CN109996550A

CN109996550A - 非酒精性脂肪肝炎治疗剂和非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒

Info

Publication number: CN109996550A
Application number: CN201780072942.2A
Authority: CN
Inventors: 仓田隼人
Original assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Rohto Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2016-12-22
Filing date: 2017-11-21
Publication date: 2019-07-09
Also published as: JPWO2018116732A1; WO2018116732A1

Abstract

本发明的目的在于提供目前尚未确立有效的药物疗法的NASH的新型治疗剂。本发明为含有间充质干细胞的非酒精性脂肪肝炎(Non‑alcoholic steatohepatitis；NASH)治疗剂。上述间充质干细胞优选为异体来源，并且优选为脂肪组织来源。

Description

非酒精性脂肪肝炎治疗剂和非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒

技术领域

本发明涉及非酒精性脂肪肝炎治疗剂和非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒。

背景技术

非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis、以下也称为“NASH”)是非酗酒者表现出类似于酒精性肝炎的组织学观察，是在肝组织中伴随脂肪沉积观察到炎症和纤维化的进行性肝疾病。一直以来作为原因尚不明确的肝硬化的原因之一，近些年上述NASH受到注目。根据2008年日本肝脏学会总会所进行的肝硬化的全国统计，与1998年的统计相比，存在起因于NASH的肝硬化的增加的担心(非专利文献1和2)。对于该NASH，目前尚未确立有效的药物疗法，但可认为与肥胖、血脂异常、糖尿病等生活方式病、高胰岛素血症、起因于肿瘤坏死因子α(TNFα：tumor necrosis factorα)等细胞因子、铁沉积等的氧化应激等的发病相关，成为治疗的目标。

作为用于NASH的研究的非人模型动物，一直以来已知有瘦蛋白受体缺陷小鼠(非专利文献3)、肝细胞特异性Pten缺陷小鼠(非专利文献4)和视黄酸受体α的显性抑制基因修饰小鼠(非专利文献5)等单基因修饰小鼠。然而，人的NASH并不是如这些基因修饰小鼠那样因单基因突变而使发病状态加剧，因此这些基因修饰小鼠不能反映出人的NASH的临床症状。另外，还已知有通过让小鼠等啮齿类摄取不含蛋氨酸/胆碱的食物(MCD)(非专利文献6和7)、不含胆碱的L-氨基酸规定饲料(CDAA)(非专利文献8)等特殊的食饵而制得的NASH的非人模型动物，但由于观察到体重的降低、血中脂质的降低等而无法反映出人的NASH的临床症状。因此，在进行新型治疗剂的开发时，即使可在这种传统的非人模型动物中观察到改善NASH样症状的效果，也难以说它对人的NASH是有效的。

专利文献1中公开了：通过使用以胰岛素抗药性作为遗传背景使II型糖尿病自然发病的KK-Ay小鼠，对其喂食新型的不含胆碱/L-氨基酸规定饲料(N-CDAA)，从而成功地制作了显示出与人同样的临床症状的NASH的模型小鼠。在该模型小鼠中观察到脂质向肝脏蓄积的异常(脂肪肝)、肝脏的纤维化和基于血液参数的慢性肝炎图像，特别是可观察到在现有的NASH模型动物中未报告的体重的增加、血清甘油三酯的增加和血清总胆固醇的增加。另外，在该模型小鼠中还可观察到与人同样的，病状的缓慢加剧。

另一方面，间充质干细胞是由Friedenstein(1982)首次从骨髓分离的具有多分化能力的前体细胞(非专利文献9)。已经明确了该间充质干细胞存在于骨髓、脐带、脂肪等各种各样的组织中，间充质干细胞移植有望成为针对各种难治性疾病的新型治疗方法(专利文献2和3)。最近，已知存在具有与脂肪组织、胎盘、脐带、卵膜等胎儿附属物的基质细胞同等功能的细胞。因此，有时也将间充质干细胞称为基质细胞(Mesenchymal Stromal Cell)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2012-80830号公报

专利文献2：日本特开2012-157263号公报

专利文献3：日本特表2012-508733号公报

非专利文献

非专利文献1：标准消化器病学，医学书院株式会社，2006年4月1日发行，pp.426-431(《標準消化器病学，株式会社医学書院，2006年4月1日発行，pp.426－431》)

非专利文献2：日本内科学会杂志，(《日本内科学会雑誌》)2010,99(9)，pp.203-209

非专利文献3：Sahai A.et al.,Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol.,2004,287:G1035-G1043

非专利文献4：Horie Y.et al.,J.Clin.Invest.,2004,113(12),pp.1774-1783

非专利文献5：Yanagitani A.et al.,Hepatology,2004,40(2),pp.366-375

非专利文献6：Rinella M.E.et al.,Journal of Hepatology,2004,40,pp.47-51

非专利文献7：Wang B.et al.,Hepatology,2009,50(4),pp.1152-1161

非专利文献8：Sakaida I.et al.,Journal of Hepatology,2003,38,pp.762-769

非专利文献9：Pittenger F.M.et al.,Science,1999,284,pp.143-147

发明内容

发明要解决的问题

在上述那样的情况下，本发明的目的在于提供目前尚未确立有效的药物疗法的NASH的新型治疗剂。

用于解决问题的方案

为了解决上述课题，本发明人等使用显示出与人同样的临床症状的NASH的模型小鼠，对间充质干细胞的治疗效果进行了研究。其结果发现含有间充质干细胞的治疗剂对于NASH的治疗是极其有效的。即，本发明的主旨如下所述。

[1]一种非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis：NASH)治疗剂，其含有间充质干细胞。

