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JP7252328B2 - Ｒｎａを編集する方法および組成物 - Google Patents

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JP7252328B2 JP2021520227A JP2021520227A JP7252328B2 JP 7252328 B2 JP7252328 B2 JP 7252328B2 JP 2021520227 A JP2021520227 A JP 2021520227A JP 2021520227 A JP2021520227 A JP 2021520227A JP 7252328 B2 JP7252328 B2 JP 7252328B2
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Description

（相互参照）
本出願は、２０１８年１０月１２日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１０１０５である国際出願、及び２０１９年４月１５日に提出された国際出願番号ＣＮ２０１９／０８２７１３である国際出願の優先権を享有することを主張する。それらの内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる。
ＡＳＣＩＩテキストファイルで提出された内容は、その全体が参照により本出願に取り込まれる：配列表のコンピュータ可読形態（ＣＲＦ）（ファイル名：ＦＣ００１５８ＰＣＴ－Ｎｅｗ－ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｌｉｓｔｉｎｇ－ＹＺＧ－ｚｈｃ．ＴＸＴ、記録日付：２０１９年１０月１１日、サイズ：１０４ＫＢ）。
本発明は、アデノシンデアミナーゼを動員して標的ＲＮＡ中の１つ以上のアデノシンを脱アミノ化することができる工学操作されたＲＮＡを使用してＲＮＡを編集するための方法および組成物に関する。
ゲノム編集は、生物医学研究および疾患治療法の開発のための強力なツールである。今まで、最もはやっている遺伝子編集技術は、細菌と古細菌の適応免疫システムから開発されたクラスター化された規則的に間隔を空けた短いパリンドロームリピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ，ＣＲＩＳＰＲ）－Ｃａｓシステムである。ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓは、ゲノムＤＮＡを正確に標的にして切断し、二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を生成することができる。ＤＳＢは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して修復でき、挿入または削除（Ｉｎｄｅｌ）を引き起こし、後者はほとんどの場合、遺伝子を不活性化させる。あるいは、相同性指向修復（ＨＤＲ）経路は、相同テンプレートｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを使用して前記ＤＳＢを修復し、正確なゲノム編集を実現できる。
最近、デアミナーゼタンパク質（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）など）を利用して、ＲＮＡ編集用の新しいツールが開発された。哺乳類細胞には、Ａｄａｒ１（２つのアイソフォーム、ｐ１１０とｐ１５０）、Ａｄａｒ２とＡｄａｒ３（触媒的に不活性）の３種類のＡＤＡＲタンパク質がある。ＡＤＡＲタンパク質の触媒基質は二本鎖ＲＮＡであり、アデノシン（Ａ）ヌクレオシド塩基から－ＮＨ２基を除去し、Ａをイノシン（Ｉ）に変更することができる。これは、グアノシン（Ｇ）として認識され、その後の細胞の転写および翻訳プロセス中にシチジン（Ｃ）とペアリングする。研究者らは、λＮペプチドをヒトＡｄａｒ１またはＡｄａｒ２デアミナーゼドメインに融合させてλＮ－ＡＤＡＲＤＤシステムを構築した。このシステムは、ＢｏｘＢステムループとアンチセンスＲＮＡからなる融合ＲＮＡによって誘導されて特定のＲＮＡ標的に結合することができる。この方法では、標的Ａの塩基に（Ａ－Ｃミスマッチを導入することで）標的ＡからＩに編集することができる。その結果、ＡからＧのＲＮＡ塩基が編集される。ＲＮＡ編集の他の方法には、アンチセンスＲＮＡをＲ／Ｇモチーフ（ＡＤＡＲ－動員ＲＮＡスキャフォールド）に融合して、哺乳類細胞でＡｄａｒ１またはＡｄａｒ２タンパク質を過剰発現させることにより、標的ＲＮＡを編集する方法や、ｄＣａｓ１３－ＡＤＡＲを使用してＲＮＡを正確に標的にして編集する方法が含まれる。
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許、特許出願、及び公開された特許出願の開示内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。
Ｐｏｒｔｅｕｓ， Ｍ． Ｈ． ＆ Ｃａｒｒｏｌｌ， Ｄ． Ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２３， ９６７－９７３ （２００５）． Ｂｏｃｈ， Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ｂｒｅａｋｉｎｇ ｔｈｅ ｃｏｄｅ ｏｆ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＴＡＬ－ｔｙｐｅ ＩＩＩ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６， １５０９－１５１２ （２００９）． Ｍｏｓｃｏｕ， Ｍ． Ｊ． ＆ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ， Ａ． Ｊ． Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｉｐｈｅｒ ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６， １５０１ （２００９）． Ｍｉｌｌｅｒ， Ｊ． Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９， １４３－１４８ （２０１１）． Ｊｉｎｅｋ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｄｕａｌ－ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＤＮＡ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ ｉｎ ａｄａｐｔｉｖｅ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｉｍｍｕｎｉｔｙ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３７， ８１６－８２１ （２０１２）． Ｃｏｎｇ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８１９－８２３ （２０１３）． Ｍａｌｉ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９， ８２３－８２６ （２０１３）． Ｋｏｍｏｒ， Ａ． Ｃ．， Ｋｉｍ， Ｙ． Ｂ．， Ｐａｃｋｅｒ， Ｍ． Ｓ．， Ｚｕｒｉｓ， Ｊ． Ａ． ＆ Ｌｉｕ， Ｄ． Ｒ． Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｂａｓｅ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５３３， ４２０－４２４ （２０１６）． Ｍａ， Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｔａｒｇｅｔｅｄ ＡＩＤ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ （ＴＡＭ） ｅｎａｂｌｅｓ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｉｃ ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３， １０２９－１０３５ （２０１６）． Ｇａｕｄｅｌｌｉ， Ｎ． Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ Ａ＊Ｔ ｔｏ Ｇ＊Ｃ ｉｎ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈｏｕｔ ＤＮＡ ｃｌｅａｖａｇｅ． Ｎａｔｕｒｅ ５５１， ４６４－４７１ （２０１７）． Ｔａｎ， Ｍ． Ｈ． ｅｔ ａｌ． Ｄｙｎａｍｉｃ ｌａｎｄｓｃａｐｅ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｍａｍｍａｌｓ． Ｎａｔｕｒｅ ５５０， ２４９－２５４ （２０１７）． Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ， Ｋ． Ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ＡＤＡＲ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ． Ａｎｎｕ Ｒｅｖ Ｂｉｏｃｈｅｍ ７９， ３２１－３４９ （２０１０）． Ｂａｓｓ， Ｂ． Ｌ． ＆ Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ， Ｈ． Ａｎ ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｔｈａｔ ｃｏｖａｌｅｎｔｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｓ ｉｔｓ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ． Ｃｅｌｌ ５５， １０８９－１０９８ （１９８８）． Ｗｏｎｇ， Ｓ． Ｋ．， Ｓａｔｏ， Ｓ． ＆ Ｌａｚｉｎｓｋｉ， Ｄ． Ｗ． Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ａｎｄ ＡＤＡＲ２． ＲＮＡ ７， ８４６－８５８ （２００１）． Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ． Ｆ．， Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ， Ｉ．， Ｙｕｄｏｗｓｋｉ， Ｇ． Ａ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｊ． Ｊ． Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ｃｙｓｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒ ｂｙ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１０， １８２８５－１８２９０ （２０１３）． Ｓｉｎｎａｍｏｎ， Ｊ． Ｒ． ｅｔ ａｌ． Ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ Ｍｅｃｐ２ ＲＮＡ ｉｎ ｎｅｕｒｏｎｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １１４， Ｅ９３９５－Ｅ９４０２ （２０１７）． Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ． Ｆ．， Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ， Ｉ． Ｃ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｊ． Ｊ． Ａｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ ｆｏｒ ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ ａｌｔｅｒｉｎｇ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｗｉｔｈｉｎ ｍＲＮＡｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， ｅ１５７ （２０１６）． Ｈａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ， Ａ．， Ｋｕｚｄｅｒｅ， Ｔ．， Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｊｅｋｅｌｙ， Ｇ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｃａｎ Ｂｅ Ｔｒｉｇｇｅｒｅｄ ｂｙ ｔｈｅ Ｌｉｇｈｔ－Ｄｒｉｖｅｎ Ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ａｎ Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｒｉｂｏｐｒｏｔｅｉｎ． Ｊ Ａｍ Ｃｈｅｍ Ｓｏｃ １３７， １５８７５－１５８８１ （２０１５）． Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ． Ｆ．， Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ．， Ｈｏｆｆｍａｎｎ， Ｐ． Ｃ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｏｐｔｉｍａｌ ｇｕｉｄｅＲＮＡｓ ｆｏｒ ｒｅ－ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｏｆ ｈＡＤＡＲ１ ａｎｄ ｈＡＤＡＲ２ ｉｎ ｔｒａｎｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４２， ｅ８７ （２０１４）． Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｈａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ， Ａ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｙ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｎｄｅｒ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｌｉｇｈｔ． ＡＣＳ ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｂｉｏｌｏｇｙ ６， １６４２－１６４９ （２０１７）． Ｖｏｇｅｌ， Ｐ．， Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ， Ｍ． Ｆ．， Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ ｂｙ ｃｈｅｍｉｃａｌ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｇｕｉｄｅＲＮＡ． Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ Ｃｈｅｍｉｅ ５３， ６２６７－６２７１ （２０１４）． Ｖｏｇｅｌ， Ｐ． ｅｔ ａｌ． Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎｄ ｐｒｅｃｉｓｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｓ ｗｉｔｈ ＳＮＡＰ－ｔａｇｇｅｄ ＡＤＡＲｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １５， ５３５－５３８ （２０１８）． Ｃｏｘ， Ｄ． Ｂ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ１３． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５８， １０１９－１０２７ （２０１７）． Ｆｕｋｕｄａ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｇｕｉｄｅ－ＲＮＡ ｆｏｒ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｕｔｉｌｉｓｉｎｇ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ａ－ｔｏ－Ｉ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ｒｅｐｏｒｔｓ ７， ４１４７８ （２０１７）． Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ．， Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ， Ｐ．， Ｇｅｉｓｌｅｒ， Ｓ．， Ｋａｈｌｅ， Ｐ． Ｊ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ｈａｒｎｅｓｓｉｎｇ ｈｕｍａｎ ＡＤＡＲ２ ｆｏｒ ＲＮＡ ｒｅｐａｉｒ － Ｒｅｃｏｄｉｎｇ ａ ＰＩＮＫ１ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒｅｓｃｕｅｓ ｍｉｔｏｐｈａｇｙ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５， ２７９７－２８０８ （２０１７）． Ｈｅｅｐ， Ｍ．， Ｍａｃｈ， Ｐ．， Ｒｅａｕｔｓｃｈｎｉｇ， Ｐ．， Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ， Ｊ． ＆ Ｓｔａｆｆｏｒｓｔ， Ｔ． Ａｐｐｌｙｉｎｇ Ｈｕｍａｎ ＡＤＡＲ１ｐ１１０ ａｎｄ ＡＤＡＲ１ｐ１５０ ｆｏｒ Ｓｉｔｅ－Ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ Ｅｄｉｔｉｎｇ－Ｇ／Ｃ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚｅｓ ＧｕｉｄｅＲＮＡｓ ａｇａｉｎｓｔ Ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｇｅｎｅｓ （Ｂａｓｅｌ） ８ （２０１７）． Ｋａｔｒｅｋａｒ， Ｄ． ｅｔ ａｌ． Ｉｎ ｖｉｖｏ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｖｉａ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １６， ２３９－２４２ （２０１９）． Ｙｉｎ， Ｈ．， Ｋａｕｆｆｍａｎ， Ｋ． Ｊ． ＆ Ａｎｄｅｒｓｏｎ， Ｄ． Ｇ． Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖ １６， ３８７－３９９ （２０１７）． Ｐｌａｔｔ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｋｎｏｃｋｉｎ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ ｃａｎｃｅｒ ｍｏｄｅｌｉｎｇ． Ｃｅｌｌ １５９， ４４０－４５５ （２０１４）． Ｃｈｅｗ， Ｗ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｍｕｌｔｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ＡＡＶ－ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ａｎｄ ｉｔｓ ｈｏｓｔ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ １３， ８６８－８７４ （２０１６）． Ｔｅｏｈ， Ｐ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． Ａｂｅｒｒａｎｔ ｈｙｐｅｒｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｙｅｌｏｍａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｂｙ ＡＤＡＲ１ ｃｏｎｆｅｒｓ ｏｎｃｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ａｎｄ ｉｓ ａ ｍａｒｋｅｒ ｏｆ ｐｏｏｒ ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ． Ｂｌｏｏｄ １３２， １３０４－１３１７ （２０１８）． Ｖａｌｌｅｃｉｌｌｏ－Ｖｉｅｊｏ， Ｉ． Ｃ．， Ｌｉｓｃｏｖｉｔｃｈ－Ｂｒａｕｅｒ， Ｎ．， Ｍｏｎｔｉｅｌ－Ｇｏｎｚａｌｅｚ， Ｍ． Ｆ．， Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ， Ｅ． ＆ Ｒｏｓｅｎｔｈａｌ， Ｊ． Ｊ． Ｃ． Ａｂｕｎｄａｎｔ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｅｄｉｔｓ ｆｒｏｍ ｓｉｔｅ－ｄｉｒｅｃｔｅｄ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｃａｎ ｂｅ ｒｅｄｕｃｅｄ ｂｙ ｎｕｃｌｅａｒ ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｎｚｙｍｅ． ＲＮＡ ｂｉｏｌｏｇｙ １５， １０４－１１４ （２０１８）． Ｍａｙｓ， Ｌ． Ｅ． ＆ Ｗｉｌｓｏｎ， Ｊ． Ｍ． Ｔｈｅ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｅｖｏｌｖｉｎｇ ｓｔｏｒｙ ｏｆ Ｔ ｃｅｌｌ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｔｏ ＡＡＶ ｖｅｃｔｏｒ－ｅｎｃｏｄｅｄ ｔｒａｎｓｇｅｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ １９， １６－２７ （２０１１）． Ｗａｇｎｅｒ， Ｄ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｈｉｇｈ ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ Ｃａｓ９－ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｔ ｃｅｌｌｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ａｄｕｌｔ ｈｕｍａｎ ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５， ２４２－２４８ （２０１９）． Ｓｉｍｈａｄｒｉ， Ｖ． Ｌ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ ｏｆ Ｐｒｅ－ｅｘｉｓｔｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｔｏ ＣＲＩＳＰＲ－Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ Ｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｔｈｅ ＵＳＡ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃｌｉｎ Ｄｅｖ １０， １０５－１１２ （２０１８）． Ｃｈａｒｌｅｓｗｏｒｔｈ， Ｃ． Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｅｅｘｉｓｔｉｎｇ ａｄａｐｔｉｖｅ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｔｏ Ｃａｓ９ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２５， ２４９－２５４ （２０１９）． Ｈａａｐａｎｉｅｍｉ， Ｅ．， Ｂｏｔｌａ， Ｓ．， Ｐｅｒｓｓｏｎ， Ｊ．， Ｓｃｈｍｉｅｒｅｒ， Ｂ． ＆ Ｔａｉｐａｌｅ， Ｊ． ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｓ ａ ｐ５３－ｍｅｄｉａｔｅｄ ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｒｅｓｐｏｎｓｅ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， ９２７－９３０ （２０１８）． Ｉｈｒｙ， Ｒ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ｐ５３ ｉｎｈｉｂｉｔｓ ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ． Ｎａｔ Ｍｅｄ ２４， ９３９－９４６ （２０１８）． Ｗｏｏｌｆ， Ｔ． Ｍ．， Ｃｈａｓｅ， Ｊ． Ｍ． ＆ Ｓｔｉｎｃｈｃｏｍｂ， Ｄ． Ｔ． Ｔｏｗａｒｄ ｔｈｅ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｍｕｔａｔｅｄ ＲＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９２， ８２９８－８３０２ （１９９５）． Ｚｈｅｎｇ， Ｙ．， Ｌｏｒｅｎｚｏ， Ｃ． ＆ Ｂｅａｌ， Ｐ． Ａ． ＤＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎ ＤＮＡ／ＲＮＡ ｈｙｂｒｉｄｓ ｂｙ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅｓ ｔｈａｔ ａｃｔ ｏｎ ＲＮＡ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４５， ３３６９－３３７７ （２０１７）． Ａｂｕｄａｙｙｅｈ， Ｏ． Ｏ． ｅｔ ａｌ． Ｃ２ｃ２ ｉｓ ａ ｓｉｎｇｌｅ－ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ＲＮＡ－ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ｅｆｆｅｃｔｏｒ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ３５３， ａａｆ５５７３ （２０１６）． Ｄａｎｉｅｌ， Ｃ．， Ｗｉｄｍａｒｋ， Ａ．， Ｒｉｇａｒｄｔ， Ｄ． ＆ Ｏｈｍａｎ， Ｍ． Ｅｄｉｔｉｎｇ ｉｎｄｕｃｅｒ ｅｌｅｍｅｎｔｓ ｉｎｃｒｅａｓｅｓ Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １８， １９５ （２０１７）． Ｃｈｅｎ， Ｃ． Ｘ． ｅｔ ａｌ． Ａ ｔｈｉｒｄ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ， ＡＤＡＲ３， ｃｏｎｔａｉｎｓ ｂｏｔｈ ｓｉｎｇｌｅ－ ａｎｄ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎｓ． ＲＮＡ ６， ７５５－７６７ （２０００）． Ｓａｖｖａ， Ｙ． Ａ．