[go: up one dir, main page]
More Web Proxy on the site http://driver.im/

RU2540021C2 - Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека - Google Patents

Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека Download PDF

Info

Publication number
RU2540021C2
RU2540021C2 RU2012105923/10A RU2012105923A RU2540021C2 RU 2540021 C2 RU2540021 C2 RU 2540021C2 RU 2012105923/10 A RU2012105923/10 A RU 2012105923/10A RU 2012105923 A RU2012105923 A RU 2012105923A RU 2540021 C2 RU2540021 C2 RU 2540021C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
cells
stem cells
markers characteristic
pluripotent stem
expressing markers
Prior art date
Application number
RU2012105923/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012105923A (ru
Inventor
Джин СЮЙ
Original Assignee
Янссен Байотек, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=43465585&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=RU2540021(C2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Янссен Байотек, Инк. filed Critical Янссен Байотек, Инк.
Publication of RU2012105923A publication Critical patent/RU2012105923A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2540021C2 publication Critical patent/RU2540021C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0676—Pancreatic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0696—Artificially induced pluripotent stem cells, e.g. iPS
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/37—Digestive system
    • A61K35/39—Pancreas; Islets of Langerhans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0613—Cells from endocrine organs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/11—Epidermal growth factor [EGF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/115—Basic fibroblast growth factor (bFGF, FGF-2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/117—Keratinocyte growth factors (KGF-1, i.e. FGF-7; KGF-2, i.e. FGF-12)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/15—Transforming growth factor beta (TGF-β)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/155—Bone morphogenic proteins [BMP]; Osteogenins; Osteogenic factor; Bone inducing factor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/16—Activin; Inhibin; Mullerian inhibiting substance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/10—Growth factors
    • C12N2501/19—Growth and differentiation factors [GDF]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/30—Hormones
    • C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
    • C12N2501/385—Hormones with nuclear receptors of the family of the retinoic acid recptor, e.g. RAR, RXR; Peroxisome proliferator-activated receptor [PPAR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/41—Hedgehog proteins; Cyclopamine (inhibitor)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
    • C12N2501/40—Regulators of development
    • C12N2501/415—Wnt; Frizzeled
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/02—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from embryonic cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/90—Substrates of biological origin, e.g. extracellular matrix, decellularised tissue

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Physiology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к области биотехнологии и медицины. Предложен способ дифференцировки популяции полипотентных стволовых клеток, полученных из установленных линий полипотентных стволовых клеток, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3. Способ может быть использован для медицинских и биотехнологических целей. 9 ил., 2 табл., 4 пр.

