂解所释放的化学物质。此类化合物包括本文所用的物质，并且还包括化合物，诸如结构中所述的化合物：
式(II)的一种或多种化合物或其药学上可接受的盐：
L-P
(II)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P结合；
P为式(I)的基团：
Figure BDA0000751870110000651
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-R、-OR、-OCOR13、-OCONR14R15、-OCON(R14)NR(R15)、＝O(与氧连接的双键)和-NR14R15；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9为-(C(R)2)m-C(O)-或-(C(R)2)m-；
L1选自：-酸、-NR-酸和
Figure BDA0000751870110000661
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；以及
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000671
Figure BDA0000751870110000672
中的一个或多个，或L3不存在；
R13独立地选自氢、C1-6烷基、C3-8碳环基、C3-8杂环基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-C5-14杂芳基，其中R13任选地被-NRR或-SO2NRR取代；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
酸为选自-SCH2CH(COOH)(NH2)、-NH(CH2)4CH(COOH)(NH2)和-C(O)(CH2)2CH(COOH)(NH2)的氨基酸残基；
R各自独立地选自氢和-C1-6烷基；以及
m各自独立地为0、1、2或3。
另外，一种或多种式(II’)的化合物或其药学上可接受的盐：
L-P’
(II’)
其中：
L为连接基部分L1-L2-L3，其中L3与P’结合；
P’为式(I’)的基团：
Figure BDA0000751870110000681
其中：
虚线表示任选的键；
X1各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X2各自独立地选自：-O-、-S-和-NR-；
X’各自为CR或N；
如果X”与L2或额外的L3结合，则X”各自为CH-、CR-(C(R)2)m-NR-、CR-(C(R)2)m-O-；CR-(C(R)2)m-C(O)NR-、CR-(C(R)2)m-C(O)NR-NR-、CR-(C(R)2)m-SO2NR-、CR-(C(R)2)m-NR-NR-、CR-(C(R)2)m-NR-C(O)-或N-，否则X”为O、S、CRR、CR-(C(R)2)m-NRR或NRR；
如果X”’与L2结合，则X”’各自为-(C(R)2)m-NR-或CR-(C(R)2)m-O-，否则X”’为R；
Y为-C(R)2-、-O-、-NR-或-S-；
R1选自：-(C(R)2)m-、-OR”、-OCOR13’、-OC(O)NRR14’、-OCON(R)N(R)-和-NR-；
R2和R3独立地选自：氢和C1-6烷基；
R4和R5独立地选自：氢、-OR、-NR14R15和氧代；
R6和R7独立地选自：氢、卤素、羟基和任选地被1至3个独立地选自羟基和卤素的取代基取代的C1-6烷基，
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代的C2-5亚烷基，
R6和R7一起为氧代，或
R6和R7连同它们所结合的碳原子一起形成包含1或2个独立地选自氧、氮和硫的杂原子的3-元至5-元杂环烷基部分，其中所述杂环烷基部分可任选地被1至3个独立地选自R的取代基取代；
R8为氢、C1-6烷基或-OR；
R9独立地选自氢、-C1-6烷基、-(C(R)2)m-C(O)OR、-(C(R)2)m-C(O)NR14R15、-(C(R)2)m-NR14R15、-(C(R)2)m-C(O)-SR、-(C(R)2)m-C(O)NR14N(R)R15、-(C(R)2)m-NR-C(O)-NR14R15、-(C(R)2)m-N(R)COR13和-(C(R)2)m-NR14N(R)R15；
L1选自：-酸、-NR-酸和
Figure BDA0000751870110000691
L2为L2A-L2B-L2C或L2C-L2B-L2A，其中：
L2A包括一个或多个选自以下的组分：
-O-、-C(O)-、-C(O)NR-、-C(O)-C1-6烷基-、-C(O)NRC1-6烷基-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-、-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-C(O)-、-C1-6烷基-S-S-C1-6烷基-NRC(O)CH2-、-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)CH2-、-C(O)-C1-6烷基-NRC(O)C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-、-N＝CR-苯基-O-C1-6烷基-C(O)-、-C(O)-C1-6烷基(OCH2CH2)1-6-NRC(O)-、-C(O)-C1-6烷基苯基-(NR-C(O)-C1-6烷基)1-4-、-C(O)-C1-6烷基-(OCH2CH2)1-6-NRC(O)C1-6烷基-、-C1-6烷基-、-S-、-C(O)-C1-6烷基苯基-NR-、-O-C1-6烷基-S-、-C(O)-O-C1-6烷基-S-和(-CH2-CH2-O-)1-20，或L2A不存在；
L2B选自AA0-aa，其中AA是天然或非天然的氨基酸，并且aa为12；以及
L2C包括一个或多个选自-PABA-和-PABC-的组分，或L2C不存在；
L3选自-C1-6烷基-、-NR-C3-C8杂环基-NR-、-NR-C3-C8碳环基-NR-、-NR-C1-6烷基-NR-、-NR-C1-6烷基-、-S-、-NR-、其中两个R基团任选地连接以形成4至10元环的-NR-NR-和-NR-C(O)-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-NR-、-NR-C1-6烷基苯基-SO2-NR-、-SO2-、-NR-C1-6烷基苯基-C(O)-、
Figure BDA0000751870110000701
中的一个或多个，或L3不存在；
R13’选自键、-C1-6亚烷基-、-C3-8碳环基-、-C3-8杂环基-、-C1-6烷基-C6-14芳基-、-C1-6烷基-C5-14杂芳基-；
R14和R15各自独立地选自：氢、羟基、-NRR、-NRNR2、-C3-10碳环基、-C1-6亚烷基-C3-10碳环基、-C3-10杂环基、-C1-6亚烷基-C3-10杂环基、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR、-(CH2CH2O)1- 6CH2CH2NRR、-C1-6烷基、C6-14芳基、-C1-6亚烷基-C6-14芳基和-C5-14杂芳基；
或者R14和R15连同它们所连接的一个或多个原子一起形成C3-10杂环基环，
其中R14、R15、或二者、或由R14和R15形成的环任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-(C(R)2)m-NRR或-(C(R)2)m-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
R14’各自独立地选自：键、-NR-、-C3-10碳环基-、-C3-10杂环基-、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2C(O)OR’、-(CH2CH2O)1-6CH2CH2NR-和-C1-6亚烷基-；
其中R14’任选地被-(C(R)2)m-R18取代，其中R18各自独立地选自(i)-NRR，(ii)-C(NRR)(C(O)OR)，(iii)-S-R，(iv)任选地被卤素、-CF3、-NRR或-SO2NRR中的一个或多个取代的芳基或杂芳基，(v)-SO2R，(vi)-S-S-C1-6烷基-C(O)OR，(vii)-SO2NRR，(viii)-C(O)NRR，(ix)-C(O)OR，(x)任选地被-NRR、-SO2NRR或-NR-C(O)(CH2)0-6NRR取代的-C4-6环烷基，(xi)-R，(xii)-OR，(xiii)-N(R)NRR，(xiv)-C(O)N(R)NRR，(xv)-(C(R)2)m-O-NRR和(xiv)-S-S-C1-6烷基-NRR；
酸为选自-SCH2CH(COOH)(NH2)、-NH(CH2)4CH(COOH)(NH2)和-C(O)(CH2)2CH(COOH)(NH2)的氨基酸残基；
R各自独立地选自：氢和-C1-6烷基；
R’各自独立地选自：-H、C1-C8烷基、C1-C8杂烷基和芳基；
R”各自独立地选自：键和-C1-6亚烷基-；以及
m各自独立地为0、1、2或3。
实施例
天然产物制备
下列操作概述了用作本发明的有效负载的"天然产物"的制备。术语"天然产物"表示该产物经由发酵过程而制备，但并非表明这些产物是已知的或可在自然界中发现。天然产物在下文以前缀“NP”注释。
实施例1
发酵、提取和分离：[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)；[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)；[(2S,5S,6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-5-羟基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP3)；[(2S,6S)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP4)
Figure BDA0000751870110000721
步骤1：使用假单胞菌属(Pseudomonas sp.)2663号(菌株FERM BP-3421)的发酵：
假单胞菌属2663号(菌株FERM BP-3421)得自National Institute of AdvancedIndustrial Science and Technology(AIST Tsukuba,Central 6,1-1-1,Higashi,Tsukuba,Ibaraki 305-8566,Japan)的International Patent Organism Depositary(IPOD)。随后，通过生化(BBL Crystal试剂盒)和16S rRNA序列分析进行的分类学研究显示FERM BP-3421为伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia sp)。
通过将FERM BP-3421野生型冷冻培养物稀释涂布到天然琼脂培养皿上来培养单个菌落分离物。将多个含50ml种子培养基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)的250ml锥形瓶用琼脂生长培养物孵育，在220rpm振摇下于30℃孵育18小时至20小时。在每个2.8升无隔板的冯巴赫烧瓶内将种子培养物以2.5％(v/v)接种至500ml生产培养基(1％可溶性淀粉、1％甘油、0.5％葡萄糖、1％HySoy Soypeptone、0.5％玉米浆、0.2％硫酸铵、0.006％硫酸镁六水合物、0.2％CaCO3，pH 7.0)中。在200rpm振摇下使发酵物在25℃孵育72小时。
步骤2.发酵肉汤的提取：在实施例1的步骤1的发酵结束时，将50g/L湿DIAION HP-20树脂添加到生产发酵的上清液中，并将混合物以100rpm振摇30分钟。通过离心收集HP-20，然后在环境温度下用乙酸乙酯提取。详言之，根据实施例1的步骤1在25℃下将FERM BP-3421的13L发酵进行72小时。将整个肉汤以3800rpm离心30分钟。将细胞丢弃，并将上清液与预清洗的湿HP20树脂(260g干重)混合。将所得的悬浮液在摇床上、于环境温度下振摇1小时。将结合化合物的HP20树脂用乙酸乙酯提取(每次1L)二次，并且乙酸乙酯溶液经赛力特硅藻土(Celite)过滤，其后减压蒸发，以得到浅色的粗制提取物(2.4g)。
步骤3：分离和表征[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)；[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)：将来自实施例1的步骤2的粗制提取物溶解在1:1乙腈/二甲亚砜的混合物(总共14mL)中。将该粘稠溶液过滤，然后通过制备型HPLC纯化：(柱：Waters C18DELTA PAK(WAT011801),300×50mm,15μm,100A；流动相A：含0.02％乙酸(vv)的1:1乙腈/H2O；流动相B：含0.02％乙酸(v/v)的3:1乙腈/H2O，以及流动相C：含0.02％乙酸(v/v)的乙腈。梯度：持续5分钟的100％A，历时18分钟的0％A至100％B，以及历时2分钟的100％B至100％C，以及持续2分钟的100％C。流速：50mL/min)。将保留时间为13.5分钟和18.0分钟的流分收集并冻干，以分别得到白色粉状的#NP1(172.5mg)及#NP2(227.2mg)。将保留时间为14.8分钟和20.5分钟的流分收集并冻干，以产生两种半纯化的浅灰色粉末I和II。
#NP1.HPLC(方案N)：保留时间＝9.36分钟(纯度92.5％)；HRESIMS(方案O)m/z536.2837[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)
Figure BDA0000751870110000741
12.20(br s,D2O可互换的),7.80(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.35(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.32(br d,J＝15.6,1H),6.10(d,J＝11.2,1H),5.85(dd,J＝11.8,7.4,1H),5.58(dd,J＝15.5,5.8,1H),5.49(brdd,J＝7.0,7.0,1H),4.24(m,2H),3.63(m,2H),3.49(ddd,J＝5.5,5.5,2.5,1H),3.24(d,J＝6.0,1H),2.74(d,J＝3.5,1H),2.57(d,J＝3.5,1H),2.55(dd,J＝16.4,8.5,1H),2.46(m,1H),2.28(m,1H),2.18(m,1H),1.97(s,3H),1.82(m,1H),1.79(m,2H),1.68(s,3H),1.65(m,1H),1.56(m),1.23(d,J＝6.4,3H),1.06(d,J＝6.5,3H),0.93(d,J＝7.0,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ172.15,169.66,164.55,142.76,136.22,133.88,128.84,123.73,122.83,79.90,76.93,74.88,70.35,68.10,67.93,57.36,49.63,46.39,39.09,35.21,33.91,31.71,28.67,21.02,19.96,17.79,14.22,12.41。
#NP2.HPLC(方案N)：保留时间＝10.93分钟(纯度90.4％)；HRESIMS(方案O)m/z520.2895[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ12.13(br s,1H,D2O可互换的),7.80(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.35(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.27(br d,J＝15.8,1H),6.10(d,J＝11.2,1H),5.85(dd,J＝11.8,7.3,1H),5.57(dd,J＝15.6,5.8,1H),5.50(brdd,J＝7.0,7.0,1H),4.50(ddd,J＝5.5,5.5,5.5,1H),4.29(m,1H),3.63(m,2H),3.48(m,1H),2.61(s,2H),2.58(dd,J＝16.0,8.5,1H),2.49(m,1H),2.28(m,1H),2.18(m,1H),1.96(s,3H),1.79(m,2H),1.76(m,1H),1.68(s,3H),1.65(m,1H),1.63(m,1H),1.40(dd,J＝11.5,7.2,1H),1.24(d,J＝6.4,3H),1.06(d,J＝6.4,3H),0.94(d,J＝7.0,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)
Figure BDA0000751870110000742
172.88,169.64,164.56,142.75,135.37,133.74,128.99,126.57,122.84,79.97,74.90,70.36,68.16,68.11,54.71,52.25,46.40,39.08,37.22,36.46,35.23,31.72,28.71,21.01,19.95,17.78,14.23,12.40。
步骤4：分离[(2S,5S,6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-5-羟基-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP3)
将实施例1的步骤2中获得的半纯化粉末I通过逆相HPLC(柱：YMC-Pack-ODS-A,250×30mm,S-10μm,12nm；流动相A：含0.02％乙酸的水；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度体系：历时23分钟的30％至100％B，以及持续1分钟的100％B；流速：20mL/min)进一步纯化以得到白色粉状的#NP3(7.6mg)。
#NP3:HPLC(方案N)：保留时间＝10.9分钟(纯度94.2％)；HRESIMS(方案O)m/z520.2910[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)
Figure BDA0000751870110000751
7.76(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.35(dq,J＝6.4,6.4,1H),6.22(br d,J＝15.8,1H),6.10(d,J＝11.0,1H),5.85(dd,J＝11.8,7.4,1H),5.57(dd,J＝15.5,5.8,1H),5.48(br dd,J＝7.0,7.0,1H),5.04(br s,1H),4.80(br s,1H),4.18(m,1H),3.88(dd,J＝5.8,5.8,1H),3.63(m,2H),3.49(ddd,J＝6.0,6.0,2.5,1H),2.37(m,2H),2.33(m,1H),2.27(m,1H),2.23(m,1H),2.17(m,1H),1.97(s,3H),1.79(m,2H),1.68(s,3H),1.65(m,1H),1.24(d,J＝6.4,3H),1.06(d,J＝6.5,3H),0.94(d,J＝7.0,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ172.35,169.57,164.50,144.64,142.64,136.08,133.77,128.74,125.24,122.81,108.88,79.95,76.97,74.84,72.37,69.47,68.02,46.34,38.09,36.97,35.17,31.67,28.70,20.95,19.91,17.72,14.20,12.34。
步骤5：分离[(2S,6S)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-亚甲基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP4)
将实施例1的步骤2中获得的半纯化粉末II通过逆相HPLC(柱：YMC-Pack-ODS-A,250×30mm,S-10μm,12nm；流动相A：含0.02％乙酸的水；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈：梯度体系：历时23分钟的30％至100％B，以及持续1分钟的100％B；流速：20mL/min)进一步纯化以得到白色粉状的#NP4(12.2mg)。
#NP4：HPLC(方案N)：保留时间＝12.7分钟(纯度96.5％)；HRESIMS(方案O)m/z504.2959[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)
Figure BDA0000751870110000761
7.75(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.37(dq,J＝7.5,6.4,1H),6.23(br d,J＝16.0,1H),6.10(d,J＝11.8,1H),5.85(dd,J＝11.8,7.5,1H),5.53(dd,J＝16.0,5.6,1H),5.51(dd,J＝6.5,6.5,1H),4.80(br s,1H),4.76(br s,1H),4.32(ddd,J＝5.6,5.5,5.5,1H),4.13(m,1H),3.63(m,2H),3.49(ddd,J＝6.0,6.0,2.5,1H),2.38(m,2H),2.36(dd,J＝11.5,5.0,1H),2.32(m,1H),2.29(m,1H),2.18(br dd,J＝11.9,6.5,1H),2.13(dd,J＝11.5,5.9,1H),2.00(dd,J＝10.5,7.0,1H),1.97(s,3H),1.79(m,2H),1.67(s,3H),1.65(m,1H),1.24(d,J＝6.4,3H),1.05(d,J＝6.3,3H),0.94(d,J＝7.0,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-
Figure BDA0000751870110000762
)δ172.11,169.61,164.54,142.69,141.40,135.72,133.71,129.01,126.48,122.83,110.53,79.94,74.86,71.99,68.76,68.06,46.37,38.97,38.92,38.70,35.19,31.70,28.71,20.97,19.92,17.74,14.21,12.36。
实施例2
发酵、提取和分离天然产物类似物：(5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-1-(羧甲基)-3-C-(氯甲基)-2-脱氧戊糖醇(#NP5)；(6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1-脱氧-4-C-(羟甲基)己-2-酮吡喃糖(#NP6)；(4-[(乙酰氧基)甲基]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸(#NP7)；[6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-(氯甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP8)；4-C-[(乙酰氧基)甲基]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1-脱氧己-2-酮吡喃糖(#NP9)；6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-C-[({[6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-(氯甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酰基}氧基)甲基]-1-脱氧己-2-酮吡喃糖(#NP10)；(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-{(2E,4E)-3-甲基-5-[(2S)-4-甲基-6-氧代-3,6-二氢-2H-吡喃-2-基]戊-2,4-二烯-1-基}四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#NP11)
Figure BDA0000751870110000771
步骤1：将实施例1步骤2中所制备的粗制固体提取物(3.7克)溶于甲醇中，并在Sephadex LH20柱上使用甲醇而分级，并且以15.0分钟间隔使用自动流分收集器收集洗脱液，持续15.0小时(总收集65份)。将由此得到的流分-19通过逆相HPLC(柱：YMC-Pack-ODS-A,250×30mm,S-10um,12nm；流动相A：0.2％乙酸铵(W/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度：历时20分钟的30％B至60％B,历时5分钟至100％B，以及在100％B保持4分钟，以及历时2分钟的100％B至30％B；流速：20mL/min)进一步纯化以产生十三个流分：流分A(4.3-6.4分钟),流分B(10.8-11.9分钟),流分C(12.5-13.5分钟),流分D(13.5-14.6分钟),流分E(15.0-16.1分钟),流分F(16.5-17.8分钟),流分G(19.0-19.8分钟),流分H(19.8-21.0分钟),流分I(21.8-23.0分钟),流分J(23.3-25.4分钟),流分J1(25.4-26.2分钟),流分K(27.9-28.5分钟),流分L(28.7-29.5分钟)。
步骤2：分离(5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-1-(羧甲基)-3-C-(氯甲基)-2-脱氧戊糖醇(#NP5)；(6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1-脱氧-4-C-(羟甲基)己-2-酮吡喃糖(#NP6)；(4-[(乙酰氧基)甲基]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸(#NP7)。
将来自实施例2的步骤1的流分D通过逆相HPLC(柱：C18-Phenomenex；Luna 10μM；250×10mm.；流动相A：含0.2％乙酸铵的水(W/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度：历时5分钟的25％B至35％B,历时17分钟至45％B,历时2分钟至70％B：流速：2.5mL/min)进一步纯化，并且将13分钟、14分钟和15分钟洗脱的流分收集并冻干。
在13分钟洗脱的流分产生#NP5:收率：1.0mg:HRESIMS(方案O)m/z 572.2614(M+H)+,m/z 594.2438(M+Na)+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝8.0,1H),6.36(m,1H),6.23(d,J＝15.8,1H),6.11(dd,J＝1.3,11.7,1H),5.86(dd,J＝7.5,11.6,1H),5.63(dd,J＝5.6,15.8,4H),5.47(m,1H),4.21(m,1H),4.10(dd,J＝5.6,8.3,1H),3.64(m,2H),3.62(d,J＝10.6,1H),3.49(m,1H),3.42(d,J＝10.6,1H),3.16(d,J＝8.3,1H),2.68(m,1H),2.57(m,1H),2.30(m,1H),2.19(m,1H),1.98(s,3H),1.83(m,2H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.24(d,J＝6.5,3H),1.06(d,J＝6.3,3H),0.95(d,J＝7.3,2H)。13CNMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.3,170,1,165,0,143.1,135.6,134.4,128.5,126.8,123.2,80.2,75.1,71.7,71.3,70.0,68.6,68.2,50.4,46.6,39.9,35.2,35.0,31.9,29.0,21.0,20.1,17.9,14.4,12.5。
步骤3：分离(6R)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1-脱氧-4-C-(羟甲基)己-2-酮吡喃糖(#NP6):将来自上文实施例2的步骤2的在保留时间14.0分钟时收集的流分使用逆相HPLC(柱：Chromolith：RP 18e,100-10mm；流动相A：含0.2％乙酸铵的水(W/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度：历时20分钟25％B至33％B；流速：2.5mL/min)进一步纯化以得到#NP6：收率4.0mg,HRESIMS(方案O)m/z 542.2948(M+H)+；1HNMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.77(d,J＝8.0,1H),6.32(m,1H),6.17(d,J＝15.8,1H),6.05(dd,J＝1.3,11.6,1H),5.82(dd,J＝7.5,11.6,1H),5.57(dd,J＝5.9,15.8,1H),5.42(m,1H),4.09(m,1H),3.60(m,2H),3.46(m,1H),3.38(d,J＝10.1,1H),3.28(d,J＝10.1,1H),3.21(br s,1H),3.17(br s,1H),2.25(m,1H),2.16(m,1H),1.94(s,1H),1.76(m,2H),1.66(s,3H),1.62(m,1H),1.21(d,J＝6.3,3H),1.17(d,J＝8.5,3H),1.02(d,J＝6.3,3H),0.91(d,J＝7.3,3H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ174.1,165.2,143.5,135.9,134.6,128.9,127.4,123.6,98.8,80.0,77.3,75.5,69.7,69.4,69.2,68.8,59.6,47.0,35.8,32.6,29.5,26.5,21.7,20.7,18.5,14.9,13.1。
步骤4：分离(4-[(乙酰氧基)甲基]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基)乙酸(#NP7)：将来自上文实施例2的步骤2的在保留时间15.0分钟时收集的流分使用逆相HPLC(YMC-Pack-ODS-A；250×10mm,S-5um,12nm；流动相A：含0.2％乙酸铵的水(W/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度：历时20分钟30％B至50％B,历时5分钟至95％B：流速：2.5mL/min)进一步纯化以产生#NP7：HRESIMS(方案O)m/z 580.3112(M+H)+,m/z 602.2928(M+Na)+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝8.0,1H),6.36(m,1H),6.19(d,J＝15.8,1H),6.11(d,J＝11.6,1H),5.87(dd,J＝7.5,11.6,1H),5.49(m,1H),5.48(m,1H),4.41(dd,J＝7.2,12.8,1H),4.28(d,J＝5.8,1H),3.79(m,2H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.49(m,1H),2.60(m,1H),2.56(m,1H),2.29(m,1H),2.19(m,1H),2.02(s,3H),1.97(s,3H),1.80(m,2H),1.67(br s,3H),1.68-1.65(br m,2H),1.51(m,1H),1.45(m,1H),1.40(m,1H),1.24(d,J＝6.5,3H),1.06(d,J＝6.3,3H),0.94(d,J＝7.3,3H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.4,170.8,170.1,165.0,143.2,134,4,134.2,129.0,128.9,123.3,80.3,75.1,68.3,68.2,68.0,66.3,71.1,46.5,39.4,38.6,35.4,35.3,31.8,28.9,21.1,20.8,20.0,17.9,14.4,12.5。
步骤5：分离[6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-(氯甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP8)；4-C-[(乙酰氧基)甲基]-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1-脱氧己-2-酮吡喃糖(#NP9)以及6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-C-[({[6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-(氯甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酰基}氧基)甲基]-1-脱氧己-2-酮吡喃糖(#NP10)：
将来自实施例2的步骤1的流分F通过逆相HPLC(C18-Phenomenex；Luna 250×10mm.10uM；流动相A：含0.2％乙酸铵的水(W/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度：历时20分钟的40％B至45％B,历时5分钟至95％B；流速：2.5mL/min)进一步纯化。将8分钟、13分钟和28分钟洗脱的流分收集并冻干以得到：
#NP8(在8.0分钟时洗脱的流分)：收率：1.0mg；HRESIMS(方案O)m/z 556.2671(M+H)+,m/z 578.2489(M+Na)+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝8.0,1H),6.37(m,1H),6.21(d,J＝15.9,1H),6.11(dd,J＝1.3,11.6,1H),5.87(dd,J＝7.5,11.6,1H),5.50(m,1H),5.48(m,1H),4.39(m,1H),4.30(m,1H),3.65(m,2H),3.50(m,1H),3.48(brs,2H),2.91(dd,J＝8.9,15.0,1H),2.60(dd,J＝6.0,15.0,1H),2.30(m,1H),2.19(m,1H),1.98(s,3H),180(m,2H),1.73(m,1H),1.69(br s,3H),1.65(m,1H),1.58(m,1H),1.55(m,1H),1.43(br dd,J＝13.1,10.4,1H),1.25(d,J＝6.5,3H),1.07(d,J＝6.3,3H),0.95(d,J＝7.3,3H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ173.4,170.1,165.0,143.2,134.5,134.2,128.9(x2),123.2,80.2,75.2,68.7,68.5,68.2,66.5,54.6,46.5,39.9,38.7,35.6,35.4,31.9,28.9,21.1,20.1,17.9,14.4,12.5。
#NP9(在13分钟时洗脱的流分):收率：1.0mg:HRESIMS(方案O)m/z 584.3066(M+H)+,m/z 606.2887(M+Na)+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝7.9,1H),6.36(m,1H),6.25(d,J＝15.7,1H),6.11(dd,J＝1.0,11.6,1H),5.87(dd,J＝7.5,11.6,1H),5.63(dd,J＝6.1,15.8,1H),5.48(m,1H),4.19(dd,J＝6.1,9.6,1H),3.97(d,J＝10.0,1H),3.88(d,J＝10.0,1H),3.65(m,2H),3.50(m,1H),3.17(br s,1H),3.15(br s,1H),2.30(m,1H),2.19(m,1H),2.00(s,3H),1.98(s,3H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.26(brd,J＝1.6,3H),1.24(br s,3H),1.06(d,J＝6.2,3H),0.96(d,J＝7.3,3H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.4,170.1,165.0,143.1,136.1,134.4,128.9,126.4,123.2,98.5,80.4,75.4,75.2,69.2(x2),69.0,68.2,60.7,46.5,35.4,31.9,28.9,25.9,21.1(x2),20.0,17.9,14.4,12.6。
#NP10(在23分钟时洗脱的流分):收率：1.0mg,HRESIMS(方案O)m/z 562.2582(M+2Na)2+,m/z 1101.5263(M+Na)+；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.79(d,J＝7.9,2H),6.37(m,2H),6.27(d,J＝16.2,1H),6.21(d,J＝15.6,1H),6.12(d,J＝11.6,1H),6.11(d,J＝15.3,1H),5.88(dd,J＝7.5,11.6,2H),5.64(dd,J＝6.2,15.8,1H),5.54-5.48(m,3H),4.40-4.31(m,2H),4.20(dd,J＝6.2,9.4,1H),4.04(m,1H),3.90(d,J＝10.0Hz,1H),3.69-3.62(m,4H),3.54-3.47(m,4H),3.21–3.13(m,2H),3.06(dd,J＝8.7,15.6,1H),2.73(dd,J＝5.3,15.7,1H),2.31(m,2H),2.20(m,2H),1.99(s,6H),1.84-1.79(m,5H),1.72(s,3H),1.69(s,3H),1.68-1.64(m,2H),1.62(m,1H),1.55(d,J＝13.8Hz,1H),1.44(m,1H),1.27(brs,3H),1.26(brs,6H),1.08(m,6H),0.96(m,6H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ171.3,170.0(x2),165.0(x2),143.2(x2),136.5,134.6,134.7,134.4,128.9(x3),126.6,123.3(x2),98.4,80.5(x2),75.4,75.5(x2),69.5(x2),69.2,68.6,68.5(x3),66.5,60.7,54.8,46.9(x2),40.0,38.5,35.9,35.7(x2),32.3(x2),29.3,29.2,26.2,21.5(x2),20.4(x2),18.2(x2),14.7(x2),12.9(x2)。
步骤6：分离(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-{(2E,4E)-3-甲基-5-[(2S)-4-甲基-6-氧代-3,6-二氢-2H-吡喃-2-基]戊-2,4-二烯-1-基}四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#NP11)
将来自实施例2的步骤1的流分K通过逆相HPLC(C18-Phenomenex；Luna 250×10mm.10uM；Phenomenex；Luna 250×10mm.10uM；流动相A：含0.2％乙酸铵的水(W/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈；梯度：历时15分钟的40至95％B；流速：2.5ml/min)进一步纯化以得到#NP11。收率：2.0mg。HRESIMS(方案O)m/z 460.2694(M+H)+,m/z 482.2514(M+Na)+；1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δppm 1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.82(d,J＝6.9Hz,1H),6.37(m,1H),6.38(m,1H),6.13(dd,J＝1.2,11.6,1H),5.88(dd,J＝7.5,11.6,1H),5.78(s,1H),5.68(dd,J＝6.7,15.8,1H),5.62(t,J＝7.0,1H),4.97(m,1H),3.67(m,1H),3.66(m,1H),3.52(m,1H),2.47(m,1H),2.44(m,1H),2.33(m,1H),2.23(m,1H),2.00(s,3H),1.97(s,3H),1.82(m,2H),1.74(s,3H),1.67(m,1H),1.26(d,J＝6.5,3H),1.08(d,J＝6.3,3H),0.97(d,J＝7.1,3H)。13C NMR(126MHz,DMSO-d6)δ170.1,165.0,164.4,159.0,143.1,137.6,133.9,131.2,124.4,123.2,115.6,80.2,75.2,77.2,68.0,46.5,35.3,34.5,32.1,28.9,22.3,21.0,20.1,17.9,14.3,12.4。
实施例3
FERM BP-3421的分子系统发生表征
步骤1：将基因组DNA从FERM BP-3421的纯培养物中分离，并将近乎完整的16SrRNA基因使用引物8FPL(5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’)(SEQ.ID NO.1)和1492RPL(5’GGTTACCTTGTTACGACTT3’)(SEQ.ID NO.2)进行PCR扩增。将PCR产物用DNA Clean andConcentratorTM-25试剂盒(Zymo Research)纯化，并直接测序以提供具有下列16S rRNA引物的双股覆盖度(double-stranded coverage)：8FPL,pC FWD(5’CTACGGGAGGCAGCAGTGGG3’)(SEQ.ID NO.3),pC REV(5’CCCACTGCTGCCTCCCGTAG3’)(SEQ.IDNO.4),pD FWD(5’CAGCAGCCGCGGTAATAC3’)(SEQ.ID NO.5),pD REV(5’GTATTACCGCGGCTGCTG3’)(SEQ.ID NO.6),pF FWD(5’CATGGCTGTCGTCAGCTCGT3’)(SEQ.IDNO.7),pF REV(5’ACGAGCTGACGACAGCCATG3’)(SEQ.ID NO.8)和1492RPL。将全双股16S rRNA序列(SEQ ID NO：1)经公共数据库(National Center for Biotechnology Information)检索以确定FERM BP-3421的分类附属关系为伯克霍尔德氏菌属。将最密切相关的伯克霍尔德氏菌属类型的菌株的16S rRNA序列和伯克霍尔德氏菌属NRRL B50319(菌株A396)(US20110207604A1 Asolkar等人,2011)的序列(其与FERM BP-3421共享100％的同一性)从GenBank中取出。使用ClustalX(版1.81)进行多重序列排列，并且通过标准建树法如TREECON(1.3b版)测定FERM BP-3421相对于其他伯克霍尔德氏菌属的系统发生位置。
FERM BP-3421(SEQ.ID NO.9)
AGAGTTTGATCCTGGCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGTGCTTGCACCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACATGTCCTGTAGTGGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGATCTACGGATGAAAGCGGGGGATCTTCGGACCTCGCGCTATAGGGTTGGCCGATGGCTGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCAGTAGCTGGTCTGAGAGGACGATCAGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGGACAATGGGGGAAACCCTGATCCAGCAATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTTGTCCGGAAAGAAATCCTTTGGGCTAATACCCCGGGGGGATGACGGTACCGGAAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTTGTTAAGACAGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGGCAAGCTAGAGTATGGCAGAGGGGGGTAGAATTCCACGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAATACCGATGGCGAAGGCAGCCCCCTGGGCCAATACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGGGATTCATTTCCTTAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGGTCGGAATCCTGAAGAGATTCGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCGATACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTTAGTTGCTACGCAAGAGCACTCTAAGGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCCTCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTTCACACGTCATACAATGGTCGGAACAGAGGGTTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGATCGTAGTCCGGATTGCACTCTGCAACTCGAGTGCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGTGGGTTTTACCAGAAGTGGCTAGTCTAACCGCAAGGAGGACGGTCACCACGGTAGGATTCATGACTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAACC
图1示出用FERM BP-3421的近乎完整的16S rRNA序列测定的与其他波克霍尔德氏菌属的系统发生关系。将邻接的系统树以皮氏柏克霍尔德氏菌(Burkholderia pickettii)生根且在其各节点处显示自展值(基于100次重复且大于50％)。比例尺表示每个核苷酸有0.02个取代。
实施例4
使用FERM BP-3421的工程化菌株#1发酵、提取和分离：[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)；以及[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)
步骤1：司普力西欧他汀生物合成基因簇的基因组挖掘(mining)：
将FERM BP-3421的基因组使用次代技术(454和Illumina)测序。通过基因组挖掘(参见Challis GL 2008 J Med Chem 51：2618-2628)从DNA序列推断司普力西欧他汀的生物合成基因簇(图2)，其使我们鉴定出反式酰基转移酶(AT)聚酮合成酶(PKS)/非核糖体肽合成酶(NRPS)杂交途径(参见J Piel 2010 Nat Prod Rep 27：996-1047及其中的参考文献)。PKS和NRPS基因敲除突变体显示没有可检测到的司普力西欧他汀产生，证实这些基因涉及司普力西欧他汀生物合成。我们的发现与Zhang F等人(2011 J Am Chem Soc 133:2452-62)所报告的那些相一致，并且该JACS论文中所介绍的基因术语在下文中使用。
图2是司普力西欧他汀的生物合成基因簇以及强调通过细胞色素P450 Fr9R和Fe(II)/α-酮戊二酸盐依赖性加双氧酶Fr9P催化的羟基化步骤的所提议的生物合成路径。顶端箭头表示PKS-NRPS基因的编码DNA序列；辅助基因未示出。
步骤2：FERM BP-3421的加双氧酶(fr9P)敲除突变菌株的生成(菌株#1)
将基因替代点的上游和下游的两个约700-bp长DNA片段通过PCR(Pfu UltraTMPolymerase,Promega)使用作为模板的FERM BP-3421基因组DNA以及引物对P1_diox(TGGCGA ACA GAT CGA GTT TG)(SEQ.ID NO.10)和P2_diox(CTT GCG GAG AAC TGT GAA TGC GCA ATA GAA GCG CTG TCA TGG AAT G)(SEQ.ID NO.11)以及P3_diox(CCG AAA AGT GCC ACC TGA CGT CTA AGA TAA CTC GTG GAT ATT CGG CAA G)(SEQ.ID NO.12)和P4_diox(AGAATC CCG CGA TCC CAA C)(SEQ.ID NO.13)进行扩增；下划线的碱基表示与四环素抗性(tet)标记物的同源区。将tet标记物通过PCR使用作为模板的pEX18Tc(Schweizer HP1998Gene212:77-86)以及引物对Ptet_f(TTG CGC ATT CAC AGT TCT C)(SEQ.ID NO.14)和Ptet_r(TCT TAG ACG TCA GGT GGC AC)(SEQ.ID NO.15)进行扩增。将这三个片段通过SOE-PCR(使用Pfu UltraTM Polymerase,Promega)组装，并结合到pEX100T(Schweizer HP&HoangTT 1995Gene 158：15-22)的SmaI位点中以生成质粒pAE-PF12。将pAE-PF12通过从大肠杆菌(E.coli)S17.1的结合而转移至FERM BP-3421中。四环素(25μg/ml)用于选择突变体；蔗糖5％用于反向选择载体骨架；并且庆大霉素(10μg/ml)用于在缀合后去除大肠杆菌。突变体通过菌落PCR(RED
Figure BDA0000751870110000851
Sigma)在三个分别的反应中使用引物对P1_diox/P4_diox,P1_diox/Ptet_r和TP1_pEX100T(GGA CGA ATC GAA CTC AGG AAC TTG)(SEQ.ID NO.16)/TP2_pEX100T(CGA AGA GCG ATT GAG GAA AAG G)(SEQ.ID NO.17)而确认，即得菌株#1。
步骤3：使用工程化菌株#1的发酵：将工程化菌株#1在含四环素(25mg/L)的种子培养基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中于30℃和220rpm下培养约24小时。通过将第一种子培养物以10％(v/v)接种至含四环素(25mg/L)的新鲜种子培养基、并在220rpm振摇下于30℃孵育约24小时而生成第二种子培养物。850ml种子培养物用于接种到在30-L生物反应器(
Figure BDA0000751870110000861
C plus,Sartorius BBI Systems)中包含的29L生产培养基(4％甘油、2％HySoy大豆蛋白胨、0.2％硫酸铵、0.01％硫酸镁六水合物、0.2％CaCO3)。发酵在25℃进行5天。初始搅动设定为344rpm；初始气流设定为1.3slpm；DO随着增加的搅动而控制于3％。
步骤4.发酵肉汤的提取：在实施例4的步骤3的发酵结束时，将1.5kg湿DIAION HP-20树脂添加到整个肉汤中，并将混合物振摇过夜。将HP-20通过经由50μm-150μm不锈钢楔形金属网的过滤而收集。将结合化合物的HP-20树脂用乙酸乙酯提取四次(每次3升，并且振摇45分钟)。然后将树脂清洗(用2L甲醇清洗一次并用大量DI水清洗3次)，并且遵循上述相同操作再用于收回仍留在水性滤液中的化合物。将来自合并的乙酸乙酯提取物的溶剂通过减压蒸发而去除，以得到淡黄色粉末(137g)。
步骤5：分离[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)；以及[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)：将来自实施例4的步骤4的1.7g提取物溶解在2:1DMF/ACN的混合溶剂(总共22mL)中，过滤，然后通过逆相HPLC(Waters ODS-A 50×300mm,15um,120A,流动相A：含0.02％AcOH的水,流动相B：含0.02％AcOH的乙腈溶剂体系,梯度：持续2分钟的50％B,历时18分钟至75％B；持续2分钟的100％B，流速：50mL/min；5次重复进样)纯化。将保留时间为13.5分钟和18.0分钟的流分收集并冻干，以分别得到白色粉状的#NP1(191mg)及#NP2(466mg)。
#NP1.；HPLC(方案N)：保留时间＝9.38分钟(纯度98.5％)
#NP2.；HPLC(方案N)：保留时间＝10.97分钟(纯度96.5％)
实施例5
使用Ferm FERM BP-3421的工程化菌株#2发酵、提取和分离：[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)
步骤1：工程化菌株#2的生成：首先，通过λ-Red-介导的重组(Datsenko KA&WannerBL.2000 Proc Natl Acad Sci U S A 97：6640-5)用得自pCR2.1(Invitrogen)的neo(卡那霉素和新霉素抗性)替换载体mini-CTX1(Hoang TT等人，2000 Plasmid 43：59-72)中的tet标记物。所用的引物为P1_neo_pCR2.1(GTT GGT TTG CGC ATT CAC AGT TCT CCG CAA GAA TTG ATT GCA AGG GCT GCT AAA GGA AG)(SEQ.ID NO.18)和P2_neo_tet_CTX1_pCR2.1(TCT TCC GCT TCC TCG CTC ACT GAC TCG CTG CGC TCG GTC ACG GAA ATG TTG AAT ACT CATACT C)(SEQ.ID NO.19)；下划线的序列表示用于λ-Red-介导的重组的同源区。所获得的载体称为pAE-PF24。
将PBAD/araC阿拉伯糖-可诱导的体系通过PCR(
Figure BDA0000751870110000874
Hot Start聚合酶，Finnzymes)使用作为模板的pKD46以及引物对P1_BADp_f(GCTCTA GAC ATC GAT TTA TTATGA CAA CTT GAC，下划线为XbaI位点)(SEQ.ID NO.20)和P2_BADp_r(CCC AAA AAA ACGGGT ATG G)(SEQ.ID NO.21)进行扩增。将司普力西欧他汀生物合成基因簇中所包含的编码细胞色素P450基因(fr9R)的基因(包括预测的RBS但无启动子)通过PCR(
Figure BDA0000751870110000871
HotStart聚合酶，Finnzymes)使用来自FERM BP-3421的基因组DNA以及引物对P3_P450_BAD_f(CTA CTG TTT CTC CAT ACC CGT TTT TTT GGG GGG TTG TTG GTT TTT GAA ATT GC,下划线为用于SOE-PCR的延伸)(SEQ.ID NO.22)和P4_P450_r(ATG GTG AAG CTT AAG TCG ACAACC GGC ATT CC,下划线为HindIII位点)(SEQ.ID NO.23)进行扩增。将所获得的两个片段通过SOE-PCR(
Figure BDA0000751870110000872
Hot Start聚合酶，Finnzymes)组装，随后结合至pAE-PF24的SpeI和HindIII位点中，以生成pAE-PF29。pAE-PF29通过从大肠杆菌S17.1的缀合而转移至工程化菌株#1中。卡那霉素(500μg/ml)用于选择突变体；并且庆大霉素(10μg/ml)用于在缀合后去除大肠杆菌。突变体通过两个克隆PCR反应(RED
Figure BDA0000751870110000873
Sigma)使用引物组TP1_CTX1_标记物(GCA TTC ACA GTT CTC CGC AAG)(SEQ.ID NO.24)和TP2_CTX1_标记物(CTC GCT CACTGA CTC GCT G)(SEQ.ID NO.25)以及T3_mini-CTX1_f(GCA ATT AAC CCT CAC TAA AGG)(SEQ.ID NO.26)和MCS_mini-CTX1_r(CTA TAG GGC GAA TTG GGT AC)(SEQ.ID NO.27)而确认，提供工程化菌株#2。
步骤2：使用工程化菌株#2的发酵：将工程化菌株#2在含四环素(25mg/L)的种子培养基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中于30℃和220rpm下培养约24小时。通过将第一种子培养物以10％(v/v)接种至含四环素(25mg/L)的新鲜种子培养基、并在220rpm振摇下于30℃孵育约24小时而生成第二种子培养物。在每个2.8L无隔板的冯巴赫烧瓶内，种子培养物用于以2.5％(v/v)接种至550ml生产培养基(4％甘油、2％HySoy大豆蛋白胨、1.5％L-阿拉伯糖、0.2％硫酸铵、0.01％硫酸镁六水合物、0.2％CaCO3)。在200rpm振摇下使发酵物在25℃孵育4天。
步骤3.发酵肉汤的提取：在实施例5的步骤2的发酵结束时，将100g/L湿DIAIONHP-20树脂添加到约6L的生产发酵中，并将混合物振摇3小时。将HP-20通过经由50μm-150μm不锈钢楔形金属网的过滤而收集。将结合化合物的HP-20树脂用乙酸乙酯提取三次(每次2升)。详言之，通过将树脂转移至酸坛(carboy)、添加2-L乙酸乙酯、振摇1小时、并通过50μm-150μm不锈钢楔形金属网过滤来进行每一次提取。将来自合并的乙酸乙酯提取物的溶剂通过减压蒸发而去除，以得到淡黄色粗制提取物(17.25g)。
步骤4：分离[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)：将0.12g来自实施例5的步骤3的提取物溶于2:1DMF/CAN的混合物溶剂(总22ml)中，过滤，然后通过逆相HPLC(YMC ODS-A 30×250mm,10um,120A,流动相A：含0.02％AcOH的水，流动相B：含0.02％AcOH的乙腈，梯度：持续2分钟的30％B,历时18分钟至100％B；持续2分钟的100％B，流速：20mL/min)而纯化。将保留时间为15.0分钟的流分收集并冻干，以得到白色粉状的#NP1(73.6mg)。
#NP1.HPLC(方案N)：保留时间＝9.36分钟(纯度92.5％)
实施例6
使用FERM BP-3421的工程化菌株#3发酵、提取和分离(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-羟基-7-甲基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#NP12)；以及[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)
Figure BDA0000751870110000891
步骤1：工程化菌株#3的生成：将基因替代点的上游和下游的两个约700-bp长DNA片段通过PCR(Pfu UltraTM Polymerase,Promega)使用作为模板的FERM BP-3421基因组DNA以及引物对P1_P450(GCA TCC AAT CAC TTG AAC AGG)(SEQ.ID NO.28)和P2_P450(CTT GCG GAG AAC TGT GAA TGC GCA AGC CAT CAT TCT CGA CAT TTC C)(SEQ.ID NO.29)以及P3_P450(CCG AAA AGT GCC ACC TGA CGT CTA AGA AGA TTG TGA CGG TAC TGA AGC)(SEQ.IDNO.30)和P4_P450(AGA GAA CGA TCG CTC CAC AG)(SEQ.ID NO.31)进行扩增；下划线的碱基表示与四环素抗性(tet)标记物的同源区。将tet标记物通过PCR使用作为模板的pEX18Tc(Schweizer HP 1998 Gene 212:77-86)以及引物对Ptet_f(TTG CGC ATT CAC AGT TCT C)(SEQ.ID NO.32)和Ptet_r(TCT TAG ACG TCA GGT GGC AC)(SEQ.ID NO.33)进行扩增。将这三个片段通过SOE-PCR(使用Pfu UltraTM Polymerase,Promega)组装，并结合到pEX100T(Schweizer HP&Hoang TT 1995 Gene 158：15-22)的SmaI位点中以生成质粒pAE-PF11。将pAE-PF11通过从大肠杆菌S17.1的结合而转移至FERM BP-3421中。四环素(25μg/ml)用于选择突变体；蔗糖5％用于反向选择载体骨架；并且庆大霉素(10μg/ml)用于在缀合后去除大肠杆菌。突变体在两个克隆PCR(RED
Figure BDA0000751870110000892
Sigma)反应中使用引物对P1_P450/Ptet_r和TP1_pEX100T(GGA CGA ATC GAA CTC AGG AAC TTG)(SEQ.ID NO.34)/TP2_pEX100T(CGAAGA GCG ATT GAG GAA AAG G)(SEQ.ID NO.35)而确认，即得菌株#3。
步骤2：使用工程化菌株#3的发酵：将工程化菌株#3在含四环素(25mg/L)的种子培养基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％氯化钠)中于30℃和220rpm下培养约24小时。通过将第一种子培养物以10％(v/v)接种至含四环素(25mg/L)的新鲜种子培养基、并在220rpm振摇下于30℃孵育约24小时而生成第二种子培养物。种子培养物用于以2.5％(v/v)接种到在2.8-L无隔板的冯巴赫烧瓶内包含的400ml生产培养基(4％甘油、2％HySoy大豆蛋白胨、0.2％硫酸铵、0.01％硫酸镁六水合物、0.2％CaCO3)。在200rpm振摇下使发酵在25℃孵育5天。
步骤3.发酵肉汤的提取：将得自实施例6的步骤2的生长培养物以4,200rpm离心30分钟以去除细胞。将50g湿DIAION HP-20树脂加到上清液(12.5％w/v)中，并将混合物以200rpm振摇1小时。将结合化合物的HP-20通过离心而收集，然后用乙酸乙酯提取两次(每次提取为250ml)。用MgSO4(其随后通过Whatman纸过滤而去除)干燥合并的提取物后，将溶剂通过减压蒸发而去除，以得到浅色粗制提取物。
步骤4：分离[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)以及(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-羟基-7-甲基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#NP12):将来自实施例6的步骤3的粗制提取物的一半通过制备型正相HPLC而纯化：(柱：Princeton SFC 2-乙基吡啶,250×21.2mm,5μm；流动相A：庚烷；流动相B：乙醇(变性的)；梯度：持续15分钟的5％B,历时8.5分钟至100％B,持续2分钟的100％B,历时0.5分钟至5％B以及持续2.5分钟的5％B；流速：27mL/min)。将保留时间为6.58分钟和8.18分钟的流分收集并冻干，以分别得到#NP12(163mg，89％纯，为非常浅的淡黄色粉末)和#NP2(205mg，通过UV为89％纯)。
#NP12：HPLC(方案P)：保留时间＝12.65分钟(纯度89％)；LC/MS：m/z 474.2[M+H+-H2O]+和514.2[M+Na+]+
#NP2：HPLC(方案P)：保留时间＝12.46分钟(纯度89％)；LC/MS：m/z 520.2[M+H+]+
步骤5：分离(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-羟基-7-甲基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#NP12)：将实施例6的步骤4的6.58-分钟流分的一半通过逆相HPLC而纯化：(柱：Phenomenex Luna C18,150×21.2mm,5μm；流动相A：水；流动相B：乙腈；梯度：持续1.5分钟的20％B,历时8.5分钟至70％B,历时2分钟至100％B,历时0.5分钟至20％B；流速：27mL/min)。将保留时间为8.25分钟的流分收集并冻干，以得到白色粉末状的#NP12(28mg)。#NP12：HPLC(方案N)：保留时间＝12.6分钟(纯度98.5％)；HRESIMS(方案O)m/z 492.296[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.78(d,J＝8.0Hz,1H),6.35(m,1H),6.21(d,J＝15.8,1H),6.11(dd,J＝0.9,11.7,1H),5.85(dd,J＝11.6,7.5Hz,1H),5.53(m,1H),5.49(m,1H),5.41(d,J＝1.6Hz,OH),4.64(m,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.49(m,1H),2.45(m,2H),2.30(m,1H),2.20(m,1H),1.98(s,3H),1.96(m,1H),1.81(m,3H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.31(s,3H),1.25(m,1H),1.25(d,J＝6.3Hz,3H),1.14(m,1H),1.07(d,J＝6.5Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ169.6,164.6,142.1,134.1,133.7,128.2,127.1,122.6,95.3,79.5,74.3,67.6,66.7,54.5,48.4,46.1,41.4,37.5,35.0,31.1,29.6,28.5,20.8,19.5,17.8,13.9,12.2。
实施例7
使用伯克霍尔德氏菌属MSMB 43发酵、提取和构建生产：[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP1)；[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#NP2)
步骤1：使用伯克霍尔德氏菌属MSMB 43的发酵：伯克霍尔德氏菌属(种属名“Burkholderia humptydooensis”)MSMB 43得自Centers for Disease Control andPrevention(CDC)和Menzies School of Health Research。将MSMB 43在得自冷冻保存的营养培养皿上培养，并在30℃孵育48小时。将琼脂生长培养物接种至含10ml种子培养基(1％聚蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.5％NaCl)的25×150mm培养管中。将种子培养物在220rpm振摇下于30℃孵育18小时至20小时。在每个250ml厄伦美厄烧瓶内将种子培养物以2.5％(体积/体积)接种至50ml生产培养基(1％可溶性淀粉、1％甘油、0.5％葡萄糖、1％HySoy Soypeptone、0.5％玉米浆、0.2％硫酸铵、0.006％硫酸镁六水合物、0.2％CaCO3，pH7.0)中。在200rpm振摇下使发酵在25℃孵育72小时。
步骤2：发酵物的LC-MS分析
使发酵物离心以使细胞成团块，并将上清液通过0.22μm聚偏二氟乙烯膜过滤。将每一上清液的一部分与二甲亚砜(10:1)混合，并通过LC-MS使用Acuity UPLC(Waters)仪器分析：柱：XBridge C18，4.6×150mm,3.5uM；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时12.0分钟的5％至100％B；持续3.0分钟的100％B(进样量：5.0uL)。如保留时间和质谱数据所证实的，在发酵的第五天，MSMB43分别产生效价为150mg/L和50mg/升的NP1和NP2。
NP1:：m/z：535.9(M+H)+,保留时间：13.31分钟.
