CN1806048A - 生产l－谷氨酸的方法 - Google Patents

Abstract

通过培养一种微生物生产L－谷氨酸，该微生物能在含有饱和浓度的L－谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具备在具有所述pH的液体培养基中积累L－谷氨酸的能力，其中L－谷氨酸的量超过了pH被控制以使L－谷氨酸沉淀的培养基中L－谷氨酸的所述饱和浓度所对应的量，所述液体培养基还含有泛酸，以使得在沉淀L－谷氨酸的同时引起L－谷氨酸的积累。

Description

生产L-谷氨酸的方法

技术领域

[0001]

本发明涉及一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸被广泛用作调味品等的原材料。

背景技术

[0002]

L-谷氨酸主要使用所谓的棒状杆菌的L-谷氨酸-生产细菌通过发酵来生产，这些棒状杆菌是属于短杆菌属、棒状杆菌属或微杆菌属或它们的突变株。此外，使用属于芽孢杆菌属、链霉菌属、青霉属、假单胞菌属、节杆菌属、沙雷氏菌属、念珠菌属的微生物或产气杆菌(通常是产气肠杆菌)、大肠杆菌的突变株等的方法是公知的。进而，本发明的发明人曾建议了一种使用属于克雷伯氏菌属、欧文氏菌属或泛菌属的微生物制造L-谷氨酸的方法(美国专利No.6,197,559)和一种使用肠杆菌属细菌制造L-谷氨酸的方法(美国专利No.6,331,419)。

[0003]

此外，各种使用重组DNA技术增强L-谷氨酸生物合成酶活性以提高L-谷氨酸生产能力的技术已被揭示了。例如，有报道由大肠埃希氏菌或谷氨酸棒杆菌获得的柠檬酸合酶的编码基因的引入对于增强棒状杆菌属或短杆菌属的细菌中L-谷氨酸生产能力是有效的(日本专利公告JP7-121228B)。另外，JP61-268185A揭示了一种含有由棒杆菌属细菌获得的谷氨酸脱氢酶基因的重组DNA的细胞。而且，JP63-214189A揭示了一种通过扩增编码谷氨酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶和柠檬酸合酶的基因来提高L-谷氨酸生产能力的技术。

[0004]

L-谷氨酸的生产能力已经通过上述微生物的育种或生产方法的改进做了相当大的提高。然而，为了与未来进一步提高的需要相适应，用更低的成本提供更有效的L-谷氨酸的生产的方法的开发仍然是必要的，而且仍旧是本领域的需求。

[0005]

本发明的发明人开发了一种在沉淀在培养液中积累的L-谷氨酸的同时，进行L-谷氨酸发酵的方法(EP1078989A)。由于通常的L-谷氨酸-生产细菌在酸性条件下不会生长，传统的L-谷氨酸发酵是在中性条件下进行的。与这种传统技术相反，本发明的发明人成功地得到在酸性条件下具有生产L-谷氨酸能力的微生物。进一步，通过在控制pH值以便L-谷氨酸沉淀的液体培养基中培养获得的微生物(成团泛菌(Enterobacter agglomerans))，L-谷氨酸可以在沉淀L-谷氨酸的同时在培养基中被生产出来并积累。

[0006]

此外，本发明的发明人也揭示了一种生产L-谷氨酸的方法，包括在培养基中培养这种L-谷氨酸-生产细菌，其能够在如上所述的酸性条件下生长，所述培养基中抑制该细菌生长的有机酸的含量是一个不会抑制该细菌生长的量(EP1233070A)，以及一种生产L-谷氨酸的方法，包括在对于微生物生长最佳的第一pH值下培养这种如上所述的细菌，然后在对于用微生物生产L-谷氨酸最佳的比第一pH值低的第二pH值下培养这种细菌(EP1233068A)。进而，他们也揭示了一种当在培养基中沉淀L-谷氨酸时，在培养基中生产和积累L-谷氨酸的方法，这里要执行操作使L-谷氨酸的晶体在一段期间内存在于培养基中，该期间内L-谷氨酸在培养基中浓度比L-谷氨酸发生天然结晶时浓度要低(EP1233069A)。

发明内容

[0007]

本发明的目的是提供一种通过使用具有生产L-谷氨酸能力的细菌如属于泛菌属(Pantoea)的细菌与本领域现有技术相比更有效的生产L-谷氨酸的方法。

[0008]

本发明的发明人发现了如果L-谷氨酸的高生产能力被赋予属于泛菌属的细菌，3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇也会同L-谷氨酸一起被生产出来。进而，他们认为如果可能抑制这些副产物的生产，L-谷氨酸相对于单位量的主要原材料(糖)的产量将会提高。因此，本发明的发明人进行了各种研究，结果发现了如果在培养基中加入泛酸，3-羟基-2-丁酮(acetoin)和2，3-丁二醇副产品会减低，因此L-谷氨酸的发酵量被提高。从而，他们完成了本发明。

[0009]

也就是说，本发明如下所述

(1)一种发酵生产L-谷氨酸的方法，它包括培养一种微生物，该微生物能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具有在该pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的饱和浓度所对应的量，此液体培养基还含有泛酸，以使得当沉淀L-谷氨酸时引起L-谷氨酸的积累。

(2)如上所述的方法，此处微生物属于泛菌属。

(3)如上所述的方法，此处微生物是Pantoea ananatis。

(4)如上所述的方法，此处培养基中的泛酸是一种泛酸盐，且该盐的浓度是1mg/L或更高。

附图说明

[0010]

[图1]源自Pantoea ananatis的pTWVEK101的DNA片断的限制性酶切图(restriction map)。

[图2]显示包含基因gltA、ppc和gdhA的质粒pMWCPG的构建的图。

[3]显示包含宽寄主范围质粒RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet的构建的图。

[图4]显示包含宽寄主范围质粒RSF1010的复制起点、四环素抗性基因、gltA、ppc和gdhA基因的质粒RSFCPG的构建的图。

[图5]显示包含gltA基因的质粒pSTVCB的构建的图。

[图6]显示通过加入泛酸提高L-谷氨酸产量机理的解释图。

[图7]显示加入到培养基中的泛酸钙的浓度与L-谷氨酸发酵量间关系的图。

优选实施方式的详细说明

[0011]

以下将详细解释本发明。本发明提供了一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，其特征在于培养一种微生物，该微生物能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具有在该pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的饱和浓度所对应的量，(此后称为“L-谷氨酸积累微生物”)此液体培养基还含有泛酸，以使得当沉淀L-谷氨酸时引起L-谷氨酸的积累。

[0012]

上述L-谷氨酸-积累微生物可以被制得，例如，按以下方法。一种含有微生物的样品在特定pH值下被接种到含有饱和浓度L-谷氨酸和碳源的液体培养基中，一个可代谢碳源的菌株被选定。尽管该特定的pH值没有特殊限制，但通常约为5.0或更小，优选约4.5或更小，进一步优选约4.3或更小。L-谷氨酸-积累微生物被用于通过伴随着L-谷氨酸沉淀的发酵生产L-谷氨酸。如果pH值太高，那允许微生物以足够沉淀的量生产L-谷氨酸变得困难。因此，pH值优选前述范围。

[0013]

如果含有L-谷氨酸的水溶液的pH值降低，L-谷氨酸的溶解度在γ-羧基的pKa(4.25，25℃)附近显著降低。溶解度在等电点(pH3.2)变得最低，而超出了对应于饱和浓度的量的L-谷氨酸被沉淀。在约30℃，虽然取决于培养基组成，L-谷氨酸溶解以下述量溶解，在pH值3.2时10-20g/L，在pH值4.0时30-40g/L，而在pH值4.7时50-60g/L。通常pH值不必被控到3.0或更低，因为L-谷氨酸沉淀效果在pH值低于一定值时达到其上限。然而，pH值可以是3.0或更低。

[0014]

另外，微生物“可以代谢碳源”这种表述意味着微生物可以繁殖或尽管它不能繁殖但可消耗碳源，即，这表明微生物使碳源如糖或有机酸发生分解代谢。特别的，例如，如果一种微生物在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基中培养下，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，在2-4天中繁殖，这种微生物就可代谢培养基中的碳源。进而，例如，如果一种微生物消耗碳源，尽管这种微生物不繁殖，当它在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的合成液体培养基中培养2-4天，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，能够消耗碳源这种微生物就是一种能够代谢培养基中碳源的微生物。

[0015]

能够代谢碳源的微生物包括能够在上述液体培养基中生长的微生物。一种微生物“能够生长”的表述意思是它可以繁殖或尽管不能繁殖但可以生产出L-谷氨酸。特别的，例如，如果一种微生物在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基中培养下，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，在2-4天中繁殖，这种微生物就可以在这培养基中生长。进而，例如，如果一种微生物尽管不能繁殖，但当这种微生物在pH值为5.0-4.0，优选pH值4.5-4.0，更优选pH值4.3-4.0，最优选pH值约为4.0的含有饱和浓度L-谷氨酸的合成液体培养基中培养下，在合适的温度下，例如，28℃，37℃或50℃，2-4天中，提高了在合成液体培养基中L-谷氨酸的量，那么这种微生物就是一种能够在这种培养基中生长的微生物。

[0016]

如上所述的微生物的选择在同样条件下或改变pH值或L-谷氨酸的浓度下，可以重复两次或多次。较早阶段的选择可以在含有低于饱和浓度的浓度下的L-谷氨酸的培养基中进行，而接着后来的选择可在含有饱和浓度的L-谷氨酸的培养基中进行。进一步，具有优良特性如较高的繁殖率的菌株可被选出。

[0017]

L-谷氨酸-积累微生物除了上述性质外，还具有在超过相对于L-谷氨酸在液体培养基中的饱和浓度的值下积累L-谷氨酸的能力。前面提到的液体培养基的pH值优选与用于筛选具有前述性质的微生物的培养基的pH值相同或接近。通常，微生物随着pH值变得更低，而变得对于高浓度的L-谷氨酸敏感。因此，考虑到对L-谷氨酸的抗性，优选pH不低；但考虑到伴随其沉淀的L-谷氨酸生产，优选低pH。为满足这些条件，pH值可以在3-5范围内，优选4-5，更优选4-4.7，进一步优选4-4.5，特别优选4.0-4.3。

[0018]

L-谷氨酸-积累微生物或繁殖原料的例子因此包括，但并不限于，属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、沙雷氏菌属、欧文氏菌属、大肠埃希氏菌属、棒状杆菌属、短杆菌属、肠环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、芽孢杆菌属、酵母属等的微生物。这些当中，泛菌属的微生物是优选的。此后，本发明的微生物将主要针对属于泛菌属的微生物进行解释。然而，该微生物并不限于属于泛菌属，那些属于其它属的也可类似的使用。

[0019]

属于泛菌属的微生物包括，但并不限于，Pantoea ananatis，优选Pantoea ananatis AJ13355菌株。这种菌株从日本Shizuoka的Iwata-shi的土壤分离，作为可以在低pH值下在含有L-谷氨酸和碳源的培养基中繁殖的菌株。

[0020]

Pantoea ananatis AJ13355于1998年2月19日保藏于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前，National Instituteof Advanced Industrial Science and Technology，国际专利生物保藏机构)并收到入藏登记号FERM P-16644。然后它于1999年1月11日转为布达佩斯条约规定的国际保藏并收到入藏登记号FERM BP-6614。

上述菌株被分离后确定为成团泛菌(Enterobacteragglomerans)，并作为成团泛菌AJ13355菌株来保藏。然而，目前在16s rRNA核苷酸测序等的基础上重新分类作为Pantoea ananatis(参见实施例部分)。

尽管源于菌株AJ13355的菌株AJ13356和AJ13601都在上述保藏机构作为成团泛菌保藏，在本说明书中它们都描述为Pantoeaananatis。

[0021]

L-谷氨酸-积累微生物可以是一种原本具有L-谷氨酸-生产能力的微生物或是一种通过诱变、重组DNA技术等通过育种而被赋予或提高L-谷氨酸-生产能力的微生物。

[0022]

L-谷氨酸-生产能力可被赋予或提高，通过，例如，提高催化L-谷氨酸生物合成反应酶的活性。L-谷氨酸-生产能力也可以通过减低或消除催化从L-谷氨酸生物合成路径分支出去并产生不同于L-谷氨酸的化合物的反应的酶的活性来提高。

[0023]

催化L-谷氨酸生物合成反应的酶的例子包括，但并不限于，谷氨酸脱氢酶(此后，也作“GDH”)、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合酶、异柠檬酸脱氢酶、乌头酸水合酶、柠檬酸合酶(此后，亦作“CS”)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(此后，亦作“PEPC”)、丙酮酸脱氢酶、丙酮酸激酶、烯醇化酶、磷酸甘油变位酶、磷酸甘油酸激酶、3-磷酸甘油醛脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、果糖二磷酸酶醛缩酶、磷酸果糖激酶、磷酸葡糖异构酶等。这些酶中，优选CS、PEPC和GDH中的一种、两种或三种。进一步，优选所有三种酶CS、PEPC和GDH的活性在L-谷氨酸-积累微生物中增强。特别是，优选来自谷氨酸棒杆菌(Brevibacterium lactofermentum)的CS，因为它不受α-酮戊二酸、L-谷氨酸及NADH抑制的影响。

[0024]

为了增强CS、PEPC或GDH的活性，例如，编码CS、PEPC或GDH的基因可克隆在合适的质粒中，可以用得到的质粒转化寄主微生物。转化体细胞中编码CS、PEPC或GDH的基因的拷贝数(此后，分别缩写为“gltA基因”、“ppc基因”和“gdhA基因”)提高了，带来CS、PEPC或GDH活性的提高。

[0025]

克隆的gltA、ppc和gdhA基因被单独或它们中任意两个或三个组合引入前述起始母株。当两或三种基因被引入时，两或三种基因可以在一种质粒中克隆并被引入寄主，或分别在两或三种能够共存的质粒中克隆并被引入寄主。

[0026]

两或三种编码相同种类但源自不同生物体的酶的基因，可以被引入同一寄主。

上述质粒并不特别限制，只要它们在属于，例如，泛菌属等的微生物细胞中自主复制即可。质粒的例子包括pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218、pACYC177、pACYC184等。噬菌体DNA的载体也可用于引入前述基因。

[0027]

转化可以通过，例如，D.A.Morrison的方法(酶学方法，68，326(1979))进行，该方法中，受体细菌细胞对DNA的透过性通过用氯化钙处理细胞(Mandel M.和Higa A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))、电穿孔(Miller J.H.，“细菌遗传学的短期课程”，ColdSpring Harbor Laboratory Press，美国，1992)或类似方法来提高。

[0028]

CS、PEPC或GDH的活性也可以通过允许gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝存在于前述启动母株的染色体DNA中来提高。gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝可以通过同源重组而引入染色体DNA。为了以多个拷贝将gltA基因、ppc基因或gdhA基因引入属于泛菌属的细菌的染色体DNA，可以使用以多个拷贝存在于染色体DNA中的序列，例如存在于可转座元件末端的重复DNA和反转重复(inverted repeats)。可选择的，gltA基因、ppc基因或gdhA基因的多个拷贝可以通过将它们合并入一个转座子并转移它从而将其引入染色体DNA。结果是，gltA基因、ppc基因或gdhA基因在转化体菌株中的拷贝数提高了，因此CS、PEPC或GDH的活性也提高了。

[0029]

作为用作拷贝数将被提高的gltA基因、ppc基因或gdhA基因源的生物体，任何生物体只要具有CS、PEPC或GDH的活性就可使用。生物体的例子优选包括，但不限于，属于泛菌属、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、欧文氏菌属、沙雷氏菌属、埃希氏菌属、棒杆菌属、短杆菌属或芽孢杆菌属的细菌。特别的，大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌等是本发明所包含的。gltA基因、ppc基因和gdhA基因可以从上述微生物的染色体DNA中获得。

[0030]

gltA基因、ppc基因和gdhA基因可以使用CS、PEPC或GDH活性缺乏的突变体菌株，以从上述微生物的染色体DNA中分离出补充其辅源营养的DNA片断来获得。进而，由于属于埃希氏菌属和棒杆菌属的细菌的这些基因的核苷酸序列是已知的(生物化学，22，第5243-5249页，(1983)；J.Biochem.，95，第909-916页，(1984)；基因，27，第193-199页，(1984)；微生物学，140，第1817-1828页，(1994)；Mol.Gen.Genet.，218，第330-339页，(1989)；分子微生物学，6，第317-326页，(1992))，它们也可以通过PCR使用基于每个核苷酸序列和染色体DNA作为模板合成的引物来获得。众所周知，在肠细菌如属于肠杆菌属或克雷伯氏菌属的细菌中，与由同种类细菌引入的gltA基因相比由棒状细菌引入的gltA基因对于增强L-谷氨酸生产能力是更有效的(EP0999282A)。在这一专利文件中，本说明书中描述的Pantoea ananatis的菌株被描述为成团泛菌。

[0031]

CS、PEPC或GDH活性也可以通过增强gltA基因、ppc基因或gdhA基因的表达来提高，除前述这些基因的扩增外。例如，可以通过用另一更强的启动子来替代gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子使表达增强。例如lamda噬菌体的lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、PR启动子和PL启动子等都是已知的强启动子。替代了启动子的gltA基因、ppc基因或gdhA基因被克隆在质粒中并被引入宿主微生物，或使用重复DNA、颠倒重复、转位子等引入到宿主微生物的染色体DNA。

[0032]

CS、PEPC或GDH活性也可以通过用另一强启动子在染色体中替代gltA基因、ppc基因或gdhA基因的启动子来提高(参见WO87/03006和JP61-268183A)，或者通过在每个基因编码序列上游插入强启动子(参见基因，29，第231-241页(1984))。特别的，可以在gltA基因、ppc基因或gdhA基因和染色体的相应基因之间进行同源重组，前述三种基因的启动子被更强的启动子或者含有它的部分的DNA来代替。

[0033]

催化L-谷氨酸生物合成路径分支出去并产生不同于L-谷氨酸化合物的反应的酶的实例包括α-酮戊二酸脱氢酶(以后也用“αKGDH”来指代)、异柠檬酸裂合酶、磷酸转乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羟酸合酶、乙酰乳酸合酶、甲酸乙酰转移酶、乳酸脱氢酶、谷氨酸脱羧酶、1-吡咯啉脱氢酶等。这些酶当中，优选αKGDH。

[0034]

为了降低或消除在属于泛菌属或类似属的微生物中的上述酶的活性，降低或消除这些酶细胞内活性的突变可以被引入上述酶的基因中，通过通常的突变发生处理方法或遗传工程方法。

[0035]

突变发生处理方法的例子包括，例如，应用X射线或紫外线辐射的方法、应用突变发生剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等处理的方法。突变被引入基因的位置可以是酶蛋白编码区或调节表达的区域如启动子中。

[0036]

