CN109477103A - 单链rna-编辑寡核苷酸 - Google Patents

Abstract

本发明涉及能够在真核细胞中在目标RNA中对目标核苷酸(腺苷)进行特异性编辑的反义寡核苷酸，其中所述寡核苷酸自身不形成分子内发夹或茎环结构，其中所述寡核苷酸在目标RNA区域中待编辑的目标腺苷相对的位置处包括胞苷(非互补性核苷酸)或尿苷。

Description

单链RNA-编辑寡核苷酸

发明领域

本发明涉及医学领域。更具体地，涉及RNA编辑领域，其中RNA序列通过单链反义寡核苷酸靶向，以特异性地改正RNA序列中的突变。

背景技术

RNA编辑是真核细胞改变其RNA分子序列的天然过程，其常常以位点特异性的精确方式进行，从而将基因组编码的RNA谱库增加数个数量级。动物界和植物界当中真核物种的RNA编辑酶已得以说明，在从最简单的生命形式(例如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditiselegans))到人的后生动物中，这些过程在细胞自我平衡的管理中发挥着重要作用。RNA编辑的例子有腺苷(A)到肌苷(I)的转化和胞苷(C)到尿苷(U)的转化，其分别通过称作腺苷脱氨基酶和胞苷脱氨基酶的酶发生。最广泛研究的RNA编辑系统是腺苷脱氨基酶。

腺苷脱氨基酶是多结构域蛋白质，其取决于所考察的酶而包括2-3个双链RNA识别结构域和一个催化结构域。识别结构域识别特定的双链RNA(dsRNA)序列和/或构象，而催化结构域通过核碱基的脱氨基化在或多或少预先确定的目标RNA的附近位置处将腺苷(A)转化成肌苷(I)。肌苷被细胞的翻译机制读取为鸟嘌呤，这意味着，如果编辑的腺苷在mRNA或前mRNA的编码区域中，其可以重新编码蛋白质的序列。

A到I的转化也可以在目标mRNA的5′非编码序列中发生，在原始起始位点的上游产生新的翻译起始位点，这产生了N-端延长的蛋白质，或者在转录物的3′UTR或其他非编码部分中发生，这可以影响RNA的加工和/或稳定性。此外，A到I的转化可以在前mRNA中的内含子或外显子中的剪接元件中发生，从而改变剪接的方式。作为其结果，可以包括或跳过外显子。腺苷脱氨基酶是称为作用于RNA的腺苷脱氨基酶(ADAR)的酶家族的一部分，其包括人脱氨基酶hADAR1、hADAR2和hADAR3。

已经描述了应用腺苷脱氨基酶使用寡核苷酸来编辑目标RNA(例如，Montiel-Gonzalez等人PNAS 2013，110(45)：18285-18290；Vogel等人2014.Angewandte Chemie IntEd 53：267-271；Woolf等人1995.PNAS 92：8298-8302)。Montiel-Gonzalez等人(2013)描述了使用基因改造的融合蛋白对目标RNA进行编辑，该融合蛋白包括hADAR2蛋白质的腺苷脱氨基酶结构域，其与识别boxB RNA发夹序列的噬菌体lambda N蛋白质融合。hADAR2的天然dsRNA结合结构域已被除去，以消除天然ADAR的底物识别特性，并将其用lambdaN-蛋白质的boxB识别结构域取代。作者生成了一种包括用于编辑的与目标序列互补的“向导RNA”部分的反义寡核苷酸，上述部分通过N-结构域-脱氨基酶融合蛋白与用于序列特异性识别的boxB部分融合。由此，精妙地显示出，向导RNA寡核苷酸忠实地将腺苷脱氨基酶融合蛋白引导至目标位点，在目标RNA中产生向导RNA-引导的位点特异性的A到I的编辑。Montiel-Gonzalez等人(2013)中公开的这些向导RNA长度大于50个核苷酸，这对于治疗应用来说通常过长(难以制造和进入细胞)。该方法在治疗设定中的缺点还在于需要有由噬菌体lambdaN-蛋白质的boxB识别结构域组成的融合蛋白，上述识别结构域通常与截短的天然ADAR蛋白质的腺苷脱氨基酶结构域融合。目标细胞需要用融合蛋白转导，这会是主要障碍，或者为进行表达，目标细胞需要用编码改造的腺苷脱氨基酶融合蛋白的核酸构建物转染。当编辑要在多细胞生物体中进行，例如在针对人类疾病的治疗中以改正遗传病时，后一种需求构成不小的障碍。

Vogel等人(2014)公开了使用苄基鸟嘌呤取代的向导RNA和基因改造的融合蛋白对编码eCFP和莱顿第五因子(Factor V Leiden)的RNA进行编辑，上述融合蛋白包括与SNAP-标记结构域(改造的O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶)基因融合的ADAR1或2的腺苷脱氨基酶结构域(缺少dsRNA结合结构域)。尽管该基因改造的人工脱氨基酶融合蛋白，通过其与向导RNA通过5′-端O6-苄基鸟嘌呤修饰共价连接的SNAP-标记结构域，可以在培养中靶向HeLa细胞中的目标RNA中的期望的编辑位点，但是该系统与Montiel-Gonzalez等人(2013)所述的基因改造的ADAR具有类似的缺点，即，并不清楚如何在不得不首先对ADAR进行基因修饰、随后转染或转导携带目标RNA的细胞的情况下应用该系统，以提供具有该基因改造的蛋白质的细胞。显然，该系统不易于适用于人，例如，在治疗设定中。

Woolf等人(1995)公开了一种更简单的方法，其使用相对较长的单链反义RNA寡核苷酸(长度为25-52个核苷酸)，其中由于目标RNA和与其杂交的寡核苷酸的双链性质，较长的寡核苷酸(34-聚体和52-聚体)可以促进目标RNA被内源性ADAR编辑。Woolf等人(1995)的寡核苷酸与目标RNA序列100％互补，其似乎仅在细胞提取物中或者在两栖动物(非洲爪蟾蜍(Xenopus))卵母细胞中通过微注射发挥作用，并具有严重缺乏特异性的缺点：目标RNA链中几乎所有与反义寡核苷酸互补的腺苷均被加以编辑。在Woolf等人(1995)中，对其中每个核苷酸均包括2′O-甲基修饰的长度为34个核苷酸的寡核苷酸进行了测试，其显示为无活性。为了提供针对核酸酶的稳定性，还对在5′-和3′-端5个核苷酸处具有2′O--甲基-修饰的硫代磷酸核苷酸的34-聚体RNA进行了测试。经显示，该寡核苷酸中心未被修饰的区域可以促进目标RNA被内源性ADAR编辑，端部的修饰提供针对核酸外切酶降解的保护。Woolf等人(1995)并未实现对目标RNA序列中特定目标腺苷的脱氨基化。如所述，几乎所有与反义寡核苷酸中的未修饰核苷酸相对的腺苷均被加以编辑(因此，如果反义寡核苷酸的5′-和3′-端5个核苷酸是修饰的，几乎所有与中心未修饰区域中的核苷酸相对的腺苷均被加以编辑，或者如果没有核苷酸被修饰，目标RNA链中几乎所有的腺苷均被加以编辑)。已知ADAR可以作用于任何dsRNA。通过有时称作“混杂编辑(promiscuous editing)”的过程，酶将会编辑dsRNA中的多个A。因此，对于避免这种混杂编辑、并仅靶向目标RNA序列中指定腺苷以用于治疗应用性的方法和手段存在需求。Vogel等人(2014)表明，通过在与应当被编辑的腺苷相对的位置处在寡核苷酸中使用2′-O-甲基-修饰的核苷酸，并使用与目标RNA上的特异性靶向腺苷直接相对的未修饰的核苷酸，可以抑制这种脱靶编辑。但是，在该文章中，没有使用与反义寡核苷酸具有共价键的重组ADAR酶，没有显示出在目标核苷酸处发生特异性编辑作用。

注意到还存在另一种称作CRISPR/Cas9系统的使用寡核苷酸的编辑技术。但是，该编辑复合物作用于DNA。其也有与上述的改造ADAR系统相同的缺点，因为其需要与向导寡核苷酸一起，共递送(co-delivery)CRISPR/Cas9酶的目标细胞，或者对其进行编码的表达构建物。

鉴于以上所述，仍存在以下需求：可以利用内源性细胞路径和天然存在的ADAR酶对哺乳动物细胞、甚至整个有机体中的内源性核酸进行特异性编辑的新技术和化合物，且不存在现有技术方法中的相关问题。

发明内容

通过提供使用反义寡核苷酸(AON)的靶向RNA编辑方法，本发明消除了现有技术方法的缺点，在一实施方式中，上述AON能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过所述细胞中存在的哺乳动物ADAR酶对所述目标RNA中的特定目标腺苷进行脱氨基化；其中所述AON与包括目标腺苷的目标RNA互补，所述AON任选地包括一个或多个具有相对于所述目标RNA的错配(mismatch)、摆动(wobble)和/或凸起(bulge)；其中AON包括一个或多个具有糖修饰的核苷酸，其条件是目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；其中AON不包括能够形成分子内茎环结构的(非互补性)部分(与目标不互补，且就其自身而言不互补)，所述茎环结构能够结合哺乳动物ADAR酶；其中AON不包括5′-端O6-苄基鸟嘌呤或5′-端氨基修饰；并且其中AON不与SNAP-标记结构域共价连接。本发明的AON优选地其基础结构是单链RNA-编辑寡核苷酸。在优选的实施方式中，目标腺苷相对的核苷酸是胞苷或尿苷，更优选为胞苷。在再另一优选的方面，从目标腺苷相对的核苷酸直接地5′和/或3′的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖。为了尽可能地防止被核酸内切酶降解，优选地，所述AON中除了目标腺苷相对的核苷酸以及与该相对的核苷酸直接相邻的一个或两个核苷酸以外的所有其他核苷酸均包括2′-O-烷基，优选2′-O-甲基。在另一优选方面，除了目标腺苷相对的核苷酸(其包括具有2′-OH基团的核糖)以外，目标RNA序列中的腺苷相对的每个核苷酸均包括2′-O-烷基，优选2′-O-甲基。在再一优选实施方式中，除了目标腺苷相对的胞苷(其可以是单一错配)以外，AON包括至少一个额外的相对于目标序列的错配或摆动碱基对。至少一个额外的错配和/或摆动碱基对的存在可以增加RNA编辑效率，这可能是因为它增加了AON对其目标分子的变更开/关率(alteredon/off rate)，并且/或者增加了ADAR分子与dsRNA的结合和/或识别，其也取决于目标序列。如本文所概述，AON与目标序列之间额外的错配和/或摆动碱基对(目标位置优选的C-A以外)的一个具体优选的位置是，目标序列中目标腺苷上游(朝向5′)的4个核苷酸位置处。另外，在本文还公开，取决于目标序列，额外的错配和/或摆动碱基对以及额外的凸起(核苷酸的不成对的向外成环(out-looping)的小段)可以增加RNA编辑的效率。因此，在本发明的优选方面，除了目标腺苷相对的胞苷之间的差异以外(或者除了目标腺苷相对的尿苷以外，则不是错配，但对于某些目标序列是优选的)，在AON与目标序列之间具有额外的凸起、错配和/或摆动。在优选的方面，导入AON的细胞是人细胞。在再另一优选方面，本发明的AON包括至少一个硫代磷酸酯键，优选地，其中AON的5′和3′端的2、3、4、5或6个端部核苷酸与硫代磷酸酯键连接，再更优选地，其中5′和3′端处的端部5个核苷酸与(在该情形中，4个)硫代磷酸酯键连接。在一实施方式中，本发明的AON不具有5′帽。在本发明另一实施方式中，AON不是17-聚体或20-聚体。在本发明另一实施方式中，AON与目标RNA序列互补的部分的长度大于17个核苷酸，或者小于14个核苷酸。本发明还涉及一种药物组合物，其包括根据本发明的AON和药学可接受的载体。

本发明还涉及用于治疗或预防遗传病的根据本发明的AON，上述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth disease)、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病(Fabry disease)、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病(Gaucher′s Disease)、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症(HunterSyndrome)、亨廷顿氏舞蹈症(Huntington′s disease)、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障(Leber congenital amaurosis)、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症(Lynch syndrome)、马凡综合征(Marfan syndrome)、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病(Niemann-Pick disease)、NY-eso1相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病(Pompe′s disease)、原发性睫毛疾病(Primary Ciliary Disease)、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病(Sandhoff Disease)、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病(Stargardt′sDisease)、泰-萨二氏病(Tay-Sachs Disease)、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。

本发明还涉及对细胞中目标RNA序列中存在的特定的目标腺苷进行脱氨基化的方法，所述方法包括以下步骤：提供具有根据本发明的AON的所述细胞；使所述AON被细胞摄取；使所述AON退火(anneal)至目标RNA序列；使包括野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的哺乳动物ADAR酶将所述目标RNA序列中的所述目标腺苷脱氨基化成肌苷；和在RNA序列中鉴别所述肌苷的存在。

在本发明的优选实施方式中，目标RNA序列编码CFTR(例如，以编辑1784G＞A突变)、CEP290(例如，以编辑c.2991+1655A＞G突变)、αl-抗胰蛋白酶(A1AT；例如，以编辑9989G＞A突变；或者1096G＞A突变)、LRRK2(例如，以编辑G6055突变)、BDNF(例如，以在RNA水平上修复Val66Met突变)，或者其中目标RNA通过IDUA基因编码(例如，以编辑c.1205G＞A(W402X)突变)。