[2]根据[1]所述的非酒精性脂肪肝炎治疗剂，其中，间充质干细胞为异体来源。

[3]根据[1]或[2]所述的非酒精性脂肪肝炎治疗剂，其中，间充质干细胞为脂肪组织来源。

[4]一种非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒，其包含：[1]～[3]中任一项所述的非酒精性脂肪肝炎治疗剂、容器和标签。

发明的效果

根据本发明，能够提供NASH的新型治疗剂和NASH的新型治疗用试剂盒。

附图说明

图1是示出通过4次给药包含间充质干细胞的非酒精性脂肪肝炎治疗剂得到的NASH治疗效果(HYP量的减少效果)的图。

图2是示出通过2次给药包含间充质干细胞的非酒精性脂肪肝炎治疗剂得到的NASH治疗效果(HYP量的减少效果)的图。

图3是示出通过1次给药包含间充质干细胞的非酒精性脂肪肝炎治疗剂得到的NASH治疗效果(HYP量的减少效果)的图。

图4是示出通过1次给药包含间充质干细胞的非酒精性脂肪肝炎治疗剂得到的NASH治疗效果(纤维化的抑制效果)的图。

具体实施方式

对本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂和非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒进行详细说明。

＜非酒精性脂肪肝炎治疗剂＞

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂含有间充质干细胞。本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂除了上述间充质干细胞之外，在不损害本发明的效果的范围内还可以含有其它成分。以下对本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂所含有的间充质干细胞、其它成分进行详细说明。

[间充质干细胞]

本发明中间充质干细胞是指：具有分化为属于间充质系统的一种以上、优选为两种以上、进一步优选为三种以上的细胞(骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、肌腱细胞、脂肪细胞等)的能力，并在维持该能力的状态下能够增殖的细胞。本发明中使用的间充质干细胞的术语是指与基质细胞相同的细胞，不对两者进行特别区分。另外，有时也简记为间充质细胞。作为包含间充质干细胞的组织，例如可列举出：脂肪组织、脐带、骨髓、脐带血、子宫内膜、胎盘、羊膜、绒毛膜、蜕膜、真皮、骨骼肌、骨膜、牙囊、牙周组织、牙髓、牙胚等。例如脂肪组织来源间充质干细胞是指脂肪组织中含有的间充质干细胞，还可称为脂肪组织来源间充质干细胞。这些当中，从对非酒精性脂肪肝炎的治疗的有效性的观点、获得容易性的观点等出发，优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞、胎盘来源间充质干细胞、牙髄来源间充质干细胞，更优选脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞，进一步优选脂肪组织来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞可以是与被处置的对象(被检体)为同种来源或异种来源。作为本发明中的间充质干细胞的种类，可列举出：人、马、牛、绵羊、猪、狗、猫、兔子、小鼠、大鼠，优选为与被处置的对象(被检体)为同种来源细胞。本发明中的间充质干细胞可以源自被处置的对象(被检体)、即为自体细胞(同种同系)，或可以源自同种的其它对象、即为异体细胞(同种异体)。优选为异体细胞(同种异体)。

由于间充质干细胞对于同种异体的被检体也不易发生排斥反应，因此可以使用对预先制备的供体的细胞进行扩大培养并冷冻保存后的细胞，作为本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂中的间充质干细胞。因此，与制备自身的间充质干细胞来使用的情况相比商品化也容易且容易稳定地得到恒定效果，从这样的观点出发，本发明中的间充质干细胞更优选为同种异体。

本发明中间充质干细胞是指：包含间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为间充质干细胞。

本发明中脂肪组织是指：含有脂肪细胞和包含微血管细胞等的间充质干细胞的组织，例如，是将哺乳动物的皮下脂肪外科切除或吸取哺乳动物的皮下脂肪而得到的组织。脂肪组织可以由皮下脂肪获得。优选从与后述的脂肪组织来源间充质干细胞的给药对象为同种的动物获得、考虑到对人给药，更优选为人的皮下脂肪。皮下脂肪的供给个体可以是存活或死亡的，但本发明中使用的脂肪组织优选为从存活个体采集的组织。从个体采集时，吸脂例如可示例出：PAL(动力辅助)吸脂、Erchonia激光吸脂或Body-jet吸脂等，从维持细胞的状态这样的观点出发，优选不使用超声波。

本发明中脐带是连接胎儿和胎盘的白色的管状组织，由脐带静脉、脐带动脉、胶状组织(华顿氏胶；Wharton’s Jelly)、脐带基质本身等构成，富含间充质干细胞。脐带优选从与使用本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的被检体(给药对象)为同种的动物获得，考虑到将本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂对人给药，更优选为人的脐带。

本发明中骨髓是指填充骨的内腔的实质组织(parenchyma)，为造血器官。骨髓中存在骨髓液，将存在于其中的细胞称为骨髓细胞。骨髓细胞中除了红细胞、粒细胞、巨核细胞、淋巴细胞、脂肪细胞等之外，包含间充质干细胞、造血干细胞、血管内皮祖细胞等。骨髓细胞例如可以由人髂骨、长骨或其它骨采集。

本发明中，所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞是指：分别包含所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞的任意的细胞群体。该细胞群体的至少20％以上、优选30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、93％、96％、97％、98％或99％为所谓脂肪组织来源间充质干细胞、脐带来源间充质干细胞、骨髓来源间充质干细胞的各组织来源间充质干细胞。

本发明中的间充质干细胞还可以利用生长特征(例如，从传代至老化为止的群体的倍增能力、倍增时间)、核型分析(例如，正常的核型、母体系统或新生儿系统)、通过流式细胞仪(例如，FACS分析)进行的表面标记物表达、免疫组织化学和/或免疫细胞化学(例如，表位检测)、基因表达谱(例如，基因芯片阵列；逆转录PCR、实时PCR、传统型PCR等聚合酶链式反应)、miRNA表达谱、蛋白质阵列、细胞因子等蛋白质分泌(例如，血浆凝血解析、ELISA、细胞因子阵列)、代谢产物(代谢组学解析)、本领域中公知的其它方法等而赋予特征。