遗传工程方法的例子包括，例如，应用基因重组、转导、细胞融合等的方法。例如，一种抗药基因被插入克隆的目标基因中以制备遗失了其功能的基因(缺陷基因)。随后，这种缺陷基因被引入一宿主微生物细胞内，染色体上的目标基因通过应用同源重组被上述缺陷基因代替(基因破坏)。

[0037]

目标酶细胞内活性的减少或缺乏及活性减少的程度能通过衡量细胞抽提物或由候选菌株获得的纯化部分的酶活性并与野生型菌株的酶活性对比来确定。例如，αKGDH的活性可以用Reed等的方法来测量(Reed L.J.和Mukherjee B.B.，酶学方法，13，第55-61页(1969))。

[0038]

依赖于目标酶，目标突变菌株可以基于突变菌株的表型来选择。例如，其αKGDH的活性消除或降低的突变菌株在含葡萄糖的基本培养基或在含乙酸或L-谷氨酸作为唯一的碳源的基本培养基中在需氧培养条件下不能繁殖或显示出明显降低的繁殖率。然而，通过在含有葡萄糖的基本培养基中加入琥珀酸或赖氨酸、蛋氨酸和二氨基庚二酸，正常的繁殖甚至在同样条件下是能够的。通过利用这些现象作为指示物，带有减低的αKGDH的活性或活性缺乏的突变菌株被选择出来。

[0039]

通过利用同源重组制备αKGDH基因-缺乏谷氨酸棒杆菌菌株的方法在WO95/34672中详细描述了。类似的方法可以应用在其它微生物上。

[0040]

进一步，诸如基因克隆和DNA的消化和连接、转化等在分子克隆，第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)等里面详细描述了。

[0041]

如上所述αKGDH活性缺乏或具有减低的αKGDH活性的突变菌株的特殊例子包括Pantoea ananatis AJ13356。Pantoea ananatisAJ13356于1998年2月19日存放于通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前，National Institute of Advanced IndustrialScience and Technology，国际专利生物保藏机构)并收到入藏登记号FERM P-16645。然后它于1999年1月11日转为布达佩斯条约规定的国际保藏并收到入藏登记号FERM BP-6615。Pantoea ananatisAJ13356由于αKGDH-E1亚基基因(sucA)破坏，其缺乏αKGDH活性。

[0042]

当Pantoea ananatis，作为本发明使用的微生物的例子，在含有糖类的培养基中培养时，粘液在细胞外分泌，有时造成低操作效率。因此，当具有这种分泌粘液性质的Pantoea ananatis被使用时，优选使用与野生型菌株相比分泌较少粘液的突变菌株。突变发生处理的例子包括，例如，利用X射线或紫外线辐射的方法、利用突变发生剂如N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等的方法。有降低分泌粘液性质的菌株可以通过在含有糖类的培养基，例如，含有5g/L葡萄糖的LB培养基盘中，接种突变发生的细菌细胞，将它们在45度倾斜的盘内培养，选择未显示出粘液流下的菌落，来进行选择。

[0043]

本发明中，L-谷氨酸生产能力的赋予或增强以及其它良好性能如上述对于较少粘液分泌的突变的赋予可以按任意顺序完成。

作为用于繁育上述L-谷氨酸生产细菌的基因的Pantoea ananatis的sucA基因的核苷酸序列和被基因编码的αKGDH-E1亚基的氨基酸序列显示为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3。

[0044]

进一步，含有源于大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒RSFCPG(参见参考实施例1)的核苷酸序列显示于SEQ IDNO：8。在SEQ ID NO：8中，gltA基因、gdhA基因和ppc基因的编码区域分别对应于核苷酸号码1170-487(由互补链编码)、2598-3941和7869-5218(由互补链编码)。这些基因编码的CS、GDH和PEPC氨基酸序列显示于SEQ ID NOS：9，10和11。进一步，含有源于谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒pSTVCB(参见参考实施例1)和用该基因编码的CS的氨基酸序列显示于SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13。

[0045]

CS、GDH和PEPC除了它们的野生型，可以包括一个或几个氨基酸残基的替换、删除、插入、增加或倒置，并且不会显著降低酶活性。尽管这里所指的“几个”氨基酸残基的数量基于蛋白质的三维结构位置或氨基酸残基的类型而不同，它可以具体地在2-30之间，优选2-20之间，更优选2-10之间。因此，CS、GDH或PEPC的所述改变例如上述的那些是典型的保守的改变，以便保持CS、GDH或PEPC的活性。替换改变包括氨基酸序列中至少一个残基被移除以及一个不同的残基在这位置上插入。CS、GDH或PEPC蛋白质中原始氨基酸可能被替换并被认为是保守替换的氨基酸的例子包括：Ala被ser或thr替换；arg被gln、his或lys替换；asn被glu、gln、lys、his或asp替换；asp被asn、glu或gln替换；cys被ser或ala替换；gln被asn、glu、lys、his、asp或arg替换；glu被asn、gln、lys或asp替换；gly被pro替换；his被asn、lys、gln、arg或tyr替换；ile被leu、met、val或phe替换；leu被ile、met、val或phe替换；lys被asn、glu、gln、his或arg替换；met被ile、leu、val或phe替换；phe被trp、tyr、met、ile或leu替换；ser被thr或ala替换；thr被ser或ala替换；trp被phe或tyr替换；tyr被his、phe或trp替换；以及val被met、ile或leu替换。

[0046]

与CS、GDH或PEPC基本相同的蛋白质或肽的编码DNA的例子包括可与SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：8的核苷酸序列的开放阅读框(ORF)杂交的DNA，或者可在严格条件下由核苷酸序列制得的并能为具有CS、GDH或PEPC活性的蛋白质编码的探针。这里所述的“严格条件”包括形成所谓特异的杂交体，而不特异的杂交体不会形成的条件。很难用任何数量化的值明白表达出这种条件。然而，例如，严格条件包括高度同源的DNA，例如，同源不少于50％的DNA，优选不少于70％，更优选不少于90％，最优选不少于95％，互相杂交，但比上述同源性低的DNA不互相杂交的条件。可选择的，严格条件包括由此DNA在对应于DNA杂交洗涤的常规条件的盐浓度下相互杂交，即1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS，在60℃的条件。

[0047]

SEQ ID NO：12或SEQ ID NO：8的核苷酸序列的ORF或它的部分序列也可被用作探针。这样的探针可以通过使用在SEQ ID NO：8或SEQ IDNO：12核苷酸序列基础上生产的低聚核苷酸作为引物的PCR来制备，其中将含有SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：12的核苷酸序列或它的部分核苷酸序列的DNA片段作为模板。当使用长度约为300bp的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是，例如，在50℃下2×SSC和0.1％SDS。

[0048]

用作基因破坏的删除型sucA基因具有足够程度的同源性以便引起同目标微生物的染色体DNA中的sucA基因同源重组。这种同源性优选不少于85％，更优选不少于90％，特别优选不少于95％。而且，在严格条件下可杂交的DNA可引起同源重组。

[0049]

如上所述得到的这种菌株的特殊例子包括源于前述Pantoeaananatis AJ13355菌株的AJ13601菌株。此菌株通过从AJ13355菌株选择低粘膜产生菌株、αKGDH基因的破坏、源于大肠埃希氏菌的gltA、ppc和gdhA基因和源于谷氨酸棒杆菌的gltA基因的引入、对低pH值下高浓度L-谷氨酸显示抵抗的菌株的选择、显示出超级生长能力和L-谷氨酸生产能力的菌株的选择而获得。

[0050]

通过在调整pH值条件以允许L-谷氨酸沉淀的液体培养基中培养L-谷氨酸-积累微生物，L-谷氨酸可以生产出来，并伴随在培养基中沉淀而积累。这里所指的“允许该微生物产生的L-谷氨酸沉淀的条件”意思是当L-谷氨酸-积累微生物生产并积累L-谷氨酸时，允许L-谷氨酸沉淀的条件。尽管这种条件下的pH值可以基于微生物的L-谷氨酸生产能力而不同，但当微生物是属于泛菌属的细菌时它通常是3-5，优选4.5或更低，更优选4或更低。

进而，对于上述允许L-谷氨酸沉淀的pH值条件，pH值在这种条件下被决定：L-谷氨酸-积累微生物可以在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中代谢其中的碳源并显示出以超过对应于L-谷氨酸在那个pH值下的培养基中饱和浓度的量在培养基中积累L-谷氨酸的能力。

[0051]

当L-谷氨酸-积累微生物在前述条件的培养基中培养时，L-谷氨酸的积累量可以通过在培养基中加入泛酸来提高。这大概是因为3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的次级(secondary)产生被在培养基中加入泛酸而减低，结果是L-谷氨酸的发酵量提高了。

[0052]

将包含在培养基中的泛酸优选以泛酸盐加入。泛酸盐的含量优选为1mg/L或更多，更优选4mg/L或更多，特别优选8mg/L或更多。泛酸盐的类型没有特别限制，实例包括钙盐、钠盐等。泛酸可以在整个培养过程中存在于培养基中，或者在含有泛酸的培养基中培养的阶段可以是这个过程的一部分。例如，当本发明的方法包括繁殖L-谷氨酸积累微生物的步骤和允许L-谷氨酸生产的步骤时，泛酸可以在至少允许L-谷氨酸生产的步骤期间存在于培养基中，而且泛酸在繁殖L-谷氨酸-积累微生物的步骤中可以存在或不存在于培养基中。进而，对于允许L-谷氨酸生产的步骤，泛酸的含量可以不必在整个步骤期间在前述的范围内。即，泛酸可以被含有，以便在步骤的早期其含量在前述范围内，且随着培养时间含量可以减低。泛酸也可以间歇地额外加入。

[0053]

对于本发明的方法，使用L-谷氨酸-积累微生物在沉淀L-谷氨酸的同时生产L-谷氨酸的公知方法都可以应用，除了使用含有泛酸的培养基以外(例如，JP2001-333769A(EP1078989A)、JP 2002-238591A(EP1233070A)、JP2002-238592A(EP1233068A)、JP2002-238593A(EP1233069A))。

[0054]

例如，本发明方法的优选实施例之一是生产L-谷氨酸的方法，包括在含有泛酸盐且pH值为5.0或更低的培养基中培养L-谷氨酸-积累微生物，其中抑制微生物生长的有机酸的总含量是不抑制该微生物生长的量(参见JP2002-238591A(EP1233070))。在这一实施例中，在培养基pH值下抑制该微生物生长的有机酸意思是当其以一定浓度(通常为0.5g/L或更多)存在于此pH值的培养基中时具有抑制该微生物生长效果的有机酸，而且它通常是具有碳原子数为1-3的有机酸，即甲酸、乙酸或丙酸。

[0055]

有机酸的总含量优选0.4g/L或更少，更优选0.3g/L或更少，进而优选0.2g/L或更少。

本发明方法的另一优选实施例是生产L-谷氨酸的方法，包括在对于微生物生长最佳的第一pH值下培养L-谷氨酸-积累微生物，然后在对于通过微生物生产L-谷氨酸最佳的且低于第一pH值的第二pH值下培养微生物，其中L-谷氨酸-积累微生物在至少第二pH值培养期内在含有泛酸的培养基中培养。

[0056]

本发明方法的另一优选实施例是生产L-谷氨酸的方法，包括在微生物生长不会被存在于培养基中的有机酸抑制的第一pH值下培养L-谷氨酸-积累微生物，然后在对于通过微生物生产L-谷氨酸最佳的且低于第一pH值的第二pH值下培养微生物，其中L-谷氨酸-积累细菌在至少第二pH值培养期内在含有泛酸的培养基中培养(参见JP2002-238591A(EP1233070A))。

[0057]

已发现L-谷氨酸-生产细菌一般在酸性条件下被有机酸抑制生长，然而它可在中性条件下消耗有机酸(参见JP2002-238591A(EP1233070A))。基于这一性质，通过在中性pH值下进行细胞生长然后改变pH值至生产L-谷氨酸的酸性pH值，使获得较高的生产力变为可能，同时使用各种材料作为糖源也成为可能。

[0058]

在这个实施例中，有机酸意味着当它在第二pH值的培养基中以一定浓度(通常0.5g/L或更多)存在时对于微生物生长具有抑制效果的有机酸，而且通常是具有碳原子数为1-3的有机酸，即甲酸、乙酸或丙酸。

[0059]

选择第一pH值和第二pH值以便它们满足所使用L-谷氨酸-生产细菌的性质。这些pH数值可以由本领域技术人员容易地测量。例如，不会被培养基中的有机酸引起抑制微生物生长的pH值可以这样确定，在含有调整至各种pH值的有机酸的培养基中培养L-谷氨酸-生产细菌，基于吸光率等测量细胞数量，与在同一条件下培养但培养基不舍有机酸的L-谷氨酸-生产细菌的细胞数量对比。对于L-谷氨酸生产合适的pH值是指在此pH值下L-谷氨酸在培养基中积累，并且通过在各pH值下的培养基中培养L-谷氨酸-生产细菌可确定此pH值。特别的，它可以通过测量L-谷氨酸在各pH值的培养基中积累的量并对比它们来确定。

[0060]

第一pH值并不特别限制，只要微生物的生长不被培养基中的有机酸抑制，但通常是5.0-8.0。

第二pH值优选在此pH值下生产的L-谷氨酸沉淀，且这样的pH值通常为3.0-5.0。L-谷氨酸在高浓度下积累导致的生产力的减低可以通过在被生产的L-谷氨酸沉淀的pH值下进行培养来避免。

[0061]

第一pH值和第二pH值在培养期间可以不是严格恒定的，只要本发明的优势可以获得，它们可以波动。

L-谷氨酸-生产细菌甚至在第一pH值下也生产L-谷氨酸，因此pH值被生产的L-谷氨酸降低了。所以，在第一pH值下培养优选通过加入碱性物质到培养基中保持培养基的pH值为第一pH值而执行。

[0062]

尽管碱性物质并不特别限定，只要它不会造成对于L-谷氨酸-生产细菌生长或L-谷氨酸生产不利的影响，但优选氨气。

[0063]

培养基的pH值通过加入酸性物质可以从第一pH值降到第二pH值。然而，pH值在上述培养期间被由L-谷氨酸-生产细菌生产的L-谷氨酸降低了。因此，优选通过控制碱性物质的加入量将培养基的pH值由第一pH值降到第二pH值，因为酸性物质的加入量可以被忽略。

[0064]

在第一pH值下培养可以延续到培养基中的有机酸耗尽为止。耗尽意味着有机酸的量降低到一定水平，在此量下L-谷氨酸-生产细菌的生长在第二pH值下的培养期间不会被抑制。这样的有机酸水平可以容易的通过本领域技术人员来测量。例如，通过在第二pH值下在含有各种浓度的有机酸的培养基中培养L-谷氨酸-生产细菌，测量L-谷氨酸-生产细菌的细胞数量，对比此细胞数量与在同一条件下但培养基不含有机酸下培养的L-谷氨酸-生产细菌的细胞数量。一般，随着第二pH值降低，有机酸的水平也变得降低了。

[0065]

本发明方法的进一步优选的实施例，是通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括在控制pH值以便通过微生物生产的L-谷氨酸沉淀以引起在L-谷氨酸沉淀的同时L-谷氨酸在培养基中积累的培养基中，培养L-谷氨酸-积累细菌，其中执行一操作使得L-谷氨酸结晶在一段期间存在于培养基中，其中L-谷氨酸在培养基中的浓度比L-谷氨酸天然结晶发生时的浓度低，且培养基含有泛酸(参见JP2002-238593A(EP1233069A))。“天然结晶”意思是，当具有生产L-谷氨酸能力的微生物积累L-谷氨酸时，L-谷氨酸在培养基中的浓度超过了L-谷氨酸的饱和浓度，因此L-谷氨酸天然的在培养基中沉淀。

[0066]

使L-谷氨酸结晶存在于培养基中的操作意思是，人工提供L-谷氨酸结晶在培养基中的存在的操作。这种操作的例子包括加入结晶，在培养开始时在培养基中溶解一定量的L-谷氨酸，以及在培养期间降低pH值以强制沉淀结晶等的操作。存在于培养基中结晶的量通常为0.01-10g/L。进而，使得结晶存在的期间优选培养基中积累的L-谷氨酸的量提高到接近饱和浓度的浓度(例如，当pH值为4.5或更高，为25g/L或更多)。存在于培养基中L-谷氨酸结晶的量和L-谷氨酸的浓度可以用本领域技术人员熟知的方法测量。L-谷氨酸的结晶在培养基静置之后测量，且通过倾析收集结晶。L-谷氨酸在培养基中的浓度是溶解的L-谷氨酸的浓度。当结晶在培养基中沉淀时，L-谷氨酸的浓度是指通过离心分离或过滤将固体物质从培养基中分离后获得的清溶液测量出的L-谷氨酸浓度值。

[0067]

使L-谷氨酸结晶存在于培养基中的操作优选加入L-谷氨酸晶体。

L-谷氨酸的晶体包括α-型和β-型晶体(H.Takahashi，T.Takenishi，N.Nagashima，Bull.Chem.Soc.Japan，35，923(1962)；J.D.Bernal，Z.Krist.，78，363(1931)；S.Hirokawa，Acta Cryst.，8，637(1955))。当想要得到α-型晶体时，加入的晶体优选为α-型晶体。

[0068]

尽管要加入的晶体的优选用量依据包括晶体结晶形式等条件而不同，通常对于α-型晶体为0.2g/L或更多。如果以上述量或更大量加入晶体，可以获得有良好再生性的α-型晶体。从形态学的观点看α-型晶体与β-型晶体相比更容易操作。

[0069]

作为本发明使用的培养基，可以使用既含有碳源、氮源和无机盐也含有，如果需要的话，有机痕量营养如氨基酸和维生素的一般营养培养基，除了它含有泛酸，且pH值被调整以满足预先设定的条件。合成培养基或天然培养基都可以使用。想要培养的菌株可以使用的任何碳源和氮源都可以在培养基中使用。

[0070]

糖类如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麦芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解产物和糖蜜，可以作为碳源使用。另外，有机酸如乙酸和柠檬酸可以每个单独使用或同另外的碳源联合使用。

[0071]

氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵和醋酸铵、硝酸铵等可用作氮源。

[0072]

氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸，含有这些物质的物质，如蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母抽提物和大豆蛋白分解产物被用作有机痕量营养。当需要氨基酸等用来新陈代谢或生长的营养缺陷型菌株被使用时，所需要的营养必须补充。

[0073]

磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等被用作矿物盐。

关于培养方法，通常实行在20-42℃下通风培养，前提是pH值被控制在预先设定的值。

[0074]

培养完成后，培养基中沉淀的L-谷氨酸可通过离心分离、过滤或类似方法收集。溶解在培养基中的L-谷氨酸也可以用公知方法收集。例如，用浓缩培养液使其结晶的方法离析L-谷氨酸或用离子交换色谱法或类似方法离析L-谷氨酸。也可以结晶溶解在培养基中的L-谷氨酸，然后收集在培养中沉淀的L-谷氨酸以及结晶的L-谷氨酸。

[0075]