附图说明

图1显示反义寡核苷酸(上链)与GFP-终止目标序列(下链)的互补性。在A-D小图中，目标RNA序列的一部分从5′到3′显示(每个小图中的下链)，目标腺苷(A)以黑体显示。上链中的寡核苷酸序列从3′到5′显示，错配、摆动和“凸起”加以下划线。化学修饰未示出。所有小图中的下链均相同(SEQ ID NO：5)，仅反映GFP目标序列的一部分。目标序列中的UAG是终止密码子(从5′到3′)，当A编辑成I时(读出为G)，其转化成代表使得GFP蛋白质完全翻译成功能蛋白质的Trp密码子的UGG。A.上链AON ADAR56(SEQ ID NO：1)；B.上链AON ADAR57(SEQ ID NO：2)；C.上链AON ADAR58(SEQ ID NO：3)；D.上链AON ADAR59(SEQ ID NO：4)。

图2显示编辑效率，其通过序列分析检验。色谱图(A-J)显示目标位点(在中心A上突出显示)和相邻核苷酸处的核苷酸频率。峰的核苷酸指认通过与色谱图下的序列中相同的颜色表示，其中G以黑色表示。小图(A)中显示来自未经处理的细胞(NT)的结果，小图(B)中，仅使用了转染试剂(CTRL)。AONADAR56至ADAR59以50nM或100nM的浓度使用，如小图(C)至(J)所示。中心A上的G信号明显增加(显示为相邻G信号上的“肩峰”，而在对照中没有观察到肩峰)，显示在使用四种AON中任一种的四种情形中，均在该位置处发生RNA编辑。

图3显示在来自用ADAR2a在GFP目标序列上转染的细胞的HeLa细胞裂解物中使用ADAR59-2和ADAR72-1(其与含有额外的凸起碱基对的ADAR59-2相比较)之后的测序结果。额外的凸起增加了RNA编辑效率。编辑目标的位置通过箭头给出。

图4显示在α-L-艾杜糖苷酸酶检验中测量的酶活性(相对荧光单位均一化至总蛋白质浓度)。如所示，每个AON显示两次重复测量的平均活性和标准偏差。NT：未经处理。

图5显示使用两对反义寡核苷酸之后与图4中相同的酶检验，上述两对反义寡核苷酸之间的差异仅在于相对于目标序列上游的位置4处的目标序列的错配，该图显示寡核苷酸与目标序列之间的该特定的额外凸起的积极效果。

图6是8种不同的人癌细胞系的蛋白质印迹(根据底部小图中的表格对条带进行编号)，其对ADAR1和ADAR2的表达进行评价，以用于内源性ADAR活性的后续分析。

图7显示源自在SNU-475肝癌细胞中与4种不同的反义寡核苷酸(ADAR56-2、ADAR57-2、ADAR58-2和ADAR59-2，在此分别缩写为56-2、57-2、58-2和59-2)一起孵育的GFPstop57目标质粒的PCR产物的测序结果。ADAR59-2＝ADAR59。RNA编辑已在不需要过量表达ADAR酶的情况下发生。“Fwd”＝正向测序；“Rev”＝反向测序。目标腺苷(在正向序列中转变至鸟苷，在反向序列中转变至胞苷)的点通过箭头给出。

图8显示源自在MCF7乳腺癌细胞中与4种不同的反义寡核苷酸(ADAR56-2、ADAR57-2、ADAR58-2和ADAR59-2，在此分别缩写为56-2、57-2、58-2和59-2)一起孵育的GFPstop57目标质粒的PCR产物的测序结果。RNA编辑已在不需要过量表达ADAR酶的情况下发生。“Fwd”＝正向测序。目标腺苷(转变至鸟苷)的点通过箭头给出。ADAR56-2、ADAR57-2和ADAR58-2没有观察到显著的转变，但ADAR59-2观察到非常显著的RNA编辑转变。

图9显示在用ADAR57-2处理之后目标腺苷(箭头)周围的区域的序列数据(另参见图7，左下)，并显示在目标腺苷附近以及在AON的目标区域中，在其他腺苷处没有发生脱氨基化。

图10(A)显示携带GFPstop57插入物的表达质粒的图。核酸序列和产生的GFP氨基酸序列在(B)中提供，其显示由于三联体58处的TAG终止子，构建物编码57个氨基酸的蛋白质。该TAG中的腺苷被编辑成肌苷(读出为鸟苷)，产生TGG密码子，如本文所公开。

图11(A)显示小核核糖核蛋白多肽A(SNRPA)基因的RNA序列的5′端部分(SEQ IDNO：16)。在上链中，编码序列加以下划线，直至UAG终止密码子(黑体)。终止密码子内的A被RNA编辑成I(读出为G)，产生编码色氨酸(W)的UGG；另外提供了编辑的序列(SEQ ID NO：17)。当翻译直至随后的终止密码子(也以黑体表示)时，这种连读则在理论上产生长25个氨基酸的蛋白质。(B)显示与(A)中给出的SNRPA相同的5′端部分。下部给出了AON序列ADAR87-1、ADAR89-1、ADAR89-2和ADAR94-1的编码序列。凸起、摆动和错配加以下划线。与要靶向的腺苷相对的胞苷以较大的字体显示。ADAR89-2和ADAR94-1中的中心三联体(CentralTriplet)5′-CCA-3′中的三个核苷是DNA，而这些寡核苷酸中的所有其他核苷都是RNA。

图12显示使用AON在小鼠Hepa 1-6细胞中在内源性SNRPA RNA上进行RNA编辑的结果。小图(A)显示未转染(NT)的对照。小图(B)显示其中仅转染编码ADAR2的短同种型的质粒的对照。小图(C)显示由箭头示出的G峰的增加，这表明在未用ADAR2过量表达质粒转染的细胞中，在用ADAR89-1 AON转染之后在所需的位置处发生(A到I)RNA编辑。小图(D)显示具有ADARsh表达质粒和AON二者的阳性对照。

图13显示在小鼠Hepa 1-6细胞中引入ADAR89-2和ADAR94-1之后的测序结果，其表明可以用在目标腺苷相对的中心三联体中具有DNA核苷的AON实现RNA编辑，并且当引入额外的错配时，这种RNA编辑可以进一步增加。

具体实施方式

WO 2016/097212公开了用于RNA的靶向编辑的反义寡核苷酸(AON)，其中AON特征在于与目标RNA序列互补的序列(在本文中称作“靶向部分”)，并存在有茎环结构(在本文中称作“募集部分”)，其优选地与目标RNA不互补。这样的寡核苷酸被称作“自成环AON”。募集部分的作用在于将细胞中存在的天然ADAR酶募集至通过目标序列与靶向部分的杂交形成的dsRNA。由于有募集部分，不需要缀合实体或存在有修饰的重组ADAR酶。WO 2016/097212将募集部分描述为茎环结构，其模拟天然底物(例如，GluB受体)或已知被ADAR酶的dsRNA结合区识别的Z-DNA结构。茎环结构可以是由两个单独的核酸链形成的分子间茎环结构，或者是在单一核酸链内形成的分子内茎环结构。WO 2016/097212中所述的募集部分的茎环结构是在AON自身内形成的分子内茎环结构，并能够吸引ADAR。

本发明的AON不包括WO 2016/097212中所述的募集部分。本发明的AON不包括能够形成分子内茎环结构的部分。本发明的AON更短，这使得其制造成本更低，更易于使用，易于制造。而且，它们不具有使ADAR酶潜在地隔绝于其在细胞中的正常功能的缺点。出人意料地，本发明的发明人发现，与用于目标腺苷(其存在于与AON互补的目标RNA序列中)的脱氨基化的目标RNA互补的，但重要的是，缺少上述的募集部分的AON，似乎仍能够利用细胞中存在的ADAR酶以对目标腺苷进行编辑。在优选的方面，本发明的AON在目标腺苷位置处包括错配，其中AON中相对的核苷酸是胞苷。另外，当尿苷与目标腺苷相对时(这实际上不是错配)，AON能够引起目标腺苷的脱氨基化。本发明的发明人已发现，额外的错配、摆动和/或外成环(out-looping)凸起(由反义寡核苷酸中不与目标RNA根据Watson-Crick碱基配对法则形成完美碱基对的核苷酸造成)是可容许的，在一些情形中是优选的，但越来越多地对于目标RNA序列的特异性靶向编辑来说并不总是必要的。本发明的AON中(当它与其RNA目标序列杂交时)错配、摆动或凸起的数量可以是零(当与目标腺苷相对的核苷酸是尿苷、并且AON的其余部分也与目标序列100％互补时)，可以是1(其可以是当胞嘧啶是相对的核苷时在目标腺苷位置处形成的1个错配，或者在AON中一些其他位置处形成的1个错配)或者更大(包括或不包括目标腺苷处的(错)配)，其取决于AON的长度。目标腺苷的上游以及下游可以有额外的错配、摆动或凸起。在特别优选实施方式中，错配或摆动存在于目标腺苷上游(朝向5′端)四个核苷酸的位置处，当尿苷与目标腺苷配对时，则其也可以是唯一的错配或摆动，或者当与目标腺苷相对的核苷是胞苷时，则其可以是额外的错配或摆动。凸起或错配可以位于单一位置处(由一个错配、摆动或凸起碱基对造成)，或者不完全互补的一连串核苷酸处(由多于一个连续的错配或摆动碱基对或凸起造成，优选地由2或3个连续地错配和/或摆动碱基对和/或凸起造成)。

在任何情形中，根据本发明的AON相对于WO 2016/097212中所述的寡核苷酸具有某些优势，其在于：不需要有发夹或茎环结构，这使得本发明的AON(显著地)更短。而且，WO2016/097212中所述的寡核苷酸具有隔绝细胞中存在的ADAR酶的潜在风险。在本上下文中，隔绝(sequestering)是指，即使在寡核苷酸的靶向部分与目标RNA之间不形成dsRNA复合物的情形中，天然ADAR蛋白质也可以与WO 2016/097212中所述的寡核苷酸结合。当使用本发明的AON时，不发生这种ADAR与WO 2016/097212中所述的寡核苷酸在不存在目标RAN序列的情况下的直接结合(由于存在分子内茎环结构)，本发明的AON不包括能够形成分子内茎环结构的部分。尽管WO 2016/097212中所述的寡核苷酸可以具有某些应用，在许多情况下优选避免存在发夹和/或(茎-)环结构的存在。

因此，本发明涉及一种反义寡核苷酸(AON)，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且AON任选地包括一个或多个相对于互补的目标RNA区域的错配、摆动和/或凸起；AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；AON不包括5′-端O6-苄基鸟嘌呤修饰；AON不包括5′-端氨基修饰；并且AON不与SNAP-标记结构域共价连接。

在优选的方面，AON中与目标腺苷相对的核苷酸不是RNA，而是DNA，在再更优选的方面，与目标腺苷相对的核苷酸以及与目标腺苷相对的核苷酸5′和/或3′的核苷酸均为DNA核苷酸，而AON中其余部分(不是DNA)的核苷酸优选为2′-O-烷基修饰的核糖核苷酸。当两个核苷酸是DNA时，所有其他均可以是RNA，并可以是2′-O甲基修饰的，而在具体的方面，三联体中与目标腺苷相对的第三核苷酸可以是RNA和未修饰的，只要目标腺苷相对的核苷酸不是2′-O甲基修饰的即可。在一具体方面，本发明涉及一种能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物的AON，用于通过细胞中存在的酶(例如ADAR酶)对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中AON与包括目标腺苷的目标RNA区域(部分地)互补，其中与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-H基团的脱氧核糖，其中与目标腺苷相对的核苷酸5′和/或3′的核苷酸也包括具有2′-H基团的脱氧核糖，并且AON的其余部分包括核糖核苷，优选地其全部具有2′-O甲基修饰。

另一方面，本发明涉及一种能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物的AON，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且AON任选地包括一个或多个相对于互补的目标RNA区域的错配、摆动和/或凸起；AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且AON不是17-聚体或20-聚体。

另一方面，本发明涉及一种能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物的AON，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且AON任选地包括一个或多个相对于互补的目标RNA区域的错配、摆动和/或凸起；AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且AON的长度大于17个核苷酸，或者小于14个核苷酸。

在再另一方面，本发明提供一种能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物的AON，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补；AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；AON不包括能够形具有结合ADAR酶能力的成分子内茎环结构的部分；并且AON任选地包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个相对于互补的目标RNA区域的错配、摆动和/或凸起。优选地，目标腺苷相对的核苷酸是胞苷、脱氧胞苷、尿苷或脱氧尿苷。当目标腺苷相对的核苷酸是胞苷或脱氧胞苷时，AON包括至少1个相对于目标RNA的错配。当目标腺苷相对的核苷酸是尿苷或脱氧尿苷时，AON可以是100％互补的，不具有任何相对于目标RNA的错配、摆动或凸起。但是，在优选的方面，无论目标腺苷相对的核苷酸是胞苷、脱氧胞苷、尿苷还是脱氧尿苷，AON与目标RNA之间均存在一个或多个额外的错配、摆动和/或凸起。在另一优选的实施方式中，从与目标腺苷相对的核苷酸直接地5′和/或3′的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖、或者这两种的混合物(三联体则由DNA-DNA-DNA；DNA-DNA-RNA；RNA-DNA-DNA；RNA-DNA-RNA；或RNA-RNA-RNA组成；优选地其中中间的核苷不具有2′-O甲基修饰(当RNA时)，且任一或两个周围的核苷也不具有2′-O甲基修饰)。然后，优选地，AON中的所有其他核苷酸则均具有2′-O-烷基，优选为2′-O-甲基，或者2′-O-甲氧基乙基(2′-MOE)、或者本文公开的任意修饰。本发明的AON优选地包括至少一个硫代磷酸酯键。在进一步优选的方面，AON的5′和3′端的2、3、4、5或6个端部核苷酸以硫代磷酸酯键连接。更优选地，5′和3′端处的端部5个核苷酸以硫代磷酸酯键连接。在本发明一具体实施方式中，AON的长度大于10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。优选地，AON的长度小于100个核苷酸，更优选小于60个核苷酸，再更优选地，AON包括18-70个核苷酸，优选18-60个核苷酸，或者18-50个核苷酸。本发明还涉及包括根据本发明的AON和药学可接受的载体的药物组合物。本发明还涉及用于治疗或预防遗传病的根据本发明的AON，上述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-eso1相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。另一方面，本发明涉及根据本发明的AON在制造用于治疗或预防遗传病的药物中的用途，上述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-eso1相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。在本发明再另一实施方式中，涉及一种对细胞中目标RNA中存在的至少一种目标腺苷进行脱氨基化的方法，该方法包括以下步骤：提供具有根据本发明的AON的细胞；使AON被细胞摄取；使AON退火至目标RNA；使包括野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的ADAR酶将目标RNA中的目标腺苷脱氨基化成肌苷；和任选地在目标RNA中鉴别肌苷的存在，优选地，其中最后的步骤包括：对目标RNA序列进行测序；当目标腺苷位于通过脱氨基化编辑成UGG密码子的UGA或UAG终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；当两个目标腺苷位于通过两个目标腺苷的脱氨基化编辑成UGG密码子的UAA终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；评价前mRNA的剪接是否通过脱氨基化改变；或者使用功能性读出，其中脱氨基化之后的目标RNA编码功能性、全长、延长的和/或野生型蛋白质。在另一实施方式中，本发明涉及根据本发明的AON或方法，其中目标RNA序列编码CFTR(例如，以编辑1784G＞A突变)、CEP290(例如，以编辑c.2991+1655A＞G突变)、αl-抗胰蛋白酶(A1AT；例如，以编辑9989G＞A突变；或者1096G＞A突变)、LRRK2(例如，以编辑G6055突变)、BDNF(例如，以在RNA水平上修复Val66Met突变)，或者其中目标RNA通过IDUA基因编码(例如，以编辑c.1205G＞A(W402X)突变)。