Description

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ
Настоящее изобретение претендует на приоритет по заявке с серийным номером 61/226936 от 20 июля 2009 года.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В настоящем изобретении предлагаются способы промотирования дифференцировки полипотентных стволовых клеток в клетки, вырабатывающие инсулин. В частности, в настоящем изобретении предлагается способ получения клеток, способных вырабатывать инсулин, после пересадки животному.
ПРЕДПОСЫЛКИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Успехи заместительной клеточной терапии в лечении сахарного диабета 1 типа и нехватка трансплантатов островков Лангерганса обуславливают интерес к разработке источников клеток, вырабатывающих инсулин, или β-клеток, пригодных для приживления. Одним из подходов является выработка функционирующих β-клеток из полипотентных стволовых клеток, таких как, например, эмбриональные стволовые клетки.
В эмбриональном развитии позвоночных полипотентная стволовая клетка порождает группу клеток, составляющих три зародышевых слоя (эктодерму, мезодерму и энтодерму) в процессе, который называется гаструляцией. Такие ткани, как, например, щитовидная железа, тимус, поджелудочная железа, кишечник и печень, развиваются из энтодермы в ходе промежуточной стадии. Промежуточная стадия этого процесса - образование дефинитивной энтодермы. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют ряд маркеров, таких как HNF3 бета, GATA4, MIXL1, CXCR4 и SOX17.
Образование поджелудочной железы происходит в результате дифференцировки дефинитивной энтодермы в панкреатическую энтодерму. Клетки панкреатической энтодермы экспрессируют ген панкреатическо-дуоденального гомеобокса PDX1. В отсутствие PDX1 развитие поджелудочной железы не идет дальше образования брюшного и спинного зародышей. Таким образом, экспрессия PDX1 - важнейшая стадия формирования поджелудочной железы. Зрелая поджелудочная железа включает, помимо других типов клеток, экзокринную и эндокринную ткань. Экзокринная и эндокринная ткани образуются в результате дифференцировки панкреатической энтодермы.
Клетки с признаками островковых клеток, по имеющимся сведениям, были получены из эмбриональных клеток мыши. Например, в работе Lumelsky et al. (Science 292:1389, 2001) сообщается о дифференцировке эмбриональных стволовых клеток мыши в структуры, секретирующие инсулин, подобные панкреатическим островкам. В работе Soria et al. (Diabetes 49:157, 2000) сообщается о том, что выделяющие инсулин клетки, выведенные из эмбриональных стволовых клеток мыши, нормализуют гликемию у мышей со стрептозотоцин-индуцированным диабетом.
В одном из примеров - Hori et al. (PNAS 99:16105, 2002) - сообщается о том, что обработка эмбриональных стволовых клеток мыши ингибиторами фосфоинозитид-3-киназы (LY294002) приводила к образованию клеток, напоминающих β-клетки.
В другом примере - Blyszczuk et al. (PNAS 100:998, 2003) - сообщается о генерации выделяющих инсулин клеток из эмбриональных стволовых клеток мыши, конститутивно экспрессирующих Pax4.
Микаллеф с соавторами (Micallef et al.) сообщают о том, что ретиноевая кислота может регулировать склонность эмбриональных стволовых клеток к формированию PDX1-позитивной панкреатической энтодермы. Ретиноевая кислота эффективнее всего индуцирует экспрессию Pdx1 при добавлении в культуры на 4-й день дифференцировки эмбриональных стволовых клеток в период, соответствующий концу гаструляции в эмбрионе (Diabetes 54:301, 2005).
Миязаки с соавторами (Miyazaki et al.) сообщает о повышенной экспрессии Pdx1 линией эмбриональных стволовых клеток мыши. Их результаты показывают, что экзогенная экспрессия Pdx1 явно повышает экспрессию инсулина, соматостатина, глюкокиназы, нейрогенина-3, p48, Pax6 и генов HNF6 в образующихся дифференцированных клетках (Diabetes 53:1030, 2004).
Скауди с соавторами (Skoudy et al.) сообщают о том, что активин A (член суперсемейства TGF-β) повышающе регулирует экспрессию экзокринных панкреатических генов (p48 и амилазы) и эндокринных генов (Pdx1, инсулина и глюкагона) в эмбриональных стволовых клетках мыши. Максимальный эффект наблюдался при применении 1 нМ активина A. Они также наблюдали, что уровень экспрессии инсулина и Pdx1 мРНК не зависел от ретиноевой кислоты; однако применение 3 нМ FGF7 привело к повышению уровня транскрипта для Pdx1 (Biochem. J. 379:749, 2004).
Шираки с соавторами (Shiraki et al.) изучали эффекты факторов роста, которые целенаправленно повышают дифференцировку эмбриональных стволовых клеток в PDX1-положительные клетки. По их наблюдениям, TGF-β2 воспроизводимо увеличивает долю PDX1-положительных клеток (Genes Cells. 2005 Jun; 10(6):503-16).
Гордон с соавторами (Gordon et al.) продемонстрировали индукцию брахиурии [положительных]/HNF3 бета [положительных] клеток энтодермы из эмбриональных стволовых клеток мыши в отсутствие сыворотки и в присутствии активина с ингибитором сигнального пути Wnt (патент США 2006/0003446A1).
Гордон с соавторами (Gordon et al.) (PNAS, Vol 103, page 16806, 2006) утверждают, что «потребовалась одновременная активация Wnt и TGF-бета/центральным/активином для образования передней первичной полоски».
Однако мышиная модель развития эмбриональных стволовых клеток может не отражать в точности программу развития у высших млекопитающих, таких как, например, человек.
Томсон с соавторами (Thomson et al.) изолировали эмбриональные стволовые клетки из бластоцист человека (Science 282:114, 1998). В то же время, Герхарт (Gearhart) с сотрудниками вывели линии эмбриональных половых клеток человека (hEG) из эмбриональной гонадной ткани (Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998). В отличие от эмбриональных стволовых клеток мыши, дифференцировку которых можно предотвратить простым культивированием фактора, ингибирующего лейкемию (LIF), эмбриональные стволовые клетки человека необходимо поддерживать в строго определенных условиях (патент США № 6200806; WO 99/20741; WO 01/51616).
Д'Амур с соавторами (D'Amour et al.) описывают получение обогащенных культур дефинитивной энтодермы, выведенной из эмбриональных стволовых клеток человека, в присутствии высокой концентрации активина и низкой концентрации сыворотки (Nature Biotechnology 2005). Трансплантация этих клеток под почечную капсулу мышей приводила к дифференцировке в более зрелые клетки с характеристиками некоторых эндодермальных органов. Клетки дефинитивной энтодермы, выведенные из эмбриональных стволовых клеток человека, можно далее дифференцировать в PDX1-положительные клетки после добавления FGF-10 (патент США № 2005/0266554A1).
Д'Амур с соавторами (D'Amour et al., Nature Biotechnology - 24, 1392-1401 (2006)) утверждают: «Мы разработали процесс дифференцировки, позволяющий превратить эмбриональные стволовые клетки человека (hES) в эндокринные клетки, способные синтезировать панкреатические гормоны инсулин, глюкагон, соматостатин, панкреатический полипептид и грелин. Этот процесс аналогичен формированию поджелудочной железы in vivo, поскольку клетки проходят стадии, напоминающие дефинитивную энтодерму, энтодерму пищеварительной трубки, панкреатическую энтодерму и эндокринный прекурсор как стадии формирования клеток, экспрессирующих эндокринные гормоны».
В другом примере Фиск с соавторами (Fisk et al.) сообщают о системе получения панкреатических островковых клеток из эмбриональных стволовых клеток человека (патент США № 2006/0040387A1). В этом случае путь дифференцировки состоял из трех стадий. Сначала эмбриональные стволовые клетки человека дифференцировались в энтодерму с помощью сочетания бутирата натрия и активина A. Затем полученные клетки культивировались антагонистами TGF-β, такими как Noggin, в сочетании с EGF или бетацеллюлином для образования PDX1-положительных клеток. Терминальную дифференцировку индуцировали никотинамидом.
В одном из примеров Бенвенистри с соавторами (Benvenistry et al.) утверждают: «Мы сделали вывод о том, что повышенная экспрессия PDX1 привела к усилению экспрессии панкреатических обогащенных генов, а для экспрессии инсулина может потребоваться дополнительная активация, присутствующая только in vivo» (Benvenistry et al., Stem Cells 2006; 24:1923-1930).
В другом примере Грейпин-Боттон с соавторами (Grapin-Botton et al.) утверждают: «При ранней активации Ngn3 почти исключительно образовывались глюкагон+клетки при обеднении пула предшественников поджелудочной железы. Как и из E11.5, предшественники PDX1 стали способны дифференцироваться в инсулин [положительные] и PP [положительные] клетки» (Johansson KA et al., Developmental Cell 12, 457-465, March 2007).
Экспрессия NGN3 в клетках, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, может снизить способность клеток далее дифференцироваться в клетки, вырабатывающие инсулин. Предыдущие исследования показали, что клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые экспрессируют NGN3, при дальнейшей дифференцировке с большей вероятностью порождают глюкагон-экспрессирующие клетки, чем инсулин-экспрессирующие клетки. Однако экспрессия NGN3 необходима для формирования панкреатических эндокринных клеток или предшественников панкреатических эндокринных клеток (клеток, которые могут формировать, например, глюкагон- или инсулин-экспрессирующие клетки). Поэтому временная регуляция NGN3 важна для того, чтобы предшественники панкреатических эндокринных клеток в итоге дали инсулин-экспрессирующие клетки.
Таким образом, сохраняется существенная потребность в разработке условий создания линий полипотентных стволовых клеток, которые можно было бы распространить на решение актуальных клинических задач, сохраняя при этом возможность дифференцировки в инсулин-экспрессирующие клетки. В настоящем изобретении применен альтернативный подход к повышению эффективности дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека в направлении инсулин-экспрессирующих клеток, создав популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3. Способы, составляющие предмет настоящего изобретения, поддерживают экспрессию NGN3 на минимальном уровне до начала дифференцировки панкреатической энтодермы в предшественники панкреатических эндокринных клеток.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
В одном осуществлении настоящего изобретения образуется популяция клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3. В одном осуществлении популяция клеток способна порождать после пересадки животному C-пептид.
В одном из осуществлений настоящего изобретения предлагается способ дифференцировки популяции полипотентных стволовых клеток в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3, включающий следующие стадии:
a. культивирование полипотентных стволовых клеток;
b. дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
c. дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3, посредством обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, первой средой с добавлением FGF7 с последующим культивированием клеток во второй среде с добавлением FGF7, фактора, способного ингибировать BMP, активина A, антагониста рецептора TGF-β, ретиноевой кислоты и ингибитора сигнального пути белка хеджехог.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
На фиг.1 показано влияние активина A на экспрессию NKX6.1, NGN3, PDX1, PTF1 альфа и ARX на стадии 3, день 4, в клетках, обработанных в соответствии с методами, описанными в примере 1. Для ПЦР-анализа в режиме реального времени отбирались дублирующие пробы. На графике показан кратный рост каждого гена относительно контрольной группы (светло-серые полосы). Темно-серыми полосами показаны клетки, обработанные FGF7, реактивом циклопамин-KAAD, ретиноевой кислотой, 20 нг/мл активина A и реактивом noggin. Черные полосы отображают клетки, обработанные FGF7, реактивом циклопамин-KAAD, ретиноевой кислотой, 50 нг/мл активина A и реактивом noggin.
На фиг.2 показаны иммунофлюоресцентные изображения, показывающие экспрессию NKX6.1 (панели a, c, и e) и NGN3 (панели b, d и f) в клетках, обработанных FGF7+реактивом Noggin+ретиноевой кислотой+реактивом KAAD-циклопамин (панели a и b), а также в клетках, обработанных FGF7+реактивом Noggin+ретиноевой кислотой+реактивом KAAD-циклопамин+20 нг/мл активина A (панели c и d), и в клетках, обработанных FGF7+реактивом Noggin+ретиноевой кислотой+реактивом KAAD-циклопамин+Alk5 ингибитором II.
На фиг.3 показаны иммунофлюоресцентные изображения, показывающие экспрессию PDX1 (панели a и c), CDX2 (панели b и d) в клетках, обработанных DMEM с высоким содержанием глюкозы с 1% B27+FGF7+реактивом Noggin+ретиноевой кислотой+реактивом KAAD-циклопамин+20 нг/мл активина A (панели a и b), и в клетках, обработанных DMEM/F12 с 1% B27+FGF7+реактивом Noggin+ретиноевой кислотой+реактивом KAAD-циклопамина+20 нг/мл активина A (панели c и d).
На фиг.4 показано влияние активина A, активина B, TGFβ2, GDF11 и GDF8 на экспрессию NKX6.1, NGN3 и PDX1 альфа на стадии 3, день 4, в клетках, обработанных в соответствии с методами, описанными в примере 1. Для ПЦР-анализа в режиме реального времени отбирались дублирующие пробы. На графике показан кратный рост каждого гена относительно группы, обработанной FGF7+циклопамином-KAAD+ретиноевой кислотой+реактивом Noggin.
На фиг.5 показано влияние обработки реактивом Noggin и ингибитором II Alk5 на экспрессию NGN3, NEUROD, NKX2.2 и PAX6 (панель a) и NKX6.1, PDX1 и PTF1 альфа (панель b) на стадии 4, день 3, в клетках, обработанных в соответствии с методами, описанными в примере 2. Для ПЦР-анализа в режиме реального времени отбирались дублирующие пробы. На графике показан кратный рост каждого гена относительно группы, обработанной только базальной средой (DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27) (светло-серые полоски). Темно-серыми полосами показаны клетки, обработанные реактивом Noggin и ингибитором II Alk5.
На фиг.6 показаны иммунофлюоресцентные изображения для клеток, обработанных FGF7+реактивом Noggin+ретиноевой кислотой+KAAD-циклопамином+активином A в течение четырех дней с последующей обработкой реактивом Noggin и ингибитором II Alk5 в течение трех дней, как описано в примере 2. На панели a показана экспрессия NKX6.1, NGN3 и наложение NKX6.1 и NGN3. На панели b показана экспрессия PDX1, NGN3 и наложение PDX1 и NGN3.
На фиг.7 показана экспрессия NGN3, PAX4, PDX1, NKX6.1, NEUROD, инсулина и глюкагона в клетках на стадии 4, день 3 (светло-серые полоски), или на стадии 5, день 3 (темно-серые полоски), или на стадии 5, день 7 (черные полоски) протокола обработки, описанного в примере 3. Для ПЦР-анализа в режиме реального времени отбирались дублирующие пробы. На графике показан кратный рост каждого гена относительно экспрессии, измеренной на стадии 4, день 1.
На фиг.8 показаны иммунофлюоресцентные изображения, демонстрирующие экспрессию инсулина, глюкагона и NKX6.1 в клетках на стадии 5, день 7 протокола обработки, описанного в примере 3. Также показаны наложения экспрессии инсулина и глюкагона, а также экспрессии инсулина и NKX6.1.
На фиг.9 показан циркулирующий C-пептид человека (панель a) и содержание глюкозы в крови не натощак (панель b) у STZ-индуцированных ТКИН-мышей с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров, которым вводили клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, в подпочечную капсулу. В указанные моменты времени определялись уровни C-пептида и уровни глюкозы в крови.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
Для ясности изложения, но не в порядке ограничения, подробное описание изобретения разделено на следующие подразделы, в которых описываются или иллюстрируются определенные особенности, осуществления или применения настоящего изобретения.
Определения
Стволовые клетки - это недифференцированные клетки, определяющим свойством которых является способность на уровне одной клетки как самообновляться, так и дифференцироваться с образованием дочерних клеток, в том числе самообновляющихся предшественников, не самообновляющихся предшественников и терминально дифференцированных клеток. Стволовые клетки также характеризуются способностью дифференцироваться in vitro в функциональные клетки различных клеточных линий из нескольких зародышевых слоев (энтодерма, мезодерма и эктодерма), а также порождать ткани нескольких зародышевых слоев после пересадки и вносить существенный вклад в большинство тканей (если не во все) после инъекции в бластоцисты.
Стволовые клетки классифицируются по дифференцировочному потенциалу следующим образом: (1) тотипотентные, то есть способные порождать клетки всех эмбриональных и экстраэмбриональных типов; (2) полипотентные, то есть способные порождать клетки всех эмбриональных типов; (3) мультипотентные, то есть способные порождать ряд клеточных линий, но лишь в рамках определенной ткани, органа или физиологической системы (например, гемопоэтические стволовые клетки (HSC) могут образовывать потомство, включающее HSC (самообновление), олигопотентные предшественники с ограничением в пределах клеток крови и все типы и элементы клеток (например, тромбоциты), являющиеся нормальными компонентами крови); (4) олигопотентные, то есть способные порождать более ограниченный набор клеточных линий, чем мультипотентные клетки; и (5) унипотентные, то есть способные порождать одну клеточную линию (например, сперматогенные стволовые клетки).
Дифференцировка - это процесс, в результате которого неспециализированные (некоммитированные) клетки или менее специализированные клетки приобретают свойства специализированной клетки, например, нервной или мышечной. Дифференцированная или образовавшаяся в результате дифференцировки клетка - это такая клетка, которая заняла более специализированное (коммитированное) положение в линии клеток. Термин «коммитированная» применительно к процессу дифференцировки означает клетку, которая дошла по пути дифференцировки до точки, где при нормальных обстоятельствах она будет продолжать дифференцироваться до клетки конкретного типа или подмножества типов клеток и не может, при нормальных обстоятельствах, дифференцироваться в клетку какого-то другого типа или вернуться к менее дифференцированному типу клеток. Дедифференцировкой называют процесс возвращения клетки к менее специализированному (коммитированному) положению в линии клеток. В данном документе линией клеток называется наследственность клетки, то есть от каких клеток она происходит и какие клетки может порождать. Линия клеток помещает клетку в иерархическую схему развития и дифференцировки. Линиеспецифическим маркером называют характеристику, связанную с фенотипом клеток данной линии. Его можно использовать для оценки дифференцировки некоммитированной клетки в данную линию.
«Клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы», или «клетками первой стадии», или «стадией 1» в данном документе называются клетки, экспрессирующие как минимум один из следующих маркеров: SOX17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, центральный, FGF8, брахиурия, гомеобокс-белок типа MIX, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 или OTX2. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, включают в себя клетки предшественников первичных полосок, клетки первичных полосок, клетки мезоэнтодермы и клетки дефинитивной энтодермы.
«Клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы», в данном документе называются клетки, экспрессирующие как минимум один из следующих маркеров: PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, NKX6.1 или HB9. Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, включают в себя клетки панкреатической энтодермы, первичные клетки кишечного тракта и клетки задней части передней кишки.
«Дефинитивной энтодермой» в данном документе называются клетки, обладающие характеристиками клеток, образующихся из эпибласта во время гаструляции, и образующие желудочно-кишечный тракт, а также их производные. Клетки дефинитивной энтодермы экспрессируют следующие маркеры: HNF3 бета, GATA4, SOX17, Cerberus, OTX2, goosecoid, C-Kit, CD99 и MIXL1.
«Маркерами» в данном документе называются молекулы нуклеиновых кислот или полипептидов, дифференциально экспрессируемые в определенной клетке. В этом контексте под дифференциальной экспрессией подразумевается повышенный уровень для положительного маркера и пониженный уровень для отрицательного маркера. Определяемый уровень маркерной нуклеиновой кислоты или полипептида значительно выше или ниже в определенных клетках по сравнению с другими клетками, и эти клетки можно выявлять и распознавать на фоне других клеток с помощью какого-либо из методов, известных в данной области.
«Панкреатической эндокринной клеткой» или «клеткой, экспрессирующей панкреатические гормоны», в данном документе называется клетка, способная экспрессировать как минимум один из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид.
Изоляция, размножение и культивирование полипотентных стволовых клеток
Характеристика полипотентных стволовых клеток
Полипотентные стволовые клетки могут экспрессировать один или несколько относящихся к определенной стадии эмбриональных антигенов (SSEA) 3 и 4, а также маркеры, определяемые с помощью антител, обозначаемых как Tra-1-60 и Tra-1-81 (Thomson et al., Science 282:1145, 1998). Дифференцировка полипотентных клеток in vitro приводит к снижению экспрессии SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81 (при ее наличии) и повышению экспрессии SSEA-1. В недифференцированных полипотентных стволовых клетках обычно отмечается активность щелочной фосфатазы, которую можно обнаружить путем фиксации клеток 4% параформальдегидом и дальнейшей обработки реактивом Vector Red в качестве субстрата, как описано изготовителем (Vector Laboratories, Бурлингейм, штат Калифорния). Недифференцированные полипотентные стволовые клетки также обычно экспрессируют OCT4 и TERT, что определяется методом ПЦР в режиме реального времени.
Другой желательный фенотип размножившихся полипотентных стволовых клеток - способность дифференцировки в клетки всех трех зародышевых слоев: ткани энтодермы, мезодермы и эктодермы. Полипотентность полипотентных клеток можно подтвердить, например, инъекцией клеток мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИД), зафиксировав образующиеся тератомы 4% параформальдегидом и проведя их гистологическое исследование на признаки типов клеток из трех зародышевых слоев. В качестве альтернативного варианта можно определить полипотентность созданием эмбриоидных телец и их обследованием на присутствие маркеров, связанных с тремя зародышевыми слоями.
Размножившиеся линии полипотентных стволовых клеток можно кариотипировать с помощью стандартного метода G-бэндинга и сравнивать с опубликованными кариотипами соответствующих видов приматов. Желательно получить клетки, имеющие «нормальный кариотип», то есть клетки должны быть эуплоидными, со всеми хромосомами человека, не имеющими заметных изменений.
Источники полипотентных стволовых клеток
К типам полипотентных стволовых клеток, которые можно использовать, относятся установленные линии полипотентных клеток, выведенные из ткани, образованной после беременности, в том числе преэмбриональной ткани (такой как, например, бластоциста), эмбриональной ткани или ткани плода, взятой в любой момент беременности - как правило, но необязательно, приблизительно до 10-12 недели беременности. К неограничивающим примерам относятся установленные линии эмбриональных стволовых клеток человека и эмбриональные половые клетки человека, такие как, например, линии эмбриональных стволовых клеток человека H1, H7 и H9 (WiCell). Также обсуждается возможность использования составов данной заявки во время первичного установления или стабилизации таких клеток, причем в этом случае источником клеток будут первичные полипотентные клетки, взятые непосредственно из тканей источника. Также подходят клетки, взятые из популяции полипотентных стволовых клеток, уже культивированных в отсутствие питающих клеток. Кроме того, подходят линии мутантных эмбриональных стволовых клеток человека, таких как, например, BG01v (BresaGen, Афины, штат Джорджия).
В одном осуществлении получение эмбриональных стволовых клеток проводят согласно описанию Томсона с соавторами (Thomson et al.) (патент США № 5843780; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998; Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995).
Культура полипотентных стволовых клеток
В одном осуществлении полипотентные стволовые клетки обычно культивируют на слое питающих клеток, поддерживающих полипотентные стволовые клетки различными способами. В качестве альтернативного варианта, полипотентные стволовые клетки культивируют в культурной системе, которая сама не содержит питающих клеток, но все же поддерживает полипотентные стволовые клетки без существенной дифференцировки. Рост полипотентных стволовых клеток в не содержащей подпитки среде без дифференцировки поддерживается с помощью среды, кондиционированной предварительным культивированием клеток другого типа. В качестве иного варианта, рост полипотентных стволовых клеток в не содержащей подпитки среде без дифференцировки поддерживается с помощью химически определенной среды.
Например, в работах Reubinoff et al. (Nature Biotechnology 18:399-404 (2000)) и Thompson et al. (Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145-1147) описано культивирование линий полипотентных стволовых клеток из бластоцист человека с помощью слоя питающих клеток из эмбриональных фибробластов мыши.
В работе Richards et al. (Stem Cells 21:546-556, 2003) оценивается панель из 11 различных взрослых, эмбриональных и неонатальных питающих клеток и определяется их способность поддерживать культуру полипотентных стволовых клеток человека. Ричардс с соавторами (Richards et al.) утверждают, что «линии эмбриональных стволовых клеток человека, культивированные на питающих слоях фибробластов кожи человека, сохраняют морфологию эмбриональных стволовых клеток человека и остаются полипотентными».