NP2：m/z：519.9(M+H)+保留时间：14.58分钟
合成实验操作
实验通常在惰性气氛(氮气或氩气)下进行，尤其在使用氧敏感性或水分敏感性试剂或中间体的情况下。商业溶剂和试剂通常在不进一步纯化的情况下使用，在适当的情况下包括无水溶剂(通常得自Aldrich Chemical Company,Milwaukee,Wisconsin的Sure-SealTM产品)。通过液相色谱-质谱法(LCMS)或大气压化学电离(APCI)来报告质谱数据。参考所用的氘化溶剂的残峰以百万分之份数(ppm,δ)形式表示核磁共振(NMR)的化学位移数据。
对于在其他实施例或方法中的合成参考操作，反应方案(反应时间和温度)可以变化。通常，反应之后是薄层色谱、LCMS或HPLC，在合适时进行后处理。纯化可随不同实验而变化：通常，选择用于洗脱液/梯度的溶剂和溶剂比以提供合适的保留时间。除非另外规定，否则逆相HPLC流分可经由冻干/冻干而浓缩。中间体和最终化合物在0℃或室温下储存在氮气下的封闭小瓶或烧瓶中。
化合物名称通过ACD Labs软件生成。
用于分析的HPLC条件
方案AA和AB：柱：Phenomenex Luna C18(2),150×3.0mm,5μm；流动相A：含0.02％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：5％至100％B(历时10分钟)A或(历时20分钟)B；流速：0.75mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 215,254nm；进样量10μL；仪器：HP 1100。
方案B：柱：Waters Sunfire C18,50×4.6mm,5μm；流动相A：含0.05％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.05％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时4分钟5％至95％B，95％B保持1分钟；流速：2.0mL/分钟；温度：室温；检测：DAD 215nm；进样量4μL；仪器：Waters LC和ZQ MassSpectrometer。
方案C：柱：Waters Acquity UPLC HSS T3,C18,2.1×50mm,1.7μm；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时1分钟5％B，历时2.5分钟5％至95％B，历时0.35分钟95％B；流速：1.25mL/分钟；温度：60℃；检测：200-450nm；MS(+)范围100-2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。
方案D：柱：Waters Acquity UPLC HSS T3,C18,2.1×50mm,1.7μm；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时0.1分钟5％B,历时1.5分钟5％至95％B,历时0.35分钟95％B；流速：1.25mL/分钟.温度：60℃；检测：200-450nm；MS(+)范围100-2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。
方案E：柱：Phenomenex Luna C18(2),150×3.0mm,5μm；流动相A：含0.02％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时23.5分钟0％至100％B；流速：1.5mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 210nm；进样量：10μL；仪器：Agilent 1100HPLC。
方案F：柱：Phenomenex Luna C18(2),150×3.0mm,5μm；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时1.5分钟的5％B，历时8.5分钟5％至100％B，然后持续100％B；流速：0.75mL/分钟；温度：45℃；检测：DAD 215nm,254nm；MS(+)范围150-2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent 1200 LCMS.
方案G：柱：Atlantis dC18,50×4.6mm,5μm；流动相A：含0.05％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.05％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时4.0分钟5％至95％B，线性；然后在95％B保持1分钟；流速：2mL/分钟；温度：室温；检测：DAD 215nm；MS(+)范围160-1000道尔顿；进样量4uL；仪器：Waters 996 PD。.
方案H：柱：Phenomenex Luna C18(2),150×3.0mm,5μm；流动相A：水；流动相B：乙腈；梯度：历时1.5分钟5％B，历时8.5分钟5％至100％B，然后持续1分钟100％B；流速：0.75mL/分钟；温度：25℃；检测：DAD 215nm,254nm；MS(+)范围150-2000道尔顿；进样量：10μL；仪器：Agilent 1200 LCMS。
方案I：柱：Xtimate C18,2.1×30mm,3μm；流动相A：含0.1％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时0.9分钟0％至60％B，历时0.6分钟的60％B；持续0.5分钟的100％B；流速：1.2mL/分钟；检测：DAD 220nM；温度：25℃；进样量：1μL；仪器：Agilent。
方案J：柱：Xtimate C18,2.1×30mm,3μm；流动相A：含0.1％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时0.9分钟10％至80％B，历时0.6分钟的80％B；持续0.5分钟的100％B；流速：1.2mL/分钟；检测：DAD 220nM；温度：25℃；进样量：1μL；仪器：Agilent。
方案K：柱：Phenomenex Luna PFP,100×3mm,5μm；流动相A：含0.05％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.05％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时9分钟5％至95％B，在95％B保持1分钟；流速：1.0mL/分钟；温度：室温；检测：DAD 215nm；进样量：4μL；仪器：Waters LC和ZQ MassSpectrometer。
方案L：柱：Phenomenex Gemini-NX,C18,4.6mm×50mm,110A,3μm,流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度5％；历时0.0-4.10分钟至100％B；从4.10-4.50分钟保持100％B；流速：1.25mL/分钟；温度：60℃；检测：200-450nm；MS(+)范围100-2000道尔顿；进样量：5μL；仪器：Waters Acquity。
方案M：柱：Phenomenex Gemini-NX,4.6mm×50mm,C18,3μm,110A；流动相A：0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时4.10分钟5％至100％B，100％B保持0.4分钟，然后历时0.5分钟100％至5％B；流速：1.5mL/分钟；温度：60℃；检测：HP1100DAD(1315A),200-450nm扫描；1nm间隔；MS ESI(+/-),100-1200m/z扫描,0.5sec扫描时间,Centroid；进样量：5μL；仪器：HPLC泵,DAD检测器,柱烘箱来自AgilentTechnologies,Wilmington,DE；自动采样机和MS检测器来自Waters Corporation,Milford,MA；ELS Detector来自Varian medical devices,Palo Alto,CA。
方案N：柱：YMC ODS-A,4.6×150mm,5μm；流动相A：含0.01％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.01％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时15分钟10％至100％B；流速：1.0mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：5μL；仪器：Agilent 1100HPLC。
方案O：高分辨率电喷雾电离质谱(HRESIMS)使用装备有主动屏蔽式9.4 Tesla超导磁铁(Magnex Scientific Ltd.，UK)、外部Bruker APOLLO ESI源和Synrad 50W CO2CW激光的Bruker(Billerica，MA)APEXII FTICR质谱仪而获得。将样品随着由1:1(v/v)水：乙腈(0.25％甲酸)组成的载体溶剂以50μL/min的流速流动注入质谱仪中。Bruker Xmass软件用于数据获取和分析。质谱使用HP tuning mix进行外部校正。
方案P：柱：YMC ODS-A,4.6×150mm,5μm；流动相A：含0.01％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.01％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时19分钟10％至100％B；流速：1.0mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：5ìL；仪器：Agilent 1100HPLC。
方案Q：柱：柱：Agilent Poroshell 300SB-C8,75×2.1mm,2.6μm；流动相A：含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：历时4分钟20％B至45％B；流速：1.0mL/分钟；温度：60℃；检测：220nm；MS(+)范围400-2000Da；进样量：10μL；仪器：Agilent 1100 LC,Waters MicromassZQ MS。使用MaxEnt1进行去卷积。
用于纯化的HPLC条件
方法A：柱：Phenomenex Gemini，C18，30×100mm，
Figure BDA0000751870110000961
；流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：可变的，含B的A的渐增梯度，历时15-20分钟；流速：20mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 215nm，254nm；进样量：可变的；仪器：Gilson。
方法B*：柱：YMC ODS-A，30×250mm，
Figure BDA0000751870110000962
；流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：可变的，含B的A的渐增梯度，历时15-20分钟；流速：20mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.5-2mL；仪器：VarianProStar Model 330制备型HPLC。
方法C*：柱：Phenomenex Luna C18(2)，150×21.2mm，5μm；流动相A：水；流动相B：乙腈；梯度：可变的，含B的A的渐增梯度，历时10分钟；流速：27mL/分钟；温度：室温；检测：DAD 210-360nm；MS(+)范围150-2000道尔顿；仪器：Waters Fraction Lynx LCMS。
方法D*：柱：Waters Sunfire，C18，19×100mm，5μm；流动相A：含0.05％甲酸的水(v/v)；流动相B：含0.05％甲酸的乙腈(v/v)；梯度：可变的，含B的A的渐增梯度，历时10-20分钟；流速：25mL/分钟；检测：DAD 215nm MS(+)范围160-1000道尔顿；仪器：WatersFractionLynx。
方法E：柱：Waters Sunfire,C18，19×100mm，5μm；流动相A：含0.05％三氟乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.05％三氟乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时8.5分钟10-50％B，历时0.5分钟50-100％B，100％B保持1分钟；流速：25mL/分钟；检测：DAD 215nm MS(+)范围160-1000道尔顿；仪器：Waters FractionLynx。
方法F*：Column：Waters C18DELTA PAK(WAT011801)，300×50mm，15μm；流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：可变的，含B的A的渐增梯度，历时15-20分钟；流速：50mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.5-5mL；仪器：Varian ProStar Model 330制备型HPLC。
方法G*：柱：YMC ODS-A，50×300mm，12μm，120A.流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：持续3分钟40％B，历时20分钟40-100％B以及持续3分钟100％B.流速；20mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.5-5mL；仪器：Varian ProStar Model 330制备型HPLC。
方法H：柱：Cromolith RP-18e 100-10mm.流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时30分钟20-55％B，历时4分钟55-100％B，历时2分钟100-20％B以及持续2分钟20％B.流速；2.5mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.025-0.1mL；仪器：Agilent 1100分析型HPLC。
方法I：柱：C18半制备型YMC-Pack ODS-A 250×10mm(S-5μm，12nm).流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时22分钟18-25％B，历时1分钟25-95％B，持续4分钟95％B，历时1分钟95-18％B以及持续6分钟18％B；流速：2.5mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.025-0.1mL；仪器：Agilent1200分析型HPLC。
方法J：柱：C18半制备型YMC-Pack ODS-A 250×10mm(S-5μm，12nm).流动相A：含0.02％乙酸的水(v/v)；流动相B：含0.02％乙酸的乙腈(v/v)；梯度：历时30分钟20-30％B，历时1分钟30-95％B，持续4分钟95％B，历时2分钟95-20％B以及持续6分钟20％B；流速：2.5mL/分钟；温度：未控制.检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.025-0.1mL；仪器：Agilent1200分析型HPLC。
方法K：柱：Cromolith RP-18e 100-10mm.流动相A：水(v/v)；流动相B：乙腈(v/v)；梯度：历时20分钟30-65％B，历时1分钟65-95％B，历时2分钟95-30％B；流速；2.5mL/分钟；温度：未控制；检测：DAD 230nm；进样量：可变的，0.025-0.1mL；仪器：Agilent 1200分析型HPLC。
在一些情况下，可些许修改纯化HPLC条件，例如但不限定于梯度、梯度长度(gradient length)和流速的改变，其以符号*指示。
一般操作
一般操作A：制备活化的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)酯
Figure BDA0000751870110000981
在0℃下，向酸在四氢呋喃中的0.1M溶液添加N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(2.2eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(2.2eq.)，并使反应升温至室温并搅拌。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)检测；反应通常在1-72小时内完成。将溶剂减压去除，并通过逆相色谱法纯化残留物，以得到期望的N-羟基琥珀酰亚胺酯。
一般操作B：由NHS酯制备酰胺
Figure BDA0000751870110000982
在0℃下，向含0.1M N-羟基琥珀酰亚胺酯(1eq.)的四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺添加胺(1-10eq.)。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)检测；反应通常在1-72小时内完成。将反应混合物真空浓缩，并通过逆相色谱法纯化残留物，以得到期望的酰胺产物。
一般操作C：制备五氟苯基(PFP)酯
Figure BDA0000751870110000983
在0℃下，向酸在四氢呋喃中的0.05M溶液添加DCC(1eq.)，随后添加五氟苯酚(2-4eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(0.3M)。将反应升温至室温并搅拌。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)检测；反应通常在1-48小时内完成。将反应减压浓缩，并通过逆相色谱法纯化残留物，以得到期望的五氟苯基(PFP)酯。
一般操作D：由NHS酯制备酰胺的库方案(Library Protocol)。将胺(1eq.)溶解在四氢呋喃(1mL,0.04M)中，并添加N,N-二异丙基乙胺(5eq.)，随后添加甲醇(0.2mL)。然后，向N-羟基琥珀酰亚胺酯(1eq.)溶解在四氢呋喃(1mL,0.04M)中的冷却溶液(0℃)中滴加全部溶液。将反应在0℃搅拌30分钟，然后升温至室温并搅拌直至72小时。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)检测；反应通常在1-72小时内完成。将溶剂真空去除，并将残留物通过逆相色谱法纯化，并将属于期望产物的流分合并，并且冻干以得到目标酰胺。
一般操作E：经由原位形成NHS酯而制备酰胺
Figure BDA0000751870110000991
向酸(1eq)(0℃或室温)在四氢呋喃或N,N-二甲基甲酰胺或N,N-二甲基乙酰胺中的溶液(0.08M)中添加DCC(2.2eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(2.2eq.)，并将反应在0℃搅拌或者升温至室温并搅拌，直至LC/MS的分析表明原料酸的大部分酸已被消耗。将反应混合物再冷却至0℃，并添加胺(1-20eq.)，升温至室温，并搅拌。反应进程通过LC-MS(或HPLC或TLC)检测；反应通常在1-72小时内完成。将反应混合物真空浓缩，并将残留物通过逆相色谱法纯化，以得到期望的酰胺。
一般操作F：由NHS酯制备酰胺。将胺(或胺-酸盐)(1.0eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(5eq.)在甲醇(0.2mL)中的混合物搅拌15分钟，并将所得的溶液转移至NHS酯(1.0eq.)在四氢呋喃(1.0mL)中的溶液中。将反应在室温搅拌，同时添加更多的胺(1-3eq.)，直至LC/MS分析表明大部分NHS-酯原料已被消耗。将反应混合物真空浓缩，并将残留物通过逆相色谱法纯化，以得到期望的酰胺产物。
实施例A1
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯#B1.
Figure BDA0000751870110001001
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯#B1。向#NP1(103mg,0.192mmol,1eq.)在四氢呋喃(2mL,0.096M)中的冷却(0℃)溶液添加DCC(87.1mg,0.422mmol,2.2eq.)，并将反应搅拌15分钟。添加N-羟基琥珀酰亚胺(48.6mg,0.422mmol,2.2eq.)并将反应在0℃搅拌15分钟，升温至室温并搅拌72小时。将反应真空浓缩，并将残留物通过中压逆相C18色谱法(梯度:具有含5％至90％水的乙腈，并且每一相有0.02％乙酸)纯化。将属于期望产物的流分低压干燥以得到固体状的#B1。收率：66.6mg,0.103mmol,54％。HPLC(方案AA)保留时间＝8.170分钟(纯度91％).LCMS(方案D):m/z 633.3[M+H]+,保留时间＝0.81分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δppm 7.78(d,J＝8.02Hz,1H)6.37-6.30(m,2H)6.09(m,1H)5.85(dd,J＝11.54,7.43Hz,1H)5.59(dd,J＝16.04,5.28Hz,1H)5.50(t,J＝7.04Hz,1H)5.07(d,J＝6.06Hz,1H,D2O可互换的)4.34-4.25(m,2H)3.63(d,J＝5.48Hz,2H)3.48(td,J＝7.09,2.64Hz,1H)3.27(d,J＝5.28Hz,1H)2.97(d,J＝6.85Hz,2H)2.82-2.77(m,4H)2.59(d,J＝5.09Hz,1H)2.33-2.11(m,2H)1.96(s,3H)1.92(d,J＝8.22Hz,1H)1.82-1.77(m,2H)1.68(s,3H)1.66-1.6(br.s.,1H)1.59-1.55(m,1H)1.23(d,J＝6.46Hz,3H)1.05(d,J＝6.26Hz,3H)0.93(d,J＝7.24Hz,3H)
实施例A2
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B2).
Figure BDA0000751870110001011
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B2)。向#NP2(430mg,0.828mmol,1eq.)在四氢呋喃(6mL,0.13M)中的冷却(0℃)溶液中添加DCC(376mg,1.82mmol,2.2eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(210mg,1.82mmol,2.2eq.)。使反应升温至室温。在18小时之后，滤除白色固体，并浓缩滤液至黄色残留物。通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以得到白色固体状的#B2。收率：204mg,0.331mmol,40％。HPLC(方案AA):保留时间＝9.463分钟(纯度77％).LCMS(方案D):m/z 617.3[M+H]+保留时间＝0.91分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-
Figure BDA0000751870110001012
)δppm 7.72(d,J＝7.81Hz,1H)6.32-6.21(m,2H)6.04(m,1H)5.85(dd,J＝11.48,7.21Hz,1H)5.57(dd,J＝15.80,4.90Hz,1H)5.47(t,J＝7.04Hz,1H)4.53-4.47(m,1H)4.32-4.25(m,1H)3.62-3.55(m,2H)3.45–3.41(m,1H)2.95(d,J＝6.60Hz,2H)2.74(s,3H)2.59(dd,J＝16.00,4.68Hz,2H)2.30-2.07(m,2H)1.91(s,3H)1.77-1.65(m,4H)1.63(br s,4H)1.61-1.57(m,1H)1.48(dd,J＝13.27,7.02Hz,1H)1.19(d,J＝6.24Hz,3H)1.050(d,J＝6.24Hz,3H)0.89(d,J＝7.41Hz,3H)
实施例A3
合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸五氟苯酯(#B3)
Figure BDA0000751870110001021
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸五氟苯酯(#B3)。向#NP1(25mg,0.047mmol,1eq.)在四氢呋喃中的溶液(0.7mL,0.06M)中添加DCC(9.7mg,0.047mmol,1eq.)，然后添加五氟苯酚(17.3mg,0.094mmol,2eq.)在四氢呋喃中的溶液(0.3mL,0.3M)。将反应在室温搅拌18小时，过滤并用乙腈冲洗滤饼。将合并的滤液真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制材料以产生白色固体状的#B3。收率：21.6mg,0.030mmol,65％。HPLC(方案AB):保留时间＝15.617分钟(纯度87％)。LCMS(方案D):m/z 702.2[M+H]+保留时间＝1.0分钟。1H NMR((400MHz,DMSO-d6)δ:7.79(d,J＝7.8Hz,1H),6.38(t,J＝6.2Hz,1H),6.32(d,J＝16.4Hz,1H),6.12(dd,J＝11.7,1.2Hz,1H),5.88(dd,J＝11.5,7.6Hz,1H),5.64(dd,J＝16.0,5.1Hz,1H),5.45(t,J＝7.0Hz,1H),5.10(d,J＝6.2Hz,1H),4.43(dd,J＝7.0,3.9Hz,1H),4.32(t,J＝4.7Hz,1H),3.70-3.60(m,1H),3.51-3.43(m,1H),3.12(d,J＝6.6Hz,1H),2.82(d,J＝5.1Hz,1H),2.65(d,J＝5.1Hz,1H),2.36-2.15(m,2H),2.02-1.91(m,3H),1.81(br.s.,1H),1.71(s,3H),1.68-1.59(m,4H),1.27(d,J＝6.2Hz,3H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)
实施例A4
制备(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B5)
Figure BDA0000751870110001031
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B4)。向#NP1(10.2mg,0.019mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃/水的1:1混合物中的溶液(1.5mL,0.012M)中添加氢氧化锂(6mg,0.25mmol,13eq.)。将反应在室温下搅拌半小时，并将溶剂真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制残留物以得到固体状#B4。收率：2mg,0.004mmol,20％.HPLC(方案A):保留时间＝7.850分钟(纯度93％).LCMS(方案D)；m/z 494.1[M+H]+保留时间＝0.68分钟。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.46(d,J＝8.6Hz,1H),6.28(d,J＝16Hz,1H),6.09(dd,J＝11.9和5.3Hz,1H),5.73,(dd,J＝12.1和1.6Hz,1H),5.57(dd,J＝15.6和5.9Hz,1H),5.39-5.32(m,1H),4.75-4.66(m,1H),4.50-4.41(m,1H),4.19-4.13(m,1H),3.89-3.82(m,1H),3.68-3.59(m,1H),3.52-3.43(m,2H),2.99(dd,J＝15.2和9.4Hz,1H),2.94(d,J＝4.3Hz,1H),2.59-2.49(m,2H),2.36-2.25(m,1H),2.20-2.09(m,2H),1.94-1.79(m,2H),1.76-1.68(m,1H),1.66(s,3H),1.63(d,J＝3.9Hz,1H),1.27(d,J＝6.6Hz,3H),1.08(d,J＝6.2Hz,3H),0.93(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤2.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B5)。根据实施例A1中用于合成#B1的一般操作进行制备，但使用#B4替代#NP1。将粗制反应真空浓缩，然后通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到固体状#B5。收率：16.2mg,0.027mmol,64％。LCMS(方案D):m/z 591.3[M+H]+保留时间＝0.71分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J inHz)δ7.78(d,J＝8.0Hz,1H),6.35(d,J＝15.6Hz,1H),5.97(dd,J＝11.9和1.2Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.1Hz,1H),5.61(dd,J＝15.6和5.1Hz,1H),5.55-5.49(m,1H),5.22-5.14(m,1H),5.11(d,J＝4.7Hz,1H),5.08(d,J＝6.0Hz,1H),4.36-4.25(m,2H),3.69-3.60(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.31-3.27(m,1H),2.99(d,J＝6.7Hz,2H),2.84-2.76(m,4H),2.61(d,J＝5.0Hz,1H),2.34-2.26(m,1H),2.24-2.15(m,1H),1.95(dd,J＝13.0和8.2Hz,1H),1.87-1.73(m,2H),1.72-1.62(m,4H),1.59(dd,J＝13.0和3.6Hz,1H),1.11(d,J＝6.4Hz,3H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A5
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B6).
Figure BDA0000751870110001041
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B6)。向#B1(78mg,0.12mmol,1eq.)溶解在二氯甲烷中的溶液(3mL,0.04M)中添加肼(0.615mL的在四氢呋喃中的1M溶液,0.615mmol,5eq.)，并且在室温下搅拌1小时，然后添加额外的肼(0.615mL的在四氢呋喃中的1M溶液,0.615mmol,5eq.)。在1小时之后，将反应用水稀释并用二氯甲烷(3×)萃取，将有机层合并，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制残留物以得到固体状的#B6。收率：43mg,58％.HPLC(方案A)保留时间＝6.870分钟(纯度＝72％)。LCMS(方案C):m/z 550.4[M+H]+,保留时间＝1.15分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.99(s,1H),7.78(d,J＝8.2Hz,1H),6.42-6.25(m,2H),6.11(dd,J＝11.5和1.4Hz,1H),5.86(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.60(dd,J＝16和5.9Hz,1H),5.55-5.49(m,1H),5.02(d,J＝5.5Hz,1H),4.32-4.07(m,4H),3.70-3.60(m,2H),3.54-3.45(m,1H),3.22(app t,J＝4.9Hz,1H),2.74(d,J＝5.1Hz,1H),2.58(d,J＝5.1Hz,1H),2.44(dd,J＝14.2和8.4Hz,1H),2.35-2.25(m,1H),2.24-2.14(m,2H),1.97(s,3H),1.91-1.77(m,3H),1.70-1.60(m,4H),1.46(dd,J＝12.9和3.5Hz,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A6
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B7)
Figure BDA0000751870110001051
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B7)。向#NP2(140mg,0.269mmol,1eq.)在四氢呋喃中的溶液(4mL,0.07M)添加DCC(122mg,0.592mmol,2.2eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(68.1mg,0.592mmol,2.2eq)。在18小时之后，添加肼(0.576mL的在四氢呋喃中的1M溶液,0.576mmol,2.1eq.)。在30分钟之后，添加额外的肼(1mL的在四氢呋喃中的1M溶液,1mmol,3.7eq.)。在10分钟之后，将反应真空浓缩，并且通过逆相色谱法(方法C*)纯化粗制的期望材料以得到固体状#B7。收率：78mg,0.145mmol,54％。HPLC(方案F):m/z534.4[M+H]+,保留时间＝8.143分钟(纯度100％)。
实施例A7
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[(2-羟乙基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B8)，和(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B9)，和(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-氧代-2-[(4-氨磺酰基苄基)氨基]乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B10)，和(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-氨基苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B11)，和(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(哌嗪-1-基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B12)，和(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B13)，和(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(羟基氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B14)
Figure BDA0000751870110001071
步骤1a.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[(2-羟乙基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B8)。根据一般操作D，由2-氨基乙醇(2.0mg,0.033mmol,1.03eq.)、四氢呋喃(1mL)、N,N-二异丙基乙胺(0.028mL,0.160mmol,5eq.)、甲醇(0.2mL)和#B1(20mg,0.032mmol,1eq.)合成粗制的期望物质，其通过逆相色谱法(方法D*)纯化以得到固体状的#B8。收率：17.6mg,0.031mmol,97％。HPLC(方案B):m/z.579.6[M+H]+,保留时间＝2.00分钟(纯度100％)。
步骤1b.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B9)。向#B1(15mg,0.024mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(1mL,0.024M)添加氨(0.069mL的在甲醇中的7M溶液,0.480mmol,20eq.)。在搅拌3.5小时之后，将溶剂真空去除，并且通过逆相色谱法(方法C*)纯化粗制的期望物质以得到固体状#B9。收率：6mg,0.012mmol,50％。HPLC(方案F)m/z535.3[M+H]+,保留时间＝7.796分钟(纯度100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.78(d,J＝8.2Hz,1H),7.30(s,1H),6.77(s,1H),6.40-6.28(m,2H),6.10(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.6Hz,1H),5.61(dd,J＝15.8和5.7Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),4.99(d,J＝5.9Hz,1H),4.29-4.20(m,2H),3.69-3.61(m,2H),3.53-3.46(m,1H),3.23(app t,J＝5.1Hz,1H),2.74(d,J＝5.1Hz,1H),2.57(d,J＝5.1Hz,1H),2.48-2.44(m,1H),2.36-2.25(m,1H),2.25-2.16(m,2H),1.97(s,3H),1.87-1.77(m,2H),1.69(s,3H),1.68-1.60(m,2H),1.49(dd,J＝13.1和3.7Hz,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤1c.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-氧代-2-[(4-氨磺酰基苄基)氨基]乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B10)。根据一般操作D，由4-(氨基甲基)苯磺酰胺盐酸盐(9.2mg,0.041mmol,1eq.)、四氢呋喃(1mL)、N,N-二异丙基乙胺(0.035mL,0.200mmol,5eq.)、甲醇(0.2mL)和#B1(25mg,0.040mmol,1eq.)合成粗制的期望物质，其通过逆相色谱法(方法D*)纯化以得到固体状的#B10。收率：15.5mg,0.022mmol,55％。HPLC(方案B):m/z 704.4[M+H]+,保留时间＝2.36分钟(纯度100％)。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4)δ:8.58(br.s.,1H),7.80(d,J＝8.2Hz,1H),7.63(d,J＝8.6Hz,2H),7.45(d,J＝8.2Hz,2H),6.42-6.32(m,2H),6.02-5.90(m,2H),5.67(dd,J＝15.8,6.0Hz,1H),5.53(t,J＝7.0Hz,1H),4.62-4.54(m,1H),4.46(d,J＝4.3Hz,1H),4.42-4.32(m,2H),3.78-3.65(m,2H),3.58(t,J＝5.8Hz,1H),3.43(d,J＝5.8Hz,1H),2.92-2.81(m,2H),2.66(d,J＝5.1Hz,1H),2.40(m,2H),2.24(m,1H),2.02-2.02(m,3H),1.98(s,1H),1.98-1.67(m,2H),1.90-1.85(m,1H),1.83-1.80(m,1H),1.77(s,2H),1.41-1.32(m,4H),1.13-0.98(m,3H)。
步骤1d.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-氨基苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B11)。根据一般操作D，由4-(氨基甲基)苯胺(3.9mg,0.032mmol,1eq.)、四氢呋喃(1mL)、N,N-二异丙基乙胺(0.011mL,0.064mmol,2eq.)、甲醇(0.2mL)和#B1(20mg,0.032mmol,1eq.)合成粗制的期望物质，其通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到固体状的#B11。收率：17.6mg,0.027mmol,86％。HPLC(方案AA):保留时间＝6.748分钟(纯度91％)。1H NMR(400MHz,DMSO-
Figure BDA0000751870110001091
)δppm 8.14(t,J＝5.77Hz,1H)7.78(d,J＝8.02Hz,1H)6.90-6.84(m,2H)6.48-6.43(m,2H)6.39-6.30(m,1H)6.27(s,1H)6.09(m,1H)5.88-5.80(m,1H)5.59(dd,J＝15.85,5.48Hz,1H)5.51(t,J＝6.94Hz,1H)5.01(d,J＝5.28Hz,1H)4.89(s,2H)4.30-4.22(m,1H)4.12–3.99(m,1H)3.63(d,J＝5.87Hz,2H)3.49(td,J＝7.04,2.54Hz,1H)3.22(t,J＝4.40Hz,1H)2.73(d,J＝5.09Hz,1H)2.59-2.50(m,2H)2.35-2.13(m,3H)1.96(s,3H)1.88-1.75(m,3H)1.69(s,3H)1.64(td,J＝4.89,2.54Hz,1H)1.44(dd,J＝12.81,3.62Hz,1H)1.23(d,J＝6.46Hz,3H)1.04(d,J＝6.46Hz,3H)0.93(d,J＝7.43Hz,3H)
步骤1e.(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(哌嗪-1-基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B12)。向#B1(15.5mg,0.024mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(0.24mL,0.048M)添加哌嗪(2.5mg,0.029mmol,1.2eq.)。在搅拌30分钟之后，将反应用水稀释、用二氯甲烷萃取，将合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并将溶剂真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B12。收率：8.2mg,0.012mmol,52％。HPLC(方案AA)保留时间＝6.795分钟(纯度80％)。LCMS(方案C):m/z 604.3[M+H]+,保留时间＝1.01分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.41-6.28(m,2H),6.11(d,J＝10.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.6Hz,1H),5.60(dd,J＝16和5.1Hz,1H),5.55-5.48(m,1H),4.97(d,J＝5.9Hz,1H),4.31-4.20(m,2H),3.70-3.60(m,2H),3.55-3.35(m,6H),3.27-3.22(m,1H),2.75(d,J＝5.1Hz,1H),2.69-2.54(m,5H),2.36-2.13(m,4H),1.98(s,3H),1.88-1.76(m,3H),1.72-1.61(m,4H),1.58-1.51(m,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤1f.(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(4-甲基哌嗪-1-基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B13)。向#B1(18.8mg,0.03mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(0.500mL,0.06M)添加1-甲基哌嗪(3.6mg,0.036mmol,1.2eq.)。在搅拌30分钟之后，将反应用水稀释、用二氯甲烷萃取，将合并的有机物经硫酸钠干燥，过滤并将溶剂真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B13。收率：11.6mg,0.017mmol,57％。HPLC(方案AA)保留时间＝6.422分钟(纯度94％).LCMS(方案C):m/z 618.4[M+H]+,保留时间＝0.97分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝7.8Hz,1H),6.42-6.27(m,2H),6.11(d,J＝10.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.3和7.4Hz,1H),5.60(dd,J＝15.8和5.3Hz,1H),5.55-5.48(m,1H),4.97(d,J＝6.2Hz,1H),4.30-4.21(m,2H),3.70-3.61(m,2H),3.56-3.33(m,5H),3.25(appt,J＝5.5Hz,1H),2.79-2.65(m,2H),2.60-2.53(m,2H),2.35-2.12(m,9H),1.98(s,3H),1.88-1.78(m,3H),1.72-1.61(m,4H),1.56(dd,J＝12.9和3.5Hz,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤1g.(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(羟基氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B14).向#B1(30.7mg,0.049mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃(0.450mL)和N,N-二甲基甲酰胺(0.175mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(32mg,0.245mmol,5eq.)和羟胺盐酸盐(10.6mg,0.152mmol,3eq.)。在搅拌30分钟之后，将反应用水稀释并用乙酸乙酯(3×)萃取，将合并的有机物再次用水清洗，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B14。收率：11.8mg,0.021mmol,43％。HPLC(方案AA)保留时间＝7.189分钟(纯度96％)。LCMS(方案C):m/z 551.2[M+H]+,保留时间＝1.18分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.42(s,1H),8.74(s,1H)7.80(d,J＝7.8Hz,1H),6.43-6.29(m,2H),6.16-6.10(m,1H),5.88(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝16和5.5Hz,1H),5.57-5.51(m,1H),5.04(d,J＝5.5Hz,1H),4.32-4.23(m,2H),3.72-3.62(m,2H),3.57-3.48(m,1H),3.27-3.21(m,1H),2.76(d,J＝5.1Hz,1H),2.60(d,J＝5.1Hz,1H),2.44-2.27(m,2H),2.26-2.11(m,2H),2.00(s,3H),1.92-1.80(m,3H),1.74-1.63(m,4H),1.49(dd,J＝12.7和3.3Hz,1H),1.27(d,J＝6.6Hz,3H),1.09(d,J＝6.2Hz,3H),0.97(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A8
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B15)
Figure BDA0000751870110001111
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B15)。向#B2(108mg,0.175mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(3mL,0.06M)添加氨(0.500mL的在甲醇中的7M溶液,3.5mmol,20eq.)。在搅拌1小时之后，将溶剂真空去除，并且通过中压逆相C18色谱法(梯度:含0％至90％水的乙腈，并且每一相有0.02％乙酸)纯化粗制的期望物质以得到固体状的#B15。收率：23.9mg,0.045mmol,26％。HPLC(方案AA)保留时间＝8.231分钟(纯度89％)。LCMS(方案C):m/z 519.3[M+H]+,保留时间＝1.41分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.80(d,J＝7.8Hz,1H),7.33(s,1H),6.78(s,1H),6.42-6.33(m,1H),6.28(d,J＝16Hz,1H),6.16-6.10(m,1H),5.88(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝15.8和5.7Hz,1H),5.56-5.50(m,1H),4.60-4.51(m,1H),4.38-4.27(m,1H),3.72-3.62(m,2H),3.56-3.48(m,1H),2.71-2.54(m,4H),2.38-2.27(m,1H),2.26-2.16(m,2H),2.00(s,3H),1.89-1.74(m,3H),1.71(s,3H),1.69-1.61(m,2H),1.39(dd,J＝13.5和6.4Hz,1H),1.27(d,J＝6.2Hz,3H),1.09(d,J＝6.6Hz,3H),0.97(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A9
制备[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B16)以及(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B17)
步骤1.合成[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B16)。向#NP2(25mg,0.048mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃/水的1:1混合物中的溶液(3mL,0.016M)添加氢氧化锂(15mg,0.63mmol,13eq.)。将反应在室温下搅拌1小时，并将溶剂真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制残留物以得到固体状的#B16。收率：17mg,0.035mmol,74％.LCMS(方案D)；m/z 478.1[M+H]+,保留时间＝0.75分钟。1HNMR(400MHz,CDCl3-d)
Figure BDA0000751870110001122
6.27(d,J＝8.98Hz,1H)6.09(d,J＝15.61Hz,1H)6.00(dd,J＝12.10,5.46Hz,1H)5.62(dd,J＝12.10,1.17Hz,1H)5.40(dd,J＝15.61,5.85Hz,2H)5.25(t,J＝6.63Hz,1H)4.61(t,J＝6.63Hz,1H)4.48-4.32(m,2H)3.79-3.73(m,1H)3.57-3.48(m,2H)3.42-3.33(m,2H)2.85(dd,J＝15.22,8.98Hz,2H)2.52-2.44(m,2H)2.42(d,J＝5.07Hz,1H)2.25-2.00(m,1H)1.94-1.87(m,2H)1.80-1.74(m,2H)1.68-1.59(m,2H)1.55(s,3H)1.46(dd,J＝13.46,3.71Hz,1H)1.27(dd,J＝13.66,4.29Hz,1H)1.17(d,J＝6.63Hz,3H)0.98(d,J＝6.24Hz,3H)0.83(d,J＝7.02Hz,3H)。
步骤2.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B17)。根据实施例A1中用于合成#B1的一般操作进行制备，但使用#B16替代#NP1。将粗制反应真空浓缩，然后通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到固体状#B17。收率：28mg,0.043mmol,43％LCMS(方案D)；m/z 575.1[M+H]+,保留时间＝0.82分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d,J＝7.8Hz,1H),6.30(d,J＝16Hz,1H),5.97(d,J＝12.1Hz,1H),5.86(dd,J＝11.7和7.0Hz,1H),5.63(dd,J＝16和5.1Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),5.22-5.06(m,2H),4.60-4.53(m,1H),4.39-4.30(m,1H),3.70-3.60(m,2H),3.54-3.45(m,1H),3.03-2.98(m,2H),2.80(s,4H),2.70-2.60(m,2H),2.59(s,1H),2.37-2.13(m,3H),1.87-1.60(m,7H),1.54(dd,J＝13.3和7Hz,1H),1.11(d,J＝6.2Hz,3H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A10
制备4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}亚肼基)乙基]苯氧基}丁酸(#B18)以及(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁氧基}苯基)亚乙基]肼基}-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B19)
Figure BDA0000751870110001141
步骤1.合成4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}亚肼基)乙基]苯氧基}丁酸(#B18)。向#B7(35mg,0.066mmol,1eq.)在乙醇中的溶液(1mL,0.06M)添加4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(73.3mg,0.330mmol,5eq.)，然后添加冰乙酸(0.250mL)，并将反应加热至37℃。在3.5小时之后，将反应过滤，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B18。收率：25.5mg,0.034mmol,52％。LCMS(方案D)；m/z 737.38[M+H]+,保留时间＝0.88分钟。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁氧基}苯基)亚乙基]肼基}-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B19)。向#B18(25mg,0.034mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(0.7mL,0.049M)添加DCC(15.5mg,0.075mmol,2.2eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(8.60mg,0.075mmol,2.2eq.)。将反应搅拌4小时。将溶剂真空去除，并通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以得到白色固体状的#B19。收率：13mg,0.015mmol,46％。LCMS(方案D)；m/z 835.8[M+H]+,保留时间＝0.92分钟。
实施例A11
制备4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}亚肼基)乙基]苯氧基}丁酸(#B20)以及(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁氧基}苯基)亚乙基]肼基}-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B21)
Figure BDA0000751870110001151
步骤1.合成4-{4-[(1E)-1-(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}亚肼基)乙基]苯氧基}丁酸(#B20)。向#B6(18.1mg,0.033mmol,1eq.)在乙醇中的溶液(0.500mL,0.06M)添加4-(4-乙酰基苯氧基)丁酸(36.7mg,0.165mmol,5eq.)，然后添加冰乙酸(0.125mL)，并将反应加热至37℃。在1小时之后，将反应过滤，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B20。收率：24.9mg,0.028mmol,85％。LCMS(方案C)；m/z 754.5[M+H]+,保留时间＝1.47分钟。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{(2E)-2-[1-(4-{4-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-4-氧代丁氧基}苯基)亚乙基]肼基}-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B21)。向#B20(21.3mg,0.028mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃中的溶液(0.550mL,0.05M)添加DCC(13.5mg,0.062mmol,2.2eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(7.3mg,0.062mmol,2.2eq.)。将反应搅拌5小时，并添加额外的DCC(5mg,0.022mmol,0.8eq.)，然后添加N-羟基琥珀酰亚胺(5mg,0.042mmol,1.5eq.)。在18小时之后，将溶剂真空去除，并通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以得到白色固体状的#B21。收率：11mg,0.013mmol,47％。HPLC(方案H):m/z 851.3[M+H]+,保留时间＝9.074分钟(纯度88％)。LCMS(方案C)；m/z 851.5[M+H]+,保留时间＝1.58分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ10.42-10.25(m,1H),7.83-7.66(m,3H),7.02-6.92(m,2H),6.43-6.22(m,2H),6.1-6.05(m,1H),5.93-5.81(m,1H),5.68-5.37(m,2H),5.08-4.90(m,1H),4.52-4.25(m,3H),4.13-4.04(m,2H),3.71-3.55(m,2H),3.52-3.40(m,1H),2.94-2.55(m,9H),2.35-2.03(m,7H),1.98(s,3H),1.95-1.85(m,1H),1.84-1.73(m,2H),1.72-1.54(m,5H),1.30-1.20(m,3H),1.12-1.00(m,3H),0.98-0.87(m,3H)。
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-(羟基氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B22).