本发明的重要方面在于，AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸。从而，AON的单个核苷酸可以具有一个或一个以上的糖修饰。在AON内，一个或更多个核苷酸可以具有这样的糖修饰。

本发明的另一重要方面在于，本发明的AON内与需要被编辑的核苷酸相对的核苷酸不含有2′-O-甲基修饰(在此，常称作2′-OMe基团或2′-O-甲基化)，并优选地包括2′-OH基团，或者是具有2′-H基团的脱氧核糖。优选地，该核苷酸直接3′和/或5′的核苷酸(“相邻的核苷酸”)也缺少这样的化学修饰，尽管据信容许这些相邻的核苷酸之一可以含有2′-O-烷基(例如2′-O-甲基)，但优选地并非二者均含有。一个或两个相邻的核苷酸可以是2′-OH或相容的取代(如本文所定义)。

本发明的AON的另一重要方面在于它不具有与目标RNA或者包括目标腺苷的RNA区域互补的部分，该部分使AON自身折叠成分子内发夹或其他类型的(茎-)环结构(在本文中也称作“自动成环”或“自成环”)，并可以潜在地充当隔绝ADAR的结构。一方面，本发明的单链AON与目标RNA全互补，但其优选地在至少一个位置上不完美成对，上述位置位于目标腺苷位置处，其中相对的核苷则优选为胞苷。本发明的单链RNA编辑寡核苷酸在目标腺苷位置处以外的其他位置处也可以具有一个或多个相对于目标序列的错配、摆动或凸起(没有相对的核苷)。本发明的AON这些相对于目标序列的摆动、错配和/或凸起并不会防止寡核苷酸与目标RNA序列的杂交，但在目标腺苷位置处，通过细胞中存在的ADAR增加了RNA编辑效率。本领域技术人员能够确定在生理条件下是否还发生杂交。与Vogel等人(2014)相反，本发明优选的单链RNA编辑寡核苷酸不包括5′-端O6-苄基鸟嘌呤或5′-端氨基修饰，并且不与SNAP-标记结构域(改造的O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶)共价连接。SNAP-标记结构域源自人DNA修复蛋白质O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶(AGT)，并可以使用O6-苄基鸟嘌呤衍生物在活细胞中加以共价标记。Vogel等人(2014)公开了总长度为20或17个核苷酸的向导RNA，其中5′端处的前三个核苷酸不与目标RNA序列结合，而是将向导RNA与SNAP-标记结构域连接。向导RNA与目标RNA序列结合的部分因此长度为14或17个核苷酸。Vogel等人(2014)中还公开了用5′-端部氨基修饰代替5′-端部O6-苄基鸟嘌呤修饰的相同长度的向导RNA，但是，仅检测到极少的或没有检测到目标RNA序列的脱氨基化。在一实施方式中，本发明的AON包括少于4个相对于目标RNA序列的错配和/或摆动。类似地，与Montiel-Gonzalez等人(2013)相反，本发明优选的AON不包括boxB RNA发夹序列。Montiel-Gonzalez等人(2013)中使用的boxB RNA发夹序列是被噬菌体λN-蛋白质识别的一小段17个核苷酸的RNA(序列为GGCCCUGAAAAAGGGCC，SEQ ID NO：6)。噬菌体早期操纵子中的下游基因的转录需要称作nut的启动子-近端元件。该位点以RNA的形式顺式发挥作用，以组装由噬菌体λN蛋白质和宿主因子组成的转录抗-终止复合物。nut-位点RNA含有称作boxB的小茎环结构。在本领域中已知boxB RNA发夹序列是间断回文(interrupted palindrome)结构，其具有形成发夹(茎环)结构的潜力。它的序列相对于噬菌体λ之间变化，其编码不同的基因组特异性N同源物。Vogel等人(2014)和Montiel-Gonzalez等人(2013)均没有使用细胞中存在的哺乳动物ADAR酶，其中ADAR酶包括其天然dsRNA结合结构域，如在野生型酶中所发现。Vogel等人(2014)使用基因改造的融合蛋白，其包括与SNAP-标记结构域融合的ADAR1或2的腺苷脱氨基酶结构域，Montiel-Gonzalez等人使用基因改造的融合蛋白，其包括与噬菌体λN蛋白质的boxB识别结构域融合的hADAR2蛋白质的腺苷脱氨基酶结构域。与现有技术相反，本发明的AON使用细胞中存在的哺乳动物ADAR酶，其中ADAR酶包括在野生型酶中发现的其天然的dsRNA结合结构域。因此，不需要将boxB RNA发夹序列、5′-端O6-苄基鸟嘌呤、5′-端氨基修饰、或SNAP-标记结构域并入到本发明的AON中以允许ADAR的募集。因此，相对于Vogel等人(2014)和Montiel-Gonzalez等人(2013)中所述的寡核苷酸，根据本发明的AON具有某些优势。根据本发明的AON可以利用内源性细胞路径和天然存在的ADAR酶对目标RNA序列中的目标腺苷进行特异性编辑。在一实施方式中，本发明的AON不与人O6-烷基鸟嘌呤-DNA-烷基转移酶共价结合。优选地，本发明的AON不与多肽共价结合。在本发明的AON的另一方面，AON不具有5′帽。在真核细胞中，5′帽由经由5′-5′三磷酸键与RNA连接的鸟嘌呤核苷酸组成。该鸟苷在7位上是甲基化的，被称作7-甲基鸟苷。如本文所公开，本发明的单链RNA编辑-诱导寡核苷酸能够对目标RNA序列中的特定目标腺苷进行脱氨基化。理想地，仅有一个腺苷被脱氨基化。另外可选地，1、2或3个腺苷核苷酸被脱氨基化，但优选仅有一个。综合考虑本发明的AON的特征，不需要有修饰的重组ADAR表达，不需要有与AON连接的缀合实体，或者不需要存在有与目标RNA序列不互补的长的募集部分。除此以外，本发明的AON确实允许通过包括野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的天然ADAR酶将目标RNA序列中存在的目标腺苷特异性地脱氨基化成肌苷，并且不存在在RNA/AON复合物中在别处发生混杂编辑的风险。

将胞苷脱氨基酶募集至目标位点，与腺苷脱氨基酶hADAR1和hADAR2的募集以相同的方式发挥作用。但是，胞苷脱氨基酶具有不同的结合要求，并在其目标RNA序列中识别不同的决定胞苷编辑的结构。一种得以特别充分研究的胞苷脱氨基酶是人Apobec1。使用寡核苷酸构建物靶向编辑位点、并募集天然存在的常驻编辑实体进行RNA编辑的一般原则，对于胞苷脱氨基化来说是相同的，并且是本发明在此公开并要求保护的一部分。

对ADAR酶天然靶标的分析表明，这些通常包括形成RNA螺旋的两个链之间的错配，其由ADAR1或ADAR2编辑。已经提出，这些错配提高了编辑反应的特异性(Stefl等人2006.Structure 14(2)：345-355；Tian等人2011.Nucleic Acids Res 39(13)：5669-5681)。AON与目标RNA之间成对/错配核苷酸的最优方式的表征，对于开发有效的基于ADAR的AON疗法来说似乎也是至关重要的。本发明的AON的改进特性在于在预定的点处使用特定的核苷酸修饰，以保证稳定性以及适当的ADAR结合和活性。这些改变可以变化，并且可以包括AON骨架中、核苷酸的糖部分中以及核碱基中的修饰。它们也可以遍及AON的序列可变地分布，其取决于目标，并取决于二级结构。可以需要特定的化学修饰，以支持ADAR酶的RNA-结合结构域内以及脱氨基酶结构域内不同氨基酸残基的相互作用。例如，核苷酸之间的硫代磷酸酯键和/或2′-O-甲基修饰在AON的一些部分中可以是容许的，但在其他部分应当避免它们，以便不破坏具有磷酸酯和/或2′-OH基团的酶的关键相互作用。这些设计原则一部分由公开的ADAR2的结构指导，而其他则不得不通过经验确定。对于ADAR1和ADAR2，可以存在不同的优先。修饰还应当选择成它们会防止AON的降解。特定的核苷酸修饰也可以是必要的，以提高对于底物RNA的编辑活性，其中目标序列对于ADAR编辑并不是最优的。之前的工作已经确立某些序列环境(sequence context)更加经得起编辑。例如，目标序列5′-UAG-3′(目标A处于中间)含有对于ADAR2来说最优选的最邻近的邻居核苷酸，而5′-CAA-3′目标序列则是不利的(Schneider等人2014.Nucleic Acids Res 42(10)：e87)。最近的ADAR2脱氨基酶结构域的结构分析暗示，有可能通过悉心选择与目标三核苷酸相对的核苷酸而提高编辑。例如，与相对链上的3′-GCU-5′序列成对的5′-CAA-3′目标序列(在中间形成A-C错配)是不利的，因为鸟苷碱基在空间上与ADAR2的氨基酸侧链冲突。但是，在此假定，较小的核碱基，例如肌苷，则能够在不导致空间冲突的情况下更好地潜在适应到该位置，同时仍保持与相对胞苷的碱基成对的能力。可以提高次优序列的活性的修饰包括使用增加AON柔性的骨架修饰，或者，反过来，迫使其成为有利于编辑的构象。

本文所用术语的定义

本文所用的术语“腺嘌呤”、“鸟嘌呤”、“胞嘧啶”、“胸腺嘧啶”、“尿嘧啶”和“次黄嘌呤”(肌苷中的核碱基)是指核碱基本身。

术语“腺苷”、“鸟苷”、“胞苷”、“胸苷”、“尿苷”和“肌苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的核碱基。

术语“核苷”是指与(脱氧)核糖基糖连接的核碱基。

术语“核苷酸”是指各个核碱基-(脱氧)核糖基-磷酸连接部分(phospholinker)，以及核糖部分或磷酸化基团的任何化学修饰。因此，该术语将包括：包括锁定的核糖基部分的核苷酸(包括2′-4′桥，包括亚甲基或本领域公知的任何其他基团)，包括连接部分(linker)的核苷酸，上述连接部分包括磷酸二酯、磷酸三酯、(二)硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯(phosphoramidate)连接部分等。

有时，术语腺苷和腺嘌呤、鸟苷和鸟嘌呤、胞嘧啶和胞苷、尿嘧啶和尿苷、胸腺嘧啶和胸苷、肌苷和次黄嘌呤可以互换地使用，以表示相应的核碱基、核苷或核苷酸。

除非上下文清楚地有不同要求，有时术语核碱基、核苷和核苷酸可互换使用。术语“核糖核苷”和“脱氧核糖核苷”、或“核糖”和“脱氧核糖”如在本领域中所使用。

除非上下文另外指出，无论何时提到“寡核苷酸”，是指寡核糖核苷酸和脱氧寡核糖核苷酸。无论何时提到“寡核糖核苷酸”，其可以包括碱基A、G、C、U或I。无论何时提到“脱氧寡核糖核苷酸”，其可以包括碱基A、G、C、T或I。在优选的方面，本发明的AON是可以包括化学修饰的寡核糖核苷酸。

无论何时提到寡核苷酸构建物中的核苷酸，例如，胞嘧啶，包括5-甲基胞嘧啶、5-羟基甲基胞嘧啶和β-D-葡糖基-5-羟基-甲基胞嘧啶；当提到腺嘌呤时，包括N6-甲基腺嘌呤和7-甲基腺嘌呤；当提到尿嘧啶时，包括二氢尿嘧啶、4-硫尿嘧啶和5-羟基甲基尿嘧啶；当提到鸟嘌呤时，包括1-甲基鸟嘌呤。

无论何时提到核苷或核苷酸时，包括呋喃核糖衍生物，例如2′-脱氧、2′-羟基和2′-O-取代的变体，例如2′-O-甲基，并包括其他的修饰，包括2′-4′桥接变体。

无论何时提到寡核苷酸时，两个单核苷酸之间的键可以是磷酸二酯键及其修饰，其包括磷酸二酯、磷酸三酯、(二)硫代磷酸酯、甲基磷酸酯、氨基磷酸酯连接部分等。

术语“包括”涵盖了“包括有”以及“由其组成”，例如“包括X”的组合物可以排他性地由X组成，或者可以包括一些额外成分，例如，X+Y。关于数值x的术语“大约”是任选的，例如，是指x±10％。