(间充质干细胞的制备方法)

间充质干细胞可以通过本领域技术人员利用公知的方法来制备。以下作为一个例子对脂肪组织来源间充质干细胞的制备方法进行说明。脂肪组织来源间充质干细胞可以利用例如美国专利第6,777,231号中记载的制造方法得到，例如，可以利用包括以下的工序(i)～(iii)的方法来制造：

(i)通过酶消化脂肪组织而得到细胞悬浮物的工序；

(ii)使细胞沉淀，将细胞再悬浮于适合的培养基的工序；以及

(iii)在固体表面培养细胞，去除不显示出与固体表面结合的细胞的工序。

工序(i)中使用的脂肪组织优选使用经清洗的脂肪组织。清洗可以通过使用生理学允许的生理盐水溶液(例如磷酸缓冲盐水(PBS))，并剧烈地搅拌使其沉淀来进行。其原因在于，从组织中去除脂肪组织中包含的杂质(也称为残骸(debris)，例如损伤组织、血液、红细胞等)。因此，通常重复进行清洗和沉淀直至从上清液中整体上去除了残骸。残留的细胞以各种各样的尺寸的块的形式存在，因此为了将细胞本身的损伤抑制在最小限度并且使其解离，而优选用使细胞间结合变弱或破坏细胞间结合的酶(例如，胶原酶、分散酶或胰蛋白酶等)对清洗后的细胞块进行处理。这样的酶的量和处理期间依赖于所使用的条件而变化，在本技术领域中是已知的。可以替代这样的酶处理或组合地利用机械的搅拌、超声波能量、热能等其它处理法将细胞块分解，但为了将细胞的损伤抑制在最小限度而优选仅通过酶处理进行。使用了酶的情况，为了将对细胞的有害作用抑制在最小限度，期望的是在经过适合的期间后使用培养基等使酶失活。

通过工序(i)而得到的细胞悬浮物包含聚集状的细胞的浆料或悬浮物、以及各种夹杂细胞、例如红细胞、平滑肌细胞、内皮细胞和成纤维细胞。接着，还可以分离、去除聚集状态的细胞和它们的夹杂细胞，但由于能够通过后述的工序(iii)中的粘接和清洗来去除，因此可以省略该分离、去除。在分离、去除夹杂细胞时，可以通过将细胞强制分成上清液和沉淀的离心分离来实现。将包含得到的夹杂细胞的沉淀悬浮于生理学允许的溶剂中。虽然有悬浮状的细胞中包含红细胞的担心，但由于红细胞会通过后述的由粘附于个体表面进行的选择而被排除，因此未必一定需要溶解的工序。作为选择性地溶解红细胞的方法，可以使用本技术领域中公知的方法例如通过用氯化铵溶解在高渗培养基或低渗培养基中进行孵育等。溶解后，还可以通过例如过滤、离心沉淀或密度分级从期望的细胞分离溶解物。

工序(ii)中，对于悬浮状的细胞，为了提高间充质干细胞的纯度，还可以进行1次或连续多次清洗、离心分离，并再悬浮于培养基中。此外，还可以基于细胞表面标记物曲线或基于细胞的尺寸和颗粒性对细胞进行分离。

再悬浮时使用的培养基只要是能培养间充质干细胞的培养基就没有特别限定，这样的培养基还可以通过如下方式制作：在基础培养基中添加血清、和/或添加白蛋白、运铁蛋白、脂肪酸、胰岛素、亚硒酸钠、胆固醇、胶原蛋白前体、微量元素、2-巯基乙醇、3’-硫代甘油等中的1种以上的血清替代物。这些培养基还可以根据需要进一步添加脂质、氨基酸、蛋白质、多糖、维生素、生长因子、低分子化合物、抗生素、抗氧化剂、丙酮酸、缓冲剂、无机盐类等物质。

作为上述基础培养基，例如可列举出：IMDM培养基、Medium 199培养基、伊格尔最低必需培养基(Eagle’s Minimum Essential Medium，EMEM)、αMEM培养基、达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco’s modified Eagle’s Medium，DMEM)、Ham’s F12培养基、RPMI 1640培养基、Fischer’s培养基、MCDB201培养基以及它们的混合培养基等。

作为上述血清，例如可列举出：人血清、胎牛血清(FBS)、牛血清、仔牛血清、山羊血清、马血清、猪血清、绵羊血清、兔子血清、大鼠血清等，但不限定于这些。使用血清时，可以相对于基础培养基添加5v/v％～15v/v％、优选添加10v/v％。

作为上述脂肪酸，可示例出：亚油酸、油酸、亚麻酸、花生四烯酸、肉豆蔻酸、棕榈酸(palmitoyl acid)、棕榈酸(palmitic acid)和硬脂酸等，但不限定于这些。脂质可示例出：磷脂酰丝氨酸、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰胆碱等，但不限定于这些。氨基酸例如包括：L-丙氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-胱氨酸、L-谷氨酸、L-谷氨酰胺、L-甘氨酸等，但不限定于这些。蛋白质例如可示例出：大肠杆菌素、还原型谷胱甘肽、纤维连接蛋白和β2-微球蛋白等，但不限定于这些。多糖可示例出糖胺聚糖，糖胺聚糖中尤其可示例出透明质酸、硫酸乙酰肝素等，但不限定于这些。生长因子例如可示例出：血小板来源生长因子(PDGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、转化生长因子β(TGF-β)、肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、结缔组织生长因子(CTGF)、血管内皮细胞生长因子(VEGF)等，但不限定于这些。从将本发明中得到的脂肪来源间充质干细胞用于细胞移植这样的观点出发，优选使用血清等不包含异种来源成分(无异源，xeno-free)的培养基。这样的培养基例如以由PromoCell公司、Lonza公司、Biological Industries公司、Veritas公司、R&DSystems公司、Corning公司和Rohto公司等提供，作为预先制备间充质干细胞(基质细胞)的培养基。