Figure BDA0000751870110001161
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-(羟基氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B22)。向#B2(100.8mg,0.175mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃(1.8mL)和N,N-二甲基甲酰胺(0.600mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(114mg,0.875mmol,5eq.)和羟胺盐酸盐(10.6mg,0.152mmol,3eq.)。在搅拌1小时之后，将反应用水稀释并用乙酸乙酯(3×)萃取，将合并的有机物再次用水清洗，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。通过中压逆相C18色谱法(梯度:含10％至100％水的乙腈，并且每一相有0.02％乙酸)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B22。收率：68mg,0.127mmol,73％。LCMS(方案C):m/z 535.4[M+H]+,保留时间＝1.36分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ10.40(s,1H),8.73(d,J＝2Hz,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.41-6.32(m,1H),6.26(d,J＝15.6Hz,1H),6.12(d,J＝11.3Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.6Hz,1H),5.59(dd,J＝16和5.5Hz,1H),5.55-5.49(m,1H),4.56-4.49(m,1H),4.36-4.27(m,1H),3.70-3.61(m,2H),3.54-3.47(m,1H),2.65-2.60(m,2H),2.48-2.41(m,1H),2.36-2.17(m,2H),2.16-2.09(m,1H),1.98(s,3H),1.85-1.72(m,3H),1.72-1.61(m,6H),1.43-1.35(m,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A12
制备N-[3-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰基]-D-缬氨酰基N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]苯基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-D-鸟氨酰胺(#B27)
Figure BDA0000751870110001181
步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基N-[4-({[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨甲酰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B23)。向(4-氨基苄基)氨基甲酸叔丁酯(75.4mg,0.339mmol,1.3eq.)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(2mL,0.16M)添加2,6-二甲基吡啶(140mg,1.3mmol,5eq.)、N,N-二异丙基乙胺(169mg,1.3mmol,5eq.)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(HOAt,71.1mg,0.522mmol,2eq.)，搅拌5分钟。将全部反应混合物添加至N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(200mg,0.261mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(2mL,0.13M)，并将反应加热至50℃，持续5小时，并真空浓缩。通过中压逆相C18色谱法(梯度:含10％至100％水的乙腈，并且每一相有0.02％三氟乙酸)纯化粗制的期望物质以得到固体状的#B23。收率：40mg,0.047mmol,18％。
步骤2.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[({[4-(氨基甲基)苯基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺双三氟乙酸盐(#B24)。向#B23(40mg,0.047mmol,1eq.)在二氯甲烷中的悬浮液(2mL,0.023M)添加二氯甲烷/三氟乙酸的1:1溶液(2mL)。在45分钟之后，将反应真空浓缩成橙色胶质#B24，其在不进一步纯化的情况下使用。收率：46mg(推定定量收率)。LCMS(方案D):m/z 750.4[M+H]+,保留时间＝0.73分钟。
步骤3.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-D-缬氨酰基N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]苯基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-D-鸟氨酰胺(#B25)。向B24(46mg,0.047mmol,1eq.)在四氢呋喃中的溶液(1mL,0.047M)添加N,N-二异丙基乙胺(12.8mg,0.017mmol,2.1eq.)。然后，将全部混合物滴加至#B1(29.7mg,0.047mmol,1eq.)在四氢呋喃(1mL)的溶液。在18h之后，添加甲醇(0.4mL)。在48小时之后，将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制产物以得到白色固体状的#B25。收率：12.2mg,0.009mmol,20％。HPLC(方案AA):保留时间＝9.140(纯度＝89％)。LCMS(方案D):m/z 1268.7[M+H]+,保留时间＝0.92分钟。
步骤4.合成D-缬氨酰基-N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]苯基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-D-鸟氨酰胺(#B26)。向#B25(12mg,0.009mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液(0.3mL,0.3M)添加哌啶(0.2mL的储备溶液，即0.050mL在1mLN,N-二甲基甲酰胺中)。在30分钟之后，将反应真空浓缩并通过逆相色谱法(方法A)纯化，并将属于期望产物的流分冻干以得到固体状的#B26。收率：6.6mg,0.006mmol,70％。HPLC(方案AA):保留时间＝6.957(纯度＝89％)。LCMS(方案D):m/z1045.8[M+H]+,保留时间＝0.69分钟。
步骤5.合成N-[3-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰基]-D-缬氨酰基-N-(4-{[({4-[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]苯基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-D-鸟氨酰胺(#B27)。向#B26(6mg,0.006mmol,1eq.)在四氢呋喃中的溶液(0.6mL,0.01M)添加N,N-二异丙基乙胺(0.25mL的储备溶液[通过将0.01mL N,N-二异丙基乙胺溶解在1mL四氢呋喃中而制成],0.012mmol,2eq.)，并在室温下搅拌5分钟。将全部混合物滴加至2-溴-N-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]乙酰胺(2.4mg,0.006mmol,1eq.)的冷却(0℃)溶液。将反应在0℃搅拌5分钟，然后升温至室温。在16小时之后，将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B27。收率：1.4mg,0.001mmol,20％。LCMS(方案D):m/z 1348.7[M+Na]+,保留时间＝0.77分钟。
实施例A13
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-({4-[(3-{2-[(N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}甘氨酰基)氨基]苯基}丙酰基)氨磺酰基]苄基}氨基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B37)
Figure BDA0000751870110001211
步骤1.合成(2E)-3-(2-{[N-(叔丁氧羰基)甘氨酰基]氨基}苯基)丙-2-烯酸甲酯(#B28)。在室温下，向N-(叔丁氧羰基)甘氨酸(13.4g,77.1mmol,1eq.)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(22.1g,115.7mmol,1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(11.4g,84.8mmol,1.1eq.)、4-(二甲基氨基)吡啶(0.9g,7.4mmol,0.10eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(350mL)中的溶液添加(2E)-3-(2-氨基苯基)丙-2-烯酸甲酯(15g,84.7mmol,1.1eq.)。将反应升温至50℃，搅拌18小时。将反应用水(400mL)稀释，用柠檬酸(200mL)清洗，用乙酸乙酯(300mL×3)萃取。将有机层用盐水(150mL)清洗，经硫酸钠干燥，过滤，并将滤液真空浓缩。通过用8:1至1:1的石油醚：乙酸乙酯洗脱的凝胶色谱法纯化粗制产物以得到固体状的#B28(20g,71％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.29(br,1H),7.84(d,2H),7.55(t,1H),7.40(t,1H),7.22(t,1H),6.41(d,2H),5.37(br,1H),4.00(d,2H),3.79(s,3H),1.46(s,9H)。
步骤2.合成3-(2-{[N-(叔丁氧羰基)甘氨酰基]氨基}苯基)丙酸甲酯(#B29)。将化合物#B28(20g,59.8mmol,1eq.)和Pd/C(2.0g)在乙酸乙酯(350mL)和甲醇(300mL)中的悬浮液在真空下脱气，用H2吹扫数次。将反应混合物在室温下于H2(30Psi)下搅拌9小时。将反应混合物过滤，并将滤饼用乙酸乙酯(100mL)清洗。将滤液蒸发至干燥，以得到油状的化合物#B29，其在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤:收率(20.75g,推定定量)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ9.13(br,1H),7.75(d,1H),7.22(d,1H),7.17(m,2H),5.34(br,1H),4.04(d,2H),3.64(s,3H),2.95(t,2H),2.72(t,2H),1.46(s,9H)。
步骤3.合成3-(2-{[N-(叔丁氧羰基)甘氨酰基]氨基}苯基)丙酸(#B30)。向#B29(20.75g,59.8mmol,1eq.)在四氢呋喃(200mL)中的溶液添加氢氧化钠(12.24g,0.306mmol)在水(155mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌3小时。通过柠檬酸将反应混合物pH调节至pH 5～6，用乙酸乙酯(400mL×2)萃取。将有机层用盐水(150mL×2)清洗，经硫酸钠干燥，浓缩至干燥以得到固体状的#B30，其在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤，收率：21.5g(推定定量)。1H NMR(400MHz,CD3OD)δ7.29(m,1H),7.23(m,3H),3.90(s,2H),2.91(m,2H),2.66(m,2H),1.49(m,9H)。LCMS(方案I):m/z 345[M+Na]+,保留时间＝1.034分钟。
步骤4.合成3-[2-(甘氨酰基氨基)苯基]丙酸(#B31)。向#B30(10g,31.1mmol,1eq.)在乙酸乙酯(100mL)中的溶液添加HCl/二氧己环(70mL)。将反应在室温下搅拌3小时，然后浓缩至干燥。将残留物从叔丁基甲醚(50mL)中再结晶以得到固体状的#B31(5.9g,26.5mmol,基于三步为85.5％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ10.06(br,1H),8.31(br,3H),7.41(d,1H),7.28(m,3H),3.84(s,2H),2.88(m,2H),2.52(m,2H)。
步骤5.合成3-(2-{[N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)甘氨酰基]氨基}苯基)丙酸(#B32)。向#B31(1.11g,4.98mmol,1eq.)和碳酸氢钠(528mg,7.47mmol,1.5eq.)在四氢呋喃(25mL)和水(10mL)中的溶液滴加9H-芴-9-基甲基{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基甲酸酯(2.7g,5.98mmol,1.2eq.)在四氢呋喃(45mL)和1,2-二甲氧基乙烷(10mL)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌16小时。通过柠檬酸将反应混合物pH调节至pH 5～6，用二氯甲烷(100mL×2)萃取。将有机层用盐水(100mL)清洗，经硫酸钠干燥，浓缩至干燥。通过用100:1至10:1的二氯甲烷：甲醇洗脱的硅胶色谱法纯化粗制产物以得到固体状的#B32(1.1g,1.97mmol,39.7％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6),δ9.31(s,1H),8.18(s,1H),7.89(d,2H),7.70(d,2H),7.40(m,6H),7.13(m,5H),4.30(m,2H),4.21(m,1H),3.90(m,2H),2.98(m,2H),2.80(m,2H),2.77(m,1H),2.48(m,1H),2.20(m,2H),1.54(m,2H),1.42(m,2H),1.25(m,2H)。LCMS(方案I):m/z 580.1[M+Na]+,保留时间＝1.315分钟。
步骤6.合成9H-芴-9-基甲基{6-[(2-{[2-(3-{[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)磺酰基]氨基}-3-氧代丙基)苯基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸酯(#B33)。在室温下，将#B32(900mg,1.62mmol,1eq.)和(4-氨磺酰基苄基)氨基甲酸叔丁酯(787mg,2.59mmol,1.6eq.)、4-(二甲基氨基)吡啶(198mg,1.62mmol,1eq.)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(369mg,1.2mmol,0.7eq.)在二氯甲烷(30mL)中的溶液搅拌3.5小时。通过柠檬酸将反应混合物pH调节至pH 5～6，用二氯甲烷(30mL×2)萃取。将有机层用盐水(100mL)清洗，经硫酸钠干燥，浓缩至干燥。通过用100:1至20:1的二氯甲烷：甲醇洗脱的硅胶色谱法纯化粗制产物以得到固体状的#B33(800mg,0.972mmol,60.0％)。1HNMR(400MHz,DMSO-d6),δ12.09(br,1H),9.30(s,1H),8.19(m,1H),7.89(m,4H),7.70(m,2H),7.46(m,1H),7.44(m,4H),7.42(m,3H),7.35(m,1H),7.16(m,1H),7.08(m,2H),4.23(m,2H),3.88(m,3H),3.87(m,2H),2.70(m,2H),2.68(m,2H),2.50(m 2H),2.17(m,2H),1.53(m,2H),1.51(s,9H),1.25(m,4H)。LCMS(方案J):m/z 726.1[M-Boc]+,保留时间＝1.211分钟。
步骤7.合成9H-芴-9-基甲基(6-{[2-({2-[3-({[4-(氨基甲基)苯基]磺酰基}氨基)-3-氧代丙基]苯基}氨基)-2-氧代乙基]氨基}-6-氧代己基)氨基甲酸酯(#B34)。向(#B33)(52.6mg,0.063mmol,1eq.)在二氯甲烷(3mL,0.02M)中的悬浮液添加三氟乙酸(0.6mL)，并搅拌2小时，然后真空浓缩。将残留物与乙腈(3×)共沸以得到#B34(45.7mg,0.063mmol,推定定量)，其在不进一步纯化的情况下原样用于接下来的步骤。LCMS(方案D):m/z 726.3[M+H]+,保留时间＝0.73分钟。
步骤.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[3-(2-{[N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)甘氨酰基]氨基}苯基)丙酰基]氨磺酰基}苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B35)。向#B34(45.7mg,0.063mmol,1eq.)在四氢呋喃中的溶液(0.5mL,0.12M)添加N,N-二异丙基乙胺(24.4mg,0.189mmol,3eq.)。将全部反应混合物添加至#B1(40mg,0.063mmol,1eq.)在四氢呋喃(0.5mL)中的冷却(0℃)溶液，并使反应升温至室温。在1小时之后，将反应真空浓缩以得到#B35(55mg,0.053mmol,70％)，其在不进一步纯化的情况下原样用于接下来的步骤。LCMS(方案D):m/z 1243.6[M+H]+,保留时间＝0.95分钟。
步骤9.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[3-(2-{[N-(6-氨基己酰基)甘氨酰基]氨基}苯基)丙酰基]氨磺酰基}苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯甲酸盐(#B36)。向#B35(55mg,0.053mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液添加哌啶(0.2mL的储备溶液[通过将0.05mL溶解在1mL N,N-二甲基甲酰胺中而制得],0.106mmol,2eq.)。在30分钟之后，将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B36。收率：30mg,0.027mmol,52％.HPLC(方案AA):保留时间＝7.143分钟(纯度＝92％)。LCMS(方案D):m/z1021.4[M+H]+保留时间＝0.67分钟。1H NMR(DMSO-d6)δ:10.23-10.21(b.s.,1H D2O可互换的)8.36-8.31(m,1H),8.25-8.20(m,1H),7.76-7.68(m,1H),7.53-7.42(m,3H),7.14-7.02(m,3H),6.99-6.93(m,1H),6.35-6.21(m,2H),6.08-6.01(m,1H),5.82-5.76(m,1H),5.61-5.52(m,1H),5.50-5.42(m,1H),4.28-4.16(m,4H),3.82(d,J＝5.9Hz,2H),3.57(d,J＝6.2Hz,2H),3.49-3.42(m,1H),3.21-3.18(m,1H),2.74-2.66(m,3H),2.62-2.49(m,3H),2.31-2.11(m,6H),1.91(s,3H),1.84-1.69(m,3H),1.64(s,3H),1.60-1.41(m,6H),1.32-1.22(m.,2H),1.18(d,J＝6.6Hz,3H),0.99(d,J＝6.21Hz,3H)-0.88(d,J＝6.21Hz,3H)
步骤10.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-({4-[(3-{2-[(N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}甘氨酰基)氨基]苯基}丙酰基)氨磺酰基]苄基}氨基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B37)。向#B36(20mg,0.018mmol,1eq.)在四氢呋喃中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(9.8mg,0.076mmol,4.2eq.)和甲醇(0.1mL)。将全部混合物添加至1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(4.2mg,0.018mmol,1eq)的冷却(0℃)溶液，并在0℃搅拌5分钟，然后升温至室温。在18小时之后，将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B37。收率：3.8mg,0.003mmol,18％。HPLC(方案AA):保留时间＝7.554和7.77分钟(纯度91％)。LCMS(方案D):m/z 1141.4[M+H]+保留时间＝0.8分钟。1H NMR(400MHz,METHANOL-d4):7.66(d,J＝8.2Hz,2H),7.56-7.49(m,1H),7.33-7.26(m,2H),7.03(m,3H),6.32-6.23(m,1H),5.94-5.81(m,2H),5.58(dd,J＝16.0,8.0Hz,1H),5.47-5.39(m,1H),4.46(s,2H),4.43-4.34(m,1H),4.3(m,2H),3.88(s,2H),3.68(s,2H),3.67-3.62(m,2H),3.61-3.55(m,1H),3.52-3.44(m,1H),3.36-3.32(m,1H),3.11(t,J＝16Hz,1H),2.8(d,J＝8.0,1H),2.78-2.72(m,2H),2.68(t,J＝8.0,2H),2.57(d,J＝4.0Hz,1H),2.45-2.39(m,2H),2.36(dd,J＝16.0,8.0Hz,1H),2.30(d,J＝8.0Hz,1H),2.25(t,J＝8.0Hz,2H),2.20-2.09(m,1H),1.9(s,1H),1.85-1.78(m,2H),1.75-1.71,(m,1H),1.68(s,3H),1.64-1.54(m,3H),1.50-1.43(m,2H),1.27-1.35(m,2H),1.25(d,J＝8.0Hz,3H),1.00(d,J＝8.0Hz,3H),1.05-0.87(d,J＝8.0Hz,3H)。
实施例A14
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B40)
Figure BDA0000751870110001261
步骤1.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B39)。向#B15(38mg,0.075mmol,1eq.)在4:1四氢呋喃:水(2.2mL)中的溶液添加氢氧化锂(15.6mg,0.652mmol,8.7eq.)，并将混合物在室温下搅拌12小时。将反应用乙酸乙酯稀释并用水清洗。将水层用乙酸乙酯(3×)萃取，并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)的纯化得到固体状的#B39。收率：16.7mg,0.035mol,47％。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.76(d,J＝8.2Hz,1H),7.31(s,1H),6.77(s,1H),6.27(d,J＝16.0Hz,1H),5.97(d,J＝11Hz,1H),5.86(dd,J＝11.7和7.0Hz,1H),5.59(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),5.22-5.12(m,1H),5.10(d,J＝4.7Hz,1H),4.58-4.48(m,1H),4.35-4.25(m,1H),3.69-3.59(m,2H),3.54-3.46(m,1H),2.64-2.52(m,3H),2.37-2.14(m,3H),1.87-1.73(m,3H),1.72-1.60(m,6H),1.37(dd,J＝13.3和6.2Hz,1H),1.11(d,J＝6.2Hz,3H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。HPLC(方案AA)保留时间＝7.15分钟(纯度＝100％)。LCMS(方案C):m/z499.3[M+Na]+,保留时间＝1.18分钟。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯#B40:向#B39(106mg,0.222mmol,1eq.)在二氯甲烷(3mL)中的溶液添加三乙胺(79mg,0.777mmol,3.5eq)、4-N,N’-二甲基氨基吡啶(18.9mg,0.155mmol,0.7eq.)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(207mg,0.666mmol,3eq.)，并将反应在室温下搅拌2小时。向1/5的此种混合物添加哌啶(18.9mg,0.222mmol,1eq.)，并将混合物在室温下搅拌3.5小时，真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法D*)纯化残留物以得到#B40。收率2.7mg,0.021mmol,9.5％。HPLC(方案B)m/z 588.4[M+H]+,保留时间＝2.82分钟(纯度＝100％)。
实施例A15
制备N-[3-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰基]-L-缬氨酰基N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B43).
Figure BDA0000751870110001271
步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B41)。向#B7(56mg,0.1mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2.6mL)中的溶液添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基N～5～-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(FMocValCitPABC-PNP,WO04010957,121mg,0.15mmol,1.5eq.)、N,N’-二异丙基乙胺(56mg,0.4mmol,4.0eq.)、2,6-二甲基吡啶(45mg,0.4mmol,4.0eq.)和3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-醇(14.3mg,0.105mmol,1.05eq.)。在50℃搅拌1.5小时之后，将反应混合物真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制物质以得到固体状的#B41。收率：72mg,0.06mmol,59％.LCMS(方案D):m/z 1183.5[M+Na]+,保留时间＝0.95分钟。
步骤2.合成L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B42)。向#B41(50mg,0.043mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.7mL)中的溶液添加哌啶(66mg,0.78mmol,20eq.)，并将混合物搅拌20分钟。将反应混合物真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制物质，以得到#B42。收率：31mg,0.033mmol,76％。LCMS(方案D):m/z 939.3[M+H]+,保留时间＝0.66分钟。
步骤3.合成N-[3-(2-{2-[(溴乙酰基)氨基]乙氧基}乙氧基)丙酰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B43)。向#B42(10mg,0.011mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中的溶液添加2-溴-N-[2-(2-{3-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-3-氧代丙氧基}乙氧基)乙基]乙酰胺(4.3mg,0.011mmol,1eq.)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应用二甲亚砜(0.2mL)稀释，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到固体状的#B43。收率：8.8mg,0.007mmol,66％。HPLC(方案AA)保留时间＝7.69分钟(纯度＝71％)。LCMS(方案A):m/z 1220.4[M+H]+,保留时间＝0.77分钟。
实施例A16
制备N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B47)
Figure BDA0000751870110001291
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(#B44)。在室温下，将N,N-二异丙基乙胺(3.8mL,22.12mmol,1.9eq.)添加至6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酸(4.2g,11.80mmol,1eq.)和N,N,N’,N'-四甲基-O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)脲鎓六氟磷酸盐(HATU,5.6g,14.75mmol,1.25eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(50mL,0.24M)中的溶液，并搅拌10分钟。然后，向混合物添加L-缬氨酰基N～5～-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(来自WO04010957,5.6g,14.75mmol,1.25eq.)。在15小时之后，通过添加二氯甲烷使反应混合物沉淀，并过滤以得到灰白色固体状的#B44。收率：6.9g,9.6mmol,82％。LCMS 715.6(M+H)+
步骤2.合成4-[(N～5～-氨甲酰基-N～2～-{(3S)-3-[(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)氨基]-4-甲基戊-1-烯-2-基}-L-鸟酰胺基)氨基]苄基4-硝基苯基碳酸酯(#B45)。用N,N-二异丙基乙胺(365μL,2.1mmol,3eq.)处理#B44(500mg,0.7mmol,1eq.)和4-硝基苯基碳酸酯(638mg,2.1mmol,3eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(3mL,0.2M)中的溶液。将反应在室温下搅拌过夜。将反应混合物真空浓缩，吸收到SiO2上，并通过硅胶色谱法(梯度:含0至25％甲醇的二氯甲烷)纯化，以得到固体状的#B45。收率：402mg,0.476mmol,68％。LCMS(方案L):m/z 880.7[M+H]+保留时间3.39。
步骤3.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B46)。使用制备化合物#B41所述的操作，由71mg(0.13mmol)的#B6和171mg(0.194mmol)的#B45以10％收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1290.5[M+H]+,保留时间＝0.91分钟。
步骤4.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B47)。向#B46(19mg,0.015mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.35mL)中的溶液添加哌啶(25mg,0.3mmol,20eq.)，并将混合物在室温下搅拌30分钟。将反应用二甲亚砜(0.7mL)稀释，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到固体状的#B47。收率：3mg,0.0028mmol,18％。HPLC(方案AA)保留时间＝6.65,6.69分钟(纯度＝91％)。LCMS(方案D):m/z 1069.9[M+H]+,保留时间＝0.61分钟。
实施例A17
制备N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B48)
Figure BDA0000751870110001301
步骤1.依照一般操作E将化合物#B9(113mg,0.217mmol)转化成粗制#B7。LCMS(方案D):m/z 534.1[M+H]+,保留时间＝0.77分钟。粗制物质在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤。
步骤2.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B48)。向粗制#B7(60mg,0.11mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2.8mL)中的溶液添加2,6-二甲基吡啶(48mg,0.448mmol,4eq.)、N,N’-二异丙基乙胺(57.9mg,0.448mmol,4eq.)和HOAt(15.2mg,0.112mmol,1eq.)。将反应升温至50℃，并搅拌1.5小时。将反应冷却至室温，并缓慢添加哌啶(191mg,2.24mmol,20eq.)，并搅拌2.0小时。将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法C*)纯化以得到固体状#B48。收率6.4mg,0.005mmol,5.2％。HPLC(方案F):m/z 1052.6[M+H]+,保留时间＝7.114分钟(纯度100％)。
实施例A18
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B49)
Figure BDA0000751870110001311
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B49)。将#NP1(1.5g,～50％纯度,2.8mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,1.07g,4.5mmol,1.6eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,1.0mL)在N,N-二甲基甲酰胺(7.0mL)中的混合物在环境温度下搅拌40分钟。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色固体状的#B49。收率：730.7mg,80％收率。HPLC(方案N):保留时间＝11.15分钟(纯度92％)。HRESIMS(方案O)m/z 654.313[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)
Figure BDA0000751870110001312
8.84(dd,J＝4.4,1.2,1H),8.74(dd,J＝8.3,1.2,1H),7.77(d,J＝8.2,1H,D2O可互换的),7.66(dd,J＝8.3,4.4,1H),6.45(br d,J＝15.8,1H),6.36(ddq,J＝1.5,6.5,6.5,1H),6.09(dd,J＝1.3,11.7,1H),5.86(dd,J＝11.7,7.4,1H),5.62(dd,J＝16.0,5.0,1H),5.38(br dd,J＝7.4,7.4,1H),5.18(d,J＝6.0,D2O可互换的),4.48(m,1H),4.37(dd,J＝4.0,4.0,1H),3.61(m,1H),3.54(dq,2.1,6.5,1H),3.37(ddd,J＝6.9,6.9,3.1,1H),3.34(m,2H),3.26(dd,J＝16.0,9.7,1H),2.21(m,1H),2.14(m,1H),2.10(dd,J＝12.7,8.9,1H),1.99(s,3H),1.74(m,2H),1.68(s,3H),1.59(dd,J＝13.0,3.3,1H),1.50(m,1H),1.25(d,J＝6.4,3H),0.95(d,J＝6.5,3H),0.86(d,J＝7.0,3H)。
实施例A19
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-[(2E,4E)-3-甲基-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-氧代-2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}戊-2,4-二烯-1-基]四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B50)
Figure BDA0000751870110001321
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-[(2E,4E)-3-甲基-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-氧代-2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基氧基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}戊-2,4-二烯-1-基]四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B50)。将#NP2(284mg,92％纯,0.47mmol,1.0eq)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,220mg,0.58mmol,1.2eq)和N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,0.1mL)在N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中的混合物在环境温度下搅拌60分钟。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色固体状的#B50。收率：307.0mg,88％收率HPLC(方案N):保留时间＝13.12分钟(纯度94％)。HRESIMS(方案O)m/z 638.320[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ8.83(dd,J＝4.4,1.2,1H),8.73(dd,J＝8.5,1.2,1H),7.76(d,J＝8.1,1H,D2O可互换的),7.66(dd,J＝8.5,4.4,1H),6.39(br d,J＝15.8,1H),6.36(ddq,J＝1.5,6.5,6.5,1H),6.09(dd,J＝1.5,11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.5,1H),5.66(dd,J＝16.1,4.9,1H),5.44(br dd,J＝7.1,7.1,1H),4.71(ddd,J＝4.4,4.4,4.4,1H),4.51(m,1H),3.63(m,1H),3.57(dq,J＝2.3,6.6,1H),3.41(ddd,J＝6.9,6.9,3.1,1H),3.36(dd,J＝16.0,4.1,1H),3.33(dd,J＝16.1,10.0,1H),2.74(d,J＝4.8,1H),2.70(d,J＝4.8,1H),2.24(m,1H),2.15(m,1H),1.98(s,3H),1.85(m,1H),1.83(m,1H),1.70(dd,J＝13.0,7.5,1H),1.66(dd,J＝13.5,7.9,1H),1.52(m,1H),1.25(d,J＝6.8,3H),1.00(d,J＝6.5,3H),0.89(d,J＝7.5,3H)。
实施例A20
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B52)
Figure BDA0000751870110001331
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B51)。在搅拌的情况下，向#B49(50.5mg,92％纯度,0.08mmol,1.0eq.)和9H-芴-9-基甲基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯(32.1mg,0.11mmol,1.4eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液添加N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,20μL)。然后，将所得的混合物在室温下搅拌10分钟。向反应溶液缓慢地添加哌啶(30μL,0.35mmol,4.4eq.)，并将溶液在环境温度下搅拌1小时。然后，使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B51。收率：38.8mg,86％收率HPLC(方案N):保留时间＝6.61分钟(纯度97％)。LCMS(方案M):m/z 578.8[M+H]+。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B52)。将碘乙酸(40.3mg,0.22mmol,7.3eq.)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC,61.6mg,0.3mmol,10.0eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2.5mL)中的溶液在室温下搅拌10分钟，并将浅黄色溶液添加至含#B51(21.1mg,85.0％纯度,0.031mmol,1.0eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中。将所得的溶液在室温下搅拌20分钟。然后，使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B52。收率：10.3mg,37％收率HPLC(方案N):保留时间＝8.96分钟(纯度37％)。LCMS(方案M):m/z 746.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ8.22(m,1H,D2O可互换的),7.91(m,1H,D2O可互换的),7.80(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.29(br d,J＝16.0,1H),6.11(d,J＝11.7,1H),5.86(dd,J＝11.7,7.8,1H),5.60(dd,J＝16.0,5.5,1H),5.51(br dd,J＝6.6,6.6,1H),5.02(d,J＝5.0,D2O可互换的,1H),4.26(m,2H),3.65(m,2H),3.60(s,2H),3.51(br dd,J＝6.2,6.2,1H),3.24(m,1H),3.08(br s,4H),2.76(d,J＝5.1,1H),2.60(d,J＝5.1,1H),2.51(m,1H),2.47(m,1H),2.28(m,1H),2.18(m,1H),1.98(s,3H),1.86(m,1H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.49(dd,J＝12.5,2.7,1H),1.25(d,J＝6.6,3H),1.07(d,J＝6.5,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例A21
制备(2Z,4S)-4-羟基-N-{(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}戊-2-烯酰胺(#B54)
Figure BDA0000751870110001351
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B4)。将#NP1(192mg,约50％纯度,0.18mmol,1.0eq.)、碳酸钾(300mg,2.4mmol,13.5eq.)和甲醇(5mL)的混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物用乙酸中和，过滤，然后使用逆相色谱法(方法G)纯化以得到白色固体状的#B4。收率：50.2mg。HPLC(方案N):保留时间＝7.39分钟(纯度96％)。LCMS(方案M):m/z 494.3[M+H]+。
步骤2.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B53)。将#B4(23.4mg,0.047mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,34.0mg,0.09mmol,2.0eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(20.0μL)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液在室温下搅拌30分钟。向该溶液添加乙-1,2-二胺(80μl,1.3mmol,～30eq.)，并将所得的溶液搅拌1小时。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色固体状的#B53。收率：31mg.HPLC(方案N):保留时间＝5.58分钟(纯度50％)。LCMS(方案M):m/z 536.4[M+H]+
步骤3.合成(2Z,4S)-4-羟基-N-{(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}戊-2-烯酰胺(#B54)。将碘乙酸(35mg,0.18mmol,6eq.)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC,49.8mg,0.24mmol,8eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2ml)中的溶液在室温下搅拌10分钟，然后添加至含#B53(31.0mg,约50％纯度,约0.03mmol,1.0eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中。将所得的溶液在室温下搅拌0.5小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B54(23.0mg)。用不同的梯度体系再纯化该物质，其得到白色粉末状的#B54。收率：15.9mg,27％收率,基于三个步骤。HPLC(方案N):保留时间＝7.10分钟(纯度92％)。LCMS(方案M)m/z704.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ8.22(m,1H,D2O可互换的),7.91(m,1H,D2O可互换的),7.77(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),6.28(br d,J＝16.0,1H),5.98(d,J＝11.7,1H),5.86(dd,J＝11.7,7.0,1H),5.60(dd,J＝16.0,5.5,1H),5.51(br dd,J＝6.6,6.6,1H),5.16(dq,J＝6.2,6.2,1H),5.11(d,J＝3.9,1H,D2O可互换的),5.03(d,J＝4.5,D2O可互换的,1H),4.26(m,2H),3.65(m,2H),3.60(s,2H),3.51(br dd,J＝6.5,6.5,1H),3.25(m,1H),3.08(br s,4H),2.75(d,J＝4.7,1H),2.60(d,J＝4.7,1H),2.51(m,1H),2.47(m,1H),2.27(m,1H),2.22(m,1H),1.86(m,1H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.49(dd,J＝12.5,2.3,1H),1.11(d,J＝6.6,3H),1.07(d,J＝6.0,3H),0.95(d,J＝7.4,3H)。
实施例A22
制备[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B55)
Figure BDA0000751870110001361
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B55)。将#NP1(9.9mg,92％纯度,0.018mmol,1.0eq.)、碳酸钾(40mg,0.33mmol,18eq.)和碘甲烷(30μL,0.31mmol,17eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(500μL)中的混合物在室温下搅拌2小时。将反应混合物用乙酸中和，过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色固体状的#B55。收率：7.8mg,77％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.7分钟(纯度94％)。LCMS(方案M)m/z 550.5[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝8.1,1H,D2O可互换的),6.36(ddq,J＝1.2,6.8,6.8,1H),6.28(br d,J＝15.9,1H),6.11(dd,J＝1.2,11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.7,1H),5.58(dd,J＝16.1,5.0,1H),5.52(br dd,J＝7.4,7.4,1H),5.02(d,J＝5.8,D2O可互换的),4.29(m,1H),4.27(dd,J＝5.3,5.3,1H),3.65(m,2H),3.60(s,3H),3.51(ddd,J＝7.0,7.0,2.5,1H),3.25(dd,J＝5.8,5.3,1H),2.76(d,J＝5.0,1H),2.65(dd,15.4,8.7,1H),2.58(d,J＝5.0,1H),2.57(dd,J＝15.4,5.0),2.30(m,1H),2.21(m,1H),1.98(s,3H),1.86(dd,J＝13.2,7.6,1H),1.69(s,3H),1.66(m,1H),1.53(dd,13.2,3.9,1H),1.25(d,J＝6.1,3H),1.07(d,J＝6.4,3H),0.95(d,J＝7.4,3H)。
实施例A23
制备[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-({(2Z,4S)-4-[(哌啶-1-基羰基)氧基]戊-2-烯酰基}氨基)四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B60)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B62)
Figure BDA0000751870110001381
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-(1-乙氧基乙氧基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B56)。向#NP1(195mg,约50％纯度,0.18mmol,1.0eq.)和碳酸钾(200mg,1.6mmol,9eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(4.0mL)的混合物添加碘甲烷(500μL,18eq.)。将所得的溶液搅拌120分钟。将反应混合物过滤，并使滤液在水与乙酸乙酯(每一相为10mL)之间分配。将有机层经无水硫酸镁干燥，并减压蒸发以得到膜状#B55(191.2mg,约50％纯度)。接下来，将粗制#B55(191.0mg,0.18mmol,1.0eq.)与对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS,56.1mg,0.22mmol,1.2eq.)和乙基乙烯基醚(2.5ml,43mmol,)混合，在无水二氯甲烷(2.0ml)中于室温下搅拌1小时。将反应混合物部分地减压蒸发，然后在乙酸乙酯(10mL)/碳酸氢钠水溶液(饱和的，10mL)之间分配。将有机层经无水硫酸镁干燥，然后减压蒸发以得到#B56(187.1mg)HPLC(方案N):保留时间＝13.2分钟(纯度50％)。LCMS(方案M):m/z 549.5[M+H-CHCH3OCH2CH3]+。其原样用于接下来的反应。
步骤2.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-(1-乙氧基乙氧基)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B57)。将#B56(187.1mg,约50％纯度,0.15mmol,1.0eq.)、碳酸钾(120mg,0.98mmol,6.5eq.)在甲醇(4mL)中的悬浮液在室温下搅拌1小时。然后，将反应混合物过滤并减压蒸发至干燥以得到#B57(171.5mg)，其原样用于接下来的反应。HPLC(方案N):保留时间＝9.9分钟(纯度50％)。LCMS(方案M):m/z507.5[M+H-CHCH3OCH2CH3]+。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-(1-乙氧基乙氧基)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B58)。将#B57(171mg,50％纯度,0.15mmol,1.0eq.)、双(对硝基苯基)碳酸酯(320.1mg,1.0mmol,7eq.)、4-(二甲基氨基)吡啶(9.8mg,0.08mmol,0.5eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,150μL)在二氯甲烷(4.0mL)中的溶液在室温下搅拌6小时。向反应溶液缓慢地添加哌啶(500μL,5.8mmol,38eq.)，并将所得的黄色溶液在室温下搅拌15分钟。添加冰冷水(20mL)，并将有机溶剂通过减压蒸发而去除。由此形成的沉淀物通过过滤而收集，然后在真空下干燥以得到#B58(347.0mg)，其原样用于接下来的反应。HPLC(方案N):保留时间＝13.20分钟(纯度25％)。LCMS(方案M):m/z691.7[M+H]+。
步骤4.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-({(2Z,4S)-4-[(哌啶-1-基羰基)氧基]戊-2-烯酰基}氨基)四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-(1-乙氧基乙氧基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B59)。向#B58(347mg,约25％纯度,0.13mmol,1.0eq.)在乙腈(10ml)中的溶液添加1M氢氧化锂(1mL)和水(1mL)。将所得的浑浊溶液在室温下搅拌1小时，并且其逐渐变澄清。添加额外的1M氢氧化锂(1.0mL)，并将溶液进一步搅拌2小时。将反应混合物在正丁醇(30mL)和水(30mL)之间分配。将顶层用H2O(20mL)清洗，然后减压蒸发至干燥以得到#B59(280.2mg)，其原样用于接下来的反应。HPLC(方案N):保留时间＝7.43分钟(纯度30％)。LCMS(方案M):m/z 677.4[M+H]+。
步骤5.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-3,6-二甲基-5-({(2Z,4S)-4-[(哌啶-1-基羰基)氧基]戊-2-烯酰基}氨基)四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B60)。将#B59(280.2mg,约30％纯度,0.12mmol,1.0eq.)和对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS,250.4mg,1mmol,8.0eq.)在甲醇(5mL)中的溶液在室温下搅拌4小时，然后在4℃静置18小时。然后，使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B60。收率：78.4mg,(40％收率,基于步骤1-5)HPLC(方案N):保留时间＝10.84分钟(纯度96.7％)。LCMS(方案M):m/z605.4[M+H]+。
步骤6.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B61)。将#B60(38.2mg,0.06mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,40.1mg,0.1mmol,1.7eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,20.0μL)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液在室温下搅拌20分钟。向该溶液添加1,2-乙二胺(120μL,2mmol,33eq.)，并将所得的溶液搅拌20分钟。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色固体状的#B61。收率：14.2mg,xx％)HPLC(方案N):保留时间＝7.86分钟(纯度70％)。LCMS(方案M):m/z647.8[M+H]+。
步骤7.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({2-[(碘乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B62)。将碘乙酸(20.3mg,0.1mmol,7eq.)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC,31.6mg,0.15mmol,10eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液在室温下搅拌10分钟，然后添加至包含在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中的#B61(14.0mg,约70％纯,0.015mmol,1.0eq.)的小瓶。将所得的溶液在室温下搅拌30分钟。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B62。收率：3.7mg,(11％,基于步骤6-7)。HPLC(方案N):保留时间＝10.48分钟(纯度94％)。LCMS(方案M):m/z 815.4[M+H]+,837.4[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz).8.22(m,1H,D2O可互换的),7.91(m,1H,D2O可互换的),7.78(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),6.29(br d,J＝16.1,1H),6.22(dq,J＝7.0,7.0,1H),6.09(d,J＝11.7,1H),5.89(dd,J＝11.3,7.4,1H),5.61(dd,J＝16.0,5.1,1H),5.51(br dd,J＝6.2,6.2,1H),5.03(d,J＝5.5,D2O可互换的),4.26(m,2H),3.65(m,2H),3.60(s,2H),3.51(brdd,J＝6.2,6.2,1H),3.30(m,4H),3.24(dd,J＝5.0,5.0,1H),3.12-3.08(m,4H),3.00(d,1H),2.80(s,4H),2.75(d,J＝5.1,1H),2.60(d,J＝5.1,1H),2.49(m,2H),2.28(m,1H),2.21(m,1H),1.89(dd,J＝13.2,8.6,1H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.64(m,1H),1.50(dq,J＝13.2,3.1,1H),1.52(m,2H),1.42(m,4H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.0,3H),0.95(d,J＝7.4,3H)。
实施例A24
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯
Figure BDA0000751870110001411
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B63)。向#B49(43.2mg,92.1％纯度,0.065mmol,1.0eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液添加纯丙胺(30μL,0.5mmol,7.0eq.)。将所得的溶液搅拌10分钟。将反应混合物在H2O和乙酸乙酯(各自为10ml)之间分配。将有机层经无水硫酸镁干燥，并减压蒸发以得到#B63。收率：40.4mg,100％。HPLC(方案N):保留时间＝9.73分钟(纯度89％)。HRESIMS(方案O)m/z577.3478[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in
Figure BDA0000751870110001412
)
Figure BDA0000751870110001413
7.83(t,J＝6.0,1H,D2O可互换的),7.81(d,J＝8.1,1H,D2O可互换的),6.36(ddq,J＝1.4,6.5,6.5,1H),6.28(br d,J＝15.9,1H),6.11(dd,J＝1.4,11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.5,1H),5.59(dd,J＝15.9,5.4,1H),5.51(brdd,J＝7.1,7.1,1H),5.02(d,J＝5.4,D2O可互换的),4.26(dd,J＝5.0,5.0,1H),4.24(m,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.49(ddd,J＝7.0,7.0,2.6,1H),3.24(dd,J＝5.0,5.0,1H),3.01(m,1H),2.96(m,1H),2.75(d,J＝5.2,1H),2.58(d,J＝5.2,1H),2.52(m,1H),2.29(ddd,J＝15.5,7.1,7.1,1H),2.21(m,1H),2.20(dd,J＝14.0,4.8,1H),1.98(s,3H),1.83(dd,J＝13.4,5.0,1H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.48(dd,12.7,3.9,1H),1.38(dq,J＝7.5,7.5,2H),1.25(d,J＝6.6,3H),1.07(d,J＝6.8,3H),0.95(d,J＝7.5,3H),0.82(t,J＝7.5,3H)。
实施例A25
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-[(2E,4E)-3-甲基-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}戊-2,4-二烯-1-基]四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B64)
Figure BDA0000751870110001421
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-2,5-二甲基-6-[(2E,4E)-3-甲基-5-{(3S,5S,7S)-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}戊-2,4-二烯-1-基]四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B64)。将#NP2(28.7mg,91％纯度,0.055mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,24.8mg,0.065mmol,1.2eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,30μL)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液在室温下搅拌30分钟。向该溶液缓慢地添加纯丙胺(30μL,0.5mmol,7.0eq.)，并将所得的反应混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色固体状的#B64。收率：34.1mg,86％。HPLC(方案N):保留时间＝13.11分钟(纯度100％)。LCMS(方案M)。m/z 561.6[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.83(t,J＝6.0,1H,D2O可互换的),7.81(d,J＝8.0,1H,D2O可互换的),6.36(ddq,J＝1.6,7.4,6.6,1H),6.24(br d,J＝16.0,1H),6.10(dd,J＝1.6,12.0,1H),5.87(dd,J＝11.8,7.6,1H),5.58(dd,J＝15.9,5.4,1H),5.50(br dd,J＝7.3,7.3,1H),4.55(ddd,J＝5.3,5.3,5.3,1H),4.29(dddd,J＝9.5,5.3,5.3,5.3,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.48(ddd,J＝7.1,7.1,2.6,1H),3.01(m,1H),2.96(m,1H),2.63(d,J＝5.0,1H),2.61(d,J＝5.0,1H),2.59(dd,J＝14.2,8.8,1H),2.31(ddd,J＝16.1,7.5,7.0,1H),2.21(dd,J＝14.1,5.0,1H),2.19(m,1H),1.96(s,3H),1.81(m,1H),1.79(m,1H),1.77(dd,J＝13.0,4.0,1H),1.69(s,3H),1.66(m,2H),1.37(dq,J＝7.5,7.5,2H),1.36(m,1H),1.25(d,J＝6.6,3H),1.07(d,J＝6.8,3H),0.95(d,J＝7.5,3H),0.82(t,J＝7.5,3H)。
