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WO2018123628A1 - 細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液 - Google Patents

細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液 Download PDF

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Publication number
WO2018123628A1
WO2018123628A1 PCT/JP2017/044993 JP2017044993W WO2018123628A1 WO 2018123628 A1 WO2018123628 A1 WO 2018123628A1 JP 2017044993 W JP2017044993 W JP 2017044993W WO 2018123628 A1 WO2018123628 A1 WO 2018123628A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cell
cells
solution
pharmaceutical composition
mesenchymal stem
Prior art date
Application number
PCT/JP2017/044993
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
里枝 武田
くみ子 長岡
陽子 堀内
輝 長谷川
琴絵 玉田
Original Assignee
ロート製薬株式会社
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ロート製薬株式会社 filed Critical ロート製薬株式会社
Priority to JP2018559040A priority Critical patent/JPWO2018123628A1/ja
Publication of WO2018123628A1 publication Critical patent/WO2018123628A1/ja
Priority to JP2022165115A priority patent/JP2022179749A/ja

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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the present invention relates to a cell pharmaceutical composition, a disease treatment kit and a cell suspension solution.
  • stem cells such as iPS cells, hematopoietic stem cells, mesenchymal stem cells, skin cells, cardiomyocytes, etc. have moved from the basic research stage to the development stage, and are currently used in clinical settings. There are also.
  • the functions of cells themselves are used directly or indirectly for disease treatment, and the functions of cells and tissues of damaged patients are newly differentiated from stem cells and It is expected to be supplemented by organs.
  • mesenchymal stem cells are pluripotent progenitor cells isolated from bone marrow for the first time by Friedenstein (1982) (Non-patent Document 1). These mesenchymal stem cells have been revealed to exist in various tissues such as bone marrow, umbilical cord, and fat, and mesenchymal stem cell transplantation is expected as a new treatment method for various intractable diseases ( Patent Documents 1 to 4). Recently, it is known that cells having an equivalent function exist in stromal cells of fetal appendages such as adipose tissue, placenta, umbilical cord, and egg membrane. Therefore, the mesenchymal stem cell may be referred to as a stromal cell (Mesenchymal Stroma Cell).
  • the cells may be suspended in a solution for the purpose of ensuring safety and facilitating administration of the cells.
  • a solution for the purpose of ensuring safety and facilitating administration of the cells.
  • the survival rate of the cells in the suspension is gradually reduced and sufficient pharmacological action is achieved.
  • problems such as formation of emboli in the patient's pulmonary veins and the like that may not be obtained, cells may aggregate and clog in the cannula, and the like. Then, this invention makes it a subject to provide the cell pharmaceutical composition which can maintain the survival rate of a cell high over a long time.
  • the inventors of the present invention include Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as electrolytes such as Ringer's solution, Ringer's acetate solution or Ringer's bicarbonate solution, as cells for disease treatment.
  • the present inventors have found that when a drip infusion or the like is performed after suspending in an isotonic electrolyte solution that does not contain carbohydrates, a decrease in the survival rate of cells during administration is remarkably suppressed.
  • a pharmaceutical composition containing cells can maintain a good state of cells and maintain a high survival rate over a long period of time, it has excellent therapeutic effects on various diseases. be able to. That is, the gist of the present invention is as follows.
  • the solution for cell suspension according to [1] wherein the solution for cell suspension further comprises at least one electrolyte selected from the group consisting of CH 3 COO ⁇ , HCO 3 ⁇ , citrate ions and lactate ions.
  • Cell pharmaceutical composition is an isotonic electrolytic solution containing Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as electrolytes and not containing carbohydrates.
  • a cell suspension solution for a cell pharmaceutical composition which is an isotonic electrolyte solution containing Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as an electrolyte and free of carbohydrates.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can maintain a good cell state and maintain its survival rate in a high state for a long time, it can be expected to have an excellent therapeutic effect on various diseases.
  • the cell pharmaceutical composition, disease treatment kit, and cell suspension solution for injection of the present invention will be described in detail.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention contains (A) cells and (B) a cell suspension solution, and (B) the cell suspension solution contains Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as electrolytes. And an isotonic electrolyte solution that does not contain carbohydrates.
  • the “cell pharmaceutical composition” refers to a pharmaceutical composition containing cells, which exhibits a therapeutic effect on diseases due to the functions of the cells.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention is excellent for various diseases because the cell viability can be maintained in a high state for a long time by suspending the cells in the specific solution. A therapeutic effect can be achieved.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention may contain other drugs having a therapeutic effect on diseases. Furthermore, as long as the effects of the present invention are not impaired, other components may be contained.
  • (A) cells, (B) cell suspension solutions, other drugs, and other components contained in the cell pharmaceutical composition of the present invention will be described in detail.
  • the (A) cell is not particularly limited as long as it has an effect on the treatment of diseases.
  • mesenchymal stem cells peripheral blood mononuclear cells (neutrophils, eosinophils, basophils, Lymphocytes, monocytes, etc.), red blood cells, T cells, NK cells, NKT cells, NKM cells, LAK cells, dendritic cells, fibroblasts, hematopoietic stem cells, iPS cells, ES cells, bone marrow cells, cardiomyocytes
  • mesenchymal stem cells, peripheral blood mononuclear cells, and bone marrow cells are preferable from the viewpoint that (B) the cell suspension solution described later is excellent in viability maintenance effect.
  • the mesenchymal stem cell refers to one or more cells belonging to the mesenchymal system, preferably two or more cells, more preferably three or more cells (bone cells, cardiomyocytes, chondrocytes, tendon cells, fat cells, etc.). It means a cell that has differentiation ability and can proliferate while maintaining the ability.
  • the term mesenchymal stem cell used in the present invention means the same cell as the stromal cell, and does not particularly distinguish them. Moreover, it may be simply described as a mesenchymal cell.
  • tissues containing mesenchymal stem cells include adipose tissue, umbilical cord, bone marrow, umbilical cord blood, endometrium, placenta, amniotic membrane, chorion, decidua, dermis, skeletal muscle, periosteum, dental follicle, periodontal ligament, Examples include dental pulp and tooth germ.
  • an adipose tissue-derived mesenchymal stem cell means a mesenchymal stem cell contained in an adipose tissue, and may be referred to as an adipose-derived mesenchymal stem cell.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells from the viewpoint of effectiveness for treatment of various diseases, from the viewpoint of availability, adipose-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, bone marrow-derived mesenchymal stem cells, placenta-derived mesenchymal stem cells, Dental pulp-derived mesenchymal stem cells are preferred, and adipose-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mesenchymal stem cells are more preferred.
  • the mesenchymal stem cells in the present invention may be derived from the same species as the subject to be treated (subject) or from a different species.
  • examples of the mesenchymal stem cell species in the present invention include humans, horses, cows, sheep, pigs, dogs, cats, rabbits, mice, and rats, preferably cells derived from the same species as the subject to be treated (subject).
  • the mesenchymal stem cells in the present invention may be derived from the subject (subject) to be treated, that is, autologous cells (allogeneic), or derived from another subject of the same species, ie, allogeneic cells (allogeneic). ). Preferred are allogeneic cells (allogeneic).
  • mesenchymal stem cells are unlikely to cause rejection even for allogeneic subjects, cells prepared by pre-expanding donor cells that have been expanded and cryopreserved are used in the cell pharmaceutical composition of the present invention (A ) It can be used as a mesenchymal stem cell as a cell. Therefore, compared to the case of preparing and using autologous mesenchymal stem cells, commercialization is easy, and from the viewpoint that a certain effect can be easily obtained stably, the mesenchymal stem cells in the present invention, More preferably, it is allogeneic.
  • the mesenchymal stem cell means an arbitrary cell population including the mesenchymal stem cell.
  • the cell population is at least 20% or more, preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 96%, 97%, 98 % Or 99% are mesenchymal stem cells.
  • an adipose tissue means a tissue containing stromal cells including adipocytes and microvascular cells, and is, for example, a tissue obtained by surgical excision or aspiration of mammalian subcutaneous fat.
  • Adipose tissue can be obtained from subcutaneous fat. It is preferably obtained from the same animal as the subject of administration of the adipose-derived mesenchymal stem cells described later, and more preferably human subcutaneous fat in consideration of administration to humans.
  • An individual supplying subcutaneous fat may be alive or dead, but the adipose tissue used in the present invention is preferably a tissue collected from a living individual.
  • liposuction is exemplified by PAL (power assist) liposuction, Erconia laser liposuction, or body jet liposuction. From the viewpoint of maintaining the state of cells, ultrasound is used. It is preferable not to use.
  • the umbilical cord is a white tubular tissue that connects the fetus and the placenta, and is composed of umbilical vein, umbilical artery, collagenous tissue (Wharton's Jelly), umbilical matrix itself, etc., and mesenchymal stem cells Including many.
  • the umbilical cord is preferably obtained from the same animal as the subject (administration subject) using the cell pharmaceutical composition of the present invention, and more preferably in consideration of administering the cell pharmaceutical composition of the present invention to a human.
  • the human umbilical cord is preferably obtained from the same animal as the subject (administration subject) using the cell pharmaceutical composition of the present invention, and more preferably in consideration of administering the cell pharmaceutical composition of the present invention to a human.
  • the bone marrow refers to a soft tissue filling the bone lumen, and is a hematopoietic organ.
  • Bone marrow fluid is present in the bone marrow, and the cells present therein are called bone marrow cells.
  • Bone marrow cells include erythrocytes, granulocytes, megakaryocytes, lymphocytes, adipocytes and the like, as well as mesenchymal stem cells, hematopoietic stem cells, vascular endothelial progenitor cells, and the like.
  • Bone marrow cells can be collected, for example, from human iliac bone, long bone, or other bone.
  • each tissue-derived mesenchymal stem cell such as adipose-derived mesenchymal stem cell, umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, bone marrow-derived mesenchymal stem cell is a fat-derived mesenchymal stem cell, umbilical cord-derived mesenchymal stem cell, It means any cell population containing mesenchymal stem cells derived from each tissue such as bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • the cell population is at least 20% or more, preferably 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 93%, 96%, 97%, 98 % Or 99% are mesenchymal stem cells derived from various tissues such as adipose-derived mesenchymal stem cells, umbilical cord-derived mesenchymal stem cells, and bone marrow-derived mesenchymal stem cells.
  • Mesenchymal stem cells have growth characteristics (eg, population doubling ability from aging to aging, doubling time), karyotype analysis (eg, normal karyotype, maternal line or neonatal line), flow cytometry ( For example, surface marker expression by FACS analysis, immunohistochemistry and / or immunocytochemistry (eg, epitope detection), gene expression profiling (eg, gene chip array; polymerase chain such as reverse transcription PCR, real-time PCR, conventional PCR, etc. Reaction), miRNA expression profiling, protein array, protein secretion such as cytokines (eg, plasma coagulation analysis, ELISA, cytokine array), metabolites (metabolome analysis), other methods known in the art, etc. May be.
  • growth characteristics eg, population doubling ability from aging to aging, doubling time
  • karyotype analysis eg, normal karyotype, maternal line or neonatal line
  • flow cytometry For example, surface marker expression by FACS analysis, immunohisto
  • Mesenchymal stem cells can be prepared by methods well known to those skilled in the art. Below, the preparation method of a fat-derived mesenchymal stem cell is demonstrated as an example. Adipose-derived mesenchymal stem cells may be obtained by the production method described in, for example, US Pat. No. 6,777,231, and can be produced, for example, by a method including the following steps (i) to (iii).
  • washing may be performed by sedimentation with vigorous stirring using a physiologically compatible saline solution (eg, phosphate buffered saline (PBS)).
  • PBS physiologically compatible saline
  • impurities also called debris, such as damaged tissue, blood, and red blood cells
  • washing and sedimentation are generally repeated until the debris is totally removed from the supernatant. Since the remaining cells exist as lumps of various sizes, in order to dissociate them while minimizing damage to the cells themselves, the washed cell lumps are made to have an enzyme (eg, an enzyme that weakens or breaks cell-cell junctions).
  • collagenase dispase or trypsin.
  • the amount of such enzyme and the duration of treatment vary depending on the conditions used, but are known in the art.
  • the cell mass can be broken down by other treatment methods such as mechanical agitation, ultrasonic energy, thermal energy, etc., but with minimal cell damage
  • an enzyme in order to minimize harmful effects on cells, it is desirable to deactivate the enzyme using a medium or the like after a suitable period of time.
  • the cell suspension obtained by the step (i) includes a slurry or suspension of aggregated cells, and various kinds of contaminated cells such as erythrocytes, smooth muscle cells, endothelial cells, and fibroblasts. Therefore, the cells in the aggregated state and these contaminated cells may be separated and removed, but they can be removed by adhesion and washing in step (iii) to be described later. May be. When contaminating cells are separated and removed, this can be achieved by centrifugation that forcibly separates the cells into a supernatant and a precipitate. The resulting precipitate containing contaminating cells is suspended in a physiologically compatible solvent.
  • Suspended cells may contain erythrocytes, but erythrocytes are excluded by selection by adhesion to the individual surface described later, and thus a lysis step is not always necessary.
  • a method for selectively lysing erythrocytes for example, a method well known in the art such as incubation in a hypertonic medium or a hypotonic medium by lysis with ammonium chloride can be used. After lysis, the lysate may be separated from the desired cells, for example, by filtration, centrifugation, or density fractionation.