В патенте US20020072117 описаны линии клеток, производящие среду, которая поддерживает рост полипотентных стволовых клеток приматов в культуре без питательной среды. Использовавшимися линиями клеток были линии мезенхимных и фибробластоподобных клеток, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В патенте US20020072117 также описано использование этих линий клеток в качестве первичного слоя питающих клеток.
В другом примере - Wang et al. (Stem Cells 23:1221-1227, 2005) - описаны способы долговременного выращивания полипотентных стволовых клеток человека на слоях питающих клеток, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека.
В другом примере - Stojkovic et al. (Stem Cells 2005 23:306-314, 2005) - описана система питающих клеток, полученная в результате спонтанной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток человека.
В еще одном примере - Miyamoto et al. (Stem Cells 22:433-440, 2004) - описан источник питающих клеток, полученных из плаценты человека.
В работе Amit et al. (Biol. Reprod 68:2150-2156, 2003) описан слой питающих клеток, полученных из крайней плоти человека.
В другом примере - Inzunza et al. (Stem Cells 23:544-549, 2005) - описан слой питающих клеток, полученных из фибробластов постнатальной крайней плоти.
В патенте US6642048 описана среда, которая поддерживает рост полипотентных стволовых клеток приматов (pPS) в культуре без питающей среды, а также линии клеток, которые используются при получении такой среды. В патенте US6642048 утверждается: «Настоящее исследование включает в себя линии мезенхимных и фибробластоподобных клеток, полученные из эмбриональной ткани или дифференцированные из эмбриональных стволовых клеток. В этом документе описаны и проиллюстрированы способы получения таких линий клеток, обработки среды и выращивания стволовых клеток с помощью кондиционированной среды».
В другом примере - WO2005014799 - описана кондиционированная среда для поддержки, пролиферации и дифференцировки клеток млекопитающих. В документе WO2005014799 утверждается: «Культурная среда, получаемая в соответствии с настоящим изобретением, кондиционируется секреторной деятельностью мышечных клеток; в частности, дифференцированными и иммортализованными трансгенными гепатоцитами, называемыми MMH (Met Murine Hepatocyte)».
В другом примере - Xu et al. (Stem Cells 22:972-980, 2004) - описана кондиционированная среда, полученная из производных эмбриональных стволовых клеток человека, генетически модифицированных таким образом, чтобы иметь повышенную экспрессию обратной транскриптазы теломеразы человека.
В другом примере - US20070010011 - описана химически определенная культурная среда для поддержки полипотентных стволовых клеток.
В альтернативной культурной системе используется не содержащая сыворотки среда с добавлением факторов роста, способных обеспечивать пролиферацию эмбриональных стволовых клеток. Например, в работе Cheon et al. (BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005) описана не содержащая питательного слоя и сыворотки культурная система, в которой эмбриональные стволовые клетки поддерживаются в некондиционированной среде, замещающей сыворотку (SR), с добавлением различных факторов роста, способных инициировать самообновление эмбриональных стволовых клеток.
В другом примере - Levenstein et al. (Stem Cells 24:568-574, 2006) - описаны способы долговременного культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в отсутствие фибробластов или кондиционированной среды с помощью среды с добавлением bFGF.
В другом примере - US20050148070 - описан способ культивирования эмбриональных стволовых клеток человека в определенной среде без сыворотки и без питающих клеток фибробластов. Способ включает в себя: культивирование стволовых клеток в культурной среде, содержащей альбумин, аминокислоты, витамины, минералы, как минимум один трансферрин или заменитель трансферрина, как минимум один инсулин или заменитель инсулина, при этом культурная среда сама по себе не содержит эмбриональной сыворотки млекопитающих и содержит не менее чем примерно 100 нг/мл фактора роста фибробластов, способного активировать сигнальный рецептор фактора роста фибробластов, где фактор роста поставляется из источника, не являющегося просто питающим слоем фибробластов, а среда поддерживает пролиферацию стволовых клеток в недифференцированном состоянии без питающих клеток или кондиционированной среды.
В другом примере - US20050233446 - описана среда известного состава, используемая в культивировании стволовых клеток, в том числе недифференцированных стволовых примордиальных клеток приматов. В растворе среда в значительной степени является изотонической по сравнению с культивируемыми стволовыми клетками. В заданной культуре конкретная среда состоит из основной среды и некоторого количества следующих веществ: bFGF, инсулина и аскорбиновой кислоты, необходимых для поддержки существенно недифференцированного роста примордиальных стволовых клеток.
В другом примере - US6800480 - указывается: «В одном осуществлении предлагается среда для культивирования клеток для выращивания примордиальных стволовых клеток приматов в существенно недифференцированном состоянии, которая включает в себя основную среду с низким осмотическим давлением и низкой концентрацией эндотоксинов, которая эффективно поддерживает рост примордиальных стволовых клеток приматов. Основная среда смешивается с питательной сывороткой, эффективно поддерживающей рост примордиальных стволовых клеток приматов, и субстратом, выбираемым из группы, в которую входят питающие клетки и компонент внеклеточного матрикса, получаемые из питающих клеток. Кроме того, среда содержит неосновные аминокислоты, антиоксидант и первый фактор роста, выбираемый из группы, в которую входят нуклеозиды и соль пировиноградной кислоты.
В другом примере - US20050244962 - утверждается: «Один аспект изобретения предусматривает способ культивирования эмбриональных стволовых клеток приматов. Стволовые клетки культивируют в культуре, которая сама по себе не содержит эмбриональной сыворотки млекопитающих (также предпочтительно, чтобы она не содержала никакой животной сыворотки), и в присутствии фактора роста фибробластов, получаемого из источника, не являющегося просто питающим слоем фибробластов. В предпочтительной форме питающий слой фибробластов, ранее необходимый для поддержания культуры стволовых клеток, становится ненужным после добавления достаточного фактора роста фибробластов».
В другом примере - WO2005065354 - описана изотоническая культурная среда с известным составом, которая сама по себе не содержит питающего слоя и сыворотки и которая включает в себя: a) базальную среду; b) некоторое количество bFGF, достаточное для поддержки роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; c) некоторое количество инсулина, достаточное для поддержки роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих; и d) некоторое количество аскорбиновой кислоты, достаточное для поддержки роста существенно недифференцированных стволовых клеток млекопитающих.
В другом примере - WO2005086845 - описан способ поддержки недифференцированной стволовой клетки, заключающийся в воздействии на стволовую клетку одного из членов семейства белков трансформирующего ростового фактора бета (TGF-β), одного из членов семейства белков факторов роста фибробластов (FGF) или никотинамида (NIC) в количестве, достаточном для поддержания клетки в недифференцированном состоянии в течение времени, достаточного для достижения желаемого результата.
Полипотентные клетки можно высевать на подходящий культурный субстрат. В одном осуществлении подходящим культурным субстратом является компонент внеклеточного матрикса, как, например, компоненты, получаемые из базальной мембраны, или компонент, который может участвовать в связях адгезивных молекул между рецептором и лигандом. В одном осуществлении подходящим культурным субстратом является MATRIGEL® (Becton Dickenson). MATRIGEL® - растворимый препарат из клеток опухоли Engelbreth-Holm Swarm, образующих гель при комнатной температуре с образованием восстановленной базальной мембраны.
Могут применяться и другие компоненты внеклеточного матрикса и смеси компонентов. В зависимости от типа пролиферирующих клеток в их число могут входить ламинин, фибронектин, протеогликан, энтактин и сходные компоненты, как сами по себе, так и в различных сочетаниях.
Полипотентные стволовые клетки можно высевать на субстрат в подходящем распределении и в присутствии среды, обеспечивающей выживание клеток, размножение и сохранение желаемых характеристик. Для улучшения всех этих характеристик желательно внимательно отнестись к распределению при высевании, а способы их определения известны специалистам.
Подходящую культурную среду можно создать из таких компонентов, как, например, модифицированная по способу Дульбекко среда Игла (DMEM), Gibco # 11965-092; модифицированная по способу Дульбекко среда Игла нокаутная (KO DMEM), Gibco # 10829-018; базальная среда Ham's F12/50% DMEM; 200 мМ L-глутамин, Gibco # 15039-027; раствор неосновных аминокислот, Gibco 11140-050; β-меркаптоэтанол, Sigma # M7522; человеческий рекомбинантный основной фактор роста фибробластов (bFGF), Gibco # 13256-029.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из полипотентных стволовых клеток
В одном из осуществлений настоящее изобретение предлагает способ получения клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, из полипотентных стволовых клеток, включающий следующие стадии:
a) культивирование полипотентных стволовых клеток;
b) дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы.
В одном аспекте настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX-2 и NGN3.
Дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, можно определить по тестам на присутствие маркеров до и после соблюдения определенного протокола. Полипотентные стволовые клетки, как правило, не экспрессируют подобные маркеры. Таким образом, дифференцировка полипотентных клеток обнаруживается, когда клетки начинают их экспрессировать.
Возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, любым из способов, известных в данной области или предлагаемых в настоящем изобретении.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе Shinozaki et al., Development 131, 1651-1662 (2004).
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе McLean et al., Stem Cells 25, 29-38 (2007).
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, способами, описанными в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A, в отсутствие сыворотки с последующим культивированием клеток активином A и сывороткой и культивированием клеток с активином A и сывороткой в различной концентрации. Пример такого способа описан в работе Nature Biotechnology 23, 1534-1541 (2005).
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A, в отсутствие сыворотки с последующим культивированием клеток с активином A и сывороткой в другой концентрации. Пример такого способа описан в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2005.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством культивирования полипотентных стволовых клеток в среде, содержащей активин A и лиганд Wnt, в отсутствие сыворотки с последующим удалением лиганда Wnt и культивированием клеток с активином A и сывороткой. Пример такого способа описан в работе Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006).
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 11/736908 компании LifeScan, Inc.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 11/779311 компании LifeScan, Inc.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 60/990529.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 61/076889.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 61/076900.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 61/076908.
Например, возможна дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, посредством обработки полипотентных стволовых клеток в соответствии с методами, описанными в заявке на патент США с серийным номером 61/076915.
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы
В одном осуществлении клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3, посредством культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в первой среде с добавлением FGF7 с последующим культивированием клеток во второй среде с добавлением FGF7, фактора, способного ингибировать BMP, активина A, антагониста рецептора TGFβ, ретиноевой кислоты и ингибитора сигнального пути хеджехог.
В одном осуществлении FGF7 может использоваться в концентрации от примерно 50 пг/мл до примерно 50 мкг/мл. В одном осуществлении FGF7 может использоваться в концентрации 50 нг/мл.
В одном осуществлении фактором, способным ингибировать BMP, является реактив noggin. Noggin может использоваться в концентрации от примерно 500 нг/мл до примерно 500 мкг/мл. В одном осуществлении noggin может использоваться в концентрации 100 нг/мл.
В одном осуществлении антагонист рецептора TGFβ выбирается из группы, в которую входят активин A, активин B, TGFβ-I, TGFβ-II, GDF-8 и GDF-11.
Активин A может использоваться в концентрации от примерно 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном осуществлении активин A может использоваться в концентрации 20 нг/мл. В другом осуществлении активин A используется в концентрации 50 нг/мл.
Активин B может использоваться в концентрации от примерно 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном осуществлении активин B может использоваться в концентрации 20 нг/мл. В другом осуществлении активин B используется в концентрации 50 нг/мл.
TGFβ-I может использоваться в концентрации от примерно 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном осуществлении TGFβ-I может использоваться в концентрации 20 нг/мл. В другом осуществлении TGFβ-I используется в концентрации 50 нг/мл.
TGFβ-II может использоваться в концентрации от примерно 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном осуществлении TGFβ-II может использоваться в концентрации 20 нг/мл. В другом осуществлении TGFβ-II используется в концентрации 50 нг/мл.
GDF-8 может использоваться в концентрации от примерно 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном осуществлении GDF-8 может использоваться в концентрации 20 нг/мл. В другом осуществлении GDF-8 используется в концентрации 50 нг/мл.
GDF-11 может использоваться в концентрации от примерно 2 нг/мл до 100 нг/мл. В одном осуществлении GDF-11 может использоваться в концентрации 20 нг/мл. В другом осуществлении GDF-11 используется в концентрации 50 нг/мл.
Ретиноевая кислота может использоваться в концентрации от примерно 1 нМ до примерно 1 мМ. В одном осуществлении ретиноевая кислота может использоваться в концентрации 1 мкМ.
В одном осуществлении ингибитором сигнального пути хеджехог является циклопамин-KAAD. Циклопамин-KAAD может использоваться в концентрации от примерно 0,025 мкМ до примерно 2,5 мкМ. В одном осуществлении циклопамин-KAAD используется в концентрации 0,25 мкМ.
Эффективность дифференцировки можно определять посредством воздействия на обработанную популяцию клеток препарата (например, антитела), позволяющего распознавать именно тот белковый маркер, который экспрессируется клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.
Методы оценки экспрессии белковых и нуклеиновокислотных маркеров в культивированных и изолированных клетках являются стандартными в данной области. К ним относятся количественная цепная реакция обратной транскриптазы и полимеразы (RT-PCR), нозерн-блоттинг, гибридизация in situ (см., например, Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)) и иммунологические анализы, такие как иммуногистохимический анализ срезов материала, вестерн-блоттинг, а для маркеров, которые можно выявить в интактных клетках - анализ методом поточной цитометрии (FACS) (см., например, Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)).
Характеристики полипотентных стволовых клеток хорошо известны специалистам; кроме того, продолжается выявление новых характеристик полипотентных стволовых клеток. К маркерам полипотентных стволовых клеток относится, например, экспрессия одного или нескольких из следующих: ABCG2, cripto, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, Tra 1-81.
После обработки полипотентных стволовых клеток по методам, представляющим предмет настоящего изобретения, дифференцированные клетки можно очистить посредством воздействия на обработанную популяцию клеток препарата (например, антитела), позволяющего распознавать именно тот белковый маркер, такой как CXCR4, который экспрессируется клетками, экспрессирующими маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы.
К числу полипотентных стволовых клеток, которые можно использовать в настоящем изобретении, относятся, например, эмбриональные стволовые клетки человека линии H9 (код Национального института здравоохранения (NIH): WA09), эмбриональные стволовые клетки человека линии H1 (код NIH: WA01), эмбриональные стволовые клетки человека линии H7 (код NIH: WA07), эмбриональные стволовые клетки человека линии SA002 (Cellartis, Швеция). Также в настоящем изобретении можно использовать клетки, которые экспрессируют как минимум один из следующих маркеров, характерных для полипотентных клеток: ABCG2, cripto, CD9, FOXD3, CONNEXIN43, CONNEXIN45, OCT4, SOX2, Nanog, hTERT, UTF1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60 и Tra 1-81.
Маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, выбираются из группы, в которую входят SOX-17, GATA4, HNF3 бета, GSC, CER1, Nodal, FGF8, брахиурия, гомеобокс-белок типа MIX, FGF4 CD48, эомезодермин (EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99 и OTX2. В настоящем изобретении можно использовать клетку, которая экспрессирует как минимум один из маркеров, характерных для линии дефинитивной энтодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клеткой, экспрессирующей маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, является клетка предшественника первичной полоски. В другом аспекте настоящего изобретения клеткой, экспрессирующей маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, является клетка мезоэнтодермы. В другом аспекте настоящего изобретения клеткой, экспрессирующей маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, является клетка дефинитивной энтодермы.
Маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, выбираются из группы, в которую входят PDX1, HNF1 бета, PTF1 альфа, HNF6, HB9 и PROX1. В настоящем изобретении можно использовать клетку, которая экспрессирует как минимум один из маркеров, характерных для линии панкреатической энтодермы. В одном из аспектов настоящего изобретения клеткой, экспрессирующей маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, является клетка панкреатической энтодермы.
Образование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии
В одном осуществлении настоящего изобретения клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3, получаемые способами, составляющими предмет настоящего изобретения, могут далее дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии.
Клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, могут дифференцироваться в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, любым из способов, известных в данной области или предлагаемых в настоящем изобретении.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в среде, содержащей эксендин-4, после чего среда с эксендином-4 удаляется, и клетки культивируются в среде, содержащей эксендин-1, IGF-1 и HGF. Пример такого способа описан в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в среде, содержащей DAPT (Sigma-Aldrich, MO) и эксендин-4. Пример такого способа описан в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством культивирования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, в среде, содержащей эксендин-4. Пример такого способа описан в работе D'Amour et al., Nature Biotechnology, 2006.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способом, описанным в заявке на патент США с серийным номером 11/736908 компании LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способом, описанным в заявке на патент США с серийным номером 11/779311 компании LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способом, описанным в заявке на патент США с серийным номером 60/953178 компании LifeScan, Inc.
Например, клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, полученные в соответствии со способами, составляющими предмет настоящего изобретения, далее дифференцируются в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, посредством обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, фактором, ингибирующим сигнальный путь Notch, в соответствии со способом, описанным в заявке на патент США с серийным номером 60/990529 компании LifeScan, Inc.
Маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, выбираются из группы, в которую входят NGN3, NEUROD, ISL1, PDX1, NKX6.1, PAX4, NGN3 и PTF-1 альфа. В одном осуществлении панкреатические эндокринные клетки способны экспрессировать не менее одного из следующих гормонов: инсулин, глюкагон, соматостатин и панкреатический полипептид. В настоящем изобретении можно использовать клетку, которая экспрессирует как минимум один из маркеров, характерных для панкреатической эндокринной линии. В одном из аспектов настоящего изобретения клеткой, экспрессирующей маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, является панкреатическая эндокринная клетка. Панкреатической эндокринной клеткой может быть панкреатическая клетка, экспрессирующая гормоны. В качестве иного варианта панкреатической эндокринной клеткой может быть панкреатическая клетка, секретирующая гормоны.
В одном из аспектов настоящего изобретения панкреатической эндокринной клеткой является клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии β-клеток. Клетка, экспрессирующая маркеры, характерные для линии β-клеток, экспрессирует PDX1 и не менее одного из следующих факторов транскрипции: NGN3, NKX2.2, NKX6.1, NEUROD, ISL1, HNF3 бета, MAFA, PAX4 и PAX6. В одном из аспектов настоящего изобретения клеткой, экспрессирующей маркеры, характерные для линии β-клеток, является β-клетка.
Способы терапевтического применения
В одном аспекте настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента, у которого диагностирован или может развиться диабет 1 типа. В одном из осуществлений метод предусматривает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку полипотентных стволовых клеток in vitro в линию β-клеток и имплантацию пациенту клеток линии β-клеток. В другом осуществлении способ предусматривает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку полипотентных стволовых клеток in vitro в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3, и имплантацию пациенту клеток линии панкреатической энтодермы, ко-экспрессирующей PDX1, NKX6.1, но не экспрессирующей CDX2 и NGN3.
В еще одном аспекте настоящее изобретение предусматривает способ лечения пациента, у которого диагностирован или может развиться диабет 2 типа. В одном из осуществлений метод предусматривает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку полипотентных стволовых клеток in vitro в линию β-клеток и имплантацию пациенту клеток линии β-клеток. В другом осуществлении способ предусматривает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку полипотентных стволовых клеток in vitro в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3, и имплантацию пациенту клеток линии панкреатической энтодермы, ко-экспрессирующей PDX1, NKX6.1, но не экспрессирующей CDX2 и NGN3.
В отдельных случаях пациент может проходить дополнительное лечение фармацевтическими препаратами или биологически активными веществами, способствующими выживанию и функционированию пересаженных клеток. В числе этих препаратов могут быть, например, инсулин, представители семейства TGF-β, в том числе TGF-β1, 2 и 3, костные морфогенетические белки (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 и -13), факторы роста фибробластов-1 и -2, фактор роста тромбоцитов-AA и -BB, обогащенная тромбоцитами плазма, фактор роста инсулина (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -7, -8, -10, -15), эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), плейотрофин, эндотелин и другие. Другими фармацевтическими соединениями могут быть, например, никотинамид, глюкагоноподобный пептид-I (GLP-1) и II, GLP-1 и 2 mimetibody, эксендин-4, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, ингибиторы МАПК, такие как, например, соединения, описанные в опубликованной заявке на патент США 2004/0209901 и в опубликованной заявке на патент США 2004/0132729.
Полипотентные стволовые клетки можно дифференцировать в производящие инсулин клетки перед трансплантацией реципиенту. В отдельном осуществлении полипотентные стволовые клетки полностью дифференцируются в β-клетки перед трансплантацией реципиенту. В качестве иного варианта полипотентные стволовые клетки можно трансплантировать реципиенту в недифференцированном или частично дифференцированном состоянии. Дальнейшая дифференцировка может происходить в организме реципиента.
Клетки дефинитивной энтодермы или, в качестве иного варианта, клетки панкреатической энтодермы или, в качестве иного варианта, β-клетки могут имплантироваться в виде клеток в суспензии или в виде кластеров, которые можно вводить в воротную вену печени. В качестве иного варианта клетки можно дополнять биологически совместимыми и деструктурируемыми полимерными вспомогательными средствами, пористыми недеструктурируемыми средствами или инкапсулировать их для защиты от иммунной реакции организма. Клетки можно имплантировать в подходящий участок тела реципиента. К местам имплантации относятся, например, печень, естественная поджелудочная железа, субкапсулярное пространство почки, сальник, брюшина, субсерозное пространство, кишечник, желудок и подкожный карман.