实施例A26
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B66)
Figure BDA0000751870110001431
步骤1.合成(3R,4R,5R,7S)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-4-基乙酸酯(#B64a)。向B63(44.0mg,约90％纯度,0.076mmol,1.0eq.)在吡啶(0.5mL)中的溶液添加乙酸酐(150μL,1.6mmol,21.0eq.)。然后，将所得的混合物在室温下搅拌3小时。将反应混合物转移至冰冷水(10mL)中，搅拌20分钟，然后在乙酸乙酯(30mL)和水(30mL)之间分配。将有机层用水(3×20mL)清洗，并蒸发至干燥。将残留物溶解在二甲亚砜(150μL)中，并将溶液缓慢地添加至1M三羟甲基氨基甲烷缓冲液(pH 7.0)，其包含由嗜热脂肪芽孢杆菌(Bucillusstearothermorphillus)(Sigma 69509,0.5mg/mL,总共15mL)产生的酯酶。将反应搅拌1小时，然后在乙酸乙酯(2×20mL)和水(20mL)之间分配。将合并的有机层用水(2×20mL)清洗，然后减压蒸发以得到灰白色粉末状的#B64a。收率：44.9mg,(推定定量)HPLC(方案N):保留时间＝9.51分钟(纯度88％)。LCMS(方案M):m/z 577.6[M+H]+。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(乙酰氧基)-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B65)。将#B64a(14.7mg,0.025mmol,1.0eq.)、双(对硝基苯基)碳酸酯(38.4mg,0.13mmol,5eq.)、对二甲基氨基吡啶(1.6mg,0.013mmol,0.5eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,30μL)在二氯甲烷(1mL)中的溶液在室温下搅拌16小时。向该反应溶液缓慢地添加哌啶(60μL,0.7mmol,28eq.)，并将溶液在室温下搅拌15分钟。添加冰冷水(10mL)，并将有机溶剂通过减压蒸发而去除。将沉淀物通过过滤而收集，用水清洗，然后减压蒸发以得到#B65。收率26.2mg,(推定定量)HPLC(方案N):保留时间＝13.1分钟(纯度45％).LCMS(方案M):m/z688.5[M+H]+。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B66)。将#B65(26.1mg,约45％纯度,0.017mmol,1.0eq.)、碳酸钾(51mg,0.41mmol,24eq.)在甲醇(1.5mL)中的溶液在室温下搅拌1小时。将反应混合物过滤，并使滤液在乙酸乙酯与水(每一相为10mL)之间分配。将有机层经无水硫酸镁干燥并减压蒸发至干燥，其随后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色粉末状的#B66。收率：7.3mg,(44％，基于步骤1-3)。HPLC(方案N):保留时间＝11.44分钟(纯度96.7％)。LCMS(方案M):m/z 646.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)
Figure BDA0000751870110001441
7.83(t,J＝5.6,1H,D2O可互换的),7.79(d,J＝8.0,1H,D2O可互换的),6.28(br d,J＝16.1,1H),6.22(ddq,J＝1.4,6.8,6.8,1H),6.08(dd,J＝1.4,11.8,1H),5.88(dd,J＝11.7,7.4,1H),5.59(dd,J＝15.7,5.3,1H),5.51(br dd,J＝7.0,7.0,1H),5.02(d,J＝5.3,D2O可互换的),4.27(dd,J＝5.0,5.0,1H),4.23(m,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.49(ddd,J＝7.0,7.0,2.6,1H),3.30(m,4H),3.24(dd,J＝5.0,5.0,1H),3.01(m,1H),2.96(m,1H),2.75(d,J＝5.2,1H),2.58(d,J＝5.2,1H),2.51(m,1H),2.29(m,1H),2.22(m,1H),2.20(dd,J＝14.0,4.8,1H),1.82(dd,J＝13.3,8.2,1H),1.79(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.51(m,2H),1.49(dd,13.3,5.0,1H),1.42(m,4H),1.38(dq,J＝7.5,7.5,2H),1.25(d,J＝6.5,3H),1.07(d,J＝6.4,3H),0.95(d,J＝7.4,3H),0.82(t,J＝7.5,3H)。
实施例A27
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B67)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B67)
Figure BDA0000751870110001451
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B67)。将#B60(实施例A23,23.0mg,96.7％纯度,0.038mmol,1.0eq.)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC,13.1mg,0.06mmol,1.7eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)中的混合物在室温下搅拌20分钟。向该溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(34.5mg,0.3mmol,7.7eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2ml)中。将所得的溶液在室温下搅拌16小时。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色固体状的#B67。收率：9.4mg,39％。HPLC(方案N):保留时间＝11.04分钟(纯度100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz).7.78(d,J＝8.0,1H,D2O可互换的),6.35(br d,J＝16.1,1H),6.22(dq,J＝7.0,7.0,1H),6.08(d,J＝11.7,1H),5.89(dd,J＝11.7,7.4,1H),5.60(dd,J＝16.0,5.1,1H),5.52(br dd,J＝7.0,7.0,1H),5.08(d,J＝6.2,D2O可互换的),4.29(m,2H),3.65(m,2H),3.49(br dd,J＝7.0,7.0,1H),3.29(m,5H),3.00(d,J＝6.6,2H),2.80(s,4H),2.79(d,J＝5.2,1H),2.60(d,J＝5.2,1H),2.28(m,1H),2.21(m,1H),1.95(dd,J＝13.2,8.6,1H),1.81(m,2H),1.69(s,3H),1.64(m,1H),1.58(dq,J＝13.2,3.1,1H),1.52(m,2H),1.43(m,4H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.2,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例A28
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基2-甲基丙酸酯(#B71)
Figure BDA0000751870110001461
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(1-乙氧基乙氧基)-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B68)。将#B63(实施例A24,35.0mg,92％纯度,0.06mmol,1.0eq.)、对甲苯磺酸吡啶鎓(PPTS,7.1mg,0.028mmol,0.4eq.)和乙基乙烯基醚(0.5mL,8.6mmol,大量过量)在无水二氯甲烷(1.0mL)中的溶液在室温下搅拌2小时。将反应混合物在二氯甲烷(10mL)/水(10mL)之间分配。将有机层经无水硫酸镁干燥，然后减压蒸发以得到#B68。收率：36.1mg。HPLC(方案N):保留时间＝12.33分钟(纯度90％)。LCMS(方案M):m/z 577.6[M+H-CHCH3OCH2CH3]+。
步骤2.合成(2Z,4S)-N-{(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(1-乙氧基乙氧基)-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B69)。将#B68(36.1mg,0.05mmol,1.0eq.)、碳酸钾(50mg,0.4mmol,8eq.)在甲醇(1.0mL)中的悬浮液在室温下搅拌1小时。然后，将反应混合物过滤并减压蒸发至干燥以得到#B69。收率：33.4mg。HPLC(方案N):保留时间＝10.458和10.459分钟(纯度87.6％)。LCMS(方案M):m/z 535.5[M+H-CHCH3OCH2CH3]+。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-(1-乙氧基乙氧基)-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基2-甲基丙酸酯(#B70)。将#B69(33.0mg,0.049mmol,1.0eq.)和异丁酸酐(100μL,0.75mmol,15eq.)在吡啶(500μL)中的溶液在35℃搅拌24小时。然后，将反应混合物减压蒸发以得到#B70。收率：37.3mg。HPLC(方案N):保留时间＝14.06(纯度88.3％)。LCMS(方案M):m/z 605.6[M+H-CHCH3OCH2CH3]+。
步骤4.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基2-甲基丙酸酯(#B71)。将#B70(17.8mg,0.023mmol,1.0eq.)、对甲苯磺酸吡啶鎓(60mg,0.24mmol,10eq.)在无水甲醇(2.0ml)中的溶液在室温下搅拌60分钟。然后，使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B71。收率：8mg,(50％，基于步骤1-4)。HPLC(方案N):保留时间＝11.50分钟(纯度100％)。HRESIMS(方案O)m/z 605.3798(M+H)+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)
Figure BDA0000751870110001471
7.83(t,J＝6.0,1H,D2O可互换的),7.81(d,J＝8.1,1H,D2O可互换的),6.35(ddq,J＝1.3,6.5,6.5,1H),6.28(br d,J＝15.9,1H),6.12(dd,J＝1.3,11.7,1H),5.86(dd,J＝11.7,7.5,1H),5.59(dd,J＝15.9,5.4,1H),5.51(br dd,J＝7.1,7.1,1H),5.02(d,J＝5.4,D2O可互换的),4.26(dd,J＝5.0,5.0,1H),4.24(m,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.49(ddd,J＝7.0,7.0,2.6,1H),3.24(dd,J＝5.0,5.0,1H),3.01(m,1H),2.96(m,1H),2.75(d,J＝5.2,1H),2.58(d,J＝5.2,1H),2.52(m,1H),2.48(sept,J＝6.5,1H),2.29(ddd,J＝15.5,7.1,7.1,1H),2.21(m,1H),2.20(dd,J＝14.0,4.8,1H),1.83(dd,J＝13.4,5.0,1H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.48(dd,12.7,3.9,1H),1.38(dq,J＝7.5,7.5,2H),1.25(d,J＝6.6,3H),1.07(d,J＝6.8,9H),0.95(d,J＝7.5,3H),0.82(t,J＝7.5,3H)。
实施例A29
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(哌啶-1-基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B72)
Figure BDA0000751870110001481
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(哌啶-1-基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B72)。将#NP1(163.0mg,92％纯度,0.27mmol,1.0eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT,160.0mg,1mmol,4eq.)和1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(EDC,195.0mg,1mol,4eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(4.0mL)中的混合物在0℃搅拌30分钟。在0℃下，随后向该溶液添加三乙胺(50μL)和哌啶(180μL,2.1mmol,7.5eq.)。将所得的反应混合物在室温下搅拌3小时，并在0℃搅拌16小时。然后将反应混合物在乙酸乙酯(2×20mL)和水(20mL)之间分配。将合并的有机层用水(2×10mL)清洗，经无水硫酸镁干燥，然后减压蒸发以得到灰白色玻璃状的#B72(223.5mg,79.5％纯度)。使用逆相色谱法(方法B*)纯化该物质的一部分(33.1mg)以得到白色粉末状的#B72。收率：27.4mg,100％HPLC(方案N):保留时间＝10.58分钟(纯度98％)。LCMS(方案M):m/z 603.7[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.31(br d,J＝16.0,1H),6.11(d,J＝11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.8,1H),5.60(dd,J＝16.0,5.5,1H),5.52(br dd,J＝7.0,7.0,1H),4.98(d,J＝5.8,1H,D2O可互换的),4.25(m,2H),3.65(m,2H),3.49(br dd,J＝6.2,6.2,1H),3.40(m,4H),3.25(dd,5.8,5.1,1H),3.08(br s,4H),2.76(d,J＝5.1,1H),2.68(dd,J＝15.2,7.0,1H),2.58(d,J＝5.1,1H),2.50(m,1H),2.29(m,1H),2.20(m,1H),1.98(s,3H),1.86(m,1H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.56(m,3H),1.48(m,2H),1.40(m,2H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.2,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例A30
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(反式-3-氨基环丁基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B73)
Figure BDA0000751870110001491
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(反式-3-氨基环丁基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B73)。将#NP1(50.2mg,94％纯,0.09mmol,1.0eq)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT,65.5mg,0.43mmol,4.7eq.)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(EDC,70mg,0.37mmol,4eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中的混合物在0℃搅拌30分钟。随后，在0℃下，向该溶液添加含反式-1,3-二氨基环丁烷(112mg,1.3mmol,14eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)和三乙胺(200μL)。将所得的反应混合物在室温下搅拌15分钟。将反应混合物用乙酸中和，过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到无色玻璃状的#B73。收率：64.3mg,100％。HPLC(方案N):保留时间＝6.66分钟(纯度85.2％)。LCMS(方案M):m/z 604.6[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ8.26(d,J＝7.0,1H,D2O可互换的),7.80(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.28(br d,J＝16.0,1H),6.11(d,J＝11.3,1H),5.88(dd,J＝11.7,7.8,1H),5.60(dd,J＝16.0,5.8,1H),5.49(br dd,J＝6.6,6.6,1H),5.04(m,1H,D2O可互换的),4.37(m,1H),4.27-4.21(m,2H),3.65(m,3H),3.50(br dd,J＝5.5,5.5,1H),3.26(d,J＝4.3,1H),2.76(d,J＝4.7,1H),2.58(d,J＝4.7,1H),2.48(m,1H),2.29(m,1H),2.22-2.11(m,6H),1.98(s,3H),1.82(m,1H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.49(dd,J＝12.5,2.7,1H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.0,3H),0.95(d,J＝7.4,3H)。
实施例A31
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({反式-3-[(碘乙酰基)氨基]环丁基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B74)
Figure BDA0000751870110001501
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({反式-3-[(碘乙酰基)氨基]环丁基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B74)。将碘乙酸(38.6mg,0.21mmol,5.9eq.)和N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC,64.2mg,0.31mmol,9eq.)在无水N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的溶液在室温下搅拌10分钟。将所得的浅黄色溶液缓慢地添加至含#B73(实施例A30,27.1mg,0.035mmol,1.0eq)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)，然后在室温下搅拌15分钟。使用逆相色谱法(方法B*)纯化产物以得到白色粉末状的#B74。收率：14.2mg,41％。HPLC(方案N):保留时间＝9.61分钟(纯度100％)。LCMS(方案M)；m/z 772.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ8.60(d,J＝7.0,D2O可互换的),8.28(d,J＝7.0,1H,D2O可互换的),7.80(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.29(br d,J＝16.0,1H),6.11(d,J＝11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.8,1H),5.60(dd,J＝16.0,5.8,1H),5.49(br dd,J＝7.0,7.0,1H),5.01(d,J＝5.4,1H,D2O可互换的),4.27-4.23(m,3H),4.19(m,1H),3.65(m,2H),3.59(s,2H),3.49(brdd,J＝6.0,6.0,1H),3.26(dd,J＝5.1,5.1,1H),2.76(d,J＝5.1,1H),2.58(d,J＝5.1,1H),2.53(m,1H),2.32(m,1H),2.22-2.11(m,6H),1.98(s,3H),1.82(m,1H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.52(dd,J＝14.8,2.7,1H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.0,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例A32
制备N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[({[反式-3-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环丁基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B75).
Figure BDA0000751870110001511
步骤1.合成N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[({[反式-3-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环丁基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B75)。向N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-{4-[({[(4-硝基苄基)氧基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-鸟氨酰胺(MalCValCitPABA-PNP,Eur.Pat.Appl.(1994),EP624377,23.1mg,0.03mmol,1.3eq.)和#B73(15.5mg,85％纯度,0.022mmol,1.0eq.)在无水N,N-二甲基甲酰胺(0.6ml)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱,30μL)。将所得的混合物在室温下搅拌1小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B75。收率：12.6mg,28％。HPLC(方案N):保留时间＝9.3分钟(纯度91％)。LCMS(方案M):m/z 1202.5[M+H]+。
实施例A33
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(反式-4-氨基环己基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B76)
Figure BDA0000751870110001521
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(反式-4-氨基环己基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B76)。将#NP1(40.2mg,92％纯度,0.07mmol,1.0eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT,62.5mg,0.4mmol,5.8eq.)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(EDC,72.2mg,0.38mmol,5eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中的溶液在0℃搅拌30分钟。随后，在0℃下，向该溶液添加含反式-1,4-二氨基环己烷(290.0mg,2.5mmol,30eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(1.5mL)和三乙胺(50μL)。然后，将所得的混合物在室温下搅拌0.5小时，并在0℃搅拌16小时。将反应混合物用乙酸中和，过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色粉末状的#B76。收率：48.2mg,100％。HPLC(方案N):保留时间＝7.16分钟(纯度87.5％)。LCMS(方案M):m/z 632.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.81(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),7.72(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.28(br d,J＝15.6,1H),6.11(d,J＝11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.8,1H),5.59(dd,J＝16.0,5.5,1H),5.49(br dd,J＝6.6,6.6,1H),5.02(m,1H,D2O可互换的),4.26(m,1H),4.22(m,H),3.65(m,2H),3.49(br dd,J＝6.2,6.2,1H),3.45-3.32(m,2H),3.26(d,J＝3.9,1H),2.75(d,J＝5.1,1H),2.58(d,J＝5.1,1H),2.46(m,1H),2.29(m,1H),2.22(m,1H),2.16(dd,J＝14.0,4.7,1H),1.98(s,3H),1.83(m,1H),1.81(m,2H),1.79-1.72(m,4H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.46(dd,J＝12.5,3.0,1H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.16-1.10(m,4H),1.07(d,J＝6.0,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例A34
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(5-氨基戊基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B77)
Figure BDA0000751870110001531
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(5-氨基戊基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B77)。将#NP1(30.5mg,92％pure,0.056mmol,1.0eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(HOBT,38.0mg,0.24mmol,4.4eq.)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(EDC,54.0mg,0.28mmol,5eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(3.0mL)中的溶液在0℃搅拌30分钟。随后，在0℃下，向该溶液添加三乙胺(50μL)和1,5-戊二胺(50μL,0.5mmol,9eq.)。将所得的混合物在室温下搅拌1小时。将反应混合物用乙酸中和，过滤，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化。将保留时间为22.0分钟的峰收集，用NH4OH中和，并冻干以得到白色固体状的#B77。收率23.1mg,68％收率。HPLC(方案N):保留时间＝7.67分钟(纯度91％)。LCMS(方案M):m/z 620.6[M+H]+。
实施例A35
制备N-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基丙氨酸(#B79)
Figure BDA0000751870110001541
步骤1.合成N-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基丙氨酸(#B78)。将#NP2(118.3mg,94.0％纯度,0.2mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,31.7mg,0.083mmol,0.4eq.)和N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱,10μL)在N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的混合物在环境温度下搅拌30分钟。随后，向该溶液添加含三乙胺(100μL)和2-甲基丙氨酸(32.5mg,0.3mmol,1.3eq.)的1:1吡啶/二甲亚砜(1.0mL)。将所得的悬浮液在环境温度下搅拌2.0小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B78。收率：54.3mg,45％收率。HPLC(方案N):保留时间＝11.29分钟(纯度94.1％)。LCMS(方案M)；m/z 605.6[M+H]+。
步骤2.合成N-{[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基丙氨酸(#B79)。将#B78(6.6mg,0.011mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,6.0mg,0.016mmol,1.5eq.)和N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱,3.0μL)在N,N-二甲基甲酰胺(200μL)中的溶液在环境温度下搅拌30分钟。向该溶液添加丙胺(3.6μL,0.06mmol,5eq.)，并将所得的溶液搅拌1小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B79。收率：4.9mg,70％收率。HPLC(方案N):保留时间＝12.31分钟(纯度100％)。LCMS(方案M):m/z 646.7[M+H]+；668.7[M+Na]+。
实施例A36
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-(2-{[2-甲基-1-氧代-1-(丙基氨基)丙-2-基]氨基}-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B81)
Figure BDA0000751870110001551
步骤1.合成N-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基丙氨酸(#B80)。将#NP1(122.4mg,92.0％纯度,0.22mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,33.2mg,0.087mmol,0.4eq.)和N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱,10μL)在N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的混合物在环境温度下搅拌30分钟。随后，向该溶液添加含三乙胺(100μL)和2-甲基丙氨酸(36.4mg,0.35mmol,1.2eq.)的1:1吡啶/二甲亚砜(1.0mL)。将所得的悬浮液在环境温度下搅拌2.0小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B80。收率：52.7mg,42％收率。HPLC(方案N):保留时间＝9.28分钟(纯度90％)。LCMS(方案M):m/z 621.6[M+H]+。
步骤2.制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-(2-{[2-甲基-1-氧代-1-(丙基氨基)丙-2-基]氨基}-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B81)。将#B80(6.0mg,90％纯度,0.01mmol,1.0eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,5.1mg,0.013mmol,1.3eq.)和N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱,3.0μL)在N,N-二甲基甲酰胺(200μL)中的溶液在环境温度下搅拌30分钟。向该溶液添加丙胺(3.6μL,0.06mmol,6eq.)，并将所得的溶液搅拌1小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B81。收率：4.7mg,87％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.95分钟(纯度99％)。LCMS(方案M):m/z 662.7[M+H]+。
实施例A37
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[({4-[(N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}甘氨酰基)氨基]苄基}氧基)羰基]氨基}苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B123)
Figure BDA0000751870110001561
步骤1:合成9H-芴-9-基甲基{2-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨基]-2-氧代乙基}氨基甲酸酯(#B118)：在0℃下，向Fmoc-甘氨酸(16g,54mmol,1.0eq.)在干燥DMF(160mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(14g,108mmol,2.0eq)和N,N,N′,N′-四甲基-O-(苯并三唑-1-基)脲鎓四氟硼酸盐(16g,54mmol,1.0eq)。将混合物在0℃搅拌30分钟，并添加[4-(甘氨酰基氨基)苄基]氨基甲酸叔丁酯(12g,54mmol,1.0eq.)在干燥DMF(50mL)中的溶液。将混合物在室温下搅拌过夜，倾倒入冰水(400mL)并用EtOAc(400mL×2)萃取。将有机层用盐水(200mL×2)清洗，经Na2SO4干燥，并真空浓缩。将残留物从EtOAc(200mL)何石油醚(400mL)再结晶以得到白色固体状的#B118(18g,66.6％)。1H NMR(400Hz,DMSO-d6):δ9.93(s,1H),7.91(d,2H),7.75(d,2H),7.61(m,1H),7.52(d,2H),7.43(m,2H),7.36(m,3H),7.18(d,3H),4.32(d,2H),4.26(m,1H),4.07(d,2H),3.80(d,2H),1.39(s,9H)
步骤2:合成[4-(甘氨酰基氨基)苄基]氨基甲酸叔丁酯(#B119)：在室温下，向#B118(7.0g,14.0mmol,1.0eq)在DMF(70mL)中的溶液添加哌啶(4.7mL,47.5mmol,3.4eq.)。将混合物在室温下搅拌30分钟，真空蒸发。将残留物用石油醚(100mL×2)清洗并从EtOAc(50mL)和石油醚(200mL)再结晶以得到白色固体状的#B119(3.3g,84.6％)。1H NMR(400Hz,CDCl3):δ9.37(s,1H),7.57(d,2H),7.25(d,2H),4.80(br,1H),4.27(d,2H),3.47(s,2H),1.45(s,9H)
步骤3:合成9H-芴-9-基甲基[6-({2-[(4-{[(叔丁氧羰基)氨基]甲基}苯基)氨基]-2-氧代乙基}氨基)-6-氧代己基]氨基甲酸酯(#B120)：在0℃下，向6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酸(2.66g,7.53mmol,1.0eq.)在干燥DCM(50mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(1.93g,15.1mmol,2.0eq)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,2.86g,7.53mmol,1.0eq.)。将混合物在0℃搅拌30分钟并一次添加#B119(2.1g,7.53mmol,1.0eq.)。将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物过滤，并且将固体用DCM清洗并真空干燥以得到白色固体状的#B120(4g,86.4％)。1H NMR(400Hz,DMSO-d6):δ9.91(s,1H),8.11(br,1H),7.90(d,2H),7.69(d,2H),7.51(d,2H),7.41(m,2H),7.33(m,3H),7.17(d,2H),4.28(m,3H),4.06(d,2H),3.86(br,2H),2.97(m,2H),2.15(m,2H),1.51(m,2H),1.38(m,12H)；LCMS(方案I):m/z 637.1(M+Na]+,保留时间＝1.18分钟。
步骤4:合成9H-芴-9-基甲基{6-[(2-{[4-(氨基甲基)苯基]氨基}-2-氧代乙基)氨基]-6-氧代己基}氨基甲酸酯三氟乙酸盐(#B121)：在0℃下，向#B120(1g,1.63mmol,1.0eq)在干燥DCM(20mL)中的悬浮液添加三氟乙酸(6mL,大量过量)。将混合物在室温下搅拌2小时，并真空浓缩。将残留物悬浮在水(30mL)中并冻干以得到浅黄色固体状的#B121(1.2g,100％)。1H NMR(400Hz,DMSO-d6):δ10.08(s,1H),8.15(br,4H),7.90(d,2H),7.69(d,2H),7.63(d,2H),7.41(m,8H),4.30(m,3H),3.98(m,3H),3.87(d,2H),2.97(m,2H),2.17(m,2H),1.51(m,2H),1.40(m,2H),1.26(m,2H):LCMS(方案I):m/z 537.1(M+Na]+,保留时间＝1.10分钟。
步骤5:合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)甘氨酰基]氨基}苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B122)：向#B121(32.7mg,0.044mmol,1eq.)在四氢呋喃(1.0mL)和甲醇(0.1mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(26.0mg,0.2mmol,4.5eq.)。将全部反应混合物添加至#B1(28mg,0.044mmol,1eq.)在四氢呋喃(1.0mL)中的冷却(0℃)溶液，并使反应升温至室温。在1小时之后，将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(Method A)纯化残留物以得到#B122(12.4mg,0.011mmol,27％):LCMS(方案D):m/z 1032.6[M+H]+,保留时间＝0.92分钟。
步骤6:合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-{[({4-[(N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}甘氨酰基)氨基]苄基}氧基)羰基]氨基}苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B123)：向#B122(12.4mg,0.012mmol,1eq.)在二甲基甲酰胺中的溶液(0.7mL,0.01M)添加哌啶(11uL储备溶液[通过将100uL哌啶溶解在1ml DMF而制成],0.013mmol,1.1eq.)。将反应搅拌16小时，然后滴加溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(2.8mg,0.012mmol,1eq.)在四氢呋喃(0.5mL)中的溶液。将反应搅拌16小时，真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以得到固体状的#B123。收率：2.5mg,0.027mmol,22％。LCMS(方案D):m/z 932.2[M+H]+保留时间＝0.76分钟。
实施例A38
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-胍基(carbamimidamido)-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B124)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(N'-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}胍基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B125)
Figure BDA0000751870110001591
步骤1:合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-胍基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B124)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(N'-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}胍基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B125)：在0℃下，向#NP1(135mg,约60％纯度,约0.15mmol)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,72mg,0.19mmol,1.2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(DMF,1.0mL)中的混合物添加N,N’-二异丙基乙胺(30uL,#eq)。在环境温度下搅拌10分钟之后，将混合物转移至盐酸胍(400mg,4.1mmol,28eq.)和N,N’-二异丙基乙胺(100uL)在1:1二甲亚砜(methylsulfoxide)/水(3.0mL)的溶液中。将所得的溶液搅拌20分钟，并使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色粉末状的(#B124)和(#B125)。
#B124：收率：55.6mg,38％收率HPLC(方案N):保留时间＝8.01分钟(纯度87％)。LCMS(方案M):m/z 577.44[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝7.9,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.27(br d,J＝16.0,1H),6.11(d,J＝11.3,1H),5.87(dd,J＝11.3,7.4,1H),5.60(dd,J＝15.6,5.5,1H),5.51(br dd,J＝7.4,7.4,1H),4.93(d,J＝5.8,1H,D2O可互换的),4.29(m,1H),4.22(m,1H),3.65(m,2H),3.50(br dd,J＝6.0,6.0,1H),3.22(dd,J＝4.7,4.7,1H),2.73(d,J＝5.1,1H),2.56(d,J＝5.1,1H),2.46(m,1H),2.32(m,2H),2.20(m,1H),1.98(s,3H),1.82(m,1H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.52(dd,J＝13.2,3.5,1H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.0,3H),0.95(d,J＝7.4,3H)。
#B125:收率：49.0mg,36％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.14分钟(纯度90％)。LCMS(方案M):m/z 1094.76[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.78(d,J＝7.9,2H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,2H),6.27(br d,J＝16.0,2H),6.11(d,J＝11.7,2H),5.87(dd,J＝11.7,7.8,2H),5.60(dd,J＝16.0,5.0,2H),5.49(br dd,J＝6.7,6.7,2H),5.01(br s,2H,D2O可互换的),4.32(m,2H),4.25(m,2H),3.65(m,4H),3.49(brdd,J＝6.6,6.6,2H),3.28(d,J＝4.3,2H),2.76(d,J＝4.7,2H),2.59(d,J＝4.7,2H),2.54(m,2H),2.30(m,2H),2.28(m,2H),2.21(m,2H),1.98(s,6H),1.83(m,2H),1.80(m,4H),1.69(s,6H),1.65(m,2H),1.52(br d,J＝12.8,2H),1.25(d,J＝6.2,6H),1.06(d,J＝6.2,6H),0.94(d,J＝7.0,6H)。
与本文所公开的那些类似的二聚化合物也包括在本发明的范围内，例如具有本申请通篇所述的取代的二聚化合物。
实施例A39
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[N'-(溴乙酰基)胍基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B126)
Figure BDA0000751870110001601
步骤1:合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[N'-(溴乙酰基)胍基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B126)：向#B124(24.0mg,0.042mmol,1.0eq.)和溴乙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(24.1mg,0.092mmol,2.0eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(1ml)中的溶液添加N,N’-二异丙基乙胺(10uL)。将所得的溶液在环境温度下搅拌30分钟，并使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色粉末状的#B126。收率：5.7mg,20％。HPLC(方案N):保留时间＝10.01分钟(纯度99％)。LCMS(方案M):m/z 697.35,699.35(1:1)[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ9.57(br s,1H,D2O可互换的),9.41(br s,1H,D2O可互换的),9.24(br s,1H,D2O可互换的),9.08(br s,1H,D2O可互换的),7.79(d,J＝7.5,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.26(brd,J＝16.0,1H),6.11(d,J＝11.7,1H),5.87(dd,J＝11.3,7.4,1H),5.60(m,1H),5.49(m,1H),4.35-4.28(m,2H),3.65(m,2H),3.50(br dd,J＝6.0,6.0,1H),3.41(s,2H),3.26(d,J＝4.7,1H),2.78(d,J＝4.3,1H),2.61(d,J＝4.3,1H),2.55(m,1H),2.32(m,2H),2.20(m,1H),1.98(s,3H),1.85(m,1H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.65(m,1H),1.53(dd,J＝13.2,3.5,1H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.2,3H),0.95(d,J＝6.6,3H)。
实施例A40
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[{2-[(碘乙酰基)(甲基)氨基]乙基}(甲基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B128)
Figure BDA0000751870110001611
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(甲基(2-(甲基氨基)乙基)氨基)]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯.(#B127)：向#B49(54.5mg,0.084mmol,1.0eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的溶液添加N,N'-二甲基-1,2-乙二胺(120uL,1.1mmol,12eq.)。将反应混合物在环境温度下搅拌5分钟，并使用逆相色谱法(方法B*)纯化产物以得到(#B127)收率：29.1mg,57％。HPLC(方案N):保留时间＝6.92分钟(纯度76％)。LCMS(方案M):m/z 606.3[M+H]+。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[{2-[(碘乙酰基)(甲基)氨基]乙基}(甲基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B128)：将碘乙酸(43.1mg,0.23mmol,4.8eq.)和N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC,64.10mg,0.3mmol,6.3eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2.0mL)中的溶液在环境温度下搅拌10分钟，然后转移至(#B127)(29.1mg,76.0％纯,0.048mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2ml)中的溶液中。将反应混合物搅拌20分钟，并通过逆相色谱法纯化以得到的白色粉末状的(#B128)。收率：12.2mg,54％。HPLC分析(方案N):保留时间＝9.57分钟(纯度95.2％)。LCMS(方案M):m/z 774.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝7.4,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.2,6.2,1H),6.33(br d,J＝15.5,1H),6.11(d,J＝11.3,1H),5.86(dd,J＝11.7,7.8,1H),5.60(dd,J＝16.0,4.7,1H),5.52(br dd,J＝6.6,6.6,1H),4.98(m,1H,D2O可互换的),4.26(m,2H),3.65(m,2H),3.51(br dd,J＝6.2,6.2,1H),3.46-3.35(m,6H),3.24(m,1H),3.02(s,1.5H),2.97(s,1.5H),2.95(s,1.5H),2.82(s,1.5H),2.76(m,1H),2.65(m,1H),2.59(m,1H),2.55(m,1H),2.30(m,1H),2.22(m,1H),1.98(s,3H),1.86(m,1H),1.80(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,1H),1.49(dd,J＝12.5,2.7,1H),1.25(d,J＝6.2,3H),1.07(d,J＝6.2,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例A41
制备(2Z)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-氧代戊-2-烯酰胺(#B129)
Figure BDA0000751870110001631
步骤1.合成(2Z)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-氧代戊-2-烯酰胺(#B129)：在0℃下，向#B39(60mg,0.13mmol,1eq.)在二氯甲烷(2mL)中的溶液添加戴斯-马丁氧化剂(Dess-Martin periodinane，119mg,0.27mmol,2eq.)，并移除冰浴。在35分钟之后，添加饱和碳酸氢钠和二氯甲烷，并将水层用二氯甲烷萃取。将合并的有机萃取物经硫酸钠干燥并过滤，并且将溶剂真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制物质以得到白色固体状的#B129。收率：19.04mg,0.04mmol,32％。LCMS(方案D):m/z 475.3[M+H]+,保留时间＝0.70分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J inHz)δd,J＝8.0Hz,1H),7.32(s,1H),6.77(s,1H),6.32(s,2H),6.27(d,J＝16.0Hz,1H),5.60(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),4.58-4.50(m,1H),4.35-4.26(m,1H),3.69-3.59(m,2H),3.54-3.48(m,1H),2.65-2.51(m,3H),2.36-2.15(m,6H),1.88-1.73(m,3H),1.72-1.60(m,6H),1.37(dd,J＝13.3和6.2Hz,1H),1.08(d,J＝6.6Hz,3H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A42
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基甲基[2-(甲硫基)乙基]氨基甲酸酯(#B130)
Figure BDA0000751870110001641
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B131)：在0℃下，向#B9(119mg,0.22mmol,1eq.)在二氯甲烷(3mL)中的溶液滴加2,6-二甲基吡啶(104μL,0.89mmol,4eq.)，然后滴加叔丁基-二甲基甲硅烷基-三氟甲磺酸酯(160μL,067mmol,3eq.)。在70分钟之后，将反应用饱和碳酸氢钠和二氯甲烷稀释，萃取，经溶剂蒸发管过滤，并将溶剂真空去除。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(5％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B131。收率：34mg,0.05mmol,23％。LCMS(方案C):m/z 671.3[M+Na]+,保留时间＝2.08分钟。
步骤2.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B132)：向#B131(32mg,0.049mmol,1eq.)在4:1四氢呋喃:水(1mL)中的溶液添加氢氧化锂(11.7mg,0.49mmol,10eq.)，并将混合物在室温下搅拌21小时。将反应真空浓缩，并将残留物溶解在乙酸乙酯和水中。将水层用乙酸乙酯(3×)萃取，并将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并真空浓缩。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法的纯化提供了白色固体状的#B132。收率：11.3mg,0.019mol,38％。LCMS(方案D):m/z 629.3[M+Na]+,保留时间＝0.98分钟。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基甲基[2-(甲硫基)乙基]氨基甲酸酯(#B133)：向#B132(63.2mg,0.104mmol,1eq.)在二氯甲烷(1.8mL)中的溶液添加三乙胺(73μL,0.520mmol,5eq)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(8.9mg,0.073mmol,0.7eq.)和双-(4-硝基苯基)-碳酸酯(106mg,0.343mmol,3.3eq.)，并将反应在室温下搅拌2.5小时。向该混合物的1/3添加N-甲基-2-(甲硫基)乙胺盐酸盐(24.6mg,0.174mmol,1.67eq.)，并将混合物在室温下搅拌1小时。将混合物用水稀释，用二氯甲烷萃取，经溶剂蒸发管过滤，用二甲亚砜(1mL)稀释，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)萃取残留物以提供#B133。收率：15.2mg,0.021mmol,20％。LCMS(方案C):m/z 760.76[M+Na]+,保留时间＝2.19分钟。
步骤4.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基甲基[2-(甲硫基)乙基]氨基甲酸酯(#B130)：向#B133(15.2mg,0.021mmol,1eq.)在冷却至0℃的四氢呋喃(0.4mL)中的溶液添加四丁基氟化铵(在四氢呋喃中为1M,53μL,0.053mmol,2.5eq.)，在10分钟之后，将反应升温至室温。在1.5小时之后，将反应真空浓缩，并通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以提供#B130。收率：8.5mg,0.014mmol,65％。LCMS(方案D):m/z 646.3[M+Na]+,保留时间＝0.79分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.77(d,J＝8.2Hz,1H),7.31(s,1H),6.77(s,1H),6.32(d,J＝16.0Hz,1H),6.26-6.18(m,1H),6.09(d,J＝11.5Hz,1H),5.89(dd,J＝11.5和7.0Hz,1H),5.60(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),5.00(d,J＝5.5Hz,1H),4.29-4.21(m,2H),3.69-3.61(m,2H),3.54-3.47(m,1H),3.42-3.33(m,2H),3.26-3.21(m,1H),2.89-2.78(m,3H),2.74(d,J＝5.1Hz,1H),2.64-2.56(m,3H),2.36-2.17(m,4H),2.07(s,3H),1.90-1.78(m,3H),1.72-1.61(m,4H),1.54-1.46(m,1H),1.26(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A43
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B134)
Figure BDA0000751870110001661
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B135)：使用实施例A42的步骤3中所述的操作，使用制备化合物#B133所述的操作，由63.2mg(0.104mmol,1.0eq)的#B132、三乙胺(73μL,0.520mmol,5eq)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(8.9mg,0.073mmol,0.7eq.)和双-(4-硝基苯基)-碳酸酯(106mg,0.343mmol,3.3eq.)以及哌啶(14.8mg,0.174mmol,1.7eq.)以18％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 740.5[M+Na]+,保留时间＝1.13分钟。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌啶-1-羧酸酯(#B134)：使用对化合物#B130所述的操作，由13.5mg(0.019mmol)的#B135和12.8mg(53μL的含1M的四氢呋喃,0.053mmol,2.5eq.)四丁基氯化铵以76％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z626.60[M+Na]+,保留时间＝0.81分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.77(d,J＝7.80Hz,1H),7.31(s,1H),6.77(s,1H),6.32(d,J＝15.6Hz,1H),6.26-6.17(m,1H),6.09(d,J＝11.7Hz,1H),5.89(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.60(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.54-5.47(m,1H),5.00(d,J＝5.5Hz,1H),4.29-4.20(m,2H),3.69-3.61(m,2H),3.54-3.47(m,1H),3.27-3.21(m,1H),2.75(d,J＝5.1Hz,1H),2.58(d,J＝5.1Hz,1H),2.36-2.16(m,4H),1.88-1.78(m,3H),1.73-1.61(m,4H),1.57-1.38(m,7H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A44
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌嗪-1-羧酸酯乙酸盐(#B136)
Figure BDA0000751870110001671
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基哌嗪-1-羧酸酯乙酸盐(#B136)：使用制备化合物#B133所述的操作，由37mg(0.078mmol)三乙胺(39.7mg,0.39mmol,5eq)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(6.7mg,0.055mmol,0.7eq.)、双-(4-硝基苯基)-碳酸酯(84.7mg,0.273mmol,3.5eq.)和哌嗪(16.8mg,0.195mmol,2.5eq.)以27％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA):保留时间＝6.318分钟(纯度95％)。LCMS(方案C):m/z 589.4[M+H]+保留时间＝0.97分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.77(d,J＝8.20Hz,1H),7.31(s,1H),6.77(s,1H),6.31-6.17(m,2H),6.09(d,J＝11.7Hz,1H),5.89(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.60(dd,J＝15.6和5.5Hz,1H),5.55-5.45(m,1H),4.57-4.50(m,1H),4.35-4.25(m,1H),3.69-3.60(m,2H),3.54-3.46(m,2H),2.65-2.53(m,4H)2.36-2.14(m,4H),1.88(s,3H),1.85-1.73(m,3H),1.72-1.61(m,5H),1.41-1.33(m,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A45