措辞“基本上”并不排除“完全地”，例如，“基本上不含Y”的组合物可以完全不含Y。当相关时，本发明的定义中可以省略措辞“基本上”。

本文所用的术语“互补”是指AON在生理条件下与目标序列杂交这一事实。该术语并不意味着AON中的每一个核苷酸都在目标序列中与其相对的核苷酸具有完美地配对。换言之，在AON可以与目标序列互补的同时，在AON与目标序列之间可以有错配、摆动和/或凸起，同时在生理条件下AON仍与目标序列杂交，使得细胞RNA编辑酶可以对目标腺苷进行编辑。因此，术语“基本上互补”也是指尽管存在有错配、摆动和/或凸起，AON在AON与目标RNA杂交的生理条件下在AON与目标序列之间具有足够的匹配核苷酸。如本文中所示，AON可以是互补的，但也可以包括一个或多个相对于目标序列的错配、摆动和/或凸起，只要在生理条件下AON能够与其目标杂交即可。

关于核酸序列，术语“下游”是指沿着序列在3′方向上继续；术语“上游”含义相反。因此，在任何编码多肽的序列上，起始密码子在正义链中处于终止密码子的上游，但在反义链中处于终止密码子的下游。

提及“杂交”通常是指特异性杂交，并将非特异性杂交排除在外。特异性杂交可以使用本领域公知的技术在所选的实验条件下进行，以保证探针与靶标之间的大多数稳定相互作用为，探针和靶标具有至少70％、优选至少80％、更优选至少90％的序列同一性。

本文所用的术语“错配”是指双链RNA复合物中相对的核苷酸并非是根据Watson-Crick碱基配对法则形成完美的碱基对。错配的核苷酸为G-A、C-A、U-C、A-A、G-G、C-C、U-U对。在一些实施方式中，本发明的AON包括少于4个错配，例如，0、1或2个错配。摆动碱基对为：G-U、I-U、I-A和I-C碱基对。

根据本发明的AON可以几乎在其整体上进行化学修饰，例如，提供所有具有2′-O-甲基化糖部分(2′-OMe)的核苷酸。但是，目标腺苷相对的核苷酸不包括2′-OMe修饰，在再更优选的方面，每个相对于目标腺苷的核苷酸两侧的两个相邻核苷酸中的至少一个，且在优选的方面，每个相对于目标腺苷的核苷酸两侧的两个相邻核苷酸中的两个，也不包括2′-OMe修饰。就进行RNA编辑而言，其中AON内所有核苷酸都有2′-OMe修饰的完全修饰会导致非功能性的寡核苷酸，推测原因在于它阻碍了目标位置处的ADAR活性。通常，通过提供具有2′-OMe基团的相对的核苷酸，或者通过提供鸟嘌呤或腺嘌呤作为相对的碱基，可以保护目标RNA中的腺苷不被编辑，因为这两种核碱基也能够减少相对的腺苷的编辑。

寡核苷酸领域中已知有许多种化学作用和修饰，其可以很容易根据本发明来使用。核苷酸之间常规的核苷间键可以通过磷酸二酯键的单-或二-硫代化(thioation)而改变，以分别产生硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯。核苷间键的其他修饰是可能的，其包括酰胺化和肽连接部分。在优选的方面，本发明的AON在AON最端部的核苷酸(因此，优选在5′和3′端处)之间具有1、2、3、4或更多个硫代磷酸酯键，这意味着在4个硫代磷酸酯键的情形中，相应地连接最终的5个核苷酸。本领域技术人员将会理解，每个端部上这种键的数量可以取决于目标序列或基于其他方面，例如毒性，而变化。

核糖可以通过将2′-O部分用低级烷基(C1-4，例如2′-O-Me)、烯基(C2-4)、炔基(C2-4)、甲氧基乙基(2′-MOE)或其他取代基置换加以修饰。优选的2′OH基团的取代基为甲基、甲氧基乙基或3，3′-二甲基烯丙基。已知后者由于其体积大而具有抑制核酸酶敏感性的特性，同时提高杂交效率(Angus&Sproat FEBS 1993 Vol.325，no.1，2，123-7)。另外可选地，可以应用锁定的核酸序列(LNA)，其在核糖环内部包括2′-4′分子内桥(通常是2′氧与4′碳之间的亚甲基桥)连接。可以对嘌呤核碱基和/或嘧啶核碱基加以修饰，以改变其特性，例如，通过杂环的酰胺化或脱氨基化。精确的化学作用和形式可以取决于不同的寡核苷酸构建物以及不同的应用，其可以根据本领域技术人员的意愿和偏好而作出。

根据本发明的AON长度通常应当大于10个核苷酸，优选大于11、12、13、14、15、16个核苷酸，再更优选大于17个核苷酸。在一实施方式中，根据本发明的AON的长度大于20个核苷酸。根据本发明的寡核苷酸的长度优选小于100个核苷酸，再更优选小于60个核苷酸。在一实施方式中，根据本发明的AON的长度小于50个核苷酸。在优选的方面，根据本发明的寡核苷酸包括18-70个核苷酸，更优选包括18-60个核苷酸，再更优选包括18-50个核苷酸。因此，在最优选的方面，本发明的寡核苷酸包括18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。

在本领域中已经知晓，RNA编辑实体(例如人ADAR酶)以不同的特异性对dsRNA结构进行编辑，其取决于若干因素。一重要的因素是构成dsRNA序列的两个链的互补程度。两条链的完美互补性通常导致hADAR的催化结构域以无判别力方式对腺苷进行脱氨基化，差不多作用于与其遇到的任何腺苷。通过引入化学修饰和/或通过保证dsRNA中的若干错配，推测其有助于以尚未清楚定义地方式将dsRNA结合结构域定位，可以增加hADAR1和2的特异性。此外，通过提供包括与要编辑的腺苷相对的错配的AON，可以加强脱氨基化反应自身。优选地，通过提供具有与要编辑的腺苷相对的胞苷的靶向部分，产生错配。作为另外可选的方式，相对于腺苷也可以使用尿苷，可以理解地，由于U和A成对，这将不会导致“错配”。目标链中的腺苷一经脱氨基化，目标链将会获得肌苷，其在大多数生化过程中被细胞的生化机制“读取”为G。因此，在A到I的转化之后，错配得以解决，因为I能够完美地与根据本发明的寡核苷酸构建物的靶向部分中相对的C进行碱基配对。在由于编辑解决错配之后，释放出底物，并从目标RNA序列释放出寡核苷酸构建物-编辑实体复合物，其则变为可用于下游生化过程，例如剪接和翻译。另外，这种开/关率很重要，因为靶向寡核苷酸不应当与目标RNA太过紧密地结合。

所需的编辑目标RNA序列的特异性水平可以取决于不同的目标。遵照本专利申请的指导，本领域技术人员将能够根据其需求经过一些试错而设计出寡核苷酸的互补部分，并得到所需的结果。

本发明的寡核苷酸通常包括正常核苷酸A、G、U和C，但也可以包括肌苷(I)，例如，代替一个或多个G核苷酸。

为了防止目标RNA序列在与寡核苷酸构建物重合的区域中发生不期望的腺苷的编辑，可以对寡核苷酸进行化学修饰。在本领域中已经显示，目标RNA序列中与腺苷相对的核苷的核糖基-部分的2′-O-甲基化大大降低了该腺苷被ADAR脱氨基化(Vogel等人2014)。因此，通过在寡核苷酸构建物的所需位置引入2′-甲氧基(2′-OMe)核苷酸，编辑特异性得以大大提高。其他在核糖基部分上的2′-O取代，例如2′-甲氧基乙基(2′-MOE)和2′-O-二甲基烯丙基，也可以减少目标RNA序列中对应(相对)的腺苷的不希望的编辑。所有这些修饰均可以应用于本发明的寡核苷酸。其他化学修饰对于寡核苷酸合成和设计领域的普通技术人员来说也是很容易获得的。在根据本发明的方法中，这些化学修饰寡核苷酸的合成及其测试并不会造成不当的负担，本发明包括了其他的修饰。

细胞中存在的RNA编辑分子通常是蛋白质性质的，例如在后生动物包括哺乳动物中发现的ADAR酶。优选地，细胞编辑实体是酶，更优选腺苷脱氨基酶或胞苷脱氨基酶，再更优选腺苷脱氨基酶。最引人关注的之一是人ADAR、hADAR1和hADAR2，包括其任意同种型，例如hADAR1p110和p150。RNA编辑酶是本领域已知的，可以方便地设计其根据本发明的寡核苷酸构建物，包括作用于RNA的腺苷脱氨基酶(ADAR)，例如人或人细胞中的hADAR1和hADAR2，以及胞苷脱氨基酶。现有技术中已对人ADAR3(hADAR3)进行了说明，但据报道其不具有脱氨基酶活性。已知hADAR1以两种同种型存在；长的150kDa干扰素诱导型版本和较短的100kDa版本，其通过从常见前mRNA的选择性剪接产生。所以，细胞中存在的150kDa同种型的水平可以受干扰素、特别是干扰素-γ(IFN-γ)影响。hADAR1也是通过TNF-α诱导型的。这便提供了开发联合疗法的机会，由此将干扰素-γ或TNF-α和根据本发明的寡核苷酸作为组合产品或者作为单独的产品，同时或者以任意顺序依次给予患者。某些疾病状况可能已经与患者某些器官中IFN-γ或TNF-α水平增加相符，产生进一步的机会以使得编辑对于患病组织更具有特异性。

本发明的AON中化学修饰的例子是糖部分的修饰，包括，通过糖(核糖)部分内的交联取代基(例如，如在LNA或锁定核酸中那样)，通过将2′-O原子用具有以上指定长度的烷基(例如，2′-O-甲基)、炔基(2′-O-炔基)、烯基(2′-O-烯基)、烷氧基烷基(例如，甲氧基乙基2′-MOE)取代，等等。此外，骨架的磷酸二酯基可以通过硫代化、二硫代化、酰胺化等修饰，生成硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯等核苷间键。核苷间键可以全部或部分地被肽键取代，以生成肽核酸(peptidonucleic acid)序列等。另外可选地，或者额外地，核碱基可以通过(脱)氨基化修饰，以生成肌苷或2′6′-二氨基嘌呤等。其他修饰可以是核苷酸胞苷部分中C5上的甲基化，以产生已知与CpG序列有关的潜在免疫原性特性。

在dsRNA复合物募集ADAR酶以将目标RNA序列中的A脱氨基化成I的情形中，要编辑的腺苷与相对的核苷酸之间的碱基对、错配、凸起或摆动可以包括腺苷、鸟嘌呤、尿苷或胞苷残基，但优选胞苷残基。除了编辑位点相对的潜在错配以外(当不应用尿苷时)，AON的其余部分可以与目标RNA完美地互补。但是，如本文中所示，在某些方面，本发明涉及包括有限数量的不完美匹配的AON。本领域普通技术人员将会理解，细胞内部编辑实体重新定向至其他目标位点的程度可以通过改变根据本发明的寡核苷酸对于编辑分子识别结构域的亲和力来调节。通过试错和/或通过基于寡核苷酸与编辑分子识别结构域之间的结构相互作用的计算方法，可以确定精确的修饰。

额外地，或者另外可选地，募集和重新定向细胞中编辑实体的程度可以通过寡核苷酸的给药量(dosing)和剂量方案(dosing regimen)来调节。这可以由实验人员(在体外)或者临床医生确定，通常是在I期和/或II期临床试验中。

本发明涉及真核生物、优选后生动物、更优选哺乳动物细胞中目标RNA序列的修饰。原则上，本发明可以用于来自任意哺乳动物物种的细胞，但优选用于人细胞。本发明可以用于来自任意器官例如皮肤、肺、心脏、肾、肝、胰腺、肠、肌肉、腺体、眼、大脑、血液等的细胞。本发明特别适合于对(人)受试者疾病状态有关的细胞、组织或器官中的序列进行修饰。这些细胞包括但不限于肺或胃肠道的上皮细胞、生殖器官的细胞、肌肉细胞、眼细胞、皮肤细胞、来自例如肝、肾、胰腺的器官和组织的细胞、免疫细胞、癌细胞、腺细胞、脑细胞等。本发明还可以用于不在有机体中天然存在的哺乳动物细胞，例如，用于细胞系或者用于胚胎干(ES)细胞。本发明可以用于各种类型的干细胞，包括多能干细胞、全能干细胞、胚胎干细胞、诱导多能干细胞等。细胞可以位于体外或体内。本发明的一优势在于，它可以用于在线处于活的有机体中的细胞，但它也可以用于培养的细胞。在一些实施方式中，将细胞离体处理，然后引入到活的有机体中(例如，重新引入到其最初源自的有机体中)。本发明还可以用于编辑所谓的类器官内的细胞中的RNA序列。类器官可以认为是三维的体外产生的组织，但使用特定的条件驱使以产生独立的、分离的组织(例如，参见，Lancaster&Knoblich，Science 2014，vol.345no.6194 1247125)。在治疗设定中，它们是有益的，因为它们可以在体外获自患者的细胞，然后可以将类器官作为比起常规移植物排斥可能性更低的自体材料重新引入到患者中。因此，根据另一优选的实施方式，本发明可以在从取自患者的组织样品生长的类器官上实施(例如，取自其胃肠道；参见Sala等人J Surg Res.2009；156(2)：205-12，以及Sato等人Gastroenterology2011；141：1762-72)；一经根据本发明进行RNA编辑，可以将类器官或者处于类器官中的干细胞用于移植回患者体内，以改善器官功能。要治疗的细胞通常会具有基因突变。突变可以是杂合的或纯合的。本发明将典型地用于修饰点突变，例如，N到A的突变，其中N可以是G、C、U(在DNA水平上为T)，优选为G到A的突变，或者N到C的突变，其中N可以是A、G、U(在DNA水平上为T)，优选U到C的突变。以下对含有特别关注的突变的基因进行讨论。但是，在一些实施方式中，通过将疾病相关的突变引入到细胞系或动物中，本发明以相反的方式使用，以提供所关注疾病的可用的研究工具。作为生成疾病模型的例子，我们提供了以下寡核苷酸序列：其用于在人细胞中募集编辑活性，以在CEP290基因中产生突变，产生隐蔽的剪接位点，该剪接位点是形成儿童先天性失明最常见的形式——雷伯氏先天性黑内障(LCA 10)——的基础。