  • the cells in step (ii), in order to increase the purity of the mesenchymal stem cells in the suspended cells, the cells may be washed once or continuously several times, centrifuged, and resuspended in the medium. Alternatively, cells may be separated based on cell surface marker profile or based on cell size and granularity.
  • the medium used in the resuspension is not particularly limited as long as it is a medium capable of culturing mesenchymal stem cells, but such a medium includes basal medium added with serum and / or albumin, transferrin, fatty acid, One or more serum substitutes such as insulin, sodium selenite, cholesterol, collagen precursor, trace elements, 2-mercaptoethanol, 3′-thiolglycerol, and the like may be added.
  • substances such as lipids, amino acids, proteins, polysaccharides, vitamins, growth factors, low molecular compounds, antibiotics, antioxidants, pyruvate, buffers, inorganic salts, etc. are added as necessary. May be.
  • basal medium examples include IMDM medium, Medium 199 medium, Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM) medium, ⁇ MEM medium, Dulbecco's modified Eagle's Medium (DMEM) medium, Ham's F12 medium, Ham's F16 medium.
  • EMEM Eagle's Minimum Essential Medium
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's Medium
  • Ham's F12 medium Ham's F16 medium.
  • Examples include a medium, Fischer's medium, MCDB201 medium, and a mixed medium thereof.
  • the serum examples include, but are not limited to, human serum, fetal bovine serum (FBS), bovine serum, calf serum, goat serum, horse serum, pig serum, sheep serum, rabbit serum, rat serum and the like.
  • FBS fetal bovine serum
  • bovine serum bovine serum
  • calf serum goat serum
  • horse serum horse serum
  • pig serum sheep serum
  • rabbit serum rat serum
  • 5 v / v% to 15 v / v% preferably 10 v / v% may be added to the basal medium.
  • fatty acid examples include, but are not limited to, linoleic acid, oleic acid, linolenic acid, arachidonic acid, myristic acid, palmitoyl acid, palmitic acid, and stearic acid.
  • lipid examples include, but are not limited to, phosphatidylserine, phosphatidylethanolamine, phosphatidylcholine, and the like.
  • Amino acids include, but are not limited to, for example, L-alanine, L-arginine, L-aspartic acid, L-asparagine, L-cysteine, L-cystine, L-glutamic acid, L-glutamine, L-glycine and the like.
  • proteins include, but are not limited to, ecotin, reduced glutathione, fibronectin and ⁇ 2-microglobulin.
  • polysaccharide examples include glycosaminoglycans, and among the glycosaminoglycans, hyaluronic acid, heparan sulfate and the like are particularly exemplified, but the polysaccharide is not limited thereto.
  • Growth factors include, for example, platelet derived growth factor (PDGF), basic fibroblast growth factor (bFGF), transforming growth factor beta (TGF- ⁇ ), hepatocyte growth factor (HGF), epidermal growth factor (EGF) Examples include, but are not limited to, connective tissue growth factor (CTGF), vascular endothelial growth factor (VEGF), and the like. From the viewpoint of using the adipose-derived mesenchymal stem cells obtained in the present invention for cell transplantation, it is preferable to use a (xenofree) medium that does not contain components derived from different species such as serum.
  • a (xenofree) medium that does not contain components derived from different species such as serum.
  • Such a medium is provided as a medium prepared in advance for mesenchymal stem cells (stromal cells) from, for example, PromoCell, Lonza, Biological Industries, Veritas, R & D Systems, Corning, and Roto. Has been.
  • the appropriate cell density and the appropriate cell medium are used on the solid surface without differentiating the cells in the cell suspension obtained in step (ii).
  • Culture under culture conditions the “solid surface” means any material capable of binding / adhering the adipose-derived mesenchymal stem cells in the present invention.
  • such a material is a plastic material that has been treated to promote the attachment and adhesion of mammalian cells to its surface.
  • the shape of the culture vessel having a solid surface is not particularly limited, but a petri dish or a flask is preferably used. The cells are washed after incubation to remove unbound cells and cell debris.
  • cells that finally remain attached and adhered to the solid surface can be selected as a cell population of adipose-derived mesenchymal stem cells.
  • the surface antigen may be analyzed by a conventional method using flow cytometry or the like. Further, the ability to differentiate into each cell line may be examined, and such differentiation can be performed by conventional methods.
  • Mesenchymal stem cells in the present invention can be prepared as described above, but may be defined as cells having the following characteristics; (1) It exhibits adhesiveness to plastic under the culture conditions in a standard medium. (2) Surface antigens CD44, CD73, CD90 are positive, CD31, CD45 are negative, and (3) Differentiated into bone cells, adipocytes, and chondrocytes under culture conditions.
  • peripheral blood mononuclear cells refer to fractions containing lymphocytes, neutrophils, eosinophils, basophils, and monocytes, which are obtained from human or animal peripheral blood.
  • Peripheral blood mononuclear cells can be separated from peripheral blood by density gradient centrifugation using Ficoll-hypaque (registered trademark) or the like.
  • Peripheral blood mononuclear cells as cells (A) in the present invention may be cells separated from peripheral blood, or they may be cultured with various factors, low molecular compounds, antibodies, etc. as necessary. It may be proliferated and activated.
  • the (A) cell in the present invention may be a cell that has been appropriately cryopreserved and thawed as long as it has a therapeutic effect on various diseases.
  • cryopreservation can be performed by suspending (A) cells in a cryopreservation solution well known to those skilled in the art and cooling. Suspension can be performed by detaching the cells with a release agent such as trypsin as necessary, transferring them to a cryopreservation container, treating them appropriately, and adding a cryopreservation solution.
  • the cryopreservation solution may contain DMSO (Dimethylsulfoxide) as a frost damage protective agent.
  • DMSO Dimethylsulfoxide
  • DMSO is also known to have differentiation-inducing properties for mesenchymal stem cells.
  • glycerol, propylene glycol or polysaccharides are exemplified.
  • DMSO When DMSO is used, it contains a concentration of 5% to 20%, preferably a concentration of 5% to 10%, more preferably a concentration of 10%.
  • additives described in WO2007 / 058308 may be included.
  • cryopreservation solution for example, cryopreservation provided by Bioverde, Nippon Genetics, Reprocell, Xenoac, Cosmo Bio, Kojin Bio, Thermo Fisher Scientific, etc.
  • a liquid may be used.
  • the cooling rate may be appropriately controlled using a program freezer.
  • the cooling rate may be appropriately selected depending on the components of the cryopreservation solution, and may be performed according to the manufacturer's instructions for the cryopreservation solution.
  • the upper limit of the storage period is not particularly limited as long as the cells cryopreserved under the above conditions are thawed and retain the same properties as before freezing, for example, 1 week or more, 2 weeks or more, 3 weeks or more, 4 weeks or more, 2 months or more, 3 months or more, 4 months or more, 5 months or more, 6 months or more, 1 year or more, or more. Since cell damage can be suppressed by storing at a lower temperature, it may be transferred to a gas phase on liquid nitrogen (from about ⁇ 150 ° C. to ⁇ 180 ° C.). When storing in a gas phase on liquid nitrogen, it can be performed using a storage container well known to those skilled in the art. Although not particularly limited, for example, when storing for 2 weeks or more, it is preferable to store in a gas phase on liquid nitrogen.
  • the thawed (A) cells may be appropriately cultured before the next cryopreservation.
  • the mesenchymal stem cells are cultured using the above-described medium capable of culturing mesenchymal stem cells, and are not particularly limited, but contain CO 2 at a culture temperature of about 30 to 40 ° C., preferably about 37 ° C. It may be performed in an air atmosphere.
  • the CO 2 concentration is about 2-5%, preferably about 5%.
  • the culture after reaching the appropriate confluency for the culture container (for example, cells may occupy 50% to 80% of the culture container), the cells are detached with a release agent such as trypsin.
  • the culture may be continued by seeding in a separately prepared culture vessel at an appropriate cell density.
  • typical cell densities are 100 cells / cm 2 to 100,000 cells / cm 2 , 500 cells / cm 2 to 50,000 cells / cm 2 , 1,000 to 10,000 cells. / Cm 2 , 2,000 to 10,000 cells / cm 2, etc. are exemplified. In a particular embodiment, the cell density is between 2,000 and 10,000 cells / cm 2 . It is preferable to adjust the period until reaching appropriate confluency from 3 days to 7 days. During culture, the medium may be changed as necessary.
  • Thawing of cryopreserved cells can be performed by methods well known to those skilled in the art. For example, the method performed by standing or shaking in a 37 degreeC thermostat or a hot water bath is illustrated.
  • the cell (A) contained in the cell pharmaceutical composition of the present invention may be a cell in any state, for example, a cell recovered by detaching a cell in culture, or frozen in a cryopreservation solution It may be a cell in a state of being formed.
  • Use of the same lot of cells obtained by expanding and culturing in the same lot is preferable in that the same action and effect can be stably obtained and the handling property is excellent.
  • the (A) cells in the cryopreservation state may be thawed immediately before use and directly mixed with the cell suspension solution (B) described later while being suspended in the cryopreservation solution.
  • the cryopreservation solution may be removed by a method such as centrifugation and then suspended in the (B) cell suspension solution.
  • the dose (dosage) of (A) cells of the present invention may vary depending on the patient's condition (body weight, age, symptoms, physical condition, etc.), dosage form, etc., but from the standpoint of sufficient therapeutic effect, the amount From the viewpoint of suppressing the occurrence of side effects, a smaller amount tends to be preferable.
  • the number of cells is 1 ⁇ 10 3 to 1 ⁇ 10 12 cells / time, preferably 1 ⁇ 10 4 to 1 ⁇ 10 11 cells / time, more preferably 1 ⁇ 10 5 to 1 ⁇ 10 10 cells / time, particularly preferably 5 ⁇ 10 5. 6 to 1 ⁇ 10 9 pieces / time.
  • this dose may be administered once as a single dose, or the dose may be divided into multiple doses.
  • the dose (dosage) of the cell (A) of the present invention may vary depending on the patient's condition (body weight, age, symptoms, physical condition, etc.) and the dosage form of the composition of the present invention, but is usually administered to an adult.
  • the number of cells is 1 ⁇ 10 to 5 ⁇ 10 10 cells / kg, preferably 1 ⁇ 10 2 to 5 ⁇ 10 9 cells / kg, more preferably 1 ⁇ 10 3 to 5 ⁇ 10 8 cells / kg, particularly preferably 1 ⁇ 10 4 to 5 ⁇ 10 7 cells / kg. It is.
  • this dose may be administered once as a single dose, or the dose may be divided into multiple doses.
  • the (B) cell suspension solution of the present invention is an isotonic electrolyte solution containing Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as electrolytes and not containing carbohydrates.
  • the cell suspension solution may further contain at least one electrolyte selected from the group consisting of CH 3 COO ⁇ , HCO 3 ⁇ , citrate ions and lactate ions.
  • the solution for cell suspension can be said to be an isotonic electrolyte infusion preparation having an extracellular fluid replacement effect in a living body, and is specifically selected from the group consisting of Ringer's solution, Ringer's acetate solution, Ringer's bicarbonate bicarbonate solution, and Ringer's lactate solution At least one of them is preferred.
  • (B) cell suspension solution having such a composition in the cell pharmaceutical composition of the present invention, (A) the state of the cells is kept good, and the survival rate is high over a long period of time. Can be maintained.
  • the cell suspension solution does not contain carbohydrates, and contains Na + , K + , Ca 2+ , Cl ⁇ as electrolytes, Na + is 140 mEq / L to 160 mEq / L, and K + is 1 mEq / L.
  • a Ringer solution having L to 10 mEq / L, Ca 2+ of 1 mEq / L to 10 mEq / L, and Cl ⁇ of 140 mEq / L to 170 mEq / L can be mentioned as a preferable example.
  • the above Ringer solution can be prepared with each electrolyte in the above concentration range, such as Ringer solution “Otsuka” (Nippon Ringer solution, Otsuka Pharmaceutical Factory), Ringer solution “Fuso” (Nippon Ringer solution, Fuso Pharmaceutical Co., Ltd.), etc. Commercial products can also be used.
  • the cell suspension solution does not contain carbohydrates, and contains Na + , K + , Ca 2+ , Cl ⁇ , CH 3 COO ⁇ as electrolytes, and Na + is 120 mEq / L to 140 mEq / L
  • the above-mentioned Ringer's solution can be prepared by adjusting the concentration of each electrolyte to the above-mentioned concentration range. Commercial products such as F infusion (Terumo Corporation) can also be used.
  • the cell suspension solution does not contain carbohydrates, and contains Na + , K + , Ca 2+ , Mg 2+ , Cl ⁇ , HCO 3 ⁇ , citrate ions (Citrate 3+ ) as electrolytes,
  • the electrolyte concentrations of Na + are 120 mEq / L to 145 mEq / L
  • K + is 1 mEq / L to 10 mEq / L
  • Ca 2+ is 1 mEq / L to 10 mEq / L
  • Mg 2+ is 0.1 mEq / L to 10 mEq / L.
  • the bicarbonate Ringer's solution can be prepared with each electrolyte in the above-mentioned concentration range.
  • commercially available products such as Bicanate (registered trademark) infusion (Otsuka Pharmaceutical Factory), Bicarbon (registered trademark) infusion (Ai Pharma Co., Ltd.), etc. Can also be used.