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基-4-甲基哌嗪-1-羧酸酯(#B137)
Figure BDA0000751870110001681
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基-4-甲基哌嗪-1-羧酸酯乙酸盐(#B137)：使用制备化合物#B133所述的操作，由37mg(0.078mmol)三乙胺(39.7mg,0.39mmol,5eq)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(6.7mg,0.055mmol,0.7eq.)、双-(4-硝基苯基)-碳酸酯(84.7mg,0.273mmol,3.5eq.)和1-Me-哌嗪(19.5mg,0.195mmol,2.5eq.)以27％的收率制备题述化合物。LCMS(方案C):m/z 603.4[M+H]+保留时间＝1.29分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)
Figure BDA0000751870110001682
7.77(d,J＝7.8Hz,1H),7.32(s,1H),6.77(s,1H),6.32-6.19(m,2H),6.10(d,J＝11.7Hz,1H),5.89(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.60(dd,J＝16.0和5.9Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),4.58-4.50(m,1H),4.35-4.26(m,1H),3.71-3.61(m,2H),3.55-3.47(m,2H),2.65-2.53(m,3H),2.36-2.14(m,8H),1.89(s,3H),1.85-1.74(m,3H),1.72-1.61(m,5H),1.42-1.33(m,1H),1.26(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A46
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-{[(1H-咪唑-1-基羰基)氨基]甲基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B138)以及(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(氨基甲基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺乙酸盐(#B139)以及(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(氨基甲基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B140)
Figure BDA0000751870110001691
步骤1a.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-{[(1H-咪唑-1-基羰基)氨基]甲基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B138)：在室温下，向#B22(15.9mg,0.030mmol,1eq.)在乙腈(0.6mL)中的溶液添加羰基二咪唑(7.4mg,0.045mmol,1.5eq.)，并使反应搅拌10分钟。然后将反应加热至60℃，持续5.5小时，并冷却至室温。添加水和二氯甲烷，并将水层萃取。将合并的有机萃取物经硫酸钠干燥并过滤，并且将溶剂真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B138。收率：3.4mg,0.0059mmol,20％。LCMS(方案C):m/z 585.4[M+H]+,保留时间＝1.40分钟。HPLC(方案AA)保留时间＝7.426分钟(纯度83％)。
步骤1b.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(氨基甲基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺乙酸盐(#B139)：在室温下，向#B22(35.2mg,0.066mmol,1eq.)在乙腈(2.2mL)中的溶液添加羰基二咪唑(16.2mg,0.099mmol,1.5eq.)，并使反应搅拌30分钟。然后，将反应加热至60℃，持续5小时。将反应冷却至室温，添加至乙腈(33mL)、水(17mL)和1N NaOH(17mL)的溶液中，并在室温下搅拌15分钟。将反应用水稀释，并将乙腈真空去除。将水溶液用二氯甲烷萃取，用乙酸(0.5mL)中和，并真空浓缩。将残留物溶解在乙腈中，经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B139。收率：7.7mg,0.015mmol,23％。LCMS(方案C):m/z 449.3[M+H]+,保留时间＝0.93分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.76(d,J＝8.2Hz,1H),6.26(d,J＝15.6Hz,1H),5.97(d,J＝11.7Hz,1H),5.86(dd,J＝11.7和7.0Hz,1H),5.67(dd,J＝15.6和5.8Hz,1H),5.56-5.49(m,1H),5.21-5.13(m,1H),4.54-4.46(m,1H),3.79-3.71(m,1H),3.70-3.60(m,2H),3.54-3.46(m,1H),2.80(dd,J＝12.9和7.4Hz,1H),2.62(s,2H),2.58-2.53(m,1H),2.37-2.14(m,2H),1.89-1.56(m,11H),1.44(dd,J＝13.3和7.4Hz,1H),1.11(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤1c.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,5S,7S)-7-(氨基甲基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B140)：在室温下，向#B22(50.8mg,0.095mmol,1eq.)在乙腈(3.1mL)中的溶液添加羰基二咪唑(23.4mg,0.143mmol,1.5eq.)，并使反应搅拌30分钟。然后，将反应加热至65℃，持续4小时。将反应冷却至室温，添加至乙腈(83mL)、水(6mL)和1N NaOH(6mL)的溶液中，并在室温下搅拌35分钟。将反应用乙酸(0.35mL)中和，并真空浓缩。将残留物溶解在乙腈中，经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到#B140收率：15mg,0.030mmol,32％。LCMS(方案C):m/z 491.3[M+H]+,保留时间＝1.13分钟。HPLC(方案AA)保留时间＝6.969分钟(纯度87％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.78(d,J＝7.8Hz,1H),6.42-6.30(m,1H),6.26(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.4Hz,1H),5.67(dd,J＝16.0和5.8Hz,1H),5.56-5.49(m,1H),4.54-4.46(m,1H),3.81-3.73(m,1H),3.69-3.61(m,2H),3.54-3.46(m,1H),2.80(dd,J＝12.9和7.4Hz,1H),2.63(s,2H),2.58-2.53(m,1H),2.37-2.14(m,2H),1.98(s,3H),1.84-1.56(m,8H),1.44(dd,J＝13.3和7.4Hz,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),0.96(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A47
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[(反式-4-羟基环己基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B141)以及(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[(顺式-3-羟基环丁基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B142)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(2-甲基肼基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B143)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(1-甲基肼基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B144)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(1,2-二甲基肼基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B145)
Figure BDA0000751870110001711
步骤1a.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[(反式-4-羟基环己基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B141)：向#B1(19.7mg,0.031mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃(0.5mL)中的溶液添加反式-4-氨基环己醇(5.7mg,0.049mmol,1.6eq.)。在搅拌1.5小时之后，将反应用水稀释，用二氯甲烷萃取，并将合并的有机物经硫酸钠干燥并过滤。将溶剂真空除去。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B141。收率：11.8mg,0.019mmol,60％。HPLC(方案AA)保留时间＝7.408分钟(纯度94％)。LCMS(方案D):m/z 633.3[M+H]+,保留时间＝0.73分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)
Figure BDA0000751870110001721
7.79(d,J＝8.2Hz,1H),7.68(d,J＝7.8Hz,1H),6.42-6.32(m,1H),6.28(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.4Hz,1H),5.59(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.54-5.45(m,1H),5.00(d,J＝5.1Hz,1H),4.49(d,J＝4.3Hz,1H),4.30-4.15(m,2H),3.70-3.60(m,2H),3.54-3.39(m,2H),3.26-3.20(m,1H),2.74(d,J＝5.1Hz,1H),2.58(d,J＝5.1Hz,1H),2.37-2.10(m,3H),1.98(s,3H),1.89-1.59(m,10H),1.51-1.41(m,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.20-1.10(m,4H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤1b.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{2-[(顺式-3-羟基环丁基)氨基]-2-氧代乙基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B142)：在室温下，向#B1(16.2mg,0.026mmol,1eq.)在四氢呋喃/N,N-二甲基甲酰胺(5:1,0.6mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(13.7μL,0.078mmol,3eq.)和反式-3-氨基环丁醇盐酸盐(4.8mg,0.039mmol,1.5eq.)(12:48pm)，并将反应搅拌2小时。添加额外的N,N-二甲基甲酰胺(100uL)、N,N-二异丙基乙胺(13uL,0.078mmol,3eq.)和反式-3-氨基环丁醇盐酸盐(3mg,0.024mmol,0.9eq.)，并将反应搅拌另外30分钟。将反应用二甲亚砜稀释并真空浓缩以去除四氢呋喃。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B142。收率：9.5mg,0.016mmol,61％。HPLC(方案AA)保留时间＝7.057分钟(纯度91％)。LCMS(方案D):m/z 627.1[M+Na]+,保留时间＝0.72分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.03(d,J＝7.8Hz,1H),7.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.42-6.32(m,1H),6.28(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.59(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.55-5.48(m,1H),5.07-4.97(m,2H),4.30-4.17(m,2H),3.81-3.71(m,1H),3.70-3.59(m,3H),3.54-3.46(m,1H),3.27-3.20(m,1H),2.75(d,J＝4.9Hz,1H),2.58(d,J＝4.9Hz,1H),2.48-2.39(m,2H),2.36-2.13(m,3H),1.98(s,3H),1.89-1.61(m,9H),1.49-1.41(m,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
步骤1c.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(2-甲基肼基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B143)以及(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-(1-甲基肼基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B144)：在室温下，向#B1(32.4mg,0.051mmol,1eq.)在四氢呋喃/N,N-二甲基甲酰胺(2:1,0.75mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(71.8μL,0.408mmol,8eq.)和N-甲基肼硫酸盐(22.1mg,0.15mmol,3eq.)，并将反应搅拌20分钟。添加额外的N,N-二甲基甲酰胺(250uL)。在另外30分钟之后，添加另外的N,N-二异丙基乙胺(35uL,0.20mmol,4eq.)和N-甲基肼硫酸盐(15mg,0.10mmol,2eq)，并将反应搅拌45分钟。将反应用水和乙酸乙酯稀释，并将水层萃取。将合并的有机层用盐水清洗，经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B143和#B144。
#B143收率：1.9mg,0.0034mmol,7％。LCMS(方案D):m/z 564.2[M+H]+,保留时间＝0.73分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.31(d,J＝5.9Hz,1H),7.81(d,J＝8.1Hz,1H),6.41-6.32(m,1H),6.29(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.6Hz,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.6Hz,1H),5.59(dd,J＝16.0和5.6Hz,1H),5.54-5.48(m,1H),5.04(d,J＝5.4Hz,1H),4.80-4.72(m,1H),4.29-4.20(m,2H),3.69-3.61(m,2H),3.53-3.46(m,1H),3.27-3.21(m,1H),2.75(d,J＝5.1Hz,1H),2.58(d,J＝5.1Hz,1H),2.45-2.13(m,7H),1.98(s,3H),1.89-1.74(m,3H),1.72-1.58(m,4H),1.53-1.45(m,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H)。
#B144收率：2.3mg,0.0040mmol,8％。LCMS(方案D):m/z 564.2[M+H]+,保留时间＝0.76分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.81(d,J＝7.8Hz,1H),6.41-6.27(m,2H),6.11(d,J＝11.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.3Hz,1H),5.60(dd,J＝16.1和5.9Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),4.94(d,J＝6.4Hz,1H),4.67(s,1H),4.32-4.20(m,2H),3.69-3.62(m,2H),3.53-3.47(m,1H),3.26-3.21(m,1H),3.06(dd,J＝154和7.3Hz,1H),2.98(s,2H),2.75(d,J＝4.9Hz,1H),2.62-2.53(m,2H),2.35-2.13(m,3H),1.98(s,3H),1.89-1.74(m,3H),1.72-1.58(m,5H),1.25(d,J＝6.4Hz,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H)。
步骤1d.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(1,2-二甲基肼基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B145)：在室温下，向#B1(29.7mg,0.047mmol,1eq.)在四氢呋喃/N,N-二甲基甲酰胺(1:1,1mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(116μL,0.658mmol,14eq.)，然后添加N,N’-二甲基肼二盐酸盐(31.3mg,0.235mmol,5eq.)，并将反应搅拌30分钟。将反应用水和乙酸乙酯稀释，并将水层萃取。将合并的有机层用盐水清洗，经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B145。收率：2.2mg,0.0038mmol,8％。LCMS(方案D):m/z 578.2[M+H]+,保留时间＝0.82分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.81(d,J＝8.1Hz,1H),6.41-6.27(m,2H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.6Hz,1H),5.60(dd,J＝15.9和5.4Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),4.94(d,J＝6.6Hz,1H),4.79(q,J＝5.7Hz,1H),4.32-4.19(m,2H),3.68-3.61(m,2H),3.53-3.47(m,1H),3.26-3.21(m,1H),3.01(d,J＝15.2和7.3Hz,1H),2.93(s,3H),2.76-2.73(m,1H),2.60-2.53(m,2H),2.44(d,J＝5.7Hz,3H),2.35-2.15(m,3H),1.98(s,3H),1.87-1.75(m,3H),1.72-1.56(m,5H),1.25(d,J＝6.4Hz,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A48
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-D-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B146).
Figure BDA0000751870110001751
步骤1.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-D-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B146)：在室温下，向#B47(10.4mg,0.009mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(6.3μL,0.036mmol,4eq.)，然后添加1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(4.2mg,0.017mmol,1.9eq.)，并搅拌15分钟，然后通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B146。收率：4.6mg,0.004mmol,43％。HPLC(方案AA):保留时间＝7.597分钟(纯度87％)。LCMS(方案C):m/z 1188.6[M+H]+保留时间＝1.37分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),9.68(s,1H),9.12(s,1H),8.26-8.18(m,1H),8.11-8.04(m,1H),7.84-7.74(m,2H),7.64-7.54(m,2H),7.34-7.21(m,2H),6.41-6.27(m,2H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),6.00-5.93(m,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.65-5.47(m,2H),5.40(s,2H),5.04(d,J＝5.5Hz,1H),5.02-4.96(m,2H),4.43-4.34(m,1H),4.30-4.16(m,3H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,2H),3.54-3.45(m,1H),3.26-3.20(m,1H),3.09-2.88(m,4H),2.77-2.73(m,1H),2.62-2.55(m,1H),2.36-2.07(m,5H),1.98(s,3H),1.84-1.76(m,1H),1.73-1.61(m,5H),1.54-1.33(m,5H),1.29-1.21(m,5H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H),0.84(dd,J＝11.3和6.6Hz,6H)。
实施例A49
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(氨基甲基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B147)
Figure BDA0000751870110001761
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(氨基甲基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B147)：在室温下，向#B14(40mg,0.073mmol,1eq.)在乙腈(2.3mL)中的溶液添加CDI(29.8mg,0.182mmol,2.5eq.)，并将反应搅拌40分钟。然后将反应加热至65℃，持续4小时。在冷却至室温之后，将反应混合物添加至乙腈(63mL)、水(4.5mL)和1N NaOH(4.5mL)的溶液中，并搅拌30分钟。添加乙酸(270uL)，并将混合物真空浓缩。将所获得的残留物溶解在乙腈中，经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B147。收率：5.1mg,0.0088mmol,12％。HPLC(方案AA)保留时间＝6.778分钟(纯度89％)。LCMS(方案C):m/z507.2[M+H]+,保留时间＝0.98分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.77(d,J＝7.4Hz,1H),6.41-6.24(m,2H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.65(dd,J＝16.0和6.2Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),5.00-4.91(m,1H),4.27-4.20(m,1H),3.78-3.60(m,3H),3.55-3.46(m,1H),3.22-3.18(m,1H),2.80-2.71(m,2H),2.62-2.53(m,2H),2.33-2.15(m,3H),1.98(s,3H),1.89-1.77(m,5H),1.73-1.61(m,4H),1.48-1.41(m,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A50
制备[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B148)
Figure BDA0000751870110001771
步骤1.合成[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B148)：在室温下，向#NP2(204mg,0.393mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(4.5mL)中的溶液添加碳酸钾(272mg,1.96mmol,5eq.)和碘甲烷(740μL,11.8mmol,30eq.)，并将反应搅拌1.5小时。将反应过滤，用水(3×)清洗，经硫酸钠干燥，过滤并真空浓缩。LCMS(方案D):m/z 534.42[M+H]+,保留时间＝0.89分钟。粗制物质在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤。
步骤2.合成[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B148)：在室温下，向来自实施例A50的步骤1的粗制物质在甲醇(3.5mL)中的溶液添加碳酸钾(136mg,0.056mmol,2.5eq.)，并将反应搅拌2小时。将反应用甲醇过滤，用二甲亚砜(2mL)稀释，并且真空浓缩。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至90％)洗脱的逆相中压液相色谱法的纯化提供了白色固体状的#B148。收率：91.6mg,0.18mmol,48％。LCMS(方案D):m/z 492.47[M+H]+,保留时间＝0.80分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d,J＝7.8Hz,1H),6.25(d,J＝16.0Hz,1H),5.97(d,J＝11.9Hz,1H),5.87(d,J＝11.9和7.0Hz,1H),5.65-5.48(m,2H),5.22-5.13(m,1H),5.10(d,J＝4.7Hz,1H),4.56-4.48(m,1H),4.36-4.25(m,1H),3.69-3.61(m,2H),3.60(s,3H),3.55-3.46(m,1H),2.74-2.56(m,4H),2.38-2.13(m,2H),1.90-1.60(m,9H),1.44(dd,J＝13.2和7.0Hz,1H),1.11(d,J＝6.2Hz,3H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A51
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基4-(甲硫基)丁酸酯(#B149)
Figure BDA0000751870110001781
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基4-(甲硫基)丁酸酯(#B149)：向#B148(12mg,0.024mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液添加4-(甲硫基)丁酸(32.2mg,0.24mmol,10eq.)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(2.9mg,0.023mmol,1eq.)和DIC(41.3μL,0.264mmol,11eq.)，并使反应搅拌1小时。将反应用二甲亚砜(0.8mL)稀释，并且真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到胶质的#B149。收率：9.7mg,0.016mmol,66％。LCMS(方案D):m/z 608.2[M+H]+,保留时间＝1.05分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝7.8Hz,1H),6.44-6.32(m,1H),6.25(d,J＝16.0Hz,1H),6.12(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.62-5.50(m,2H),4.57-4.48(m,1H),4.36-4.25(m,1H),3.70-3.62(m,2H),3.60(s,3H),3.55-3.47(m,1H),2.74-2.56(m,4H),2.48-2.43(m,2H),2.41-2.15(m,4H),2.02(s,3H),1.88-1.60(m,11H),1.44(dd,J＝12.9和6.6Hz,1H),1.26(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A52
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{[(溴乙酰基)氨基]甲基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B150)
Figure BDA0000751870110001791
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{[(溴乙酰基)氨基]甲基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B150)：在室温下，向#B147(7mg,0.01mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(8.5μL,0.048mmol,4eq.)和1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(4.2mg,0.018mmol,1.5eq.)，并将反应搅拌10分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B150。收率：2.9mg,0.005mmol,40％。LCMS(方案D):m/z 649.2[M+Na]+,保留时间＝0.81分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.42-8.32(m,1H),δ7.79(d,J＝7.8Hz,1H),6.44-6.32(m,1H),6.28(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.3Hz,1H),5.87(dd,J＝11.3和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.56-5.49(m,1H),5.02(d,J＝5.9Hz,1H),4.33-4.26(m,1H),3.95-3.83(m,3H),3.72-3.59(m,2H),3.55-3.45(m,1H),3.40-3.32(m,1H),3.28-3.14(m,2H),2.77(d,J＝5.1Hz,1H),2.61(d,J＝5.1Hz,1H),2.31-2.12(m,2H),1.98(s,3H),1.88-1.75(m,3H),1.73-1.61(m,4H),1.51-1.41(m,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A53
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B151)
Figure BDA0000751870110001801
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B152)：在室温下，向#B140(10.7mg,0.022mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺中的溶液添加2,6-二甲基吡啶(10.2μL,0.088mmol,4eq.)、N,N-二异丙基乙胺(15.5μL,0.088mmol,4eq.)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(2.7mg,0.022mmol,1eq.)和#B45(22.9mg,0.026mmol,1.2eq.)，并将反应搅拌40分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B152。收率：14.9mg,0.012mmol,55％。LCMS(方案C):m/z 1231.6[M+H]+,保留时间＝1.97分钟。
步骤2.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺,乙酸盐(#B153)：使用制备化合物#B47所述的操作，由14.9mg(0.012mmol,1.0eq)的#B152和20.4mg(0.24mmol,20.0eq)的哌啶以86％的收率制备题述化合物。LCMS(方案C):m/z 1009.83[M+H]+,保留时间＝1.35分钟。
步骤3.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B151)：使用制备化合物#B150所述的操作，由11mg(0.01mmol,1.0eq)的#B153和3.5mg(0.015mmol,1.5eq)1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮和5.2mg(0.04mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以70％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝8.413分钟(纯度87％)。LCMS(方案C):m/z1151.5[M+Na]+,保留时间＝1.61分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.96(s,1H),8.25-8.18(m1H),8.06(d,J＝7.4Hz,1H),7.83-7.74(m,2H),7.62-7.54(m,2H),7.31-7.20(m,3H),6.41-6.31(m,1H),6.25(d,J＝15.8Hz,1H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),6.00-5.92(m,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝15.8和5.9Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),5.39(s,2H),5.00-4.88(m,2H),4.59-4.49(m,1H),4.43-4.34(m,1H),4.24-4.15(m,2H),3.99-3.88(m,1H),3.81(s,2H),3.69-3.58(m,2H),3.53-3.36(m,2H),3.10-2.88(m,5H),2.63(s,2H),2.31-2.08(m,4H),2.02-1.92(m,4H),1.83-1.56(m,10H),1.55-1.29(m,7H),1.28-1.20(m,5H),1.05(d,J＝6.6Hz,3H),0.94(d,J＝7.4Hz,3H),0.85(dd,J＝11.3和6.6Hz,6H)。
实施例A54
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B154)
Figure BDA0000751870110001821
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B155)：使用制备#B152所述的操作，由13mg(0.023mmol)的#B147、9.9mg(0.092mmol,4eq.)的2,6-二甲基吡啶、12.0mg(0.092mmol,4eq.)的N,N-二异丙基乙胺、2.8mg(0.023mmol,1eq.)的4-N,N-二甲基氨基吡啶和24.6mg(0.028mmol,4eq)的#B45(22.9mg,0.026mmol,1.2eq.)以41％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1247.93[M+H]+,保留时间＝0.91分钟。
步骤2.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺,乙酸盐(#B156)：使用制备#B153中所述的操作，由11.9mg(0.01mmol,1.0eq)额##B155和17.0mg(0.2mmol,20.0eq)的哌啶以66％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝7.001分钟(纯度82％)。LCMS(方案D):m/z 1025.4[M+H]+,保留时间＝0.69分钟。
步骤3.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-(4-{[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]甲基}氨甲酰基)氧基]甲基}苯基)-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B154)：使用制备化合物#B150所述的操作，由6.1mg(0.006mmol,1.0eq.)的#B156、5.0mg(0.015mmol,7.0eq)的N,N-二异丙基乙胺和3.5mg(0.015mmol,1.5eq.)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以46％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝7.669分钟(纯度84％)。LCMS(方案D):m/z 1151.5[M+Na]+,保留时间＝0.79分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.27-8.19(m 1H),8.16-8.06(m,1H),7.89-7.73(m,2H),7.62-7.54(m,2H),7.31-7.20(m,3H),6.41-6.31(m,1H),6.27(d,J＝16.4Hz,1H),6.11(d,J＝10.9Hz,1H),6.05-5.94(m,1H),5.86(dd,J＝10.9和7.0Hz,1H),5.67-5.56(m,1H),5.55-5.47(m,1H),5.40(s,2H),5.02-4.88(m,3H),4.44-4.33(m,2H),4.30-4.23(m,1H),4.22-4.15(m,2H),3.96-3.84(m,1H),3.81(s,2H),3.69-3.58(m,2H),3.53-3.43(m,2H),3.10-2.89(m,5H),2.79-2.71(m,1H),2.61-2.56(m,1H),2.31-2.10(m,4H),2.04-1.91(m,4H),1.84-1.32(m,15H),1.30-1.18(m,4H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.94(d,J＝7.4Hz,3H),0.84(dd,J＝10.9和6.6Hz,6H)。
实施例A55
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-{1-[4-({5-[(溴乙酰基)氨基]戊基}氧基)苯基]亚乙基}肼基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B157)
Figure BDA0000751870110001841
步骤1.合成9H-芴-9-基甲基[5-(4-乙酰基苯氧基)戊基]氨基甲酸酯(#B158)：在0-10℃下，向(9H-芴-9-基)甲基5-羟基戊基氨基甲酸酯(5g,15.4mmol,1eq.)、1-(4-羟苯基)乙酮(2.1g,15.4mmol,1eq.)和三苯基膦(4.53g,16.9mmol,1.1eq.)在甲苯(50mL)中的溶液滴加DIAD(3.43g,16.9mmol,1.1eq.)。将溶液在室温下搅拌1小时，用乙酸乙酯稀释，并用饱和氯化铵水溶液和盐水清洗。将有机层经硫酸钠干燥，过滤，并真空浓缩。残留物通过用10:1至7:1的石油醚：乙酸乙酯洗脱的硅胶色谱法而纯化，并通过逆相色谱法进一步纯化以得到白色固体状的#B158(3.6g,53％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ7.93(d,2H),7.76(d,2H),7.59(d,2H),7.42(m,2H),7.33(m,2H),6.92(d,2H),4.79(m,1H),4.43(m,2H),4.23(m,1H),4.04(m,2H),3.25(m,2H),2.55(s,3H),1.84(m,2H),1.58-1.52(m,4H)。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-(1-{4-[(5-{[(9H-芴-9-l甲氧基)羰基]氨基}戊基)氧基]苯基}亚乙基)肼基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B159)：使用制备化合物#B20所述的操作，由30.8mg(0.056mmol,1.0eq.)的#B6和124.0mg(0.28mmol,5.0eq)的#B158以33％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 975.4[M+H]+,保留时间＝1.05分钟。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-(1-{4-[(5-氨基戊基)氧基]苯基}亚乙基)肼基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B160)：使用制备#B47所述的操作，由17.8mg(0.018mmol,1.0eq)的#B159和30.7mg(0.36mmol,20.0eq.)的哌啶以64％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 753.62[M+H]+,保留时间＝0.66分钟。
步骤4.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2E)-2-{1-[4-({5-[(溴乙酰基)氨基]戊基}氧基)苯基]亚乙基}肼基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B157)：使用制备化合物#B150所述的操作，由6.2mg(0.008mmol,1.0eq)的#B160和2.8mg(0.012mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以及4.2mg(0.032mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以46％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝8.668分钟(纯度53％)。LCMS(方案D):m/z 873.3[M+H]+,保留时间＝0.88分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ10.39-10.25(m,1H),8.30-8.20(m,1H),7.82-7.66(m,3H),6.99-6.90(m,2H),6.42-6.22(m,2H),6.16-6.06(m,1H),5.92-5.81(m,1H),5.68-5.34(m,3H),5.09-4.92(m,1H),4.51-4.25(m,3H),4.03-3.94(m,2H),3.82(s,2H),3.70-3.55(m,2H),3.50-3.40(m,1H),3.15-3.05(m,2H),2.90-2.71(m,2H),2.64-2.56(m,2H),2.30-2.10(m,5H),1.98(s,3H),1.94-1.84(m,1H),1.83-1.55(m,8H),1.53-1.33(m,4H),1.29-1.20(m,3H),1.12-1.00(m,3H),0.98-0.88(m,3H)。
实施例A56
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-({[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}甲基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B161)
Figure BDA0000751870110001861
步骤1.合成2,5-二氧代吡咯烷-1-基N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-β-丙氨酸酯(#B162)：在室温下，向N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-β-丙氨酸(297mg,0.95mmol,1eq.)在四氢呋喃(3.5mL)中的溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(112mg,0.954mmol,1eq.)和N,N'-二环己基碳二亚胺(228mg,1.05mmol,1.1eq.)，并使反应搅拌4小时。将反应过滤，用乙酸乙酯清洗，并真空浓缩。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至95％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B162。收率：320mg,0.78mmol,82％。LCMS(方案D):m/z 431.0[M+Na]+,保留时间＝0.91分钟。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[({N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-β-丙氨酰基}氨基)甲基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B163)：向#B147(15.1mg,0.027mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(14.3μL,0.081mmol,3eq.)和#B162(22.1mg,0.054mmol,2eq.)，并使反应搅拌30分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到期望的#B163和未反应的#B162的混合物LCMS(方案D):m/z 800.4[M+H]+,保留时间＝0.97分钟。该物质在不进一步纯化的情况下使用。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(β-丙氨酰基氨基)甲基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B164)：使用制备化合物#B47所述的操作，由15.7mg(0.02mmol,1.0eq)of#B163和34.1mg(0.4mmol,20.0eq)的哌啶以63％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 578.41[M+H]+,保留时间＝0.62分钟。
步骤4.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-({[N-(溴乙酰基)-β-丙氨酰基]氨基}甲基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B161)：使用制备化合物#B150所述的操作，由7.3mg(0.013mmol,1.0eq)的#B164和4.5mg(0.019mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以及6.8mg(0.052mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以43％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝6.564分钟(纯度72％)。LCMS(方案D):m/z 698.1[M+H]+,保留时间＝0.79分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.31-8.23(m,1H),8.02-7.93(m,1H),δ7.78(d,J＝7.8Hz,1H),6.41-6.32(m,1H),6.28(d,J＝15.8Hz,1H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝15.8和5.5Hz,1H),5.56-5.45(m,1H),5.00(d,J＝6.2Hz,1H),4.31-4.24(m,1H),3.93-3.79(m,3H),3.72-3.59(m,2H),3.55-3.45(m,1H),3.27-3.08(m,3H),3.28-3.14(m,2H),2.77(d,J＝5.1Hz,1H),2.61(d,J＝5.1Hz,1H),2.36-2.14(m,4H),1.98(s,3H),1.88-1.75(m,3H),1.73-1.61(m,4H),1.51-1.41(m,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A57
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}羰基)哌嗪-1-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B165)
Figure BDA0000751870110001881
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[4-(叔丁氧羰基)哌嗪-1-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B166)：向哌嗪-1-羧酸叔丁酯(32mg,0.17mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.9mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(90.8μL,0.52mmol,3eq.)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(4.2mg,0.034mmol,0.2eq.)，然后添加#B45(151mg,0.17mmol,1eq.)，并将反应搅拌30分钟。将反应用DMSO(2.5mL)稀释，并通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至95％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化以得到白色固体状的#B166。收率：114mg,0.12mmol,71％。LCMS(方案C):m/z 927.5[M+H]+,保留时间＝1.89分钟。
步骤2.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N～5～-氨甲酰基-N-(4-{[(哌嗪-1-基羰基)氧基]甲基}苯基)-L-鸟氨酰胺(#B167)：在两个独立的小瓶中，在室温下，向#B166(106mg total,0.11mmol,1eq.)在乙腈(6mL)中的悬浮液添加TFA(800μL)，并将反应搅拌1.5-2小时。将反应真空浓缩，用已经再稀释，并真空浓缩(3×)。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B167。收率：62mg,0.066mmol,57％。LCMS(方案D):m/z 827.4[M+H]+,保留时间＝0.72分钟。
步骤3.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}羰基)哌嗪-1-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B168)：在室温下，向#B39(13.5mg,0.028mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.4mL)中的溶液添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(3.4mg,0.028mmol,1eq.)、N,N-二异丙基乙胺(24.7μL,0.14mmol,5eq.)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(10.6mg,0.034mmol,1.2eq.)，并使反应搅拌6小时。添加#B167(34.5mg,0.037mmol,1.3eq.)和N,N-二异丙基乙胺(12uL,0.07mmol,2.5eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(500uL)中的溶液，并使反应搅拌1小时。将反应用DMSO(500ul)稀释，并将二氯甲烷真空去除。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B168。收率：13mg,0.01mmol,35％。LCMS(方案C):m/z 1329.6[M+H]+,保留时间＝1.81分钟。
步骤4.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}羰基)哌嗪-1-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺,乙酸盐(#B169)：使用制备化合物#B47所述的操作，由13mg(0.01mmol,1.0eq.)的#B168和17.0mg(0.2mmol,20.0eq)的哌啶以80％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1107.5[M+H]+,保留时间＝0.69分钟。
步骤5.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[4-({[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}羰基)哌嗪-1-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B165)：使用制备化合物#B150所述的操作，由9.4mg(0.008mmol,1.0eq)的#B169和2.8mg(0.012mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以及4.2mg(0.032mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以69％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝7.741分钟(纯度91％)。LCMS(方案C):m/z 1229.4[M+H]+,保留时间＝1.48分钟.1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.27-8.19(m 1H),8.13-8.04(m,1H),7.85-7.73(m,2H),7.64-7.55(m,2H),7.35-7.26(m,3H),6.77(s,1H),6.32-6.21(m,2H),6.10(d,J＝12.1Hz,1H),6.01-5.85(m,2H),5.59(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),5.40(s,2H),5.02(s,2H),4.58-4.49(m,1H),4.45-4.25(m,2H),4.24-4.14(m,2H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,2H),3.53-3.45(m,2H),3.43-3.33(m,6H),3.10-2.89(m,4H),2.64-2.53(m,2H),2.38-2.09(m,5H),2.03-1.92(m,1H),1.87-1.56(m,11H),1.55-1.31(m,7H),1.30-1.19(m,5H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.0Hz,3H),0.84(dd,J＝10.9和6.6Hz,6H)。
实施例A58
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}哌嗪-1-基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B170)
Figure BDA0000751870110001901
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}哌嗪-1-基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B171)：在室温下，向#B1(15mg,0.024mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.1mL)中的溶液添加#B167(28.2mg,0.03mol,1.25eq.)和N,N-二异丙基乙胺(16.8μL,0.096mmol,4eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.6mL)中的溶液，并将反应搅拌1.5小时。将反应用二甲亚砜稀释，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B171。收率：17.8mg,0.013mmol,55％。LCMS(方案D):m/z 1345.8[M+H]+,保留时间＝0.92分钟。
步骤2.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}哌嗪-1-基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B172)：使用制备化合物#B47所述的操作，由17.8mg(0.013mmol)的#B171和22.1mg(0.26mmol,20.0eq)的哌啶以79％的收率制备题述化合物。LCMS(方案C):m/z 1122.6[M+H]+,保留时间＝1.23分钟。
步骤3.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-[4-({[(4-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}哌嗪-1-基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N～5～-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B170)：使用制备化合物#B150所述的操作，由12.1mg(0.01mmol)的#B172和3.5mg(0.015mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以及5.2mg(0.04mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以57％的收率制备题述化合物。HPLC(方案AA)保留时间＝7.925分钟(纯度81％)。LCMS(方案C):m/z 1244.4[M+H]+,保留时间＝1.45分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.27-8.19(m 1H),8.13-8.04(m,1H),7.85-7.73(m,2H),7.64-7.55(m,2H),7.35-7.26(m,2H),6.44-6.24(m,2H),6.10(d,J＝11.7Hz,1H),6.03-5.93(m,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝15.6和5.5Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),5.40(s,2H),5.02(s,2H),4.98(d,J＝5.9Hz,1H),4.43-4.33(m,2H),4.30-4.16(m,3H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,2H),3.55-3.34(m,6H),3.26-3.22(m,1H),3.09-2.89(m,4H),2.75(d,J＝5.1Hz,1H),2.63-2.55(m,2H),2.31-2.09(m,4H),1.98(s,3H),1.92-1.78(m,3H),1.73-1.31(m,12H),1.30-1.19(m,5H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H),0.84(dd,J＝10.9和6.6Hz,6H)。
实施例A59
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S,7S)-7-[(丁酰基氨基)甲基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B173)
Figure BDA0000751870110001921
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S,7S)-7-[(丁酰基氨基)甲基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B173)：在0℃下，向#B140(6.7mg,0.014mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.4mL)中的溶液添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(0.4mg,0.003mmol,0.2eq.)、N,N-二异丙基乙胺(12.3μL,0.07mmol,5eq.)和丁酸(6.8μL,0.074mmol,5.3eq.)，并使反应在室温下搅拌2小时。向反应添加DCC(8mg,0.042mmol,3eq.)，并将反应搅拌45分钟。将反应用乙酸乙酯和饱和碳酸氢钠稀释，萃取，用盐水清洗，经硫酸镁干燥，过滤，并真空浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B173。收率：3.4mg,0.006mmol,43％。HPLC(方案AA):保留时间＝8.927分钟(纯度87％)。LCMS(方案D):m/z 583.2[M+Na]+,保留时间＝0.88分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.84-7.75(m,2H),6.42-6.32(m,1H),6.23(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.5和7.4Hz,1H),5.65-5.45(m,3H),4.60-4.51(m,1H),3.96-3.85(m,1H),3.70-3.60(m,2H),3.54-3.46(m,1H),3.12-3.01(m,1H),2.63(s,2H),2.32-2.12(m,2H),2.09-2.01(m,2H),1.98(s,3H),1.75-1.56(m,7H),1.55-1.45(m,2H),1.41-1.33(m,1H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H),0.88-0.80(m,3H)。
实施例A60
通过重组Fr9P的生物催化制备[(3R,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-5-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B174)
Figure BDA0000751870110001931