要通过RNA编辑恢复的突变可以在染色体或一些其他形式的DNA、例如线粒体DNA、或者RNA、包括前mRNA、核糖体RNA或线粒体RNA的水平上产生。要进行的改变可以是在细胞或受试者已感染的病原体的目标RNA中，上述病原体包括真菌、酵母、寄生虫、动质体(kinetoplastids)、细菌、噬菌体、病毒等。随后，编辑可以在RNA水平上在这些细胞、受试者或病原体内部的目标序列上进行。某些病原体例如病毒，将其核酸、DNA或RNA释放至感染宿主(细胞)的细胞中。其他病原体在感染的宿主中停留或循环。本发明的寡核苷酸构建物可以用于编辑在受感染的真核生物宿主细胞中存在的目标RNA序列，或者编辑在真核生物宿主中存在或循环的病原体细胞内部的RNA序列，只要其中要进行编辑的细胞含有与向其施用的寡核苷酸构建物相容的编辑实体即可。

无意拘泥于理论，据信通过hADAR1和hADAR2进行的RNA编辑在细胞核中在转录或剪接过程中在初级转录物上发生，或者在细胞质中发生，其中例如可以对成熟mRNA、miRNA或ncRNA进行编辑。已知编辑酶的不同同种型定位不同，例如，hADAR1 p110主要发现在细胞核中，hADAR1 p150在细胞质中。据信通过胞苷脱氨基酶进行RNA编辑在mRNA水平上进行。并不排除成熟mRNA中线粒体RNA密码子或非编码序列的编辑。

通过使用能够靶向要编辑的位点、并募集位于细胞中的RNA编辑实体以引起编辑反应的寡核苷酸，本发明用于在真核生物细胞中的目标RNA序列中产生变化。优选的编辑反应是腺苷脱氨基化和胞苷脱氨基化，其分别将腺苷转化成肌苷和将胞苷转化成尿苷。变化可以位于目标RNA的5′或3′未翻译区中、(隐蔽)剪接位点中、外显子中(通过改变外显子剪接沉默子或增强子，或者通过引入或除去启动或终止密码子，改变从目标RNA翻译的蛋白质中的氨基酸、密码子应用或剪接行为)、内含子中(通过改变内含子剪接沉默子或内含子剪接增强子、分支点，改变剪接)、及通常是在影响RNA稳定性、结构或功能的任意区域中。目标RNA序列可以包括人们可能希望改正或改变的突变，例如点突变(转换或颠换)。另外可选地，目标RNA序列有意地突变成产生变化的表型(或者基因型，在基于RNA的有机体例如RNA病毒的情形中)，其中之前没有突变。例如，可以使得细胞系或动物在目标RNA序列中携带变化(突变)，其可以用于检验中，或者用作(动物、类器官等)模型系统以研究疾病、针对疾病的测试实验化合物等。根据本发明的寡核苷酸构建物和方法可以用于高通量筛选系统(阵列形式)，用以产生具有大量各种各样目标RNA的细胞库，例如，其编码大量各种各样的蛋白质同种型，用于进一步实验，包括化合物筛选、蛋白质改造等。

目标RNA可以是任何细胞或病毒RNA序列，但通常是具有蛋白质编码功能的前mRNA或mRNA。

单纯出于方便参考的目的，而无意于限制本发明，提供表1以说明可以由通过本发明的寡核苷酸定向的腺苷脱氨基酶引起的可能的密码子变化。具体地，表1不应当解释成将本发明的应用限于任何RNA中的编码序列；如已经指出，本发明可以在任何包括腺苷的RNA目标上实施，无论腺苷是在编码区、内含子、非编码外显子(例如5′-或3′未翻译区)中还是在miRNA、tRNA、rRNA等中。为了避免关于应用广泛性的误解，从编码角度而言不重要的(“沉默”)的变化仍可以改变某些蛋白质的基因表达，因为对于相同的氨基酸来说，一些密码子相比于其他可以更加优选，例如，可以导致不同的转录稳定性或翻译效率，造成编码的蛋白质变得比没有变化时的丰度更高或更低。

表1

使用根据本发明的寡核苷酸所编辑的特别令人关注的目标腺苷是氨基酸残基的密码子的一部分，上述氨基酸残基定义了关键的功能或特性，例如催化位点，其他蛋白质的结合位点，底物的结合，定位结构域，用于共翻译或翻译后修饰例如糖基化、羟基化、豆蔻酰化，通过蛋白酶进行蛋白质切割(以使蛋白质成熟和/或作为分子内路径的一部分)等。

遗传病的宿主是由G到A的突变造成的，这些疾病是优选的目标疾病，因为在突变的目标腺苷处进行的腺苷脱氨基化会将突变逆转成野生型。但是，逆转成野生型并非总是必然得到有益效果。如果野生型核苷酸是G以外的其他核苷酸，在目标中将A修饰成G也可以是有益的。在某些情形中，这一点可以预测是该种情况，在其他情形中，这一点需要一些测试。在某些情形中，将目标RNA中的A修饰成G(其中野生型不是G)可能是沉默的(没有翻译成不同的氨基酸)，或者是不重要的(例如，氨基酸被置换，但其构成不破坏蛋白质结构和功能的保守置换)，或者氨基酸是具有一定变化强健性(robustness)的功能性结构域的一部分。如果根据本发明进行编辑造成的A到G的转变是在非编码RNA或者RNA的非编码部分中，结果也可以是不重要的，或者严重性比原始突变要低。本领域普通技术人员将会认识到，本发明的应用性非常广泛，甚至并不限于疾病的预防或治疗。本发明还可以用于甚至即便是或者具体地当这些修饰导致患病状态时，例如在细胞或非人动物模型中，对转录物进行修饰以研究其效果。可以用根据本发明的寡核苷酸预防和/或治疗的遗传病的优选例子是其中目标RNA中的一个或多个腺苷的修饰将带来(潜在)有益变化的任何疾病。

含有特别关注的突变的、作为根据本发明的潜在目标RNA序列的转录的RNA序列包括，但不限于，从以下转录者：CFTR基因(囊性纤维化跨膜转导调节物)、肌营养不良蛋白、亨廷顿蛋白(huntingtin)、神经纤维素1、神经纤维素2、血红蛋白的β-球蛋白链、CEP290(中心体蛋白质290kDa)、β-氨基己糖苷酶A的HEXA基因、和对称作Usher综合症的遗传性失明形式有责任的任一种Usher基因(例如，USH2A编码Usherin)。下文进一步列出更加广泛的列表。目标序列将由此选择，寡核苷酸构建物将包括所需的修饰以对突变进行改正。CF突变领域技术人员认识到，CFTR基因中1000-2000个突变是已知的，包括R117H、G542X、G551D、R553X、W1282X和N1303K。

通常，可以使用根据本发明的寡核苷酸构建物逆转的任意目标RNA中的突变，在腺苷脱氨基酶募集的情形中是G到A的突变，在胞苷脱氨基酶募集的情形中是U到C的突变，可以由此设计寡核苷酸构建物。可以使用根据本发明的寡核苷酸构建物靶向的突变还包括C到A、U到A(在DNA水平上为T到A)(在募集腺苷脱氨基酶的情况下)、以及A到C和G到C突变(在募集胞苷脱氨基酶的情况下)。尽管在后一种情形中RNA编辑可能不必要将突变恢复成野生型，编辑的核苷酸可以导致相对于原始突变的改善。例如，导致框内终止密码子的突变——在翻译时导致截短的蛋白质——可以变成编码如下氨基酸的密码子：该氨基酸不是在该位置处的初始氨基酸，但其产生具有至少一些功能性、至少比截短的蛋白质功能性更多的(全长)蛋白质。目标序列对于真核生物、优选哺乳动物、更优选人细胞是内源性的。因此，例如，目标序列不是在细胞史中在某些点处人工引入的转基因或标记基因，而是细胞中天然存在的基因(无论是突变还是非突变形式)。

本发明并不限于改正突变，因为通过应用根据本发明的寡核苷酸，其可以反过来用于将野生型序列变化成突变的序列。修饰野生型腺苷可能有利的一个例子是导致跳过外显子，例如通过对正好是剪接所述外显子所需的分支位点的腺苷进行修饰。另一例子是，腺苷定义了蛋白质结合的识别序列或者构成其一部分，或者参与了定义mRNA稳定性的二级结构。因此，如上所述，本发明可以用于提供疾病研究工具，以引入比现有突变有害程度低的新的突变等。要给予的寡核苷酸的量、剂量和剂量方案可以取决于不同的细胞类型、要治疗的疾病、目标人群、给药方式(例如，全身与局部)、疾病严重程度和可接受的副活性水平而变化，但这些均可以且应当在体外研究中、在临床前和临床试验中通过试错进行评价。当修饰的序列导致易于检测的表型变化时，试验尤其直接。有可能较高剂量的寡核苷酸可以竞争结合细胞内的核酸编辑实体(例如，ADAR)，从而耗尽实体自由参与RNA编辑的量，但常规的剂量试验将会揭示指定寡核苷酸和指定目标的任意这些效果。

一项合适的试验技术涉及到将寡核苷酸构建物递送至细胞系或测试有机体，然后在之后的不同时间点取活检样品。目标RNA的序列可以在活检样品中评价，具有修饰的细胞的比例能够很容易获知。该试验已进行之后，则可以保留该知识，并可以在无需取活检样品的情况下进行未来的递送。本发明的方法因此可以包括在细胞的目标RNA序列中鉴别所需改变的存在的步骤，从而验证目标RNA序列已得以修饰。该步骤将典型地包括对目标RNA或其cDNA拷贝(或者在目标RNA是前mRNA的情形中，其剪接产物的cDNA拷贝)的相关部分进行测序，如上文所述，从而可以容易地验证序列的变化。另外可选地，变化可以在蛋白质水平上评价(长度、糖基化、功能等)，或者通过一些功能读出评价，例如，当由目标RNA序列编码的蛋白质是离子通道时，通过(诱导型)电流评价。在CFTR功能的情形中，在包括人的哺乳动物中的尤斯灌流室(Ussing chamber)检验或NPD测试是本领域技术人员公知的，用以评价功能的恢复或获得。

细胞中已发生RNA编辑之后，修饰的RNA可以随时间而稀释，例如，因为细胞分裂、编辑的RNA的半衰期有限等。因此，在实际治疗期间，本发明的方法可以涉及重复递送寡核苷酸构建物，直至足够的目标RNA得以修饰，以便为患者提供切实的益处和/或随着时间保持益处。

本发明的寡核苷酸特别适合用于治疗用途，因此本发明提供一种药物组合物，其包括本发明的寡核苷酸和药学可接受的载体。在本发明一些实施方式中，药学可接受的载体可以仅是盐水溶液。等渗的或低渗的可以是有用的，特别是对于肺部递送。本发明还提供包括本发明的药物组合物的递送装置(例如，注射器、吸入器、雾化器)。

如本文所述，本发明还提供在哺乳动物、优选人细胞中的目标RNA序列中产生变化的方法中使用的本发明的寡核苷酸。类似地，如本文所述，本发明提供本发明的寡核苷酸构建物在制造用于在哺乳动物、优选人细胞的目标RNA序列中产生变化的药物中的用途。

本发明还涉及对细胞中目标RNA序列中存在的至少一种特定的目标腺苷进行脱氨基化的方法，所述方法包括以下步骤：提供具有根据本发明的AON的所述细胞；使所述AON被细胞摄取；使所述AON退火至目标RNA序列；使包括野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的哺乳动物ADAR酶将所述目标RNA序列中的所述目标腺苷脱氨基化成肌苷；和任选地，在RNA序列中鉴别所述肌苷的存在。将根据本发明的AON引入到细胞中通过本领域技术人员已知的通常方法进行。脱氨基化之后效果(目标RNA序列的变化)的读出可以通过不同的方式监测。因此，目标腺苷的所需脱氨基化是否已实际发生的鉴别步骤通常取决于目标腺苷在目标RNA序列中的位置，以及腺苷的存在招致的效果(点突变、早期终止密码子、异常剪接位点、选择剪接位点、产生的蛋白质的错误折叠等)。因此，在优选的方面，取决于A到I转化的最终的脱氨基化效果，鉴别步骤包括：对目标RNA进行测序；当所述目标腺苷位于通过所述脱氨基化编辑成UGG密码子的UGA或UAG终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；当两个目标腺苷位于通过两个目标腺苷的脱氨基化编辑成UGG密码子的UAA终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；评价前mRNA的剪接是否通过所述脱氨基化改变；或者使用功能性读出，其中所述脱氨基化之后的目标RNA编码功能性、全长、延长的和/或野生型蛋白质。在存在有UAA终止密码子的情形中，这意味着两个腺苷均需被脱氨基化。因此，本发明还涉及其中两个彼此紧挨着的腺苷通过RNA编辑酶(例如ADAR)被共脱氨基化(co-deaminated)的寡核苷酸和方法。在该特殊情形中，将UAA终止密码子转化成UGG Trp-编码密码子(参见表1)。