， Ｒｉｅｄｅｒ， Ｌ． Ｅ． ＆ Ｒｅｅｎａｎ， Ｒ． Ａ． Ｔｈｅ ＡＤＡＲ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆａｍｉｌｙ． Ｇｅｎｏｍｅ Ｂｉｏｌ １３， ２５２ （２０１２）． Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ， Ｋ． Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｃｏｄｉｎｇ ａｎｄ ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡｓ ｂｙ ＡＤＡＲｓ． Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １７， ８３－９６ （２０１６）． Ｆｌｏｑｕｅｔ， Ｃ．， Ｄｅｆｏｒｇｅｓ， Ｊ．， Ｒｏｕｓｓｅｔ， Ｊ． Ｐ． ＆ Ｂｉｄｏｕ， Ｌ． Ｒｅｓｃｕｅ ｏｆ ｎｏｎ－ｓｅｎｓｅ ｍｕｔａｔｅｄ ｐ５３ ｔｕｍｏｒ ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ ｇｅｎｅ ｂｙ ａｍｉｎｏｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９， ３３５０－３３６２ （２０１１）． Ｋｅｒｎ， Ｓ． Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３ ａｓ ａ ｓｅｑｕｅｎｃｅ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＤＮＡ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｐｒｏｔｅｉｎ． Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５２， １７０８－１７１１ （１９９１）． Ｄｏｕｂｒｏｖｉｎ， Ｍ． ｅｔ ａｌ． Ｉｍａｇｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｐ５３－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｅｎｅｓ ｗｉｔｈ ｐｏｓｉｔｒｏｎ ｅｍｉｓｓｉｏｎ ｔｏｍｏｇｒａｐｈｙ ｉｎ ｖｉｖｏ． Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ ９８， ９３００－９３０５ （２００１）． Ｌａｎｄｒｕｍ， Ｍ． Ｊ． ｅｔ ａｌ． ＣｌｉｎＶａｒ： ｐｕｂｌｉｃ ａｒｃｈｉｖｅ ｏｆ ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｃｌｉｎｉｃａｌｌｙ ｒｅｌｅｖａｎｔ ｖａｒｉａｎｔｓ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ４４， Ｄ８６２－８６８ （２０１６）． Ｏｕ， Ｌ． ｅｔ ａｌ． ＺＦＮ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｉｎ Ｖｉｖｏ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｃｏｒｒｅｃｔｓ Ｍｕｒｉｎｅ Ｈｕｒｌｅｒ Ｓｙｎｄｒｏｍｅ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ ２７， １７８－１８７ （２０１９）． Ｆｉｒｅ， Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｐｏｔｅｎｔ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｅｔｉｃ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ ｂｙ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｉｎ Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ． Ｎａｔｕｒｅ ３９１， ８０６－８１１ （１９９８）． Ｚｕｏ， Ｅ． ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒ ｇｅｎｅｒａｔｅｓ ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｓｉｎｇｌｅ－ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｖａｒｉａｎｔｓ ｉｎ ｍｏｕｓｅ ｅｍｂｒｙｏｓ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１９）． Ｊｉｎ， Ｓ． ｅｔ ａｌ． Ｃｙｔｏｓｉｎｅ， ｂｕｔ ｎｏｔ ａｄｅｎｉｎｅ， ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ ｉｎｄｕｃｅ ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｏｆｆ－ｔａｒｇｅｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｒｉｃｅ． Ｓｃｉｅｎｃｅ （２０１９）． Ｋｉｍ， Ｄ．， Ｋｉｍ， Ｄ． Ｅ．， Ｌｅｅ， Ｇ．， Ｃｈｏ， Ｓ． Ｉ． ＆ Ｋｉｍ， Ｊ． Ｓ． Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅ ｔａｒｇｅｔ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ－ｇｕｉｄｅｄ ａｄｅｎｉｎｅ ｂａｓｅ ｅｄｉｔｏｒｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７， ４３０－４３５ （２０１９）． Ｌｅｖａｎｏｎ， Ｅ． Ｙ． ｅｔ ａｌ． Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｂｕｎｄａｎｔ Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２２， １００１－１００５ （２００４）． Ｍｅｒｋｌｅ， Ｔ． ｅｔ ａｌ． Ｐｒｅｃｉｓｅ ＲＮＡ ｅｄｉｔｉｎｇ ｂｙ ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ＡＤＡＲｓ ｗｉｔｈ ａｎｔｉｓｅｎｓｅ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ． Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３７， １３３－１３８ （２０１９）． Ｗａｇｎｅｒ， Ｒ． Ｗ． ｅｔ ａｌ． Ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ ＲＮＡ ｕｎｗｉｎｄｉｎｇ ａｎｄ ｍｏｄｉｆｙｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｕｂｉｑｕｉｔｏｕｓｌｙ ｉｎ ｐｒｉｍａｒｙ ｔｉｓｓｕｅｓ ａｎｄ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １０， ５５８６－５５９０ （１９９０）． Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ， Ｊ． Ｂ． ＆ Ｓａｍｕｅｌ， Ｃ． Ｅ． Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｂｙ ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ ｏｆ ａ ｄｏｕｂｌｅ－ｓｔｒａｎｄｅｄ－ＲＮＡ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ ａｄｅｎｏｓｉｎｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ： ｅｖｉｄｅｎｃｅ ｆｏｒ ｔｗｏ ｆｏｒｍｓ ｏｆ ｔｈｅ ｄｅａｍｉｎａｓｅ． Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １５， ５３７６－５３８８ （１９９５）． Ｇｉｂｓｏｎ， Ｄ． Ｇ． ｅｔ ａｌ． Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＤＮＡ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｕｐ ｔｏ ｓｅｖｅｒａｌ ｈｕｎｄｒｅｄ ｋｉｌｏｂａｓｅｓ． Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ６， ３４３－３４５ （２００９）． Ｚｈｏｕ， Ｙ．， Ｚｈａｎｇ， Ｈ． ＆ Ｗｅｉ， Ｗ． Ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｌｔｉ－ｇｅｎｅ ｋｎｏｃｋｏｕｔｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ． ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ ５９０， ４３４３－４３５３ （２０１６）． Ｄｏｂｉｎ， Ａ． ｅｔ ａｌ． ＳＴＡＲ： ｕｌｔｒａｆａｓｔ ｕｎｉｖｅｒｓａｌ ＲＮＡ－ｓｅｑ ａｌｉｇｎｅｒ． Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ２９， １５－２１ （２０１３）． Ｖａｎ ｄｅｒ Ａｕｗｅｒａ， Ｇ． Ａ． ｅｔ ａｌ． Ｆｒｏｍ ＦａｓｔＱ ｄａｔａ ｔｏ ｈｉｇｈ ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ ｖａｒｉａｎｔ ｃａｌｌｓ： ｔｈｅ Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｔｏｏｌｋｉｔ ｂｅｓｔ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ ｐｉｐｅｌｉｎｅ． Ｃｕｒｒ Ｐｒｏｔｏｃ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ ４３， １１ １０ １１－３３ （２０１３）． Ｗａｎｇ， Ｋ．， Ｌｉ， Ｍ． ＆ Ｈａｋｏｎａｒｓｏｎ， Ｈ． ＡＮＮＯＶＡＲ： ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｎｔｓ ｆｒｏｍ ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｄａｔａ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３８， ｅ１６４ （２０１０）． Ｇｅｎｏｍｅｓ Ｐｒｏｊｅｃｔ， Ｃ． ｅｔ ａｌ． Ａｎ ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ｍａｐ ｏｆ ｇｅｎｅｔｉｃ ｖａｒｉａｔｉｏｎ ｆｒｏｍ １，０９２ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅｓ． Ｎａｔｕｒｅ ４９１， ５６－６５ （２０１２）． Ｐｅｒｔｅａ， Ｍ．， Ｋｉｍ， Ｄ．， Ｐｅｒｔｅａ， Ｇ． Ｍ．， Ｌｅｅｋ， Ｊ． Ｔ． ＆ Ｓａｌｚｂｅｒｇ， Ｓ． Ｌ． Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ－ｌｅｖｅｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＲＮＡ－ｓｅｑ ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ＨＩＳＡＴ， ＳｔｒｉｎｇＴｉｅ ａｎｄ Ｂａｌｌｇｏｗｎ． Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ １１， １６５０－１６６７ （２０１６）．
核酸編集は、生物学的研究と治療法の開発に大きな可能性を秘めている。ＤＮＡまたはＲＮＡ編集のための現在のツールは、外因性タンパク質を生物に導入することに依存している。これは、可能な異常なエフェクター活性、送達制限、および免疫原性により、潜在的なリスクまたは技術的障壁の影響を受ける可能性がある。いくつかの局面において、本出願は、標的ＲＮＡ編集のため内因性ＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）タンパク質を活用するために短いＲＮＡを使用するプログラム可能な方法を提供する。いくつかの局面において、本出願は、標的転写物に部分的に相補的であり、天然のＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員して、標的ＲＮＡの特定の部位でアデノシンをイノシンに変化させる工学操作されたＲＮＡを提供する。本明細書に記載の方法は、まとめて「ＬＥＡＰＥＲ」（内因性ＡＤＡＲを利用したＲＮＡのプログラム可能な編集）と呼ばれ、ＡＤＡＲ動員ＲＮＡは、「ｄＲＮＡ」または「ａｒＲＮＡ」とも呼ばれる。
一局面では、本出願は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）またはデアミナーゼ動員ＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における標的ＲＮＡを編集する方法を提供し、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化するようにＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。特定の実施形態では、前記宿主細胞が真核細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞が哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞がヒト細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞がマウス細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞が原核細胞である。
特定の実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞に自然にまたは内因的に存在し、例えば、真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞によって内因的に発現される。特定の実施形態では、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因的である。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）によってコードされる。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、宿主細胞にタンパク質を導入することを含まない。特定の実施形態では、前記ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２である。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１およびマウスＡＤＡＲ２からなる群から選ばれる１つ以上のＡＤＡＲである。
特定の実施形態では、Ｃａｓは前記ｄＲＮＡを認識しない。一部の実施形態では、前記ｄＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムに使用されるｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを含まない。一部の実施形態では、この方法は、ＣａｓまたはＣａｓ融合タンパク質を宿主細胞に導入することを含まない。
特定の実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の標的Ａの脱アミノ化作用は、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的スプライシングを引き起こす。一部の実施形態では、標的ＲＮＡはタンパク質をコードし、前記標的ＲＮＡ中の標的Ａの脱アミノ化作用は、前記タンパク質の点突然変異、切断、伸長および／またはミスフォールディングを引き起こす。一部の実施形態では、前記標的ＲＮＡ中の標的Ａの脱アミノ化作用は、標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復を引き起こす。一部の実施形態では、前記標的ＲＮＡが、切断された、伸長した、突然変異した、またはミスフォールディングされたタンパク質をコードし、標的ＲＮＡ中の標的Ａ（アデノシン）の脱アミノ化作用は、標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及び／または野生型タンパク質を引き起こす。一部の実施形態では、標的ＲＮＡは調節性ＲＮＡであり、標的Ａの脱アミノ化作用により、標的ＲＮＡによって調節される下流分子の発現が変化する。特定の実施形態では、この方法は、内因性アデノシンデアミナーゼを利用して標的ＲＮＡ上で編集し、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異及び／またはミスフォールディング、及び／または標的ＲＮＡにおいて早期終止コドン、異常なスプライシング部位または可変的スプライシング部位を生成する。
特定の実施形態では、複数のｄＲＮＡまたは前記複数のｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞における複数の標的ＲＮＡを編集するための方法が提供され、前記複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡのそれぞれが、複数の標的ＲＮＡ中の対応する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、各ｄＲＮＡが、対応する標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化するようにＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。