在L-谷氨酸超过饱和浓度而沉淀的实施例中，溶解在培养基中的L-谷氨酸的浓度保持在一个不变的水平。因此，L-谷氨酸在高浓度时对微生物的影响可以减低。从而，繁殖具有进一步提高的L-谷氨酸-生产能力的微生物也变为可能。进而，由于L-谷氨酸作为晶体沉淀，L-谷氨酸积累带来的培养液酸化被抑制，因此用于保持培养的pH值的碱用量可以明显减少。

实施例

[0076]

此后，本发明将被详细描述。

参考实施例1

<1>筛选具有在酸性环境下抵抗L-谷氨酸能力的微生物

筛选具有在酸性环境下抵抗L-谷氨酸能力的微生物按以下步骤执行。一(1)克来自于天然的大约500种样品的每一种，包括土壤、水果、植物体、河流水等，悬浮在5mL无菌水中，将200μL的这种液体加入到20mL用盐酸调pH值至4.0的固体培养基上。培养基组分如下：3g/L葡萄糖，1g/L硫酸铵，0.2g/L硫酸镁七水合物，0.5g/L磷酸二氢钾，0.2g/L氯化钠，0.1g/L氯化钙二水合物，0.01g/L硫酸铁七水合物，0.01g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物，50μg/L维生素h，50μg/L泛酸钙，50μg/L叶酸，50μg/L肌醇，50μg/L烟酸，50μg/L对氨基苯甲酸，50μg/L维生素B6，50μg/L核黄素，50μg/L盐酸硫胺素，50μg/L放线菌酮和20g/L琼脂。

[0077]

用以上样品覆盖的培养基在28℃、37℃或50℃下培养2-4天，得到形成菌落的378个菌株。

随后如上所述获得的每个菌株在16.5cm长14mm直径的含有3mL含有饱和浓度L-谷氨酸的液体培养基(用HCL调整pH值至4.0)的试管中接种，并在震荡下在28℃、37℃或50℃下培养24小时。然后，选出生长的菌株。前述培养基组成如下：40g/L葡萄糖，20g/L硫酸铵，0.5g/L硫酸镁七水合物，2g/L磷酸二氢钾，0.5g/L氯化钠，0.25g/L氯化钙二水合物，0.02g/L硫酸铁七水合物，0.02g/L硫酸锰四水合物，0.72mg/L硫酸锌二水合物，0.64mg/L硫酸铜五水合物，0.72mg/L氯化钴六水合物，0.4mg/L硼酸，1.2mg/L钼酸钠二水合物和2g/L酵母抽提物。

[0078]

这样，78个在酸性环境下显示出对L-谷氨酸抵抗的微生物的菌株就成功的获得了。

[0079]

<2>从在酸性环境下具有L-谷氨酸抗性的微生物中选择显示出较好生长速率的菌株

上述获得的各种在酸性环境下具有L-谷氨酸抗性的微生物的每一个在16.5cm长14mm直径的含有3mL通过在M9培养基中加入20g/L谷氨酸和2g/L葡萄糖而获得的培养基(用HCL调整pH值至4.0)的试管中接种(Sambrook，J.，Fritsh，E.F.和Maniatis，T.，“分子克隆”，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A.，1989)，并在一时间段内测量培养基的混浊度以选择显示好的生长速率的菌株。结果，作为显示好的生长的菌株，AJ13355菌株从日本Shizuoka，Iwata-shi的土壤中得到。该菌株在它的前述细菌学性质基础上被确定为成团泛菌。成团泛菌(Enterobacter agglomerans)包括那些根据16S rRNA的核苷酸序列分析等而重新分类到成团泛菌(Pantoeaagglomerans)、Pantoea ananatis、斯氏泛菌(Pantoeea Stewartii)等的细菌，而AJ13355菌株被分类到这些中的Pantoea ananatis。

[0080]

<3>从Pantoea ananatis AJ13355菌株获得较少粘液分泌的菌株

由于Pantoea anatatis AJ13355菌株在含有糖类的培养基中培养时在细胞外分泌粘液，操作效率不好。因此通过紫外线辐射方法获得较少粘液分泌的菌株(Miller，J.H.et al.，“细菌遗传学的短期课程；实验室手册”，第150页，1992，Cold Spring HarborLaboratory Press，美国)。

[0081]

Pantoea ananatis AJ13355菌株在距离60-W紫外灯60cm处用紫外线辐射2分钟，在LB培养基中培养过夜以固定突变。发生突变的菌株被稀释并接种在含有5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中以便在每板上有大约100个菌落形成，然后将板倾斜约45度在30℃下培养过夜，选择没有流下粘液的20个菌落。

[0082]

作为满足即使在含有5g/L葡萄糖和20g/L琼脂的LB培养基中传代培养5次也没有回复突变发生的条件的菌株，SC17菌株显示了与LB培养基，在含有5g/L葡萄糖的LB培养基和增补了20g/L L-谷氨酸和2g/L葡萄糖并用HCL调整pH值至4.5的M9培养基中(Sambrook，J.et al.，“分子克隆”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，U.S.A.，1989)的母株同等的生长，从上述选择的菌株中选择SC17菌株。

[0083]

<4>由Pantoea ananatis SC17菌株得来的谷氨酸-生产细菌的构建

(1)由Pantoea ananatis SC17菌株制备αKGDH缺乏菌株

由Pantoea ananatis SC17菌株制备缺乏αKGDH并具有增强的L-谷氨酸生物合成系统的菌株。

[0084]

(i)Pantoea ananatis AJ13355菌株αKGDH基因的克隆(此后，用“sucAB”指代)

Pantoea ananatis AJ13355菌株的sucAB基因通过由Pantoeaananatis AJ13355菌株的染色体DNA中选择互补于αKGDH-E1亚基基因(此后秒为“sucA”)缺乏的大肠杆菌菌株的乙酸不吸收性质的DNA片段来克隆。

[0085]

Pantoea ananatis AJ13355菌株的染色体DNA用通常应用的从大肠埃希氏菌提取染色体DNA的方法离析(生物工程学实验课本，生物科学和生物工程学协会编辑，日本，第97-98页，Baifukan，1992)。PTWV228(氨苄青霉素抗性)用作载体，是Takara Shuzo公司的商业产品。

[0086]

被EcoT221消化的AJ13355菌株的染色体DNA和被PstI消化的pTWV228被用T4连接酶连接，使用连接混合物转化sucA缺乏大肠埃希氏菌JRG465菌株(Herbert，J.et al.，Mol.Gen.Genetics，105，182(1969))。在醋酸盐基本培养基中生长的菌株从上述得到的转化株中选择出，从上述得到的菌株中提取质粒，称为pTWVEK101。含有pTWVEK101的大肠埃希氏菌JRG465菌株恢复(recover)了对于琥珀酸或L-赖氨酸和L-蛋氨酸的营养缺陷型，包括乙酸-不可同化性的特性。这表明pTWVEK101含有Pantoea ananatis的sucA基因。

[0087]

图1表示了源于Pantoea ananatis的pTWVEK101中的DNA片断的限制酶图谱。在图1阴影线部分的核苷酸序列中，发现被认为是两个全长的可读框的核苷酸序列和被认为是可读框的部分序列的两个核苷酸序列。预测这些可读框或部分序列编码的氨基酸序列以开始于5’侧的顺序表示为SEQ ID NOS：2-5。这些序列同源性检索的结果，表明其核苷酸序列被测定的部分包含了琥珀酸脱氢酶铁硫蛋白基因(sdhB)、全长sucA和αKGDH-E2亚基基因(sucB)的3’端的部分序列和琥珀酰CoA合成酶β亚基基因(sucC)的5’端部分序列。由这些核苷酸序列推出的氨基酸序列与源自大肠埃希氏菌的序列的对比结果(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Eur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；生物化学，24，第6245-6252页(1985))表明这些氨基酸序列显示出非常高的相互同源。另外，发现sdhB-sucA-sucB-sucC聚簇在Pantoea ananatis的染色体上，和大肠埃希氏菌一样(Eur.J.Biochem.，141，第351-359页(1984)；Bur.J.Biochem.，141，第361-374页(1984)；生物化学，24，第6245-6252页(1985))。

[0088]

(ii)源自Pantoea ananatis SC17菌株的αKGDH-缺乏菌株的获得

使用上述得到的Pantoea ananatis的sucAB基因进行同源重组来得到Pantoea ananatis的αKGDH-缺乏菌株。

[0089]

在pTWVEK101被SphI消化以切除含有sucA的片断后，用klenow片断将该片断平端(Takara Shuzo有限公司)，并用T4 DNA连接酶(Takara Shuzo有限公司)与由EcoRI消化得来且用klenow片断将其平端的pBR322连接。所得的质粒通过使用酶在大约位于sucA中心的限制酶BglII识别位点消化，用klenow片断平端，然后再使用T4 DNA连接酶连接。认为sucA基因成为非功能性的，因为移码突变被引入通过上述步骤新构造的质粒的sucA中。

[0090]

如上构造的质粒用限制酶ApaLI消化，进行琼脂糖凝胶电泳以回收含有其中引入了移码突变的sucA和源自pBR322的四环素抗性基因的DNA片断。回收的DNA片断再次用T4 DNA连接酶连接以构造用于破坏αKGDH基因的质粒。

[0091]

如上述获得的用于破坏αKGDH基因的质粒被用于电穿孔转化Pantoea ananatisSC17菌株(Miller，J.H.，“细菌遗传学的短期课程；手册”，第279页，Cold Spring Harbor Laboratory Press，美国，1992)，由抗四环素作为标记菌株中染色体上的sucA通过同源重组被质粒的突变sucA替代的菌株被获得。得到的菌株记为SC17sucA菌株。

[0092]

为了确定SC17sucA菌株缺乏αKGDH活性，使用Reed等人的方法测量酶的活性(Reed，L.J.和Mukherjee，B.B.，酶学方法，13，第55-61页，(1969))，使用在LB培养基中培养到对数生长期的菌株的细胞。结果是，从SC17菌株中检测到αKGDH活性为0.073(ΔABS/min/mg蛋白质)，但从SC17sucA菌株中未检测到任何αKGDH活性，因此确定sucA按设想被消除了。

[0093]

(2)Pantoea ananatisSC17sucA菌株的L-谷氨酸生物合成系统的增强

之后，源自大肠埃希氏菌的柠檬酸合酶基因、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶基因和谷氨酸脱氢酶基因被引入SC17sucA菌株。

[0094]

(i)制备具有源自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒

制备具有源自大肠埃希氏菌的gltA基因、ppc基因和gdhA基因的质粒的过程参考图2和3来解释。

[0095]

具有源自大肠埃希氏菌的gdhA基因的质粒，pBRGDH(JP7-203980A)，被HindIII和AphI消化，两端用T4DNA聚合酶处理为平端，然后具有gdhA基因的DNA片断被纯化和回收。分别的，具有源自大肠埃希氏菌的gltA基因和ppc基因的质粒，pMWCP(WO97/08294)，被XbaI消化，两端用T4 DNA聚合酶处理为平端。将这与上述纯化的具有gdhA基因的DNA片断混合，并用T4连接酶连接得到质粒pMWCPG，它对应于还含有gdhA基因(图2)的pMWCP。

[0096]

同时，具有宽寄主范围质粒RSF1010的复制起点的质粒pVIC40(JP8-047397A)被NotI消化，用T4 DNA聚合酶处理并用PstI消化。PBR322被EcoT14I消化，用T4DNA聚合酶处理并用PstI消化。两个产品混合，并用T4连接酶连接得到具有RSF1010的复制起点和四环素抗性基因的质粒RSF-Tet(图3)。

[0097]

之后，pMWCPG被EcoRI和PstI消化，具有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的DNA片断被纯化和回收。RSF-Tet类似地被EcoRI和PstI消化，具有RSF1010的复制起点的DNA片断被纯化和回收。将两个产品混合并用T4连接酶连接得到质粒RSFCPG，它对应于含有gltA基因、ppc基因和gdhA基因的RSF-Tet(图4)。确定了得到的质粒RSFCPG表达gltA基因、ppc基因和gdhA基因，这基于源自大肠埃希氏菌的gltA基因-、ppc基因-或gdhA基因-缺乏菌株的营养缺陷型的补充以及每种酶活性的测定。

[0098]

(ii)制备具有源自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒

具有源自谷氨酸棒杆菌的gltA基因的质粒按以下构造。通过使用具有核苷酸序列SEQ ID NOS：6和7且在谷氨酸棒杆菌的gltA基因的核苷酸序列的基础上制备的引物DNA(微生物学，140，第1817-1828页(1994))执行PCR，用谷氨酸棒杆菌ATCC13869的染色体DNA作为模板得到大约3kb的gltA基因片断。将此片断插入被SmaI消化的质粒pHSG399(购买于Takara Shuzo有限公司)，得到质粒pHSGCB(图5)。此后，pHSGCB被HindIII消化，将切除的大约3kb的gltA基因片断插入被HindIII消化的质粒pSTV29(购买于Takara Shuzo有限公司)得到质粒pSTVCB。确认了得到的质粒pSTVCB表达了gltA基因，其中通过测量Pantoea ananatisAJ13355菌株的酶活性。

[0099]

(iii)RSFCPG和pSTVCB引入SC17sucA菌株

Pantoea ananatisSC17sucA菌株通过电穿孔用RSFCPG转化，得到显示四环素抗性的转化体SC17sucA/RSFCPG菌株。因而，SC17sucA/RSFCPG菌株通过电穿孔用pSTVCB转化，得到显示氯霉素抗性的转化体SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株。

[0100]

<4>带有提高的在低pH值环境下抵抗L-谷氨酸性质的菌株的获得

带有提高的在低pH值环境下抵抗高浓度L-谷氨酸性质的菌株(此后，也作为“在低pH值下抵抗高浓度Glu菌株”)从PantoeaananatisSC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株中分离。

[0101]

SC17sucA/RSFCPG+pSTVCB菌株在LBG培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/LNaCl、5g/L葡萄糖)中在30℃下培养一整夜，用盐水洗过的细胞被适当稀释，铺在M9-E培养基(4g/L葡萄糖、17g/LNa₂HPO₄·12H₂O、3g/LKH₂PO₄、0.5g/LNaCl、1g/LNH₄Cl、10mMMgSO₄、10μMCaCl₂、50mg/L L-赖氨酸、50mg/LL-蛋氨酸、50mg/LDL-二氨基庚二酸、25mg/L四环素、25mg/L氯霉素、30g/LL-谷氨酸，用氨水调pH值到4.5)板上。在32℃下培养2天后出现的菌落作为在低pH值下抵抗高浓度Glu菌株被得到。

[0102]

对于得到的菌株，测量在M9-E液体培养基中的生长水平，并在含有5mlL-谷氨酸生产测试培养基(40g/L葡萄糖、20g/L硫酸铵、0.5g/L硫酸镁七水合物、2g/L磷酸二氢钾、0.5g/L氯化钠、0.25g/L氯化钙二水合物、0.02g/L硫酸亚铁七水合物、0.02g/L硫酸锰四水合物、0.72mg/L硫酸锌二水合物、0.64mg/L硫酸铜五水合物、0.72mg/L氯化钴六水合物、0.4mg/L硼酸、1.2mg/L钼酸钠二水合物、2g/L酵母抽提物、200mg/LL-盐酸赖氨酸、200mg/LL-蛋氨酸、200mg/LDL-α，ε-二氨基庚二酸、25mg/L盐酸四环素和25mg/L氯霉素)的50-ml容积的大试管中测试L-谷氨酸-生产能力。表现出最好的生长水平并同其母株的L-谷氨酸-生产能力相同的菌株，SC17/RSFCPG+pSTVCB菌株，被称为Pantoea ananatisAJ13601。AJ13601菌株已于1999年8月18日保藏在通商产业省工业技术院生命工学工业技术研究所(目前，National Institute of Advanced Industrial Science andTechnology，国际专利生物保藏机构，中央6，1-1，Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，305-8566，日本)并收到入藏登记号FERMP-17516。然后它于2000年7月6日转为布达佩斯条约规定的国际保藏并收到入藏登记号FERM BP-7207。

[0103]

实施例1

Pantoea ananatisAJ13601菌株在含有泛酸钙(12mg/L)的培养基和不含有泛酸钙的培养基中培养来研究L-谷氨酸的生产力。

[0104]

特别的，按以下步骤培养。在30℃下在含有25mg/L盐酸四环素和25mg/L氯霉素的LBG琼脂培养基(10g/L胰化蛋白胨、5g/L酵母抽提物、10g/LNaCl、15g/L琼脂)中培养14小时的PantoeaananatisAJ13601菌株的细胞从一板中刮下并接种到300ml具有以下组成并容纳在1L容积的广口瓶发酵罐中的种子培养基中，在34℃和pH值6.0条件下进行种子培养。

[0105]

[种子培养基的组成]

蔗糖                            50g/L

MgSO₄·7H₂O                 0.4g/L

KH₂PO₄                       2.0g/L

酵母抽提物                      4.0g/L

FeSO₄·7H₂O                 0.01g/L

MnSO₄·5H₂O                 0.01g/L

L-盐酸赖氨酸                    0.4g/L

DL-蛋氨酸                       0.4g/L

ε-二氨基庚二酸                 0.4g/L

盐酸四环素                      25mg/L

氯霉素                          25mg/L

[0106]

在培养期间加入氨水调整pH值至6.0。通过观察培养基中糖类的耗尽作为指示来完成种子培养，相当于主培养基容积的20％的种子培养基被接种到300ml容纳在1L容积的广口瓶发酵罐中的主培养基中以便在34℃和pH值4.5条件下进行主要培养。主培养基的组成如下所示。

[0107]

[主培养基的组成]

葡萄糖                        50g/L

(NH₄)₂SO₄                 5.0g/L

MgSO₄·7H₂O               0.7g/L

KH₂PO₄                     6.0g/L

NaCl                       1.5g/L

FeSO₄·7H₂O              0.01g/L

MnSO₄·5H₂O              0.01g/L

L-盐酸赖氨酸                0.8g/L

DL-蛋氨酸                   0.6g/L

DL-α，ε-二氨基庚二酸      0.6g/L

盐酸四环素                  25mg/L

氯霉素                      25mg/L

氯化钙二水合物              0.75g/L

泛酸钙                      12mg/L

(只在加入泛酸的培养中添加)

[0108]

在培养期间加入氨水调整pH值至4.5。当培养基中糖类被消耗并耗尽时，连续加入(5ml/hr)700g/L葡萄糖水溶液。当培养液中L-谷氨酸浓度达到45g/L时，在培养基中加入1.0g/LL-谷氨酸晶体作为促进L-谷氨酸在培养液中沉淀的种晶。

[0109]

进行主要培养50小时后，L-谷氨酸晶体以显著的量在广口瓶发酵罐中沉淀。然后加入氨气提高pH值到6.0，从而使所有L-谷氨酸晶体在广口瓶发酵罐中溶解。接着，测量所生产的L-谷氨酸的量。使用Asahi化学公司生产的自动酶电极分析器As210测量L-谷氨酸浓度。

[0110]