由于将腺苷脱氨基化成肌苷可以导致蛋白质不再在目标位置处受困于突变的A，脱氨基化成肌苷的鉴别也可以是个功能性读出，例如，评价是否存在有功能性蛋白质，或者甚至是评价因存在腺苷而导致的疾病是否得以(部分)逆转。本文所述的每种疾病的功能性评价通常是根据技术人员已知的方法。当目标腺苷的存在导致异常剪接时，读出可以是评价异常剪接是否仍然发生，还是不发生，还是较少发生。另一方面，当想要将目标腺苷的脱氨基化引入剪接位点时，则类似的方法可以用于检查所需的剪接类型是否实际上发生。目标腺苷的脱氨基化之后鉴别肌苷存在的非常适合的方式当然是使用本领域技术人员公知的方法进行RT-PCR和测序。

根据本发明的寡核苷酸适当地在水性溶液例如盐水、或悬浮液中给药，其任选地包括与药学用途相容的添加剂、赋形剂或其他成分，浓度范围为1ng/ml至1g/ml，优选10ng/ml至500mg/ml，更优选100ng/ml至100mg/ml。给药量范围可以适当地为大约1μg/kg至大约100mg/kg，优选大约10μg/kg至大约10mg/kg，更优选大约100μg/kg至大约1mg/kg。给药可以是通过吸入(例如，通过雾化)、鼻内、口服、通过注射或输注、静脉内、皮下、皮内、颅内、肌肉内、气管内、腹膜内、直肠内、通过直接注射到肿瘤中等。给药可以是固体形式的，可以是粉剂、丸剂的形式，或者可以是与人类药用相容的任何其他形式。

本发明特别适合用于治疗遗传病，例如囊性纤维化、白化病、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、阿尔茨海默氏病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、Hurler综合症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-eso1相关的癌症、帕金森氏病、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷、各种形式的癌症(例如，BRCA1和2相关的乳腺癌和卵巢癌)等。

在一些实施方式中，寡核苷酸构建物可以全身给药，但更典型的是将寡核苷酸递送至观察到目标序列表型的细胞。例如，CFTR中的突变导致主要在肺上皮组织中观察到的囊性纤维化，因此，对于CFTR目标序列，优选将寡核苷酸构建物特定地、直接地递送至肺部。这一点可以方便地通过将例如粉末或气溶胶典型地经由使用雾化器吸入来实现。特别优选使用所谓的振动筛网的雾化器，包括来自Respironics的PARI eFlow(快速)或i-neb。发明人已经发现，核苷酸构建物的吸入应用可以导致寡核苷酸构建物的全身分布，并被肠、肝、胰腺、肾和唾液腺组织等中的细胞摄取。因此，预计根据本发明的寡核苷酸构建物的吸入给药也可以有效地靶向这些细胞，其中在CFTR基因的情形中，该靶向可以导致也与囊性纤维化相关的胃肠道症状的减轻。对于其他目标序列，取决于疾病和/或目标器官，给药可以是局部(例如，在皮肤上)、皮肤内、皮下、肌肉内、静脉内、口服、眼部注射等。

在一些疾病中，粘液层表现出厚度增加，导致药物经由肺的吸收降低。这种疾病之一是慢性支气管炎，另一例子是囊性纤维化。可获得各种形式的粘液正常化药剂(mucusnormalizer)，例如脱氧核糖核酸酶(DNase)、高渗盐水或甘露醇，其均以Bronchitol的名称市售。当粘液正常化药剂与RNA编辑寡核苷酸构建物例如根据本发明的寡核苷酸构建物结合使用时，它们可以增加这些药物的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建物给予受试者、优选人受试者，优选地与粘液正常化药剂结合，优选本文所述的那些粘液正常化药剂。此外，根据本发明的寡核苷酸构建物的给药可以与用于治疗CF的小分子的给药相结合，上述小分子是例如增效剂化合物例如Kalydeco(ivacaftor；VX-770)，或者改正剂(corrector)化合物例如VX-809(lumacaftor)和/或VX-661。CF的其他组合疗法可以包括将根据本发明的寡核苷酸构建物的使用结合腺苷脱氨基酶诱导物，使用IFN-γ或TNF-γ。

另外可选地，或者与粘液正常化药剂结合，以粘液穿透颗粒或纳米颗粒给药，可以用于将RNA编辑分子有效递送至例如肺和肠的上皮细胞。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建物给予受试者、优选人受试者，优选地使用以粘液穿透颗粒或纳米颗粒给药。

慢性和急性肺部感染常常存在于例如囊性纤维化的疾病患者中。抗生素治疗减轻细菌感染和例如粘液增厚和/或形成生物膜的症状。由于寡核苷酸构建物更易于接近目标细胞，将抗生素与根据本发明的寡核苷酸构建物结合使用可以增加RNA编辑的有效性。因此，将根据本发明的寡核苷酸构建物给予受试者、优选人受试者，优选地与抗生素治疗结合，以减轻细菌感染和例如粘液增厚和/或形成生物膜的症状。抗生素可以全身或局部或以这两种方式给药。

对于例如在囊性纤维化患者中的应用，根据本发明的寡核苷酸构建物、或者包装或复合的根据本发明的寡核苷酸构建物，可以与以下任意者组合：粘液正常化药剂，例如脱氧核糖核酸酶、甘露醇、高渗盐水，和/或抗生素，和/或用于CF治疗的小分子，例如增效剂化合物例如ivacaftor，或者改正剂化合物例如lumacaftor和/或VX-661。为了增加对目标细胞的接近，可以应用支气管肺泡灌洗(Broncheo-Alveolar Lavage，BAL)，以便在给予根据本发明的寡核苷酸之前清洁肺部。

实施例

实施例1：使用不同的反义寡核苷酸编辑GFP目标RNA中的无义突变以及序列分析

首先在使用HeLa细胞的细胞系统中对RNA编辑进行考察，上述细胞含有稳定地整合到细胞基因组中的编码绿色荧光蛋白(GFP)的表达构建物。在该构建物中，已经在密码子位置57处引入有终止密码子(TAG)，导致在mRNA中存在有三联体UAG。在该三联体中间的腺苷处进行RNA编辑将最终导致正常全长蛋白质的表达。使用本领域普通技术人员已知的技术产生构建物(参见下文)和细胞系。

考察使用与目标RNA相比较包括不同错配的一系列不同反义寡核苷酸，是否可以将该三联体中间的A实际上脱氨基化成I(其随后被读成G)，参见图1。对UAG三联体的编辑将产生UGG，其代表Trp密码子，并随后产生功能性GFP蛋白质。为了保证目标RNA中其他腺苷不会被编辑，反义寡核苷酸中仅三个与终止密码子相对的核苷酸(每个寡核苷酸中的3′-ACC-5′，在中间具有错配的C，参见图1)不含有2′-OMe基团，而反义寡核苷酸中所有其他核苷酸则含有该基团。而且，所有测试的寡核苷酸每侧端部的4个连接是硫代磷酸酯键，而其余连接是正常的磷酸二酯键。

作为第一步，考察序列分析是否能够揭示，该位置处的核苷酸确实能够通过本发明的任意寡核苷酸和ADAR2的组合得以编辑。出于这一点，将0.4x 10⁶稳定表达GFPstop57构建物的HeLa细胞在每孔中(6-孔板)接种在具有10％胎牛血清的Dulbecco′s modifiedEagle′s培养基中。24小时之后，使用Lipofectamine 3000将用于后续AON转染的细胞用2μgADAR2过量表达质粒(RC212324；Origene)转染。48小时后，使用Lipofectamine 3000将选择的细胞样品用0、50或100nM每种AON(参见图1)转染。再过24小时之后，从溶解的细胞中分离出RNA，并用作cDNA合成的模板。使用本领域技术人员已知的普通RT-PCR和测序方法，通过RT-PCR(正向引物5′-AGAGGGTGAAGGTGATGCAA-3′(SEQ ID NO：7)和反向引物5′-GGGCATGGCACTCTTGAAAA-3′(SEQ ID NO：8))，然后对PCR产物进行桑格(Sanger)测序，进行RNA编辑的分析。A到I的编辑效率可以通过RT-PCR产物的桑格测序分析，其中A到I的编辑在测序图谱中应当是明显的信号强度从A到G的(部分)转变。尽管该方法并不是完全定量的，A和G频率的比例可以用作A到I的编辑效率的近似推测。如所预计，在没有用任何AON转染的样品中，目标位点处没有观察到与A峰重叠的G的信号(图2，小图A和B)。相反地，在用AON转染的样品中，在该位置处观察到部分变成G，如A和G峰(图2中分别为绿色和黑色)的重合所指示。效果是不同的：尽管每种AON均可以在目标位点处观察到少量的重合G信号，但AONADAR58和ADAR59的效果最强(图2G-J)。

摆动碱基对在RNA二级结构中发挥基本作用，并在tRNA中大量存在。它们在RNA序列中的出现非常经常地靠近凸起的RNA结构、回环和错配。为了考察AON中摇摆碱基对的存在对RNA编辑的影响，本发明的发明人设计出含有5个摇摆碱基对的ADAR72-1。考察其在GFP目标RNA中(参见上文)诱导无义突变编辑的能力，并与具有完全相同的序列、但没有摆动碱基对的寡核苷酸ADAR59-2(＝ADAR59，参见上文)进行比较：

上链是AON，而下链是5′到3′目标RNA。目标腺苷是黑体的。错配和摆动加以下划线，箭头表示额外的摆动碱基对的位置。

如下所示对ADAR59-2(＝ADAR59；SEQ ID NO：4，另外参见实施例5)和ADAR72-1(SEQ ID NO：34)进行化学修饰：小写表示2′-O-甲基修饰的RNA核苷酸，而大写的核苷酸是未修饰的RNA核苷酸。星号表示AON 3′和5′端处的核苷间硫代磷酸酯键。错配和摆动通过下划线表示。

ADAR59-2

ADAR72-1

ADAR59-2和ADAR72-1均使用具有ADAR2的过量表达同种型2(ADAR2a)的HEK293细胞裂解物在体外编辑检验中进行测试。使用具有过量表达的ADAR2a、但没有AON的HEK293细胞裂解物作为阴性对照。为了得到裂解物，首先使用Lipofectamine 3000将HEK293细胞用500ng ADARB1表达质粒(OriGene)转染过夜。然后将细胞用Lysis-M试剂溶解。在体外编辑检验缓冲液中将200nM AON和90nM模板ssRNA在30℃下一起预孵育30分钟。预孵育之后，加入细胞裂解物(10μl)，将反应混合物在30℃下孵育30分钟，随后在37℃下孵育30分钟。然后通过苯酚氯仿提取法提取目标RNA，并使用Maxima RT试剂使用制造商的方案，对其进行逆转录，如上所述准备测序。图3中提供的测序数据表明，对于其中没有使用AON的样品，没有可检测的A到I的编辑：背底之上观察不到G信号。相反，对于在编辑检验中使用寡核苷酸ADAR59-2的样品，可见明显的G信号的存在。此外，对于寡核苷酸ADAR72-1，甚至显示出强度更高的G信号，说明在目标RNA/AON序列中存在额外的摆动碱基对有助于增加A到I的编辑。

实施例2.Hurler综合症治疗中的RNA编辑

使用本发明系统的RNA编辑的一种潜在的疾病靶标是黏多糖病型I-Hurler(MPSI-H；Hurler综合症)。该疾病由IDUA基因中的c.1205G＞A(W402X)突变导致，其编码溶酶体酶α-L-艾杜糖苷酸酶。使用本发明的方法和手段将A编辑成I将会潜在地将突变逆转成野生型序列。Hurler综合症是溶酶体贮积症，其由于糖胺聚糖的积累导致多器官衰竭。存在具有类似突变(W392X)的小鼠模型，其在内源性基因中具有突变。在该小鼠模型中进行最初实验，评价在不同组织和器官中的作用。而且，评价在不同组织中的糖胺聚糖水平，以评价编辑方法的治疗潜力。

小鼠Idua基因的外显子9的一部分序列如下(突变是黑体的)：

该DNA序列是SEQ ID NO：11，对应的RNA序列是SEQ ID NO：12。本发明的发明人产生若干种指向来自Idua序列该部分的前mRNA的反义寡核苷酸，其使用小鼠模型如本文所概述用于RNA编辑，序列如下(上链是3′-5′寡核苷酸；下链是5′-3′目标RNA(SEQ ID NO：12)；错配和摆动加以下划线)：

ADAR65(SEQ ID NO：13)、ADAR65-2(SEQ ID NO：24)、ADAR65-2x(SEQ ID NO：25)、ADAR66(SEQ ID NO：14)、ADAR67(SEQ ID NO：15)、ADAR91(SEQ ID NO：26)和ADAR93(SEQ IDNO：27)具有若干如下化学修饰：

小写字母表示2′-O-甲基修饰的RNA核苷酸，大写的核苷酸是未修饰的RNA核苷酸(因此，没有2′-O-甲基修饰)，并在与目标腺苷相对的中心胞苷周围，除了ADAR65-2，其在所有核苷酸上均具有2′-O-甲基修饰。星号表示寡核苷酸所有端部的(4)硫代磷酸酯键。错配和摆动由下划线表示。ADAR91相对于目标RNA具有5个错配/摆动(区)，ADAR67具有4个，ADAR93和ADAR65-2X二者均具有2个，而ADAR65、ADAR65-2和ADAR66AON仅在目标腺苷相对的核苷酸处不同。ADAR65和ADAR66在修饰方面相同，但ADAR66在3′端比ADAR65短2个核苷酸。