  • the (B) a solution for cell suspension, free of carbohydrates, and Na +, K +, Ca 2+ as the electrolyte, Cl -, lactate (Lactate -) include respective electrolyte concentration, Na + is 120 mEq / L to 140 mEq / L, K + 1 mEq / L to 10 mEq / L, Ca 2+ 1 mEq / L to 10 mEq / L, Cl ⁇ 90 mEq / L to 130 mEq / L, Lactate ⁇ 15 mEq / L to 45 mEq / L
  • a preferred example is Lactated Ringer's solution which is L.
  • the above Lactated Ringer solution can be prepared with each electrolyte in the above-mentioned concentration range.
  • Kriticare Co., Ltd. Hartmann Infusion "NP” (Nipro Corporation), Hartmann Infusion pH 8 "NP” (Nipro Corporation), Lactec (registered trademark) Note (Otsuka Pharmaceutical Factory), Lactolin Gel Solution “Fuso” (Fuso Pharmaceutical) Commercial products such as Kogyo Co., Ltd. can also be used.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention may contain one or more other drugs having a therapeutic effect on a disease.
  • Other drugs that can be used as liver disease drugs, heart disease drugs, inflammatory bowel disease drugs, respiratory drugs, nervous system drugs, cardiovascular drugs, cerebral circulation improving drugs, immunosuppressive drugs Of these drugs.
  • liver diseases examples include hepatitis B therapeutic agents (lamivudine, adefovir, entecavir, tenofovir, etc.), interferon preparations (interferon ⁇ , interferon ⁇ -2b, interferon ⁇ , peginterferon ⁇ -2a, peginterferon ⁇ -2b, etc.
  • hepatitis C drugs ribavirin, terapyrevir, simeprevir, vaniprevir, daclatasvir, asunaprevir, sofosbuvir, etc.
  • corticosteroids prednisolone, methylprednisolone sodium succinate, etc.
  • anticoagulants dry concentrated human antithrombin III
  • antidote calcium edetate disodium hydrate, glutathione, dimethicaprol, sodium thiosulfate hydrate, Sugamasekuna Human serum albumin, liver extract, ursodeoxycholic acid, glycyrrhizic acid, azathioprine, bezafibrate, amino acids (glycine, L-cysteine, L-isoleucine, L-leucine, L-valine, L-threonine, L-serine,
  • therapeutic agents for heart diseases include ACE inhibitors, angiotensin II receptor antagonists, ⁇ -blockers, antiplatelet agents, warfarin, calcium antagonists, nitrates, diuretics, HMG-CoA reductase inhibitors, ancalons, etc. Is mentioned.
  • Examples of the therapeutic agent for inflammatory bowel disease include salazosulfapyridine and mesalazine.
  • Examples of the respiratory medicine include dimorpholine, doxapram hydrochloride hydrate, cyberestat sodium hydrate, pirfenidone, pulmonary surfactant, and Dornase alpha.
  • Examples of the nervous system drug include edaravone, interferon beta-1a, interferon beta-1b, fingolimod hydrochloride, riluzole, tartilelin hydrate and the like.
  • circulatory drugs examples include hepronicart, midodrine hydrochloride, amedinium methylmethyl sulfate, ethylephrine hydrochloride, phenylephrine hydrochloride, and the like.
  • cerebral circulation improving drug examples include ifenprodil tartrate, nicergoline, ipdilast, dihydroergotoxin mesylate, nizophenone fumarate, fasudil hydrochloride hydrate and the like.
  • immunosuppressant examples include cyclosporine, azathioprine, mizoribine, basiliximab, tacrolimus hydrate, gusperimus hydrochloride, mycophenolate mofetil, everolimus and the like.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention contains the above-mentioned other drug, at the time of storage, it may be stored in a container different from (A) the cell and (B) the cell suspension solution. It may be contained in a form blended with. Depending on the type of disease, treatment method, patient condition, etc., other drugs and (A) cells and (B) cell suspension solutions may be administered simultaneously, or at regular intervals. Also good.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention is within a range not impairing the effects of the present invention, in addition to the above (A) cell and (B) cell suspension solution, according to its use and form, according to a conventional method, Other components such as pharmaceutically acceptable carriers and additives may be included.
  • Such carriers and additives may be contained in the (B) cell suspension solution, or may be contained separately from the (B) cell suspension solution.
  • Examples of such carriers and additives include isotonic agents, thickeners, sugars, sugar alcohols, preservatives (preservatives), bactericides or antibacterial agents, pH regulators, stabilizers, chelating agents.
  • Oily base Oily base, gel base, surfactant, suspending agent, binder, excipient, lubricant, disintegrant, foaming agent, fluidizer, dispersant, emulsifier, buffer, solubilizer , Antioxidants, sweeteners, sour agents, colorants, flavoring agents, fragrances or refreshing agents, but are not limited thereto.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can be used in various forms depending on the purpose, for example, injections (including infusions, implantable injections, continuous injections, injections prepared at the time of use), dialysis agents, patches. It can be used in the form of a poultice.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can also be applied to the affected area by spraying, and the cell pharmaceutical composition of the present invention can also be used in the form of gelation or sheeting at the affected area after spraying.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can also be applied to the affected area after the (A) cell is made into a sheet or a three-dimensional structure.
  • (A) cells, (B) cell suspension solutions, other drugs, and other components are sealed and stored in separate containers, and are used by mixing them at the time of use. Also good.
  • the above (A) cells, (B) cell suspension solution, other drugs, and other components may be stored under conditions suitable for each, for example, freezing conditions, refrigerated conditions, room temperature Any of conditions etc. may be sufficient.
  • the pH of the cell pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is within a pharmaceutically, pharmacologically (pharmaceutical) or physiologically acceptable range.
  • the range is 9.0, preferably 2.5 to 8.5, and more preferably 4.0 to 8.0.
  • the osmotic pressure of the cell pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited as long as it is within the range acceptable to the living body.
  • An example of the osmotic pressure ratio of the cell pharmaceutical composition of the present invention is preferably in the range of 0.6 to 1.5, more preferably 0.7 to 1.2, and still more preferably 0.8 to 1.0. It is done.
  • the osmotic pressure can be adjusted by a method known in the technical field using the above-described electrolyte or the like.
  • the osmotic pressure ratio is the ratio of the osmotic pressure of the sample to the osmotic pressure of 286 mOsm (0.9 w / v% sodium chloride aqueous solution) based on the 15th revised Japanese Pharmacopoeia. Measure by referring to the freezing point method.
  • the standard solution for osmotic pressure ratio measurement (0.9 w / v% sodium chloride aqueous solution) was prepared by drying sodium chloride (Japanese Pharmacopoeia standard reagent) at 500 to 650 ° C. for 40 to 50 minutes, and then in a desiccator (silica gel).
  • the mixture is allowed to cool and 0.900 g is accurately weighed and dissolved in purified water to make exactly 100 mL, or a commercially available standard solution for osmotic pressure ratio measurement (0.9 w / v% sodium chloride aqueous solution) is used.
  • the concentration of (A) cells in the cell pharmaceutical composition of the present invention is the cell type, cell suspension although it may vary depending on the solution used, it is usually 1 ⁇ 10 2 to 2.5 ⁇ 10 8 cells / mL, preferably 1 ⁇ 10 3 to 2.5 ⁇ 10 7 cells / mL, more preferably 1 ⁇ 10 4 to 2.5 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • human mesenchymal stem cells are contained in a cell suspension solution at a density of 1 ⁇ 10 4 to 2.5 ⁇ 10 6 cells / mL,
  • the turbid solution contains 125 to 150 mEq / L sodium ion, 100 to 160 mEq / L chloride ion, 3 to 5 mEq / L potassium ion and 2 to 6 mEq / L calcium ion, and has an osmotic pressure ratio of 0 to physiological saline.
  • a pH of 4.0 to 8.0 is a cell suspension solution at a density of 1 ⁇ 10 4 to 2.5 ⁇ 10 6 cells / mL.
  • the administration route to the subject of the cell pharmaceutical composition of the present invention includes subcutaneous administration, intramuscular administration, intravenous administration, intraarterial administration, intrathecal administration, intraperitoneal administration, rectal administration, vaginal administration, and transdermal administration.
  • implant, intraarterial administration, intravenous administration, and direct administration to an organ are more preferable. Are intravenous and direct administration to the organ.
  • the administration rate of the cell pharmaceutical composition of the present invention to the subject may vary depending on the patient's condition (weight, age, symptoms, physical condition, etc.) and the administration route of the non-alcoholic steatohepatitis therapeutic agent of the present invention.
  • it When administered to an adult, it is 50 mL / h to 1,000 mL / h, preferably 75 mL / h to 500 mL / h, and more preferably 100 mL / h to 250 mL / h.
  • the administration temperature of the cell pharmaceutical composition of the present invention to the subject may vary depending on the patient's condition (body weight, age, symptoms, physical condition, etc.), the administration route of the cell pharmaceutical composition of the present invention, etc. ⁇ 45 ° C., preferably 15 ° C. to 37 ° C., more preferably room temperature to 37 ° C.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject using an infusion set.
  • an infusion set a wand disposable infusion tube set (manufactured by Yoshida Seisakusho Co., Ltd.), an infusion set (manufactured by Fortegro Medical Co., Ltd.), a terfusion (registered trademark) infusion set (manufactured by Terumo Corporation), a JMS infusion Set (manufactured by JMS Co., Ltd.), Sure plug infusion set (manufactured by Terumo Corporation), Infusion set (manufactured by Nipro Corporation), Top infusion set NP (manufactured by Top Co., Ltd.), Infusion set with filter (EX type ) (Manufactured by Toray Medical Co., Ltd.) can also be used.
  • EX type Manufactured by Toray Medical Co., Ltd.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a subject using an infusion tube.
  • an infusion tube Lectro Cass (manufactured by Samick International Co., Ltd.), JMS extension tube (manufactured by JMS Co., Ltd.), Saffy extension tube (manufactured by Terumo Corporation), extension tube (manufactured by Co., Ltd.) Top product), Connecting tube (Chuatsu) (Medicos Hirata Co., Ltd.), SAFTY AP tube (manufactured by Kawasumi Chemical Industry Co., Ltd.), Bioconnector 2 with extension tube (Toray Medical Co., Ltd.), Medicut Extension Tube Set B (Nippon Sherwood) Commercially available products such as Wand Disposable Infusion Tube Set (manufactured by Yoshida Seisakusho Co., Ltd.), Infusion Tube (manufactured by Forte Grow Medical Co., Ltd.), and the like can also be used.
  • the material of the infusion tube used when administering the cell pharmaceutical composition of the present invention to a subject includes polyvinyl chloride, thermoplastic elastomer, TPE thermoplastic elastomer, silicone, silicone rubber, polyethylene, polybutadiene, Teflon (registered trademark), Polyurethane, polypropylene, natural rubber, polyolefin, PVC (plasticizer: TOTM, DOA), plasticizer PVC, and mixtures thereof can be used.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can be suitably used for the treatment of various diseases.
  • visceral diseases specifically heart disease, stomach / duodenal disease, small intestine / colon disease, liver disease, biliary disease, pancreatic disease, kidney disease, lung disease, mediastinal disease, diaphragm disease, pleural disease, peritoneal disease
  • CNS central nervous system
  • peripheral arterial diseases peripheral venous diseases.
  • Specific diseases include, for example, autoimmune hepatitis, fulminant hepatitis, chronic hepatitis, viral hepatitis, alcoholic hepatitis, nonalcoholic fatty liver disease (NAFLD), nonalcoholic steatohepatitis (Nonalcoholic steatohepatitis (NASH)), non-alcoholic fatty liver (NAFL), liver fibrosis, cirrhosis, liver cancer, fatty liver, drug allergic liver disorder, hemochromatosis, hemosiderosis, Wilson's disease, primary Hepatic diseases such as biliary cirrhosis (PBC), primary sclerosing cholangitis (PSC), biliary atresia, liver abscess, chronic active hepatitis, chronic persistent hepatitis; myocardial infarction, heart failure, arrhythmia, palpitations, cardiomyopathy, false blood Cardiomyopathy, angina, congenital heart disease, valvular heart disease, myocarditis,
  • biliary tract diseases such as acute cholecystitis, acute cholangitis, chronic cholecystitis, cholangiocarcinoma, gallbladder cancer
  • pancreatic diseases such as acute pancreatitis, chronic pancreatitis, pancreatic cancer
  • acute nephritis, chronic nephritis, acute renal failure chronic Renal diseases such as renal failure
  • Diaphragmatic diseases such as diaphragmatic hernia
  • Pleural diseases such as pleurisy, pyothorax, pleural tumor, cancerous pleurisy, pleural mesothelioma
  • Peritoneal diseases such as peritonitis, peritoneal tumor
  • Aseptic meningitis Guillain-Barre syndrome, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), myasthenia gravis, mononeuropathy, polyneuropathy, spinal muscular atrophy, spinal disorder, acute transverse myelitis, spinal cord infarction (false) Hematologic spinal cord disorder), intracranial tumor, spine
  • Neurological diseases such as tumors; CNS disorders such as Alzheimer's disease, cognitive impairment, stroke, multiple sclerosis, Parkinson's disease; fibromyalplasia, peripheral arterial disease (PAD), obstructive thromboangitis (Burger's disease), Kawasaki Peripheral arterial disease such as KD disease; deep vein
  • liver diseases, heart diseases, lung diseases, neurological diseases, peripheral arterial diseases, immunodeficiency diseases that have been confirmed to have sufficient therapeutic effects by mesenchymal stem cells are preferred, among which liver fibrosis, Suitable for the treatment of cirrhosis, myocardial infarction, heart failure, pulmonary fibrosis, interstitial pneumonia, childhood cerebral palsy, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), peripheral arterial disease (PAD), graft-versus-host disease (GVHD) And can be used more suitably for liver fibrosis, cirrhosis, myocardial infarction, heart failure, pulmonary fibrosis, and interstitial pneumonia. Moreover, it can use suitably for the cancer of each structure
  • the present invention includes (A) a cell and (B) a cell suspension solution, (B) the cell suspension solution contains Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as an electrolyte, and a sugar Also included is a disease treatment kit that is an isotonic electrolyte without quality.