接着，工序(iii)中，对于工序(ii)中得到的细胞悬浮液中的细胞，不使之分化而在固体表面上、在适合的细胞密度和培养条件下使用上述的适合的细胞培养基对其进行培养。本发明中，“固体表面”是指：能够结合/粘附本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞的任意材料。在特定的方式中，这样的材料是为了促进哺乳类细胞与该表面的结合/粘附而经处理的塑料材料。具有固体表面的培养容器的形状没有特别限定，可适宜地使用培养皿、烧瓶等。为了去除非结合状态的细胞和细胞的碎片，在孵育后清洗细胞。

本发明中，可以选择最终以与固体表面结合/粘附的状态滞留的细胞作为脂肪组织来源间充质干细胞的细胞群体。

对于所选择的细胞，为了确认为本发明中的脂肪组织来源间充质干细胞，还可以使用流式细胞仪等利用现有的方法对表面抗原进行解析。进而，还可以对分化为各细胞系列的能力进行检测，这样的分化可以利用现有的方法进行。

本发明中的间充质干细胞可以如上所述进行制备，但还可以定义为具有以下特性的细胞；

(1)在标准培养基中的培养条件下，对塑料显示出粘接性、

(2)表面抗原CD44、CD73、CD90为阳性，CD31、CD45为阴性、和

(3)在培养条件下能分化为骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞。

(间充质干细胞的冷冻保存)

本发明中的间充质干细胞只要具备针对非酒精性脂肪肝炎的治疗效果就可以是适宜重复进行了冷冻保存和融解的细胞。本发明中，冷冻保存可以通过如下方式进行：本领域技术人员将间充质干细胞悬浮于公知的冷冻保存液中进行冷却。悬浮可以通过如下方式进行：利用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，转移至冷冻保存容器中进行适宜处理后，加入冷冻保存液。

冷冻保存液作为冷冻保护剂还可以含有二甲基亚砜(DMSO：Dimethylsulfoxide)，但DMSO除了细胞毒性之外还具有分化诱导间充质干细胞的特性，因此优选减少DMSO含量。作为DMSO的替代物，可示例出：甘油、丙二醇或多糖类。使用DMSO时，含有5％～20％的浓度、优选含有5％～10％的浓度、更优选含有10％的浓度。此外还可以包含WO2007/058308中记载的添加剂。作为这样的冷冻保存液，例如还可以使用由Bioverde Inc.、NIPPON Genetics Co,Ltd.、REPROCELL Inc.、ZENOAQ公司、Cosmo Bio Co.,Ltd.、KohjinBio Co.,Ltd.、Thermo Fisher Scientific Inc.等提供的冷冻保存液。

冷冻保存上述悬浮的细胞时，在-80℃～-100℃之间的温度(例如，-80℃)下保管为宜，可以使用能达到该温度的任意的冷冻仪来进行。没有特别限定，为了避免急剧的温度变化，还可以使用程序冷冻仪来适宜控制冷却速度。冷却速度可以根据冷冻保存液的成分进行适宜选择，可以依据冷冻保存液的制造者指示来进行。

保存期间只要在上述条件下经冷冻保存的细胞融解后保持与冷冻前同等性质就没有特别限定，例如可列举出：1周以上、2周以上、3周以上、4周以上、2个月以上、3个月以上、4个月以上、5个月以上、6个月以上、1年以上或更长时间。通过在更低的温度下保存而能够抑制细胞毒性，因此还可以移至液氮上的气相(从-180℃以上至约-150℃以下)中进行保存。在液氮上的气相中保存时，可以使用本领域技术人员公知的保存容器来进行。没有特别限定，例如保存2周以上时，优选在液氮上的气相中进行保存。

融解的间充质干细胞还可以适宜培养至接下来的冷冻保存。间充质干细胞的培养使用能培养上述的间充质干细胞的培养基进行，没有特别限定，还可以在30～40℃、优选为在约37℃的培养温度下、在含有CO₂的空气气氛下进行。CO₂浓度为约2～5％、优选为约5％。在培养时，在相对于培养容器到达适合的汇合(例如可列举出相对于培养容器，细胞占50％至80％的情况)后，还可以用胰蛋白酶等剥离剂使细胞剥离，以适合的细胞密度接种于另行准备的培养容器中继续进行培养。在接种细胞时，作为典型的细胞密度，可示例出：100细胞/cm²～100000细胞/cm²、500细胞/cm²～50000细胞/cm²、1000～10000细胞/cm²、2000～10000细胞/cm²等。在特定的方式中，细胞密度为2000～10000细胞/cm²。优选为3天～7天到达适合的汇合的方式进行调节。在培养时，还可以根据需要适宜更换培养基。

经冷冻保存的细胞的融解可以通过本领域技术人员利用公知的方法来进行。例如可示例出通过在37℃的恒温槽内或热水浴中静置或振荡来进行的方法。

(间充质干细胞的形态)