Для стимулирования дальнейшей дифференцировки, выживаемости или активности имплантированных клеток могут вводиться дополнительные факторы, такие как факторы роста, антиоксиданты и противовоспалительные средства, до или после введения клеток, а также одновременно с ними. В определенных осуществлениях используются факторы роста для дифференцировки введенных клеток in vivo. Эти факторы могут секретироваться эндогенными клетками и взаимодействовать с введенными клетками in situ. Можно индуцировать дифференцировку имплантированных клеток любым сочетанием эндогенных и экзогенно введенных факторов роста, известных в данной области.
Количество клеток, используемых в имплантации, зависит от различных факторов, в том числе от состояния пациента и его реакции на лечение, и может быть определено специалистом.
В одном аспекте настоящего изобретения предусматривается способ лечения пациента, у которого диагностирован или может развиться диабет. Настоящий способ предусматривает культивирование полипотентных стволовых клеток, дифференцировку культивированных клеток in vitro в линию β-клеток и встраивание клеток в трехмерную подложку. Клетки можно сохранять in vitro на этой подложке до имплантации пациенту. В качестве иного варианта подложку с клетками можно непосредственно имплантировать пациенту без дополнительного культивирования in vitro. В подложку можно встраивать по меньшей мере один фармацевтический препарат, способствующий выживанию и функционированию трансплантированных клеток.
К числу материалов подложки, пригодных для использования в целях настоящего изобретения, относятся матрицы тканей, каналы, барьеры и резервуары, используемые для восстановления тканей. В частности, для реализации способов, составляющих предмет настоящего изобретения, подходят синтетические и природные материалы в форме пен, губок, гелей, гидрогелей, тканей и нетканых структур, которые используются in vitro и in vivo для восстановления или регенерации биологической ткани, а также с целью доставки хемотаксических агентов для индуцирования роста ткани. См., например, материалы, описанные в патенте США 5770417, патенте США 6022743, патенте США 5567612, патенте США 5759830, патенте США 6626950, патенте США 6534084, патенте США 6306424, патенте США 6365149, патенте США 6599323, патенте США 6656488, опубликованной заявке на патент США 2004/0062753 A1, патенте США 4557264 и патенте США 6333029.
Для получения подложки со встроенным фармацевтическим препаратом этот фармацевтический препарат можно смешать с раствором полимера перед образованием подложки. В качестве иного варианта фармацевтический препарат можно нанести в виде покрытия на изготовленную подложку, предпочтительно в присутствии фармацевтического носителя. Фармацевтический препарат может присутствовать в виде жидкости, тонко измельченного твердого вещества или в другой подходящей физической форме. В качестве иного варианта можно добавлять в подложку наполнители для изменения скорости высвобождения фармацевтического препарата. В альтернативном осуществлении в подложку встраивается по меньшей мере одно фармацевтическое соединение, представляющее собой противовоспалительный препарат, как, например, соединения, описанные в патенте США 6509369.
В подложку может встраиваться по меньшей мере одно фармацевтическое соединение, представляющее собой антиапоптозный препарат, как, например, соединения, описанные в патенте США 6793945.
В подложку может также встраиваться по меньшей мере одно фармацевтическое соединение, представляющее собой ингибитор фиброза, как, например, соединения, описанные в патенте США 6331298.
В подложку может также встраиваться по меньшей мере одно фармацевтическое соединение, способное стимулировать развитие кровеносных сосудов, как, например, соединения, описанные в опубликованной заявке на патент США 2004/0220393 и в опубликованной заявке на патент США 2004/0209901.
В подложку может также встраиваться по меньшей мере одно фармацевтическое соединение, представляющее собой иммунодепрессант, такой как, например, соединения, описанные в опубликованной заявке на патент США 2004/0171623.
В подложку также может встраиваться по меньшей мере одно из фармацевтических соединений, являющихся факторами роста, таких как, например, представители семейства TGF-β, в том числе TGF-β1, 2 и 3, костные морфогенетические белки (BMP-2, -3, -4, -5, -6, -7, -11, -12 и -13), факторы роста фибробластов-1 и -2, фактор роста тромбоцитов-AA и -BB, обогащенная тромбоцитами плазма, фактор роста инсулина (IGF-I, II), фактор роста и дифференцировки (GDF-5, -6, -8, -10, -15), эндотелиальный фактор роста сосудов (VEGF), плейотрофин, эндотелин и другие. Другими фармацевтическими соединениями могут быть, например, никотинамид, фактор 1-альфа, индуцируемый гипоксией, глюкагоноподобный пептид-I (GLP-1), GLP-1 и GLP-2 mimetibody, и II, эксендин-4, nodal, noggin, NGF, ретиноевая кислота, паратиреоидный гормон, тенасцин-C, тропоэластин, тромбин-производные пептиды, кателицидины, дефензины, ламинин, биологические пептиды с содержанием связывающих клетки и гепарин доменов белков адгезивной внеклеточной матрицы, такие как фибронектин и витронектин, ингибиторы МАПК, такие как, например, соединения, описанные в опубликованной заявке на патент США 2004/0209901 и в опубликованной заявке на патент США 2004/0132729.
Встраивание клеток по данному изобретению в каркас можно выполнять посредством простого размещения клеток на каркасе. Клетки могут проникать в каркас в ходе простой диффузии (J. Pediatr. Surg. 23 (1 Pt 2):3-9 (1988)). Для повышения эффективности высевания клеток было разработано еще несколько подходов. Например, используют вращающиеся колбы для высевания хондроцитов на матрицы полигликолиевой кислоты (Biotechnol. Prog. 14(2):193-202 (1998)). Другой подход к высеванию клеток заключается в использовании центрифугирования, что приводит к минимальной нагрузке на высеваемые клетки и повышает эффективность высевания. Например, Янг с соавторами (Yang et al.) разработали способ высевания клеток (J. Biomed. Mater. Res. 55(3):379-86 (2001)), называемый иммобилизацией клеток на центрифуге (CCI).
Далее настоящее изобретение иллюстрируется, помимо прочего, следующими примерами.
ПРИМЕРЫ
Пример 1
Дифференцировка полипотентных стволовых клеток человека в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3
Этот пример демонстрирует, что активин A можно использовать в сочетании с реактивом Noggin и ретиноевой кислотой для повышения эффективности повышающей регуляции экспрессии NKX6.1. По краткому описанию, клетки линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека культивируются на чашках с покрытием MATRIGEL™ (с разбавлением 1:30) и средой RPMI с добавлением 2% БСА, 100 нг/мл активина A, 20 нг/мл WNT-3a, 8 нг/мл bFGF в течение суток с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА, 100 нг/мл активина A, 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a. DMEM/F12+2% БСА+50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b. DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin+20 нг/мл активина A или 50 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3).
Для контроля отдельные популяции клеток обрабатываются DMEM с высоким содержанием глюкозы с добавлением 1% B27, 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ циклопамина-KAAD, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA) и 100 нг/мл реактива Noggin.
На стадии 3 дня 4 отбирались двойные пробы культур и проводился анализ экспрессии панкреатических маркеров методом ПЦР в режиме реального времени.
Как показано на фиг.1, наблюдался резкий рост экспрессии NKX6.1 на стадии 3 дня 4 по сравнению с образцами из клеток, не получавших активин A. Рост экспрессии NKX6.1, вызванный активином A, был пропорционален дозе активина A. Кроме того, наблюдалась понижающая регуляция экспрессии NGN3 в клетках на стадии 3, день 4. Для того чтобы определить, был ли задействован путь TGF-бета в активизации образования клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для панкреатической эндокринной линии, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, клетки обрабатывались следующим образом:
Клетки линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека культивировались на чашках с покрытием из MATRIGEL (с разбавлением 1:30) и дифференцировались в предшественники панкреатических эндокринных клеток по следующему протоколу:
a) среда RPMI (№ по каталогу 22400, Invitrogen, штат Калифорния) с добавлением 2% БСА (№ по каталогу 152401, MP Biomedical, штат Огайо) и 100 нг/мл активина A (R&D Systems, штат Миннесота) плюс 20 нг/мл WNT-3a (№ по каталогу 1324-WN-002, R&D Systems, штат Миннесота) плюс 8 нг/мл bFGF (№ по каталогу 100-18B, PeproTech, штат Нью-Джерси) в течение одного дня с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА и 100 нг/мл активина A плюс 8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
b) DMEM/F12 (№ по каталогу 11330, Invitrogen, штат Калифорния)+2% БСА+50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
c) обработка по варианту 1: DMEM (с высоким содержанием глюкозы)+1% B27 (Invitrogen, штат Калифорния)+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin в течение четырех дней (стадия 3), или
d) обработка по варианту 2: DMEM (с высоким содержанием глюкозы)+1% B27 (Invitrogen, штат Калифорния)+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin, 20 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3), или
e) обработка по варианту 3: DMEM (с высоким содержанием глюкозы)+1% B27 (Invitrogen, штат Калифорния)+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin, 1 мкМ ALK5 ингибитора II (Alexis Biochemical) в течение четырех дней (стадия 3).
На стадии 3 дня 4 отбирались двойные пробы культур и проводился анализ экспрессии панкреатических маркеров методом ПЦР в режиме реального времени. Культуры также параллельно фиксировались для иммунофлюоресцентного анализа.
В таблице 1 показаны относительные уровни экспрессии NKX6.1, NGN3 и PDX1 на стадии 3, день 4, после нормализации по минимальному состоянию в данном эксперименте (обработка по варианту 1).
Таблица 1
  NGN3 NKX6.1 PDX1
Вариант обработки 1 1 1 1
Вариант обработки 2 0,02 5,97 1,13
Вариант обработки 3 5,64 0,02 0,65
Обработка по варианту 1 (FGF7, ретиноевая кислота и реактив Noggin) привела к экспрессии NKX6.1 и NGN3. См. фиг.2, панели a и b. Однако добавление активина A (обработка по варианту 2) блокировало экспрессию NGN3 и существенно повысило число клеток, экспрессирующих NKX6.1. См. фиг.2, панели c и d. Эти данные позволяют предположить, что активация пути рецептора TGFβ во время образования популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, приводит к образованию популяции клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые не экспрессируют NGN3.
Инкубация клеток с ингибитором Alk5 II рецептора TGFβ подтверждает эту гипотезу (см. вариант обработки 3). Обработка клеток DMEM (с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 1% B27 (Invitrogen, штат Калифорния), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ циклопамина-KAAD, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA), 100 нг/мл реактива Noggin, 1 мкМ ALK5 ингибитора II привела к снижению уровня экспрессии NKX6.1. Наблюдавшийся уровень экспрессии был ниже, чем в клетках, обрабатывавшихся по варианту 1 (см. таблицу 1, а также фиг.2, панель e). С другой стороны, число клеток, экспрессирующих NGN3, значительно возросло. См. таблицу 1, а также фиг.2, панель f. Существенного влияния на экспрессию PDX1 не наблюдалось. Эти результаты позволяют предположить, что сочетание реактива Noggin, ретиноевой кислоты и активина A оказывает синергическое действие, определяя популяцию панкреатических клеток-предшественников, положительную по отношению к экспрессии NKN6.1 и PDX1, но отрицательную по отношению к экспрессии NGN3.
Как показано на фиг.3, панели a и b, большинство клеток, экспрессирующих PDX1, полученных с помощью DMEM (обработка по варианту 2 - DMEM (с высоким содержанием глюкозы) с добавлением 1% B27 (Invitrogen, штат Калифорния), 50 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ циклопамина-KAAD, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA), 100 нг/мл реактива Noggin, 20 нг/мл активина А) не экспрессировали CDX2 на стадии 3, день 4. Этим они отличаются от клеток, экспрессирующих PDX1, полученных с помощью DMEM/F12 с добавлением 1% B27 (Invitrogen, штат Калифорния)+50 нг/мл FGF7, 0,25 мкМ циклопамина-KAAD, 2 мкМ ретиноевой кислоты (RA), 100 нг/мл реактива Noggin, 20 нг/мл активина A, где большинство клеток, экспрессировавших PDX1, экспрессировали и CDX2. См. фиг.3, панели c и d.
Тестировался ряд антагонистов рецептора TGFβ. В случае замены в обработке по варианту 2 активина А на GDF-8, GDF-11, активин B или TGFβ2 результаты были аналогичными: обработка GDF-8, GDF-11, активином B или TGFβ2 в течение четырех дней приводила к повышению экспрессии NKX6.1 и понижающей регулировке NGN3. См. фиг.4, панели a и c. Значительного влияния на экспрессию PDX1 не наблюдалось. См. фиг.4, панель b.
Пример 2
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX-2 и NGN3, в предшественники панкреатических эндокринных клеток
Предыдущие исследования показали, что клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, при дальнейшей дифференцировке с большей вероятностью порождают глюкагон-экспрессирующие клетки, чем инсулин-экспрессирующие клетки. Это может быть отчасти обусловлено экспрессией NGN3 в клетках панкреатической энтодермы. Способы, составляющие предмет настоящего изобретения, позволяют получать популяцию клеток панкреатической энтодермы, которые не экспрессируют NGN3, а потому с большей вероятностью будут дифференцироваться в клетки, вырабатывающие инсулин. Однако экспрессия NGN3 необходима для формирования панкреатических эндокринных клеток или предшественников панкреатических эндокринных клеток (клеток, которые могут формировать, например, глюкагон- или инсулин-экспрессирующие клетки). Поэтому временная регуляция NGN3 важна для конечной судьбы предшественников панкреатических эндокринных клеток.
В настоящем изобретении предполагается, что следует поддерживать экспрессию NGN3 на минимальном уровне до начала дифференцировки панкреатической энтодермы в предшественники панкреатических эндокринных клеток.
По краткому описанию, клетки линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека культивируются на чашках с покрытием MATRIGEL™ (с разбавлением 1:30) и средой RPMI с добавлением 2% БСА, 100 нг/мл активина A, 20 нг/мл WNT-3a, 8 нг/мл bFGF в течение суток с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА+100 нг/мл активина A+8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a) DMEM/F12+2% БСА+50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin+20 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3), затем
c) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+100 нг/мл Noggin+1 мкМ ингибитора II ALK5 в течение трех дней (стадия 4), или
d) DMEM с высоким содержанием глюкозы+только 1% B27 в течение трех дней (стадия 4).
Указанный выше протокол дифференцировки был разработан для проверки способности клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1 и NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3, далее дифференцироваться в предшественники панкреатических эндокринных клеток. Предшественники панкреатических эндокринных клеток экспрессируют NGN3.
Простое культивирование клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3, в базальной среде (DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27) не привело к появлению экспрессии NGN3. См. фиг.5, панель a, светло-серые полоски. Подобным образом, также не наблюдалась экспрессия NEUROD, NKX2.2 и PAX6.
Напротив, в клетках, инкубированных в присутствии ингибитора Alk5 II, наблюдалось значительное увеличение экспрессии NGN3. См. фиг.5, панель a, темно-серые полоски. Также наблюдалась повышающая регуляция экспрессии NEUROD, NKX2.2, PAX4 и PAX6, как и рост экспрессии PTF1 альфа. См. фиг.5, панели a и b. Присутствие ингибитора Alk5 II, судя по всему, не влияло на экспрессию PDX1 и NKX6.1. См. фиг.5, панель b.
Рост экспрессии NGN3, обнаруженный методом ПЦР, в присутствии ингибитора Alk5 II также отразился на росте ряда клеток, положительных к присутствию белка NGN3, как показали иммуноцитохимические измерения. См. фиг.6. Анализ изображений показал, что большая часть клеток, экспрессирующих NGN3, экспрессировала также PDX1, но не NKX6.1. Кроме того, большая часть клеток NKX6.1 экспрессировала PDX1. На этой стадии уровень экспрессии эндокринных клеток, судя по экспрессии инсулина и глюкагона, был минимальным. Наши результаты позволяют предположить, что активация TGF-бета пути должна способствовать образованию популяции клеток, ко-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, а последующее ингибирование TGF-бета пути будет дополнительно приводить к дифференцировке энтодермы в эндокринные клетки-предшественники.
Пример 3
Дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX-2 и NGN3, в панкреатические эндокринные клетки
Этот пример был разработан для проверки способности клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1 и NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3, далее дифференцироваться в панкреатические эндокринные клетки из предшественников панкреатических эндокринных клеток.
По краткому описанию, клетки линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека культивируются на чашках с покрытием MATRIGEL™ (с разбавлением 1:30) и средой RPMI с добавлением 2% БСА, 100 нг/мл активина A, 20 нг/мл WNT-3a, 8 нг/мл bFGF в течение суток с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 2% БСА+100 нг/мл активина A+8 нг/мл bFGF в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a) DMEM/F12+2% БСА+50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin+20 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3), или
c) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+50 нг/мл FGF7+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin+20 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3), затем
d) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+100 нг/мл Noggin+1 мкМ ингибитора II ALK5 в течение трех дней (стадия 4),
e) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+100 нг/мл реактива Noggin+1 мкМ ингибитора II ALK5+бетацеллюлин 20 нг/мл в течение пяти-семи дней (стадия 5).
Экспрессия NGN3 и PAX4 снизилась от максимального уровня на стадии 4, день 3, и достигла нижнего уровня экспрессии на стадии 5, день 7. В течение этого времени экспрессия эндокринных маркеров (например, инсулина и глюкагона) увеличилась. См. фиг.7. Эти данные указывают на то, что клетки, составляющие предмет настоящего изобретения, были способны к образованию панкреатических эндокринных клеток из эндокринных клеток-предшественников.
Наблюдались клетки, экспрессирующие или только инсулин, или только глюкагон, или инсулин и глюкагон одновременно. См. фиг.8 и таблицу 2. Как показал анализ методом поточной цитометрии (FACS) культур на стадии 5, день 7 (таблица 2), приблизительно 60% дифференцированных предшественников панкреатической энтодермы, ко-экспрессировавших PDX1 и NKX6.1, экспрессировали панэндокринный маркер синаптофизин. Доля клеток, экспрессировавших только инсулин, составляла 10,4%, а клеток, экспрессировавших только глюкагон, - 5,1%. Кроме того, 20% клеток экспрессировало и инсулин, и глюкагон. Среди клеток, экспрессировавших инсулин, но не экспрессировавших больше ни одного панкреатического гормона, 60% экспрессировали также NKX6.1 (маркер взрослых бета-клеток). Эти данные позволяют предположить, что более взрослые инсулин-экспрессирующие клетки образовались по методу, составляющему предмет настоящего изобретения.
Таблица 2
  Инсулин
Инсулин+ 10,4%
Глюкагон+ 5,1%
Инсулин+/глюкагон+ 20%
Синаптофизин+ 60%
NKX6.1+ 52%
NKX6.1+/инсулин+ 6%
Пример 4
Имплантация клеток, составляющих предмет настоящего изобретения, STZ-индуцированным мышам с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (ТКИН) с врожденным отсутствием естественных клеток-киллеров (Bg)
Клетки линии H1 эмбриональных стволовых клеток человека культивируются на чашках с покрытием MATRIGEL™ (с разбавлением 1:30) и средой RPMI с добавлением 0,2% ЭБС+100 нг/мл активина A+20 нг/мл WNT-3a в течение суток с последующей обработкой средой RPMI с добавлением 0,5% ЭБС+100 нг/мл активина A в течение еще двух дней (стадия 1), затем
a) DMEM/F12+2% ЭБС+50 нг/мл FGF7 в течение трех дней (стадия 2), затем
b) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+0,25 мкМ циклопамина-KAAD+2 мкМ ретиноевой кислоты (RA)+100 нг/мл реактива Noggin+50 нг/мл FGF7+20 нг/мл активина A в течение четырех дней (стадия 3), затем
c) DMEM с высоким содержанием глюкозы+1% B27+100 нг/мл Noggin+1 мкМ ингибитора II ALK5 в течение четырех дней (стадия 4).
ТКИН/Bg самцы мыши возрастом от пяти до шести недель (C.B-Igh-1b/GbmsTac-Prkdcscid-Lystbg N7) были приобретены в компании Taconic Farms. Мышей держали в клетках микроизолятора со свободным доступом к стерилизованной пище и воде. При подготовке к хирургическому вмешательству мышей метили ярлыком на ухе и измеряли вес тела и уровень сахара в крови ручным глюкометром (One Touch, LifeScan).
За две недели до пересадки мышей взвешивали и вводили им 80 мг/кг стрептозотоцина (Sigma), растворенного в ацетатном буфере с pH 4,5, пять дней подряд, чтобы вызвать диабет. Контролировался уровень глюкозы в крови, и только мыши с уровнем глюкозы >300 мг/дл использовались в качестве реципиентов для трансплантации.
Мышам в качестве обезболивающего вводили смесь изофлурана и кислорода, а место хирургического вмешательства брили небольшими ножницами для животных. Мышам вводили 0,1 мг/кг препарата Buprenex подкожно перед операцией. Место хирургической операции подготавливали, промывая несколько раз 70% изопропиловым спиртом и 10% повидон-йодом.
Клетки конца четвертой стадии кратковременно обрабатывались 1 мг/мл диспазы в течение пяти минут, механически набирались 1-мл стеклянной пипеткой и переносились в неадгезивные планшеты для культивирования в течение ночи. Во время дооперационной подготовки мышей клетки центрифугировали в 1,5 мл микроцентрифуге и большую часть супернатанта убирали, оставляя лишь столько, сколько нужно для того, чтобы собрать гранулу клеток. Клетки собирали в пипетку Rainin Pos-D положительного вытеснения и далее пипетку инвертировали, позволяя клеткам осаждаться под действием силы тяжести. Излишек среды убирали и получали упакованный препарат клеток для пересадки.
Для пересадки использовался катетер 24GЧѕ” I.V., позволяющий проникать в капсулу почки, после чего иглу вынимали. Затем катетер вводили под капсулу почки к дистальному полюсу почки. Наконечник пипетки Pos-D устанавливали жестко в соединитель катетера и вводили 5 миллионов клеток из пипетки через катетер под капсулу почки к дистальному полюсу почки. Капсулу почки герметизировали низкотемпературным прижиганием, и далее почку возвращали в исходное анатомическое положение. Параллельно агрегаты клеток, содержащие 5 миллионов клеток, загружались в 50-мкл устройство с помощью наконечника пипетки Post-D. Устройства объемом 50 мкл приобретались в компании TheraCyte, Inc (Ирвин, штат Калифорния). Устройство герметизировали медицинским силиконовым клеем типа A (Dow Corning, № по каталогу 129109) после загрузки и имплантировали подкожно ТКИН/Bg мышам (животные № 3 и 4). Мышцу зашивали непрерывным швом с использованием викрила 5-0 и далее закрывали кожу при помощи зажимов для ран. После операции мышам вводили 1,0 мг/кг препарата Metacam подкожно. Мышей выводили из анестезии и позволяли им полностью поправиться.
После пересадки мышей взвешивали раз в неделю, а уровень глюкозы в крови измеряли дважды в неделю. Через различные интервалы после пересадки забиралась кровь через ретроорбитальное пространство в пипетки для микроцентрифуги с небольшим содержанием гепарина. Кровь центрифугировали и плазму помещали во вторую пипетку для микроцентрифуги и замораживали на сухом льду, после чего хранили при температуре -80ºC до выполнения анализа С-пептида человека. Уровень С-пептида человека определяли с помощью Mercodia/ALPCO Diagnostics Ultrasensitive C-peptide ELISA (№ по каталогу 80-CPTHU-E01, Alpco Diagnostics, штат Нью-Гемпшир) в соответствии с инструкциями изготовителя.
C-пептид человека обнаруживали в сыворотке животных уже через 4 недели в группе капсулы почки после пересадки, и его уровень рос со временем (фиг.9, панель a). По истечении двух месяцев мы смогли обнаружить значительное количество циркулирующего C-пептида человека, 1,1±0,5 нг/мл (фиг.9, панель a). В период до двух месяцев после пересадки уровень глюкозы в крови не натощак неизменно был выше 400 нг/дл. В этом исследовании введения инсулина не требовалось. Рост концентрации в сыворотке вызванного пересадкой инсулина выше 1 нг/мл, приводит к постепенному уменьшению гипергликемии. Через три месяца мы смогли обнаружить значительное количество циркулирующего C-пептида человека у 90% STZ-индуцированных животных с диабетом. Средний уровень циркулирующего C-пептида человека составлял 2±0,96 нг/мл (n=8) (фиг.9, панель a). Уровень глюкозы у 90% мышей с диабетом, привитых эндокринными предшественниками из клеток hES, был ниже 200 мг/дл и не менялся. После того как мы хирургически удалили пересаженный материал, уровень глюкозы в крови увеличился до гипергликемических значений вскоре после удаления имплантата, что позволяет предположить, что пересаженные клетки человека были единственной причиной поддержания нормогликемии у STZ-обработанных мышей (фиг.9, панель b).
Этот пример демонстрирует, что популяция клеток, ко-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, и популяция эндокринных клеток-предшественников, полученных из популяции клеток, ко-экспрессирующих PDX1 и NKX6.1, обладает способностью далее дифференцироваться в инсулин-секретирующие клетки in vivo.
Публикации, цитируемые в данном документе, включаются в него полностью посредством ссылки. Хотя различные аспекты изобретения проиллюстрированы выше ссылками на примеры и предпочтительные осуществления, следует понимать, что область изобретения определяется не приведенным выше описанием, но указанными ниже пунктами, понимаемыми в соответствии с нормами патентного права.