  • the disease treatment kit of the present invention is a kit containing the above-described cell pharmaceutical composition of the present invention, and may contain (A) cells, (B) cell suspension solutions, and other cell pharmaceutical compositions of the present invention. The description in the section of the cell pharmaceutical composition can be applied to the components. According to the disease treatment kit of the present invention, since the state of cells can be kept good and the survival rate can be maintained high over a long period of time, an excellent therapeutic effect can be obtained for various diseases. .
  • the disease treatment kit of the present invention can also be expressed as comprising the cell pharmaceutical composition, container and label of the present invention.
  • Suitable containers included in the disease treatment kit of the present invention are not particularly limited, and examples include cryotubes for freezing cells, bottles for cell suspension solutions, vials, test tubes, and dialysis bags. These containers may be formed from a variety of materials such as glass, metal, plastic, or combinations thereof.
  • the contents on the labels on these containers describe the contents of the cells, the solution for cell suspension, and the like.
  • the disease treatment kit of the present invention includes other additives, other drugs, diluents, filters, needles, syringes, and other packages that are desirable from a commercial and user standpoint, including package inserts that describe usage. Material can be included.
  • ⁇ Cell suspension solution> Also within the scope of the present invention is a solution for cell suspension for a cell pharmaceutical composition, which is an isotonic electrolyte containing Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ as an electrolyte and free of carbohydrates. is there.
  • an isotonic electrolyte solution containing Na + , Cl ⁇ , K + and Ca 2+ and not containing carbohydrates As a cell suspension solution for cell medicine injection / infusion, It is a finding newly found by the present inventors that the survival rate can be maintained high over a long period of time.
  • the description of (B) the cell suspension solution in the section of the cell pharmaceutical composition can be applied.
  • the present invention relates to a method for treating a disease in which (A) cells are suspended in (B) a cell suspension solution and administered to a patient, and (B) the cell suspension solution contains Na + , Cl as an electrolyte.
  • the cell suspension solution contains Na + , Cl as an electrolyte.
  • - includes a K + and Ca 2+, and does not contain carbohydrates, including methods of treatment wherein the isotonic electrolyte solution.
  • the disease method of the present invention is a treatment method using the above-described cell pharmaceutical composition of the present invention, and may contain (A) cells, (B) a cell suspension solution, and other cell pharmaceutical compositions of the present invention.
  • the description in the section of the cell pharmaceutical composition can be applied to the components.
  • Example 1 Preparation of adipose-derived mesenchymal stem cells
  • the subcutaneous adipose tissue obtained by the liposuction method was washed with physiological saline.
  • collagenase (Roche diagnostics) (solvent was physiological saline) was added, shaken at 37 ° C. for 90 minutes, and dispersed. Subsequently, the suspension was centrifuged at 800 g for 5 minutes to obtain a precipitate of stromal vascular cell groups.
  • a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto) is added to the cell precipitate, the cell suspension is centrifuged at 400 g for 5 minutes, and after removal of the supernatant, a serum-free medium for mesenchymal stem cells (Rohto)
  • the cells were seeded in a flask. Cells were cultured at 37 ° C. for several days in 5% CO 2 . Several days later, the culture was washed with PBS to remove residual blood cells and adipose tissue contained in the culture solution, and mesenchymal stem cells adhered to a plastic container were obtained.
  • adipose-derived mesenchymal stem cells were dispensed into a centrifuge tube and centrifuged at 400 g for 5 minutes to obtain cell precipitates. After removing the supernatant, an appropriate amount of a cell cryopreservation solution (STEM-CELLBANKER (Zenoac)) was added and suspended. The cell suspension was dispensed into a cryotube, stored at ⁇ 80 ° C. in a freezer, transferred to a gas phase on liquid nitrogen, and storage was continued.
  • a cell cryopreservation solution STEM-CELLBANKER (Zenoac)
  • Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells were rapidly thawed in a hot water bath (37 ⁇ 1 ° C.), and then 62.5 ⁇ L of a cell suspension of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells was added. Suspended by inversion and stored at room temperature. Immediately after preparation, 1 mL was taken from the middle layer with a 5 mL syringe with a 21 G injection needle immediately after preparation, 2 hours, 4 hours, and 7 hours, and transferred to a 1.5 mL tube. .
  • Example 2 In a 15 mL centrifuge tube (Sumitomo Bakelite Co., Ltd., product number: MS-56150), Ringer's solution (Ringer's solution “Otsuka”, Otsuka Pharmaceutical Factory, Lot: K4K73), bicarbonate Ringer's solution (Bikanate (registered trademark) infusion, Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) After dispensing 5 mL each of the plant), in the same manner as in Example 1, the fat-derived mesenchymal stem cells that had been cryopreserved were rapidly thawed in a hot water bath (37 ⁇ 1 ° C.) and then the cell suspension of the fat-derived mesenchymal stem cells was The suspension was added in 62.5 ⁇ L aliquots.
  • Example 3 The fat-derived mesenchymal stem cells of Example 1 were replaced with bone marrow-derived mesenchymal stem cells (Lonza), and the same test was performed using Ringer's solution (Ringer solution “Otsuka”, Otsuka Pharmaceutical Factory, Lot: K4K73). The cell viability was calculated by measuring the number of living cells and the number of dead cells immediately after preparation, 2 hours later, 3 hours later and 7 hours later. The results are shown in Table 5 below.
  • Example 4 The fat-derived mesenchymal stem cells of Example 1 were replaced with umbilical cord-derived mesenchymal stem cells (Lifeline Cell Technology, LifeLine (registered trademark) _UCMSC, Lot. 160907), Ringer's solution (Ringer solution “Otsuka”, Otsuka Pharmaceutical Factory, Ltd., Lot : K4K73), the number of viable cells and the number of dead cells were measured immediately after preparation, 2 hours, 4 hours and 6 hours, and the cell viability was calculated in the same manner as in Example 1. . The results are shown in Table 6 below.
  • Example 5 The fat-derived mesenchymal stem cells of Example 1 were replaced with peripheral blood mononuclear cells (ACCUCELL (registered trademark) normal donor-derived PBMC, Precision Bioservices (PRECISION FOR MEDICINE), Lot. 13134-10), Ringer's solution ( The same test was conducted using Ringer's solution “Otsuka”, Otsuka Pharmaceutical Factory, Lot: K4K73), and the number of living cells and dead cells were measured immediately after preparation, 2 hours, 4 hours and 6 hours later. Cell viability was calculated. The results are shown in Table 7 below.
