CN100428932C - TGF-α表达抑制剂 - Google Patents

Abstract

含有聚异戊二烯基羧酸(比如3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸)等聚异戊二烯类化合物作为有效成分的TGF-α表达抑制剂，以及肝炎和/或肝硬化细胞的转化抑制剂，可以用作在肝脏中癌的发病、复发(二次发病)或恶性化的抑制剂。

Description

TGF-α表达抑制剂

技术领域

本发明涉及以聚异戊二烯类化合物为有效成分的转化生长因子-α(transforming growth factor-α；TGF-α：下面在本说明书中有时也记为“TGF-α”)表达抑制剂，还涉及由该表达抑制剂得到的肝炎细胞或肝硬化细胞的转化抑制剂，以及肝癌发生、复发(二次发癌)或恶性化抑制剂。

背景技术

在平成11年，由恶性肿瘤而死亡的人数为29万6千人，占死因的第一位，其中由肝癌死亡的人数超过3万人。这个数字每年还在增加，在此20年间增加了3倍。在日本，发生肝癌的主要原因，90％以上是由于乙型肝炎病毒(HBV：下面在本说明书中有时也记为“HBV”)或丙型肝炎病毒(HCV：下面在本说明书中有时也记为“HCV”)的持续感染(慢性肝炎)。而肝癌在治疗以后，据认为每年有大约20～25％会复发(二次发癌)，是一种预后不良的疾病。因此，在早期发现和早期治疗肝癌的同时，作为今后的重要课题，可以举出是要抑制由慢性肝炎引起肝癌，并且抑制肝癌在治疗以后的复发。

转化生长因子-α(TGF-α)被认为是与肝癌发病与肝癌细胞的恶性化(助长/进展)有密切的关系的生长因子。有报道说，在肝中发现的TGF-α的水平与病毒性肝炎炎症的严重程度有关，而在由肝炎病毒引起的肝硬化当中，发现TGF-α过剩与肝炎病毒的复制有关。实际上，已经确认，在由于感染HBV和HCV而引起慢性肝炎患者的肝组织里，TGF-α的表达要高于健康的正常人，而在肝癌患者的肝组织和癌周围的非癌组织中，也发现了高度的TGF-α表达，这就意味着在由于感染肝炎病毒引发的肝癌的发病和发展的过程中，TGF-α有可能起着极为重要的作用。

经过实验已经确认，鼠肝细胞的转化与TGF-α的表达亢进有关，在由致肝癌化学物质和肝炎病毒引起转化的肝细胞中，TGF-α有高水平的表达。而在TGF-α表达过度的转基因鼠中，在以高的发病率自然发生肝癌的同时，据认为在这些鼠中，由于化学致癌物质和癌的遗传因子使肝癌的发病产生急剧的恶化。

因此，由于TGF-α与肝癌发病和肝癌细胞的恶性化有着密切的关系，因此提出了将TGF-α作为目标的新的肝癌治疗战略。

慢性病毒性肝炎患者的正确的肝癌发病机理还不明了，但已经指出，肝的卵圆细胞(oval cell：下面，在本说明书中，有时记为oval cell)有可能起着重要的作用。这就是说，在慢性肝炎或肝硬化的患者当中见到卵圆细胞的增殖，确认了在肝病变加重的过程中，卵圆细胞的数目增多。这意味着，肝炎病毒提高了在肝中引起慢性肝炎的卵圆细胞的分裂增殖活性，而肝炎病毒同时也对卵圆细胞具有致癌的抑制剂的作用。由此，意味着由肝炎病毒而受到抑制的卵圆细胞，使得由于慢性炎症导致的分裂增殖活性亢进(助长)，致使癌化(癌症发病)的机理。

在许多使用动物的化学致肝癌实验中，报道了肝癌来源于脱分化的肝细胞，另一方面，指出了由于肝癌细胞的表现型和卵圆细胞相类似，以卵圆细胞作为发生源致使肝癌是有可能的。

有许多报告谈到了卵圆细胞和TGF-α的关连。TGF-α是促进卵圆细胞细胞分裂的物质(分裂素)，卵圆细胞自身和在周围的肝组织中产生的TGF-α，通过作为其受体的上皮增殖因子(epidermal growth factor receptor；EGFR)刺激卵圆细胞增殖。而由于对于人类已经确认，在病毒性肝炎中已经明确认识的卵圆细胞，在作为肝炎病毒感染的目标细胞的同时，还伴随着TGF-α表达的亢进，肝炎病毒在发癌的初期阶段起作用(抑制)，TGF-α在其后则作为促进剂，认为卵圆细胞自身有转变为肝癌细胞的可能性。