一部の実施形態では、上記のＲＮＡ編集方法のいずれか１つによって生成された編集されたＲＮＡを有する、編集されたＲＮＡまたは宿主細胞が提供される。
一局面において、本願は、上記のＲＮＡ編集方法のいずれか１つに従って、個体の細胞内の疾患または病症に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体の疾患または病症を治療または予防するための方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、エクスビボ（Ex vivo）で細胞内の標的ＲＮＡを編集することを含む。一部の実施形態では、この方法は、編集された細胞を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体（例えば、ウイルスベクター）を細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体（例えば、ウイルスベクター）を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患である。一部の実施形態において、前記疾患または病症は、１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する。
本願の一局面は、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含む、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することによって標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのｄＲＮＡを提供する。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、配列番号２５～４４、１４２～２０５、３４１～３４２のいずれか１つの核酸配列を含む。
本明細書に記載の方法またはｄＲＮＡのいずれか１つによる一部の実施形態では、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡで編集される標的アデノシンと真向かいのシチジン（Ｃ）、アデノシン（Ａ）、またはウリジン（Ｕ）を含むＲＮＡ配列を含む。特定の実施形態では、前記ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む。特定の実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的Ａの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的ＲＮＡにおける標的Ａの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。特定の実施形態では、標的ＲＮＡにおける標的Ａは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する。特定の実施形態では、前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡが、前記３塩基モチーフのＵと真向かいのＡ、前記標的Ａと真向かいのＣ、及び３塩基モチーフのＧと真向かいのＣ、Ｇ、またはＵを含む。特定の実施形態では、前記３塩基モチーフは、標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＵを含む。
本明細書に記載の方法またはｄＲＮＡのいずれか１つによる一部の実施形態では、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡは、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５または８０を超えるヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、デアミナーゼ動員ＲＮＡは、４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～１５０または１０５～１４０ヌクレオチドの長さを有する。特定の実施形態では、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、および小さいＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択されるＲＮＡである。
本明細書に記載の方法またはｄＲＮＡのいずれか１つによる一部の実施形態では、前記ｄＲＮＡは一本鎖ＲＮＡである。一部の実施形態では、前記相補的ＲＮＡ配列は一本鎖であり、ここで、前記ｄＲＮＡは、１つ以上の二本鎖領域をさらに含む。一部の実施形態では、前記ｄＲＮＡは、２'－Ｏ－メチル修飾および／またはホスホロチオエート修飾などの１つ以上の修飾を含む。
一部の実施形態において、上記のｄＲＮＡのいずれか１つをコードする構築体（例えば、ウイルスベクターまたはプラスミド）が提供される。一部の実施形態において、前記構築体は、ｄＲＮＡをコードする配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。一部の実施形態では、前記構築体はＤＮＡ構築体である。一部の実施形態において、前記構築体は、ＡＡＶ８などのＡＡＶなどのウイルスベクターである。
一部の実施形態において、上記のｄＲＮＡのいずれか１つによる複数のｄＲＮＡ、または上記の構築体のいずれか１つによる複数の構築体を含むライブラリーが提供される。
また、本明細書に記載のｄＲＮＡのいずれか１つ、本明細書に記載の構築体のいずれか１つ、または本明細書に記載のライブラリーのいずれか１つを含む、組成物、宿主細胞、キット、及び製品が提供される。
図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図１Ａ～１Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡを使用したＲＮＡ編集を示す図である。図１Ａ及び１Ｂは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を使用したＲＮＡ編集の概略図である。図１Ｃは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用したｄＲＮＡを使用してレポーターｍＲＮＡを編集することを示す図である。図１Ｄは、図１Ｂの結果の統計分析を示す図である。図１Ｅは、Ａｄａｒ１ノックアウト及びＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）及びＡｄａｒ２のレスキュー結果を示す図である。図１Ｆは、図１Ｄの結果の統計分析を示す図である。図１Ｇは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞中のｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対する、Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２の過剰発現の影響を示す図である。図１Ｈは、ディープシーケンシング（すなわち、次世代シーケンシング、ＮＧＳ）の結果により、標的部位でのＡからＧへの編集が確認されたことを示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図２Ａ～２Ｈは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図２Ａは、標的化アデノシンに対向する４つの塩基（Ａ、Ｕ、Ｃ及びＧ）識別を示す図である。図２Ｂは、ｄＲＮＡのＲＮＡ編集効率に対する、標的化アデノシンに対向する塩基識別の影響を示す図である。図２Ｃは、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基を有するｄＲＮＡの概略図である。図２Ｄは、ｄＲＮＡによるレポーターＲＮＡ編集に対する、ＵＡＧ標的化部位とミスマッチした１、２、または３塩基の影響を示す図である。ｄＲＮＡは、標的化アデノシンでのＡ－Ｃミスマッチが好ましい。図２Ｅは、異なる長さを有するｄＲＮＡを示す図である。図２Ｆは、二重蛍光レポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するｄＲＮＡの長さの影響を示す図である。図２Ｇは、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置を示す図である。図２Ｈは、ＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図３Ａ～３Ｂは、本願の例示的なＲＮＡ編集方法による内因性ＲＮＡ編集の柔軟性を示す図である。図３Ａは、１６の異なる３塩基モチーフのすべてにおける内因性ＲＮＡ編集効率の百分率定量化を示す図である。図３Ｂは、１６の異なる３塩基モチーフに対する内因性ＲＮＡ編集の５’側及び３’ 側塩基の優先度のヒートマップである。 図３Ａ～３Ｂは、本願の例示的なＲＮＡ編集方法による内因性ＲＮＡ編集の柔軟性を示す図である。図３Ａは、１６の異なる３塩基モチーフのすべてにおける内因性ＲＮＡ編集効率の百分率定量化を示す図である。図３Ｂは、１６の異なる３塩基モチーフに対する内因性ＲＮＡ編集の５’側及び３’ 側塩基の優先度のヒートマップである。