  • the cell pharmaceutical composition of the present invention can maintain a good cell state and maintain its survival rate in a high state for a long time, it can be expected to have an excellent therapeutic effect on various diseases.

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Abstract

本発明は、細胞の状態を良好に保ち、生存率を長時間に渡って高く維持することができる細胞医薬組成物を提供することを課題とする。 本発明は、（Ａ）細胞、及び（Ｂ）細胞懸濁用溶液を含有し、（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、細胞医薬組成物である。（Ｂ）細胞懸濁用溶液は、ＣＨ３ＣＯＯ－、ＨＣＯ３ －、クエン酸イオン及び乳酸イオンからなる群より選択される少なくとも１種の電解質をさらに含んでいてもよい。

Description

細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液
　本発明は、細胞医薬組成物、疾患治療用キット及び細胞懸濁用溶液に関する。
　細胞を含む医薬品を疾患治療に用いるための技術は年々進歩している。特にｉＰＳ細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞等の幹細胞、皮膚細胞、心筋細胞等については、基礎的な研究段階から開発段階へと移行して、現在では、実際に臨床の場で用いられているものも存在する。細胞による疾患の治療においては、細胞自体が有する機能を直接的又は間接的に疾患治療のために用いること、ダメージを受けた患者の細胞や組織の機能を、幹細胞から新たに分化させた細胞や臓器により補うこと等が期待されている。
　例えば、間葉系幹細胞は、Ｆｒｉｅｄｅｎｓｔｅｉｎ（１９８２）によって初めて骨髄から単離された多分化能を有する前駆細胞である（非特許文献１）。この間葉系幹細胞は、骨髄、臍帯、脂肪等の様々な組織に存在することが明らかにされており、間葉系幹細胞移植は、様々な難治性疾患に対する新しい治療方法として、期待されている（特許文献１～４）。最近では、脂肪組織、胎盤、臍帯、卵膜等の胎児付属物の間質細胞に同等の機能を有する細胞が存在することが知られている。従って、間葉系幹細胞を間質細胞（Ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ　Ｓｔｒｏｍａｌ　Ｃｅｌｌ）と称することもある。
特表２００２－５０６８３１号公報 特表２０００－５０８９１１号公報 特開２０１２－１５７２６３号公報 特表２０１２－５０８７３３号公報
Ｐｉｔｔｅｎｇｅｒ　Ｆ．Ｍ．ｅｔ　ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９，２８４，ｐｐ．１４３－１４７
　間葉系幹細胞等の細胞を含む医薬品においては、安全性を確保する、細胞の投与を容易にすること等を目的として、細胞を溶液に懸濁して用いることがある。間葉系幹細胞等の細胞を懸濁液として、生体内へ点滴、注射等の方法によって移入・注入する場合において、懸濁液中の細胞の生存率が徐々に低下して十分な薬理作用が得られない、細胞同士が凝集してカニューレ中に詰まる、患者の肺静脈等に塞栓を形成する等の不都合が生じることが懸念されている。そこで、本発明は、細胞の生存率を長時間に渡って高く維持することができる細胞医薬組成物を提供することを課題とする。
　上記課題を解決するために鋭意研究した結果、本発明者らは、疾患治療用の細胞をリンゲル液、酢酸リンゲル液又は重炭酸リンゲル液といった、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液に懸濁して点滴注入等を行うと、投与中の細胞の生存率低下が顕著に抑制されることを見出し、本発明に到達した。本発明によれば、細胞を含む医薬組成物が、細胞の状態を良好に保ち、生存率を長時間に渡って高く維持することができるため、様々な疾患に対して優れた治療効果を奏することができる。すなわち本発明の要旨は、以下の通りである。
［１］（Ａ）細胞、及び
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液
を含有し、
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、細胞医薬組成物。
［２］（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、ＣＨ３ＣＯＯ－、ＨＣＯ３ －、クエン酸イオン及び乳酸イオンからなる群より選択される少なくとも１種の電解質をさらに含む、［１］に記載の細胞医薬組成物。
［３］（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液及び乳酸リンゲル液からなる群より選択される少なくとも１種である、［１］又は［２］に記載の細胞医薬組成物。
［４］（Ａ）細胞が、間葉系幹細胞又は末梢血単核球である、［１］から［３］のいずれかに記載の細胞医薬組成物。
［５］上記間葉系幹細胞が、脂肪由来、臍帯由来又は骨髄由来である、［４］に記載の細胞医薬組成物。
［６］（Ａ）細胞、及び
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液
を含有し、
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、疾患治療用キット。
［７］電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、細胞医薬組成物用の細胞懸濁用溶液。
　本発明の細胞医薬組成物は、細胞の状態を良好に保ち、その生存率を長時間に渡って高い状態で維持することができるため、様々な疾患に対して優れた治療効果が期待できる。
　本発明の細胞医薬組成物、疾患治療用キット、及び注射剤用の細胞懸濁用溶液について詳細に説明する。
＜細胞医薬組成物＞
　本発明の細胞医薬組成物は、（Ａ）細胞、及び（Ｂ）細胞懸濁用溶液を含有し、（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液であることを特徴とする。なお、本発明において「細胞医薬組成物」とは、細胞を含有する医薬用の組成物であり、細胞が有する機能によって疾患に対する治療効果を奏するものをいう。本発明の細胞医薬組成物は、細胞を上記特定の溶液に懸濁することで、細胞の生存率を長時間に渡って高い状態で維持することができるため、様々な疾患に対して優れた治療効果を奏することが可能となる。本発明の細胞医薬組成物は、上記必須成分である（Ａ）細胞及び（Ｂ）細胞懸濁用溶液に加えて、疾患に対する治療効果を有する他の薬剤を含有していてもよい。さらに、本発明の効果を損なわない限り、その他の成分を含有していてもよい。以下、本発明の細胞医薬組成物が含有する（Ａ）細胞、（Ｂ）細胞懸濁用溶液、他の薬剤、その他の成分について詳細に説明する。
［（Ａ）細胞］
　本発明において（Ａ）細胞とは、疾患の治療に対する効果を奏する細胞であれば特に限定されないが、例えば間葉系幹細胞、末梢血単核球（好中球、好酸球、好塩基球、リンパ球、単球等を含む）、赤血球、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、ＮＫＭ細胞、ＬＡＫ細胞、樹状細胞、繊維芽細胞、造血幹細胞、ｉＰＳ細胞、ＥＳ細胞、骨髄細胞、心筋細胞、肝細胞、神経細胞、皮膚細胞、脂肪細胞、その他各組織を構成する細胞が挙げられる。これらのうち、後述する（Ｂ）細胞懸濁用溶液による生存率維持効果に優れるとい観点から、間葉系幹細胞、末梢血単核球、骨髄細胞が好ましい。
（間葉系幹細胞）
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系に属する一種以上、好ましくは二種以上、さらに好ましくは三種以上の細胞（骨細胞、心筋細胞、軟骨細胞、腱細胞、脂肪細胞など）への分化能を有し、当該能力を維持したまま増殖できる細胞を意味する。本発明において用いる間葉系幹細胞なる用語は、間質細胞と同じ細胞を意味し、両者を特に区別するものではない。また、単に間葉系細胞と表記される場合もある。間葉系幹細胞を含む組織としては、例えば、脂肪組織、臍帯、骨髄、臍帯血、子宮内膜、胎盤、羊膜、絨毛膜、脱落膜、真皮、骨格筋、骨膜、歯小嚢、歯根膜、歯髄、歯胚等が挙げられる。例えば脂肪組織由来間葉系幹細胞とは、脂肪組織に含有される間葉系幹細胞を意味し、脂肪由来間葉系幹細胞と称してもよい。これらのうち、各種疾患の治療に対する有効性の観点、入手容易性の観点等から、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞、胎盤由来間葉系幹細胞、歯髄由来間葉系幹細胞が好ましく、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞がより好ましい。
　本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）と同種由来であってもよいし、異種由来であってもよい。本発明における間葉系幹細胞の種として、ヒト、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ネコ、ラビット、マウス、ラットが挙げられ、好ましくは処置される対象（被検体）と同種由来細胞である。本発明における間葉系幹細胞は、処置される対象（被検体）に由来、すなわち自家細胞（同種同系）であってもよいし、同種の別の対象に由来、すなわち他家細胞（同種異系）であってもよい。好ましくは他家細胞（同種異系）である。
　間葉系幹細胞は同種異系の被験体に対しても拒絶反応を起こしにくいため、あらかじめ調製されたドナーの細胞を拡大培養して凍結保存したものを、本発明の細胞医薬組成物における（Ａ）細胞としての間葉系幹細胞として使用することができる。そのため、自己の間葉系幹細胞を調製して用いる場合と比較して、商品化も容易であり、かつ安定して一定の効果を得られ易いという観点から、本発明における間葉系幹細胞は、同種異系であることがより好ましい。
　本発明において間葉系幹細胞とは、間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が間葉系幹細胞である。
　本発明において脂肪組織とは、脂肪細胞、及び微小血管細胞等を含む間質細胞を含有する組織を意味し、例えば、哺乳動物の皮下脂肪を外科的切除又は吸引して得られる組織である。脂肪組織は、皮下脂肪より入手され得る。後述する脂肪由来間葉系幹細胞の投与対象と同種動物から入手されることが好ましく、ヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの皮下脂肪である。皮下脂肪の供給個体は、生存していても死亡していてもよいが、本発明において用いる脂肪組織は、好ましくは、生存個体から採取された組織である。個体から採取する場合、脂肪吸引は、例えば、ＰＡＬ（パワーアシスト）脂肪吸引、エルコーニアレーザー脂肪吸引、又は、ボディジェット脂肪吸引などが例示され、細胞の状態を維持するという観点から、超音波を用いないことが好ましい。
　本発明において臍帯とは、胎児と胎盤を結ぶ白い管状の組織であり、臍帯静脈、臍帯動脈、膠様組織（ウォートンジェリー；Ｗｈａｒｔｏｎ’ｓ　Ｊｅｌｌｙ）、臍帯基質自体等から構成され、間葉系幹細胞を多く含む。臍帯は、本発明の細胞医薬組成物を使用する被験体（投与対象）と同種動物から入手されることが好ましく、本発明の細胞医薬組成物をヒトへ投与することを考慮すると、より好ましくは、ヒトの臍帯である。
　本発明において骨髄とは、骨の内腔を満たしている柔組織のことをいい、造血器官である。骨髄中には骨髄液が存在し、その中に存在する細胞を骨髄細胞と呼ぶ。骨髄細胞には、赤血球、顆粒球、巨核球、リンパ球、脂肪細胞等の他、間葉系幹細胞、造血幹細胞、血管内皮前駆細胞等が含まれている。骨髄細胞は、例えば、ヒト腸骨、長管骨、又はその他の骨から採取することができる。
　本発明において、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞とは、それぞれ脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞を含む任意の細胞集団を意味する。当該細胞集団は、少なくとも２０％以上、好ましくは、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９３％、９６％、９７％、９８％又は９９％が、脂肪由来間葉系幹細胞、臍帯由来間葉系幹細胞、骨髄由来間葉系幹細胞といった各組織由来間葉系幹細胞である。
　本発明における間葉系幹細胞は、成長特徴（例えば、継代から老化までの集団倍加能力、倍加時間）、核型分析（例えば、正常な核型、母体系統又は新生児系統）、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ分析）による表面マーカー発現、免疫組織化学及び／又は免疫細胞化学（例えば、エピトープ検出）、遺伝子発現プロファイリング（例えば、遺伝子チップアレイ；逆転写ＰＣＲ、リアルタイムＰＣＲ、従来型ＰＣＲ等のポリメラーゼ連鎖反応）、ｍｉＲＮＡ発現プロファイリング、タンパク質アレイ、サイトカイン等のタンパク質分泌（例えば、血漿凝固解析、ＥＬＩＳＡ、サイトカインアレイ）、代謝産物（メタボローム解析）、本分野で知られている他の方法等によって、特徴付けられてもよい。
（間葉系幹細胞の調製方法）
　間葉系幹細胞は、当業者に周知の方法により調製することができる。以下に、一つの例として、脂肪由来間葉系幹細胞の調製方法を説明する。脂肪由来間葉系幹細胞は、例えば米国特許第６，７７７，２３１号に記載の製造方法によって得られて良く、例えば、以下の工程（i）～（iii）を含む方法で製造することができる：
（i）　脂肪組織を酵素による消化により細胞懸濁物を得る工程；
（ii）　細胞を沈降させ、細胞を適切な培地に再懸濁する工程；ならびに
（iii）　細胞を固体表面で培養し、固体表面への結合を示さない細胞を除去する工程。
　工程（i）において用いる脂肪組織は、洗浄されたものを用いることが好ましい。洗浄は、生理学的に適合する生理食塩水溶液（例えばリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ））を用いて、激しく攪拌して沈降させることによって行い得る。これは、脂肪組織に含まれる夾雑物　（デブリとも言い、例えば損傷組織、血液、赤血球など）を組織から除去するためである。したがって、洗浄及び沈降は一般に、上清からデブリが総体的に除去されるまで繰り返される。残存する細胞は、さまざまなサイズの塊として存在するので、細胞そのものの損傷を最小限に抑えながら解離させるため、洗浄後の細胞塊を、細胞間結合を弱めるか、又は破壊する酵素（例えば、コラゲナーゼ、ディスパーゼ又はトリプシンなど）で処理することが好ましい。このような酵素の量及び処理期間は、使用される条件に依存して変わるが、当技術分野で既知である。このような酵素処理に代えて、又は併用して、細胞塊を、機械的な攪拌、超音波エネルギー、熱エネルギーなどの他の処理法で分解することができるが、細胞の損傷を最小限に抑えるため、酵素処理のみで行うことが好ましい。酵素を用いた場合、細胞に対する有害な作用を最小限に抑えるために、適切な期間をおいた後に培地等を用いて酵素を失活させることが望ましい。