如此，可认为在卵圆细胞中有病毒存在和TGF-α表达的相互作用，是导致卵圆细胞癌化的重要因素。同时，在卵圆细胞周围的肝炎/肝硬化组织中发现的过剩TGF-α，对通过受体促进卵圆细胞的癌化也有很高的可能性。由此，在病毒性肝炎中所见到的卵圆细胞内TGF-α表达变低的同时，在肝炎/肝硬化组织中的TGF-α的表达受到抑制，与作为肝癌先驱细胞的卵圆细胞被沉寂下来的而控制肝癌的发病是有关的，据认为这是极为重要的机理。

如上所述，TGF-α与肝炎和肝硬化细胞的转化，以及在肝脏中致癌和肝癌细胞的恶化有着密切的关系，对在肝脏中的肝组织细胞和卵圆细胞中处于过度表达状态的TGF-α进行抑制，与抑制肝炎个肝硬化细胞的转化，以及抑制肝脏中致癌和肝癌细胞的恶性化有联系的可能性是很大的。

作为聚异戊二烯类化合物之一的(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸(开发号“NIK-333”)，显示出对视黄酸结合蛋白和视黄酸受体的亲和性，以及在肝癌细胞中的分化诱导作用和死亡诱导作用都是已知的。在临床上，由于NIK-333通过一年的给药有意义地抑制了肝癌根治治疗以后的复发，所以可以确认具有抑制肝癌复发的作用。特别是，在上述给药的过程中，几乎看不到对肝脏功能的损害和其它在类视黄酸中可见的副作用，是一种安全的药物(引用文献：N.Eng.J.Med.334，1561～1567(1996))。

已有报告说，聚异戊二烯类化合物抑制株化肝癌细胞的TGF-α表达(引用文献：Biochem.Biophys.Res.Commun.219，100～104(1996))。但是，在生体肝组织中，聚异戊二烯类化合物抑制通过给予化学致肝癌物质引起的在肝组织中表达亢进的TGF-α，以及抑制在被认为是肝癌前体细胞的卵圆细胞中的TGF-α表达都是未知的。

发明内容

因此，本发明的目的是通过抑制TGF-α的表达提供肝炎和/或肝硬化细胞的转化抑制剂，以及在肝脏中致癌的抑制剂和癌恶性化抑制剂等。

本发明人重复进行了对于发现肝炎和/或肝硬化细胞的转化抑制剂(肝炎或肝硬化恶性化抑制剂)，以及在肝脏中致癌的抑制剂和癌恶性化抑制剂所应该进行的各种研究。结果发现，聚异戊二烯类化合物，抑制了由化学致肝癌物质转化的肝组织细胞中TGF-α的表达，特别是抑制了在强烈地表现出有可能作为肝癌前体细胞的卵圆细胞中的TGF-α表达，至此完成了本发明。

这就是说，本发明涉及以聚异戊二烯类化合物作为有效成分的TGF-α表达抑制剂，还涉及含有以聚异戊二烯类化合物作为有效成分的肝炎和/或肝硬化细胞转化抑制剂(肝炎或肝硬化的恶性化抑制剂)。特别是，本发明涉及由含有聚异戊二烯类化合物作为有效成分的，通过抑制TGF-α表达的肝炎细胞或肝硬化细胞的转化抑制剂，以及肝癌的发病、复发(二次发癌)或恶性化的抑制剂。

从另外的观点出发，为了制造上述药品而使用聚异戊二烯类化合物，是通过抑制包括人类在内的哺乳类动物中的TGF-α的表达，来抑制肝炎细胞或肝硬化细胞转化的方法，并且是通过抑制TGF-α的表达，来抑制在肝脏中致癌或癌细胞恶性化的方法，由本发明提供了包括对包括人类在内的哺乳类动物给予有效量的聚异戊二烯类化合物工序的方法，而且是抑制肝炎细胞或肝硬化细胞转化的方法，是抑制在肝脏中癌的发病、复发或恶性化的方法，提供了给有必要抑制的包括人类在内的哺乳类动物给予有效量的聚异戊二烯类化合物工序的方法。