Claims (1)

  1. Способ дифференцировки популяции полипотентных стволовых клеток, полученных из установленных линий полипотентных стволовых клеток, в популяцию клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которая ко-экспрессирует PDX1, NKX6.1, но не экспрессирует CDX2 и NGN3, включающий следующие стадии:
    a) культивирование полипотентных стволовых клеток;
    b) дифференцировка полипотентных стволовых клеток в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы;
    c) дифференцировка клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, в клетки, экспрессирующие маркеры, характерные для линии панкреатической энтодермы, которые ко-экспрессируют PDX1, NKX6.1, но не экспрессируют CDX2 и NGN3, посредством обработки клеток, экспрессирующих маркеры, характерные для линии дефинитивной энтодермы, первой средой с добавлением от 50 пг/мл до 50 мкг/мл FGF7 с последующим культивированием клеток во второй среде с добавлением от 50 пг/мл до 50 мкг/мл FGF7, от 500 нг/мл до 500 мкг/мл фактора, способного ингибировать BMP, от 2 нг/мл до 100 нг/мл активина А, от 1 нМ до 1 мМ ретиноевой кислоты, от 0,025 мкМ до 2,5 мкМ ингибитора сигнального пути белка хеджехог и от 2 нг/мл до 100 нг/мл агониста рецептора TGF-β.
RU2012105923/10A 2009-07-20 2010-07-19 Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека RU2540021C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US22693609P 2009-07-20 2009-07-20
US61/226,936 2009-07-20
PCT/US2010/042393 WO2011011302A2 (en) 2009-07-20 2010-07-19 Differentiation of human embryonic stem cells