结果，发现通过加入泛酸使L-谷氨酸发酵产量明显提高，如表1所示。

[0111][表1]

                           表1

	不加入泛酸钙	加入泛酸钙(12mg/L)
			L-谷氨酸发酵产量(％)	40.2	53.3

[0112]

研究了通过加入泛酸钙所提供的L-谷氨酸产量提高的起因。因而，确定3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二醇和CO₂产生的减少(表2)。使用Shimadzu生产的气相色谱仪GC1700在以下条件测量3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的浓度。

[0113]

[所使用的柱]

J&W Scientific生产的DB-210 123-0233，柱长：30m，柱直径：0.32mm，膜厚：5μm

[测量条件]

蒸汽室温度：250℃

载体气体：He

压力：85.6kPa

总流动速率：97.2ml/min

柱流动速率：0.93ml/min

线性粘度：25.0cm/sec

排空流动速率：3.0ml/min

分流比(split ratio)：100

柱温：70℃

补充(makeup)气体：He

补充流动速率：30.0ml/min

H₂流动速率：47ml/min

空气流动速率：400ml/min

[0114]

用ABLE生产的氧气二氧化碳消耗仪表(Exhaust oxygen carbondioxide meter)型号EX-1562测量释放的CO₂量。3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的产量同由这些值计算出的CO₂产量示于表2(所有值用碳量表示)。由培养基中释放的CO₂测量值在不加泛酸时为26.5％，加入泛酸时为27.6％。

[0115]

当在培养基中加入泛酸钙时，3-羟基-2-丁酮、2，3-丁二醇和与前述物质的次级生产相关而产生的CO₂的量(3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇各一摩尔产生两摩尔CO₂)与不添加泛酸钙的情况作对比减少了约14.3％，这基于碳平衡。因为这个值与加入和不加入泛酸钙时L-谷氨酸发酵量的差值，即约13.1％，基本相当，可以认为由于加入泛酸钙带来产量提高的效果主要是由3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇次级生产(Secondary production)的减少引起的。

[0116][表2]

                         表2

副产品(％，以碳表示)	不加入泛酸钙	加入泛酸钙(12mg/L)
			3-羟基-2-丁酮+与3-羟基-2-丁酮产生相关产生的CO2	12.0	2.5
丁二醇+与丁二醇产生相关产生的CO2	6.1	1.3

[0117]

从以上结果看，通过加入泛酸改进L-谷氨酸发酵的机理如以下评估。即，可认为L-谷氨酸发酵量的提高是由于加入泛酸补偿了辅酶A(CoA)的缺乏。在泛酰巯基乙胺形态的CoA结构中含有泛酸，因此它是CoA的组分之一。CoA用作代谢途径中将丙酮酸转换为乙酰-CoA过程中的辅酶。另一方面，3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇由丙酮酸产生，CO₂与3-羟基-2-丁酮产生相关而被释放。当不在用于培养L-谷氨酸生产细菌的培养基中添加泛酸时，3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇在培养基中积累。因此，可以认为CoA最初在细菌中缺乏，且细菌中没有足够的乙酰-CoA产出，这带来的结果是3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇的次级生产。

[0118]

另一方面，当通过加入泛酸提供足够量的CoA时，就促进了由丙酮酸脱氢酶复合物(丙酮酸→乙酰-CoA)引起的反应，该反应由于CoA的缺乏起速度-限制因素的作用，因此促进了碳流入TCA循环。所以，可以认为L-谷氨酸的生产是通过α-酮戊二酸(αKG)作为结果而促进的。进而，当3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇产生减少时，同始自丙酮酸的这些物质的产生一起产生的CO₂也减少了(3-羟基-2-丁酮和2，3-丁二醇各1摩尔产生2摩尔CO₂)。因此，认为这种减低也对于L-谷氨酸产量的提高有贡献(图6)。

[0119]

在上述机理的基础上，认为代替泛酸加入或在泛酸加入时加入的物质如D-泛解酸(D-panto acid)、β-丙氨酸或D-泛酰巯基乙胺会提供相当的或更好的产量提高效果。

[0120]

实施例2

加入到培养基中的泛酸钙的浓度变到0mg/L到196mg/L，以研究泛酸钙的浓度对于L-谷氨酸发酵量的影响。以同实施例1相同的方式除了将泛酸钙浓度变为0、1、2、4、8、12、24、48、96或192mg/L外进行培养。结果示于图7。由这些结果可以确认，L-谷氨酸发酵量可以依赖于泛酸钙浓度正向提高。即使当加入1mg/L泛酸钙时，与不加入(0mg/L)相比产量提高约5％。由于依赖于加入的泛酸钙浓度一直达到12mg/L的加入浓度都可以获得产量提高的效果，因此认为产量提高效果甚至在浓度低于1mg/L也可获得。

[0121]

实施例3

通过加入泛酸钠代替泛酸钙进行主要培养。培养条件与实施例1相同。泛酸钠以浓度12.15mg/L加入，以便泛酸的摩尔浓度会与加入12mg/L泛酸钙时得到的相当。结果示于表3。

[0122]

结果表示，相当的L-谷氨酸发酵量由泛酸钙和泛酸钠得到。因此，阐明了产量提高因素是泛酸本身，而不是泛酸的相反离子。

[0123][表3]

                      表3

	加入泛酸钙(12mg/L)	加入泛酸钠(12.15mg/L)
			L-谷氨酸发酵量(％)	52.8	52.5

实用性

[0124]

根据本发明，使用如属于泛菌属的细菌可以比传统技术更有效的生产L-谷氨酸。

                       序列表

<110>味之素株式会社

<120>生产L-谷氨酸的方法

<130>C210YMOPC4045

<150>2003-165545

<151>2003-06-10

<160>13

<170>PatentIn Ver.2.0

<210>1

<211>4556

<212>DNA

<213>Pantoea ananatis

<220>

<221>CDS

<222>(2)..(121)

<220>

<221>CDS

<222>(322)..(3129)

<220>

<221>CDS

<222>(3145)..(4368)

<220>

<221>CDS

<222>(4437)..(4556)