附图说明

图1表示未处置动物肝组织的照片。完全辨别不出表示TGF-α阳性的卵圆细胞表达。

图2是在对照组(只给予化学致肝癌物质3’-MeDAB)的肝组织中表达的卵圆细胞，表示出在细胞质内有强的TGF-α阳性所见(浓褐色的染色部分表示TGF-α的表达)的照片。

图3是由3’-MeDAB表达的卵圆细胞，通过给予80mg/kg/d的NIK-333呈现TGF-α的弱阳性(显示出浓褐色的染色部分比图2要小)，表示TGF-α的表达被降低的照片。

图4表示未处置的动物肝组织的照片。几乎无法辨认出TGF-α的表达。

图5是表示在对照组(只给予致肝癌化学物质DEN)的非肿瘤部分肝组织中TGF-α表达的照片。在中心静脉周围的肝组织中辨认出很强的TGF-α所见(浓褐色的染色部分表示TGF-α表达)。

图6是表示由DEN而在中心静脉周围的肝组织中表达的TGF-α，通过给予80mg/kg/d的NIK-333而大致转阴的图像(表示几乎见不到浓褐色的染色部分)的照片。

图7表示未处置动物肝组织的照片，几乎见不到TGF-α的表达。

图8是表示在通过给予DEN形成对照组的非肿瘤部分肝组织中的TGF-α表达的照片。辨认出在中心静脉周围的肝组织中有强的TGF-α所见(浓褐色的染色部分表示TGF-α的表达)。

图9是表示由DEN而在中心静脉周围的肝组织中表达的TGF-α，通过给予80mg/kg/d的NIK-333而大致转阴的图像(几乎见不到浓褐色的染色部分)的照片。

图10表示未处置动物的肝组织的照片。辨认不出显示TGF-α阳性的卵圆细胞表达。

图11是表示通过给予3’-MeDAB而在对照组的肝组织中表达的卵圆细胞，在细胞质内显示出强的TGF-α阳性所见的图像(浓褐色的染色部分表示TGF-α表达)。

图12是表示由3’-MeDAB表达的TGF-α强阳性卵圆细胞数，通过给予80mg/kg/d的NIK-333而被减少的图像(显示出染成浓褐色的细胞数比图11要少)的照片。

图13表示未处置动物的肝组织的照片。不能辨认出显示出明显的TGF-α阳性所见的细胞。

图14是表示通过给予D-半乳糖胺而在对照组的肝组织中表达的卵圆细胞，在细胞质内显示出很强的TGF-α阳性所见的图像(浓褐色的染色部分表示TGF-α的表达)的照片；

图15是表示由D-半乳糖胺而表达的卵圆细胞，通过给予200mg/kg/d的NIK-333而呈现出TGF-α弱阳性的图像(表示出浓褐色的染色部分比图14更少)的照片。表示TGF-α的表达被降低。

具体实施方式

作为在本发明中使用的聚异戊二烯类化合物，可以举出是聚异戊二烯羧酸的3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸、香叶基香叶酸(GGA：geranylgeranoic acid)、植烷酸(phytanic acid)等，还可以举出聚异戊二烯基羧酸酯、维生素K1、维生素K2等。作为优选的化合物，可以举出聚异戊二烯基羧酸，特别是3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸，作为最优选的化合物，可以举出(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸(NIK-333)。

在本发明中使用的聚异戊二烯类化合物，可以由公知的方法(日本专利昭63-32,058，J.Chem.Soc.(C)，2154页，1966年)合成。

本发明的TGF-α表达抑制剂，通常能够配制成含有聚异戊二烯类化合物的药物组合物，通过经口或非经口的任何一种适当的方法给药。作为适合于经口给药的药物组合物的形态，可以举出比如锭剂、颗粒剂、胶囊剂、软胶囊剂、丸剂、散剂、液体制剂等，作为适合于非经口给药的药物组合物的形态，可以举出比如注射剂、栓剂等。这些药物组合物，可以使用聚异戊二烯类化合物或其可药用的盐和一种或两种以上的通常的制剂载体，通过通常的方法来配制。