步骤1.重组Fr9P酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中的产生以及从大肠杆菌纯化：合成密码子优化的Fr9P基因(如实施例4的步骤1所述)，并结合至pGS-21a(GenScript)的NcoI-HindIII位点中以生成pAE-PF16。重组的His6-GST标记的Fr9P蛋白质在用质粒pAE-PF16转化之后于大肠杆菌BL21(DE3)中产生以及从大肠杆菌纯化。在两个2.8-L含0.5L培养基(含100mg/L氨苄青霉素的Terrific肉汤)的冯巴赫烧瓶中各自接种20mL过夜LB培养物，并在25℃于200rpm下孵育。当OD600达到约0.9时，用0.2mM IPTG诱导细胞，并继续在25℃和200rpm下孵育。在18-20h之后，通过离心获得细胞并在-80℃冷冻。将细胞团块再悬浮于约50mL冰冷的溶解缓冲液[10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4；500mM NaCl；20mM咪唑；10％甘油；溶菌酶1mg/ml；0.5％(v/v)Tween 20；20mMβ-巯基乙醇]中，并在冰上培育30分钟。在冰上超声处理之后，将细胞溶解物在14,000rpm和4℃下离心45分钟。将上清液转移至新的管中，并再次于14,000rpm和4℃下离心30分钟。将5ml Ni-NTA树脂浆料(Qiagen)添加至在冰上小烧杯内所包含的上清液部分(澄清的溶解物)中，并和缓地搅拌1小时。将悬浮液转移至falcon管中，并在3,000rpm和4℃下离心10分钟。将上清液丢弃，并将树脂清洗三次，每次使用30ml冰冷的清洗缓冲液[10mM磷酸盐缓冲液pH 7.4；500mM NaCl；40mM咪唑；10％甘油；20mMβ-ME]，然后在3,000rpm和4℃下离心10分钟。将树脂转移至一次性柱，并再清洗三次，每次使用2.5ml清洗缓冲液。将酶以3×2.5ml洗脱缓冲液[10mM磷酸盐缓冲液pH7.4；500mM NaCl；250mM咪唑；10％甘油；20mMβ-ME]洗脱。使用PD-10柱将缓冲液交换成50mM MOPS pH 7.5，并使用分子量截留值为30kDa的Vivaspin柱浓缩该溶液。储存缓冲液包含50mM MOPS pH 7.5、2mM DTT和10％甘油(用于在-80℃下储存)或50％甘油(用于在-20℃下储存)。纯化酶的收率为约25mg/升培养物。
步骤2.使用重组Fr9P合成[(3R,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-5-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B174)：向#NP2(1mg,0.4mM,1eq.)在50mM MOPS缓冲液pH 7.5中的水溶液添加α-酮戊二酸盐(0.8mM最终浓度,2eq.)、抗坏血酸钠(0.08mM,0.2eq.)、NH4Fe(II)SO4(0.04mM,0.1eq.)和来自实施例#A60的步骤1的重组Fr9P(1.2μM,0.003eq.)。在室温下孵育2小时之后，将反应用乙酸酸化至pH约4-5并用等体积的乙酸乙酯萃取三次。将溶剂减压蒸发，将残留物再悬浮于0.25ml乙腈中，过滤并通过逆相色谱法(方法H)纯化。将保留时间为18.5分钟的流分收集并用氢氧化铵中和，之后将其减压浓缩。将水性浓缩物用乙酸酸化至pH约4，并用等体积的乙酸乙酯萃取两次。将溶剂减压去除以得到白色固体状的#B174。收率：0.2mg.HPLC(方案P):保留时间＝10.39分钟。HRESIMS m/z 536.286[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ12.24(brs,OH),8.00(d,J＝8.0Hz,1H),6.37(m,1H),6.23(d,J＝15.9,1H),6.12(dd,J＝0.7,11.5,1H),5.88(dd,J＝11.6,7.5Hz,1H),5.54(m,1H),5.50(m,1H),4.67(m,1H),3.66(m,2H),3.51(m,1H),2.60(m,1H),2.53(m,1H),2.33(m,1H),2.31(m,1H),2.20(m,1H),2.00(s,3H),1.84(m,1H),1.81(m,2H),1.70(s,3H),1.67(m,1H),1.39(m,1H),1.26(d,J＝6.6Hz,3H),1.16(m,1H),1.08(d,J＝6.4Hz,3H),0.96(d,J＝7.2Hz,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ171.7,170.5,165.0,142.7,134.4,133.3,128.5,127.3,122.6,95.3,79.9,74.8,67.9,67.2,46.7,46.1,38.9,37.7,35.0,31.5,28.7,20.8,19.7,17.6,14.2,12.2。
实施例A61
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基甲基[2-(吡啶-2-基二硫基)乙基]氨基甲酸酯(#B175)
Figure BDA0000751870110001941
步骤1.合成N-甲基-2-(吡啶-2-基二硫基)乙胺三氟乙酸盐(#B176)：在室温下，向[2-(吡啶-2-基二硫基)乙基]氨基甲酸叔丁基甲酯(Angew.Chem.Int.Ed.2007,46,6469)(90mg,0.3mmol,1eq.)在二氯甲烷(1mL)中的溶液添加TFA(1mL)，并将反应搅拌1小时。将反应真空浓缩并与乙腈(3×)共沸以得到油状的#B176。LCMS(方案D):m/z 201.1[M+H]+,保留时间＝0.43分钟。将粗制物质在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基甲基[2-(吡啶-2-基二硫基)乙基]氨基甲酸酯(#B175)：在室温下，向#B39(19.5mg,0.041mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(5mg,0.041mmol,1eq.)、N,N-二异丙基乙胺(21.7μL,0.123mmol,3eq.)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(18.9mg,0.62mmol,1.5eq.)，并使反应搅拌2.5小时。添加额外的双(4-硝基苯基)碳酸酯(3.1mg,0.008mmol,0.2eq.)，并将反应搅拌另外的1.5小时。添加#B176(44.1mg,0.103mmol,2.5eq.)和N,N-二异丙基乙胺(54μL,0.31mmol,7.5eq.)在二氯甲烷(0.4mL)中的溶液，并使反应搅拌1小时。添加#B176(17mg,0.04mmol,1eq.)和N,N-二异丙基乙胺(44μL,0.25mmol,6eq.)在二氯甲烷(0.2mL)中的额外的溶液，并使反应搅拌另外15分钟。将反应混合物用DMSO(1mL)稀释，并将二氯甲烷真空去除。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B175。收率：7.6mg,0.011mmol,26％。LCMS(方案D):m/z 703.6[M+H]+,保留时间＝0.91分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz).8.49-8.43(m,1H),7.87-7373(m,2H),7.32(s,1H),7.28-7.21(m,1H),6.78(s,1H),6.32(d,J＝16.0Hz,1H),6.26(d,J＝16.4Hz,1H),6.23-6.13(m,1H),6.11-5.98(m,1H),5.93-5.84(m,1H),5.76-5.67(m,1H),5.59(dd,J＝15.9和5.6Hz,1H)
实施例A#62
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(2,2-二甲基肼基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B177)
Figure BDA0000751870110001961
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[2-(2,2-二甲基肼基)-2-氧代乙基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B177)：在室温下，向#B1(26.8mg,0.042mmol,1eq.)溶解在四氢呋喃(1mL)中的溶液添加N,N-二甲基肼(16μ,0.21mmol,5eq.)。在搅拌40分钟之后，添加另外的N,N-二甲基肼(6.4μL,0.084mmol,2eq.)，并将反应搅拌5分钟。将反应用水稀释，用乙酸乙酯萃取，并将合并的有机物经硫酸钠干燥并过滤。将溶剂真空除去。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B177。收率：14.5mg,0.025mmol,60％。LCMS(方案D):m/z 578.5[M+H]+,保留时间＝0.72分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.85(s,0.6H),8.33(s,0.4H),7.93-7.84(m,1H),6.40-6.27(m,2H),6.10(d,J＝11.6Hz,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.6Hz,1H),5.63-5.54(m,1H),5.53-5.46(m,1H),5.09(d,J＝5.1Hz,0.6H),5.01(d,J＝6.6Hz,0.4H),4.35-4.16(m,2H),3.68-3.60(m,2H),3.53-3.46(m,1H),3.27-3.21(m,1H),2.99-2.90(m,0.6H),2.76(d,J＝5.4Hz,1H),2.60-2.53(m,1H),2.47-2.38(m,6.4H),2.34-2.26(m,1H),2.25-2.15(m,1H),2.06(dd,J＝14.2和4.9Hz,1H),1.98(s,3H),1.87-1.72(m,3H),1.71-1.58(m,4H),1.51-1.43(m,1H),1.24(d,J＝6.4Hz,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#63
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({反式-3-[(1H-咪唑-1-基羰基)氨基]环丁基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B178)
Figure BDA0000751870110001962
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-({反式-3-[(1H-咪唑-1-基羰基)氨基]环丁基}氨基)-2-氧代乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B178)：在室温下，向#B73(15.3mg,0.025mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(8.8μL,0.05mmol,2eq.)和羰基二咪唑(4.9mg,0.03mmol,1.2eq.)，并将反应搅拌25分钟。将反应用二氯甲烷稀释，用水清洗，经硫酸钠干燥，过滤，用DMSO(0.8mL)稀释并浓缩以去除二氯甲烷。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制的期望物质以得到白色固体状的#B178。收率：3.2mg,0.0045mmol,18％。LCMS(方案D):m/z698.6[M+H]+,保留时间＝0.68分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.67(d,J＝6.9Hz,1H),8.37(d,J＝7.1Hz,1H),8.24(s,1H),7.78(d,J＝8.1Hz,1H),7.70-7.67(m,1H),7.02(s,1H),6.40-6.27(m,2H),6.10(dd,11.6和1.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.3Hz,1H),5.60(dd,J＝15.7和5.6Hz,1H),5.52-5.45(m,1H),5.01(d,J＝5.4Hz,1H),4.43-4.34(m,1H),4.33-4.21(m,2H),3.67-3.54(m,2H),3.48-3.43(m,1H),3.30-3.26(m,1H),2.78(d,J＝5.1Hz,1H),2.60-2.54(m,2H),2.39-2.13(m,7H),1.98(s,3H),1.83-1.74(m,3H),1.69(s,3H),1.65-1.53(m,3H),1.25(d,J＝6.4Hz,3H),1.04(d,J＝6.4Hz,3H),0.93(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#64
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(四氢哒嗪-1(2H)-基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B179)
Figure BDA0000751870110001971
步骤1.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-[2-氧代-2-(四氢哒嗪-1(2H)-基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B179)：在室温下，向#B1(18.1mg,0.029mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.6mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(51.1μL,0.29mmol,10eq.)和六氢哒嗪二盐酸盐(18.5mg,0.12mmol,4eq.)，并将反应搅拌30分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B179。收率：10.7mg,0.018mmol,61％。LCMS(方案D):m/z 604.6[M+H]+,保留时间＝0.80分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.42-6.27(m,2H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.61(dd,J＝16.0和5.9Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),4.92(d,J＝6.2Hz,1H),4.76(app t,J＝7.0Hz,1H),4.34-4.18(m,2H),3.70-3.60(m,2H),3.54-3.40(m,3H),3.27-3.21(m,1H),3.03(dd,J＝15.2和7.4Hz,1H),2.81-2.70(m,3H),2.55(d,J＝5.5Hz,1H),2.33-2.15(m,2H),1.98(s,3H),1.85-1.74(m,3H),1.71-1.56(m,5H),1.55-1.48(m,4H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A#65
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N-5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B180)
Figure BDA0000751870110001991
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(9,9-二甲基-3,7-二氧代-2,8-二氧杂-4,6-二氮杂癸-1-基)苯基]-L-鸟氨酰胺(#B181)：在0℃下，向#B45(161.5mg,0.18mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(2mL)中的溶液滴加氨基乙基氨基甲酸叔丁酯盐酸盐(J.Org.Chem.,1980,45,1703,32.9mg,0.18mmol,1eq.)和N,N-二异丙基乙胺(47μL,0.27mmol,3eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液。添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(2mg,0.016mmol,0.1eq.)，并将所得的溶液在室温下搅拌1小时。将反应混合物用叔丁基甲醚稀释并过滤。通过制备型HPLC纯化滤饼以得到白色固体状的#B181。收率：20mg,0.00023mmol,13％。1H NMR(400MHz,MeOD-d4)δ7.82(d,2H),7.67(d,2H),7.58(d,2H),7.42(m,6H),5.04(br,3H),4.63(s,4H),4.52(m,5H),4.36(m,2H),3.20(m,4H),2.32(m,2H),2.10(m,1H),1.90(m,1H),1.77(m,1H),1.65(m,4H),1.44(m,7H),1.35(m,3H),0.98(m,6H)。
步骤2.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(氨基甲基)氨甲酰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(#B182)：在0℃下，向#B181(20mg,0.00023mmol)添加预先冷却的三氟乙酸(1.3mL)，并使反应搅拌10分钟。将反应浓缩，溶解于乙腈中并再浓缩三次以得到胶质的#B182，其在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤:收率：25mg,0.028mmol,100％。LCMS(方案D):m/z 787.6[M+H]+,保留时间＝0.75分钟。
步骤3.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B183)：在室温下，向#NP2(14.5mg,0.028mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(19.7μL,0.11mmol,4eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(12mg,0.031mmol,1.1eq.)。添加含#B182(25.2mg,0.028mmol,1eq.)的DMF(0.6mL)，并使反应搅拌45分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B183。收率：9.8mg,0.0076mmol,27％。LCMS(方案D):m/z 1288.94[M+H]+,保留时间＝0.94分钟。
步骤4.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B184)：使用制备化合物#B47所述的操作，由11.9mg(0.009mmol,1.0eq)的#B183和15.3mg(0.18mmol,20.0eq)的哌啶以75％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1066.8[M+H]+,保留时间＝0.73分钟。
步骤5.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3S,5S,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N-5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B180)：使用制备化合物#B150所述的操作，由7.6mg(0.01mmol)的#B184和2.6mg(0.011mmol,1.5eq.)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以及3.7mg(0.028mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以61％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1188.8[M+H]+,保留时间＝0.81分钟。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),8.45-8.37(m,1H),8.27-8.20(m,1H),8.14-8.05(m,1H),7.85-7.73(m,2H),7.61-7.55(m,2H),7.30-7.24(m,2H),6.40-6.32(m,1H),6.25(d,J＝16.1Hz,1H),6.10(dd,J＝11.5和1.2Hz,1H),6.01-5.93(m,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.6Hz,1H),5.60(dd,J＝15.6和5.4Hz,1H),5.56-5.49(m,1H),5.41(s,2H),5.02(s,2H),4.56-4.50(m,1H),4.42-4.23(m,3H),4.22-4.16(m,1H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,3H),3.52-3.45(m,2H),3.09-2.89(m,5H),2.66-2.53(m,3H),2.34-2.09(m,6H),2.01-1.92(m,4H),1.85-1.55(m,10H),1.54-1.31(m,7H),1.27-1.20(m,4H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H),0.83(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例A#66
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B185)
Figure BDA0000751870110002021
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-(叔丁氧羰基)-2-甲基肼基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B186)：在室温下，向1-甲基肼羧酸叔丁酯(34.8mg,0.24mmol,1.3eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(1mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(64.4μL,0.37mmol,2eq.)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(11.1mg,0.091mmol,0.5eq.)，然后添加#B45(161mg,0.18mmol,1eq.)，并使反应搅拌。在4h之后，添加另外的含1-甲基肼羧酸叔丁酯(14mg,0.096mmol,0.5eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)，并将反应混合1.5小时。将反应用DMSO(1mL)稀释，并通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化以得到白色固体状的#B186。收率：26.1mg,0.029mmol,16％。LCMS(方案D):m/z 887.6[M+H]+,保留时间＝0.92分钟。
步骤2.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-({[(2-甲基肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺三氟乙酸盐(#B187)：在室温下，向#B186(16.5mg,0.019mmol,1eq.)添加三氟乙酸(1mL)，并使反应搅拌20分钟。将反应浓缩，溶解于乙腈中并再浓缩三次以得到胶质的#B187，其在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤。LCMS(方案D):m/z 809.6[M+Na]+,保留时间＝0.80分钟。
步骤3.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B188)：在室温下，向#NP1(8.7mg,0.016mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(11.3μL,0.064mmol,4eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(7.4mg,0.019mmol,1.2eq.)，然后添加#B187(17.1mg,0.019mmol,1.2eq.)和N,N-二异丙基乙胺(5.7μL,0.032mmol,2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液，并使反应搅拌30分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B188。收率：8.3mg,0.0064mmol,40％。LCMS(方案D):m/z 1304.9[M+H]+,保留时间＝0.93分钟。
步骤4.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B189)：使用制备化合物#B47所述的操作，由8.3mg(0.006mmol,1.0eq.)的#B188和10.2mg(0.12mmol,20.0eq)的哌啶以80％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1082.81[M+H]+,保留时间＝0.66分钟。
步骤5.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}-2-甲基肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B185)：使用制备化合物#B150所述的操作，由5.5mg(0.005mmol,1eq.)的#B189、1.7mg(0.011mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮和2.6mg(0.02mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以63％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1204.86[M+H]+,保留时间＝0.77分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.01(s,1H),9.94-9.81(m,1H),8.28-8.20(m,1H),8.13-8.05(m,1H),7.86-7.76(m,2H),7.66-7.55(m,2H),7.37-7.25(m,2H),6.59-6.46(m,1H),6.40-6.29(m,2H),6.10(dd,J＝11.6和1.5Hz,1H),6.01-5.95(m,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.6Hz,1H),5.65-5.57(m,1H),5.56-5.50(m,1H),5.41(m,2H),5.12-4.96(m,4H),4.42-4.33(m,1H),4.32-4.24(m,1H),4.23-4.16(m,2H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,2H),3.52-3.47(m,1H),3.07-2.89(m,5H),2.77-2.73(m,1H),2.60-2.54(m,1H),2.34-2.08(m,4H),2.01-1.92(m,4H),1.86-1.31(m,14H),1.27-1.20(m,4H),1.06(d,J＝6.1Hz,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H),0.83(d,J＝6.6Hz,3H)。
实施例A#67
制备N-{7-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-7-氧代庚酰基}-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B190)
Figure BDA0000751870110002051
步骤1.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B191)：在室温下，向#B6(19.4mg,0.035mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(24.7μL,0.14mmol,4eq.)、2,6-二甲基吡啶(16.3μL,0.14mmol,4eq.)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(4.3mg,0.035mmol,1eq.)和N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基N5-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(40.6mg,0.053mmol,1.5eq.)，并将反应搅拌2.5小时。添加另外的N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(13.5mg,0.018mmol,0.5eq.)，并将反应搅拌另外的1小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B191。收率：9.4mg,0.0081mmol,23％。LCMS(方案D):m/z 1177.8[M+H]+,保留时间＝0.90分钟。
步骤2.合成L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B192)：使用制备化合物#B47所述的操作，由9.4mg(0.008mmol,1.0eq)的#B191和13.6mg(0.16mmol,20.0eq)的哌啶以56％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 955.8[M+H]+,保留时间＝0.65分钟。
步骤3.合成N-{7-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-7-氧代庚酰基}-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B190)：在室温下，向#B192(4.5mg,0.004mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(3.5μL,0.02mmol,5eq.)，然后添加1,1'-[(1,7-二氧代庚烷-1,7-二基)双(氧基)]二吡咯烷-2,5-二酮(如J.Am.Chem.Soc.2006,128,2802所制备,8.9mg,0.025mmol)6.2eq.)，并使反应搅拌35分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B190。收率：1.65mg,0.0014mmol,34％。LCMS(方案D):m/z 1194.80[M+H]+,保留时间＝0.75分钟。1H NMR(500MHz,CD3CN)δ9.06(s,1H),8.17(s,1H),7.71-7.63(m,2H),7.35-7.25(m,2H),7.19(d,J＝7.6Hz,1H),6.73(d,J＝6.6Hz,1H),6.47(d,J＝8.8Hz,1H),6.41-6.30(m,2H),5.96-5.85(m,2H),5.67-5.50(m,2H),5.33-5.24(m,1H),5.08-4.99(m,2H),4.74(s,1H),4.57-4.48(m,1H),4.39-4.25(m,2H),4.15-4.08(m,1H),3.82-3.75(m,1H),3.67-3.59(m,1H),3.55-3.47(m,1H),3.35-3.20(m,2H),3.12-2.99(m,2H),2.82-2.73(m,5H),2.66-2.52(m,6H),2.46-2.38(m,2H),2.36-2.20(m,4H),1.98(s,3H),1.77-1.57(m,11H),1.53-1.36(m,6H),1.30(d,J＝6.6Hz,3H),1.06(d,J＝6.6Hz,3H),1.00-0.91(m,9H)。
实施例A#68
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B193)
Figure BDA0000751870110002071
步骤1.合成6-[(溴乙酰基)氨基]己酸(#B194)：在0℃下，将6-氨基己酸(14.2g,0.11mol,1eq.)添加至含KOH(6.2g,0.11mol,1eq.)的水(30mL)中。滴加溴乙酰溴(26.1g,0.13mol,1.2eq.)，同时滴加碳酸钾溶液(2.8N)以将pH调节为>7.8。在添加之后，将溶液在0℃搅拌1小时。由0.5M HCl酸化反应混合物以将pH调节至1，并用乙酸乙酯萃取。将有机相经硫酸钠干燥，并真空浓缩。通过用二氯甲烷：甲醇50:1洗脱的硅胶柱色谱法纯化残留物以得到白色固体状的#B194(10.2g,38％)。
步骤2.合成6-[(溴乙酰基)氨基]己酸五氟苯酯(#B195)：在0℃下，向#B194(8g,31.7mmol,1eq.)在二氯甲烷(400mL)中的溶液添加三氟乙酸五氟苯酯(13.3g,45.7mmol,1.45eq.)和吡啶(10g,127mmol,4eq.)。将反应混合物在0℃搅拌10分钟。将反应混合物用0.5M HCl清洗并真空浓缩。通过用乙酸乙酯(49.2％，在PE中)洗脱的快速色谱法纯化残留物以得到白色固体状的#B195(9.5g,71.7％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)6.53(br,1H),3.89(s,2H),3.35(m,2H),2.70(m,2H),1.83(m,2H),1.64(m,2H),1.48(m,2H)。
步骤3.合成(2E)-3-(2-{[N-(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基]氨基}苯基)丙-2-烯酸甲酯(#B196)：将(2E)-3-(2-氨基丙基)丙-2-烯酸甲酯(14g,79.1mmol,1eq.)、N-(叔丁氧羰基)-L-丙氨酸(22.4g,119mmol,1.5eq.)、1-羟基苯并三唑(16.1g,119mmol,1.5eq.)、1-[3-(二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(22.8g,119mmol,1.5eq.)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(1.93g,15.8mmol,0.2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(600mL)中的混合物在50℃搅拌3天。将反应混合物用乙酸乙酯(1500mL)和水(500mL)稀释。将有机层分离并用水(300mL×2)清洗，经硫酸钠干燥并浓缩至干燥。通过用20:1至5:1的石油醚：乙酸乙酯洗脱的硅胶柱色谱法纯化残留物以得到黄色油状的粗制#B196(21g,76.4％)，其在不进一步纯化的情况下使用。
步骤4.合成3-(2-{[N-(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基]氨基}苯基)丙酸甲酯(#B197)：在20℃下，向粗制#B196(21g,60.3mmol,1eq.)在甲醇(1L)中的溶液添加Pd/C(4g)，并将反应混合物在室温下于氢气(35psi)下搅拌12小时。将反应混合物过滤并浓缩至干燥以得到黄色油状的粗制#B197(19g,90.5％)，其在不进一步纯化的情况下使用。
步骤5.合成3-(2-{[N-(叔丁氧羰基)-L-丙氨酰基]氨基}苯基)丙酸(#B198)：在0℃下，向粗制#B197(19g,54.2mmol,1eq.)在四氢呋喃(150mL)中的溶液添加氢氧化钠(110mL,2M)，并将反应在50℃搅拌3小时。将四氢呋喃真空去除，并由1M HCl将所得的溶液调节至pH＝3-4，并用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。将萃取物用盐水(20mL×1)清洗，经硫酸钠干燥并浓缩至干燥，以得到褐色油状的粗制#B198(16g,88.9％)。
步骤3.合成3-[2-(L-丙氨酰基氨基)苯基]丙酸三氟乙酸盐(#B199)：在0℃下，向#B198(16g,47.5mmol,1eq.)在二氯甲烷(150mL)中的溶液添加TFA(100mL)，并将反应在25℃搅拌12小时。将反应混合物浓缩至干燥，并将残留物在不进一步纯化的情况下直接用于接下来的步骤。
步骤4.合成3-[2-({N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酰基}氨基)苯基]丙酸(#B200)：在0℃下，向#B199(5g,21.1mmol,1eq.)在丙酮(50mL)和水(100mL)中的溶液添加碳酸氢钠(5.30g,63.4mmol,3eq.)。然后，在0℃下，滴加含9H-芴-9-基甲基氯甲酸酯(carbonochloridate)(4.94g,19.1mmol,0.9eq.)的丙酮(50mL)。用1M HCl将反应调节至pH＝3-4，并将水相拥乙酸乙酯萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥，真空浓缩，并通过用甲醇：二氯甲烷(1.5％～2％)洗脱的硅胶柱色谱法纯化残留物以得到粗制产物，所述粗制产物通过制备型HPLC进一步纯化以得到白色固体，所述白色固体通过SFC-分离而进一步纯化以得到白色固体状的#B200(560mg,5.8％)。1H NMR(400Hz,DMSO-d6):9.65(s,1H),7.92(d,2H),7.76(m,3H),7.43-7.14(m,8H),4.32(m,4H),2.80(m,2H),2.50(m,2H),1.37(m,3H)。
步骤5.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基3-[2-({N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-丙氨酰基}氨基)苯基]丙酸酯(#B201)：在室温下，向#B148(21.2mg,0.043mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.5mL)中的溶液添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(3.5mg,0.029mmol,0.67eq.)、#B200(39.4mg,0.086mmol,2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)中的溶液、以及N,N'-二环己基碳二亚胺(DCC)(23.2mg,0.107mmol,2.5eq.)，并使反应搅拌2.5小时。添加另外的DCC(23mg,0.107mmol,2.5eq.)，并使反应搅拌额外的2小时。将反应用DMSO(0.7mL)稀释，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B201。收率：8.6mg,0.009mmol,21％。LCMS(方案D):m/z 954.57[M+Na]+,保留时间＝1.10分钟。
步骤6.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基3-[2-(L-丙氨酰基氨基)苯基]丙酸酯乙酸盐(#B202)：使用制备化合物#B47所述的操作，由15.1mg(0.016mmol,1.0eq.)的#B201和27.2mg(0.32mmol,20.0eq.)的哌啶以70％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z955.8[M+H]+,保留时间＝0.65分钟。
步骤7.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B203)：在室温下，向#B202(9mg,0.01mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(8.5μL,0.048mmol,4eq.)，然后添加2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酸酯(10.5mg,0.024mmol,2eq.)，并使反应搅拌20分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B203。收率：7.4mg,0.007mmol,60％。LCMS(方案D):m/z 1031.9[M+H]+,保留时间＝1.11分钟。
步骤8.合成L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺乙酸盐(#B204)：使用制备化合物#B47所述的操作，由7.4mg(0.007mmol,1.0eq.)的#B203和11.9mg(0.14mmol,20.0eq.)的哌啶以87％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 809.9[M+H]+,保留时间＝0.81分钟。
步骤9.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B193)：在室温下，向#B204(5.3mg,0.006mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(6.3μL,0.036mmol,6eq.)，然后添加#B195(2.9mg,0.007mmol,1.2eq.)，并使反应搅拌10分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B193。收率：4.1mg,0.004mmol,65％。LCMS(方案D):m/z 1044.9[M+H]+,保留时间＝0.95分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.42(s,1H),8.26-8.19(m,1H),8.14(d,J＝6.9Hz,1H),7.85-7.77(m,2H),7.30-7.10(m,4H),6.42-6.33(m,1H),6.25(d,J＝15.9Hz,1H),6.10(dd,J＝11.7和1.2Hz,1H),5.83(dd,J＝11.5和7.3Hz,1H),5.58(dd,J＝15.9和5.1Hz,1H),5.56-5.50(m,1H),4.55-4.42(m,2H),4.34-4.26(m,1H),4.20(dd,J＝8.8和6.9Hz,1H),3.81(s,2H),3.68-3.62(m,2H),3.60(s,3H),3.54-3.46(m,1H),3.07-2.99(m,2H),2.87-2.56(m,7H),2.35-2.08(m,5H),2.02-1.92(m,2H),1.88-1.61(m,8H),1.53-1.35(m,5H),1.33(d,J＝7.1Hz,3H),1.28-1.19(m,4H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H),0.85(d,J＝6.6Hz,3H),0.82(d,J＝6.6Hz,3H)。
实施例A#69
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}四氢哒嗪-1(2H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B205)
Figure BDA0000751870110002121
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-(4-{[(四氢哒嗪-1(2H)-基羰基)氧基]甲基}苯基)-L-鸟氨酰胺(#B206)：在室温下，向六氢哒嗪二盐酸盐(11.1mg,0.07mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(49.3μL,0.28mmol,4eq.)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(4.3mg,0.035mmol,0.5eq.)，然后添加#B45(61.6mg,0.07mmol,1eq.)，并使反应搅拌30分钟。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(5％至95％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化反应以得到白色固体状的#B206。收率：19.8mg,0.024mmol,34％。LCMS(方案D):m/z 827.63[M+H]+,保留时间＝0.84分钟。
步骤2.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}四氢哒嗪-1(2H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B207)：在室温下，向#NP1(15.5mg,0.029mmol,2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.15mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(19.7μL,0.11mmol,8eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(11.3mg,0.029mmol,2.1eq.)，然后添加#B206(11.4mg,0.014mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.6mL)中的溶液，并使反应搅拌22小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B207。收率：4.2mg,0.003mmol,22％。LCMS(方案D):m/z 1345.2[M+H]+,保留时间＝0.97分钟。
步骤3.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}四氢哒嗪-1(2H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B208)：使用制备化合物#B47所述的操作，由9.8mg(0.007mmol,1.0eq.)的#B207和11.9mg(0.14mmol,20.0eq.)的哌啶以67％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1122.95[M+H]+,保留时间＝0.74分钟。
步骤4.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}四氢哒嗪-1(2H)-基]羰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B205)：使用制备化合物#B150所述的操作，由5.6mg(0.005mmol,1eq.)的#B208、1.7mg(0.007mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮和2.6mg(0.02mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以52％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1244.9[M+H]+,保留时间＝0.83分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.04(br s,1H),8.24(br s,1H),8.13(br s,1H),7.87-7.77(m,2H),7.65-7.55(m,2H),7.36-7.24(m,2H),6.88-6.77(m,1H),6.41-6.26(m,2H),6.10(d,J＝11.5Hz,1H),6.04-5.95(m,1H),5.86(dd,J＝11.5和7.3Hz,1H),5.66-5.48(m,2H),5.42(br s,1H),5.18-5.06(m,1H),5.05-4.94(m,1H),4.39-4.15(m,5H),4.11-3.98(m,1H),3.81(s,2H),3.68-3.60(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.28-3.20(m,2H),3.08-2.89(m,4H),2.85-2.72(m,2H),2.34-2.08(m,5H),2.02-1.92(m,4H),1.86-1.31(m,18H),1.28-1.20(m,4H),1.09-1.03(m,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.85(d,J＝6.6Hz,3H),0.82(d,J＝6.6Hz,3H)。
实施例A#70
制备(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B209)
Figure BDA0000751870110002141
步骤1.合成(2Z,4S)-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-肼基-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]-4-羟基戊-2-烯酰胺(#B209)：在0℃下，向#B4(13.1mg,0.027mmol,1eq.)在四氢呋喃(0.4mL)中的溶液添加DCC(11.7mg,0.054mmol,2eq.)，并将反应搅拌10分钟。添加N-羟基琥珀酰亚胺(6.3mg,0.054mmol,2eq.)，并使反应在室温下搅拌5小时。将反应用乙腈稀释，过滤并浓缩。将残留物溶解在二氯甲烷(0.5mL)中，添加肼溶液(1M，在THF中,270μL,0.27mmol,10eq.)。将反应搅拌10分钟，用二甲亚砜稀释，浓缩以去除二氯甲烷，并过滤。通过逆相色谱法(方法A)纯化粗制残留物以得到固体状的#B209。收率：8.1mg,59％。LCMS(方案D):m/z 508.6[M+H]+,保留时间＝0.59分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.00(s,1H),7.76(d,J＝7.4Hz,1H),6.29(d,J＝15.8Hz,1H)5.98(d,J＝11.3Hz,1H),5.86(dd,J＝11.3和7.4Hz,1H),5.60(dd,J＝15.8和5.5Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),5.23-5.07(m,2H),5.06-4.98(m,1H),4.32-4.09(m,3H),3.70-3.59(m,2H),3.55-3.45(m,1H),3.25-3.19(m,1H),2.74(d,J＝5.1Hz,1H),2.58(d,J＝5.1Hz,1H),2.44(dd,J＝14.4和8.6Hz,1H),2.36-2.14(m,3H),1.93-1.58(m,8H),1.50-1.42(m,1H),1.11(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.0Hz,3H)。
实施例A#71
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-溴-6-甲基-2,5,8,11,18-五氧代-9-(丙-2-基)-3,4,7,10,17-五氮杂十九烷-1-基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B210)
Figure BDA0000751870110002151
步骤1.合成9H-芴-9-基甲基-{6-[(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基]-6-氧代己基}氨基甲酸酯(#B211)：在0℃下，向6-((((9H-芴-9-基)甲氧基)羰基)氨基)己酸(6g,16.9mmol,1eq.)在四氢呋喃(250mL)中的溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(2.13g,18.5mmol,1.1eq.)和DCC(3.5g,18.59mmol,1.1eq.)，并将反应在20℃搅拌过夜。将反应混合物冷却至-20℃，过滤并浓缩至干燥。将残留物在MTBE(300mL)中搅拌20分钟并再次过滤。将滤饼真空干燥以得到白色固体状的#B211(5.6g,73％)。
步骤2.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酸(#B212)：在0℃下，向L-缬氨酸(1.5g,12.8mmol,1eq.)在水(60mL)和四氢呋喃(30mL)中的溶液添加NaHCO3(1.37g,16.3mmol,1.3eq.)。然后，在0-10℃下，滴加#B211(5.67g,12.6mmol,0.98eq.)在二甲氧基乙烷(80mL)和四氢呋喃(80mL)中的溶液，并将反应在20℃搅拌18小时。通过添加柠檬酸将反应混合物的pH调节至4，并将反应混合物浓缩。添加乙酸乙酯(450mL)和甲醇(50mL)，并将混合物搅拌10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并浓缩至干燥。通过用100:1至8:1的二氯甲烷：甲醇洗脱的快速柱色谱法纯化残留物以得到白色固体状的#B212(2.6g,45％)。
步骤3.合成2,5-二氧代吡咯烷-1-基-N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酸酯(#B213)：在0℃下，向#B212(2g,4.42mmol,1eq.)在四氢呋喃(60mL)中的溶液添加N-羟基琥珀酰亚胺(0.53g,4.65mmol,1.05eq.)和DCC(0.88g,4.65mmol,1.05eq.)，并将反应在20℃搅拌过夜。将反应混合物冷却至-20℃，过滤并浓缩至干燥。将残留物在MTBE(300mL)中搅拌20分钟并过滤。将滤饼真空干燥以得到白色固体状的#B213(1.9g,79％)。
步骤4.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基L-丙氨酸(#B214)：在0℃下，向L-丙氨酸(0.32g,3.6mmol,1.04eq.)在水(15mL)和四氢呋喃(10mL)中的溶液添加NaHCO3(0.44g,5.19mmol,1.5eq.)。然后，在0-10℃下，滴加#B213(1.9g,3.46mmol,1eq.)在二甲氧基乙烷(30mL)中的溶液，并将反应在20℃搅拌18小时。通过添加柠檬酸将反应混合物的pH调节至4，并将反应混合物浓缩。添加二氯甲烷那(400mL)和甲醇(50mL)，并将混合物搅拌10分钟。将有机层分离，经硫酸钠干燥并浓缩至干燥。通过用100:1至8:1的二氯甲烷：甲醇洗脱的快速柱色谱法纯化残留物以得到残留物，其用甲醇/四氢呋喃(3:1)再结晶三次以得到白色固体状的#B214(490mg,27％)。1H NMR(400MHz,DMSO):12.48(b,1H),8.21(b,1H),7.91(d,2H),7.77(d,1H),7.68(m,2H),7.41(m,2H),7.33(m,2H),7.31(m,1H),4.29(m,2H),4.18(m,3H),2.94(m,2H),2.16(m,2H),1.93(m,1H),1.47(m,2H),1.37(m,2H),1.25(m,3H),1.21(m,2H),0.86(m,6H)。
步骤5.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(12S,15S)-1-(9H-芴-9-基)-15-甲基-3,10,13,16,19-五氧代-12-(丙-2-基)-2-氧杂-4,11,14,17,18-五氮杂二十-20-基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B215)：在室温下，向#B214(11.5mg,0.022mmol,1.2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(12.7μL,0.072mmol,4eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(8.5mg,0.022mmol,1.2eq.)，然后添加#B6(10mg,0.018mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液，并使反应搅拌35分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B215。收率：14.6mg,0.014mmol,77％。LCMS(方案D):m/z1056.0[M+H]+,保留时间＝0.94分钟。
步骤6.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{2-[(2S)-2-({(2S)-2-[(6-氨基己酰基)氨基]-3-甲基丁酰基}氨基)丙酰基]肼基}-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯乙酸盐(#B216)：使用制备化合物#B47所述的操作，由20.8mg(0.02mmol,1.0eq.)的#B215和34.1mg(0.4mmol,20.0eq.)的哌啶以85％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 833.9[M+H]+,保留时间＝0.65分钟。
步骤7.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-溴-6-甲基-2,5,8,11,18-五氧代-9-(丙-2-基)-3,4,7,10,17-五氮杂十九烷-1-基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B210)：使用制备化合物#B150所述的操作，由15.2mg(0.017mmol,1eq.)的#B216、6.1mg(0.026mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮和8.9mg(0.068mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以57％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 975.68[M+Na]+,保留时间＝0.76分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.93-9.80(m,2H),8.26-8.19(m,1H),8.14(d,J＝7.8Hz,1H),7.98(d,J＝7.6Hz,1H),7.85-7.73(m,2H),6.56(br s,1H),6.41-6.26(m,2H),6.11(d,J＝11.5Hz,1H),5.86(dd,J＝11.7和7.6Hz,1H),5.61(dd,J＝15.9和5.6Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),5.10-5.03(m,1H),4.39-4.13(m,4H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,2H),3.54-3.45(m,1H),3.25-3.19(m,1H),3.09-3.00(m,2H),2.74(d,J＝5.0Hz,1H),2.58(d,J＝5.0,1H),2.35-2.25(m,2H),2.24-2.05(m,3H),1.98(s,3H),1.96-1.75(m,4H),1.73-1.60(m,4H),1.55-1.33(m,5H),1.29-1.18(m,7H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H),0.87-0.77(m,6H)。
实施例A#72
制备(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基-2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼羧酸酯(#B217)
Figure BDA0000751870110002181
步骤1.合成(2R)-2-(乙酰基硫基)丙酸甲酯(#B218)：在室温下，向硫代乙酸钾(3.9g,34.4mmol,1.2eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(60mL)中的溶液添加S-甲基-2-氯丙酸酯(3.5g,28.7mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(10mL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倾倒入水(150mL)中，并用石油醚(100mL)萃取三次。将萃取物用盐水清洗，经硫酸钠干燥并真空浓缩以得到浅黄色油状的#B218(4.4g,94.8％)。
步骤2.合成(2R)-2-硫基丙-1-醇(#B219)：在0℃下，向LAH(3.4g,89.5mmol,5eq.)在四氢呋喃(116mL)中的悬浮液添加#B218(2.9g,17.9mmol,1eq.)在四氢呋喃(29mL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌1小时。小心地用2N HCl(50mL)中止反应。将混合物用二氯甲烷(100mL)萃取五次，并将萃取物经硫酸钠干燥。将溶液真空浓缩至约150mL，并将溶液在不进一步纯化的情况下直接用于接下来的步骤。
步骤3.合成(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙-1-醇(#B220)：在0℃下，向2,2'-二硫二吡啶(aldrithiol-2，5.9g,26.8mmol,1.5eq.)和乙酸(1.07g,17.9mmol,1eq.)在乙醇(120mL)中的溶液添加#B219在THF(150mL,约17.9mmol,1eq.)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物真空浓缩，并通过用石油醚：乙酸乙酯(10:1 to 4:1)洗脱的硅胶色谱法纯化残留物以得到黄色油，其通过SFC再纯化以得到浅黄色油状的#B220(860mg,24％)。1H NMR(400Hz,CDCl3):8.50(m,1H),7.59(m,1H),7.40(d,1H),7.16(m,1H),5.98(m,1H),3.70(m,1H),3.41(m,1H),3.12(m,1H),1.31(d,3H)。
步骤4.合成4-硝基苯基-(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基碳酸酯(#B221)：在室温下，向#B220(111mg,0.554mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.9mL)中的溶液滴加吡啶(99.4μL,1.22mmol,2.2eq.)，然后滴加4-硝基苯基氯甲酸酯(140mg,0.665mmol,1.2eq.)在二氯甲烷(0.9mL)中的溶液，并将反应搅拌过夜。将反应用二氯甲烷和水稀释，萃取两次并用盐水清洗，并且将合并的有机提取物经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过用二氯甲烷洗脱的硅胶色谱法纯化残留物以得到胶质#B221。收率：45mg,0.123mmol,22％。LCMS(方案D):m/z 367.2[M+H]+,保留时间＝0.99分钟。
步骤5.合成(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基-2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼羧酸酯(#B217)：在室温下，向#B6(9.8mg,0.018mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.1mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(12.7μL,0.072mmol,4eq.)、2,6-二甲基吡啶(8.4μL,0.072mmol,4eq.)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(2.2mg,0.018mmol,1eq.)，添加#B221(10mg,0.027mmol,1.5eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)中的溶液，并使反应搅拌5.5小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B217。收率：5.9mg,0.0076mmol,42％。LCMS(方案D):m/z 777.51[M+H]+,保留时间＝0.84分钟。1H NMR(500MHz,CD3CN)δ8.45-8.38(m,1H),8.15(br s,1H),7.84-7.73(m,2H),7.35(br s,1H),7.16(ddd,J＝7.3,4.9和1.2Hz,1H),6.48-6.28(m,3H),5.97-5.84(m,2H),5.63(dd,J＝15.7和5.9Hz,1H),5.59-5.52(m,1H),4.40-4.26(m,2H),4.20-4.04(m,2H),3.83-3.75(m,1H),3.69-3.61(m,1H),3.56-3.49(m,1H),3.32(d,J＝4.7Hz,1H),3.24(br s,1H),2.79(d,J＝4.9Hz,1H),2.65-2.53(m,2H),2.47-2.38(m,1H),2.36-2.19(m,4H),1.97(s,3H),1.77-1.67(m,4H),1.66-1.58(m,1H),1.35-1.26(m,6H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.98(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#73