<400>1

t gca ttc agc gtt ttc cgc tgt cac agc atc atg aac tgt gta agt gtt   49

  Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val

    1               5                  10                  15

tgt cct aaa ggg cta aac ccg acg cgc gct atc ggc cac att aag tcg     97

Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser

             20                  25                  30

atg ctg ctg caa cgc agc gcg tagttatacc accgggaacc tcaggttccc        148

Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala

         35

ggtattttac ggaagcctct gtaaacgcgg tcccaaccac gtttacaaag gttcccttac   208

gggccgggcg cgcgctgcgc acagtgctcg tatcgctgaa ctcactacgg caaaccgcga   268

aagcggcaac aaatgaaacc tcaaaaaagc ataacattgc ttaagggatc aca atg      324

                                                           Met

                                                             1

cag aac agc gcg atg aag ccc tgg ctg gac tcc tcc tgg ctg gcc ggc     372

Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala Gly

             5                   10                   15

gcg aat cag tct tac ata gag caa ctc tat gag gat ttc ctg acc gat     420

Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr Asp

         20                  25                  30

cct gac tct gtg gat gca gtg tgg cgc tcg atg ttc caa cag tta cca     468

Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu Pro

     35                  40                  45

ggc acg gga gtg aaa cct gag cag ttc cac tcc gca act cgc gaa tat     516

Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu Tyr

 50                  55                  60                  65

ttc cgt cgc ctg gcg aaa gac gca tct cgt tac acc tcc tca gtt acc     564

Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val Thr

                 70                  75                  80

gat ccg gca acc aac tcc aaa caa gtg aaa gtg ctg cag ctg att aac     612

Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile Asn

             85                  90                  95

gcg ttt cgt ttc cgc gga cat cag gaa gca aat ctc gat ccg ctt ggc     660

Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu Gly

        100                 105                 110

ctg tgg aaa cag gac cgc gtt gcc gat ctc gat cct gcc ttt cac gat     708

Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His Asp

    115                 120                 125

ctg acc gac gcc gat ttt cag gaa agc ttt aac gta ggt tct ttt gcc     756

Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe Ala

130                 135                 140                 145

att ggc aaa gaa acc atg aag ctg gcc gat ctg ttc gac gcg ctg aag     804

Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu Lys

                150                 155                 160

cag acc tac tgt ggc tcg att ggt gca gag tat atg cac atc aat aac     852

Gln Thr Tyr Gys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn Asn

            165                 170                 175

acc gaa gag aaa cgc tgg atc cag cag cgt atc gaa tcc ggt gcg agc     900

Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala Ser

        180                 185                 190

cag acg tca ttc agt ggc gaa gag aaa aaa ggt ttc ctg aaa gag ctg     948

Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu Leu

    195                 200                 205

acc gcg gca gaa ggg ctg gaa aaa tat ctg ggc gcg aaa ttc ccg ggt   996

Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro Gly

210                 215                 220                 225

gca aaa cgt ttc tcg ctg gaa ggc ggt gat gcg ctg gtg ccg atg ctg   1044

Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met Leu

                230                 235                 240

cgc gag atg att cgt cat gcg ggc aaa agc ggc aca cgt gaa gtg gta   1092

Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val Val

            245                 250                 255

ctg ggg atg gcg cac cgt ggc cgt ctt aac gta ctg att aac gta ctg   1140

Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val Leu

        260                 265                 270

ggt aaa aag cca cag gat ctg ttc gac gaa ttc tcc ggt aaa cac aaa   1188

Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His Lys

    275                 280                 285

gag cat ctg ggc acc ggt gat gtg aag tat cac atg ggc ttc tct tcg   1236

Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser Ser

290                 295                 300                 305

gat att gaa acc gaa ggt ggt ctg gtg cat ctg gcg ctg gcg ttt aac   1284

Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe Asn

                310                 315                 320

ccg tct cac ctg gaa att gtc agc ccg gtg gtc atg gga tcg gta cgt   1332

Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val Arg

            325                 330                 335

gca cgt ctc gat cgt ctg gcc gaa ccg gtc agc aat aaa gtg ttg cct   1380

Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu Pro

        340                 345                 350

atc acc att cac ggt gat gcg gcg gtg att ggt cag ggc gtg gtt cag   1428

Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val Gln

    355                 360                 365

gaa acc ctg aac atg tct cag gcg cgc ggc tac gaa gtg ggc ggc acg   1476

Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly Thr

370                 375                 380                 385

gta cgt atc gtc att aac aac cag gtt ggt ttt acc acc tcc aac ccg   1524

ValArg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn Pro

               390                 395                 400

aaa gat gcg cgt tca acc ccg tac tgt act gac atc ggc aag atg gtg   1572

Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met Val

            405                 410                 415

ctg gca ccg att ttc cac gtc aat gct gac gat ccg gaa gcg gtg gcc   1620

Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val Ala

        420                 425                 430

ttt gtt acc cgc ctg gcg ctg gac tat cgc aac acc ttc aaa cgc gat   1668

Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg Asp

    435                 440                 445

gtg ttt atc gat ctg gtg tgc tat cgc cgt cat ggt cac aac gag gcg   1716

Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu Ala

450                 455                 460                 465

gat gag cca agt gct acc cag ccg ttg atg tac cag aaa atc aaa aag   1764

Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys Lys

                470                 475                 480

cat ccg acg ccg cgt aaa att tac gcc gat cgt ctg gaa ggc gaa ggt   1812

His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu Gly

            485                 490                 495

gtc gcg tcg cag gaa gat gcc acc gag atg gtg aac ctg tac cgc gat   1860

Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg Asp

        500                 505                 510

gcg ctc gat gcg ggc gaa tgc gtg gtg ccg gaa tgg cgt ccg atg agc   1908

Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met Ser

    515                 520                 525

ctg cac tcc ttc acg tgg tcg cct tat ctg aac cac gaa tgg gat gag   1956

Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp Glu

530                 535                 540                 545

cct tat ccg gca cag gtt gac atg aaa cgc ctg aag gaa ctg gca ttg   2004

Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala Leu

                550                 555                 560

cgt atc agc cag gtc cct gag cag att gaa gtg cag tcg cgc gtg gcc   2052

Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val Ala

            565                 570                575

aag atc tat aac gat cgc aag ctg atg gcc gaa ggc gag aaa gcg ttc   2100

Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala Phe

        580                 585                 590

gac tgg ggc ggt gcc gag aat ctg gcg tac gcc acg ctg gtg gat gaa   2148

Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp Glu

    595                 600                 605

ggt att ccg gtt cgc ctc tcg ggt gaa gac tcc ggt cgt gga acc ttc   2196

Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr Phe

610                 615                 620                 625

ttc cat cgc cac gcg gtc gtg cac aac cag gct aac ggt tca acc tat   2244

Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr Tyr

                630                 635                 640

acg ccg ctg cac cat att cat aac agc cag ggc gag ttc aaa gtc tgg   2292

Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val Trp

            645                 650                 655

gat tcg gtg ctg tct gaa gaa gcg gtg ctg gcg ttt gaa tac ggt tac   2340

Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly Tyr

        660                 665                 670

gcc acg gct gag ccg cgc gtg ctg acc atc tgg gaa gcg cag ttt ggt   2388

Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe Gly

    675                 680                 685

gac ttt gcc aac ggt gct cag gtg gtg att gac cag ttc atc agc tct   2436

Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser Ser

690                 695                 700                 705

ggc gaa cag aag tgg ggc cgt atg tgt ggc ctg gtg atg ttg ctg ccg   2484

Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu Pro

                710                 715                 720

cat ggc tac gaa ggt cag gga ccg gaa cac tcc tct gcc cgt ctg gaa   2532

His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu Glu

            725                 730                 735

cgc tat ctg caa ctt tgc gcc gag cag aac atg cag gtt tgc gtc ccg   2580

Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val Pro

        740                 745                 750

tcg acg ccg gct cag gtg tat cac atg ctg cgc cgt cag gcg ctg cgc   2628

Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu Arg

    755                 760             765

ggg atg cgc cgt ccg ctg gtg gtg atg tcg ccg aag tcg ctg tta cgc   2676

Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu Arg

770                 775                 780                 785

cat cca ctg gcg atc tcg tcg ctg gat gaa ctg gca aac ggc agt ttc   2724

His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser Phe

                790                 795                 800

cag ccg gcc att ggt gag atc gac gat ctg gat ccg cag ggc gtg aaa   2772

Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val Lys

            805                 810                 815

cgc gtc gtg ctg tgc tcc ggt aag gtt tac tac gat ctg ctg gaa cag   2820

Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu Gln

        820                 825                 830

cgt cgt aaa gac gag aaa acc gat gtt gcc atc gtg cgc atc gaa cag   2868

Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu Gln

    835                 840                 845

ctt tac ccg ttc ccg cat cag gcg gta cag gaa gca ttg aaa gcc tat   2916

Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala Tyr

850                 855                 860                 865

tct cac gta cag gac ttt gtc tgg tgc cag gaa gag cct ctg aac cag   2964

Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn Gln

                870                 875                 880

ggc gcc tgg tac tgt agc cag cat cat ttc cgt gat gtc gtg ccg ttt   3012

Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro Phe

            885                 890                 895

ggt gcc acc ctg cgt tat gca ggt cgc ccg gca tcg gct tct ccg gcc   3060

Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro Ala

        900                 905                 910

gtg ggt tat atg tcc gta cac caa caa cag cag caa gac ctg gtt aat   3108

Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val Asn

    915                 920                  925

gac gca ctg aac gtc aat taattaaaag gaaagata atg agt agc gta gat   3159

Asp Ala Leu Asn Val Asn                     Met Ser Ser Val Asp

930                 935                       1               5

att ctc gtt ccc gac ctg cct gaa tcg gtt gca gat gcc aca gta gca   3207

Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala Asp Ala Thr Val Ala

                 10                  15                  20

acc tgg cac aag aaa cca ggc gat gca gtc agc cgc gat gaa gtc atc   3255

Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser Arg Asp Glu Val Ile

             25                  30                  35

gtc gaa att gaa act gac aaa gtc gtg ctg gaa gtg ccg gca tct gcc   3303

Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu Val Pro Ala Ser Ala

         40                  45                  50

gat ggc gtg ctg gaa gcc gtg ctg gaa gac gaa ggg gca acc gtt acg   3351

Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu Gly Ala Thr Val Thr

     55                  60                  65

tcc cgc cag atc ctg ggt cgc ctg aaa gaa ggc aac agt gcg ggt aaa   3399

Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly Asn Ser Ala Gly Lys

 70                  75                  80                  85

gaa agc agt gcc aaa gcg gaa agc aat gac acc acg cca gcc cag cgt   3447

Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr Thr Pro Ala Gln Arg

                 90                  95                 100

cag aca gcg tcg ctt gaa gaa gag agc agc gat gcg ctc agc ccg gcg   3495

Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp Ala Leu Ser Pro Ala

            105                     110             115

atc cgt cgc ctg att gcg gag cat aat ctt gac gct gcg cag atc aaa   3543

Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp Ala Ala Gln Ile Lys

        120                 125                 130

ggc acc ggc gta ggc gga cgt tta acg cgt gaa gac gtt gaa aaa cat   3591

Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu Asp Val Glu Lys His

    135                 140                 145

ctg gcg aac aaa ccg cag gct gag aaa gcc gcc gcg cca gcg gcg ggt   3639

Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala Ala Pro Ala Ala Gly

150                 155                 160                 165

gca gca acg gct cag cag cct gtt gcc aac cgc agc gaa aaa cgt gtt   3687

Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg Ser Glu Lys Arg Val

                170                 175                 180

ccg atg acg cgt tta cgt aag cgc gtc gcg gag cgt ctg ctg gaa gcc   3735

Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu Arg Leu Leu Glu Ala

            185                 190                 195

aag aac agc acc gcc atg ttg acg acc ttc aac gaa atc aac atg aag   3783

Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn Glu Ile Asn Met Lys

        200                 205                 210

ccg att atg gat ctg cgt aag cag tac ggc gat gcg ttc gag aag cgt   3831

Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp Ala Phe Glu Lys Arg

    215                 220                 225

cac ggt gtg cgt ctg ggc ttt atg tct ttc tac atc aag gcc gtg gtc   3879

His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr Ile Lys Ala Val Val

230                 235                 240                 245

gaa gcg ctg aag cgt tat cea gaa gtc aac gcc tct atc gat ggc gaa   3927

Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala Ser Ile Asp Gly Glu

                250                 255                 260

gac gtg gtg tac cac aac tat ttc gat gtg agt att gcc gtc tct acg   3975

Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Thr

            265                 270                 275

cca cgc gga ctg gtg acg cct gtc ctg cgt gac gtt gat gcg ctg agc   4023

Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp Val Asp Ala Leu Ser

        280                 285                 290

atg gct gac atc gag aag aaa att aaa gaa ctg gca gtg aaa ggc cgt   4071

Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu Ala Val Lys Gly Arg

    295                 300                 305

gac ggc aag ctg acg gtt gac gat ctg acg ggc ggt aac ttt acc atc   4119

Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly Gly Asn Phe Thr Ile

310                 315                 320                 325

acc aac ggt ggt gtg ttc ggt tcg ctg atg tct acg cca atc atc aac   4167

Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser Thr Pro Ile Ile Asn

                330                 335                 340

ccg cca cag agc gcg att ctg ggc atg cac gcc att aaa gat cgt cct   4215

Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala Ile Lys Asp Arg Pro

            345                 350                 355

atg gcg gtc aat ggt cag gtt gtg atc ctg cca atg atg tac ctg gct   4263

Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro Met Met Tyr Leu Ala

        360                 365             370

ctc tcc tac gat cac cgt tta atc gat ggt cgt gaa tct gtc ggc tat   4311

Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg Glu Ser Val Gly Tyr

    375                 380                 385

ctg gtc gcg gtg aaa gag atg ctg gaa gat ccg gcg cgt ctg ctg ctg   4359

Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro Ala Arg Leu Leu Leu

390                 395                 400                 405

gat gtc tgattcatca ctgggcacgc gttgcgtgcc caatctcaat actcttttca    4415

Asp Val

gatctgaatg gatagaacat c atg aac tta cac gaa tac cag gct aaa cag   4466

                        Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln

                          1               5                  10

ctg ttt gca cgg tat ggc atg cca gca ccg acc ggc tac gcc tgt act   4514

Leu Phe Ala Arg Tyr Gly Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr

                 15                  20                  25

aca cca cgt gaa gca gaa gaa gcg gca tcg aaa atc ggt gca           4556

Thr Pro Arg Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala

             30              35                      40丂

<210>2

<211>39

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>2

Ala Phe Ser Val Phe Arg Cys His Ser Ile Met Asn Cys Val Ser Val

  1               5                  10                  15

Cys Pro Lys Gly Leu Asn Pro Thr Arg Ala Ile Gly His Ile Lys Ser

             20                  25                  30

Met Leu Leu Gln Arg Ser Ala

         35

<210>3

<211>935

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>3

Met Gln Asn Ser Ala Met Lys Pro Trp Leu Asp Ser Ser Trp Leu Ala

  1               5                  10                  15

Gly Ala Asn Gln Ser Tyr Ile Glu Gln Leu Tyr Glu Asp Phe Leu Thr

             20                   25                 30

Asp Pro Asp Ser Val Asp Ala Val Trp Arg Ser Met Phe Gln Gln Leu

         35                  40                  45

Pro Gly Thr Gly Val Lys Pro Glu Gln Phe His Ser Ala Thr Arg Glu

     50                  55                  60

Tyr Phe Arg Arg Leu Ala Lys Asp Ala Ser Arg Tyr Thr Ser Ser Val

 65                  70                  75                  80

Thr Asp Pro Ala Thr Asn Ser Lys Gln Val Lys Val Leu Gln Leu Ile

                 85                  90                  95

Asn Ala Phe Arg Phe Arg Gly His Gln Glu Ala Asn Leu Asp Pro Leu

            100                 105                 110

Gly Leu Trp Lys Gln Asp Arg Val Ala Asp Leu Asp Pro Ala Phe His

        115                 120                 125

Asp Leu Thr Asp Ala Asp Phe Gln Glu Ser Phe Asn Val Gly Ser Phe

    130                 135                 140

Ala Ile Gly Lys Glu Thr Met Lys Leu Ala Asp Leu Phe Asp Ala Leu

145                 150                 155                 160

Lys Gln Thr Tyr Cys Gly Ser Ile Gly Ala Glu Tyr Met His Ile Asn

                165                 170                 175

Asn Thr Glu Glu Lys Arg Trp Ile Gln Gln Arg Ile Glu Ser Gly Ala

            180                 185                 190

Ser Gln Thr Ser Phe Ser Gly Glu Glu Lys Lys Gly Phe Leu Lys Glu

        195                 200                 205

Leu Thr Ala Ala Glu Gly Leu Glu Lys Tyr Leu Gly Ala Lys Phe Pro

    210                 215                 220

Gly Ala Lys Arg Phe Ser Leu Glu Gly Gly Asp Ala Leu Val Pro Met

225                 230                 235                 240

Leu Arg Glu Met Ile Arg His Ala Gly Lys Ser Gly Thr Arg Glu Val

                245                 250                 255

Val Leu Gly Met Ala His Arg Gly Arg Leu Asn Val Leu Ile Asn Val

            260                 265                 270

Leu Gly Lys Lys Pro Gln Asp Leu Phe Asp Glu Phe Ser Gly Lys His

        275                 280                 285

Lys Glu His Leu Gly Thr Gly Asp Val Lys Tyr His Met Gly Phe Ser

    290                     295             300

Ser Asp Ile Glu Thr Glu Gly Gly Leu Val His Leu Ala Leu Ala Phe

305                 310                 315                 320

Asn Pro Ser His Leu Glu Ile Val Ser Pro Val Val Met Gly Ser Val

                325                 330                 335

Arg Ala Arg Leu Asp Arg Leu Ala Glu Pro Val Ser Asn Lys Val Leu

            340                 345                 350

Pro Ile Thr Ile His Gly Asp Ala Ala Val Ile Gly Gln Gly Val Val

        355                 360                 365

Gln Glu Thr Leu Asn Met Ser Gln Ala Arg Gly Tyr Glu Val Gly Gly

    370                 375                 380

Thr Val Arg Ile Val Ile Asn Asn Gln Val Gly Phe Thr Thr Ser Asn

385                 390                 395                 400

Pro Lys Asp Ala Arg Ser Thr Pro Tyr Cys Thr Asp Ile Gly Lys Met

                405                 410                 415

Val Leu Ala Pro Ile Phe His Val Asn Ala Asp Asp Pro Glu Ala Val

            420                 425                 430

Ala Phe Val Thr Arg Leu Ala Leu Asp Tyr Arg Asn Thr Phe Lys Arg

        435                 440                 445

Asp Val Phe Ile Asp Leu Val Cys Tyr Arg Arg His Gly His Asn Glu

    450                 455                 460

Ala Asp Glu Pro Ser Ala Thr Gln Pro Leu Met Tyr Gln Lys Ile Lys

465                 470                 475                 480

Lys His Pro Thr Pro Arg Lys Ile Tyr Ala Asp Arg Leu Glu Gly Glu

                485                 490                 495

Gly Val Ala Ser Gln Glu Asp Ala Thr Glu Met Val Asn Leu Tyr Arg

            500                 505                 510

Asp Ala Leu Asp Ala Gly Glu Cys Val Val Pro Glu Trp Arg Pro Met

        515                 520                 525

Ser Leu His Ser Phe Thr Trp Ser Pro Tyr Leu Asn His Glu Trp Asp

    530                 535                 540

Glu Pro Tyr Pro Ala Gln Val Asp Met Lys Arg Leu Lys Glu Leu Ala

545                 550                 555                 560

Leu Arg Ile Ser Gln Val Pro Glu Gln Ile Glu Val Gln Ser Arg Val

                565                 570                 575

Ala Lys Ile Tyr Asn Asp Arg Lys Leu Met Ala Glu Gly Glu Lys Ala

            580                 585                 590

Phe Asp Trp Gly Gly Ala Glu Asn Leu Ala Tyr Ala Thr Leu Val Asp

        595                 600                 605

Glu Gly Ile Pro Val Arg Leu Ser Gly Glu Asp Ser Gly Arg Gly Thr

    610                 615                 620

Phe Phe His Arg His Ala Val Val His Asn Gln Ala Asn Gly Ser Thr

625                 630                 635                 640

Tyr Thr Pro Leu His His Ile His Asn Ser Gln Gly Glu Phe Lys Val