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012105923A RU2012105923A (ru) 2013-08-27
RU2540021C2 true RU2540021C2 (ru) 2015-01-27

Family

ID=43465585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012105923/10A RU2540021C2 (ru) 2009-07-20 2010-07-19 Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека

Country Status (18)

Country Link
US (1) US8785184B2 (ru)
EP (1) EP2456858B1 (ru)
JP (1) JP5819825B2 (ru)
KR (2) KR101785626B1 (ru)
CN (1) CN102482640B (ru)
AR (1) AR077767A1 (ru)
AU (1) AU2010276440B2 (ru)
BR (1) BR112012001557A2 (ru)
CA (1) CA2768644A1 (ru)
ES (1) ES2693088T3 (ru)
GB (1) GB2485112B (ru)
HK (1) HK1170262A1 (ru)
MX (1) MX340952B (ru)
PL (1) PL2456858T3 (ru)
RU (1) RU2540021C2 (ru)
SG (1) SG177483A1 (ru)
WO (1) WO2011011302A2 (ru)
ZA (1) ZA201201221B (ru)

Families Citing this family (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2993226B1 (en) * 2008-06-03 2020-12-16 Viacyte, Inc. Growth factors for production of definitive endoderm
ES2849181T3 (es) * 2009-04-22 2021-08-16 Viacyte Inc Composiciones celulares derivadas de células reprogramadas desdiferenciadas
JP6013196B2 (ja) 2010-03-01 2016-10-25 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド 多能性幹細胞から誘導した細胞を精製するための方法
WO2012046085A2 (en) 2010-10-08 2012-04-12 Mina Therapeutics Limited Methods of inducing insulin production
JP6312591B2 (ja) * 2011-06-21 2018-04-18 ノヴォ ノルディスク アー／エス 多能性幹細胞からの胚体内胚葉の効率的な誘導
RU2668798C2 (ru) 2011-12-22 2018-10-02 Янссен Байотек, Инк. Способы in vitro пошаговой дифференцировки полюрипотентных клеток
ES2690118T3 (es) * 2012-06-08 2018-11-19 Janssen Biotech, Inc. Diferenciación de células madre embrionarias humanas en células endocrinas pancreáticas
JP6470687B2 (ja) 2012-09-03 2019-02-13 ノヴォ ノルディスク アー／エス 小分子を用いた多能性幹細胞からの膵臓内胚葉の作製
ES2837763T3 (es) 2012-12-31 2021-07-01 Janssen Biotech Inc Cultivo de células madre embrionarias humanas en la interconexión aire-líquido para la diferenciación en células endocrinas pancreáticas
DK2938722T3 (da) 2012-12-31 2022-02-14 Janssen Biotech Inc Suspension og klyngedannelse af humane pluripotente celler til differentiering til endokrine pankreasceller
US8859286B2 (en) 2013-03-14 2014-10-14 Viacyte, Inc. In vitro differentiation of pluripotent stem cells to pancreatic endoderm cells (PEC) and endocrine cells
EP3569694A1 (en) 2013-06-11 2019-11-20 President and Fellows of Harvard College Sc-beta cells and compositions and methods for generating the same
SI3594348T1 (sl) 2013-11-22 2022-04-29 Mina Therapeutics Limited Sestavki kratko aktivirajoče rna c/ebp alfa in postopki uporabe
DK3234110T3 (da) 2014-12-18 2024-05-13 Harvard College FREMGANGSMÅDER TIL GENERERING AF STAMCELLE-AFLEDTE ß-CELLER OG ANVENDELSER DERAF
WO2016100898A1 (en) 2014-12-18 2016-06-23 President And Fellows Of Harvard College Serum-free in vitro directed differentiation protocol for generating stem cell-derived b cells and uses thereof
CN113234661A (zh) 2014-12-18 2021-08-10 哈佛学院校长同事会 干细胞来源的β细胞的产生方法及其使用方法
US10767164B2 (en) 2017-03-30 2020-09-08 The Research Foundation For The State University Of New York Microenvironments for self-assembly of islet organoids from stem cells differentiation
US10391156B2 (en) 2017-07-12 2019-08-27 Viacyte, Inc. University donor cells and related methods
CN111630155B (zh) 2017-11-15 2024-05-03 沃泰克斯药物股份有限公司 胰岛细胞制备性组合物和使用方法
WO2020033879A1 (en) 2018-08-10 2020-02-13 Semma Therapeutics, Inc. Stem cell derived islet differentiation
US20200080107A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Crispr Therapeutics Ag Universal donor cells
EP3856205A4 (en) * 2018-09-25 2022-06-15 The Regents of the University of California PRODUCTION AND ACCUMULATION OF PANCREATIC ENDOCRIN PROGENIOR CELLS
CN114206480B (zh) 2019-05-31 2024-06-04 W.L.戈尔及同仁股份有限公司 生物相容性膜复合材料
CA3139292A1 (en) 2019-05-31 2020-12-03 Timothy M. BRUHN Cell encapsulation devices with controlled oxygen diffusion distances
US20220370184A1 (en) 2019-05-31 2022-11-24 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3139585C (en) 2019-05-31 2024-01-23 W. L. Gore & Associates, Inc. A biocompatible membrane composite
CA3150233A1 (en) 2019-09-05 2021-03-11 Alireza Rezania UNIVERSAL DONOR CELLS
EP4025690A1 (en) 2019-09-05 2022-07-13 CRISPR Therapeutics AG Universal donor cells
JP2024503290A (ja) 2020-12-31 2024-01-25 クリスパー セラピューティクス アクチェンゲゼルシャフト ユニバーサルドナー細胞

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20030138948A1 (en) * 2001-12-07 2003-07-24 Fisk Gregory J. Islet cells from human embryonic stem cells
US20060281174A1 (en) * 2004-03-09 2006-12-14 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
RU2305708C2 (ru) * 2001-10-02 2007-09-10 Энститю Клейтон Де Ля Решерш Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение
US20070259421A1 (en) * 2006-03-02 2007-11-08 D Amour Kevin A Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production
RU2351648C2 (ru) * 2001-11-09 2009-04-10 Артесел Сайенсиз, Инк. Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование

Family Cites Families (174)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3209652A (en) 1961-03-30 1965-10-05 Burgsmueller Karl Thread whirling method
AT326803B (de) 1968-08-26 1975-12-29 Binder Fa G Maschenware sowie verfahren zur herstellung derselben
US3935067A (en) 1974-11-22 1976-01-27 Wyo-Ben Products, Inc. Inorganic support for culture media
US4499802A (en) 1982-09-29 1985-02-19 Container Graphics Corporation Rotary cutting die with scrap ejection
US4537773A (en) 1983-12-05 1985-08-27 E. I. Du Pont De Nemours And Company α-Aminoboronic acid derivatives
US4557264A (en) 1984-04-09 1985-12-10 Ethicon Inc. Surgical filament from polypropylene blended with polyethylene
US5215893A (en) 1985-10-03 1993-06-01 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding the ba chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US5089396A (en) 1985-10-03 1992-02-18 Genentech, Inc. Nucleic acid encoding β chain prodomains of inhibin and method for synthesizing polypeptides using such nucleic acid
US4737578A (en) 1986-02-10 1988-04-12 The Salk Institute For Biological Studies Human inhibin
US5863531A (en) 1986-04-18 1999-01-26 Advanced Tissue Sciences, Inc. In vitro preparation of tubular tissue structures by stromal cell culture on a three-dimensional framework
US5804178A (en) 1986-11-20 1998-09-08 Massachusetts Institute Of Technology Implantation of cell-matrix structure adjacent mesentery, omentum or peritoneum tissue
US5567612A (en) 1986-11-20 1996-10-22 Massachusetts Institute Of Technology Genitourinary cell-matrix structure for implantation into a human and a method of making
CA1340581C (en) 1986-11-20 1999-06-08 Joseph P. Vacanti Chimeric neomorphogenesis of organs by controlled cellular implantation using artificial matrices
EP0363125A3 (en) 1988-10-03 1990-08-16 Hana Biologics Inc. Proliferated pancreatic endocrine cell product and process
US5837539A (en) 1990-11-16 1998-11-17 Osiris Therapeutics, Inc. Monoclonal antibodies for human mesenchymal stem cells
US5449383A (en) 1992-03-18 1995-09-12 Chatelier; Ronald C. Cell growth substrates
GB9206861D0 (en) 1992-03-28 1992-05-13 Univ Manchester Wound healing and treatment of fibrotic disorders
CA2114282A1 (en) 1993-01-28 1994-07-29 Lothar Schilder Multi-layered implant
JP3525221B2 (ja) 1993-02-17 2004-05-10 味の素株式会社 免疫抑制剤
US5523226A (en) 1993-05-14 1996-06-04 Biotechnology Research And Development Corp. Transgenic swine compositions and methods
GB9310557D0 (en) 1993-05-21 1993-07-07 Smithkline Beecham Plc Novel process and apparatus
TW257671B (ru) 1993-11-19 1995-09-21 Ciba Geigy
US6703017B1 (en) 1994-04-28 2004-03-09 Ixion Biotechnology, Inc. Reversal of insulin-dependent diabetes by islet-producing stem cells, islet progenitor cells and islet-like structures
US5834308A (en) 1994-04-28 1998-11-10 University Of Florida Research Foundation, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans
US6001647A (en) 1994-04-28 1999-12-14 Ixion Biotechnology, Inc. In vitro growth of functional islets of Langerhans and in vivo uses thereof
US6083903A (en) 1994-10-28 2000-07-04 Leukosite, Inc. Boronic ester and acid compounds, synthesis and uses
EP0800829B2 (en) 1994-12-29 2012-07-25 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Use of a pm-1 antibody or of a mh 166 antibody for enhancing the anti-tumor effect of cisplatin or carboplatin
US5843780A (en) 1995-01-20 1998-12-01 Wisconsin Alumni Research Foundation Primate embryonic stem cells
US5718922A (en) 1995-05-31 1998-02-17 Schepens Eye Research Institute, Inc. Intravitreal microsphere drug delivery and method of preparation
US5908782A (en) 1995-06-05 1999-06-01 Osiris Therapeutics, Inc. Chemically defined medium for human mesenchymal stem cells
CA2297176A1 (en) 1997-04-24 1998-10-29 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Substituted imidazoles useful in the treatment of inflammatory diseases
CA2294944A1 (en) 1997-07-03 1999-01-14 Osiris Therapeutics, Inc. Human mesenchymal stem cells from peripheral blood
US6670127B2 (en) 1997-09-16 2003-12-30 Egea Biosciences, Inc. Method for assembly of a polynucleotide encoding a target polypeptide
ATE462004T1 (de) 1997-09-16 2010-04-15 Centocor Inc Methoden zur kompletten chemischen synthese und zusammensetzung von genen und genomen
US6800480B1 (en) 1997-10-23 2004-10-05 Geron Corporation Methods and materials for the growth of primate-derived primordial stem cells in feeder-free culture
CO4980885A1 (es) 1997-12-29 2000-11-27 Ortho Mcneil Pharm Inc Compuestos de trifenilpropanamida utiles en el tratamiento de inflamaciones y metodos para preparar dicho compuesto
CA2320040C (en) 1998-03-18 2007-05-22 Osiris Therapeutics, Inc. Mesenchymal stem cells for prevention and treatment of immune responses in transplantation
MY132496A (en) 1998-05-11 2007-10-31 Vertex Pharma Inhibitors of p38
US7410798B2 (en) 2001-01-10 2008-08-12 Geron Corporation Culture system for rapid expansion of human embryonic stem cells
US6667176B1 (en) 2000-01-11 2003-12-23 Geron Corporation cDNA libraries reflecting gene expression during growth and differentiation of human pluripotent stem cells
US6413556B1 (en) 1999-01-08 2002-07-02 Sky High, Llc Aqueous anti-apoptotic compositions
CA2359159A1 (en) 1999-01-21 2000-07-27 Vitro Diagnostics, Inc. Immortalized cell lines and methods of making the same
US6815203B1 (en) 1999-06-23 2004-11-09 Joslin Diabetes Center, Inc. Methods of making pancreatic islet cells
US6333029B1 (en) 1999-06-30 2001-12-25 Ethicon, Inc. Porous tissue scaffoldings for the repair of regeneration of tissue
US6306424B1 (en) 1999-06-30 2001-10-23 Ethicon, Inc. Foam composite for the repair or regeneration of tissue
US6685936B2 (en) 1999-10-12 2004-02-03 Osiris Therapeutics, Inc. Suppressor cells induced by culture with mesenchymal stem cells for treatment of immune responses in transplantation
US6303424B1 (en) * 1999-10-21 2001-10-16 United Microelectronics Corp. Method for fabricating a buried bit line in a DRAM cell
US20030082155A1 (en) 1999-12-06 2003-05-01 Habener Joel F. Stem cells of the islets of langerhans and their use in treating diabetes mellitus
EP1240518A4 (en) 1999-12-13 2006-05-17 Scripps Research Inst MARKERS FOR THE IDENTIFICATION AND INSULATION OF PRE-GENERIC CELLS OF A AND B PANCREAS ISOLATED CELLS
US7005252B1 (en) 2000-03-09 2006-02-28 Wisconsin Alumni Research Foundation Serum free cultivation of primate embryonic stem cells
US7439064B2 (en) 2000-03-09 2008-10-21 Wicell Research Institute, Inc. Cultivation of human embryonic stem cells in the absence of feeder cells or without conditioned medium
US6436704B1 (en) 2000-04-10 2002-08-20 Raven Biotechnologies, Inc. Human pancreatic epithelial progenitor cells and methods of isolation and use thereof
US6458589B1 (en) 2000-04-27 2002-10-01 Geron Corporation Hepatocyte lineage cells derived from pluripotent stem cells
JP4621410B2 (ja) 2000-06-26 2011-01-26 Ｎｃメディカルリサーチ株式会社 神経細胞へ分化しうる細胞分画の調製方法及び神経変性疾患治療薬の製造方法
CA2426654C (en) 2000-10-23 2010-12-21 Smithkline Beecham Corporation 2,4,8-trisubstituted-8h-pyrido[2,3-d}pyrimidin-7-one compounds
US6849643B2 (en) 2000-12-08 2005-02-01 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Indazolyl-substituted pyrroline compounds as kinase inhibitors
AU2002227371B2 (en) 2000-12-08 2007-05-10 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Macroheterocylic compounds useful as kinase inhibitors
US6599323B2 (en) 2000-12-21 2003-07-29 Ethicon, Inc. Reinforced tissue implants and methods of manufacture and use
JP2005503759A (ja) 2001-01-24 2005-02-10 アメリカ合衆国 幹細胞の膵臓内分泌細胞への分化方法
US6713446B2 (en) 2001-01-25 2004-03-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Formulation of boronic acid compounds
US6656488B2 (en) 2001-04-11 2003-12-02 Ethicon Endo-Surgery, Inc. Bioabsorbable bag containing bioabsorbable materials of different bioabsorption rates for tissue engineering
DE10290025T1 (de) * 2001-04-19 2003-10-09 Develogen Ag Verfahren zur Differenzierung von Stammzellen in Insulin-produzierende Zellen
WO2002088335A1 (fr) 2001-04-24 2002-11-07 Ajinomoto Co., Inc. Cellules souches et procede d'extraction de ces cellules
WO2002092756A2 (en) 2001-05-15 2002-11-21 Rappaport Family Institute For Research In The Medical Sciences Insulin producing cells derived from human embryonic stem cells
US6626950B2 (en) 2001-06-28 2003-09-30 Ethicon, Inc. Composite scaffold with post anchor for the repair and regeneration of tissue
KR100418195B1 (ko) 2001-07-05 2004-02-11 주식회사 우리기술 전력케이블의 다중절연진단장치 및 그 방법
GB0117583D0 (en) 2001-07-19 2001-09-12 Astrazeneca Ab Novel compounds
AU2002319780A1 (en) 2001-08-06 2003-02-24 Bresagen, Ltd. Alternative compositions and methods for the culture of stem cells
US6617152B2 (en) 2001-09-04 2003-09-09 Corning Inc Method for creating a cell growth surface on a polymeric substrate
US20030138951A1 (en) 2001-10-18 2003-07-24 Li Yin Conversion of liver stem and progenitor cells to pancreatic functional cells
JP4330995B2 (ja) 2001-11-15 2009-09-16 チルドレンズ メディカル センター コーポレーション 絨毛膜絨毛、羊水、および胎盤からの胎児性幹細胞を単離、増殖、および分化させる方法、ならびにその治療的使用方法
CA2469370C (en) 2001-12-07 2014-07-08 Macropore Biosurgery, Inc. Adipose-derived cell processing unit
WO2003054169A1 (en) 2001-12-21 2003-07-03 Thromb-X Nv Compositions for the in vitro derivation and culture of embryonic stem (es) cell lines with germline transmission capability
US20030162290A1 (en) 2002-01-25 2003-08-28 Kazutomo Inoue Method for inducing differentiation of embryonic stem cells into functioning cells
CA2482716A1 (en) 2002-04-17 2003-10-23 Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd. Method of forming pancreatic .beta. cells from mesenchymal cells
US20040161419A1 (en) 2002-04-19 2004-08-19 Strom Stephen C. Placental stem cells and uses thereof
ES2300573T3 (es) 2002-05-08 2008-06-16 Janssen Pharmaceutica Nv Inhibidores de cinasa sustituidos con pirrolina.
US20060003446A1 (en) 2002-05-17 2006-01-05 Gordon Keller Mesoderm and definitive endoderm cell populations
AU2003273573A1 (en) 2002-05-28 2003-12-19 Becton, Dickinson And Company Expansion and transdifferentiation of human acinar cells
RU2004135382A (ru) 2002-06-05 2005-06-27 Янссен Фармацевтика Н.В. (Be) Замещенные пирролины в качестве ингибиторов киназы
GB0212976D0 (en) 2002-06-06 2002-07-17 Tonejet Corp Pty Ltd Ejection method and apparatus
CN1171991C (zh) 2002-07-08 2004-10-20 徐如祥 人神经干细胞的培养方法
US6877147B2 (en) 2002-07-22 2005-04-05 Broadcom Corporation Technique to assess timing delay by use of layout quality analyzer comparison
US7838290B2 (en) 2002-07-25 2010-11-23 The Scripps Research Institute Hematopoietic stem cells and methods of treatment of neovascular eye diseases therewith
WO2004011621A2 (en) 2002-07-29 2004-02-05 Es Cell International Pte Ltd. Multi-step method for the differentiation of insulin positive, glucose
US20040063204A1 (en) 2002-08-14 2004-04-01 Lijun Yang Bone marrow cell differentiation
EP1539928A4 (en) 2002-09-06 2006-09-06 Amcyte Inc POSIOTIVE PANCREATIC ENDOCRINE PROGENITOR CELLS CD56 IN ADULT HUMAN BEINGS
US9969977B2 (en) 2002-09-20 2018-05-15 Garnet Biotherapeutics Cell populations which co-express CD49c and CD90
US20040062753A1 (en) 2002-09-27 2004-04-01 Alireza Rezania Composite scaffolds seeded with mammalian cells
AU2003285172A1 (en) 2002-11-08 2004-06-03 The Johns Hopkins University Human embryonic stem cell cultures, and compositions and methods for growing same
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
WO2004050827A2 (en) 2002-12-05 2004-06-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Cultured human pancreatic islets, and uses thereof
EP2457999B1 (en) 2002-12-16 2018-10-17 Technion Research & Development Foundation Ltd. Culture medium for pluripotent stem cells
US20070154981A1 (en) 2003-02-14 2007-07-05 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Insulin-producing cells derived from stem cells
WO2004073633A2 (en) 2003-02-14 2004-09-02 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and compositions for modulating the development of stem cells
CA2520861A1 (en) 2003-03-27 2004-10-14 Ixion Biotechnology, Inc. Method for transdifferentiation of non-pancreatic stem cells to the pancreatic pathway
WO2004090110A2 (en) 2003-03-31 2004-10-21 Bresagen Inc. Compositions and methods for the control, differentiation and/or manipulation of pluripotent cells through a gamma-secretase signaling pathway
US20090203141A1 (en) 2003-05-15 2009-08-13 Shi-Lung Lin Generation of tumor-free embryonic stem-like pluripotent cells using inducible recombinant RNA agents
EP1649013B1 (en) 2003-06-27 2016-01-20 DePuy Synthes Products, Inc. Cartilage and bone repair and regeneration using postpartum-derived cells
IL161903A0 (en) 2003-07-17 2005-11-20 Gamida Cell Ltd Ex vivo progenitor and stem cell expansion for usein the treatment of disease of endodermally- deri ved organs
ITRM20030395A1 (it) 2003-08-12 2005-02-13 Istituto Naz Per Le Malattie Infettive Lazz Terreno di coltura per il mantenimento, la proliferazione e il differenziamento di cellule di mammifero.
WO2005017117A2 (en) 2003-08-14 2005-02-24 Martin Haas Multipotent amniotic fetal stem cells (mafsc) and banking of same
US7157275B2 (en) 2003-08-15 2007-01-02 Becton, Dickinson And Company Peptides for enhanced cell attachment and growth
WO2005021728A2 (en) 2003-08-27 2005-03-10 Stemcells California, Inc. Enriched pancreatic stem cell and progenitor cell populations, and methods for identifying, isolating and enriching for these populations
JP2007515433A (ja) 2003-12-17 2007-06-14 アラーガン　インコーポレイテッド Ｃｙｐ２６ａおよびｃｙｐ２６ｂの選択的阻害剤を使用するレチノイド反応性障害の処置方法
US20060030042A1 (en) 2003-12-19 2006-02-09 Ali Brivanlou Maintenance of embryonic stem cells by the GSK-3 inhibitor 6-bromoindirubin-3'-oxime
US7625753B2 (en) 2003-12-23 2009-12-01 Cythera, Inc. Expansion of definitive endoderm cells
EP2722387B1 (en) 2003-12-23 2019-12-11 Viacyte, Inc. Definitive endoderm
US20050266554A1 (en) 2004-04-27 2005-12-01 D Amour Kevin A PDX1 expressing endoderm
US20050233446A1 (en) 2003-12-31 2005-10-20 Parsons Xuejun H Defined media for stem cell culture
TWI334443B (en) 2003-12-31 2010-12-11 Ind Tech Res Inst Method of single cell culture of undifferentiated human embryonic stem cells
US20080241107A1 (en) 2004-01-23 2008-10-02 Copland Iii John A Methods and Compositions For Preparing Pancreatic Insulin Secreting Cells
GB2441530B (en) 2004-02-12 2009-09-23 Univ Newcastle Stem Cells
WO2005086845A2 (en) 2004-03-10 2005-09-22 Regents Of The University Of California Compositions and methods for growth of embryonic stem cells
CA2555571C (en) 2004-04-01 2012-10-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Differentiation of stem cells to endoderm and pancreatic lineage
JP4926946B2 (ja) 2004-04-27 2012-05-09 ヴィアサイト，インコーポレイテッド Ｐｄｘ１発現性内胚葉
EP1786896B1 (en) 2004-07-09 2018-01-10 Viacyte, Inc. Methods for identifying factors for differentiating definitive endoderm
KR20070083559A (ko) 2004-08-13 2007-08-24 더 유니버시티 오브 죠지아 리서치 파운데이션, 인코포레이티드 인간 배아 줄기세포에서의 자가재생 및 분화를 위한 조성물및 방법
WO2006026473A2 (en) 2004-08-25 2006-03-09 University Of Georgia Research Foundation, Inc. METHODS AND COMPOSITIONS UTILIZING MYC AND GSK3ß TO MANIPULATE THE PLURIPOTENCY OF EMBRYONIC STEM CELLS
DE102004043256B4 (de) 2004-09-07 2013-09-19 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Skalierbarer Prozess zur Kultivierung undifferenzierter Stammzellen in Suspension
JP5420837B2 (ja) 2004-09-08 2014-02-19 ウィスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 胚幹細胞の培地及び培養
WO2006029198A2 (en) 2004-09-08 2006-03-16 Wisconsin Alumni Research Foundation Culturing human embryonic stem cells
WO2006083782A2 (en) 2005-01-31 2006-08-10 Es Cell International Pte Ltd. Directed differentiation of embryonic stem cells and uses thereof
ES2627419T3 (es) 2005-03-04 2017-07-28 Lifescan, Inc. Células estromales adultas derivadas del páncreas
GB0505970D0 (en) 2005-03-23 2005-04-27 Univ Edinburgh Culture medium containing kinase inhibitor, and uses thereof
WO2006113470A2 (en) 2005-04-15 2006-10-26 Geron Corporation Cancer treatment by combined inhibition of proteasome and telomerase activities
WO2006114097A2 (en) 2005-04-26 2006-11-02 Aarhus Universitet Biosurface structure array
CN101238129A (zh) 2005-06-10 2008-08-06 Irm责任有限公司 维持胚胎干细胞多能性的化合物
WO2006138433A2 (en) 2005-06-14 2006-12-28 The Regents Of The University Of California Induction of cell differentiation by class i bhlh polypeptides
WO2006137787A1 (en) 2005-06-21 2006-12-28 Ge Healthcare Bio-Sciences Ab Method for cell culture
JP5345388B2 (ja) 2005-06-30 2013-11-20 ジヤンセン・フアーマシユーチカ・ナームローゼ・フエンノートシヤツプ 環式アニリノ−ピリジノトリアジン
US20080194021A1 (en) 2005-07-29 2008-08-14 Mays Robert W Use of a Gsk-3 Inhibitor to Maintain Potency of Culture Cells
AU2006274438A1 (en) 2005-07-29 2007-02-01 Australian Stem Cell Centre Limited Compositions and methods for growth of pluripotent cells
JP2009506769A (ja) 2005-09-02 2009-02-19 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 間充織幹細胞誘導方法
GB2444686B (en) 2005-09-12 2010-08-25 Es Cell Int Pte Ltd Differentiation of pluripotent stem cells using p38 MAPK inhibitors or prostaglandins
WO2008048671A1 (en) 2006-10-18 2008-04-24 University Of Illinois Embryonic-like stem cells derived from adult human peripheral blood and methods of use
AU2006304318B2 (en) 2005-10-14 2012-12-06 Regents Of The University Of Minnesota Differentiation of non-embryonic stem cells to cells having a pancreatic phenotype
EP3584311A1 (en) * 2005-10-27 2019-12-25 Viacyte, Inc. Pdx-1 expressing dorsal and ventral foregut endoderm
WO2007082963A1 (es) 2006-01-18 2007-07-26 Fundación Instituto Valenciano De Infertilidad Líneas de células madre embrionarias humanas y métodos para usar las mismas
KR20080109775A (ko) 2006-02-23 2008-12-17 노보셀, 인크 분화가능한 세포를 배양하는데 유용한 조성물 및 방법
US7695965B2 (en) 2006-03-02 2010-04-13 Cythera, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
US8741643B2 (en) 2006-04-28 2014-06-03 Lifescan, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells to definitive endoderm lineage
AU2007244675A1 (en) 2006-04-28 2007-11-08 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
JP5288209B6 (ja) 2006-05-02 2018-06-27 ウイスコンシン アラムニ リサーチ ファンデーション 幹細胞の内胚葉細胞および膵臓系列細胞への分化方法
WO2007139929A2 (en) 2006-05-25 2007-12-06 The Burnham Institute For Medical Research Methods for culture and production of single cell populations of human embryonic stem cells
WO2007149182A2 (en) 2006-06-19 2007-12-27 Geron Corporation Differentiation and enrichment of islet-like cells from human pluripotent stem cells
CN100494359C (zh) 2006-06-23 2009-06-03 中日友好医院 神经干细胞三维立体培养体外扩增的方法
US20080003676A1 (en) 2006-06-26 2008-01-03 Millipore Corporation Growth of embryonic stem cells
CA2656175C (en) 2006-06-26 2018-08-28 Lifescan, Inc. Conditioned media obtained from amniotic fluid-derived cells for pluripotent stem cell culture
AU2007270069B2 (en) 2006-07-06 2013-05-16 Es Cell International Pte Ltd Method for stem cell culture and cells derived therefrom
AU2007277364B2 (en) 2006-07-26 2010-08-12 Viacyte, Inc. Methods of producing pancreatic hormones
JP2008099662A (ja) 2006-09-22 2008-05-01 Institute Of Physical & Chemical Research 幹細胞の培養方法
WO2008039521A2 (en) 2006-09-26 2008-04-03 Nmt Medical, Inc. Method for modifying a medical implant surface for promoting tissue growth
WO2008048647A1 (en) 2006-10-17 2008-04-24 Cythera, Inc. Modulation of the phosphatidylinositol-3-kinase pathway in the differentiation of human embryonic stem cells
WO2008086005A1 (en) 2007-01-09 2008-07-17 University Of South Florida Compositions including triciribine and bortezomib and derivatives thereof and methods of use thereof
EP2126045A4 (en) 2007-01-30 2010-05-26 Univ Georgia EARLY MESODERM CELLS, STABLE POPULATION OF MESENDODERM CELLS WITH THE ABILITY TO GENERATE ENDODERM AND MESODERM CELL LINES AND MULTIPOTENTIAL MIGRATION CELLS
GB0703188D0 (en) 2007-02-19 2007-03-28 Roger Land Building Large scale production of stem cells
WO2009012428A2 (en) * 2007-07-18 2009-01-22 Lifescan, Inc. Differentiation of human embryonic stem cells
DK2185693T3 (da) 2007-07-31 2019-09-23 Lifescan Inc Differentiering af humane embryoniske stamceller
MX2010002179A (es) 2007-08-24 2010-04-27 Stichting Het Nl Kanker I Composicion para el tratamiento de enfermedades neoplasicas.
MX2010005805A (es) 2007-11-27 2010-06-09 Lifescan Inc Diferenciacion de celulas madre embrionarias humanas.
SG154367A1 (en) 2008-01-31 2009-08-28 Es Cell Int Pte Ltd Method of differentiating stem cells
WO2009101407A2 (en) 2008-02-11 2009-08-20 Cambridge Enterprise Limited Improved reprogramming of mammalian cells, and the cells obtained
KR20190057164A (ko) 2008-02-21 2019-05-27 얀센 바이오테크 인코포레이티드 세포 부착, 배양 및 탈리를 위한 방법, 표면 개질 플레이트 및 조성물
SG188918A1 (ru) 2008-03-17 2013-04-30 Agency Science Tech & Res
EP2283117B1 (en) 2008-04-21 2013-10-23 Viacyte, Inc. Methods for purifying pancreatic endoderm cells derived from human embryonic stem cells
US20090298178A1 (en) 2008-06-03 2009-12-03 D Amour Kevin Allen Growth factors for production of definitive endoderm
DE102008032236A1 (de) 2008-06-30 2010-04-01 Eberhard-Karls-Universität Tübingen Isolierung und/oder Identifizierung von Stammzellen mit adipozytärem, chondrozytärem und pankreatischem Differenzierungspotential
EP2310492B1 (en) 2008-06-30 2015-07-22 Janssen Biotech, Inc. Differentiation of pluripotent stem cells
US20100028307A1 (en) 2008-07-31 2010-02-04 O'neil John J Pluripotent stem cell differentiation
JP5785088B2 (ja) 2008-10-31 2015-09-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の膵内分泌系への分化
US8008075B2 (en) 2008-11-04 2011-08-30 Viacyte, Inc. Stem cell aggregate suspension compositions and methods of differentiation thereof
JP5819826B2 (ja) 2009-07-20 2015-11-24 ヤンセン バイオテツク，インコーポレーテツド ヒト胚性幹細胞の分化
EP2542666A4 (en) 2010-03-02 2014-05-07 Univ Singapore CULTURE ADDITIVES FOR PROMOTING A STEM CELL PROGRAMMING AND DIFFERENTIATION REACTION