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂所含有的间充质干细胞可以是任意状态的细胞，例如可以是将培养中的细胞剥离并回收的细胞，还可以是在冷冻保存液中被冷冻的状态的细胞。使用将扩大培养而得到的相同批次的细胞分成小部分进行冷冻保存后的细胞时，在稳定地得到同样的作用效果方面、操作性优异方面等是优选的。冷冻保存状态的间充质干细胞可以在即将使用之前进行融解并悬浮于冷冻保存液的状态下直接混合于输液或培养基等的间充质干细胞悬浮用溶液中。另外，可以利用离心分离等方法去除冷冻保存液后悬浮于输液或培养基等的间充质干细胞悬浮用溶液中。此处，本发明中的“输液”是指：对人进行治疗时所使用的溶液，没有特别限定，例如可列举出：生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格溶液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补充剂)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等。需要说明的是，上述的输液或培养基等间充质干细胞悬浮用溶液还可以以包含后述的其它成分(药学上可接受的载体、添加物)的方式来制备。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂只要在不损害本发明的效果的范围内，除了上述间充质干细胞以外还可以根据其用途、形态，按照常规方法含有药学上可接受的载体、添加物。作为这样的载体、添加物，例如可列举出：等渗剂、增稠剂、糖类、糖醇类、防腐剂(保存剂)、杀菌剂或抗菌剂、pH调节剂、稳定化剂、螯合剂、油性基质、凝胶基质、表面活性剂、悬浮化剂、粘结剂、赋形剂、润滑剂、崩解剂、发泡剂、流动化剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、助溶剂、抗氧化剂、甜味剂、酸味剂、着色剂、呈味剂、香料或清凉化剂等，但不限定于这些。作为代表性的成分，例如可列举出以下的载体、添加物等。

作为载体，例如可列举出：水、含水乙醇等的水性载体。另外，作为等渗剂(无机盐)，例如可列举出：氯化钠、氯化钾、氯化钙、氯化镁等；作为多元醇，例如可列举出：甘油、丙二醇、聚乙二醇等；作为增稠剂，例如可列举出：羧乙烯基聚合物、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、甲基纤维素、藻酸、聚乙烯醇(完全、或部分皂化物)、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙二醇等；作为糖类，例如可列举出：环糊精、葡萄糖等；作为糖醇类，例如可列举出：木糖醇、山梨醇、甘露糖醇等(它们可以是d构型、l构型或dl构型中的任意者)；作为防腐剂、杀菌剂或抗菌剂，例如可列举出：二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、烷基二氨基乙基甘氨酸盐酸盐、苯甲酸钠、乙醇、苯扎氯铵、苄索氯铵、葡萄糖酸洗必泰、氯丁醇、山梨酸、山梨酸钾、氨丁三醇、脱氢醋酸钠、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、羟基喹啉硫酸盐、苯乙醇、苄醇、双胍化合物(具体而言，聚己缩胍盐酸盐(聚六亚甲基双胍盐酸盐)等)、Glokill(Rhodia公司制商品名)等；作为pH调节剂，例如可列举出：盐酸、硼酸、氨基乙基磺酸、ε-氨基己酸、柠檬酸、乙酸、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氢氧化镁、碳酸氢钠、碳酸钠、硼砂、三乙醇胺、单乙醇胺、二异丙醇胺、硫酸、硫酸镁、磷酸、多聚磷酸、丙酸、草酸、葡萄糖酸、富马酸、乳酸、酒石酸、苹果酸、琥珀酸、葡萄糖酸内酯、乙酸铵等；作为稳定化剂，例如可列举出：二丁基羟基甲苯、氨丁三醇、甲醛次硫酸氢钠(RONGALIT)、生育酚、焦亚硫酸钠、单乙醇胺、单硬脂酸铝、单硬脂酸甘油酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠等；作为油性基质，例如可列举出：橄榄油、玉米油、大豆油、芝麻油、棉籽油等植物油、中链脂肪酸甘油三酯等；作为水性基质，例如可列举出：聚乙二醇400等；作为凝胶基质，例如可列举出：羧乙烯基聚合物、胶质等；作为表面活性剂，例如可列举出：聚山梨醇酯80、硬化蓖麻油、脂肪酸甘油酯、山梨坦倍半油酸酯等；作为悬浮化剂，例如可列举出：白蜂蜡、各种表面活性剂、阿拉伯胶、阿拉伯胶粉末、黄原胶、大豆磷脂等；作为粘结剂，例如可列举出：羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚乙烯基吡咯烷酮、聚乙烯醇等；作为赋形剂，例如可列举出：蔗糖、乳糖、淀粉、玉米淀粉、结晶纤维素、轻质硅酸酐等；作为润滑剂，例如可列举出：蔗糖脂肪酸酯、硬脂酸镁、滑石等；作为崩解剂，例如可列举出：低取代度羟丙基纤维素、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠等；作为发泡剂，例如可列举出：碳酸氢钠等；作为流动化剂，例如可列举出：偏硅酸铝钠、轻质硅酸酐等。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂根据目的可以以各种形态、例如固体制剂、半固体制剂、液体制剂等各种各样的剂型来提供。例如可以以固体制剂(片剂、粉末、散剂、颗粒剂、胶囊剂等)、半固体制剂[软膏剂(硬软膏剂、软软膏剂等)、霜剂等]、液体制剂[洗剂、萃取剂、悬浮剂、乳剂、糖浆剂、注射剂(包括输液剂、嵌入式注射剂、缓释型注射、使用时制备型的注射剂)、透析用剂、气雾剂、软胶囊剂、营养剂等]、贴剂、巴布剂等的形态加以利用。另外，本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂还可以以油性或水性的赋形剂中的溶液或乳液等的形式加以利用。进而，本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂还可以通过喷雾来用于患部，本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂还可以以喷雾后在患部被凝胶化或片化的形态加以利用。本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂还可以在将上述间充质干细胞制成片状或立体结构体后用于患部。