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図４Ａ～４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図４Ａは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ標的、及び異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図である。図４Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＫＲＡＳ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。空のベクター、ｄＲＮＡ－９１ｎｔプラスミドはそれぞれ２９３Ｔ－ＷＴ細胞にトランスフェクトされた。６０時間後、ＲＴ－ＰＣＲ用にＲＮＡを単離し、ｃＤＮＡを増幅してＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。図４Ｃは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（部位１、部位２および部位３）および対応するｄＲＮＡ設計を示す図である。図４Ｄ、４Ｅ、及び４Ｆは、２９３Ｔ細胞でｄＲＮＡを使用して内因性ＰＰＩＢ遺伝子のｍＲＮＡを編集することを示す図である。図４Ｇは、β－アクチンｍＲＮＡターゲットとｄＲＮＡ（７１－ｎｔ及び１３１－ｎｔ）の概略図である。図４Ｈは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図５Ａ～５Ｇはオフターゲット解析を示す図である。図５Ａは、ＡからＩの編集がＰＰＩＢ ｍＲＮＡ標的（ＰＰＩＢ部位１）について解析された配列ウィンドウの概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｂは、ＰＰＩＢ ｍＲＮＡターゲット（ＰＰＩＢ部位１）を標的とする１５１－ｎｔｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｃは、配列ウィンドウを示す概略図であり、ＡからＩの編集がＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットについて解析されている。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示している。図５Ｄは、ＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする９１－ｎｔおよび１１１－ｎｔ ｄＲＮＡによるＡからＩへのＲＮＡ編集のディープシーケンシング定量化を示す図である。図５Ｅは、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む、設計された４種類の９１－ｎｔまたは１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを示す概略図である。Ａ－Ｇミスマッチは、図５Ｄの統計結果、及び異なるアミノ酸の遺伝子コードに関する既存の知識に基づいて設計された。図５Ｆは、ｄＲＮＡおよび図５Ｅにおける異なる種類のｄＲＮＡ変異体による標的化Ａ５６編集の結果を示す図である。図５Ｇは、１１１－ｎｔ ｄＲＮＡおよびＫＲＡＳ ｍＲＮＡターゲットを標的とする４種類の１１１－ｎｔ ｄＲＮＡ変異体によるＡからＩへのＲＮＡ編集ディープシーケンシング定量化を示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図６Ａ～６Ｈは、内因性Ａｄａｒ１タンパク質を利用した単一のｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図６Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ融合タンパク質によるＲＮＡ編集を示す概略図である。触媒的に不活性なｄＬｂｕＣａｓ１３は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２のＲＮＡデアミナーゼドメインに融合した。図６Ｂは、二重蛍光レポーターｍＲＮＡ標的およびガイドＲＮＡ設計を示す概略図である。図６Ｃは、図６Ａ及び図６Ｂの結果の統計解析を示す図である。図６Ｄは、２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるＡｄａｒ１およびＡｄａｒ２のｍＲＮＡレベルを示す図である。図６Ｅは、ゲノムＰＣＲによる２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡＤＡＲ１遺伝子のジェノタイピング結果を示す図である。図６Ｆは、（ウエスタンブロッティングによる）２９３Ｔ－ＷＴおよび２９３Ｔ－ＡＤＡＲ１－ＫＯ細胞株におけるＡｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）の発現レベルを示す図である。図６Ｇは、（ＦＡＣＳを介した）２９３Ｔ－ＷＴ細胞におけるｄＲＮＡによって媒介されるＲＮＡ編集に対するＡｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）またはＡｄａｒ２過剰発現の影響を示す図である。図６Ｈは、サンガーシーケンシングの結果が、標的化されたアデノシン部位におけるＡからＧへの編集を示したことを示す図である。 図７Ａ～７Ｃは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図７Ａは、異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図、および二重蛍光レポーター－１に基づく異なる長さを有するｄＲＮＡによる標的化されたｍＲＮＡ編集結果を示す図である。図７Ｂは、二重蛍光レポーター－１に基づいた、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置、およびＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図７Ｃは、二重蛍光レポーター－３に基づいた、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置、およびＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図７Ａ～７Ｃは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図７Ａは、異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図、および二重蛍光レポーター－１に基づく異なる長さを有するｄＲＮＡによる標的化されたｍＲＮＡ編集結果を示す図である。図７Ｂは、二重蛍光レポーター－１に基づいた、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置、およびＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図７Ｃは、二重蛍光レポーター－３に基づいた、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置、およびＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図７Ａ～７Ｃは、ｄＲＮＡの最適化を示す図である。図７Ａは、異なる長さを有するｄＲＮＡの概略図、および二重蛍光レポーター－１に基づく異なる長さを有するｄＲＮＡによる標的化されたｍＲＮＡ編集結果を示す図である。図７Ｂは、二重蛍光レポーター－１に基づいた、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置、およびＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図７Ｃは、二重蛍光レポーター－３に基づいた、異なるＡ－Ｃミスマッチ位置、およびＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。 図８Ａ～８Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図８Ａは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子（部位２）のｍＲＮＡの編集を示す図である。図８Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図８Ａ～８Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。図８Ａは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性β－アクチン遺伝子（部位２）のｍＲＮＡの編集を示す図である。図８Ｂは、２９３Ｔ細胞におけるｄＲＮＡを用いた内因性ＧＡＰＤＨ遺伝子のｍＲＮＡの編集を示す図である。 図９は、異なる細胞株におけるｄＲＮＡによるＲＮＡ編集を示す図である。図９Ａは、レポータープラスミドおよびｄＲＮＡプラスミドが異なる細胞株に同時トランスフェクトされたことを示し、その結果は、ｄＲＮＡが複数の細胞株において良好に機能できることを示し、ｄＲＮＡ適用の普遍性を示している。 