                    645             650                 655

Trp Asp Ser Val Leu Ser Glu Glu Ala Val Leu Ala Phe Glu Tyr Gly

             660                665                 670

Tyr Ala Thr Ala Glu Pro Arg Val Leu Thr Ile Trp Glu Ala Gln Phe

        675                 680                 685

Gly Asp Phe Ala Asn Gly Ala Gln Val Val Ile Asp Gln Phe Ile Ser

    690                 695                 700

Ser Gly Glu Gln Lys Trp Gly Arg Met Cys Gly Leu Val Met Leu Leu

705                 710                 715                 720

Pro His Gly Tyr Glu Gly Gln Gly Pro Glu His Ser Ser Ala Arg Leu

                725                 730                 735

Glu Arg Tyr Leu Gln Leu Cys Ala Glu Gln Asn Met Gln Val Cys Val

            740                 745                 750

Pro Ser Thr Pro Ala Gln Val Tyr His Met Leu Arg Arg Gln Ala Leu

        755                 760                 765

Arg Gly Met Arg Arg Pro Leu Val Val Met Ser Pro Lys Ser Leu Leu

    770                 775                 780

Arg His Pro Leu Ala Ile Ser Ser Leu Asp Glu Leu Ala Asn Gly Ser

785                 790                 795                 800

Phe Gln Pro Ala Ile Gly Glu Ile Asp Asp Leu Asp Pro Gln Gly Val

                805                 810                 815

Lys Arg Val Val Leu Cys Ser Gly Lys Val Tyr Tyr Asp Leu Leu Glu

            820                 825                 830

Gln Arg Arg Lys Asp Glu Lys Thr Asp Val Ala Ile Val Arg Ile Glu

        835                 840                 845

Gln Leu Tyr Pro Phe Pro His Gln Ala Val Gln Glu Ala Leu Lys Ala

    850                 855                 860

Tyr Ser His Val Gln Asp Phe Val Trp Cys Gln Glu Glu Pro Leu Asn

865                 870                 875                 880

Gln Gly Ala Trp Tyr Cys Ser Gln His His Phe Arg Asp Val Val Pro

                885                 890                 895

Phe Gly Ala Thr Leu Arg Tyr Ala Gly Arg Pro Ala Ser Ala Ser Pro

            900                 905                 910

Ala Val Gly Tyr Met Ser Val His Gln Gln Gln Gln Gln Asp Leu Val

        915                 920                 925

Asn Asp Ala Leu Asn Val Asn

    930                 935

<210>4

<211>407

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>4

Met Ser Ser Val Asp Ile Leu Val Pro Asp Leu Pro Glu Ser Val Ala

  1               5                  10                  15

Asp Ala Thr Val Ala Thr Trp His Lys Lys Pro Gly Asp Ala Val Ser

             20                  25                  30

Arg Asp Glu Val Ile Val Glu Ile Glu Thr Asp Lys Val Val Leu Glu

         35              40                      45

Val Pro Ala Ser Ala Asp Gly Val Leu Glu Ala Val Leu Glu Asp Glu

     50                  55                  60

Gly Ala Thr Val Thr Ser Arg Gln Ile Leu Gly Arg Leu Lys Glu Gly

 65                  70                  75                  80

Asn Ser Ala Gly Lys Glu Ser Ser Ala Lys Ala Glu Ser Asn Asp Thr

                 85                  90                  95

Thr Pro Ala Gln Arg Gln Thr Ala Ser Leu Glu Glu Glu Ser Ser Asp

            100                 105                 110

Ala Leu Ser Pro Ala Ile Arg Arg Leu Ile Ala Glu His Asn Leu Asp

        115                 120                 125

Ala Ala Gln Ile Lys Gly Thr Gly Val Gly Gly Arg Leu Thr Arg Glu

    130                 135                 140

Asp Val Glu Lys His Leu Ala Asn Lys Pro Gln Ala Glu Lys Ala Ala

145                 150                 155                 160

Ala Pro Ala Ala Gly Ala Ala Thr Ala Gln Gln Pro Val Ala Asn Arg

                165                 170                 175

Ser Glu Lys Arg Val Pro Met Thr Arg Leu Arg Lys Arg Val Ala Glu

            180                 185                 190

Arg Leu Leu Glu Ala Lys Asn Ser Thr Ala Met Leu Thr Thr Phe Asn

        195                 200                 205

Glu Ile Asn Met Lys Pro Ile Met Asp Leu Arg Lys Gln Tyr Gly Asp

    210                 215                 220

Ala Phe Glu Lys Arg His Gly Val Arg Leu Gly Phe Met Ser Phe Tyr

225                 230                 235                 240

Ile Lys Ala Val Val Glu Ala Leu Lys Arg Tyr Pro Glu Val Asn Ala

                245                 250                 255

Ser Ile Asp Gly Glu Asp Val Val Tyr His Asn Tyr Phe Asp Val Ser

            260                 265                 270

Ile Ala Val Ser Thr Pro Arg Gly Leu Val Thr Pro Val Leu Arg Asp

        275                 280                 285

Val Asp Ala Leu Ser Met Ala Asp Ile Glu Lys Lys Ile Lys Glu Leu

    290                 295                 300

Ala Val Lys Gly Arg Asp Gly Lys Leu Thr Val Asp Asp Leu Thr Gly

305                 310                 315                 320

Gly Asn Phe Thr Ile Thr Asn Gly Gly Val Phe Gly Ser Leu Met Ser

                325                 330                 335

Thr Pro Ile Ile Asn Pro Pro Gln Ser Ala Ile Leu Gly Met His Ala

            340                 345                 350

Ile Lys Asp Arg Pro Met Ala Val Asn Gly Gln Val Val Ile Leu Pro

        355                 360                 365

Met Met Tyr Leu Ala Leu Ser Tyr Asp His Arg Leu Ile Asp Gly Arg

    370                 375                 380

Glu Ser Val Gly Tyr Leu Val Ala Val Lys Glu Met Leu Glu Asp Pro

385                 390                 395                 400

Ala Arg Leu Leu Leu Asp Val

                405

<210>5

<211>40

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>5

Met Asn Leu His Glu Tyr Gln Ala Lys Gln Leu Phe Ala Arg Tyr Gly

  1               5                  10                  15

Met Pro Ala Pro Thr Gly Tyr Ala Cys Thr Thr Pro Arg Glu Ala Glu

             20                  25                  30

Glu Ala Ala Ser Lys Ile Gly Ala

         35                  40

<210>6

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>6

gtcgacaata gccygaatct gttctggtcg                                       30

<210>7

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：引物

<400>7

aagcttatcg acgctcccct ccccaccgtt                                       30

<210>8

<211>16214

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：质粒RSFCPG

<400>8

gaattccgcc agaaccttca tcagcagcat aaacaggtgc agtgaacagc agagatacgg    60

ccagtgcggc caatgttttt tgtcctttaa acataacaga gtcctttaag gatatagaat   120

aggggtatag ctacgccaga atatcgtatt tgattattgc tagtttttag ttttgcttaa   180

aaaatattgt tagttttatt aaattggaaa actaaattat tggtatcatg aattgttgta   240

tgatgataaa tatagggggg atatgataga cgtcattttc atagggttat aaaatgcgac   300

taccatgaag tttttaattc aaagtattgg gttgctgata atttgagctg ttctattctt   360

tttaaatatc tatataggtc tgttaatgga ttttattttt acaagttttt tgtgtttagg   420

catataaaaa tcaagcccgc catatgaacg gcgggttaaa atatttacaa cttagcaatc   480

gaaccattaa cgcttgatat cgcttttaaa gtcgcgtttt tcatatcctg tatacagctg   540

acgcggacgg gcaatcttca taccgtcact gtgcatttcg ctccagtggg cgatccagcc   600

aacggtacgt gccattgcga aaatgacggt gaacatggaa gacggaatac ccatcgcttt   660

caggatgata ccagagtaga aatcgacgtt cgggtacagt ttcttctcga taaagtacgg   720

gtcgttcagc gcgatgtttt ccagctccat agccacttcc agcaggtcat ccttcgtgcc   780

cagctctttc agcacttcat ggcaggtttc acgcattacg gtggcgcgcg ggtcgtaatt   840

tttgtacacg cggtgaccga agcccatcag gcggaaagaa tcatttttgt ctttcgcacg   900

acgaaaaaat tccggaatgt gtttaacgga gctgatttct tccagcattt tcagcgccgc   960

ttcgttagca ccgccgtgcg caggtcccca cagtgaagca atacctgctg cgatacaggc  1020

aaacgggttc gcacccgaag agccagcggt acgcacggtg gaggtagagg cgttctgttc  1080

atggtcagcg tgcaggatca gaatacggtc catagcacgt tccagaatcg gattaacttc  1140

atacggttcg cacggcgtgg agaacatcat attcaggaag ttaccggcgt aggagagatc  1200

gttgcgcggg taaacaaatg gctgaccaat ggaatacttg taacacatcg cggccatggt  1260

cggcattttc gacagcaggc ggaacgcggc aatttcacgg tgacgaggat tgttaacatc  1320

cagcgagtcg tgatagaacg ccgccagcgc gccggtaata ccacacatga ctgccattgg  1380

atgcgagtcg cgacggaaag catggaacag acgggtaatc tgctcgtgga tcatggtatg  1440

acgggtcacc gtagttttaa attcgtcata ctgttcctga gtcggttttt caccattcag  1500

caggatgtaa caaacttcca ggtagttaga atcggtcgcc agctgatcga tcgggaaacc  1560

gcggtgcagc aaaatacctt catcaccatc aataaaagta attttagatt cgcaggatgc  1620

ggttgaagtg aagcctgggt caaaggtgaa cacacctttt gaaccgagag tacggatatc  1680

aataacatct tgacccagcg tgcctttcag cacatccagt tcaacagctg tatccccgtt  1740

gagggtgagt tttgcttttg tatcagccat ttaaggtctc cttagcgcct tattgcgtaa  1800

gactgccgga acttaaattt gccttcgcac atcaacctgg ctttacccgt tttttatttg  1860

gctcgccgct ctgtgaaaga ggggaaaacc tgggtacaga gctctgggcg cttgcaggta  1920

aaggatccat tgatgacgaa taaatggcga atcaagtact tagcaatccg aattattaaa  1980

cttgtctacc actaataact gtcccgaatg aattggtcaa tactccacac tgttacataa  2040

gttaatctta ggtgaaatac cgacttcata acttttacgc attatatgct tttcctggta  2100

atgtttgtaa caactttgtt gaatgattgt caaattagat gattaaaaat taaataaatg  2160

ttgttatcgt gacctggatc actgttcagg ataaaacccg acaaactata tgtaggttaa  2220

ttgtaatgat tttgtgaaca gcctatactg ccgccagtct ccggaacacc ctgcaatccc  2280

gagccaccca gcgttgtaac gtgtcgtttt cgcatctgga agcagtgttt tgcatgacgc  2340

gcagttatag aaaggacgct gtctgacccg caagcagacc ggaggaagga aatcccgacg  2400

tcggggatcc tctagagctt tagcgtctga ggttatcgca atttggttat gagattactc  2460

tcgttattaa tttgctttcc tgggtcattt ttttcttgct taccgtcaca ttcttgatgg  2520

tatagtcgaa aactgcaaaa gcacatgaca taaacaacat aagcacaatc gtattaatat  2580

ataagggttt tatatctatg gatcagacat attctctgga gtcattcctc aaccatgtcc  2640

aaaagcgcga cccgaatcaa accgagttcg cgcaagccgt tcgtgaagta atgaccacac  2700

tctggccttt tcttgaacaa aatccaaaat atcgccagat gtcattactg gagcgtctgg  2760

ttgaaccgga gcgcgtgatc cagtttcgcg tggtatgggt tgatgatcgc aaccagatac  2820

aggtcaaccg tgcatggcgt gtgcagttca gctctgccat cggcccgtac aaaggcggta  2880

tgcgcttcca tccgtcagtt aacctttcca ttctcaaatt cctcggcttt gaacaaacct  2940

tcaaaaatgc cctgactact ctgccgatgg gcggtggtaa aggcggcagc gatttcgatc  3000

cgaaaggaaa aagcgaaggt gaagtgatgc gtttttgcca ggcgctgatg actgaactgt  3060

atcgccacct gggcgcggat accgacgttc cggcaggtga tatcggggtt ggtggtcgtg  3120

aagtcggctt tatggcgggg atgatgaaaa agctctccaa caataccgcc tgcgtcttca  3180

ccggtaaggg cctttcattt ggcggcagtc ttattcgccc ggaagctacc ggctacggtc  3240

tggtttattt cacagaagca atgctaaaac gccacggtat gggttttgaa gggatgcgcg  3300

tttccgtttc tggctccggc aacgtcgccc agtacgctat cgaaaaagcg atggaatttg  3360

gtgctcgtgt gatcactgcg tcagactcca gcggcactgt agttgatgaa agcggattca  3420

cgaaagagaa actggcacgt cttatcgaaa tcaaagccag ccgcgatggt cgagtggcag  3480

attacgccaa agaatttggt ctggtctatc tcgaaggcca acagccgtgg tctctaccgg  3540

ttgatatcgc cctgccttgc gccacccaga atgaactgga tgttgacgcc gcgcatcagc  3600

ttatcgctaa tggcgttaaa gccgtcgccg aaggggcaaa tatgccgacc accatcgaag  3660

cgactgaact gttccagcag gcaggcgtac tatttgcacc gggtaaagcg gctaatgctg  3720

gtggcgtcgc tacatcgggc ctggaaatgc cacaaaacgc tgcgcgcctg ggctggaaag  3780

ccgagaaagt tgacgcacgt ttgcatcaca tcatgctgga tatccaccat gcctgtgttg  3840

agcatggtgg tgaaggtgag caaaccaact acgtgcaggg cgcgaacatt gccggttttg  3900

tgaaggttgc cgatgcgatg ctggcgcagg gtgtgattta agttgtaaat gcctgatggc  3960

gctacgctta tcaggcctac aaatgggcac aattcattgc agttacgctc taatgtaggc  4020

cgggcaagcg cagcgccccc ggcaaaattt caggcgttta tgagtattta acggatgatg  4080

ctccccacgg aacatttctt atgggccaac ggcatttctt actgtagtgc tcccaaaact  4140

gcttgtcgta acgataacac gcttcaagtt cagcatccgt taactttctg cggactcacg  4200

cgcgcagcac tatgccagta aagaaatccc atttgactat ttttttgata atcttcttcg  4260

ctttcgaaca actcgtgcgc ctttcgagaa gctagagtcg actcgccaat caccagcact  4320

aaagtgcgcg gttcgttacc cgattcatct ttgaaattag ccagtggcgg caaggcatta  4380

ttttcattca gtaactttgt tagcgagttt agttgctgac gatactgata atagccggtc  4440

aggaattgcc acggtgcggc aggctccata cgcgaggcca ggttatccaa cgttttctca  4500

aacggcttgt ttttgataaa cgtattcatg gcgatcggat gcagaatcaa gccataaagc  4560

agggcaaaag agacaacata acgccacggc tttggaatat agaccgggcg caggcgtgtc  4620

cacagcagaa ctgccaccgc cgtataggcc agcgcgataa gcacaatttt caggctgaaa  4680

tactggctta aatactcgct ggcttcgttg gtgttggttt cgaacatcac aaacagaacg  4740

ctctgcgaga actcctgacc gtagatgacg tagtagcaca gcgccgccag agaggccgcc  4800

catagcacca cgccgattac tgcggcaata attttaatcc gcttcggaaa gaggaatacc  4860

gggatcaacc acagcgaact gaataacagc gagtcgcgaa tgccgttagt gccactataa  4920

ccactgatgt aaataatggc ctgtagcaga gtagagaaaa accaaaagta gagcagtgcc  4980

caacccaggg ctttccagct aaaaagaggt ttagcctgga cttctgtgga atgcatagta  5040

agaacctgtc ttgaaaaaat atcgccgaat gtaacgacaa ttccttaagg atatctgaag  5100

gtatattcag aatttgaata aaatgcagac agaaatatat tgaaaacgag ggtgttagaa  5160

cagaagtatt tcagaaaacc ctcgcgcaaa agcacgaggg tttgcagaag aggaagatta  5220

gccggtatta cgcatacctg ccgcaatccc ggcaatagtg accattaacg cttgttcgac  5280

gcgaggatcc ggttcctggc cttctttttc tgcctggcgg gagcggtgca gcaactcggc  5340

ctgcaatacg ttcagcgggt cggtgtaaat attccgtagc tgaatagact ctgcaatcca  5400

cggcagatcg gccatcagat gggaatcgtt ggcaatcgcc agcaccactt tgatgtcttc  5460

ttcttgcagg ttgcgtaact ctttacctaa cggccacagt gctttgtcta ccaggcgttg  5520

gtcatagtat tccgccagcc acaggtctgc tttggcgaag accatctcca gcatgccgag  5580

acgcgtcgag aagaatggcc aatcgcggca catagcctcc agctcgctct gtttgccgtc  5640

ttcgaccact ttttgcagcg ccgtacctgc acccagccag gcggggagca tcagacggtt  5700

ttgcgtccag gcgaagatcc acggaatggc gcgtagtgac tcgacgccgc cggttgggcg  5760

acgtttcgcc ggacgtgaac ccaacggcag tttgcccagt tcttgttccg gcgtagcgga  5820

gcggaagtaa ggcacaaaat ctttgttttc acgtacgtag ccgcggtaga catcgcagga  5880

gatgactgac agttcatcca taatgcgacg ccagctctct ttcggctccg gcggtggcag  5940

caggttggct tccagaatcg ccccggtata aagcgacagg ctgctgacgg tgatttctgg  6000

cagaccatat ttaaagcgga tcatctcgcc ctgttcggtt acgcgcaggc cgcctttcag  6060

gcttcctggc ggttgtgaca gcagcgccgc atgagcaggt gcgccgccgc gaccaatgga  6120

accgccgcga ccgtggaaca acgtcagctc aatacccgct ttttcgcagg ttttgattaa  6180

tgcatcctgt gcctgatatt gcgcccagga agctgccatc actcccgcat cttttgctga  6240

gtcggaatag ccaatcatca ccatctgttt gccctgaatc aggccacgat accagtcaat  6300

attgagcagc tgggtcatga catcgttggc gttgttcaga tcatcgaggg tttcaaacag  6360

cggagcaacc ggcatcgcaa acccgatacc cgcttctttc agcagcaggt ggacagccag  6420

tacgtcggac ggcgttttcg ccatcgagat cacgtaggcg gcaatggagc cttgcggtgc  6480

ttcggcaatc acctggcagg tatcgagcac ttcgcgcgtt tcggcgcttg gttgccagtt  6540

gcgcggcaga agcggacgtt tggagttcag ttcgcggatc aggaacgcct gtttgtcggc  6600

ctctgaccag ctttcgtagt cgccgatacc gaggtagcgg gtcagctcgc ccagcgcttc  6660

ggtatgacgc gtgctctcct gacggatatc aatacggacc agcggtacgc cgaaacattt  6720

cacgcggcgc agggtgtcga gcagatcgcc gttggcgata atacccatgc cacacgcctg  6780

aagtgactgg tagcaagcgt agagcggttc ccacagttct tcgttttgtg tcagcaggcc  6840

ttctggtttt ggcagttctt cgcctttcag gcgcgcttcc agccatgcct gtgtcgccat  6900

caggcgagaa cgcaggtttt tcatcagata gcgatacggt tctgcggcac cttcttcgcc  6960

aaccagcgcc agcagttcag gggtcgcttc aaccatcgac agttcagaaa ccagcacctg  7020

aatatctttc aggaacaaat cggtggcttt ccagcggctg agtagcagga cgtggcgggt  7080

gatatcggca gtgacgttcg ggttgccgtc gcggtcgccg cccatccacg aagtaaaacg  7140

gaccggaaca aattcgacgg gcagtttgta gccgaggttc tcttccagtt gttcgttcag  7200

ttcgcgcagg taatttggta cgccttgcca caggctgttt tccactacgg caaagcccca  7260

tttggcttca tctaccgggc ttggacgcag cttacggatt tcatcggtat gccatgactg  7320

ggcgatcaac tggcgcaggc gacgcatcag ctggttgtgt tcgtagtcag cgatatcttt  7380

gttatcgagc tgttttaaac aggcgttcac ttccaccatt ttgtggatca gtgtacgacg  7440

ggtaatttcg gttgggtgag ccgtgaggac cagttccagc gacagcgatt ccactgcttt  7500

tttgatggtg tcttcgctca gttccggctg gtttttcagt ttacgcaggg tgcgggcgat  7560

cacttccggg ttgctggcag cttcgccttt cggcgaaatg ctgtggtatt gctcggcggt  7620

gttggccagg ttcaggaact gactaaacgc acgcgcaacg ggcagcagct cgtcgttcga  7680

caaattttgt aaggtggtga gcaactcctg gcggttagca tcattgccag cgcgtgaaga  7740

tttcgacaac ttacggatag tttctacgcg ttcaagaatg tgttctccca acgcatcctt  7800

gatggtttct cccagcactt tgccgagcat actgacatta ctacgcaatg cggaatattg  7860

ttcgttcata ttaccccaga caccccatct tatcgtttga tagccctgta tccttcacgt  7920

cgcattggcg cgaatatgct cgggctttgc ttttcgtcgt cttttataaa gccacgtaaa  7980

agcggtgacg tcaaatgctg cgaaatcgct tcagcaaacg aataaatagc aggaatttac  8040

gtcattaaat tcacgacgct ttaaataagc gtaacttatg gaaatgttaa aaaatcgccc  8100

caagtaacac caaaggtgta ggtcggataa gatgcgcaag tatcgcatcc gacattattg  8160

cggcactgga gtttggcaac agtgccggat gcggcgcgag cgccttatcc ggcctacagt  8220

tgggcatcgt ttgagtcact gtcggtcgga taagatgcgc aagtatcgca tccgacatta  8280

ttgcggcact ggagtttggc aacagtgccg gatgcggcgc gagcgcctta tccggcctac  8340

ggttgggcat cgtttgagtc actgtaggtc ggataagatg cgcaagcatc gcatccgaca  8400

ttattgcggc actggagttt ggcaacagcg ccggatgcgg cgcgagcgcc ttatccggcc  8460

tacgttttaa tgccagcaaa aatggtgaat tacctgggtt atcagttcgc gggtgggctt  8520

gataaaccgt gtttccagat attcatcagg ttgatgagcc tgattaattg agccaggccc  8580

caacaccagc gtcgggcata acgtttgaat aaacggcgct tcggtacagt agttcaccac  8640

ttcggttttt gctccgagca atttctcaac cacttcaacc agttgatgat tcggtgggca  8700

ttcatagcca gggatcggcg gatgcagctc gtcgacctgc aggagcagaa gagcatacat  8760

ctggaagcaa agccaggaaa gcggcctatg gagctgtgcg gcagcgctca gtaggcaatt  8820

tttcaaaata ttgttaagcc ttttctgagc atggtatttt tcatggtatt accaattagc  8880

aggaaaataa gccattgaat ataaaagata aaaatgtctt gtttacaata gagtgggggg  8940

ggtcagcctg ccgccttggg ccgggtgatg tcgtacttgc ccgccgcgaa ctcggttacc  9000

gtccagccca gcgcgaccag ctccggcaac gcctcgcgca cccgctggcg gcgcttgcgc  9060

atggtcgaac cactggcctc tgacggccag acatagccgc acaaggtatc tatggaagcc  9120

ttgccggttt tgccggggtc gatccagcca cacagccgct ggtgcagcag gcgggcggtt  9180

tcgctgtcca gcgcccgcac ctcgtccatg ctgatgcgca catgctggcc gccacccatg  9240

acggcctgcg cgatcaaggg gttcagggcc acgtacaggc gcccgtccgc ctcgtcgctg  9300

gcgtactccg acagcagccg aaacccctgc cgcttgcggc cattctgggc gatgatggat  9360

accttccaaa ggcgctcgat gcagtcctgt atgtgcttga gcgccccacc actatcgacc  9420

tctgccccga tttcctttgc cagcgcccga tagctacctt tgaccacatg gcattcagcg  9480

gtgacggcct cccacttggg ttccaggaac agccggagct gccgtccgcc ttcggtcttg  9540

ggttccgggc caagcactag gccattaggc ccagccatgg ccaccagccc ttgcaggatg  9600

cgcagatcat cagcgcccag cggctccggg ccgctgaact cgatccgctt gccgtcgccg  9660

tagtcatacg tcacgtccag cttgctgcgc ttgcgctcgc cccgcttgag ggcacggaac  9720

aggccggggg ccagacagtg cgccgggtcg tgccggacgt ggctgaggct gtgcttgttc  9780

ttaggcttca ccacggggca cccccttgct cttgcgctgc ctctccagca cggcgggctt  9840

gagcaccccg ccgtcatgcc gcctgaacca ccgatcagcg aacggtgcgc catagttggc  9900

cttgctcaca ccgaagcgga cgaagaaccg gcgctggtcg tcgtccacac cccattcctc  9960

ggcctcggcg ctggtcatgc tcgacaggta ggactgccag cggatgttat cgaccagtac 10020

cgagctgccc cggctggcct gctgctggtc gcctgcgccc atcatggccg cgcccttgct 10080

ggcatggtgc aggaacacga tagagcaccc ggtatcggcg gcgatggcct ccatgcgacc 10140

gatgacctgg gccatggggc cgctggcgtt ttcttcctcg atgtggaacc ggcgcagcgt 10200

gtccagcacc atcaggcggc ggccctcggc ggcgcgcttg aggccgtcga accactccgg 10260

ggccatgatg ttgggcaggc tgccgatcag cggctggatc agcaggccgt cagccacggc 10320

ttgccgttcc tcggcgctga ggtgcgcccc aagggcgtgc aggcggtgat gaatggcggt 10380

gggcgggtct tcggcgggca ggtagatcac cgggccggtg ggcagttcgc ccacctccag 10440

cagatccggc ccgcctgcaa tctgtgcggc cagttgcagg gccagcatgg atttaccggc 10500

accaccgggc gacaccagcg ccccgaccgt accggccacc atgttgggca aaacgtagtc 10560

cagcggtggc ggcgctgctg cgaacgcctc cagaatattg ataggcttat gggtagccat 10620

tgattgcctc ctttgcaggc agttggtggt taggcgctgg cggggtcact acccccgccc 10680

tgcgccgctc tgagttcttc caggcactcg cgcagcgcct cgtattcgtc gtcggtcagc 10740

cagaacttgc gctgacgcat ccctttggcc ttcatgcgct cggcatatcg cgcttggcgt 10800

acagcgtcag ggctggccag caggtcgccg gtctgcttgt ccttttggtc tttcatatca 10860

gtcaccgaga aacttgccgg ggccgaaagg cttgtcttcg cggaacaagg acaaggtgca 10920

gccgtcaagg ttaaggctgg ccatatcagc gactgaaaag cggccagcct cggccttgtt 10980

tgacgtataa ccaaagccac cgggcaacca atagcccttg tcacttttga tcaggtagac 11040

cgaccctgaa gcgctttttt cgtattccat aaaaccccct tctgtgcgtg agtactcata 11100

gtataacagg cgtgagtacc aacgcaagca ctacatgctg aaatctggcc cgcccctgtc 11160

catgcctcgc tggcggggtg ccggtgcccg tgccagctcg gcccgcgcaa gctggacgct 11220

gggcagaccc atgaccttgc tgacggtgcg ctcgatgtaa tccgcttcgt ggccgggctt 11280

gcgctctgcc agcgctgggc tggcctcggc catggccttg ccgatttcct cggcactgcg 11340

gccccggctg gccagcttct gcgcggcgat aaagtcgcac ttgctgaggt catcaccgaa 11400

gcgcttgacc agcccggcca tctcgctgcg gtactcgtcc agcgccgtgc gccggtggcg 11460

gctaagctgc cgctcgggca gttcgaggct ggccagcctg cgggccttct cctgctgccg 11520

ctgggcctgc tcgatctgct ggccagcctg ctgcaccagc gccgggccag cggtggcggt 11580

cttgcccttg gattcacgca gcagcaccca cggctgataa ccggcgcggg tggtgtgctt 11640

gtccttgcgg ttggtgaagc ccgccaagcg gccatagtgg cggctgtcgg cgctggccgg 11700

gtcggcgtcg tactcgctgg ccagcgtccg ggcaatctgc ccccgaagtt caccgcctgc 11760

ggcgtcggcc accttgaccc atgcctgata gttcttcggg ctggtttcca ctaccagggc 11820

aggctcccgg ccctcggctt tcatgtcatc caggtcaaac tcgctgaggt cgtccaccag 11880

caccagacca tgccgctcct gctcggcggg cctgatatac acgtcattgc cctgggcatt 11940

catccgcttg agccatggcg tgttctggag cacttcggcg gctgaccatt cccggttcat 12000

catctggccg gtggtggcgt ccctgacgcc gatatcgaag cgctcacagc ccatggcctt 12060

gagctgtcgg cctatggcct gcaaagtcct gtcgttcttc atcgggccac caagcgcagc 12120

cagatcgagc cgtcctcggt tgtcagtggc gtcaggtcga gcaagagcaa cgatgcgatc 12180

agcagcacca ccgtaggcat catggaagcc agcatcacgg ttagccatag cttccagtgc 12240

cacccccgcg acgcgctccg ggcgctctgc gcggcgctgc tcacctcggc ggctacctcc 12300

cgcaactctt tggccagctc cacccatgcc gcccctgtct ggcgctgggc tttcagccac 12360

tccgccgcct gcgcctcgct ggcctgctgg gtctggctca tgacctgccg ggcttcgtcg 12420

gccagtgtcg ccatgctctg ggccagcggt tcgatctgct ccgctaactc gttgatgcct 12480

ctggatttct tcactctgtc gattgcgttc atggtctatt gcctcccggt attcctgtaa 12540

gtcgatgatc tgggcgttgg cggtgtcgat gttcagggcc acgtctgccc ggtcggtgcg 12600

gatgccccgg ccttccatct ccaccacgtt cggccccagg tgaacaccgg gcaggcgctc 12660

gatgccctgc gcctcaagtg ttctgtggtc aatgcgggcg tcgtggccag cccgctctaa 12720

tgcccggttg gcatggtcgg cccatgcctc gcgggtctgc tcaagccatg ccttgggctt 12780

gagcgcttcg gtcttctgtg ccccgccctt ctccggggtc ttgccgttgt accgcttgaa 12840

ccactgagcg gcgggccgct cgatgccgtc attgatccgc tcggagatca tcaggtggca 12900

gtgcgggttc tcgccgccac cggcatggat ggccagcgta tacggcaggc gctcggcacc 12960

ggtcaggtgc tgggcgaact cggacgccag cgccttctgc tggtcgaggg tcagctcgac 13020

cggcagggca aattcgacct ccttgaacag ccgcccattg gcgcgttcat acaggtcggc 13080

agcatcccag tagtcggcgg gccgctcgac gaactccggc atgtgcccgg attcggcgtg 13140

caagacttca tccatgtcgc gggcatactt gccttcgcgc tggatgtagt cggccttggc 13200

cctggccgat tggccgcccg acctgctgcc ggttttcgcc gtaaggtgat aaatcgccat 13260

gctgcctcgc tgttgctttt gcttttcggc tccatgcaat ggccctcgga gagcgcaccg 13320

cccgaagggt ggccgttagg ccagtttctc gaagagaaac cggtaagtgc gccctcccct 13380

acaaagtagg gtcgggattg ccgccgctgt gcctccatga tagcctacga gacagcacat 13440

taacaatggg gtgtcaagat ggttaagggg agcaacaagg cggcggatcg gctggccaag 13500

ctcgaagaac aacgagcgcg aatcaatgcc gaaattcagc gggtgcgggc aagggaacag 13560

cagcaagagc gcaagaacga aacaaggcgc aaggtgctgg tgggggccat gattttggcc 13620

aaggtgaaca gcagcgagtg gccggaggat cggctcatgg cggcaatgga tgcgtacctt 13680

gaacgcgacc acgaccgcgc cttgttcggt ctgccgccac gccagaagga tgagccgggc 13740

tgaatgatcg accgagacag gccctgcggg gctgcacacg cgcccccacc cttcgggtag 13800

ggggaaaggc cgctaaagcg gctaaaagcg ctccagcgta tttctgcggg gtttggtgtg 13860

gggtttagcg ggctttgccc gcctttcccc ctgccgcgca gcggtggggc ggtgtgtagc 13920

ctagcgcagc gaatagacca gctatccggc ctctggccgg gcatattggg caagggcagc 13980

agcgccccac aagggcgctg ataaccgcgc ctagtggatt attcttagat aatcatggat 14040

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acagttattg caggggttcg tgacagttat tgcagggggg cgtgacagtt attgcagggg 14160