对于本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂，可以将上述的间充质干细胞、其它成分(药学上可接受的载体、添加物)使用生理盐水、日本药典生理盐水、5％葡萄糖液、日本药典葡萄糖注射液、林格氏液、日本药典林格氏液、乳酸林格氏液、乙酸林格氏液、碳酸氢盐林格氏液、1号液(初始溶液)、2号液(脱水补给液)、3号液(维持液)、4号液(术后恢复液)等输液、或、DMEM等细胞培养培养基等间充质干细胞悬浮用溶液进行悬浮或稀释来使用，优选用生理盐水、5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)、更优选用5％葡萄糖液、1号液(初始溶液)进行悬浮或稀释来使用。另外，上述间充质干细胞悬浮用溶液可以以预先包含上述其它成分(药学上可接受的载体、添加物)的方式来制备。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂，可以将间充质干细胞及间充质干细胞悬浮用溶液封入不同的容器中进行保管，在使用时将两者混合来使用。需要说明的是，在保管时，上述间充质干细胞和间充质干细胞悬浮用的溶液可以是冷冻状态或冷藏状态。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂为液体制剂时，非酒精性脂肪肝炎治疗剂的pH只要在药物上、药理学上(制药上)或生理学上可接受的范围内就没有特别限定，作为一个例子，可列举出为2.5～9.0、优选为3.0～8.5、更优选为3.5～8.0的范围。需要说明的是，在将间充质干细胞和间充质干细胞悬浮用溶液封入不同的容器中进行保管的情况下，间充质干细胞悬浮用溶液只要满足上述条件即可。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂为液体制剂时，对于非酒精性脂肪肝炎治疗剂的渗透压，只要在生物体可接受的范围内就没有特别限制。作为本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的渗透压比的一个例子，可列举出优选为0.7～5.0、更优选为0.8～3.0、进一步优选为0.9～1.4的范围。渗透压的调节可以使用无机盐、多元醇、糖醇、糖类等，利用该技术领域中已知的方法进行。渗透压比是基于第十五次修订日本药典、试样的渗透压相对于286mOsm(0.9w/v％氯化钠水溶液)的渗透压之比，渗透压参考日本药典中记载的渗透压测定法(冰点下降法)进行测定。需要说明的是，对于渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)，可以如下制备：将氯化钠(日本药典标准试剂)在500～650℃下干燥40～50分钟后，在干燥器(硅胶)中进行自然冷却，准确称量其0.900g，溶解于纯化水中准确地制成100mL，或使用市售的渗透压比测定用标准液(0.9w/v％氯化钠水溶液)。需要说明的是，在将间充质干细胞和间充质干细胞悬浮用溶液封入不同的容器中进行保管的情况下，间充质干细胞悬浮用溶液只要满足上述条件即可。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂向对象的给药途径可列举出：口服给药、皮下给药、肌肉给药、静脉内给药、动脉内给药、髄腔内给药、腹腔内给药、舌下给药、直肠给药、阴道给药、眼内给药、经鼻给药、吸入、经皮给药、植入物、向肝表面的喷雾及通过片等的粘贴进行的直接给药等，从本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的有效性的观点出发，优选为植入物、肝动脉内给药、静脉内给药和向肝表面的喷雾和通过片等的粘贴进行的直接给药，从减轻对象者的负担的观点出发，更优选为静脉内给药。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂中，其用量(给药量)可以根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)及剂型等而不同，从发挥充分的治疗效果的观点出发，有优选大量的倾向，另一方面，从抑制副作用的表现的观点出发，有优选小量的倾向。通常，在对成人给药时，作为细胞数，为1×10³～1×10¹²个/次、优选为1×10⁴～1×10¹¹个/次、更优选为1×10⁵～1×10¹⁰个/次、进一步优选为5×10⁶～1×10⁹个/次。另外，作为每患者的体重的给药量，1×10～5×10¹⁰个/kg、优选为1×10²～5×10⁹个/kg、更优选为1×10³～5×10⁸个/kg、进一步优选为1×10⁴～5×10⁷个/kg的。需要说明的是，可以将本用量作为1次量来进行多次给药，还可以将本用量分成多次进行给药。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂向对象的给药速度根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)和本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的给药途径等而不同，通常，在对成人给药时，为50mL/小时～1000mL/小时、优选为75mL/小时～500mL/小时、更优选为100mL/小时～250mL/小时。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂向对象的给药温度根据患者的状态(体重、年龄、症状、身体状况等)和本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂的给药途径等而不同，通常为4℃～45℃、优选为15℃～37℃、更优选为室温～37℃。

本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂可以与1种或2种以上的其它药剂一起给药。作为其它药剂，可列举出可以作为肝脏的治疗药作使用的任意药剂，例如可列举出：乙型肝炎治疗药(拉米夫定(Lamivudine)、阿德福韦(Adefovir)、恩替卡韦(Entecavir)、替诺福韦(Tenofovir)等)、干扰素制剂(干扰素α、干扰素α-2b、干扰素β、PEG干扰素α-2a、PEG干扰素α-2b等)、丙型肝炎治疗药(利巴韦林(Ribavirin)、特拉匹韦(Telaprevir)、司美匹韦(simeprevir)、伐尼瑞韦(Vaniprevir)、达卡他韦(Daclatasvir)、阿那匹韦(Asunaprevir)、索非布韦(Sofosbuvir)等)、糖皮质激素(泼尼松龙(Prednisolone)、甲基泼尼松龙琥珀酸钠等)、抗凝固剂(干燥浓缩人抗凝血酶III、甲磺酸加贝酯(GabexateMesilate)、血栓调节蛋白α等)、解毒剂(依地酸钙二钠水合物、谷胱甘肽(Glutathione)、2,3-二巯基-1-丙醇、硫代硫酸钠水合物、舒更葡糖钠(Sugamadex sodium)等)、人血清白蛋白、肝脏提取物、熊去氧胆酸、甘草酸、硫唑嘌呤、苯扎贝特(Bezafibrate)、氨基酸(甘氨酸、L-半胱氨酸、L-异亮氨酸、L-亮氨酸、L-缬氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-丙氨酸、L-蛋氨酸、L-苯丙氨酸、L-色氨酸、L-蓖麻毒蛋白、L-组氨酸、L-精氨酸和它们的盐等)、维生素(生育酚、黄素腺嘌呤二核苷酸、硫胺素二硫化物磷酸盐(Thiamine disulfide phosphate)、吡哆醇(Pyridoxine)、维生素B12(Cyanocobalamin)和它们的盐等)、抗生素(舒巴坦钠(Sulbactam sodium)、头孢哌酮钠(Cefoperazone sodium)、美洛培南(Meropenem)水合物、盐酸万古霉素(Vancomycin hydrochloride)等)等。需要说明的是，将本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂与1种或2种以上的其它药剂一同给药的情况是指包括：本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂与其它药剂同时使用的情况，将任一种药剂给药并经过一定时间后再将另一种药剂给药的情况，它们的组合等各种情况。