在测量由Idua编码的α-L-艾杜糖苷酸酶活性的检验中，测试这些AON对恢复野生型序列的作用。出于这一点，将获自W392X小鼠的永生化胚胎成纤维细胞(70,000/样品)在生长培养基(DMEM/10％FCS)中培养，并使用Lipofectamine 3000用1μg表达Idua W392XmRNA的质粒转染。24小时之后，将细胞类似地用100nM(最终浓度)寡核苷酸转染，并继续培养48小时。然后收集细胞，并在mPER缓冲液(Thermo Scientific#78501)中溶解。通过离心从裂解物中除去细胞碎片，将25μl上清液用于酶检验：将25μl 360μM的4-甲基伞形酮基α-L-艾杜糖醛酸/0.4M甲酸钠缓冲液(pH 3.5)加入到裂解物样品中，然后在37℃下孵育2小时。通过加入200μl 0.17M甘氨酸缓冲液(pH 9.9)使反应终止，然后测量产生的荧光强度(激发波长365nm，发射波长450nm)。将结果均一化至样品总蛋白质浓度，如通过BCA检验(Pierce^TM BCA蛋白质检验试剂盒，Thermo Scientific)所测量。

结果(参见图4)清楚地表明，在这些条件下，与来自仅表达突变Idua mRNA的未经寡核苷酸处理的细胞(NT)的样品获得的荧光相比较，用寡核苷酸ADAR65-2和ADAR 93-1转染导致酶活性仅有微小的增加(小于2倍)。相反，其他AON观察到明显的增加，AONADAR67和ADAR91导致活性增加超过2倍，AON ADAR66、ADAR65和ADAR65-2X分别导致3倍、4倍和6倍的增加。

随后，基于寡核苷酸、目标RNA和ADAR蛋白质之间的相互作用的模拟数据，发明人预想，编辑位点上游4位的寡核苷酸的错配可以提高ADAR蛋白质与目标RNA的结合，从而增加编辑效率和编辑水平。设计出4种寡核苷酸(ADAR93-2、ADAR93-3、ADAR93-4和ADAR93-5)以测试4位上的错配对小鼠Idua突变基因(W392X)的目标前mRNA的编辑以及其WT序列恢复的效果。

上链是寡核苷酸，下链是具有黑体的突变(A)的目标RNA。错配和摆动加以下划线。用箭头表示寡核苷酸ADAR93-3和ADAR93-5与目标序列之间的错配，其在目标序列中突变上游4个核苷酸位置处。ADAR92-2(除该错配以外)与ADAR93-3相同。ADAR93-4(除该错配以外)与ADAR93-5相同。ADAR93-2(SEQ ID NO：28)、ADAR93-3(SEQ ID NO：29)、ADAR93-4(SEQ IDNO：30)和ADAR93-5(SEQ ID NO：31)具有若干如下化学修饰：

ADAR93-2

ADAR93-3

ADAR93-4

ADAR93-5

小写字母表示2′-O甲基修饰的RNA核苷酸，大写的核苷酸是未修饰的RNA核苷酸(因此，没有2′-O甲基修饰)。核苷酸之间的星号表示硫代磷酸酯键。错配和摆动通过下划线表示。

这4种寡核苷酸对野生型序列恢复的效果在如上所述的编辑和酶检验中加以测试。如图5(A)和(B)所示，引入寡核苷酸ADAR93-2和ADAR93-5与目标序列的C-A错配表现出对于编辑的积极作用，其与没有错配的寡核苷酸(分别为ADAR93-2和ADAR93-4)相比较时由荧光信号的增加所示。这表明编辑位点上游4位的额外的错配(上游＝目标序列中朝向5′)可以进一步有助于ADAR蛋白质与目标RNA结合，其则导致编辑效率增加。

实施例3.AIAT-缺乏症治疗中的RNA编辑

使用本文所述方法进行RNA编辑的另一疾病靶标是A1AT缺乏症(A1ATD)，其由SERPINA1基因中的c.1096G＞A突变导致。对于体外和体内递送，目标是人c.1096G＞A突变序列。小鼠模型含有人源化序列。对于体内递送，按照本发明的教导设计的构建物的主要目标是肝，因为这是大多数A1AT产生的地点。评价基于观察到的RNA水平的编辑活性，以及与疾病相关的肺和肝表型的功能挽救。

实施例4.帕金森氏病治疗中的RNA编辑

使用本发明的方法进行RNA编辑的另一疾病靶标是帕金森氏病，其由LRRK2基因中的c.6055G＞A突变导致。这是与帕金森氏病相关的最常见的遗传原因。测试各种方法以用如本文所述设计的反义寡核苷酸靶向脑部，以使用小鼠模型进行直接注射开始。效力的评价主要是基于在RNA水平上观察到的编辑活性。另外研究了细胞的磷酸化蛋白质组，以确立由突变造成的过度活跃的激酶活性(已知影响例如Rab GTP酶(GTPase))得以逆转。最后，评价对小鼠黑质纹状体多巴胺能神经元完整性的效果。

实施例5.内源性ADAR的RNA编辑

为了考察是否可以在不过量表达外源性ADAR酶的情况下实现RNA编辑，首先评价哪些可获得的细胞系表达ADAR1和/或ADAR2。这些细胞(如果(过量)表达ADAR1和/或ADAR2)则将用构建物转染，该构建物包括实施例1所述的GFP终止密码子、连同所关注的寡核苷酸以编辑GFP终止子。最初测试以下细胞系的ADAR表达：A549(人肺癌)、HCT116(人结肠癌)、T84(人结肠癌)、SNU-449(人肝细胞癌)、SNU-475(人肝细胞癌)、PANC1(人胰腺癌)、SK-N-SH(人成神经细胞瘤)和MCF7(人乳腺癌)。A549细胞保持于RPMI1640+10％FBS中，HCT116(ATCC#62765668)保持于McCoy′s 5A+10％FBS中，T84保持于DMEM：F12(1∶1)+10％FBS中，SNU-449(ATCC#63014146)保持于RPMI1640+10％FBS中，SNU-475(ATCC#62996846)保持于RPMI1640+10％FBS中，PANC1保持于DMEM+10％FBS中，SK-N-SH保持于MEME+10％FBS+5ml/LNaPyr+5ml/L Glutamax中，MCF7细胞保持于DMEM+10％FBS中。每个细胞系中ADAR1和ADAR2的表达使用蛋白质印迹检查。出于这一点，收获细胞，并使用Pierce BSA蛋白质检验试剂盒(Thermo Scientific)使用制造商的方案进行蛋白质定量。将等量的蛋白质在SDS-PAGE凝胶上分离，并转移至膜上用于分析。首先，将印迹用Ponceau S染色，以将总蛋白质负荷可视化，其似乎对于所有细胞系/条带是相等的(数据未示出)。接下来，将膜在PBS-T中洗涤1x，在4℃下在辊台O/N上在10ml原代小鼠抗-ADARB1(SAB1405426(Sigma)；0.05％PBS-T中1∶1000)和小鼠抗-ADAR1(GT1066ab184527(Abeam)0.05％PBS-T中1∶1000)和兔抗-微管蛋白(0.05％PBS-T中1∶5000)抗体溶液中孵育。次日，将膜用PBS-T洗涤3x 5分钟，并在RT下用1∶5000抗-小鼠IRDye 800CW和1∶5000抗-兔IRDye680RD二抗溶液孵育1小时。将膜用PBS-T洗涤3x 5分钟，然后用PBS洗涤5分钟。以700和800的波长和自动成像设定，将膜用OddyseyCLx成像系统(LiCor Bioscence)扫描。

蛋白质印迹如图6所示。尽管从B-微管蛋白表达可以推导所有细胞系的蛋白质装样是相等的，似乎除人乳腺癌细胞系MCF7以外所有细胞系的ADAR1表达是类似的，上述人乳腺癌细胞系中的表达显著较低。另一方面，除人肝细胞癌SNU-475以外所有细胞系的ADAR2表达是类似的，似乎在上述人干细胞癌中其存在但丰度显著较低。其他6种细胞系似乎在相当的水平上表达ADAR1和ADAR2。由于所有的细胞系均得以证实表达ADAR1或ADAR2或ADAR1和ADAR2二者，除了似乎难以转染的T84以外，对所有细胞进行测试以考察RNA编辑酶的这些内源性水平是否足以在目标序列中在预定的位置处对RNA进行编辑。出于这一点，将细胞用目标序列(GFPstop57)和寡核苷酸转染。GFPstop57表达构建物(图10A)是与HeLa细胞系(实施例1)的产生中所用者相同的构建物，其具有稳定整合的GFPstop57序列(SEQ ID NO：9；图10B)，由于残基58处的终止子，该序列编码57个氨基酸的蛋白质(氨基酸序列为SEQ ID NO：10；图10B)。

将细胞以大约0.3x10⁶细胞/孔在6孔板中平板接种在2ml培养基中。平板培养24小时之后，应用本领域技术人员已知的通用技术使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)将细胞用1000ng GFPstop57质粒和Opti-Mem(Gibco)转染。该转染之后6小时，加入2ml新鲜培养基，平板培养48小时之后，将细胞用100nM寡核苷酸转染，再过6小时之后，加入2ml新鲜培养基。用寡核苷酸转染之后30小时，收集细胞。乱序(scrambled)寡核苷酸和Mock(Cy5)一起转染作为阴性对照。分别对以下反义寡核苷酸进行测试，其与实施例1和图1和SEQ ID NO：1-4中所示者类似：

ADAR56-2

ADAR57-2

ADAR58-2

ADAR59-2

小写是2′-O甲基修饰的RNA核苷酸，大写的核苷酸是未修饰的RNA核苷酸(因此，没有2′-O甲基修饰)，并围绕GFPstop57中的与目标腺苷相对的中心C。星号(*)表示寡核苷酸端部处核苷酸之间的硫代磷酸酯键。

转染之后36小时，从溶解的细胞中分离出RNA，并用作cDNA合成和PCR的模板。RNA质量用Agilent 2100生物分析仪检查。使用本领域技术人员已知的通用RT-PCR和测序方法，通过实施例1所述的RT-PCR，然后对PCR产物进行桑格测序，进行RNA编辑的分析。RT-PCR表明，用GFPstop57构建物和寡核苷酸转染的所有5种其余细胞系(除用ADAR59-2转染的SK-N-SH细胞以外)确实产生了175种核苷酸产物(数据未示出)。来自不同细胞系的PCR产物均用于序列分析，其使用GFP正向3(SEQ ID NO：7，参见上文)和GFP反向3引物(SEQ ID NO：8，参见上文)。在A549、HCT116和PANC1细胞中，在背底水平之上没有检测到TAG-＞TGG(正向)或CTA-＞CCA(反向)的明显转变，而在SNU-449细胞中，ADAR56-2和ADAR59-2寡核苷酸观察到一些转变(数据未示出)。SNU-475和MCF7细胞得到远在背底之上的最清楚结果。图7显示了测序中使用正向(FWD)和反向(REV)引物的4种寡核苷酸对于SNU-475(肝癌)细胞的结果。图8显示了测序中使用正向(FWD)引物的4种寡核苷酸对于MCF7(乳腺癌)细胞的结果。这些图在目标位置处表现出非常明显和显著的序列转变，其中似乎ADAR59-2在MCF7中提供最好的结果，而使用所有4种寡核苷酸均在SNU-475细胞中观察到内源性ADAR的RNA编辑。图9提供了使用ADAR57-2之后的测序结果(还参见图7左下)，其表明仅在目标腺苷处(箭头)发生脱氨基化，说明在腺苷周围处没有发生混杂编辑，且本发明的AON和方法保证了非常位点特异性的编辑。这些结果表明，本发明的发明人实现了细胞中的RNA编辑，其中在无需过量表达RNA编辑酶的情况下、即依赖于内源性ADAR蛋白质的酶活性，以位点特异性方式(即，仅编辑AON靶向的RNA序列中的一个腺苷；参见图9)，引入目标序列和RNA-编辑诱导性寡核苷酸(具有特定修饰)。

实施例6.通过内源性ADAR对内源性目标进行RNA编辑

在如实施例5所述实现用内源性ADAR酶进行RNA编辑之后，考察在不使用目标序列共转染的情况下是否也可以实现用内源性ADAR酶进行RNA编辑。本发明的发明人选择小核核糖核蛋白多肽A(Snrpa)作为内源性目标，因为其具有相对较高的丰度和普遍的表达。该基因编码与U1小核核糖核蛋白的茎环II有关的蛋白质，其与前体mRNA的5′剪接位点结合并且为剪接所要求。设计AON以编辑小鼠Snrpa mRNA的野生型终止密码子(UAG)，其继而有可能导致开放可读框延长，以及下游序列编码扩大的蛋白质(图11)。

首先设计两种AON：ADAR87-1和ADAR89-1(参见表2)，并在Hepa 1-6细胞中进行测试，上述细胞是源自在C57/L小鼠中产生的BW7756小鼠肝细胞瘤的细胞系。在转染之前24小时，将细胞以200,000细胞/孔于常规培养基(DMEM+10％FCS)中平板接种在6孔板中。24小时之后，细胞或不进行转染(NT对照，仅AON)，或者使用Lipofectamine 2000(Invitrogen)按照制造商的方案用1000ng编码ADAR2的短同种型(ADAR2sh)的质粒转染。加入转染混合物之前改变培养基，在不转染的情况下更新孔中的培养基。再过24小时之后，将细胞或再次不转染(NT对照)，或者用最终浓度100nM AON/孔的ADAR87-1或ADAR89-1转染。转染之前更新培养基。