比如，在适合于经口给药的情况下，作为制剂的载体，能够使用乳糖、葡萄糖、玉米淀粉、蔗糖等赋形剂、羧甲基纤维素钙、羟丙基纤维素等崩解剂、硬脂酸钙、硬脂酸镁、滑石粉、聚乙二醇、硬化油等润滑剂、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯醇、明胶、阿拉伯树胶等粘合剂、甘油、乙二醇等润湿剂、以及根据需要的表面活性剂、矫味剂等配制成希望的药物组合物。

而在适合于非经口给药的情况下，作为制剂载体，可以使用水、乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、植物油、琼脂等稀释剂，根据需要使用助溶剂、悬浮剂、乳化剂、稳定剂、缓冲剂、表面张力匀化剂、防腐剂、止痛剂等。

本发明的TGF-α表达抑制剂的给药量没有特别的限定，但在比如成人每天经口给药的情况下，一般为50～1,200mg，优选300～900mg，在非经口给药的情况下，每天为1～1,200mg，优选5～900mg。每天将上述给药量分成1～3次给药，能够期待所需的抑制效果。

实施例

下面举出实施例更详细地说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。在以下的实施例中，作为聚异戊二烯类化合物，使用的是(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸(在下面称为NIK-333)。

实施例1

对于小鼠，由化学致肝癌的物质3’-甲基-4-二甲基氨基偶氮苯(3’-Methyl-4-dimethylaminoazobenzene：3’-MeDAB)，诱发TGF-α阳性的卵圆细胞效果。

动物使用了Fischer系的雄性小鼠(F344/N Slc，6周)，将在固体饲料中以0.06％的比例配制化学致肝癌物质3’-MeDAB的饲料喂养4周，诱发出卵圆细胞。将NIK-333悬浮在油中，以80mg/kg的用量与3’-MeDAB一起经口喂养4周(1次/日)。而对照组是经口给药大豆油(5mg/kg)。在开始给予3’-MeDAB4周以后，在麻醉下摘除肝脏，在用10％的甲醛固定以后进行石蜡包埋，使用抗TGF-α抗体进行免疫组织染色，在显微镜下观察TGF-α表达的程度。

图1～图3是对给予3’-MeDAB 4周诱发的TGF-α阳性卵圆细胞，在以80mg/kg/d给予NIK-3334周的情况下，表示抑制效果的照片(由抗TGF-α抗体进行的免疫组织学染色)。在同时进行的其它动物中也进行同样的观察。

图1表示未处置动物的肝组织。完全没有观察到显示TGF-α阳性的卵圆细胞表达。

图2表示在对照组(只施用3’-MeDAB)的肝组织中发现的卵圆细胞中细胞质内强的TGF-α阳性。

图3表示由3’-MeDAB表达的卵圆细胞，而通过给予80mg/kg/d的NIK-333，使TGF-α呈现弱阳性，表示TGF-α的表达降低。

在与上述同样的实验中的其它部位进行照像，得到如在图10～图12中所示的结果。

图10表示未处置动物的肝组织。没有观察到显示TGF-α阳性的卵圆细胞表达。

图11表示通过给予3’-MeDAB在对照组的肝组织中表达的卵圆细胞中的细胞质内显示出强的TGF-α阳性。

图12表示通过给予80mg/kg/d的NIK-333，使由3’-MeDAB表达的TGF-α阳性的卵圆细胞数减少。

实施例2

对于小鼠，在给予化学致肝癌物质N-亚硝基二乙胺(N-Nitrosodiethyl-amine：DEN)后，在非肿瘤部分的肝组织中对TGF-α表达的效果

动物使用Fischer系雄性小鼠(F344/N Slc，6周)，将化学致肝癌物质DEN投入饮水中(浓度40ppm)5周，其后的15周用通常的饮水喂养诱发肝细胞癌。将NIK悬浮在大豆油中，以80mg/kg的用量，在给予DEN结束1周后经口给予14周(1次/日)。在对照组中经口给予大豆油(5mL/kg)。在开始给予DEN以后的20周，在麻醉下摘除肝脏，用10％的甲醛固定以后，进行石蜡包埋。使用抗TGF-α抗体进行免疫组织染色，在显微镜下观察TGF-α表达的程度。