　工程（i）により得られる細胞懸濁物は、凝集状の細胞のスラリー又は懸濁物、ならびに各種夾雑細胞、例えば赤血球、平滑筋細胞、内皮細胞、及び線維芽細胞を含む。従って、続いて凝集状態の細胞とこれらの夾雑細胞を分離、除去してもよいが、後述する工程（iii）での接着及び洗浄により、除去可能であることから、当該分離、除去は割愛してもよい。夾雑細胞を分離、除去する場合、細胞を上清と沈殿に強制的に分ける遠心分離によって達成しえる。得られた夾雑細胞を含む沈殿は、生理学的に適合する溶媒に懸濁させる。懸濁状の細胞には、赤血球を含む恐れがあるが、後述する個体表面への接着による選択により、赤血球は除外されるため、溶解する工程は必ずしも必要ではない。赤血球を選択的に溶解する方法として、例えば、塩化アンモニウムによる溶解による高張培地又は低張培地中でのインキュベーションなど、当技術分野で周知の方法を使用することができる。溶解後、例えば濾過、遠心沈降、又は密度分画によって溶解物を所望の細胞から分離してもよい。
　工程（ii）において、懸濁状の細胞において、間葉系幹細胞の純度を高めるために、１回もしくは連続して複数回洗浄し、遠心分離し、培地に再懸濁してもよい。この他にも、細胞を、細胞表面マーカープロファイルを基に、又は細胞のサイズ及び顆粒性を基に分離してもよい。
　再懸濁において用いる培地は、間葉系幹細胞を培養できる培地であれば、特に限定されないが、このような培地は、基礎培地に、血清を添加する、及び／又は、アルブミン、トランスフェリン、脂肪酸、インスリン、亜セレン酸ナトリウム、コレステロール、コラーゲン前駆体、微量元素、２－メルカプトエタノール、３’－チオールグリセロール等の１つ以上の血清代替物を添加して作製してもよい。これらの培地には、必要に応じて、さらに脂質、アミノ酸、タンパク質、多糖、ビタミン、増殖因子、低分子化合物、抗生物質、抗酸化剤、ピルビン酸、緩衝剤、無機塩類等の物質を添加してもよい。
　上記基礎培地としては、例えば、ＩＭＤＭ培地、Ｍｅｄｉｕｍ　１９９培地、Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｉｎｉｍｕｍ　Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＥＭＥＭ）培地、αＭＥＭ培地、Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ’ｓ　Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ）培地、Ｈａｍ’ｓ　Ｆ１２培地、ＲＰＭＩ　１６４０培地、Ｆｉｓｃｈｅｒ’ｓ培地、ＭＣＤＢ２０１培地及びこれらの混合培地等が挙げられる。
　上記血清としては、例えば、ヒト血清、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清、仔ウシ血清、ヤギ血清、ウマ血清、ブタ血清、ヒツジ血清、ウサギ血清、ラット血清等が挙げられるがこれらに限定されない。血清を用いる場合、基礎培地に対して、５ｖ／ｖ％から１５ｖ／ｖ％、好ましくは、１０ｖ／ｖ％を添加してもよい。
　上記脂肪酸としては、リノール酸、オレイン酸、リノレイン酸、アラキドン酸、ミリスチン酸、パルミトイル酸、パルミチン酸、及びステアリン酸等が例示されるが、これらに限定されない。脂質は、フォスファチジルセリン、フォスファチジルエタノールアミン、フォスファチジルコリン等が例示されるが、これらに限定されない。アミノ酸は、例えば、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－シスチン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシンなどを含むがこれらに限定されない。タンパク質は、例えば、エコチン、還元型グルタチオン、フィブロネクチン及びβ２－ミクログロブリン等が例示されるが、これらに限定されない。多糖は、グリコサミノグリカンが例示され、グリコサミノグリカンのうち特に、ヒアルロン酸、ヘパラン硫酸等が例示されるが、これらに限定されない。増殖因子は、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ－β）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、結合組織増殖因子（ＣＴＧＦ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）等が例示されるが、これらに限定されない。本発明において得られる脂肪由来間葉系幹細胞を細胞移植に用いるという観点から、血清等の異種由来成分を含まない（ゼノフリー）培地を用いることが好ましい。このような培地は、例えば、ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ社、Ｌｏｎｚａ社、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｄｕｓｔｒｉｅｓ社、Ｖｅｒｉｔａｓ社、Ｒ＆Ｄ　Ｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｃｏｒｎｉｎｇ社及びＲｏｈｔｏ社などから間葉系幹細胞（間質細胞）用として予め調製された培地として提供されている。
　続いて、工程（iii）では、工程（ii）で得られた細胞懸濁液中の細胞を分化させずに固体表面上で、上述の適切な細胞培地を使用して、適切な細胞密度及び培養条件で培養する。本発明において、「固体表面」とは、本発明における脂肪由来間葉系幹細胞の結合・接着を可能とする任意の材料を意味する。特定の態様では、このような材料は、その表面への哺乳類細胞の結合・接着を促すように処理されたプラスチック材料である。固体表面を有する培養容器の形状は特に限定されないが、シャーレやフラスコなどが好適に用いられる。非結合状態の細胞及び細胞の破片を除去するために、インキュベーション後に細胞を洗浄する。
　本発明では、最終的に固体表面に結合・接着した状態で留まる細胞を、脂肪由来間葉系幹細胞の細胞集団として選択することができる。
　選択された細胞について、本発明における脂肪由来間葉系幹細胞であることを確認するために、表面抗原についてフローサイトメトリー等を用いて従来の方法で解析してもよい。さらに、各細胞系列に分化する能力について検査してもよく、このような分化は、従来の方法で行うことができる。
　本発明における間葉系幹細胞は、上述の通り調製することができるが、次の特性を持つ細胞として定義してもよい；
（１）標準培地での培養条件で、プラスチックに接着性を示す、
（２）表面抗原ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０が陽性であり、ＣＤ３１、ＣＤ４５が陰性であり、及び
（３）培養条件にて骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞に分化可能。
（末梢血単核球）
　本発明において末梢血単核球細胞とは、ヒト又は動物の末梢血から取得される、リンパ球、好中球、好酸球、好塩基球、単球を含む分画をいう。末梢血単核球は、末梢血からＦｉｃｏｌｌ－ｈｙｐａｑｕｅ（登録商標）等を用いた密度勾配遠心法により分離することができる。本発明における（Ａ）細胞としての末梢血単核球は、末梢血から分離した状態の細胞でもよいし、それらを必要に応じて、各種因子、低分子化合物、抗体等と共に培養等することで、増殖・活性化させたものであってもよい。
（（Ａ）細胞の凍結保存）
　本発明における（Ａ）細胞は、各種疾患に対する治療効果を備えていれば、適宜、凍結保存及び融解を繰り返した細胞であってもよい。本発明において、凍結保存は、当業者に周知の凍結保存液で（Ａ）細胞を懸濁し、冷却することによって行い得る。懸濁は、細胞を、必要に応じてトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、凍結保存容器に移し、適宜処理した後、凍結保存液を加えることによって行い得る。
　凍結保存液は、凍害防御剤として、ＤＭＳＯ（Ｄｉｍｅｔｈｙｌ　ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）を含有していてもよいが、ＤＭＳＯは、細胞毒性を有することから、ＤＭＳＯ含有量を減らすことが好ましい。なお、ＤＭＳＯは間葉系幹細胞に対しては、分化誘導する特性を有することも知られている。ＤＭＳＯの代替物として、グリセロール、プロピレングリコール又は多糖類が例示される。ＤＭＳＯを用いる場合、５％～２０％の濃度、好ましくは５％～１０％の濃度、より好ましくは１０％の濃度を含有する。この他にも、ＷＯ２００７／０５８３０８に記載の添加剤を含んでもよい。このような凍結保存液として、例えば、バイオベルデ社、日本ジェネティクス株式会社、リプロセル社、ゼノアック社、コスモ・バイオ社、コージンバイオ株式会社、サーモフィッシャーサイエンティフィック社等から提供されている凍結保存液を用いてもよい。
　上述の懸濁した細胞を凍結保存する場合、－８０℃～－１００℃の間の温度（例えば、－８０℃）で保管することで良く、当該温度に達成しえる任意のフリーザーを用いて行い得る。特に限定されないが、急激な温度変化を回避するため、プログラムフリーザーを用いて、冷却速度を適宜制御してもよい。冷却速度は、凍結保存液の成分によって適宜選択しても良く、凍結保存液の製造者指示に従って行われ得る。
　保存期間は、上記条件で凍結保存した細胞が融解した後、凍結前と同等の性質を保持している限り、特に上限は限定されないが、例えば、１週間以上、２週間以上、３週間以上、４週間以上、２か月以上、３か月以上、４か月以上、５か月以上、６か月以上、１年以上、又はそれ以上が挙げられる。より低い温度で保存することで細胞障害を抑制することができるため、液体窒素上の気相（約－１５０℃以下から－１８０℃以下）へ移して保存してもよい。液体窒素上の気相で保存する場合、当業者に周知の保存容器を用いて行うことができる。特に限定されないが、例えば、２週間以上保存する場合、液体窒素上の気相で保存することが好ましい。
　融解した（Ａ）細胞は、次の凍結保存までに適宜培養してもよい。例えば、間葉系幹細胞の培養は、上述した間葉系幹細胞を培養できる培地を用いて行われ、特に限定されないが、約３０～４０℃、好ましくは約３７℃の培養温度で、ＣＯ２含有空気の雰囲気下で行われてもよい。ＣＯ２濃度は、約２～５％、好ましくは約５％である。培養において、培養容器に対して適切なコンフルエンシー（例えば、培養容器に対して、５０％から８０％を細胞が占有することが挙げられる）に達した後に、細胞をトリプシンなどの剥離剤によって剥離し、別途用意した培養容器に適切な細胞密度で播種して培養を継続してもよい。細胞を播種する際において、典型的な細胞密度として、１００細胞／ｃｍ２～１００，０００細胞／ｃｍ２、５００細胞／ｃｍ２～５０，０００細胞／ｃｍ２、１，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２、２，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２などが例示される。特定の態様では、細胞密度は２，０００～１０，０００細胞／ｃｍ２である。適切なコンフルエンシーに達するまでの期間が、３日間から７日間となるように調整することが好ましい。培養中、必要に応じて、適宜、培地を交換してもよい。
　凍結保存した細胞の融解は、当業者に周知の方法によって行い得る。例えば、３７℃の恒温槽内又は湯浴中にて静置又は振とうすることによって行う方法が例示される。
（（Ａ）細胞の形態）
　本発明の細胞医薬組成物が含有する（Ａ）細胞は、いずれの状態の細胞であってもよく、例えば培養中の細胞を剥離して回収された細胞でもよいし、凍結保存液中に凍結された状態の細胞でもよい。拡大培養して得られる同ロットの細胞を小分けして凍結保存したものを使用すると、安定して同様の作用効果が得られる点、取扱い性に優れる点等において好ましい。
　凍結保存状態の（Ａ）細胞は、使用直前に融解し、凍結保存液に懸濁したまま後述する（Ｂ）細胞懸濁用溶液に直接混合してもよい。また、遠心分離等の方法により凍結保存液を除去してから（Ｂ）細胞懸濁用溶液に懸濁してもよい。
　本発明の（Ａ）細胞の用量（投与量）は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び剤形等によって異なりうるが、十分な治療効果を奏する観点からは、その量は多い方が好ましい傾向にあり、一方、副作用の発現を抑制する観点からはその量は少ない方が好ましい傾向にある。通常、成人に投与する場合には、細胞数として、１ｘ１０３～１ｘ１０１２個／回、好ましくは１ｘ１０４～１ｘ１０１１個／回、更に好ましくは１ｘ１０５～１ｘ１０１０個／回、特に好ましくは５ｘ１０６～１ｘ１０９個／回である。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。
　本発明の（Ａ）細胞の用量（投与量）は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の組成物の剤形等によって異なりうるが、通常、成人に投与する場合には、細胞数として、１ｘ１０～５ｘ１０１０個／ｋｇ、好ましくは１ｘ１０２～５ｘ１０９個／ｋｇ、更に好ましくは１ｘ１０３～５ｘ１０８個／ｋｇ、特に好ましくは１ｘ１０４～５ｘ１０７個／ｋｇである。なお、本用量を１回量として、複数回投与してもよく、本用量を複数回に分けて投与しても良い。
［（Ｂ）細胞懸濁用溶液］
　本発明の（Ｂ）細胞懸濁用溶液は、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である。（Ｂ）細胞懸濁用溶液は、ＣＨ３ＣＯＯ－、ＨＣＯ３ －、クエン酸イオン及び乳酸イオンからなる群より選択される少なくとも１種の電解質をさらに含んでいてもよい。（Ｂ）細胞懸濁用溶液は、生体における細胞外液補液効果を有する等張性電解質輸液製剤ともいえ、具体的には、リンゲル液、酢酸リンゲル液重炭酸リンゲル液及び乳酸リンゲル液からなる群より選択される少なくとも１種を好ましいものとして挙げられる。このような組成の（Ｂ）細胞懸濁用溶液を採用することで、本発明の細胞医薬組成物においては（Ａ）細胞の状態を良好に保ち、その生存率を長時間に渡って高い状態で維持することができる。
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液としては、糖質を含まず、かつ電解質としてＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ－を含み、Ｎａ＋が１４０ｍＥｑ／Ｌ～１６０ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃａ２＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ－が１４０ｍＥｑ／Ｌ～１７０ｍＥｑ／Ｌであるリンゲル液を好ましいものとして挙げることができる。上記リンゲル液は各電解質を上記濃度範囲として調製することができるが、リンゲル液「オーツカ」（日局リンゲル液、株式会社大塚製薬工場）、リンゲル液「フソー」（日局リンゲル液、扶桑薬品工業株式会社）等の市販品を用いることもできる。
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液としては、糖質を含まず、かつ電解質としてＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ－、ＣＨ３ＣＯＯ－を含み、Ｎａ＋が１２０ｍＥｑ／Ｌ～１４０ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃａ２＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ－が９０ｍＥｑ／Ｌ～１３０ｍＥｑ／Ｌ、ＣＨ３ＣＯＯ－が１０ｍＥｑ／Ｌ～４０ｍＥｑ／Ｌである酢酸リンゲル液を好ましいものとして挙げることができる。上記酢酸リンゲル液は各電解質を上記濃度範囲として調製することができるが、ヴィーン（登録商標）Ｆ輸液（興和株式会社）、ソリューゲン（登録商標）Ｆ注（共和クリティケア株式会社）、ソルアセト（登録商標）Ｆ輸液（テルモ株式会社）等の市販品を用いることもできる。