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2305708C2 (ru) * 2001-10-02 2007-09-10 Энститю Клейтон Де Ля Решерш Рекомбинантный лентивирусный вектор, клетка-хозяин, трансдуцированная лентивирусным вектором, способ ее трансдукции и применение
RU2351648C2 (ru) * 2001-11-09 2009-04-10 Артесел Сайенсиз, Инк. Дифференцировка стромальных клеток, полученных из жировой ткани, в эндокринные клетки поджелудочной железы и их использование
US20030138948A1 (en) * 2001-12-07 2003-07-24 Fisk Gregory J. Islet cells from human embryonic stem cells
US20060040387A1 (en) * 2001-12-07 2006-02-23 Fisk Gregory J Islet cells from human embryonic stem cells
US20060281174A1 (en) * 2004-03-09 2006-12-14 Gang Xu Methods for generating insulin-producing cells
US20070259421A1 (en) * 2006-03-02 2007-11-08 D Amour Kevin A Endocrine precursor cells, pancreatic hormone-expressing cells and methods of production

Also Published As

Publication number Publication date
KR101893021B1 (ko) 2018-08-29
EP2456858A2 (en) 2012-05-30
CN102482640B (zh) 2015-03-11
ES2693088T3 (es) 2018-12-07
PL2456858T3 (pl) 2019-01-31
US8785184B2 (en) 2014-07-22
CA2768644A1 (en) 2011-01-27
EP2456858B1 (en) 2018-08-29
JP2012533321A (ja) 2012-12-27
JP5819825B2 (ja) 2015-11-24
WO2011011302A3 (en) 2011-05-05
AR077767A1 (es) 2011-09-21
US20110014702A1 (en) 2011-01-20
BR112012001557A2 (pt) 2016-03-08
MX340952B (es) 2016-07-29
GB2485112A (en) 2012-05-02
CN102482640A (zh) 2012-05-30
KR20120034793A (ko) 2012-04-12
RU2012105923A (ru) 2013-08-27
WO2011011302A2 (en) 2011-01-27
KR101785626B1 (ko) 2017-10-16
HK1170262A1 (en) 2013-02-22
SG177483A1 (en) 2012-02-28
EP2456858A4 (en) 2015-03-18
GB201202847D0 (en) 2012-04-04
KR20170117231A (ko) 2017-10-20
AU2010276440B2 (en) 2014-07-03
MX2012000899A (es) 2012-02-13
GB2485112B (en) 2014-02-26
ZA201201221B (en) 2013-07-31
AU2010276440A1 (en) 2012-01-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2540021C2 (ru) Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
US20220296653A1 (en) Methods for lowering blood glucose
RU2540016C2 (ru) Дифференцировка эмбриональных стволовых клеток человека
RU2701335C2 (ru) Способ получения популяции панкреатических эндокринных клеток, соэкспрессирующих nkx6.1 и инсулин, и способ лечения диабета
RU2528861C2 (ru) Дифференцирование человеческих эмбриональных стволовых клеток в линию панкреатических эндокринных клеток
ES2728900T3 (es) Diferenciación de células madre embrionarias humanas
RU2682719C2 (ru) Лечение диабета при помощи панкреатических эндокринных клеток-предшественников