二次转染之后(或者在仅AON的情形中，单一转染之后)，将细胞在37℃下孵育48小时。除去培养基，将细胞用1x PBS洗涤一次，向每孔中加入400μl Trizol用于细胞溶解。然后将Trizol收集在1.5ml Eppendorf管中，按照制造商提供的说明书用Direct-Zol RNAminiprep(Zymo)提取RNA。使用Nanodrop测量RNA浓度，使用500ng RNA用于用Maxima逆转录酶试剂盒(ThermoFisher Scientific)进行cDNA合成。在第一步中，通过与1.2μl(2μM)部分互补的反义寡核苷酸mSnrpa-SON3一起孵育，将AON与目标mRNA解缔合：5′-U*C*C*U*UUGCCAAGAAGUGGCACCUUUUCCUCCCAUGCCUACUCC*U*U*C*C-3′(SEQ ID NO：20)。mSnrpa-SON3中的星号表示核苷间硫代磷酸酯键。该寡核苷酸中的所有核苷酸都是2′-O-甲基化的。使用制造商的方案进行cDNA合成。使用本领域技术人员通常知晓的方法，使用正向引物Fw1_mSNRPA5′-GCCTTCGTGGAGTTTGACA-3′(SEQ ID NO：21)和反向引物Rev1_mSNRPA 5′-ACACACGGCTCTGAGAAGGT-3′(SEQ ID NO：22)进行PCR。将PCR产物在Agilent2100生物分析仪上检查，并用Nucleo-Spin Gel and PCR clean-up试剂盒(Macherey-Nagel)提纯，提纯的产物用测序引物Snrp-1-Fw15′-CGTGGAGTTTGACAATGAAGT-3′(SEQ ID NO：23)进行测序。

表2.A、C、G和U是RNA；有下划线的C和A是DNA；mA、mC、mG和mU是2′-O甲基化核糖核苷酸；星号表示硫代磷酸酯键。

当使用ADAR87-1时，没有观察到背底以上的编辑(数据未示出)。ADAR89-1寡核苷酸导致的RNA编辑结果提供于图12中。小图(A)显示未转染(NT)对照，其在终止密码子位置处(箭头示出)没有任何可检测到的RNA编辑。小图(B)显示其中仅转染编码ADAR2短同种型的质粒的对照。小图(C)显示G峰的增加，其由箭头指示。这种明显在背底之上的增加说明，在仅用ADAR89-1AON转染之后，在没有用ADAR2过量表达质粒转染的细胞中，在所需的位置处发生了(A-＞I)RNA编辑。小图(D)显示具有ADARsh表达质粒和AON的阳性对照。据信该结果(小图C)是首次在不存在ADAR过量表达并且没有共转染导致目标RNA过量表达的质粒的情况下，通过引入反义寡核苷酸特异性地在所需的位置处观察到诱导的RNA编辑。

设计两种其他寡核苷酸：ADAR89-2和ADAR94-1(参见表2)，其中中心三联体CCA(中间的核苷酸C与要编辑的腺苷相对)是DNA，同时其余寡核苷酸是2′-O-甲基-修饰的。ADAR89-2的序列与ADAR89-1相同，但是ADAR94-1的序列与ADAR89-2相比较具有2个额外的错配(参见图12)。这些AON在以上该实施例中所述的相同检验中在Hepa 1-6细胞中进行测试。产生的测序数据描绘于图13中，其显示未转染的对照(NCTRL)中没有检测到RNA编辑。寡核苷酸ADAR89-2的测序数据显示，在编辑位点处存在有G核苷酸，如箭头所指示，这表明当中心三联体是DNA(不是RNA)时也可以实现良好的编辑。将对核酸酶非常敏感的中心三联体RNA核苷酸用DNA取代可以增加AON的稳定性。寡核苷酸ADAR94-1的G峰信号明显增加，表明在ADAR89-2序列中的位置10和14处插入两个额外的错配对于内源性Snrpa前mRNA编辑具有更加积极的作用，这再次说明额外的凸起、错配和/或摆动可以进一步增加RNA编辑效率(其在全部不同的目标中非常有可能取决于多种因素，例如序列、AON-RNA螺旋的熔点、重叠、二级结构等)。

实施例7.对RNA进行编辑以修复编码BDNF的RNA中的Val66Met突变

单链RNA编辑诱导寡核苷酸的设计可以用于多种RNA目标以及与包括突变的这些目标相关的多种疾病和病症。最近识别的阿尔茨海默氏病的潜在靶标之一是脑源性神经营养因子(BDNF)Val66Met多态型，其也是由G到A的突变导致(Boots等人Neurology May 30，2017.Vol 88(22)：2098-2106)。使用本文所述的AON在特定的BDNF mRNA位置处对RNA进行编辑。用于该目的的AON具有如下序列(下链是BDNF目标序列(SEQ ID NO：35)，上链表示寡核苷酸。修饰是2′-O-甲基(小写)、DNA(大写)、硫代磷酸酯键(星号)以及错配和摆动(下划线)。目标腺苷用黑体示出。

BDNF AON1(SEQ ID NO：36)

BDNF AON2(SEQ ID NO：37)

BDNF AON3(SEQ ID NO：38)

应当理解到，以上仅通过实施例的方式对本发明进行说明，并且可以在保持在本发明的范围和精神内的前提下做出各种改变。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种反义寡核苷酸(AON)，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且所述AON包括相对于互补的目标RNA区域的一个或多个错配、摆动和/或凸起；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；

d)所述AON不包括5′-端O6-苄基鸟嘌呤修饰；

e)所述AON不包括5′-端氨基修饰；并且

f)所述AON不与SNAP-标记结构域共价连接。

2.一种AON，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且所述AON包括相对于互补的目标RNA区域的一个或多个错配、摆动和/或凸起；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且

d)所述AON不是17-聚体或20-聚体。

3.一种AON，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且所述AON包括相对于互补的目标RNA区域的一个或多个错配、摆动和/或凸起；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且

d)所述AON的长度大于17个核苷酸，或者小于14个核苷酸。

4.一种AON，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且

d)所述AON包括相对于互补的目标RNA区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配、摆动和/或凸起。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的AON，其中与目标腺苷相对的核苷酸是胞苷、脱氧胞苷、尿苷或脱氧尿苷。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的AON，其中从与目标腺苷相对的核苷酸直接地5′和/或3′的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖。

7.根据权利要求5或6所述的AON，其中所述AON中的所有其他核苷酸包括2′-O-烷基，优选2′-O-甲基。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的AON，包括至少一个硫代磷酸酯键。

9.根据权利要求8所述的AON，其中所述AON的5′和3′端的2、3、4、5或6个端部核苷酸以硫代磷酸酯键连接。

10.根据权利要求9所述的AON，其中5′和3′端处的端部5个核苷酸以硫代磷酸酯键连接。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的AON，其中所述AON的长度大于10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的AON，其中所述AON的长度小于100个核苷酸，优选地小于60个核苷酸。

13.根据权利要求11或12所述的AON，其中所述AON包括18至70个核苷酸，优选18至60个核苷酸，更优选18至50个核苷酸。

14.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-13中任一项所述的AON和药学可接受的载体。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的AON，其用于治疗或预防遗传病，所述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-esol相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。

16.根据权利要求1-13中任一项所述的AON在制造用于治疗或预防遗传病的药物中的用途，所述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-esol相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。

17.一种对细胞中目标RNA中存在的至少一个目标腺苷进行脱氨基化的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供具有根据权利要求1-13中任一项所述的AON的细胞；

(ii)使AON被细胞摄取；

(iii)使AON退火至目标RNA

(iv)使包括在野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的ADAR酶将目标RNA中的目标腺苷脱氨基化成肌苷；和

(v)任选地，在目标RNA中鉴别肌苷的存在。

18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(v)包括：

a)对目标RNA序列进行测序；

b)当目标腺苷位于通过脱氨基化编辑成UGG密码子的UGA或UAG终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；

c)当两个目标腺苷位于通过两个目标腺苷的脱氨基化编辑成UGG密码子的UAA终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；

d)评价前mRNA的剪接是否通过脱氨基化改变；或者

e)使用功能性读出，其中脱氨基化之后的目标RNA编码功能性、全长、延长的和/或野生型蛋白质。

19.根据前述权利要求中任一项所述的AON或方法，其中目标RNA序列编码CFTR(例如，以编辑1784G＞A突变)、CEP290(例如，以编辑c.2991+1655A＞G突变)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT；例如，以编辑9989G＞A突变；或者1096G＞A突变)、LRRK2(例如，以编辑G6055突变)、BDNF(例如，以在RNA水平上修复Val66Met突变)，或者其中目标RNA通过IDUA基因编码(例如，以编辑c.1205G＞A(W402X)突变)。

Claims (19)

1.一种反义寡核苷酸(AON)，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且所述AON任选地包括相对于互补的目标RNA区域的一个或多个错配、摆动和/或凸起；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；

d)所述AON不包括5′-端O6-苄基鸟嘌呤修饰；

e)所述AON不包括5′-端氨基修饰；并且

f)所述AON不与SNAP-标记结构域共价连接。

2.一种AON，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且所述AON任选地包括相对于互补的目标RNA区域的一个或多个错配、摆动和/或凸起；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且

d)所述AON不是17-聚体或20-聚体。

3.一种AON，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补，并且所述AON任选地包括相对于互补的目标RNA区域的一个或多个错配、摆动和/或凸起；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且

d)所述AON的长度大于17个核苷酸，或者小于14个核苷酸。

4.一种AON，其能够在细胞中与目标RNA形成双链复合物，用于通过细胞中存在的ADAR酶对目标RNA中存在的目标腺苷进行脱氨基化，其中：

a)所述AON与包括目标腺苷的目标RNA区域互补；

b)所述AON包括一个或多个具有一个或多个糖修饰的核苷酸，其条件是与目标腺苷相对的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖；

c)所述AON不包括能够形成具有结合ADAR酶能力的分子内茎环结构的部分；并且

d)所述AON任选地包括相对于互补的目标RNA区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个错配、摆动和/或凸起。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的AON，其中与目标腺苷相对的核苷酸是胞苷、脱氧胞苷、尿苷或脱氧尿苷。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的AON，其中从与目标腺苷相对的核苷酸直接地5′和/或3′的核苷酸包括具有2′-OH基团的核糖或者具有2′-H基团的脱氧核糖。

7.根据权利要求5或6所述的AON，其中所述AON中的所有其他核苷酸包括2′-O-烷基，优选2′-O-甲基。

8.根据权利要求1-7中任一项所述的AON，包括至少一个硫代磷酸酯键。

9.根据权利要求8所述的AON，其中所述AON的5′和3′端的2、3、4、5或6个端部核苷酸以硫代磷酸酯键连接。

10.根据权利要求9所述的AON，其中5′和3′端处的端部5个核苷酸以硫代磷酸酯键连接。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的AON，其中所述AON的长度大于10、11、12、13、14、15、16或17个核苷酸。

12.根据权利要求1-11中任一项所述的AON，其中所述AON的长度小于100个核苷酸，优选地小于60个核苷酸。

13.根据权利要求11或12所述的AON，其中所述AON包括18至70个核苷酸，优选18至60个核苷酸，更优选18至50个核苷酸。

14.一种药物组合物，其包括根据权利要求1-13中任一项所述的AON和药学可接受的载体。

15.根据权利要求1-13中任一项所述的AON，其用于治疗或预防遗传病，所述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-esol相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。

16.根据权利要求1-13中任一项所述的AON在制造用于治疗或预防遗传病的药物中的用途，所述遗传病优选地选自：囊性纤维化、Hurler综合症、α-1-抗胰蛋白酶(A1AT)缺乏症、帕金森氏病、阿尔茨海默氏病、白化病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、哮喘、β-地中海贫血、Cadasil综合症、腓骨肌萎缩症、慢性阻塞性肺病(COPD)、远端脊髓性肌萎缩(DSMA)、Duchenne/Becker肌营养不良、营养不良性大疱性表皮松解症、大疱性表皮松解症、法布里病、莱顿第五因子相关疾病、家族性腺瘤、息肉病、半乳糖血症、高歇氏病、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、血友病、遗传性血色病、亨特综合症、亨廷顿氏舞蹈症、炎症性肠病(IBD)、遗传性多凝集反应综合症、雷伯氏先天性黑内障、Lesch-Nyhan综合症、林奇综合症、马凡综合征、黏多糖病、肌肉萎缩症、I型和II型肌强直性营养不良、神经纤维瘤、A、B和C型尼曼匹克氏病、NY-esol相关的癌症、Peutz-Jeghers综合症、苯丙酮尿症、庞佩氏病、原发性睫毛疾病、凝血酶原突变相关疾病，例如凝血酶原G20210A突变、肺动脉高血压、色素性视网膜炎、山德霍夫氏病、严重合并免疫缺陷综合征(SCID)、镰状细胞性贫血、脊髓性肌肉萎缩症、斯特格氏病、泰-萨二氏病、Usher综合症、X-连锁免疫缺陷和癌症。

17.一种对细胞中目标RNA中存在的至少一个目标腺苷进行脱氨基化的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供具有根据权利要求1-13中任一项所述的AON的细胞；

(ii)使AON被细胞摄取；

(iii)使AON退火至目标RNA

(iv)使包括在野生型酶中发现的天然dsRNA结合结构域的ADAR酶将目标RNA中的目标腺苷脱氨基化成肌苷；和

(v)任选地，在目标RNA中鉴别肌苷的存在。

18.根据权利要求17所述的方法，其中步骤(v)包括：

a)对目标RNA序列进行测序；

b)当目标腺苷位于通过脱氨基化编辑成UGG密码子的UGA或UAG终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；

c)当两个目标腺苷位于通过两个目标腺苷的脱氨基化编辑成UGG密码子的UAA终止密码子中时，评价功能性、延长的、全长和/或野生型蛋白质的存在；

d)评价前mRNA的剪接是否通过脱氨基化改变；或者

e)使用功能性读出，其中脱氨基化之后的目标RNA编码功能性、全长、延长的和/或野生型蛋白质。

19.根据前述权利要求中任一项所述的AON或方法，其中目标RNA序列编码CFTR(例如，以编辑1784G＞A突变)、CEP290(例如，以编辑c.2991+1655A＞G突变)、α1-抗胰蛋白酶(A1AT；例如，以编辑9989G＞A突变；或者1096G＞A突变)、LRRK2(例如，以编辑G6055突变)、BDNF(例如，以在RNA水平上修复Val66Met突变)，或者其中目标RNA通过IDUA基因编码(例如，以编辑c.1205G＞A(W402X)突变)。