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液としては、糖質を含まず、かつ電解質としてＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｃｌ－、ＨＣＯ３ －、クエン酸イオン（Ｃｉｔｒａｔｅ３＋）を含み、それぞれの電解質濃度は、Ｎａ＋が１２０ｍＥｑ／Ｌ～１４５ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃａ２＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｍｇ２＋が０．１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ－が９５ｍＥｑ／Ｌ～１３５ｍＥｑ／Ｌ、ＨＣＯ３ －が１０ｍＥｑ／Ｌ～４０ｍＥｑ／Ｌ、クエン酸イオン（Ｃｉｔｒａｔｅ３＋）が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌである重炭酸リンゲル液を好ましいものとして挙げることができる。上記重炭酸リンゲル液は各電解質を上記濃度範囲として調製することができるが、ビカネイト（登録商標）輸液（株式会社大塚製薬工場）、ビカーボン（登録商標）輸液（エイワイファーマ株式会社）等の市販品を用いることもできる。
　（Ｂ）細胞懸濁用溶液としては、糖質を含まず、かつ電解質としてＮａ＋、Ｋ＋、Ｃａ２＋、Ｃｌ－、乳酸イオン（Ｌａｃｔａｔｅ－）を含み、それぞれの電解質濃度は、Ｎａ＋が１２０ｍＥｑ／Ｌ～１４０ｍＥｑ／Ｌ、Ｋ＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃａ２＋が１ｍＥｑ／Ｌ～１０ｍＥｑ／Ｌ、Ｃｌ－が９０ｍＥｑ／Ｌ～１３０ｍＥｑ／Ｌ、Ｌａｃｔａｔｅ－が１５ｍＥｑ／Ｌ～４５ｍＥｑ／Ｌである乳酸リンゲル液を好ましいものとして挙げることができる。上記乳酸リンゲル液は各電解質を上記濃度範囲として調製することができるが、ソルラクト（登録商標）輸液（テルモ株式会社）、ニソリ（登録商標）輸液（マイラン製薬株式会社）、ハルトマン液「コバヤシ」（共和クリティケア株式会社）、ハルトマン輸液「ＮＰ」（ニプロ株式会社）、ハルトマン輸液ｐＨ８「ＮＰ」（ニプロ株式会社）、ラクテック（商標登録）注（株式会社大塚製薬工場）、ラクトリンゲル液“フソー”（扶桑薬品工業株式会社）等の市販品を用いることもできる。
［他の薬剤］
　本発明の細胞医薬組成物は、１又は２以上の、疾患に対する治療効果を有する他の薬剤を含有してもよい。他の薬剤としては、肝疾患治療薬、心疾患治療薬、炎症性腸疾患治療薬、呼吸器用薬、神経系用薬、循環器用薬、脳循環改善薬、免疫抑制薬として用いることができる任意の薬剤が挙げられる。
　肝疾患治療薬としては、例えば、Ｂ型肝炎治療薬（ラミブジン、アデホビル、エンテカビル、テノホビル等）、インターフェロン製剤（インターフェロンα、インターフェロンα－２ｂ、インターフェロンβ、ペグインターフェロンα－２ａ、ペグインターフェロンα－２ｂ等）、Ｃ型肝炎治療薬（リバビリン、テラピレビル、シメプレビル、バニプレビル、ダクラタスビル、アスナプレビル、ソホスブビル等）、副腎皮質ステロイド（プレドニゾロン、メチルプレドニゾロンコハク酸エステルナトリウム等）、抗凝固剤（乾燥濃縮人アンチトロンビンIII、ガベキサートメシル酸塩、トロンボモデュリンα等）、解毒剤（エデト酸カルシウム二ナトリウム水和物、グルタチオン、ジメチカプロール、チオ硫酸ナトリウム水和物、スガマデスクナトリウム等）、人血清アルブミン、肝臓抽出エキス、ウルソデオキシコール酸、グリチルリチン酸、アザチオプリン、ベザフィーブラート、アミノ酸（グリシン、Ｌ－システイン、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－バリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－セリン、Ｌ－アラニン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－リシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－アルギニン及びこれらの塩等）、ビタミン（トコフェロール、フラビンアデニンジヌクレオチド、リン酸チアミンジスルフィド、ピリドキシン、シアノコバラミン及びこれらの塩等）、抗生物質（スルバクタムナトリウム、セフォペラゾンナトリウム、メロペネム水和物、塩酸バンコマイシン等）等が挙げられる。
　心疾患治療薬としては、例えば、ＡＣＥ阻害薬、アンギオテンシンII受容体拮抗薬、β遮断薬、抗血小板薬、ワーファリン、カルシウム拮抗薬、硝酸薬、利尿剤、ＨＭＧ－ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンカロン等が挙げられる。
　炎症性腸疾患治療薬としては、例えば、サラゾスルファピリジン、メサラジン等が挙げられる。
　呼吸器用薬としては、例えば、ジモルホラミン、ドキサプラム塩酸塩水和物、シベレスタットナトリウム水和物、ピルフェニドン、肺サーファクタント、ドルナーゼ　アルファ等が挙げられる。
　神経系用薬としては、例えば、エダラボン、インターフェロンベータ－１ａ、インターフェロンベータ－１ｂ、フィンゴリモド塩酸塩、リルゾール、タルチレリン水和物等が挙げられる。
　循環器用薬としては、例えば、ヘプロニカート、ミドドリン塩酸塩、アメジニウムメチルメチル硫酸塩、エチレフリン塩酸塩、フェニレフリン塩酸塩等が挙げられる。
　脳循環改善薬としては、例えば、イフェンプロジル酒石酸塩、ニセルゴリン、イプジラスト、ジヒドロエルゴトキシンメシル酸塩、ニゾフェノンフマル酸塩、ファスジル塩酸塩水和物等が挙げられる。
　免疫抑制薬としては、例えば、シクロスポリン、アザチオプリン、ミゾリビン、バシリキシマブ、タクロリムス水和物、グスペリムス塩酸塩、ミコフェノール酸モフェチル、エベロリムス等が挙げられる。
　上記他の薬剤を本発明の細胞医薬組成物が含有する場合、保存時には、（Ａ）細胞、（Ｂ）細胞懸濁用溶液とは別の容器中に保存されていてもよいし、いずれかに配合される形で含有されていてもよい。疾患の種類、治療方法、患者の状態等により、他の薬剤と、（Ａ）細胞及び（Ｂ）細胞懸濁用溶液とを同時に投与してもよいし、一定の間隔をあけて投与してもよい。
　本発明の細胞医薬組成物は、本発明の効果を損なわない範囲であれば、上記（Ａ）細胞及び（Ｂ）細胞懸濁用溶液以外に、その用途や形態に応じて、常法に従い、薬学的に許容される担体や添加物等のその他の成分を含有させてもよい。このような担体や添加物は、（Ｂ）細胞懸濁用溶液に含有させてもよいし、（Ｂ）細胞懸濁用溶液とは別に含有させてもよい。このような担体や添加物としては、例えば、等張化剤、増粘剤、糖類、糖アルコール類、防腐剤（保存剤）、殺菌剤又は抗菌剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、キレート剤、油性基剤、ゲル基剤、界面活性剤、懸濁化剤、結合剤、賦形剤、滑沢剤、崩壊剤、発泡剤、流動化剤、分散剤、乳化剤、緩衝剤、溶解補助剤、抗酸化剤、甘味剤、酸味剤、着色剤、呈味剤、香料又は清涼化剤等が挙げられるが、これらに限定されない。
　本発明の細胞医薬組成物は、目的に応じて種々の形態、例えば、注射剤（輸液剤、埋め込み注射剤、持続性注射、用時調製型の注射剤を含む）、透析用剤、貼付剤、パップ剤等の形態で利用できる。本発明の細胞医薬組成物は噴霧により、患部に適用することもでき、本発明の細胞医薬組成物は噴霧した後に患部でゲル化もしくはシート化される形態でも利用できる。本発明の細胞医薬組成物は上記（Ａ）細胞をシート状または立体構造体とした後に、患部に適用することもできる。
　本発明の細胞医薬組成物は、（Ａ）細胞、（Ｂ）細胞懸濁用溶液、他の薬剤、その他の成分が別々の容器に封入されて保管され、使用時にこれらを混合して用いてもよい。なお、保管の際、上記（Ａ）細胞、（Ｂ）細胞懸濁用溶液、他の薬剤、その他の成分はそれぞれに適した条件で保管されていればよく、例えば凍結条件、冷蔵条件、室温条件等いずれであってもよい。
　本発明の細胞医薬組成物のｐＨは、医薬上、薬理学的に（製薬上）又は生理学的に許容される範囲内であれば特に限定されるものではないが、一例として、２．０～９．０、好ましくは２．５～８．５、より好ましくは４．０～８．０となる範囲が挙げられる。
　本発明の細胞医薬組成物の浸透圧については、生体に許容される範囲内であれば、特に制限されない。本発明の細胞医薬組成物の浸透圧比の一例として、好ましくは０．６～１．５、より好ましくは０．７～１．２、さらに好ましくは０．８～１．０となる範囲が挙げられる。浸透圧の調整は上述した電解質等を用いて、当該技術分野で既知の方法で行うことができる。浸透圧比は、第十五改正日本薬局方に基づき２８６ｍＯｓｍ（０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液）の浸透圧に対する試料の浸透圧の比とし、浸透圧は日本薬局方記載の浸透圧測定法（氷点降下法）を参考にして測定する。なお、浸透圧比測定用標準液（０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液）は、塩化ナトリウム（日本薬局方標準試薬）を５００～６５０℃で４０～５０分間乾燥した後、デシケーター（シリカゲル）中で放冷し、その０．９００ｇを正確に量り、精製水に溶かし正確に１００ｍＬとして調製するか、市販の浸透圧比測定用標準液（０．９ｗ／ｖ％塩化ナトリウム水溶液）を用いる。
　本発明の細胞医薬組成物における（Ａ）細胞の濃度、即ち（Ａ）細胞を（Ｂ）細胞懸濁用溶液に懸濁して調製し投与に用いる際の濃度は、細胞の種類、細胞懸濁用溶液によって異なりうるが、通常、１ｘ１０２～２．５ｘ１０８個／ｍＬ、好ましく１ｘ１０３～２．５ｘ１０７個／ｍＬ、より好ましくは１ｘ１０４～２．５ｘ１０６個／ｍＬである。
　本発明の細胞医薬組成物の好ましい一形態としては、ヒト間葉系幹細胞を細胞懸濁用溶液中に１×１０４～２．５×１０６個／ｍＬの密度で含んでなり、細胞懸濁用溶液が１２５～１５０ｍＥｑ／Ｌのナトリウムイオン、１００～１６０ｍＥｑ／Ｌの塩素イオン、３～５ｍＥｑ／Ｌのカリウムイオン及び２～６ｍＥｑ／Ｌのカルシウムイオンを含み、生理食塩水に対する浸透圧比が０．８～１．０であり、ｐＨが４．０～８．０のものである。
　本発明の細胞医薬組成物の対象への投与経路は、皮下投与、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、髄腔内投与、腹腔内投与、経直腸投与、経腟投与、経皮投与、インプラント、臓器への直接投与等が挙げられるが、本発明の細胞医薬組成物の有効性の観点から、好ましくはインプラント、動脈内投与、静脈内投与及び臓器への直接投与であり、更に好ましくは静脈内投与及び臓器への直接投与である。
　本発明の細胞医薬組成物の対象への投与速度は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の非アルコール性脂肪肝炎治療剤の投与経路等によって異なりうるが、通常、成人に投与する場合には、５０ｍＬ／ｈ～１，０００ｍＬ／ｈであり、７５ｍＬ／ｈ～５００ｍＬ／ｈであることが好ましく、１００ｍＬ／ｈ～２５０ｍＬ／ｈであることがより好ましい。
　本発明の細胞医薬組成物の対象への投与温度は、患者の状態（体重、年齢、症状、体調等）、及び本発明の細胞医薬組成物の投与経路等によって異なりうるが、通常、４℃～４５℃であり、１５℃～３７℃であることが好ましく、室温～３７℃であることがより好ましい。
　本発明の細胞医薬組成物は、輸液セットを用いて、対象への投与を行う事ができる。具体的に輸液セットとしては、ワンド・ディスポーザブル輸液チューブセット（株式会社吉田製作所製）、輸液セット（フォルテグロウメディカル株式会社製）、テルヒュージョン（登録商標）輸液セット（テルモ株式会社製）、ＪＭＳ輸液セット（株式会社ジェイ・エム・エス製）、シュアプラグ輸液セット（テルモ株式会社製）、輸液セット（ニプロ株式会社製）、トップ輸液セットＮＰ（株式会社トップ製）、フィルター付き輸液セット（ＥＸタイプ）（東レ・メディカル株式会社製）等の市販品を用いることもできる。
　本発明の細胞医薬組成物は、輸液チューブを用いて、対象への投与を行う事ができる。具体的に輸液チューブとしては、レクトロ・キャス（株式会社サミック・インターナショナル製）、ＪＭＳエキステンションチューブ（株式会社ジェイ・エム・エス製）、サフィード延長チューブ（テルモ株式会社製）、延長チューブ（株式会社トップ製）、コネクティングチューブ（チュウアツ）（株式会社メディコスヒラタ）、サフティＡＰチューブ（川澄化学工業株式会社製）、延長チューブ付ビオネクター２（東レ・メディカル株式会社）、メディカットエクステンションチューブセット　Ｂ（日本シャーウッド株式会社製）、ワンド・ディスポーザブル輸液チューブセット（株式会社吉田製作所製）、輸液チューブ（フォルテグロウメディカル株式会社製）等の市販品を用いることもできる。
　本発明の細胞医薬組成物を対象へ投与する際に用いる輸液チューブの材質としては、ポリ塩化ビニル、熱可塑性エラストマー、ＴＰＥ　熱可塑性エラストマー、シリコーン、シリコーンゴム、ポリエチレン、ポリブタジエン、テフロン（登録商標）、ポリウレタン、ポリプロピレン、天然ゴム、ポリオレフィン、ＰＶＣ（可塑剤：ＴＯＴＭ、ＤＯＡ）、無可塑剤ＰＶＣ及びこれらの混合物を用いることができる。
　本発明の細胞医薬組成物は、種々の疾患の治療に好適に用いることができる。例えば、内臓疾患、具体的には、心疾患、胃・十二指腸疾患、小腸・大腸疾患、肝疾患、胆道疾患、膵疾患、腎疾患、肺疾患、縦隔膜疾患、横隔膜疾患、胸膜疾患、腹膜疾患、神経疾患、中枢神経系（ＣＮＳ）障害、末梢動脈疾患、末梢静脈疾患に対して用いることが好ましい。
　具体的疾患としては、例えば、自己免疫性肝炎、劇症肝炎、慢性肝炎、ウイルス性肝炎、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ））、非アルコール性脂肪肝炎（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ（ＮＡＳＨ））、非アルコール性脂肪肝（ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ　ｆａｔｔｙ　ｌｉｖｅｒ　（ＮＡＦＬ））、肝線維症、肝硬変、肝癌、脂肪肝、薬剤アレルギー性肝障害、ヘモクロマトーシス、ヘモジデローシス、ウィルソン病、原発性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、胆道閉鎖、肝膿瘍、慢性活動性肝炎、慢性持続性肝炎等の肝疾患；心筋梗塞、心不全、不整脈、動悸、心筋症、虚血性心筋症、狭心症、先天性心疾患、心臓弁膜症、心筋炎、家族性肥大型心筋症、拡張型心筋症、急性冠症候群、アテローム血栓症、再狭窄等の心疾患；急性胃炎、慢性胃炎、胃・十二指腸潰瘍、胃癌、十二指腸癌等の胃・十二指腸疾患；虚血性腸炎、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、Ｃｒｏｈｎ病、単純性潰瘍、腸管ベーチェット病、小腸癌、大腸癌等の小腸・大腸疾患；急性胆嚢炎、急性胆管炎、慢性胆嚢炎、胆管癌、胆嚢癌等の胆道疾患；急性膵炎、慢性膵炎、膵癌等の膵疾患；急性腎炎、慢性腎炎、急性腎不全、慢性腎不全等の腎疾患；肺炎、肺気腫、肺線維症、間質性肺炎、特発性間質性肺炎、剥離性間質性肺炎、急性間質性肺炎、非特異的間質性肺炎、薬物誘発性肺疾患、好酸球性肺疾患、肺高血圧症、肺結核、肺結核後遺症、急性呼吸窮迫症候群、嚢胞性線維症、慢性閉塞性肺疾患、肺塞栓症、肺膿症、塵肺、嚥下性肺炎肺線維症、急性上気道感染症、慢性下気道感染症、気胸、肺胞上皮に傷害が見られる疾患、リンパ管平滑筋種、リンパ性間質性肺炎、肺胞蛋白症、肺ランゲルハンス細胞肉芽腫症等の肺疾患；縦隔腫瘍、縦隔の嚢胞性疾患、縦隔炎等の縦隔膜疾患；横隔膜ヘルニア等の横隔膜疾患；胸膜炎、膿胸、胸膜腫瘍、がん性胸膜炎、胸膜中皮腫等の胸膜疾患；腹膜炎、腹膜腫瘍等の腹膜疾患；小児脳性麻痺を含む脳性麻痺症候群、無菌性髄膜炎、ギランーバレー症候群、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、重症筋無力症、モノニューロパシー、多発ニューロパシー、脊髄性筋萎縮症、脊椎障害、急性横断性脊髄炎、脊髄梗塞（虚血性脊髄障害）、頭蓋内腫瘍、脊椎腫瘍等の神経疾患；Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ病、認知障害、脳卒中、多発性硬化症、Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ病等のＣＮＳ障害；線維筋性異形成、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、閉塞性血栓血管炎（ビュルガー病）、川崎病（ＫＤ）等の末梢動脈疾患；深部静脈血栓症、慢性静脈不全、静脈炎後症候群、表在性静脈血栓症等の末梢静脈疾患；移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、続発性免疫不全症、原発性免疫不全疾患、Ｂ細胞の欠損、Ｔ細胞不全、ＢおよびＴ細胞複合欠損、食細胞欠損、古典経路における補体欠損、ＭＢＬ経路における補体欠損、代替経路における補体欠損、補体調節蛋白欠損、補体レセプター欠損等の免疫不全疾患が挙げられる。