制备N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B222)
Figure BDA0000751870110002211
步骤1.合成N2-乙酰基-N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(#B223)：在0℃下，向N6-(叔丁氧羰基)-L-赖氨酸(22.5g,91.5mmol,1eq.)和K2CO3(63.1g,0.457mol,5eq.)在四氢呋喃/水(200mL/200mL)中的混合物添加乙酰氯(8.62g,0.109mol,1.2eq.)，并将混合物在室温下搅拌4小时。将混合物真空浓缩以去除四氢呋喃，并用2M HCl将水层调节至pH＝1，并用EtOAc(100mL)萃取三次。将萃取物用盐水(100mL)清洗，经硫酸钠干燥并真空浓缩以得到黄色油状的#B223(23.1g,87.7％)。
步骤2.合成N2-乙酰基-L-赖氨酸盐酸盐(#B224)：在0℃下，在氮气下，向#B223(23.1g,0.080mmol,1eq.)在乙酸乙酯(400mL)中的溶液添加含HCl(g)的乙酸乙酯(250mL)。将混合物在室温下搅拌4小时并过滤。将固体用乙酸乙酯清洗并真空干燥以得到白色固体状的#B224(18.5g,>100％)，其在不进一步纯化的情况下使用。
步骤3.合成N2-乙酰基-N6-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酸(#B225)：在0℃下，向#B224(8g,35.6mmol,1eq.)和NaHCO3(5.99g,71.3mmol,2eq.)在丙酮/水(80mL/80mL)中的混合物添加Fmoc-Cl(9.41g,36.3mmol,1.02eq.)在丙酮(80mL)中的溶液，并将混合物在室温下搅拌2小时。用2N HCl将混合物调节至pH＝3-4，并用乙酸乙酯(100mL)萃取三次。将萃取物用盐水(100mL)清洗，经硫酸钠干燥并真空浓缩以得到黄色油状的粗制产物(7g)。向粗制产物添加二氯甲烷和对丁基甲醚(100mL)，并将悬浮液搅拌30分钟，然后过滤。将滤饼真空干燥以得到白色固体状的#B225(3.25g,22.2％)。
步骤4.合成N2-乙酰基-N6-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(#B226)：在0℃下，在氮气下，向#B225(1.04g,2.54mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中的混合物添加N-甲基吗啉(769mg,7.61mmol,3eq.)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(632mg,3.30mmol,1.3eq.)、1-羟基苯并三唑水合物(445mg,3.30mmol,1.3eq.)和L-缬氨酰基N5-氨甲酰基-N-[4-(羟甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(来自WO04010957,1.01g,2.66mmol,1.05eq.)，并将混合物在室温下搅拌2小时。将混合物倾倒入叔丁基甲醚(300mL)并过滤。将固体用二氯甲烷(50mL)和水(50mL)清洗，并真空干燥以得到白色固体状的#B226(1.87g,95.6％)。
步骤5.合成N2-乙酰基-N6-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(#B227)：在0℃下，在氮气下，向#B226(1.87g,2.43mmol,1eq.)和双-(4-硝基苯基)碳酸酯(2.21g,7.28mmol,3eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(30mL)中的混合物添加N,N-二异丙基乙胺(313mg,2.43mmol,1eq.)，并将混合物在室温下搅拌过夜。将混合物倾倒入叔丁基甲醚(50mL)并过滤。通过制备型HPLC纯化固体(1.95g)以得到白色固体状的#B227(580mg,25.7％)。1H NMR(400Hz,DMSO-d6):10.1(s,1H),8.29(d,2H),8.00(d,1H),7.86(d,1H),7.65(d,2H),7.64(d,1H),7.61(m,4H),7.40(m,2H),7.38(m,4H),7.30(m,3H),6.01(br,1H),5.21(s,2H),4.35(br,1H),4.27-4.15(m,5H),2.96(m,4H),1.98(m,1H),1.82(s,3H),1.65(br,3H),1.43-1.24(m,7H),0.83(m,6H)。
步骤6.合成N2-乙酰基-N6-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(#B228)：在室温下，向#B209(8.1mg,0.016mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加2,6-二甲基吡啶(7.5μL,0.064mmol,4eq.)、N,N-二异丙基乙胺(11.3μL,0.064mmol,4eq.)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(2mg,0.016mmol,1eq.)，然后添加#B227(17.8mg,0.019mmol,1.2eq.)，并将反应搅拌5小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B228。收率：5.5mg,0.004mmol,26％。LCMS(方案D):m/z 1306.1[M+H]+,保留时间＝0.81分钟。
步骤7.合成N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N5-氨甲酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B222)：使用制备化合物#B47所述的操作，由9.5mg(0.007mmol,1.0eq.)的#B228和11.9mg(0.14mmol,20.0eq.)的哌啶以79％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1084.1[M+H]+,保留时间＝0.58分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.10(s,1H),8.22-8.12(m,1H),8.03(d,J＝7.8Hz,1H),7.87-7.74(m,2H),7.64-7.53(m,2H),7.34-7.18(m,2H),6.31(d,J＝15.9Hz,1H),6.09-6.01(m,1H),5.98(d,J＝11.8Hz,1H),5.86(dd,J＝11.8和7.1Hz,1H),5.66-5.56(m,1H),5.55-5.49(m,1H),5.44(br s,1H),5.23-4.91(m,3H),4.43-4.33(m,1H),4.30-4.21(m,2H),4.20-4.12(m,1H),3.69-3.59(m,1H),3.53-3.45(m,1H),3.07-2.88(m,2H),2.76-2.71(m,1H),2.61-2.56(m,1H),2.35-2.14(m,4H),2.04-1.53(m,18H),1.52-1.18(m,10H),1.11(d,J＝6.4Hz,3H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H),0.85(d,J＝6.9Hz,3H),0.82(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例A#74
制备[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-甲氧基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B229)
Figure BDA0000751870110002241
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B230)：在0℃下，向#B55(66.8mg,0.122mmol,1eq.)在二氯甲烷中的溶液添加2,6-二甲基吡啶(71.1μL,0.61mmol,5eq.)，然后添加叔丁基(氯)二甲基硅烷(86.3μL,0.366mmol,3eq.)，并将反应升温至室温。在1h之后，将反应冷却至0℃，用NaHCO3水溶液中止，用二氯甲烷萃取三次，经硫酸钠干燥，过滤并浓缩。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化残留物以得到胶质的#B230。收率：68mg,0.001mmol,84％。LCMS(方案D):m/z 686.58[M+Na]+,保留时间＝1.16分钟。
步骤2.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B231)：在室温下，向#B230(68mg,0.1mmol,1eq.)在甲醇(1mL)中的溶液添加K2CO3(35.2mg,0.255mmol,2.5eq.)，并使反应搅拌1小时。将反应过滤，用乙酸乙酯清洗。将有机层用水和盐水清洗，经硫酸钠干燥并浓缩。通过用含0.02％乙酸的水(v/v)和含0.02％乙酸的乙腈(v/v)(10％至100％)洗脱的逆相中压液相色谱法纯化残留物以得到白色固体状的#B231。收率：33.2mg,0.053mmol,52％。LCMS(方案D):m/z 622.55[M+H]+,保留时间＝1.09分钟。
步骤3.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-{[叔丁基(二甲基)甲硅烷基]氧基}-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-甲氧基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B232)：在室温下，向#B231(24.7mg,0.04mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液添加MeI(37.5μL,0.6mmol,15eq.)和Ag2O(55.6mg,0.24mmol,6eq.)，并使反应在黑暗中搅拌23小时。添加另外的MeI(38μL,0.6mmol,15eq.)和Ag2O(55mg,0.24mmol,6eq.)，并将反应搅拌另外25小时。将反应经赛力特硅藻土过滤并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B232。收率：9.4mg,0.015mmol,37％。LCMS(方案D):m/z 636.7[M+H]+,保留时间＝1.19分钟。
步骤4.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-甲氧基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B229)：在0℃下，向#B232(12.6mg,0.02mmol,1eq.)在四氢呋喃(0.4mL)中的溶液添加四丁基氟化铵(1M，在四氢呋喃中,20.7μL,0.02mmol,1eq.)，并使反应升温至室温并搅拌1小时。添加另外的四丁基氟化铵(1M，在四氢呋喃中,10.3uL,0.01mmol,0.5eq)，并将反应搅拌45分钟。将反应浓缩，溶解在DMSO中，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B229。收率：4.9mg,0.01mmol,47％。LCMS(方案D):m/z 522.50[M+H]+,保留时间＝0.79分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝8.0Hz,1H),6.28(d,J＝15.8Hz,1H),6.16(d,J＝11.7Hz,1H),5.75(dd,J＝11.7和8.1Hz,1H),5.58(dd,J＝15.8和5.1Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),5.10-4.99(m,2H),4.31-4.21(m,2H),3.69-3.62(m,2H),3.60(s,3H),3.54-3.47(m,1H),3.28-3.22(m,1H),3.14(s,3H),2.76(d,J＝5.1Hz,1H),2.69-2.55(m,3H),2.35-2.14(m,2H),1.90-1.75(m,3H),1.73-1.60(m,4H),1.57-1.48(m,1H),1.12(d,J＝6.4Hz,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#75
制备N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B233)
Figure BDA0000751870110002261
步骤1.合成N2-乙酰基-N6-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B234)：在室温下，向#B6(20.5mg,0.037mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)中的溶液添加2,6-二甲基吡啶(17.3μL,0.148mmol,4eq.)、N,N-二异丙基乙胺(26μL,0.148mmol,4eq.)和4-N,N-二甲基氨基吡啶(4.5mg,0.037mmol,1eq.)，然后添加#B227(45mg,0.048mmol,1.3eq.)，并将反应搅拌4小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B234。收率：18.5mg,0.014mmol,37％。LCMS(方案D):m/z 1348.1[M+H]+,保留时间＝0.88分钟。
步骤2.合成N2-乙酰基-L-赖氨酰基-L-缬氨酰基-N-[4-({[(2-{[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}肼基)羰基]氧基}甲基)苯基]-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B233)：在室温下，向#B234(18.5mg,0.014mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.7mL)中的溶液添加哌啶(27.6μL,0.28mmol,20eq.)，并将反应搅拌20分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体，其通过逆相色谱法(方法C，Phenomenex Luna PFP(2)柱)进一步纯化以得到白色固体状的#B233。收率：8mg,0.07mmol,50％。LCMS(方案D):m/z 1125.91[M+H]+,保留时间＝0.63分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.11(s,1H),8.43(s,1H),8.19-8.11(m,1H),8.05(d,J＝8.1Hz,1H),7.86-7.76(m,2H),7.64-7.53(m,2H),7.34-7.18(m,2H),6.42-6.27(m,2H),6.16-6.04(m,2H),5.86(dd,J＝11.5和7.3Hz,1H),5.66-5.38(m,3H),5.12-4.89(m,3H),4.43-4.33(m,1H),4.32-4.22(m,2H),4.20-4.14(m,1H),3.68-3.59(m,1H),3.54-3.45(m,1H),3.07-2.86(m,2H),2.79-2.72(m,1H),2.71-2.65(m,1H),2.61-2.55(m,1H),2.34-2.14(m,4H),2.04-1.94(m,4H),1.92-1.75(m,7H),1.74-1.54(m,8H),1.53-1.19(m,12H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝7.1Hz,3H),0.86(d,J＝6.8Hz,3H),0.82(d,J＝6.8Hz,3H)。
实施例A#76
制备[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B235)
Figure BDA0000751870110002281
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B235)：在室温下，向#B55(60mg,0.11mmol,1eq.)在甲醇(1mL)中的溶液添加K2CO3(37.7mg,0.273mmol,2.5eq.)，并使反应搅拌1小时。将反应过滤，用乙酸乙酯清洗。将有机层用水和盐水清洗，经硫酸钠干燥并浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以得到白色固体状的#B235。收率：31.2mg,0.06mmol,56％。LCMS(方案D):m/z 530.43[M+Na]+,保留时间＝0.72分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.78(d,J＝7.6Hz,1H),6.28(d,J＝16.0Hz,1H),5.98(d,J＝11.8Hz,1H),5.87(dd,J＝11.8和7.6Hz,1H),5.58(dd,J＝16.0和5.2Hz,1H),5.55-5.49(m,1H),5.23-5.14(m,1H),5.10(d,J＝4.7Hz,1H),5.02(d,J＝6.1Hz,1H),4.31-4.22(m,2H),3.69-3.62(m,2H),3.60(s,3H),3.54-3.47(m,1H),3.28-3.22(m,1H),2.76(d,J＝5.1Hz,1H),2.69-2.55(m,3H),2.35-2.15(m,2H),1.90-1.73(m,3H),1.73-1.61(m,4H),1.57-1.49(m,1H),1.11(d,J＝6.5Hz,3H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.5Hz,3H)。
实施例A#77
制备(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸酯(#B236)
Figure BDA0000751870110002282
步骤1.合成(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸酯(#B236)：在室温下，向#NP1(10.4mg,0.019mmol,1eq.)和#B220(11.5mg,0.057mmol,3eq.)在二氯甲烷(0.3mL)中的溶液添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(2.3mg,0.019mmol,1eq.)和N,N'-二异丙基碳二亚胺(8.9μL,0.057mmol,3eq.)，并使反应搅拌75分钟。将反应浓缩，溶解在DMSO中，并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B236。收率：7.6mg,0.011mmol,55％。LCMS(方案D):m/z 719.58[M+H]+,保留时间＝0.94分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.46-8.40(m,1H),7.86-7.74(m,3H),7.27-7.20(m,1H),6.41-6.32(m,1H),6.27(d,J＝16.1Hz,1H),6.10(dd,J＝11.7和1.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.6Hz,1H),5.61(dd,J＝16.1和5.9Hz,1H),5.52-5.45(m,1H),5.02(d,J＝6.1Hz,1H),4.31-4.20(m,2H),4.18-4.06(m,2H),3.68-3.58(m,2H),3.52-3.44(m,1H),3.28-3.23(m,1H),2.76(d,J＝4.9Hz,1H),2.70(dd,J＝15.2和9.3Hz,1H),2.62-2.53(m,2H),2.34-2.14(m,2H),1.98(s,3H),1.86-1.72(m,4H),1.70-1.59(m,4H),1.29-1.21(m,6H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#78
制备N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B237)
Figure BDA0000751870110002301
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B238)：在室温下，向#NP1(20.4mg,0.038mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.4mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(40.2μL,0.228mmol,6eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(19mg,0.049mmol,1.3eq.)，然后添加#B182(34.2mg,0.038mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.7mL)中的溶液，并使反应搅拌45分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B238。收率：16.1mg,0.012mmol,33％。LCMS(方案D):m/z 1305.3[M+H]+,保留时间＝0.92分钟。
步骤2.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B239)：使用制备化合物#B47所述的操作，由16.1mg(0.012mmol,1.0eq.)的#B238和20.4mg(0.24mmol,20.0eq.)的哌啶以88％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1083.1[M+H]+,保留时间＝0.67分钟。
步骤3.合成N-{6-[(溴乙酰基)氨基]己酰基}-L-缬氨酰基-N-{4-[({[({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)甲基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B237)：使用制备化合物#B150所述的操作，由11.5mg(0.011mmol)的#B239和4mg(0.017mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮以及5.7mg(0.044mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以62％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1203.2[M+H]+,保留时间＝0.77分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.99(s,1H),8.45-8.37(m,1H),8.28-8.20(m,1H),8.15-8.05(m,1H),7.86-7.73(m,2H),7.62-7.54(m,2H),7.31-7.22(m,2H),6.41-6.33(m,1H),6.30(d,J＝15.9Hz,1H),6.11(dd,J＝11.6和1.5Hz,1H),6.02-5.94(m,1H),5.86(dd,J＝11.6和7.6Hz,1H),5.60(dd,J＝15.9和5.6Hz,1H),5.56-5.48(m,1H),5.41(s,2H),5.04(d,J＝5.4Hz,1H),4.95(s,2H),4.43-4.15(m,5H),3.81(s,2H),3.69-3.60(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.25-3.18(m,1H),3.09-2.88(m,4H),2.73(d,J＝5.0Hz,1H),2.57(d,J＝5.0Hz,1H),2.34-2.08(m,5H),2.03-1.91(m,4H),1.91-1.74(m,4H),1.73-1.30(m,12H),1.29-1.18(m,4H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(d,J＝6.6Hz,3H),0.83(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例A#79
制备[(3R,5S,7R,8R)-8-甲氧基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-甲氧基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B240)
Figure BDA0000751870110002321
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-8-甲氧基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-甲氧基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B240)：在室温下，向#B235(24.2mg,0.048mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液添加MeI(45μL,0.7mmol,15eq.)和Ag2O(66.7mg,0.29mmol,6eq.)，并使反应在黑暗中搅拌23小时。添加另外的MeI(45μL,0.7mmol,15eq.)和Ag2O(67mg,0.29mmol,6eq.)，并将反应搅拌另外24小时。将反应经赛力特硅藻土过滤并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B240。收率：12.2mg,0.023mmol,48％。LCMS(方案D):m/z 536.7[M+H]+,保留时间＝0.90分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ7.75(d,J＝8.0Hz,1H),6.36(d,J＝15.8Hz,1H),6.16(d,J＝11.7Hz,1H),5.75(dd,J＝11.7和8.1Hz,1H),5.62-5.50(m,2H),5.10-4.99(m,1H),4.58-4.51(m,1H),4.28-4.18(m,1H),3.70-3.62(m,2H),3.60(s,3H),3.55-3.47(m,1H),3.32(s,3H),3.14(s,3H),2.96-2.91(m,1H),2.70-2.63(m,2H),2.58-2.52(m,1H),2.35-2.16(m,2H),2.06-1.97(m,1H),1.88-1.75(m,2H),1.73-1.60(m,4H),1.18-1.09(m,4H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.96(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#80
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(氨甲酰基氨基)甲基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B241)以及(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{[(丙基氨甲酰基)氨基]甲基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B242)
Figure BDA0000751870110002331
步骤1.制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B243)：在室温下，向#NP1(25.6mg,0.048mmol,1eq.)在二氯甲烷(1mL)中的溶液添加乙胺(7.3mg,0.072mmol,1.5eq.)，然后添加叠氮磷酸二苯酯(11.7μL,0.053mmol,1.1eq.)，并使反应搅拌20小时。将反应用二氯甲烷稀释，用5％NaHCO3(aq.)清洗三次，经硫酸钠干燥并真空浓缩以得到黄色油。将油溶解在乙腈(1mL)中并加热至50℃，持续1小时。将反应冷却以得到在乙腈中的溶液形式的#B243，其在不进一步纯化的情况下使用。推定完全转化。LCMS(方案D):m/z 533.6[M+H]+,保留时间＝0.88分钟。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(氨甲酰基氨基)甲基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B241)：在室温下，向#B243(12.8mg,0.024mmol,1eq.)在乙腈(0.5mL)中的溶液添加NH3(7M，在甲醇中,34.3μL,0.24mmol,10eq.)，并使反应搅拌30分钟。将反应浓缩，用DMSO稀释并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B241。收率：6.7mg,0.012mmol,51％。LCMS(方案D):m/z 550.6[M+H]+,保留时间＝0.72分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝8.2Hz,1H),6.41-6.25(m,2H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),6.02-5.94(m,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.4Hz,1H),5.64(dd,J＝16.0和5.9Hz,1H),5.57-5.50(m,1H),5.46(br s,1H),5.01(d,J＝5.9Hz,1H),4.32-4.23(m,1H),3.88-3.77(m,1H),3.70-3.60(m,2H),3.55-3.46(m,1H),3.25-3.04(m,3H),2.75(d,J＝5.1Hz,1H),2.60(d,J＝5.1Hz,1H),2.35-2.13(m,2H),1.98(s,3H),1.88-1.59(m,8H),1.46-1.37(m,1H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.95(d,J＝7.0Hz,3H)。
步骤3.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{[(丙基氨甲酰基)氨基]甲基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B242)：在室温下，向#B243(9mg,0.02mmol,1eq.)在乙腈(0.5mL)中的溶液添加正丙胺(7μL,0.085mmol,5eq.)，并将反应搅拌10分钟。将反应用DMSO(0.7ml)稀释，真空浓缩并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B242。收率：8mg,0.014mmol,80％。LCMS(方案D):m/z 592.7[M+H]+,保留时间＝0.80分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)
Figure BDA0000751870110002342
d,J＝8.1Hz,1H),6.41-6.32(m,1H),6.28(d,J＝16.0Hz,1H),6.11(d,J＝11.7Hz,1H),6.00-5.93(m,1H),5.91-5.81(m,2H),5.62(dd,J＝16.0和5.6Hz,1H),5.54-5.46(m,1H),5.02(d,J＝5.6Hz,1H),4.31-4.25(m,1H),3.86-3.77(m,1H),3.69-3.59(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.26-3.08(m,3H),2.97-2.88(m,2H),2.75(d,J＝5.1Hz,1H),2.60(d,J＝5.1Hz,1H),2.35-2.15(m,2H),1.98(s,3H),1.88-1.75(m,3H),1.73-1.60(m,4H),1.44-1.30(m,3H),1.25(d,J＝6.6Hz,3H),1.07(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H),0.82(app t,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#81
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{[({[(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基]氧基}羰基)氨基]甲基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B244)
Figure BDA0000751870110002341
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-4-羟基-7-{[({[(2R)-2-(吡啶-2-基二硫基)丙基]氧基}羰基)氨基]甲基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B244)：在室温下，向#B147(8.2mg,0.014mmol,1eq.)在二氯甲烷(0.4mL)中的溶液添加三乙胺(12.3μL,0.088mmol,6.3eq.)，然后添加含#B221(9.4mg,0.026mmol,1.9eq.)的二氯甲烷(0.3mL)，并将反应搅拌30分钟。添加4-N,N-二甲基氨基吡啶(1mg,0.008mmol,0.6eq.)，并使反应搅拌2小时。将反应浓缩，溶解在DMSO(800uL)中并通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B244。收率：4mg,0.005mmol,40％。LCMS(方案D):m/z 734.33[M+H]+,保留时间＝0.91分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.46-8.40(m,1H),7.85-7.76(m,2H),7.36-7.29(m,1H),7.26-7.20(m,1H),6.41-6.32(m,1H),6.25(d,J＝15.8Hz,1H),6.11(d,J＝11.6Hz,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.6Hz,1H),5.61(dd,J＝15.8和6.0Hz,1H),5.50-5.43(m,1H),4.98(d,J＝6.2Hz,1H),4.29-4.22(m,1H),4.10-4.03(m,1H),4.01-3.85(m,2H),3.67-3.57(m,2H),3.52-3.44(m,1H),3.28-3.21(m,1H),3.02-2.93(m,1H),2.76(d,J＝5.1Hz,1H),2.57(d,J＝5.1Hz,1H),2.34-2.13(m,2H),1.98(s,3H),1.85-1.53(m,9H),1.28-1.20(m,6H),1.05(d,J＝6.2Hz,3H),0.93(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#82
制备N-(24-溴-23-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十四烷-1-酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)乙基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B245)
Figure BDA0000751870110002361
步骤1.合成1-羟基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(#B246)：将3,6,9,12,15-五氧杂十七烷-1,17-二醇(25g,88.7mmol,1eq.)、丙-2-烯酸叔丁酯(11.3g,88.7mmol,1eq.)和苄基三甲基氢氧化铵(2.5mL)的混合物在50℃搅拌过夜。通过用乙酸乙酯：二氯甲烷(4％～10％)洗脱的硅胶色谱法纯化反应混合物以得到黄色油状的#B246(9.63g,25.7％)。
步骤2.合成1-{[(4-甲基苯基)磺酰基]氧基}-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(#B247)：在0℃下，向#B246(9.63g,23.5mmol,1eq.)和三乙胺(3.56g,35.2mmol,1.5eq.)在二氯甲烷(150mL)中的溶液添加4-甲基苯磺酰氯(6.69g,35.2mmol,1.5eq.)，并将溶液在室温下搅拌过夜。将反应混合物用NaHCO3水溶液(150mL)清洗，并将水相用乙酸乙酯(200mL×3)再萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并真空浓缩，并通过用甲醇：二氯甲烷(0.5％～0.8％)洗脱的硅胶柱色谱法纯化残留物以得到黄色油状的#B247(9.21g,69.7％)。
步骤3.合成1-叠氮基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(#B248)：向#B247(13.0g,23.0mmol,1eq.)在丙酮/水(150mL/150mL)中的溶液添加叠氮化钠(3.20g,49.2mmol,2.1eq.)和碘化钠(621mg,3.45mmol,0.15eq.)，并将反应在回流下搅拌过夜。将反应混合物用乙酸乙酯(150mL×3)萃取，并将有机相真空浓缩。通过用乙酸乙酯：石油醚(12％-35％)洗脱的硅胶色谱法纯化残留物以得到黄色油状的#B248(8.30g,83.1％)。
步骤4.合成1-氨基-3,6,9,12,15,18-六氧杂二十一烷-21-酸叔丁酯(#B249)：在室温下，在氢气球下，将#B248(8.30g,19.1mmol,1eq.)和Pd/C(1.0g)在甲醇中的悬浮液搅拌过夜。将反应混合物过滤，并将滤液真空浓缩以得到黄色油状的#B249(7.80g,100％)，其直接用于接下来的步骤。
步骤5.合成1-溴-2-氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-3-氮杂二十四烷-24-酸叔丁酯(#B250)：在0℃下，向#B249(5.80g,14.1mmol,1eq.)在二氯甲烷(300mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(5.50g,42.6mmol,3eq.)和溴乙酰溴(4.24g,21.3mmol,1.5eq.)，并将反应在0℃搅拌15分钟。将反应混合物浓缩至干燥，并通过用甲醇：二氯甲烷(0.5-0.8％)洗脱的硅胶柱色谱法纯化残留物以得到黄色固体状的#B250(5.20g,69.3％)。
步骤6.合成1-溴-2-氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-3-氮杂二十四烷-24-酸(#B251)：在0℃下，向#B250(5.20g,9.80mmol,1eq.)在二氯甲烷(100mL)中的溶液添加三氟乙酸(100mL)，并将溶液在室温下搅拌3小时。将反应混合物真空浓缩以得到黄色油状的#B251(6.00g,100％)。
步骤7.合成1-溴-2-氧代-6,9,12,15,18,21-六氧杂-3-氮杂二十四烷-24-酸五氟苯酯(#B252)：在0℃下，向#B251(4.65g,9.80mmol,1eq.)和三氟乙酸五氟苯酯(4.12g,14.7mmol,1.5eq.)在二氯甲烷(150mL)中的溶液滴加吡啶(4.65g,9.80mmol,1.5eq.)，并将溶液搅拌30分钟。将反应混合物用2M HCl(150mL×2)清洗，并将水相用二氯甲烷(150mL×2)萃取。将合并的有机层经硫酸钠干燥并真空浓缩，并通过用甲醇：二氯甲烷(1.5-2％)洗脱的硅胶柱色谱法纯化残留物以得到黄色油，其通过制备型HPLC进一步纯化以得到黄色油状的#B252(1.20g,19.1％)。1H NMR(400MHz,CDCl3)7.06(br,1H),3.89(m,4H),3.69-3.59(m,22H),3.58(m,2H),2.96(m,2H)。
步骤8.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)乙基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B253)：在室温下，向#B51(18.5mg,0.032mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(22.5μL,0.128mmol,4eq.)，然后添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基N5-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(29.1mg,0.038mmol,1.2eq.)，并将反应搅拌70分钟。添加另外的N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基N5-氨甲酰基-N-[4-({[(4-硝基苯氧基)羰基]氧基}甲基)苯基]-L-鸟氨酰胺(4.9mg,0.006mmol,0.2eq.)，并将反应搅拌另外的30分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B253。收率：13.1mg,0.011mmol,34％。LCMS(方案D):m/z1206.2[M+H]+,保留时间＝0.91分钟。
步骤9.合成L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)乙基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B254)：使用制备化合物#B47所述的操作，由13.1mg(0.011mmol,1.0eq.)的#B253和18.7mg(0.22mmol,20.0eq.)的哌啶以76％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 984.0[M+H]+,保留时间＝0.67分钟。
步骤10.合成N-(24-溴-23-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十四烷-1-酰基)-L-缬氨酰基-N-{4-[({[2-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)乙基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B245)：在室温下，向#B254(8.2mg,0.008mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.15mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(5.7μL,0.032mmol,4eq.)，然后添加含#B252(7.5mg,0.012mmol,1.5eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)，并使反应在室温下搅拌30分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B245。收率：5.4mg,0.0038mmol,47％。LCMS(方案D):m/z 1440.72[M+H]+,保留时间＝0.75分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),8.38-8.28(m,1H),8.17-8.07(m,1H),7.96-7.90(m,1H),7.90-7.84(m,1H),7.83-7.76(m,1H),7.64-7.54(m,2H),7.32-7.23(m,2H),7.21-7.12(m,1H),6.41-6.32(m,1H),6.28(d,J＝15.8Hz,1H),6.11(dd,J＝11.7和1.2Hz,1H),6.02-5.94(m,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.6Hz,1H),5.60(dd,J＝15.8和5.6Hz,1H),5.56-5.46(m,1H),5.41(s,2H),5.03(d,J＝5.6Hz,1H),4.93(s,2H),4.41-4.34(m,1H),4.29-4.18(m,2H),3.85(s,2H),3.69-3.55(m,4H),3.54-3.45(m,22H),3.43-3.39(m,2H),3.27-3.19(m,2H),3.16-2.89(m,6H),2.74(d,J＝5.2Hz,1H),2.58(d,J＝5.2Hz,1H),2.42-2.14(m,5H),2.01-1.91(m,4H),1.88-1.75(m,3H),1.73-1.53(m,6H),1.52-1.30(m,4H),1.25(d,J＝6.4Hz,3H),1.06(d,J＝6.1Hz,3H),0.94(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H),0.83(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例A#83
制备N-(24-溴-23-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十四烷-1-酰基)-L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[反式-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环己基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B255)
Figure BDA0000751870110002401
步骤1.合成反式-4-[(叔丁氧羰基)氨基]环己基(2E)-3-(2-硝基苯基)丙-2-烯酸酯(#B257)：向(2E)-3-(2-硝基苯基)丙-2-烯酸(8.26g,55.8mmol,1eq.)在二氯甲烷(100mL)中的溶液添加#B256(12g,55.8mmol,1eq.)，然后添加1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺-HCl(10.9g,55.8mmol,1eq.)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(680mg,5.58mmol,0.1eq.)和三乙胺(23mL,167.7mmol,3eq.)，并将反应在室温下搅拌17小时。将反应浓缩并通过用石油醚/乙酸乙酯(4:1)洗脱的快速柱色谱法纯化以得到白色固体状的#B257(8.8g,40％)。
步骤2.合成反式-4-[(叔丁氧羰基)氨基]环己基(2E)-3-(2-氨基苯基)丙-2-烯酸酯(#B258)：向#B257(7.8g,20mmol,1eq.)在乙酸乙酯(150mL)中的溶液添加SnCl2二水合物(25g,0.11mol,5.5eq.)，并将反应搅拌16小时。用NaHCO3水溶液将溶液pH调节至pH＝8-9，并过滤。将滤饼用乙酸乙酯/甲醇清洗三次，并将合并的有机层用盐水清洗，经硫酸钠干燥并真空浓缩。通过用石油醚/乙酸乙酯(4:1)和乙酸乙酯/甲醇(20:1)洗脱的快速柱色谱法纯化残留物以得到黄色固体状的#B255(850mg,12％)。
步骤3.合成反式-4-[(叔丁氧羰基)氨基]环己基3-(2-氨基苯基)丙酸酯(#B259)：在室温下，向#B258(800mg,2.2mmol,1eq.)在乙酸乙酯(10mL)中的溶液添加Pd/C(1g)，并将混合物在氢气(35psi)下搅拌30分钟。将反应过滤并真空浓缩以得到白色固体状的粗制#B259(500mg,63％)，其在不进一步纯化的情况下使用。
步骤4.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-{2-[3-({反式-4-[(叔丁氧羰基)氨基]环己基}氧基)-3-氧代丙基]苯基}-L-丙氨酰胺(#B260)：在室温下，向#B259(400mg,1.1mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(20mL)中的溶液添加N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基L-丙氨酸(453mg,1.1mmol,1eq.)、4-N,N-二甲基氨基吡啶(12mg,0.1mmol,0.1eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(460mg,1.2mmol,1.1eq.)，并将反应搅拌3天。将反应混合物倾倒入水中并用乙酸乙酯萃取三次。将合并的有机层经硫酸钠上干燥并浓缩。通过用二氯甲烷/甲醇(20:1至10:1)洗脱的快速柱色谱法纯化残留物以得到白色固体状的#B260(110mg,13％)。1H NMR(500MHz,CDCl3)δ9.18(s,1H),7.77(m,3H),7.61(d,2H),7.40(m,4H),7.15(m,3H),6.77(m,1H),5.47(d,1H),4.73(m,2H),4.45(m,4H),4.24(m,1H),3.11(q,1H),2.85(m,2H),2.69(m,2H),2.17(m,2H),1.97(m,4H),1.65(m,1H),1.56(m,3H),1.43(m,11H),1.25(m,4H),0.98(m,6H)。
步骤5.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-(2-{3-[(反式-4-氨基环己基)氧基]-3-氧代丙基}苯基)-L-丙氨酰胺三氟乙酸盐(#B261)：在0℃下，向#B260(34.8mg,0.046mmol,1.0eq)添加预先冷却的三氟乙酸(0.8mL)，并且随着其升温至室温，使反应搅拌10分钟。将反应浓缩，溶解在乙腈中并在浓缩三次以得到胶质的#B261，其在不进一步纯化的情况下用于接下来的步骤。推定完全转化。LCMS(方案D):m/z 655.8[M+H]+,保留时间＝0.81分钟。
步骤6.合成N-[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]-L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[反式-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环己基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B262)：在室温下，向#B4(14.1mg,0.029mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(30.6μL,0.17mmol,6eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(13.6mg,0.035mmol,1.2eq.)，并将反应搅拌5分钟。添加#B261(35.4mg,0.046mmol,1.6eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.6mL)中的溶液，并使反应搅拌30分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B262。收率：22.8mg,0.02mmol,70％。LCMS(方案D):m/z 1131.2[M+H]+,保留时间＝0.96分钟。
步骤7.合成L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[反式-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环己基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B263)：使用制备化合物#B47所述的操作，由22.8mg(0.02mmol,1.0eq.)的#B262和34.1mg(0.40mmol,20.0eq.)的哌啶以88％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 908.54[M+H]+,保留时间＝0.64分钟。
步骤8.合成N-(24-溴-23-氧代-4,7,10,13,16,19-六氧杂-22-氮杂二十四烷-1-酰基)-L-缬氨酰基-N-[2-(3-{[反式-4-({[(3R,5S,7R,8R)-8-羟基-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环己基]氧基}-3-氧代丙基)苯基]-L-丙氨酰胺(#B255)：在室温下，向#B263(16.1mg,0.018mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.2mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(12.7μL,0.072mmol,4eq.)，然后添加含#B252(9.4mg,0.034mmol,1.9eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)，并使反应在室温下搅拌15分钟。添加另外的含#B252(8.8mg,0.014mmol,0.75eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.3mL)，并将反应搅拌另外15分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B255。收率：14.4mg,0.011mmol,59％。LCMS(方案D):m/z 1365.75[M+H]+,保留时间＝0.78分钟。1HNMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.40(s,1H),8.37-8.29(m,1H),8.15(d,J＝7.1Hz,1H),7.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.82-7.74(m,2H),7.29-7.09(m,4H),6.28(d,J＝15.9Hz,1H),5.98(d,J＝10.5Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.1Hz,1H),5.60(dd,J＝15.9和5.6Hz,1H),5.54-5.46(m,1H),5.22-5.13(m,1H),5.11(d,J＝4.7Hz,1H),5.02(d,J＝5.1Hz,1H),4.61-4.52(m,1H),4.51-4.42(m,1H),4.30-4.17(m,3H),3.85(s,2H),3.69-3.37(m,25H),3.27-3.19(m,3H),2.88-2.72(m,3H),2.57(d,J＝5.1Hz,1H),2.42-2.13(m,5H),2.01-1.91(m,2H),1.88-1.59(m,10H),1.53-1.43(m,1H),1.40-1.16(m,7H),1.11(d,J＝6.4Hz,3H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.96(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(d,J＝6.9Hz,3H),0.83(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例A#84
制备[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-甲氧基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B265)以及[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-甲氧基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B264)
Figure BDA0000751870110002431
步骤1.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-甲氧基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B265)：在室温下，向#NP1(32.9mg,0.061mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.7mL)中的溶液添加MeI(114μL,1.83mmol,30eq.)和Ag2O(170mg,0.73mmol,12eq.)，并使反应在黑暗中搅拌72小时。将反应经赛力特硅藻土过滤，用N,N-二甲基甲酰胺(0.8mL)清洗，并分成两份。一份转向步骤2，而另一份通过逆相色谱法(方法A)纯化以得到白色固体状的#B265。收率：4.66mg,0.008mmol,14％。LCMS(方案D):m/z 564.39[M+H]+,保留时间＝0.90分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.79(d,J＝7.8Hz,1H),6.41-6.31(m,2H),6.11(dd,J＝11.7和1.2Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.8Hz,1H),5.63-5.51(m,2H),4.58-4.51(m,1H),4.28-4.18(m,1H),3.70-3.57(m,5H),3.55-3.47(m,1H),3.33(s,3H),2.96-2.91(m,1H),2.71-2.63(m,2H),2.37-2.15(m,2H),2.07-1.94(m,4H),1.88-1.75(m,2H),1.73-1.60(m,4H),1.25(d,J＝6.2Hz,3H),1.19-1.11(m,1H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.0Hz,3H)。
步骤2.合成[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-羟基戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-甲氧基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸甲酯(#B264)：在室温下，向#B265(20mg,0.035mmol,1eq.)在甲醇(0.6mL)中的溶液添加K2CO3(12.2mg,0.088mmol,2.5eq.)，并使反应搅拌45分钟。将反应过滤，用乙酸乙酯清洗。将有机层用水和盐水清洗，经硫酸钠干燥并浓缩。通过逆相色谱法(方法A)纯化残留物以得到白色固体状的#B264。收率：4.2mg,0.008mmol,23％。LCMS(方案D):m/z 522.40[M+Na]+,保留时间＝0.81分钟。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ7.76(d,J＝7.8Hz,1H),6.36(d,J＝14.4Hz,1H),5.98(d,J＝11.7Hz,1H),5.87(dd,J＝11.7和7.0Hz,1H),5.63-5.50(m,2H),5.22-5.08(m,2H),4.58-4.52(m,1H),4.28-4.18(m,1H),3.70-3.57(m,5H),3.55-3.47(m,1H),3.32(s,3H),2.96-2.91(m,1H),2.71-2.63(m,2H),2.37-2.16(m,2H),2.06-1.96(m,1H),1.89-1.59(m,6H),1.20-1.02(m,7H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例A#85
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-氨甲酰基苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B266)
Figure BDA0000751870110002451
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-氨甲酰基苄基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B266)：在室温下，向#B1(18.7mg,0.03mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(21.2μL,0.12mmol,2eq.)和4-(氨基甲基)苯甲酰胺盐酸盐(11.2mg,0.06mmol,2eq.)，并将反应搅拌1小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B266。收率：15.4mg,0.023mmol,77％。LCMS(方案D):m/z 668.37[M+Na]+,保留时间＝0.71分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ8.50-8.43(m,1H),7.88(s,1H),7.82-7.74(m,3H),7.33-7.25(m,3H),6.41-6.27(m,2H),6.10(d,J＝11.6Hz,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.5Hz,1H),5.62(dd,J＝15.8和5.5Hz,1H),5.50-5.43(m,1H),5.04(d,J＝5.4Hz,1H),4.43-4.20(m,3H),3.68-3.59(m,2H),3.53-3.45(m,1H),3.29-3.23(m,1H),2.78(d,J＝5.3Hz,1H),2.68-2.56(m,2H),2.35-2.13(m,3H),1.98(s,3H),1.90-1.72(m,4H),1.70(s,3H),1.66-1.58(m,1H),1.57-1.49(m,1H),1.25(d,J＝6.5Hz,3H),1.04(d,J＝6.2Hz,3H),0.93(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例A#86
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-氨甲酰基苯基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B267)
Figure BDA0000751870110002461
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(4-氨甲酰基苯基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B267)：在室温下，向#NP1(12.4mg,0.023mmol,1eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(20.2μL,0.12mmol,5eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(10.9mg,0.028mmol,1.2eq.)，并将反应搅拌5分钟。添加4-氨基苯甲酰胺(6.3mg,0.046mmol,2eq.)，并使反应搅拌1小时。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B267。收率：4.5mg,0.007mmol,30％。LCMS(方案D):m/z 654.37[M+H]+,保留时间＝0.73分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ10.21(s,1H),7.88-7.75(m,3H),7.70-7.62(m,2H),7.23(s,1H),6.41-6.32(m,1H),6.26(d,J＝16.1Hz,1H),6.10(d,J＝11.6Hz,1H),5.87(dd,J＝11.6和7.6Hz,1H),5.58(dd,J＝16.1和5.3Hz,1H),5.43-5.34(m,1H),5.08(d,J＝5.4Hz,1H),4.42-4.29(m,2H),3.70-3.59(m,2H),3.48-3.40(m,1H),3.30-3.26(m,1H),2.81-2.73(m,2H),2.62(d,J＝5Hz,1H),2.31-2.12(m,2H),1.98(s,3H),1.96-1.88(m,1H),1.87-1.74(m,2H),1.68(s,3H),1.63-1.50(m,2H),1.25(d,J＝6.5Hz,3H),1.06(d,J＝6.2Hz,3H),0.93(d,J＝7.5Hz,3H)。
实施例A#87
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-溴-6-甲基-2,5,8,11,18-五氧代-9-(丙-2-基)-3,4,7,10,17-五氮杂十九烷-1-基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B268)
Figure BDA0000751870110002471