图4～图6是表示在用DEN处理5周以后停止给药1周，接着给予80mg/kg/d的NIK-333，在给药14周的情况下，对于在非肿瘤部位肝组织中的TGF-α表达的抑制效果的照片(由抗TGF-α抗体进行免疫组织染色)。在同时进行的其它动物中，也得到同样的观察结果。

图4表示未处置动物的肝组织。几乎辨认不出TGF-α的表达。

图5表示在对照组(只给予DEN)的非肿瘤部位肝组织中的TGF-α表达。在中心静脉周围的肝组织中辨认出强的TGF-α阳性的观察结果。

图6表示通过DEN在中心静脉周围的肝组织中表达的TGF-α，由于给予80mg/kg/d的NIK-333而大致转阴。

在与上述相同的实验中进行其它部位的照像，得到如在图7～图9中所示的结果。

图7表示未处置动物的肝组织。几乎辨认不出TGF-α的表达。

图8表示在由给予DEN造成的对照组的非肿瘤部位肝组织中的TGF-α表达。在中心静脉周围的肝组织中辨认出强的TGF-α阳性所见。

图9表示通过给予80mg/kg/d的NIK，使由于DEN而在中心静脉周围的肝组织中表达的TGF-α大致转阴。

实施例3

对于小鼠，对由于D-半乳糖胺盐酸盐诱发的卵圆细胞中TGF-α表达的效果

动物使用的是SD系雄性小鼠(Crj/CD  (SD)，6周)，以5mL/kg的量向腹腔内给予一次在生理食盐水中配制的200mg/mL D-半乳糖胺，诱发卵圆细胞。在大豆油中悬浮NIK-333，以200mg/kg的用量经口给药1～6天。而在对照组中是经口给药大豆油(2mL/kg)。从开始给药的次日到第7天，在不同时间在麻醉下摘除肝脏，用10％的甲醛固定后进行石蜡包埋，使用抗TGF-α抗体进行免疫组织染色，在显微镜下观察TGF-α表达的程度。

图13～图15是对一次给予D-半乳糖胺盐酸盐诱发的卵圆细胞中TGF-α表达，以200mg/kg/d的用量给药4天NIK-333情况下抑制效果的照片(由抗TGF-α抗体进行免疫组织染色)。在同时进行的其它动物中也得到同样的的观察结果。

图13表示未处置动物的肝组织。没有辨认出显示明确TGF-α阳性的细胞。

图14表示在由于D-半乳糖胺盐酸盐造成的对照组的肝组织中表达的卵圆细胞中，在细胞质内辨认出强的TGF-α阳性的结果。

图15表示对于由D-半乳糖胺盐酸盐表达的卵圆细胞，通过给予200mg/kg/d的NIK-333而呈现TGF-α弱阳性，使TGF-α表达降低的结果。

产业上利用的可能性

由于聚异戊二烯类化合物抑制了与肝炎细胞或肝硬化细胞转化，或者在肝脏中致癌或使癌细胞恶性化有关的TGF-α，能够用作肝炎或肝硬化细胞的转化抑制剂，比如作为肝炎细胞或肝硬化恶性化的抑制剂，以及用作在肝脏中癌的发病、复发(二次发病)或恶性化的抑制剂。

Claims (4)

1、含有聚异戊二烯类化合物的TGF-α表达抑制剂在制造抑制非肿瘤部肝组织细胞转化药物中的应用。

2、根据权利要求1所述的TGF-α表达抑制剂在制造抑制非肿瘤部肝组织细胞转化药物中的应用，其中，聚异戊二烯类化合物是聚异戊二烯基羧酸。

3、根据权利要求2所述的TGF-α表达抑制剂在制造抑制非肿瘤部肝组织细胞转化药物中的应用，其中，聚异戊二烯基羧酸是3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸。

4、根据权利要求2所述的TGF-α表达抑制剂在制造抑制非肿瘤部肝组织细胞转化药物中的应用，其中，聚异戊二烯基羧酸是(2E，4E，6E，10E)-3，7，11，15-四甲基-2，4，6，10，14-十六碳戊烯酸。

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