ttcgtgacag ttagtacggg agtgacgggc actggctggc aatgtctagc aacggcaggc 14220

atttcggctg agggtaaaag aactttccgc taagcgatag actgtatgta aacacagtat 14280

tgcaaggacg cggaacatgc ctcatgtggc ggccaggacg gccagccggg atcgggatac 14340

tggtcgttac cagagccacc gacccgagca aacccttctc tatcagatcg ttgacgagta 14400

ttacccggca ttcgctgcgc ttatggcaga gcagggaaag gaattgccgg gctatgtgca 14460

acgggaattt gaagaatttc tccaatgcgg gcggctggag catggctttc tacgggttcg 14520

ctgcgagtct tgccacgccg agcacctggt cgctttcagc tgtaagcgtc gcggtttctg 14580

cccgagctgt ggggcgcggc ggatggccga aagtgccgcc ttgctggttg atgaagtact 14640

gcctgaacaa cccatgcgtc agtgggtgtt gagcttcccg tttcagctgc gtttcctgtt 14700

tggggtcgtt tgcgggaagg ggcggaatcc tacgctaagg ctttggccag cgatattctc 14760

cggtgagatt gatgtgttcc caggggatag gagaagtcgc ttgatatcta gtatgacgtc 14820

tgtcgcacct gcttgatcgc ggcccaaggg ttggtttgcg cattcacagt tctccgcaag 14880

aattgattgg ctccaattct tggagtggtg aatccgttag cgaggtgccg ccggcttcca 14940

ttcaggtcga ggtggcccgg ctccatgcac cgcgacgcaa cgcggggagg cagacaaggt 15000

atagggcggc gcctacaatc catgccaacc cgttccatgt gctcgccgag gcggcataaa 15060

tcgccgtgac gatcagcggt ccagtgatcg aagttaggct ggtaagagcc gcgagcgatc 15120

cttgaagctg tccctgatgg tcgtcatcta cctgcctgga cagcatggcc tgcaacgcgg 15180

gcatcccgat gccgccggaa gcgagaagaa tcataatggg gaaggccatc cagcctcgcg 15240

tcgcgaacgc cagcaagacg tagcccagcg cgtcggccgc catgccggcg ataatggcct 15300

gcttctcgcc gaaacgtttg gtggcgggac cagtgacgaa ggcttgagcg agggcgtgca 15360

agattccgaa taccgcaagc gacaggccga tcatcgtcgc gctccagcga aagcggtcct 15420

cgccgaaaat gacccagagc gctgccggca cctgtcctac gagttgcatg ataaagaaga 15480

cagtcataag tgcggcgacg atagtcatgc cccgcgccca ccggaaggag ctgactgggt 15540

tgaaggctct caagggcatc ggtcgacgct ctcccttatg cgactcctgc attaggaagc 15600

agcccagtag taggttgagg ccgttgagca ccgccgccgc aaggaatggt gcatgcaagg 15660

agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac catacccacg ccgaaacaag 15720

cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc ggtgatgtcg gcgatatagg 15780

cgccagcaac cgcacctgtg gcgccggtga tgccggccac gatgcgtccg gcgtagagga 15840

tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat agtggctcca agtagcgaag 15900

cgagcaggac tgggcggcgg ccaaagcggt cggacagtgc tccgagaacg ggtgcgcata 15960

gaaattgcat caacgcatat agcgctagca gcacgccata gtgactggcg atgctgtcgg 16020

aatggacgat atcccgcaag aggcccggca gtaccggcat aaccaagcct atgcctacag 16080

catccagggt gacggtgccg aggatgacga tgagcgcatt gttagatttc atacacggtg 16140

cctgactgcg ttagcaattt aactgtgata aactaccgca ttaaagctta tcgatgataa 16200

gctgtcaaac atga                                                   16214

<210>9

<211>427

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>9

Met Ala Asp Thr Lys Ala Lys Leu Thr Leu Asn Gly Asp Thr Ala Val

  1               5                  10                  15

Glu Leu Asp Val Leu Lys Gly Thr Leu Gly Gln Asp Val Ile Asp Ile

             20                  25                  30

Arg Thr Leu Gly Ser Lys Gly Val Phe Thr Phe Asp Pro Gly Phe Thr

         35                  40                  45

Ser Thr Ala Ser Cys Glu Ser Lys Ile Thr Phe Ile Asp Gly Asp Glu

     50                  55                  60

Gly Ile Leu Leu His Arg Gly Phe Pro Ile Asp Gln Leu Ala Thr Asp

 65                  70                  75                  80

Ser Asn Tyr Leu Glu Val Cys Tyr Ile Leu Leu Asn Gly Glu Lys Pro

                 85                  90                  95

Thr Gln Glu Gln Tyr Asp Glu Phe Lys Thr Thr Val Thr Arg His Thr

            100                 105                 110

Met Ile His Glu Gln Ile Thr Arg Leu Phe His Ala Phe Arg Arg Asp

        115                 120                 125

Ser His Pro Met Ala Val Met Cys Gly Ile Thr Gly Ala Leu Ala Ala

    130                 135                 140

Phe Tyr His Asp Ser Leu Asp Val Asn Asn Pro Arg His Arg Glu Ile

145                 150                 155                 160

Ala Ala Phe Arg Leu Leu Ser Lys Met Pro Thr Met Ala Ala Met Cys

                165                 170                 175

Tyr Lys Tyr Ser Ile Gly Gln Pro Phe Val Tyr Pro Arg Asn Asp Leu

            180                 185                 190

Ser Tyr Ala Gly Asn Phe Leu Asn Met Met Phe Ser Thr Pro Cys Glu

        195                 200                 205

Pro Tyr Glu Val Asn Pro Ile Leu Glu Arg Ala Met Asp Arg Ile Leu

    210                 215                 220

Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln Asn Ala Ser Thr Ser Thr Val Arg

225                 230                 235                 240

Thr Ala Gly Ser Ser Gly Ala Asn Pro Phe Ala Cys Ile Ala Ala Gly

                245                 250                 255

Ile Ala Ser Leu Trp Gly Pro Ala His Gly Gly Ala Asn Glu Ala Ala

            260                 265                 270

Leu Lys Met Leu Glu Glu Ile Ser Ser ValLys His Ile Pro Glu Phe

        275                 280                285

Phe Arg Arg Ala Lys Asp Lys Asn Asp Ser Phe Arg Leu Met Gly Phe

    290                 295                 300

Gly His Arg Val Tyr Lys Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Thr Val Met Arg

305                 310                 315                 320

Glu Thr Cys His Glu Val Leu Lys Glu Leu Gly Thr Lys Asp Asp Leu

                325                 330             335

Leu Glu Val Ala Met Glu Leu Glu Asn Ile Ala Leu Asn Asp Pro Tyr

            340                 345                 350

Phe Ile Glu Lys Lys Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Ser Gly Ile

        355                 360                 365

Ile Leu Lys Ala Met Gly Ile Pro Ser Ser Met Phe Thr Val Ile Phe

    370                 375                 380

Ala Met Ala Arg Thr Val Gly Trp Ile Ala His Trp Ser Glu Met His

385                 390                 395                 400

Ser Asp Gly Met Lys Ile Ala Arg Pro Arg Gln Leu Tyr Thr Gly Tyr

                405                 410                 415

Glu Lys Arg Asp Phe Lys Ser Asp Ile Lys Arg

            420                 425

<210>10

<211>447

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>10

Met Asp Gln Thr Tyr Ser Leu Glu Ser Phe Leu Asn His Val Gln Lys

  1               5                  10                  15

Arg Asp Pro Asn Gln Thr Glu Phe Ala Gln Ala Val Arg Glu Val Met

             20                  25                  30

Thr Thr Leu Trp Pro Phe Leu Glu Gln Asn Pro Lys Tyr Arg Gln Met

         35                  40                  45

Ser Leu Leu Glu Arg Leu Val Glu Pro Glu Arg Val Ile Gln Phe Arg

     50                  55                  60

Val Val Trp Val Asp Asp Arg Asn Gln Ile Gln Val Asn Arg Ala Trp

 65                  70                  75                  80

Arg Val Gln Phe Ser Ser Ala Ile Gly Pro Tyr Lys Gly Gly Met Arg

                 85                  90                  95

Phe His Pro Ser Val Asn Leu Ser Ile Leu Lys Phe Leu Gly Phe Glu

            100                 105                 110

Gln Thr Phe Lys Asn Ala Leu Thr Thr Leu Pro Met Gly Gly Gly Lys

        115                 120                 125

Gly Gly Ser Asp Phe Asp Pro Lys Gly Lys Ser Glu Gly Glu Val Met

    130                 135                 140

Arg Phe Cys Gln Ala Leu Met Thr Glu Leu Tyr Arg His Leu Gly Ala

145                 150                 155                 160

Asp Thr Asp Val Pro Ala Gly Asp Ile Gly Val Gly Gly Arg Glu Val

                165                 170                 175

Gly Phe Met Ala Gly Met Met Lys Lys Leu Ser Asn Asn Thr Ala Cys

            180                 185                 190

Val Phe Thr Gly Lys Gly Leu Ser Phe Gly Gly Ser Leu Ile Arg Pro

        195                 200                 205

Glu Ala Thr Gly Tyr Gly Leu Val Tyr Phe Thr Glu Ala Met Leu Lys

    210                 215                 220

Arg His Gly Met Gly Phe Glu Gly Met Arg Val Ser Val Ser Gly Ser

225                 230                 235                 240

Gly Asn Val Ala Gln Tyr Ala Ile Glu Lys Ala Met Glu Phe Gly Ala

                245                 250                 255

Arg Val Ile Thr Ala Ser Asp Ser Ser Gly Thr Val Val Asp Glu Ser

            260                 265                 270

Gly Phe Thr Lys Glu Lys Leu Ala Arg Leu Ile Glu Ile Lys Ala Ser

        275                 280                 285

Arg Asp Gly Arg Val Ala Asp Tyr Ala Lys Glu Phe Gly Leu Val Tyr

    290                 295                 300

Leu Glu Gly Gln Gln Pro Trp Ser Leu Pro Val Asp Ile Ala Leu Pro

305                 310                 315                 320

Cys Ala Thr Gln Asn Glu Leu Asp Val Asp Ala Ala His Gln Leu Ile

                325                 330                 335

Ala Asn Gly Val Lys Ala Val Ala Glu Gly Ala Asn Met Pro Thr Thr

            340                 345                 350

Ile Glu Ala Thr Glu Leu Phe Gln Gln Ala Gly Val Leu Phe Ala Pro

        355                 360                 365

Gly Lys Ala Ala Asn Ala Gly Gly Val Ala Thr Ser Gly Leu Glu Met

    370                 375                 380

Pro Gln Asn Ala Ala Arg Leu Gly Trp Lys Ala Glu Lys Val Asp Ala

385                 390                 395                 400

Arg Leu His His Ile Met Leu Asp Ile His His Ala Cys Val Glu His

                405                 410                 415

Gly Gly Glu Gly Glu Gln Thr Asn Tyr Val Gln Gly Ala Asn Ile Ala

            420                 425                 430

Gly Phe Val Lys Val Ala Asp Ala Met Leu Ala Gln Gly Val Ile

        435                 440                 445

<210>11

<211>883

<212>PRT

<213>Pantoea ananatis

<400>11

Met Asn Glu Gln Tyr Ser Ala Leu Arg Ser Asn Val Ser Met Leu Gly

  1               5                  10                  15

Lys Val Leu Gly Glu Thr Ile Lys Asp Ala Leu Gly Glu His Ile Leu

             20                  25                  30

Glu Arg Val Glu Thr Ile Arg Lys Leu Ser Lys Ser Ser Arg Ala Gly

         35                  40                  45

Asn Asp Ala Asn Arg Gln Glu Leu Leu Thr Thr Leu Gln Asn Leu Ser

     50                  55                  60

Asn Asp Glu Leu Leu Pro Val Ala Arg Ala Phe Ser Gln Phe Leu Asn

 65                  70                  75                  80

Leu Ala Asn Thr Ala Glu Gln Tyr His Ser Ile Ser Pro Lys Gly Glu

                 85                  90                  95

Ala Ala Ser Asn Pro Glu Val Ile Ala Arg Thr Leu Arg Lys Leu Lys

            100                 105                 110

Asn Gln Pro Glu Leu Ser Glu Asp Thr Ile Lys Lys Ala Val Glu Ser

        115                 120                 125

Leu Ser Leu Glu Leu Val Leu Thr Ala His Pro Thr Glu Ile Thr Arg

    130                 135                 140

Arg Thr Leu Ile His Lys Met Val Glu Val Asn Ala Cys Leu Lys Gln

145                 150                 155                 160

Leu Asp Asn Lys Asp Ile Ala Asp Tyr Glu His Asn Gln Leu Met Arg

                165                 170                 175

Arg Leu Arg Gln Leu Ile Ala Gln Ser Trp His Thr Asp Glu Ile Arg

            180                 185                 190

Lys Leu Arg Pro Ser Pro Val Asp Glu Ala Lys Trp Gly Phe Ala Val

        195                 200                 205

Val Glu Asn Ser Leu Trp Gln Gly Val Pro Asn Tyr Leu Arg Glu Leu

    210                 215                 220

Asn Glu Gln Leu Glu Glu Asn Leu Gly Tyr Lys Leu Pro Val Glu Phe

225                 230                 235                 240

Val Pro Val Arg Phe Thr Ser Trp Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn

                245                 250                 255

Pro Asn Val Thr Ala Asp Ile Thr Arg His Val Leu Leu Leu Ser Arg

            260                 265                 270

Trp Lys Ala Thr Asp Leu Phe Leu Lys Asp Ile Gln Val Leu Val Ser

        275                 280                 285

Glu Leu Ser Met Val Glu Ala Thr Pro Glu Leu Leu Ala Leu Val Gly

    290                 295                 300

Glu Glu Gly Ala Ala Glu Pro Tyr Arg Tyr Leu Met Lys Asn Leu Arg

305                 310                 315                 320

Ser Arg Leu Met Ala Thr Gln Ala Trp Leu Glu Ala Arg Leu Lys Gly

                325                 330                 335

Glu Glu Leu Pro Lys Pro Glu Gly Leu Leu Thr Gln Ash Glu Glu Leu

            340                 345                 350

Trp Glu Pro Leu Tyr Ala Cys Tyr Gln Ser Leu Gln Ala Cys Gly Met

        355                 360                 365

Gly Ile Ile Ala Asn Gly Asp Leu Leu Asp Thr Leu Arg Arg Val Lys

    370                 375                 380

Cys Phe Gly Val Pro Leu Val Arg Ile Asp Ile Arg Gln Glu Ser Thr

385                 390                 395                 400

Arg His Thr Glu Ala Leu Gly Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Gly Ile Gly

                405                 410                 415

Asp Tyr Glu Ser Trp Ser Glu Ala Asp Lys Gln Ala Phe Leu Ile Arg

            420                 425                 430

Glu Leu Asn Ser Lys Arg Pro Leu Leu Pro Arg Asn Trp Gln Pro Ser

        435                 440                 445

Ala Glu Thr Arg Glu Val Leu Asp Thr Cys Gln Val Ile Ala Glu Ala

    450                 455                 460

Pro Gln Gly Ser Ile Ala Ala Tyr Val Ile Ser Met Ala Lys Thr Pro

465                 470                 475                 480

Ser Asp Val Leu Ala Val His Leu Leu Leu Lys Glu Ala Gly Ile Gly

                485                 490                 495

Phe Ala Met Pro Val Ala Pro Leu Phe Glu Thr Leu Asp Asp Leu Asn

            500                 505                 510

Asn Ala Asn Asp Val Met Thr Gln Leu Leu Asn Ile Asp Trp Tyr Arg

        515                 520                 525

Gly Leu Ile Gln Gly Lys Gln Met Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser

    530                  535                540

Ala Lys Asp Ala Gly Val Met Ala Ala Ser Trp Ala Gln Tyr Gln Ala

545                 550                 555                 560

Gln Asp Ala Leu Ile Lys Thr Cys Glu Lys Ala Gly Ile Glu Leu Thr

                565                 570                 575

Leu Phe His Gly Arg Gly Gly Ser Ile Gly Arg Gly Gly Ala Pro Ala

            580                 585                 590

His Ala Ala Leu Leu Ser Gln Pro Pro Gly Ser Leu Lys Gly Gly Leu

        595                 600                 605

Arg Val Thr Glu Gln Gly Glu Met Ile Arg Phe Lys Tyr Gly Leu Pro

    610                 615                 620

Glu Ile Thr Val Ser Ser Leu Ser Leu Tyr Thr Gly Ala Ile Leu Glu

625                 630                 635                 640

Ala Asn Leu Leu Pro Pro Pro Glu Pro Lys Glu Ser Trp Arg Arg Ile

                645                 650                 655

Met Asp Glu Leu Ser Val Ile Ser Cys Asp Val Tyr Arg Gly Tyr Val

            660                 665                 670

Arg Glu Asn Lys Asp Phe Val Pro Tyr Phe Arg Ser Ala Thr Pro Glu

        675                 680                 685

Gln Glu Leu Gly Lys Leu Pro Leu Gly Ser Arg Pro Ala Lys Arg Arg

    690                 695                 700

Pro Thr Gly Gly Val Glu Ser Leu Arg Ala Ile Pro Trp Ile Phe Ala

705                 710                 715                 720

Trp Thr Gln Asn Arg Leu Met Leu Pro Ala Trp Leu Gly Ala Gly Thr

                725                 730                 735

Ala Leu Gln Lys Val Val Glu Asp Gly Lys Gln Ser Glu Leu Glu Ala

            740                 745                 750

Met Cys Arg Asp Trp Pro Phe Phe Ser Thr Arg Leu Gly Met Leu Glu

        755                 760                 765

Met Val Phe Ala Lys Ala Asp Leu Trp Leu Ala Glu Tyr Tyr Asp Gln

    770                 775                 780

Arg Leu Val Asp Lys Ala Leu Trp Pro Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn

785                 790                 795                 800

Leu Gln Glu Glu Asp Ile Lys Val Val Leu Ala Ile Ala Asn Asp Ser

                805                 810                 815

His Leu Met Ala Asp Leu Pro Trp Ile Ala Glu Ser Ile Gln Leu Arg

            820                 825                 830

Asn Ile Tyr Thr Asp Pro Leu Asn Val Leu Gln Ala Glu Leu Leu His

        835                 840                 845

Arg Ser Arg Gln Ala Glu Lys Glu Gly Gln Glu Pro Asp Pro Arg Val

    850                 855                 860

Glu Gln Ala Leu Met Val Thr Ile Ala Gly Ile Ala Ala Gly Met Arg

865                 870                 875                 880

Asn Thr Gly

<210>12

<211>6035

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>人工序列描述：质粒pSTVCB

<220>

<221>CDS

<222>(2129)..(3439)

<400>12

cgtatggcaa tgaaagacgg tgagctggtg atatgggata gtgttcaccc ttgttacacc 60

gttttccatg agcaaactga aacgttttca tcgctctgga gtgaatacca cgacgatttc 120

cggcagtttc tacacatata ttcgcaagat gtggcgtgtt acggtgaaaa cctggcctat 180

ttccctaaag ggtttattga gaatatgttt ttcgtctcag ccaatccctg ggtgagtttc 240

accagttttg atttaaacgt ggccaatatg gacaacttct tcgcccccgt tttcaccatg 300

ggcaaatatt atacgcaagg cgacaaggtg ctgatgccgc tggcgattca ggttcatcat 360

gccgtctgtg atggcttcca tgtcggcaga atgcttaatg aattacaaca gtactgcgat 420

gagtggcagg gcggggcgta atttttttaa ggcagttatt ggtgccctta aacgcctggt 480

gctacgcctg aataagtgat aataagcgga tgaatggcag aaattcgaaa gcaaattcga 540

cccggtcgtc ggttcagggc agggtcgtta aatagccgct tatgtctatt gctggtttac 600

cggtttattg actaccggaa gcagtgtgac cgtgtgcttc tcaaatgcct gaggccagtt 660

tgctcaggct ctccccgtgg aggtaataat tgacgatatg atcatttatt ctgcctccca 720

gagcctgata aaaacggtta gcgcttcgtt aatacagatg taggtgttcc acagggtagc 780

cagcagcatc ctgcgatgca gatccggaac ataatggtgc agggcgcttg tttcggcgtg 840

ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg ctgccggcac ctgtcctacg 900

agttgcatga taaagaagac agtcataagt gcggcgacga tagtcatgcc ccgcgcccac 960

cggaaggagc taccggacag cggtgcggac tgttgtaact cagaataaga aatgaggccg 1020

ctcatggcgt tccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca 1080

gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga 1140

gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt 1200

gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca 1260

agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccgtcga caatagcctg aatctgttct 1320

ggtcgaacct tggaaggtcc gcagccgaaa cggccgtcgc cagggatgaa ctcagagggc 1380

agggtgggga agtcggtcat gtcttcgggc aactttctgc gcttggaagt aaaagggcca 1440

gggatcgtta acgatctgac ccaacaacta taaccctgaa gctgtcagtt cctagcaccc 1500

tagattcttc acgcagtctc ccaaacgatg aaaaacgccc aaaactggcg acaccgaact 1560

attgaaaacg cgggggttag ttgaccagcc accaatttgg gggtagttca aagttttgca 1620

aagttttcaa tttctaggtt gttaatatcc cctgaggttg cgttataggg tggcgaattg 1680

catggggaaa gctactcggc acccatcctt gtcgcgtgca tcacaaactt tgctaaactg 1740

tgtaccagtc cacttattgt gggattttta atgccttaaa ggccagcatt ttcaccctct 1800

agcggggttg aatgctggcc ttgagggtgc agaactaaat agcagcacat cggcacaatt 1860

gatctgagtt ctattggcgt gaccgtggct actgattacg gtggctgtgg gtggtcggga 1920

atgatgtaac caacgtgatt gtgggggaat tggctctcac ttcggatatg gctaaaccgc 1980

atttatcggt atagcgtgtt aaccggacca gattgggaaa gaaatgtgtc gagtaacaaa 2040

aactgacatg cgcttggcgc atcccagttg gtaagaataa acgggactac ttccgtaatc 2100

cggaagagtt tttttccgaa caaat atg ttt gaa agg gat atc gtg gct act   2152

                            Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr

                              1               5

gat aac aac aag gct gtc ctg cac tac ccc ggt ggc gag ttc gaa atg   2200

Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met

 10                  15                  20                  25

gac atc atc gag gct tct gag ggt aac aac ggt gtt gtc ctg ggc aag   2248

Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys

                 30                  35                  40

atg ctg tct gag act gga ctg atc act ttt gac cca ggt tat gtg agc   2296

Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser

             45                  50                  55

act ggc tcc acc gag tcg aag atc acc tac atc gat ggc gat gcg gga   2344

Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly

         60                  65                  70

atc ctg cgt tac cgc ggc tat gac atc gct gat ctg gct gag aat gcc   2392

Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala

     75                  80                  85

acc ttc aac gag gtt tct tac cta ctt atc aac ggt gag cta cca acc   2440

Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr

 90                  95                 100                 105

cca gat gag ctt cac aag ttt aac gac gag att cgc cac cac acc ctt   2488

Pro Asp Glu Leu His Lys Phe Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu

                110                 115                 120

ctg gac gag gac ttc aag tcc cag ttc aac gtg ttc cca cgc gac gct   2536

Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala

            125                 130                 135

cac cca atg gca acc ttg gct tcc tcg gtt aac att ttg tct acc tac   2584

His Pro Met Ala Thr Leu Ala Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr

        140                 145                 150

tac cag gat cag ctg aac cca ctc gat gag gca cag ctt gat aag gca   2632

Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala

    155                 160                 165

acc gtt cgc ctc atg gca aag gtt cca atg ctg gct gcg tac gca cac   2680

Thr Val Arg Leu Met Ala Lys Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His

170                 175                 180                 185

cgc gca cgc aag ggt gct cct tac atg tac cca gac aac tcc ctc aac   2728

Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn

                190                 195                 200

gcg cgt gag aac ttc ctg cgc atg atg ttc ggt tac cca acc gag cca   2776

Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro

            205                 210                 215

tac gag atc gac cca atc atg gtc aag gct ctg gac aag ctg ctc atc   2824

Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile

        220                 225                 230

ctg cac gct gac cac gag cag aac tgc tcc acc tcc acc gtt cgt atg   2872

Leu His Ala Asp His Glu Gln Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met

    235                 240                 245

atc ggt tcc gca cag gcc aac atg ttt gtc tcc atc gct ggt ggc atc   2920

Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile

250                 255                 260                 265

aac gct ctg tcc ggc cca ctg cac ggt ggc gca aac cag gct gtt ctg   2968

Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu

                270                 275                 280

gag atg ctc gaa gac atc aag aac aac cac ggt ggc gac gca acc gcg   3016

Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala

            285                 290                 295

ttc atg aac aag gtc aag aac aag gaa gac ggc gtc cgc ctc atg ggc   3064

Phe Met Asn Lys Val Lys Asn Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly

        300                305                 310

ttc gga cac cgc gtt tac aag aac tac gat cca cgt gca gca atc gtc   3112

Phe Gly His Arg Val Tyr Lys Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val

    315                 320                 325

aag gag acc gca cac gag atc ctc gag cac ctc ggt ggc gac gat ctt   3160

Lys Glu Thr Ala His Glu Ile Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu

330                 335                 340                 345

ctg gat ctg gca atc aag ctg gaa gaa att gca ctg gct gat gat tac   3208

Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr

                350                 355                 360

ttc atc tcc cgc aag ctc tac ccg aac gta gac ttc tac acc ggc ctg   3256

Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu

            365                 370                 375

atc tac cgc gca atg ggc ttc cca act gac ttc ttc acc gta ttg ttc   3304

Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe

        380                 385                 390

gca atc ggt cgt ctg cca gga tgg atc gct cac tac cgc gag cag ctc   3352

Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu

    395                 400                 405

ggt gca gca ggc aac aag atc aac cgc cca cgc cag gtc tac acc ggc   3400

Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly

410                 415                 420                 425

aag gaa tcc cgc aag ttg gtt cct cgc gag gag cgc taaatttagc        3446

Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val Pro Arg Glu Glu Arg

                430                 435

ggatgattct cgttcaactt cggccgaagc cacttcgtct gtcataatga cagggatggt 3506

ttcggccgtt tttgcatgaa accaaaaaat acgattttca aggagcatgt acagcacatg 3566

gaaaagccac agattgagct accggtcggt ccagcaccgg aagatctcgt aatctctgac 3626

atcatcgttg gcgaaggcgc agaagcccgc ccaggcggag aagttgaggt ccactatgtg 3686

ggcgttgacc ttgaaaccgg cgaggagttt gactcttcct gggatcgtgg acagaccagc 3746

cagttcccac tcaacggcct cattgcaggt tggcaagaag gaattccagg catgaaggtc 3806

ggcggacgtc gtcagctgac cattccgcca gaggctgctt acggccctga gggttccggc 3866

cacccactgt ctggccgtac cctggtgttc atcatcgatt tgatcagcgc ataattttct 3926

ttactgcgct aaacgctcaa atcgtgtgaa gcgactgtcg cgtcctgccc tctccggatt 3986

gttatccaat tcggagaggg cgttgctgat tgtgccgaga atttcttcaa caaagtgctc 4046

ggtttcggcg acgatcccgt cgataagccc ttggcttaaa agtgcgtgcg cctgcacgcc 4106

ttgtcgctct atgatttccg cggcgtggtt ggtgtcgcgg aagaggatgg ccgaggcgcc 4166

ctctggaggc aatgcggaca gccacgcgtt ttcggccgcg tagaccagat cggcgggcag 4226

catggccagc gcgccaccgc caacgccctg accaataatg accgaaacgg tggggagggg 4286

agcgtcgata agcttgcatg cctgcaggtc gactctagag gatccccggg taccgagctc 4346

gaattcactg gccgtcgttt tacaacgtcg tgactgggaa aaccctggcg ttacccaact 4406

taatcgcctt gcagcacatc cccctttcgc cagctggcgt aatagcgaag aggcccgcac 4466

cgatcgccct tcccaacagt tgcgcagcct gaatggcgaa tgagcttatc gatgataagc 4526

tgtcaaacat gagaattaca acttatatcg tatggggctg acttcaggtg ctacatttga 4586

agagataaat tgcactgaaa tctagaaata ttttatctga ttaataagat gatcttcttg 4646

agatcgtttt ggtctgcgcg taatctcttg ctctgaaaac gaaaaaaccg ccttgcaggg 4706

cggtttttcg aaggttctct gagctaccaa ctctttgaac cgaggtaact ggcttggagg 4766

agcgcagtca ccaaaacttg tcctttcagt ttagccttaa ccggcgcatg acttcaagac 4826

taactcctct aaatcaatta ccagtggctg ctgccagtgg tgcttttgca tgtctttccg 4886

ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcggactga acggggggtt 4946

cgtgcataca gtccagcttg gagcgaactg cctacccgga actgagtgtc aggcgtggaa 5006

tgagacaaac gcggccataa cagcggaatg acaccggtaa accgaaaggc aggaacagga 5066

gagcgcacga gggagccgcc aggggaaacg cctggtatct ttatagtcct gtcgggtttc 5126

gccaccactg atttgagcgt cagatttcgt gatgcttgtc aggggggcgg agcctatgga 5186

aaaacggctt tgccgcggcc ctctcacttc cctgttaagt atcttcctgg catcttccag 5246

gaaatctccg ccccgttcgt aagccatttc cgctcgccgc agtcgaacga ccgagcgtag 5306

cgagtcagtg agcgaggaag cggaatatat cctgtatcac atattctgct gacgcaccgg 5366

tgcagccttt tttctcctgc cacatgaagc acttcactga caccctcatc agtgccaaca 5426

tagtaagcca gtatacactc cgctagcgct gatgtccggc ggtgcttttg ccgttacgca 5486

ccaccccgtc agtagctgaa caggagggac agctgataga aacagaagcc actggagcac 5546

ctcaaaaaca ccatcataca ctaaatcagt aagttggcag catcacccga cgcactttgc 5606

gccgaataaa tacctgtgac ggaagatcac ttcgcagaat aaataaatcc tggtgtccct 5666

gttgataccg ggaagccctg ggccaacttt tggcgaaaat gagacgttga tcggcacgta 5726

agaggttcca actttcacca taatgaaata agatcactac cgggcgtatt ttttgagtta 5786

tcgagatttt caggagctaa ggaagctaaa atggagaaaa aaatcactgg atataccacc 5846

gttgatatat cccaatggca tcgtaaagaa cattttgagg catttcagtc agttgctcaa 5906

tgtacctata accagaccgt tcagctggat attacggcct ttttaaagac cgtaaagaaa 5966

aataagcaca agttttatcc ggcctttatt cacattcttg cccgcctgat gaatgctcat 6026

ccggaattt                                                         6035

<210>13

<211>437

<212>PRT

<213>Brevibacterium lactofermentum

<400>13

Met Phe Glu Arg Asp Ile Val Ala Thr Asp Asn Asn Lys Ala Val Leu

  1               5                  10                  15

His Tyr Pro Gly Gly Glu Phe Glu Met Asp Ile Ile Glu Ala Ser Glu

                 20              25                  30

Gly Asn Asn Gly Val Val Leu Gly Lys Met Leu Ser Glu Thr Gly Leu

         35                  40                  45

Ile Thr Phe Asp Pro Gly Tyr Val Ser Thr Gly Ser Thr Glu Ser Lys

     50                  55                  60

Ile Thr Tyr Ile Asp Gly Asp Ala Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr

 65                  70                  75                  80

Asp Ile Ala Asp Leu Ala Glu Asn Ala Thr Phe Asn Glu Val Ser Tyr

                 85                  90                  95

Leu Leu Ile Asn Gly Glu Leu Pro Thr Pro Asp Glu Leu His Lys Phe

            100                 105                 110

Asn Asp Glu Ile Arg His His Thr Leu Leu Asp Glu Asp Phe Lys Ser

        115                 120                 125

Gln Phe Asn Val Phe Pro Arg Asp Ala His Pro Met Ala Thr Leu Ala

    130                 135                 140

Ser Ser Val Asn Ile Leu Ser Thr Tyr Tyr Gln Asp Gln Leu Asn Pro

145                 150                 155                 160

Leu Asp Glu Ala Gln Leu Asp Lys Ala Thr Val Arg Leu Met Ala Lys

                165                 170                 175

Val Pro Met Leu Ala Ala Tyr Ala His Arg Ala Arg Lys Gly Ala Pro

            180                 185                 190

Tyr Met Tyr Pro Asp Asn Ser Leu Asn Ala Arg Glu Asn Phe Leu Arg

        195                 200                 205

Met Met Phe Gly Tyr Pro Thr Glu Pro Tyr Glu Ile Asp Pro Ile Met

    210                 215                 220

Val Lys Ala Leu Asp Lys Leu Leu Ile Leu His Ala Asp His Glu Gln

225                 230                 235                 240

Asn Cys Ser Thr Ser Thr Val Arg Met Ile Gly Ser Ala Gln Ala Asn

                245                 250                 255

Met Phe Val Ser Ile Ala Gly Gly Ile Asn Ala Leu Ser Gly Pro Leu

             260                265                 270

His Gly Gly Ala Asn Gln Ala Val Leu Glu Met Leu Glu Asp Ile Lys

        275                 280                 285

Asn Asn His Gly Gly Asp Ala Thr Ala Phe Met Asn Lys Val Lys Asn

    290                 295                 300

Lys Glu Asp Gly Val Arg Leu Met Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys

305                 310                 315                 320

Asn Tyr Asp Pro Arg Ala Ala Ile Val Lys Glu Thr Ala His Glu Ile

                325                 330                 335

Leu Glu His Leu Gly Gly Asp Asp Leu Leu Asp Leu Ala Ile Lys Leu

            340                 345                 350

Glu Glu Ile Ala Leu Ala Asp Asp Tyr Phe Ile Ser Arg Lys Leu Tyr

        355                 360                 365

Pro Asn Val Asp Phe Tyr Thr Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe

    370                 375                 380

Pro Thr Asp Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Ile Gly Arg Leu Pro Gly

385                 390                 395                 400

Trp Ile Ala His Tyr Arg Glu Gln Leu Gly Ala Ala Gly Asn Lys Ile

                405                 410                 415

Asn Arg Pro Arg Gln Val Tyr Thr Gly Lys Glu Ser Arg Lys Leu Val

            420                 425                 430

Pro Arg Glu Glu Arg

        435

Claims (4)

1.一种发酵生产L-谷氨酸的方法，它包括培养一种微生物，该微生物能在含有饱和浓度的L-谷氨酸和碳源的液体培养基中在特定的pH值下代谢碳源，并具备在具有所述pH的液体培养基中积累L-谷氨酸的能力，其中L-谷氨酸的量超过了pH被控制以使L-谷氨酸沉淀的培养基中L-谷氨酸的所述饱和浓度所对应的量，所述液体培养基还含有泛酸，以使得在沉淀L-谷氨酸的同时引起L-谷氨酸的积累。

2.如权利要求1所述的方法，其中的微生物属于泛菌属。

3.如权利要求2所述的方法，其中的微生物是Pantoeaananatis。

4.如权利要求1-3中任一权利要求所述的方法，其中培养基中的泛酸是一种泛酸盐，且该盐的浓度是1mg/L或更高。

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