步骤1.合成N-(6-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}己酰基)-L-缬氨酰基-N-(4-{9-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3,7-二氧代-2-氧杂-4,6,8-三氮杂壬-1-基}苯基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B269)：向#B243(19.7mg,0.037mmol,1eq.)在乙腈(1mL)中的溶液添加N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)，并将乙腈真空去除。向该溶液添加N,N-二异丙基乙胺(32.6μL,0.19mmol,5eq.)，然后添加#B182(40.5mg,0.045mmol,1.22eq.)的溶液，并将反应搅拌30分钟。添加另外的N,N-二异丙基乙胺(32.6μL,0.19mmol,5eq.)，并将反应搅拌另外70分钟。通过逆相色谱法(方法A)纯化反应以得到白色固体状的#B269。收率：12mg,0.009mmol,25％。LCMS(方案D):m/z 1320.4[M+H]+,保留时间＝0.91分钟。
步骤2.合成N-(6-氨基己酰基)-L-缬氨酰基-N-(4-{9-[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3,7-二氧代-2-氧杂-4,6,8-三氮杂壬-1-基}苯基)-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺乙酸盐(#B270)：使用制备化合物#B47所述的操作，由19.8mg(0.015mmol,1.0eq.)的#B269和25.5mg(0.3mmol,20.0eq.)的哌啶以69％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1097.78[M+H]+,保留时间＝0.64分钟。
合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-7-[(6S,9S)-19-溴-6-甲基-2,5,8,11,18-五氧代-9-(丙-2-基)-3,4,7,10,17-五氮杂十九烷-1-基]-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B268)：使用制备化合物#B150所述的操作，由12mg(0.01mmol,1eq.)的#B270、3.5mg(0.015mmol,1.5eq)的1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮和5.2mg(0.04mmol,4.0eq)的N,N-二异丙基乙胺以64％的收率制备题述化合物。LCMS(方案D):m/z 1217.43[M+H]+,保留时间＝0.75分钟。1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δ9.98(s,1H),8.27-8.20(m,1H),8.08(d,J＝7.3Hz,1H),7.84-7.73(m,2H),7.62-7.54(m,2H),7.30-7.23(m,2H),6.65-6.57(m,1H),6.41-6.32(m,1H),6.29(d,J＝15.9Hz,1H),6.16-6.07(m,2H),6.01-5.93(m,1H),5.86(dd,J＝11.5和7.6Hz,1H),5.63(dd,J＝15.9和5.6Hz,1H),5.55-5.47(m,1H),5.41(s,2H),5.01(d,J＝5.9Hz,1H),4.94(s,1H),4.43-4.16(m,4H),3.81(s,2H),3.69-3.59(m,2H),3.54-3.45(m,1H),3.26-3.10(m,3H),3.08-2.88(m,4H),2.74(d,J＝5.0Hz,1H),2.60(d,J＝5.0Hz,1H),2.35-2.09(m,6H),2.01-1.92(m,4H),1.87-1.75(m,4H),1.74-1.30(m,14H),1.29-1.19(m,4H),1.06(d,J＝6.4Hz,3H),0.95(d,J＝7.3Hz,3H),0.86(d,J＝6.6Hz,3H),0.83(d,J＝6.9Hz,3H)。
实施例#A88
制备(2E)-4-氨基-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]戊-2-烯酰胺(#B271)以及(2Z)-4-氨基-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]戊-2-烯酰胺(#B272)
Figure BDA0000751870110002491
步骤1.合成(2E)-4-氨基-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]戊-2-烯酰胺(#B271)以及(2Z)-4-氨基-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]戊-2-烯酰胺(#B272)：向100mM磷酸钠缓冲液pH 7.4(3.57ml)添加#B129(7mg，在0.23ml DMSO中，1eq.)、异丙胺(1.475ml的在磷酸盐缓冲液pH 3中制成的1M溶液,得到pH约7的溶液,100eq.)、磷酸吡哆醛(0.295ml的在磷酸盐缓冲液pH 7.4中的50mM溶液,1eq.)和ATA-P2-B01酶制剂(33mg,在0.33ml磷酸盐缓冲液pH7.4中,Codexis,lot#D11134,对苯乙酮有R-选择性)。在30℃、200rpm孵育19小时之后，用氢氧化钠将pH调节至约12，并将反应用等体积的乙酸乙酯萃取7次。将溶剂减压蒸发，将残留物再悬浮于0.25ml乙腈/水1:1中，过滤并通过逆相色谱法共计运行10次(方法I)而纯化。将保留时间为10分钟和13分钟的流分收集并用氢氧化铵中和，然后冻干以分别得到白色固体状的#B271和#B272。
#B271；(收率1.6mg).HPLC(方案P):保留时间＝6.5分钟；HRESIMS m/z观察为476.3124[M+H]+(对C26H42N3O5预测为m/z 476.3124)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J inHz)δ7.55(d,J＝8.2Hz,1H),7.32(br s,1H),6.77(br s,1H),6.54(dd,J＝15.6和6.2Hz,1H),6.27(d,J＝16.0Hz,1H),6.21(dd,J＝15.4和1.2Hz,1H),5.59(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.51(br t,J＝7.0Hz,1H),4.54(br q,J＝5.5Hz,1H),4.30(m,1H),3.69(m,1H),3.64(m,1H),3.50(m,1H),3.42(m,1H),2.62(m,2H),2.58-2.52(m,1H),2.34-2.27(m,2H),2.24-2.17(m,2H),1.85-1.73(m,4H),1.70(s,3H),1.64(m,2H),1.37(dd,J＝13.1和6.2Hz,1H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),1.05(d,J＝6.2Hz,3H),0.96(d,J＝7.4Hz,3H)。
#B272(收率1.1mg)HPLC(方案P):保留时间＝6.85分钟；HRESIMS m/z 476.3131[M+H]+(对C26H42N3O5预测为m/z 476.3124)；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.76(d,J＝7.8Hz,1H),7.32(br s,1H),6.77(br s,1H),6.27(d,J＝15.6Hz,1H),5.88(br d,J＝11.7,1H),5.73(dd,J＝11.5和8.4Hz,1H),5.59(dd,J＝16.0和5.5Hz,1H),5.51(br t,J＝6.6Hz,1H),4.54(br q,J＝5.5Hz,1H),4.47(m,J＝7.0Hz,1H),4.30(m,1H),3.65(m,2H),3.50(m,1H),2.62(m,2H),2.55(m,1H),2.34-2.27(m,2H),2.24-2.18(m,2H),1.83-1.75(m,2H),1.70(s,3H),1.65(m,3H),1.38(dd,J＝13.3和6.2Hz,1H),1.24(br s,1H),1.07(d,J＝6.2Hz,3H),1.02(d,J＝6.6Hz,3H),0.95(d,J＝7.4Hz,3H)。
实施例#A89
制备(2E)-4-氨基-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]戊-2-烯酰胺(#B273)
Figure BDA0000751870110002501
步骤1.合成(2E)-4-氨基-N-[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3S,5S,7S)-7-(2-氨基-2-氧代乙基)-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]戊-2-烯酰胺(#B273)：向#B129(2.9mg,in 0.1ml DMSO,1eq.)添加磷酸吡哆醛(0.125ml的在磷酸缓冲液pH 7.4中的50mM溶液,1eq.)，以及在45℃、200rpm预先孵育1小时的异丙胺(0.625ml的在磷酸盐缓冲液pH 3中制得的1M溶液,得到pH约7的溶液,100eq.)、ATA-251酶制剂(15mg,在0.15ml磷酸盐缓冲液pH 7.4中,Codexis,lot#D11140,对苯乙酮有S-选择性)和100mM磷酸钠缓冲液pH 7.4(1.6ml)的混合物。在37℃、200rpm孵育22小时之后，用氢氧化钠将pH调节至约12，并将反应用等体积的乙酸乙酯萃取7次。将溶剂减压蒸发，将残留物再悬浮于0.25ml乙腈/水1:1中，过滤并通过逆相色谱法共计运行4次(方法J)而纯化。将保留时间为9分钟的流分收集并用氢氧化铵中和，然后冻干以得到白色固体状的#B273。收率：0.7mg.HPLC(方案P):保留时间＝6.6分钟；HRESIMS m/z 476.3126[M+H]+(对C26H42N3O5预测为m/z 476.3124)；1H NMR(500MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.57(d,J＝8.3Hz,1H),7.33(br s,1H),6.78(br s,1H),6.54(dd,J＝15.4和6.1Hz,1H),6.27(d,J＝15.9Hz,1H),6.22(br d,J＝15.4Hz,1H),5.59(dd,J＝15.9和5.4Hz,1H),5.51(br t,J＝7.1Hz,1H),4.54(q,J＝5.3Hz,1H),,4.30(m,1H),3.69(m,1H),3.64(dq,J＝6.8和2.2Hz,1H),3.49(dt,J＝7和2.2Hz,1H),3.42(m,1H),2.62(m,2H),2.58-2.53(m,1H),2.33-2.28(m,1H),2.23-2.18(m,2H),1.85-1.74(m,4H),1.70(s,3H),1.64(m,2H),1.37(dd,J＝13.3和6.2Hz,1H),1.07(d,J＝6.6Hz,3H),1.05(d,J＝6.3Hz,3H),0.96(d,J＝7.3Hz,3H)。
实施例#A90
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S)-7-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B274)
Figure BDA0000751870110002511
步骤1.合成[(3R,7S)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-5-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B174)：向#NP2(4mg,0.4mM,1eq.)在50mM MOPS缓冲液pH 7.5中的水溶液添加α-酮戊二酸盐(0.8mM最终浓度,2eq.)、抗坏血酸钠(0.08mM,0.2eq.)、NH4Fe(II)SO4(0.04mM,0.1eq.)和来自实施例#A60的步骤1的重组Fr9P(1.6μM,.004eq.)。在室温下孵育2小时之后，将反应用乙酸酸化至pH约4-5并用等体积的乙酸乙酯萃取三次。将溶剂减压蒸发以得到#B174，其在不进一步纯化的情况下使用。LCMS m/z 536[M+H]+。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,5S,7S)-7-羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B274)：在0℃下，向含#B174(4.0mg；0.0075mmol)的DMF(0.05M)中添加HATU(1.4eq)，并将混合物搅拌5分钟。添加DIPEA(1eq)，然后添加含丙胺(1.5eq)的DMF，并将混合物在室温下搅拌2小时。将反应用乙腈稀释，并通过逆相HPLC(方案K)纯化:保留时间＝10.8分钟。将含产物的流分立即冷冻并冻干以得到白色固体状的#B274(2.4mg；收率60％)。LCMS m/z 577[M+H]+1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.99(dd,J＝5.5,5.5Hz,1H),7.80(d,J＝8.0Hz,1H),6.36(m,1H),6.21(d,J＝15.7Hz,1H),6.11(dd,J＝11.7,0.9Hz,1H),5.86(dd,J＝11.6,7.6Hz,1H),5.53(dd,15.7,6.0Hz,1H),5.47(m,1H),4.65(m,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.48(m,1H),3.05(m,1H),3.01(m,1H),2.47(m,2H),2.40(m,2H),2.29(m,1H),2.19(m,1H),2.11(m,1H),1.98(s,3H),1.80(m,3H),1.68(s,3H),1.64(m,1H),1.41(m,2H),1.29(m,1H),1.25(d,J＝6.4Hz,3H),1.17(m,1H),1.07(d,J＝6.7Hz,3H),0.94(d,J＝7.2Hz,3H),0.84(dd,J＝7.6,7.6Hz,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.0,169.7,164.4,142.6,133.9,133.6,128.4,127.3,122.6,95.9,79.7,74.7,66.8,67.7,54.2,49.2,46.0,45.5,39.8,39.7,37.8,35.0,31.4,28.5,22.0,19.5,17.4,13.9,12.6,12.0,10.9。
实施例#A91
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4,7-二羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯
Figure BDA0000751870110002521
步骤1.合成[(3R,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-5,8-二羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酸(#B276)：向##NP1(4mg,0.4mM,1eq.)在50mMMOPS缓冲液pH 7.5中的水溶液添加α-酮戊二酸盐(0.8mM最终浓度,2eq.)、抗坏血酸钠(0.08mM,0.2eq.)、NH4Fe(II)SO4(0.04mM,0.1eq.)和来自实施例#A60的步骤1的重组Fr9P(1.2μM,.003eq.)。在室温下孵育1小时30分钟之后，将反应用乙酸酸化至pH约4-5并用等体积的乙酸乙酯萃取三次。将溶剂减压蒸发，并将所获得的粗制#B276在进一步纯化的情况下使用。LCMS m/z 552[M+H]+。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(3R,4R,5R,7S)-4,7-二羟基-7-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B275)：在0℃下，向含#B276(4.3mg；0.0080mmol)的DMF(0.05M)添加HATU(1.4eq)，并搅拌5分钟。添加DIPEA(1eq)，然后添加含丙胺(1.5eq)的DMF，并使反应在室温下搅拌1小时。添加额外量的HATU(0.7eq)、DIPEA(1eq)和丙胺(1eq)，并将混合物搅拌另外30分钟。将粗制产物用乙腈稀释并通过逆相HPLC(方案K)纯化:保留时间＝8.60分钟。将含产物的流分立即冷冻并冻干以得到白色固体状的#B275(2.3mg；收率49％)。LCMS m/z 593[M+H]+；1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ8.01(dd,J＝5.6,5.6Hz,1H),7.81(d,J＝8.0Hz,1H),6.36(m,1H),6.24(d,J＝16.1Hz,1H),6.11(dd,J＝12.1Hz,1H),5.88(dd,J＝11.7,7.7Hz,1H),5.67(dd,16.1,4.4Hz,1H),5.44(m,1H),4.55(d,8.7Hz,1H),4.33(m,1H),3.65(m,1H),3.64(m,1H),3.48(m,1H),3.33(m,1H),3.07(m,1H),3.00(m,1H),2.73(m,1H),2.39(m,2H),2.31(m,1H),2.29(m,1H),2.27(m,1H),2.19(m,1H),1.98(s,3H),1.80(m,2H),1.69(s,3H),1.64(m,1H),1.49(m,1H),1.41(m,2H),1.25(d,J＝6.3Hz,3H),1.07(d,J＝6.3Hz,3H),0.95(d,J＝7.2Hz,3H),0.84(m,3H)。13C NMR(100MHz,DMSO-d6)δ170.4,169.6,164.7,143.4,135.5,134.0,128.9,126.3,123.4,95.7,80.6,75.4,71.4,68.4(x2),56.7,46.7,46.2,45.9,41.3,40.6,35.6,32.1,29.1,22.8,21.4,20.2,18.1,14.6,12.8,11.8。
实施例#A92
制备N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[({[反式-4-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环己基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B277)
Figure BDA0000751870110002541
步骤1.合成N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基-N-{4-[({[反式-4-({[(3R,5S,7R,8R)-7-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-8-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]乙酰基}氨基)环己基]氨甲酰基}氧基)甲基]苯基}-N5-氨甲酰基-L-鸟氨酰胺(#B277)：向N-[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]-L-缬氨酰基N5-氨甲酰基-N-{4-[({[(4硝基苄基)氧基]羰基}氧基)甲基]苯基}-L-鸟氨酰胺(MalCValCitPABC-PNP,如Bioconjugate Chem.2002,13,855-869所制备,16.5mg,0.022mmol,1.1eq.)和B76(11.9mg,83％纯度,0.019mmol,1.0eq.)在无水N,N-二甲基甲酰胺(1.5ml)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(30μL)。将所得的混合物在环境温度下搅拌0.5小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B277。收率：9.3mg,40％。HPLC(方案N):保留时间＝9.5分钟(纯度94％)。LCMS(方案M):m/z 1229.5[M+H]+。
实施例#A93
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(反式-4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}环己基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B278)
Figure BDA0000751870110002542
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(反式-4-{[6-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)己酰基]氨基}环己基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B278)：将6-马来酰亚胺基己酸(24.2mg,0.11mmol,5eq.)和二环己基碳二亚胺earbodiimide(DCC,49.5mg,0.24mmol,11eq.)在无水N,N-二甲基甲酰胺(1.0mL)中的溶液在环境温度下搅拌30分钟。添加含#B76(13.0mg,83％传毒,0.021mmol,1.0eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5ml)，并将所得的混合物搅拌2小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#B278。收率：8.6mg,49％。HPLC(方案N):保留时间＝9.6分钟(纯度96％)。LCMS(方案M):m/z 824.4[M+H]+。
实施例#A94
制备(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-1-(羧甲基)-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-D-赤式戊糖醇(#NP5)[PF-06739239]
Figure BDA0000751870110002551
步骤1.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-1-(羧甲基)-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-D-赤式戊糖醇(#NP5)：在0℃下，将#NP1(101mg,约70％纯,约0.19mmol,1eq.)在无水四氢呋喃(1.0mL)中的溶液与氯化锂(61mg,1.4mmol,7eq.)在无水乙酸(1.0mL)中的溶液混合。将所得的溶液在环境温度下搅拌1.5小时。使用逆相色谱法(方法B*)纯化反应混合物以得到白色粉末状的#NP5。收率：54.6mg,约76％。HPLC(方案N):保留时间＝10.5分钟(纯度96％)。LCMS(方案M):m/z 572.5[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ12.00(br s,D2O可互换的),7.80(d,J＝8.2,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.22(br d,J＝15.6,1H),6.11(d,J＝11.7,1H),5.87(dd,J＝11.7,7.4,1H),5.62(dd,J＝15.6,5.4,1H),5.47(br dd,J＝7.0,7.0,1H),5.02(d,J＝7.0,1H,D2O可互换的),4.78(br s,1H,D2O可互换的),4.27(m,1H),4.09(dd,8.1,6.3,1H),3.65(m,2H),3.63(d,J＝10.9,1H),3.50(m,1H),3.46(d,J＝10.9,1H),3.22(dd,J＝8.6,7.4,1H),2.97(dd,J＝15.6,9.0,1H),2.60(dd,J＝15.6,5.5,1H),2.28(m,1H),2.21(m,1H),1.98(s,3H),1.92(dd,J＝14.7,6.6,1H),1.80(m,3H),1.70(s,3H),1.65(m,2H),1.25(d,J＝6.6,3H),1.07(d,J＝6.5,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例#A95
制备(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-[2-氧代-2-(五氟苯氧基)乙基]-D-赤式戊糖醇(#B279)
Figure BDA0000751870110002561
步骤1.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-[2-氧代-2-(五氟苯氧基)乙基]-D-赤式戊糖醇(#B279)：向#NP5(18.2mg,0.032mmol,1eq.)和HATU(16.8mg)在干燥N,N-二甲基甲酰胺(200uL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(20uL)，并将溶液在环境温度下搅拌5分钟，然后与含五氟苯酚(25mg,0.13mmol,4eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(150ul)混合。将反应混合物搅拌20分钟，然后使用逆相色谱法(方法B*)纯化以得到白色粉末状的#B279。收率：15.1mg,74％。HPLC(方案N):保留时间＝14.8分钟(纯度94％)。LCMS(方案M):m/z 738.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6,mult,J in Hz)δ7.80(d,J＝7.8,1H,D2O可互换的),6.36(dq,J＝6.0,6.0,1H),6.24(br d,J＝15.6,1H),6.11(d,J＝11.3,1H),5.87(dd,J＝11.3,7.4,1H),5.66(dd,J＝15.9,5.5,1H),5.44(br dd,J＝6.6,6.6,1H),5.16(d,J＝7.0,1H,D2O可互换的),4.97(brs,1H,D2O可互换的),4.46(m,1H),4.16(dd,9.0,5.8,1H),3.70-3.63(m,3H),3.68(d,J＝10.6,1H),3.51(d,J＝10.9,1H),3.49(m,1H),3.27(dd,J＝9.0,7.0,1H),3.10(dd,J＝15.6,4.3,1H),2.30(m,1H),2.19(m,1H),2.01(dd,J＝15.1,7.0,1H),1.97(s,3H),1.81(m,2H),1.77(d,J＝14.8,1H),1.70(s,3H),1.64(m,1H),1.25(d,J＝6.4,3H),1.07(d,J＝6.5,3H),0.95(d,J＝7.0,3H)。
实施例#A96
制备(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-1-[2-({2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-D-赤式戊糖醇(#B280)
Figure BDA0000751870110002571
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-{2-[(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B281)：向#NP1(122.1mg,约67％纯度,0.22mmol,1.2eq.)和O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,151mg,0.30mmol,1.7eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(3mL)中的溶液添加N,N-二异丙基乙胺(Hunig碱,60uL)，并将所得的溶液在环境温度下搅拌10分钟。然后，添加含N-芴基甲氧基羰基-1,2-二氨基乙醇氢溴酸盐(73mg,0.2mmol,1eq.)的N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)，并将所得的溶液搅拌10分钟。将反应混合物过滤，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B281。收率：114.5mg,64％收率。HPLC(方案N):保留时间＝12.7分钟(纯度99％)。ESIMS(正)m/z 800.7[M+H]+。
步骤2.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-{2-[(2-{[(9H-芴-9-基甲氧基)羰基]氨基}乙基)氨基]-2-氧代乙基}-D-赤式戊糖醇(#B282)：将#B281(44.5mg,0.056mmol)在无水四氢呋喃(0.4mL)中的溶液与氯化锂(30.0mg,0.71mmol)在干燥乙酸(0.2mL)中的溶液混合。将反应物在环境温度下搅拌1.5小时，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B282。收率：48.0mg,100％收率。HPLC(方案N):保留时间＝16.0分钟(纯度96％)。ESIMS(正)m/z 836.7[M+H]+。
步骤3.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1-{2-[(2-氨基乙基)氨基]-2-氧代乙基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-D-赤式戊糖醇(#B283)：向#B282(48mg,0.057mmol)在DMF(2mL)中的溶液添加哌啶(20uL)。将溶液在环境温度下搅拌1小时，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B283。收率：26.4mg,92％收率。HPLC(方案N):保留时间＝6.8分钟(纯度91％)。ESIMS(正)m/z 614.6[M+H]+。
步骤4.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-1-[2-({2-[(溴乙酰基)氨基]乙基}氨基)-2-氧代乙基]-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-D-赤式戊糖醇(#B280)：向#B283(9.1mg,0.015mmol)和1-[(溴乙酰基)氧基]吡咯烷-2,5-二酮(6.2mg,0.024mmol)在DMF(0.5ml)中的溶液添加N,N’-二异丙基乙胺(Hunig碱,5.0uL)。将所得的溶液在环境温度下搅拌30分钟，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B280。收率：5.8mg,53％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.0分钟(纯度99％)。ESIMS(正)m/z 736.6[M+H]+。
实施例#A97
制备(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-D-赤式戊糖醇(#B284)
Figure BDA0000751870110002591
步骤1.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-(2-甲氧基-2-氧代乙基)-D-赤式戊糖醇(#B284)：向#NP5(6.2mg,0.011mmol,1eq.)和碳酸钾(20.0mg,0.14mmol,12eq.)在N,N-二甲基甲酰胺(0.5mL)中的悬浮液添加甲基碘(20uL,0.32mmol,29eq.)。将所得的混合物在0度搅拌30分钟。将固体通过过滤去除，并使用逆相色谱法(方法F*)纯化滤液以得到白色粉末状的#B284。收率：5.6mg,90％收率。HPLC(方案N):保留时间＝12.7分钟(纯度97％)。ESIMS(正)m/z 586.4[M+H]+。
实施例#A98
制备(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(2S,4S,6S)-4-(氯甲基)-4-羟基-6-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]四氢-2H-吡喃-2-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B285)
Figure BDA0000751870110002592
步骤1.合成[(2S,4S,6S)-6-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-4-(氯甲基)-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-基]乙酸(#NP8)：在0℃下，将#NP2(70.4mg,90％纯度,0.19mmol,1eq.)在无水四氢呋喃(1.0mL)中的溶液与氯化锂(50mg,1.2mmol,6eq.)在干燥乙酸(1.0mL)中的溶液混合。将溶液在环境温度下搅拌1.5小时，然后在40度搅拌2小时。使用逆相色谱法(方法F*)纯化反应物以得到白色粉末状的#NP8。收率：52.0mg,72％收率。HPLC(方案N):保留时间＝11.4分钟(纯度98％)。ESIMS(正)m/z 556.2[M+H]+。
步骤2.合成(2S,3Z)-5-({(2R,3R,5S,6S)-6-[(2E,4E)-5-{(2S,4S,6S)-4-(氯甲基)-4-羟基-6-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]四氢-2H-吡喃-2-基}-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基]-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基}氨基)-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B285)：将#NP8(5.0mg,0.009mmol,1eq.)、O-(7-氮杂苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲鎓六氟磷酸盐(HATU,5.2mg,0.014mmol,1.5eq.)和二异丙基乙胺(Hunig碱,5.0uL)在无水N,N-二甲基甲酰胺(0.5ml)中的溶液在环境温度下搅拌10分钟。然后添加纯丙胺(5.0uL,0.08,9eq.)，并将溶液搅拌1小时，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B285。收率：4.2mg,90％收率。HPLC(方案N):保留时间＝11.8分钟(纯度95％)。ESIMS(正)m/z 597.4[M+H]+。
实施例#A99
制备(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-D-赤式戊糖醇(#B286)
Figure BDA0000751870110002601
步骤1.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-[2-氧代-2-(丙基氨基)乙基]-D-赤式戊糖醇(#B286)：将#B63(18.4mg,0.032mmol,1eq.)在无水四氢呋喃(1.0ml)中的溶液与氯化钠(50.0mg)在干燥乙酸(0.5mL)中的溶液混合。然后，将溶液在50℃搅拌5小时，并使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B286。收率：17.5mg,94％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.9分钟(纯度97％)。ESIMS(正)m/z 613.6[M+H]+。
实施例#A100
制备(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{[反式-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环丁基]氨基}-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B287)以及(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-(2-{[反式-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环丁基]氨基}-2-氧代乙基)-D-赤式戊糖醇(#B288)
Figure BDA0000751870110002611
步骤1.合成(2S,3Z)-5-{[(2R,3R,5S,6S)-6-{(2E,4E)-5-[(3R,4R,5R,7S)-7-(2-{[反式-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环丁基]氨基}-2-氧代乙基)-4-羟基-1,6-二氧杂螺[2.5]辛-5-基]-3-甲基戊-2,4-二烯-1-基}-2,5-二甲基四氢-2H-吡喃-3-基]氨基}-5-氧代戊-3-烯-2-基乙酸酯(#B287)：向#B73(32.5mg,0.05mmol,1eq.)在1:2:3二甲亚砜/饱和碳酸氢钠/水(总共6mL)添加N-甲氧基羰基马来酰亚胺(45mg,0.29mmol,6eq.)。将悬浮液在℃搅拌1小时。将产物用乙酸乙酯(10mL)萃取。将有机层经无水氯化镁干燥，然后减压蒸发至干燥。将残留物再溶解于二氯甲烷(2mL)中，并添加三乙胺(90uL)，然后在40℃搅拌2小时。将反应混合物用乙酸中和，并使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B287。收率：4.3mg,11％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.1分钟(纯度97％)。ESIMS(正)m/z 684.4[M+H]+。
步骤2.合成(1S,5R)-5-{(1E,3E)-5-[(2S,3S,5R,6R)-5-{[(2Z,4S)-4-(乙酰氧基)戊-2-烯酰基]氨基}-3,6-二甲基四氢-2H-吡喃-2-基]-3-甲基戊-1,3-二烯-1-基}-1,5-脱水-3-C-(氯甲基)-2-脱氧-1-(2-{[反式-3-(2,5-二氧代-2,5-二氢-1H-吡咯-1-基)环丁基]氨基}-2-氧代乙基)-D-赤式-戊糖醇(#B288)在0度下，将#B287(2.7mg,)在无水四氢呋喃(200uL)中的溶液与氯化锂(13mg)在干燥乙酸(200uL)中的溶液混合。将溶液在环境温度下搅拌0.5小时，然后使用逆相色谱法(方法F*)纯化以得到白色粉末状的#B288。收率：0.8mg,26％收率。HPLC(方案N):保留时间＝10.6分钟(纯度92％)。ESIMS(正)m/z 720.7[M+H]+。
缀合操作
一般缀合操作A：将市售赫赛汀抗体(Genentech Inc)透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。然后将透析抗体(5-10mg/mL)与含反应性N-羟基琥珀酰亚胺酯的PL(3-12)当量连接基-有效负载(10mM，在二甲亚砜(DMSO)中)在室温于50mM pH 8.7硼酸盐缓冲液中反应2小时。在一些情况下，所述50mM pH 8.7硼酸盐缓冲液被杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)替代。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入二甲基乙酰胺(DMA)或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)的总有机溶剂组份。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GESuperdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后将得自AKTA的合并的单体流分浓缩，并按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使缓冲液交换至10mM琥珀酸钠缓冲液、5.4％海藻糖(pH 5.1)中。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESIMS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作B：将市售赫赛汀抗体(Genentech Inc)或治疗性抗体透析至50mMpH 6.8磷酸盐缓冲液中。然后将透析抗体(5-10mg/mL)与含反应性五氟苯酯的PL(4-12)当量连接基-有效负载(5-30mM，在二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)中)在室温于50mMpH 6.8磷酸盐缓冲液中反应2-20小时。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入DMA或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)的总有机溶剂组份。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GESuperdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后将得自AKTA的合并的单体流分浓缩，并按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使缓冲液交换至10mM琥珀酸钠缓冲液、5.4％海藻糖(pH 5.1)中。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESIMS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作C：将市售赫赛汀抗体(Genentech Inc)或治疗性抗体透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。通过添加y(1-7)当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,5mM，在蒸馏水中)还原透析的抗体，并使用DPBS、5mM 2,2',2",2”'-(乙-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)(pH 7.0)(缓冲液A)稀释成15mg/mL最终抗体浓度。将反应在37℃孵育2小时，然后冷却至室温。通过添加PL(2至15)当量的连接基-有效负载(5-10mM，在二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)中)进行缀合。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入DMA或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)的总有机溶剂组份，并且加入缓冲液A以达到10mg/mL的最终抗体浓度。将反应在室温下孵育2小时。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GE Superdex200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作D：将治疗性抗体透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。通过添加y(1-7)当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,5mM，在蒸馏水中)还原透析的抗体，并使用DPBS、5mM 2,2',2",2”'-(乙-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)(pH 7.0)(缓冲液A)稀释成15mg/mL的最终抗体浓度。将反应在37℃孵育2小时，然后冷却至室温。通过添加PL(2至15)当量的连接基-有效负载(5-10mM，在二甲基乙酰胺(DMA)中)进行缀合。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入DMA或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)总有机溶剂组份，并且加入20X硼酸盐缓冲液和DPBS以在50mM pH 8.7硼酸盐缓冲液中达到10mg/mL的最终抗体浓度。将反应在37℃孵育3小时或在室温下孵育16小时。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GESuperdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作E：将相对于天然抗体而言带有额外的半胱氨酸残基的治疗性抗体透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。通过添加100当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,5mM，在蒸馏水中)还原透析的抗体，并使用DPBS、5mM 2,2',2",2”'-(乙-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)(pH 7.0)(缓冲液A)稀释成15mg/mL最终抗体浓度。然后将反应在室温下孵育2小时，然后冷却至室温。还原后，使用Millipore Amicon Ultra 4mL 50KD MWCO超滤装置将TCEP从反应混合物中去除。将反应混合物浓缩成原始体积的1/10四次且每次使用缓冲液A再稀释成原始体积。在一些情况下，随后按照制造商的使用说明，使用GEHealthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至缓冲液A中。可替代的方法如切向流过滤(TFF)或透析也可用于特定情况。还原后，将已还原的抗体的铰链区(hinge)/内部二硫化物使用1-1.5mM脱氢抗坏血酸盐(DHA)在室温下、于缓冲液A中再氧化过夜。氧化后，使用Millipore Amicon Ultra 4mL 50KD MWCO超滤装置将DHA从反应混合物中去除。将反应混合物浓缩成原始体积的1/10四次且每次使用50mM pH 8.7硼酸盐缓冲液再稀释成原始体积。在一些情况下，然后按照制造商的使用说明，使用GE HealthcareSephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至50mM pH8.7硼酸盐缓冲液中。可替代的方法如TFF或透析也可用于特定情况。通过添加PL(3至12)当量的连接基-有效负载(10mM，在二甲基乙酰胺(DMA)中)进行缀合。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入DMA或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)的总有机溶剂组份，并且加入20X硼酸盐缓冲液和DPBS以在50mM pH 8.7硼酸盐缓冲液中达到5-10mg/mL的最终抗体浓度。将反应在37℃孵育3小时或在室温下孵育16小时。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GE Superdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作F：将相对于天然抗体而言带有额外的半胱氨酸残基的治疗性抗体透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。通过添加100当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,5mM，在蒸馏水中)还原透析的抗体，并使用DPBS、5mM 2,2',2",2”'-(乙-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)(pH 7.0)(缓冲液A)稀释成15mg/mL的最终抗体浓度。然后将反应在室温下孵育2小时，然后冷却至室温。还原后，使用Millipore Amicon Ultra 4mL 50KDMWCO超滤装置将TCEP从反应混合物中去除。将反应混合物浓缩成原始体积的1/10四次且每次使用缓冲液A再稀释成原始体积。在一些情况下，随后按照制造商的使用说明，使用GEHealthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至缓冲液A中。可替代的方法如切向流过滤(TFF)或透析也可用于特定情况。还原后，将已还原的抗体的铰链区/内部二硫化物使用1-1.5mM脱氢抗坏血酸盐(DHA)在室温下、于缓冲液A中再氧化过夜。氧化后，使用Millipore Amicon Ultra 4mL 50KD MWCO超滤装置将DHA从反应混合物中去除。将反应混合物浓缩成原始体积的1/10四次且每次使用缓冲液A再稀释成原始体积。在一些情况下，随后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至缓冲液A中。可替代的方法如切向流过滤(TFF)或透析也可用于特定情况。通过添加PL(2至15)当量的连接基-有效负载(5-10mM，在二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)中)进行缀合。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入DMA或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)的总有机溶剂组份，并且加入缓冲液A以达到5-10mg/mL最终抗体浓度。将反应在室温下孵育1-2小时。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GE Superdex200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作G：在离心超滤装置如Amicon Ultra 50k Ultracel过滤器(part#UFC805096,GE)的上方部分中进行缀合反应。在杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)5mM 2,2',2",2”'-(乙-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA),pH7.0(缓冲液A)中制备132mM L-半胱氨酸储备溶液。将该溶液(50uL)加入到带有额外的半胱氨酸残基的各突变抗体(5mg)在950uL缓冲液A中的混合液中。反应混合物中的最终半胱氨酸浓度为6.6mM。使反应在室温下静置1.5小时后，将反应管离心以将物质浓缩至约100uL。将混合物用缓冲液A稀释成1mL。该过程重复4次以去除所有半胱氨酸还原物。将所得的物质在缓冲液A中稀释至1mL，并用16uL的5mM马来酰亚胺连接基-有效负载(在二甲基乙酰胺(DMA)中)(约5当量)的溶液处理。在室温下静置1.5小时后，将反应管离心以将物质浓缩至约100uL。将混合物用DPBS稀释至1mL。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GESuperdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作H：将带有转谷氨酰胺酶-反应性谷氨酰胺残基的治疗性抗体透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。通过将0.5-5.0mg/mL含转谷氨酰胺酶反应性谷氨酰胺的抗体的25mM pH 8.0Tris缓冲液、150mM NaCl、0.31mM还原谷胱甘钛与5.0-20.0倍摩尔过量的带有氨基烷基连接基的有效负载(5-10mM，在二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)中)和2％w/v转谷氨酰胺酶(Ajinomot Activa TI)反应而进行转谷氨酰胺酶介导的缀合。然后将反应在室温下孵育4-16小时。然后按照制造商的使用说明，使用GE HealthcareSephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GE Superdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTAExplorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
一般缀合操作I：将相对于天然抗体而言带有额外的半胱氨酸残基的治疗性抗体突变体透析至杜氏磷酸盐缓冲盐水(DPBS,Lonza)中。通过添加x(25-100)当量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP,5mM，在蒸馏水中)还原透析的抗体，并使用DPBS、5mM 2,2',2",2”'-(乙-1,2-二基二次氮基)四乙酸(EDTA)，pH 6.5-7.4(缓冲液A)稀释成15mg/mL最终抗体浓度。然后将反应在室温下孵育1-2小时，然后冷却至室温。还原后，使用Millipore AmiconUltra 4mL 50KD MWCO超滤装置将TCEP从反应混合物中去除。将反应混合物浓缩成原始体积的1/10四次且每次使用缓冲液A再稀释成原始体积。一些情况下，随后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至缓冲液A中。还原后，将已还原的抗体的铰链区/内部二硫化物使用1mM脱氢抗坏血酸盐(DHA)在室温下、于缓冲液A中再氧化过夜。氧化后，使用Millipore Amicon Ultra 4mL 50KDMWCO超滤装置将DHA从反应混合物中去除。将反应混合物浓缩成原始体积的1/10四次且每次使用缓冲液A再稀释成原始体积。通过添加PL(2至10)当量的连接基-有效负载(5-10mM，在二甲基乙酰胺(DMA)或二甲亚砜(DMSO)中)进行缀合。在一些情况下，为了改善连接基-有效负载的溶解度/反应性，加入DMA或DMSO以在最终反应混合物中达到10-15％(v/v)总有机溶剂组份，并且加入缓冲液A以达到5-10mg/mL最终抗体浓度。将反应在室温下孵育1-4小时。然后按照制造商的使用说明，使用GE Healthcare Sephadex G-25M缓冲液交换柱使反应混合物被缓冲液交换至DPBS(pH7.4)中。将粗制物质通过体积排阻色谱法(SEC)、使用具有GE Superdex 200柱和DPBS(pH7.4)洗脱液的GE AKTA Explorer系统而纯化。然后，视需要将来自AKTA的合并的单体流分浓缩。将ADC经由体积排阻色谱法(SEC)进一步表征纯度，并经由液相色谱电喷雾电离串联质谱法(LC-ESI MS)进一步表征以计算药物-抗体比(负载)。蛋白质浓度经由UV分光光度计测定。
用于分析缀合物的SEC和HPLC-ESI MS条件：
方案1:
方案1(SEC):柱:TSK-gel G3000SWxl,300×7.8mm,10μm；流动相:含2％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS,1X),pH 7.4；等度；流速:1mL/分钟。温度:室温；进样量:5μL；仪器:Agilent 1100 HPLC。
方案1b:柱:Superdex 200 5/150GL,5×150mm,13ìm；流动相:含2％乙腈的磷酸盐缓冲盐水(PBS,1X),pH 7.4；等度；流速:1mL/分钟.温度:室温；进样量:5ìL；仪器:Agilent1100 HPLC。
方案2:方案2(HPLC):柱:Agilent Poroshell 300SB-C8,75×2.1mm,2.6μm；流动相A:含0.1％甲酸的水(v/v)；流动相B:含0.1％甲酸的乙腈(v/v)；梯度:历时4分钟的20％B至45％B；流速:1.0mL/分钟。温度:60℃；检测:220nm；MS(+)范围400-2000Da；进样量:10μL；仪器:Agilent 1100 LC,Waters MicromassZQ MS。使用MaxEnt1进行去卷积。样品用100倍过量的三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)或二硫苏糖醇(DTT)处理，并在室温下孵育15分钟，然后注入。
方案3:柱:Aquity UPLC BEH 200 SEC 1.7um；流动相:450mM NaCl；流速:0.5mL/分钟.温度:35C；进样量:10ìL。
曲妥珠单抗体外和体内研究
应注意，对于下列研究，在不存在缀合的细胞毒性剂的情况下，曲妥珠单抗在相当的抗体浓度下未显示显著的体外效力或体内功效。
体外细胞测定操作
将表达(BT474(乳癌)、N87(胃癌)、HCC1954(乳癌)、MDA-MB-361-DYT2(乳癌))或未表达(MDA-MB-468)靶标的细胞在处理前接种于96孔细胞培养板中24小时。将细胞用3倍连续稀释的抗体-药物缀合物或游离化合物(即药物没有与抗体缀合)以10种浓度一式两份地处理。在处理后96小时，通过CellTiter
Figure BDA0000751870110002691
AQueous单溶液细胞增殖MTS测定法(Promega,Madison WI)测定细胞活力。相对细胞活力以未经处理的对照的百分比测定。使用四参数逻辑模型#203连同XLfit v4.2(IDBS,Guildford,Surry,UK)计算IC50值。结果示于表4和9中。效力范围由0.0002nm往上。其他细胞系的测试报告于表9A中。采用类似的操作和技术。
体内N87肿瘤异种移植模型(图3和4)
通过表达靶标的异种移植模型使用N87细胞系进行抗体-药物缀合物的体内功效研究。对于功效研究，将七百五十万个肿瘤细胞(在50％基质胶中)皮下植入6-8周龄的裸鼠中，直至肿瘤尺寸达到250mm3至350mm3。通过尾静脉快速浓注来进行给药。根据肿瘤对治疗的反应，用1-10mg/kg抗体药物缀合物注射动物，每四天治疗四次。每周监测所有实验动物的体重变化。在最初50天内每周两次且其后每周一次通过卡尺装置测量并且使用下列公式计算以测量出肿瘤体积：肿瘤体积＝(长度×宽度2)/2。在动物的肿瘤体积达到2500mm3之前，将其人道地处死。在治疗的第一周后观察到肿瘤尺寸变小。在中断治疗后可连续地监测动物的肿瘤再生长。
ADC 3、4和5及ADC 14和15在N87小鼠异种移植体内筛选模型中的测试的结果示于图3和4中。
表1提供了实施例#B82-#B108的制备细节。
表2提供了实施例#B82-#B108的表征数据。
表3提供了有效负载-连接基#B109-#B117的制备。
表4示出天然产物和合成类似物的体外细胞毒性数据。
表5提供了有效负载-连接基#B109-#B117的表征数据。
表6提供了ADC的结构和用于制备其的有效负载连接基。
表7提供了制备示例性ADC的一般方法。
表8提供了示例性ADC的分析数据。
表9示出ADC的体外细胞毒性数据。
表格
Figure BDA0000751870110002711
Figure BDA0000751870110002721
Figure BDA0000751870110002731
Figure BDA0000751870110002741
1将胺溶解在甲醇中，并通过过量的N,N-二异丙基乙胺而游离碱化。将整个混合物添加到反应中。
2通过欧洲专利申请(1996),EP 694536 A1 19960131中所述的那样制备原料胺。
3HPLC流分用氢氧化铵中和，然后冻干。
Figure BDA0000751870110002742
Figure BDA0000751870110002751
Figure BDA0000751870110002761
Figure BDA0000751870110002771
Figure BDA0000751870110002772
Figure BDA0000751870110002781
1反应用TEA中和，然后经HPLC纯化。
Figure BDA0000751870110002782
Figure BDA0000751870110002791
Figure BDA0000751870110002801
Figure BDA0000751870110002811
Figure BDA0000751870110002821
表6:ADC的结构及用于制备其的有效负载连接基
Figure BDA0000751870110002822
Figure BDA0000751870110002831
Figure BDA0000751870110002841
Figure BDA0000751870110002851
Figure BDA0000751870110002861
Figure BDA0000751870110002871
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Figure BDA0000751870110002891
Figure BDA0000751870110002901
Figure BDA0000751870110002911
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Figure BDA0000751870110002931
Figure BDA0000751870110002941
表7:制备ADC的一般方法
Figure BDA0000751870110002942
Figure BDA0000751870110002951
Figure BDA0000751870110002961
1反应时间＝16小时,2反应时间＝4小时,3反应时间＝20小时
a所述的2,2',2"-膦三基三丙酸(TCEP)的量＝y
*所用的反应缓冲液是DPBS,5mM EDTA pH 7.0而非50mM硼酸盐缓冲液。
**所用的反应缓冲液是180mM HEPES缓冲液pH 8.8而非50mM硼酸盐缓冲液。
表8:ADC的分析数据
Figure BDA0000751870110002971
Figure BDA0000751870110002981
Figure BDA0000751870110002991
Figure BDA0000751870110003001
表9:ADC的体外细胞毒性数据
Figure BDA0000751870110003011
Figure BDA0000751870110003021
表9A:ADC的体外细胞毒性数据
Figure BDA0000751870110003031
Figure BDA0000751870110003032
Figure BDA0000751870110003041
Figure BDA0000751870110003051
Figure IDA0000751870170000011
Figure IDA0000751870170000021
Figure IDA0000751870170000031
Figure IDA0000751870170000041
Figure IDA0000751870170000051
Figure IDA0000751870170000061
Figure IDA0000751870170000071
Figure IDA0000751870170000081
Figure IDA0000751870170000091

Claims (8)

1.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FFW0000020429990000011
Figure FFW0000020429990000021
Figure FFW0000020429990000031
Figure FFW0000020429990000041
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Figure FFW0000020429990000061
Figure FFW0000020429990000071
2.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FFW0000020429990000072
Figure FFW0000020429990000081
Figure FFW0000020429990000091
Figure FFW0000020429990000101
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3.选自以下的化合物或其药学上可接受的盐：
Figure FFW0000020429990000112
Figure FFW0000020429990000121
Figure FFW0000020429990000131
Figure FFW0000020429990000141
Figure FFW0000020429990000151
其中-X或-S-X表示抗体AB。
4.如权利要求3所述的化合物或盐，其中所述抗体AB选自：曲妥珠单抗、曲妥珠单抗突变体、奥戈伏单抗、依决洛单抗、西妥昔单抗、玻连蛋白受体(αvβ3)的人源化单克隆抗体、阿伦珠单抗、用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-HLA-Dr抗体、131I Lym-1、用于治疗非霍金奇氏淋巴瘤的鼠抗-HLA-Dr10抗体、用于治疗霍金奇氏病或非霍金奇氏淋巴瘤的人源化抗-CD2mAb、拉贝珠单抗、贝伐单抗、替伊莫单抗、奥法木单抗、帕木单抗、利妥昔单抗、托西莫单抗、伊匹木单抗、吉妥珠单抗、癌胚胎蛋白受体5T4的人源化单克隆抗体、M1/70(CD11b受体的抗体)以及其他抗体。
5.如权利要求3所述的化合物或盐，其中所述抗体AB为单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、双特异性抗体或抗体片段。
6.用于在患者中治疗癌症的药物组合物，其包含有效量的权利要求1至3中任一项所述的化合物或盐，以及药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的药物组合物，其还包含治疗有效量的选自微管蛋自形成抑制剂、拓朴异构酶抑制剂和DNA结合剂的化学治疗剂。
8.权利要求1至3中任一项所述的化合物或者其药学上可接受的盐在制备用于在患者中治疗癌症的药物中的用途。
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