＜非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒＞

本发明还包括非酒精性脂肪肝炎治疗用的试剂盒，其包含间充质干细胞和间充质干细胞悬浮用溶液。对于本发明的试剂盒所包含的间充质干细胞、间充质干细胞悬浮用溶液，可以适用非酒精性脂肪肝炎治疗剂项目中的说明。

另外，本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒还可以表现为包括本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂、容器和标签。作为本发明的试剂盒所包含的适合的容器，没有特别限定，例如可列举出：细胞冷冻用的内旋盖冻存管、间充质干细胞悬浮用溶液用的瓶、小瓶、试验管等。这些容器可以由玻璃、金属、塑料或它们的组合等多种材料形成。这些容器上的标签记载了对作为内容物的间充质干细胞、间充质干细胞悬浮用溶液等进行说明的内容。

本发明的试剂盒可以包括其它添加剂、其它药剂、稀释剂、过滤器、针、注射器、记载了使用方法的随附文档在内的、从商业和利用者的观点出发所期望的其它材料。

＜非酒精性脂肪肝炎的治疗方法＞

根据本发明的另一方案，本发明还包括使用间充质干细胞的非酒精性脂肪肝炎的治疗方法。即，根据本发明，通过将间充质干细胞投与非酒精性脂肪肝炎患者，从而能够显著地改善非酒精性脂肪肝炎部位的功能等。需要说明的是，对于本发明的治疗方法中使用的间充质干细胞，可以适用非酒精性脂肪肝炎治疗剂项目中的说明。

实施例

以下列举实施例和试验例对本发明进行详细地说明，但本发明不受这些实施例等限定。

1.脂肪来源间充质干细胞的制备

获得人供体的同意后，用生理盐水清洗利用吸脂法得到的皮下脂肪组织。为了实现细胞外基质的破坏和细胞的分离，添加胶原酶(Roche diagnostics公司)(溶剂为生理盐水)，在37℃下振荡90分钟使其分散。接着，将该上述悬浮液以800g进行5分钟离心分离而得到间质血管细胞群的沉淀。在上述细胞的沉淀中加入间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)，将该细胞悬浮液以400g进行5分钟离心分离，去除上清液后再悬浮于间充质干细胞用无血清培养基(Rohto公司)中，将细胞接种于烧瓶中。将细胞在37℃下5％CO₂中培养数天。数天后用PBS清洗培养物来去除培养液中包含的血球、脂肪组织的残留等，得到贴壁于塑料容器中的间充质干细胞。

将得到的脂肪组织来源间充质干细胞分注在离心管中，以400g进行5分钟、离心分离而得到细胞的沉淀。去除上清液后加入适量细胞冷冻保存液(STEM-CELLBANKER(ZENOAQ公司))使其悬浮。将该细胞悬浮溶液分注于内旋盖冻存管中后，在冷冻仪内以-80度保存，然后转移至液氮上的气相中继续进行保存。

2.使用了非酒精性脂肪性肝炎模型的治疗效果(实施例1)

让KK-Ay/Ta Jcl小鼠(6周龄、雄性、CLEA Japan,Inc.制)摄取Choline-deficientL-amino acid-defined饲料(缺乏胆碱的氨基酸调整(以下也称为“N-CDAA”)饲料、Research Diets Inc.制、A09042101、Lot.14011403)9周，制作了非酒精性脂肪肝炎(NASH)模型。对于脂肪来源间充质干细胞给药组，自摄取N-CDAA饲料开始1周后，从液氮中取出通过上述1制得的脂肪来源间充质干细胞的内旋盖冻存管，浸渍于水浴(37℃)中，使内部的细胞融解。以活细胞密度为1.5×10⁶个细胞/mL的方式添加HBSS，制备了脂肪来源间充质干细胞悬浮液。将0.2mL的脂肪来源间充质干细胞悬浮液(3×10⁵个细胞/体)进行每2周1次(第8天、第22天、第36天、第50天)共计4次静脉内给药。在N-CDAA饲料摄取开始9周后采集肝脏，在深冷制冷器中以-80℃保存。对于经冷冻保存的肝脏，利用Woessner的方法(Woessner,J.F.Jr.:Arch.of Biophysics,93:pp440～447,1961)测定了肝脏中羟基脯氨酸(以下也称为“HYP”)含量。

具体而言，向切出的肝脏(最大0.5g)中加入PBS(PBS(-)和光纯药工业株式会社制)，在冰冷下使用简易均质机(PHYSCOTRON NS-360D、MICROTEC Co.,Ltd.制)进行均质，进而边利用PBS清洗叶片部边制备了最终为5％肝匀浆溶液。在匀浆溶液0.5mL中添加盐酸(35～37％盐酸(约10N)和光纯药工业株式会社制)0.75mL使最终规定浓度为6N，在约110℃下进行20小时以上的水解处理。利用2.5N的氢氧化钠将反应物中和后，将该溶液的2mL作为HYP含量测定用试样。在HYP含量测定用试样2mL中添加氯胺T试剂1mL，在20分钟室温放置后，加入1mL的高氯酸试剂并室温放置5分钟。加入1mL的对二甲基氨基苯甲醛试剂并进行60℃、20分钟加热后，使用安装了滤纸(ADVANTEC)的过滤器进行过滤而得到上清液。通过分光光度计测定在557nm下的吸光度，基于标准曲线计算出HYP含量(μg/mL)。