　これらのうち、間葉系幹細胞による治療効果が十分に得られることが確認されている肝疾患、心疾患、肺疾患、神経疾患、末梢動脈疾患、免疫不全疾患が好ましく、中でも、肝線維症、肝硬変、心筋梗塞、心不全、肺線維症、間質性肺炎、小児脳性麻痺、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）の治療により好適に用いることができ、肝線維症、肝硬変、心筋梗塞、心不全、肺線維症、間質性肺炎にさらに好適に用いることができる。また、末梢血単核球による治療効果が十分に得られることが確認されている各組織の癌に好適に用いることができる。
＜疾患治療用キット＞
　本発明は、（Ａ）細胞、及び（Ｂ）細胞懸濁用溶液を含有し、（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、疾患治療用キットも含む。本発明の疾患治療用キットは、上述した本発明の細胞医薬組成物を含むキットであり、（Ａ）細胞、（Ｂ）細胞懸濁用溶液、その他本発明の細胞医薬組成物が含有し得る成分については細胞医薬組成物の項における説明を適用できる。本発明の疾患治療用キットによれば、細胞の状態を良好に保ち、生存率を長時間に渡って高く維持することができるため、様々な疾患に対して優れた治療効果を奏することができる。
　また、本発明の疾患治療用キットは、本発明の細胞医薬組成物、容器及びラベルを含むものであると表現することもできる。本発明の疾患治療用キットが含む適切な容器としては、特に限定されないが、例えば、細胞凍結用のクライオチューブ、細胞懸濁用溶液用のボトル、バイアル、試験管、透析バック等が挙げられる。これらの容器は、ガラス、金属、プラスチック又はこれらの組み合わせ等の多様な材料から形成されていてもよい。これらの容器上のラベルには、内容物である細胞、細胞懸濁用溶液等を説明する内容が記載されている。
　本発明の疾患治療用キットは、その他の添加剤、その他の薬剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、使用法を記載した添付文書を含めた、商業的、及び利用者の観点から望ましい他の材料を包含することができる。
＜細胞懸濁用溶液＞
　電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、細胞医薬組成物用の細胞懸濁用溶液も本発明の範囲内である。細胞医薬品の注射・点滴用の細胞懸濁用溶液として、Ｎａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液を採用することで、細胞の生存率を長時間に渡って高く維持することができることは、本発明者らが新たに見出した知見である。細胞懸濁用溶液の詳細については、細胞医薬組成物の項における（Ｂ）細胞懸濁用溶液の説明を適用できる。
＜疾患の治療方法＞
　本発明は、（Ａ）細胞を、（Ｂ）細胞懸濁用溶液に懸濁して患者に投与する疾患の治療方法であって、（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液であることを特徴とする治療方法も含む。本発明の治療方法によると、細胞の生存率を長時間に渡って高く維持することができるため、様々な疾患に対して優れた治療効果を奏することができる。本発明の疾患方法は、上述した本発明の細胞医薬組成物を用いた治療方法であり、（Ａ）細胞、（Ｂ）細胞懸濁用溶液、その他本発明の細胞医薬組成物が含有し得る成分については細胞医薬組成物の項における説明を適用できる。
　以下に、実施例及び試験例を挙げて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例等によって限定されるものではない。
［実施例１］
（脂肪由来間葉系幹細胞の調製）
　ヒトドナーから同意を得た後、脂肪吸引法で得た皮下脂肪組織を生理食塩液で洗浄した。細胞外基質の破壊、及び細胞の単離を達成するために、コラゲナーゼ（Ｒｏｃｈｅ　ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社）（溶媒は生理食塩液）を添加し、３７℃で９０分間振倒し、分散した。続いて、この上記懸濁液を８００ｇで５分間、遠心分離して間質血管細胞群の沈殿を得た。上記細胞の沈殿に間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）を加え、当該細胞懸濁液を４００ｇで５分間遠心分離し、上清除去後に間葉系幹細胞用無血清培地（Ｒｏｈｔｏ社）に再懸濁し、フラスコに細胞を播種した。細胞を３７℃で数日間、５％ＣＯ２中で培養した。数日後に培養物をＰＢＳで洗浄して、培養液中に含まれていた血球や脂肪組織の残存等を除去し、プラスチック容器に接着している間葉系幹細胞を得た。
　得られた脂肪由来間葉系幹細胞を遠沈管に分注し、４００ｇで５分間、遠心分離し細胞の沈殿を得た。上清を除去した後、細胞凍結保存液（ＳＴＥＭ－ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（ゼノアック社））を適量加え懸濁した。当該細胞懸濁液を、クライオチューブに分注した後、フリーザー内で－８０度にて保存後、液体窒素上の気相に移し、保存を継続した。
　１５ｍＬ遠沈管（住友ベークライト株式会社，品番：ＭＳ－５６１５０）に、リンゲル液（リンゲル液「オーツカ」、株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ４Ｋ７３）、ＫＮ２号輸液（２号液（脱水補給液））（株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ６Ｅ９２）、ＫＮ３号輸液（３号液（維持液））（株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ６Ｄ９６）、ＫＮ４号輸液（４号液（術後回復液））（株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ６Ｄ８０）及びフィジオ（登録商標）７０（２．５％ブドウ糖加酢酸リンゲル液）（株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｍ６Ｄ９１）をそれぞれ５ｍＬずつ分注した後に、凍結保存された脂肪組織由来間葉系幹細胞を湯浴（３７±１℃）で急速融解後、脂肪組織由来間葉系幹細胞の細胞懸濁液を６２．５μＬずつ加えた。転倒混和により懸濁した後、室温で保管し、調製直後、２時間後、４時間後、及び７時間後に２１Ｇの注射針付５ｍＬシリンジで中層より１ｍＬ分取し、１．５ｍＬチューブに移した。細胞懸濁液１０μＬに対して、トリパンブルー（Ｔｒｙｐａｎ　Ｂｌｕｅ　Ｓｔａｉｎ（０．４％）；Ｌｉｆｅ　ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、１５２５０－０６１）１０μＬを加えて、生細胞及び死細胞を区別して位相差顕微鏡（ＯＬＹＭＰＵＳ、品番：ＣＫＸ４１ＳＦ）にて計測を行った。なお、細胞のカウントにはディスポーザブル細胞計算盤（ＷＡＫＥＮ、品番：ＷＣ２－１００）を用い、１８区画カウントを５回行い、最大の数値と最少の数値を除いた３回の計測値の平均値を用いて、下記式により細胞生存率を算出した。なお、４時間後において細胞生存率が７０％を下回ったものについては、７時間後の計測を行わなかった。各輸液の組成を下記表１に、細胞生存率の結果を下記表２に示した。
 
細胞生存率（％）＝生細胞数／総細胞数×１００
 
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　ＫＮ２号輸液及びフィジオ（登録商標）７０に脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁した場合に、４時間後の細胞生存率が７０％を下回った。ＫＮ３号輸液及びＫＮ４号輸液に脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁した場合に、７時間後において細胞生存率が７０％を下回った。これに対して、リンゲル液に脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁した場合には、７時間後においても細胞生存率が８０％以上であった。以上の結果から、リンゲル液に脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁することにより、細胞生存率を顕著に高い状態で長時間に渡って維持できることがわかった。
［実施例２］
　１５ｍＬ遠沈管（住友ベークライト株式会社、品番：ＭＳ－５６１５０）に、リンゲル液（リンゲル液「オーツカ」、株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ４Ｋ７３）、重炭酸リンゲル液（ビカネイト（登録商標）輸液、株式会社大塚製薬工場）をそれぞれ５ｍＬずつ分注した後に、実施例１と同様に、凍結保存された脂肪由来間葉系幹細胞を湯浴（３７±１℃）で急速融解後脂肪由来間葉系幹細胞の細胞懸濁液を６２．５μＬずつ加えた。転倒混和により懸濁した後、室温で保管し、調製直後、１時間後、２時間後及び４時間後の生細胞数及び死細胞数を実施例１と同様に測定して細胞生存率を算出し、調製直後に対しての細胞生存率を算出した。各リンゲル液の組成を下記表３に、細胞生存率の結果を下記表４に示した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　リンゲル液だけでなく、重炭酸リンゲル液に脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁した場合には、４時間後を含むすべての保存時間において、細胞生存率が９０％程度と高かった。以上の結果から、リンゲル液及び重炭酸リンゲル液に脂肪由来間葉系幹細胞を懸濁することにより、細胞生存率を顕著に高い状態で長時間に渡って維持できることがわかった。
［実施例３］
　実施例１の脂肪由来間葉系幹細胞を骨髄由来間葉系幹細胞（ロンザ社製）に代え、リンゲル液（リンゲル液「オーツカ」、株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ４Ｋ７３）を用いて、同様に試験を行い、調製直後、２時間後、３時間後及び７時間後の生細胞数及び死細胞数を測定して細胞生存率を算出した。結果を下記表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　リンゲル液に骨髄由来間葉系幹細胞を懸濁した場合にも、７時間後において細胞生存率が９５％以上であった。以上の結果より、リンゲル液に骨髄由来間質細胞を懸濁することにより、細胞生存率を顕著に高い状態で長時間に渡って維持できることがわかった。
［実施例４］
　実施例１の脂肪由来間葉系幹細胞を臍帯由来間葉系幹細胞（Ｌｉｆｅｌｉｎｅ　Ｃｅｌｌ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＬｉｆｅＬｉｎｅ（登録商標）＿ＵＣＭＳＣ、Ｌｏｔ．１６０９０７）に代え、リンゲル液（リンゲル液「オーツカ」、株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ４Ｋ７３）を用いて同様に試験を行い、調製直後、２時間後、４時間後及び６時間後の生細胞数及び死細胞数を測定し、実施例１と同様に細胞生存率を算出した。結果を下記表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　リンゲル液に臍帯由来間質細胞を懸濁した場合にも、６時間後において細胞生存率が９０％以上であった。従って、リンゲル液は、臍帯由来間葉系幹細胞についても脂肪由来間葉系幹細胞と同様に、細胞生存率を顕著に高い状態で長時間に渡って維持できることがわかった。
［実施例５］
　実施例１の脂肪由来間葉系幹細胞を末梢血単核球細胞（ＡＣＣＵＣＥＬＬ（登録商標）正常ドナー由来ＰＢＭＣ、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ　Ｂｉｏｓｅｒｖｉｃｅｓ社（ＰＲＥＣＩＳＩＯＮ　ＦＯＲ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ社）製、Ｌｏｔ．１３１３４－１０）に代え、リンゲル液（リンゲル液「オーツカ」、株式会社大塚製薬工場、Ｌｏｔ：Ｋ４Ｋ７３）を用いて同様に試験を行い、調製直後、２時間後、４時間後及び６時間後の生細胞数及び死細胞数を測定して細胞生存率を算出した。結果を下記表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　リンゲル液に末梢血単核球細胞を懸濁した場合にも、６時間後において細胞生存率が８０％程度であった。したがって、リンゲル液は、末梢血単核球細胞についても脂肪由来間葉系幹細胞と同様に、細胞生存率を顕著に高い状態で長時間に渡って維持できることがわかった。
　本発明の細胞医薬組成物は、細胞の状態を良好に保ち、その生存率を長時間に渡って高い状態で維持することができるため、様々な疾患に対して優れた治療効果が期待できる。

Claims (7)

  1. 　（Ａ）細胞、及び
    　（Ｂ）細胞懸濁用溶液
    を含有し、
    　（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、細胞医薬組成物。
  2. 　（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、ＣＨ３ＣＯＯ－、ＨＣＯ３ －、クエン酸イオン及び乳酸イオンからなる群より選択される少なくとも１種の電解質をさらに含む、請求項１に記載の細胞医薬組成物。
  3. 　（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、リンゲル液、酢酸リンゲル液、重炭酸リンゲル液及び乳酸リンゲル液からなる群より選択される少なくとも１種である、請求項１又は２に記載の細胞医薬組成物。
  4. 　（Ａ）細胞が、間葉系幹細胞又は末梢血単核球である、請求項１から３のいずれか１項に記載の細胞医薬組成物。
  5. 　上記間葉系幹細胞が、脂肪由来、臍帯由来又は骨髄由来である、請求項４に記載の細胞医薬組成物。
  6. 　（Ａ）細胞、及び
    　（Ｂ）細胞懸濁用溶液
    を含有し、
    　（Ｂ）細胞懸濁用溶液が、電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、疾患治療用キット。
  7. 　電解質としてＮａ＋、Ｃｌ－、Ｋ＋及びＣａ２＋を含み、かつ糖質を含まない、等張性の電解液である、細胞医薬組成物用の細胞懸濁用溶液。
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