非细胞给药组的肝脏每1g的HYP量和肝脏整体的HYP量为562.3±74.4μg/g肝脏和5001.8±477.6μg/肝脏。相对于此，细胞给药组的肝脏每1g的HYP量和肝脏整体的HYP量为230.8±38.6μg/g肝脏和2073.0±430.0μg/肝脏，通过给药脂肪来源间充质干细胞，从而可观察到肝脏中HYP量的显著减少。

3.使用了非酒精性脂肪性肝炎模型的治疗效果(实施例2)

让KK-Ay/Ta Jcl小鼠(6周龄、雄性、CLEA Japan,Inc.制)摄取N-CDAA饲料(Research Diets Inc.制、A09042101、Lot.15072308)9周而制作了NASH模型。从液氮中取出加入了与实施例1同样制备的脂肪来源间充质干细胞的玻璃小瓶，浸渍于水浴(约37℃)中，使内部的细胞悬浮液融解。向15mL离心管中加入恢复至室温的DMEM(厂商：Lifetechnologies，型号：11054)12mL，将玻璃小瓶内的细胞悬浮液缓慢移至离心管后，进行离心分离(室温，400×g)。去除上清液并以总细胞浓度为1×10⁷个细胞/mL的方式加入HBSS，制备了脂肪来源间充质干细胞悬浮液。对于脂肪来源间充质干细胞给药组，自摄取N-CDAA开始6周将脂肪来源间充质干细胞悬浮液进行1天1次、连续2天5mL/kg(5×10⁷个细胞/kg)静脉内给药。自摄取N-CDAA饲料开始9周后采集肝脏，在深冷制冷器中以-80℃保存。对于经冷冻保存的肝脏与实施例1同样地利用Woessner的方法测定了肝脏中HYP含量。

非细胞给药组的肝脏每1g的HYP量和肝脏整体的HYP量为587.1±56.4μg/g肝脏和5999.7±703.0μg/肝。相对于此，细胞给药组的肝脏每1g的HYP量和肝脏整体的HYP量为408.5±30.8μg/g肝脏和3737.8±402.0μg/肝脏。明确了：通过给药细胞从而可观察到肝脏中HYP量显著减少，人脂肪来源间充质干细胞具有抑制肝脏的纤维化的作用。

4.使用了非酒精性脂肪性肝炎模型的治疗效果3(实施例3)

让KK-Ay/Ta Jcl小鼠(6周龄、雄性、CLEA Japan,Inc.制)摄取N-CDAA(ResearchDiets Inc.制、A09042101、Lot.15072308)9周而制作了NASH模型。从液氮中取出加入了与实施例1同样制备的脂肪来源间充质干细胞，浸渍于水浴(约37℃)中，使内部的细胞悬浮液融解。向15mL离心管中加入恢复至室温的DMEM(厂商：Life technologies，型号：11054)12mL，将玻璃小瓶内的细胞悬浮液缓慢移至离心管后，进行离心分离(室温，400×g)。去除上清液并以总细胞浓度为5×10⁶个细胞/mL的方式加入HBSS，制备了脂肪来源间充质干细胞悬浮液。对于脂肪来源间充质干细胞给药组，自摄取N-CDAA开始6周将脂肪来源间充质干细胞悬浮液进行10mL/kg(5×10⁷个细胞/kg)静脉内给药。自摄取N-CDAA饲料开始9周后采集肝脏，在深冷制冷器中以-80℃保存。对于经冷冻保存的肝脏与实施例1同样地利用Woessner的方法测定了肝脏中HYP含量。另外，利用10％中性磷酸缓冲福尔马林溶液将摘出的肝脏的外侧左叶固定。依据常规方法实施天狼星红染色，通过图像解析评价了纤维化面积。

非细胞给药组的肝脏每1g的HYP量和肝脏整体的HYP量为510.1±25.4μg/g肝脏和4916.5±456.1μg/肝脏。相对于此，细胞给药组的肝脏每1g的HYP量和肝脏整体的HYP量为418.9±24.8μg/g肝脏和3709.1±493.0μg/肝脏，通过细胞给药可观察的肝脏中HYP量的显著减少。另外，肝脏的纤维化面积为细胞非给药组的3.06％，而细胞给药组为2.16％。明确了：人脂肪来源间充质干细胞具有抑制肝脏的纤维化的作用。如上所述，可知包含脂肪来源间充质干细胞的本发明的非酒精性脂肪肝炎治疗剂即使进行单次给药也可发挥显著的非酒精性脂肪肝炎治疗效果。

产业上的可利用性

根据本发明，提供含有间充质干细胞的新型的非酒精性脂肪肝炎治疗剂、和非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒。本发明的治疗剂和试剂盒对于目前尚未确立有效的药物疗法的非酒精性脂肪肝炎发挥显著的治疗效果。

Claims

1.一种非酒精性脂肪肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis；NASH)治疗剂，其含有间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的非酒精性脂肪肝炎治疗剂，其中，间充质干细胞为异体来源。

3.根据权利要求1或2所述的非酒精性脂肪肝炎治疗剂，其中，间充质干细胞为脂肪组织来源。

4.一种非酒精性脂肪肝炎治疗用试剂盒，其包含：权利要求1～3中任一项所述的非酒精性脂肪肝炎治疗剂、容器和标签。