図１０Ａ～１０Ｄは、効率的な例示的なＲＮＡ編集プラットフォームの探索を示す図である。図１０Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）融合タンパク質および対応するｃｒＲＮＡの概略図である。触媒的に不活性なＬｂｕＣａｓ１３ａは、３×ＧＧＧＧＳリンカーを使用してＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメイン（過活性Ｅ１００８Ｑバリアント）に融合された。ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａ）は、Ｌｂｕ－ｃｒＲＮＡスキャフォールドとスペーサーで構成されており、当該スペーサーは、示されているＡ－Ｃミスマッチを有し、標的ＲＮＡに相補的であった。図１０Ｂは、二重蛍光レポーターシステム、および示される様々な長さのスペーサーを有するＬｂｕ－ｃｒＲＮＡの概略図である。図１０Ｃは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１（Ｒｅｐｏｔｅｒ－１）を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）の共発現の有無にかかわらず、示された長さのｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａでトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。図１０Ｄは、対照（Ｃｔｒｌ ｃｒＲＮＡ７０）またはターゲティングスペーサー（ｃｒＲＮＡ７０）を使用して実行された実験からの代表的なＦＡＣＳ結果を示す図である。 図１０Ａ～１０Ｄは、効率的な例示的なＲＮＡ編集プラットフォームの探索を示す図である。図１０Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）融合タンパク質および対応するｃｒＲＮＡの概略図である。触媒的に不活性なＬｂｕＣａｓ１３ａは、３×ＧＧＧＧＳリンカーを使用してＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメイン（過活性Ｅ１００８Ｑバリアント）に融合された。ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａ）は、Ｌｂｕ－ｃｒＲＮＡスキャフォールドとスペーサーで構成されており、当該スペーサーは、示されているＡ－Ｃミスマッチを有し、標的ＲＮＡに相補的であった。図１０Ｂは、二重蛍光レポーターシステム、および示される様々な長さのスペーサーを有するＬｂｕ－ｃｒＲＮＡの概略図である。図１０Ｃは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１（Ｒｅｐｏｔｅｒ－１）を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）の共発現の有無にかかわらず、示された長さのｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａでトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。図１０Ｄは、対照（Ｃｔｒｌ ｃｒＲＮＡ７０）またはターゲティングスペーサー（ｃｒＲＮＡ７０）を使用して実行された実験からの代表的なＦＡＣＳ結果を示す図である。 図１０Ａ～１０Ｄは、効率的な例示的なＲＮＡ編集プラットフォームの探索を示す図である。図１０Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）融合タンパク質および対応するｃｒＲＮＡの概略図である。触媒的に不活性なＬｂｕＣａｓ１３ａは、３×ＧＧＧＧＳリンカーを使用してＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメイン（過活性Ｅ１００８Ｑバリアント）に融合された。ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａ）は、Ｌｂｕ－ｃｒＲＮＡスキャフォールドとスペーサーで構成されており、当該スペーサーは、示されているＡ－Ｃミスマッチを有し、標的ＲＮＡに相補的であった。図１０Ｂは、二重蛍光レポーターシステム、および示される様々な長さのスペーサーを有するＬｂｕ－ｃｒＲＮＡの概略図である。図１０Ｃは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１（Ｒｅｐｏｔｅｒ－１）を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）の共発現の有無にかかわらず、示された長さのｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａでトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。図１０Ｄは、対照（Ｃｔｒｌ ｃｒＲＮＡ７０）またはターゲティングスペーサー（ｃｒＲＮＡ７０）を使用して実行された実験からの代表的なＦＡＣＳ結果を示す図である。 図１０Ａ～１０Ｄは、効率的な例示的なＲＮＡ編集プラットフォームの探索を示す図である。図１０Ａは、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）融合タンパク質および対応するｃｒＲＮＡの概略図である。触媒的に不活性なＬｂｕＣａｓ１３ａは、３×ＧＧＧＧＳリンカーを使用してＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメイン（過活性Ｅ１００８Ｑバリアント）に融合された。ｃｒＲＮＡ（ｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａ）は、Ｌｂｕ－ｃｒＲＮＡスキャフォールドとスペーサーで構成されており、当該スペーサーは、示されているＡ－Ｃミスマッチを有し、標的ＲＮＡに相補的であった。図１０Ｂは、二重蛍光レポーターシステム、および示される様々な長さのスペーサーを有するＬｂｕ－ｃｒＲＮＡの概略図である。図１０Ｃは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１（Ｒｅｐｏｔｅｒ－１）を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ｄＬｂｕＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）の共発現の有無にかかわらず、示された長さのｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａでトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。図１０Ｄは、対照（Ｃｔｒｌ ｃｒＲＮＡ７０）またはターゲティングスペーサー（ｃｒＲＮＡ７０）を使用して実行された実験からの代表的なＦＡＣＳ結果を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１１Ａ～１１Ｇは、標的ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲ１タンパク質を活用する例示的な方法を示す図である。図１１Ａは、レポーター－１および７０－ｎｔ ａｒＲＮＡの概略図である。図１１Ｂは、レポーター－１を安定して発現する野生型（ＨＥＫ２９３Ｔ、上図）またはＡＤＡＲ１ノックアウト（ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－、下図）細胞におけるａｒＲＮＡによって誘導されたＥＧＦＰ発現の代表的なＦＡＣＳ解析を示す図である。図１１Ｃは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ１アイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｄは、野生型およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞、ならびにＡＤＡＲ２がトランスフェクトされたＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ２タンパク質の発現レベルを示すウエスタンブロット解析を示す図である。図１１Ｅは、ＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。レポーター－１および示されたＡＤＡＲを発現する構築体を、対照ＲＮＡ７０または標的化ａｒＲＮＡ７０とともに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞にトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝４）として表される。図１１Ｆは、対照ＲＮＡ７０（上図）またはａｒＲＮＡ７０（下図）の標的領域のサンガーシーケンシングの結果を示すエレクトロフェログラムである。図１１Ｇは、ディープシーケンシングによる標的部位でのＡからＩへの変換率の定量化を示す図である。 図１２Ａ～１２Ｂは、ＡＤＡＲ１／ＡＤＡＲ２のｍＲＮＡ発現レベルおよびａｒＲＮＡ媒介性ＲＮＡ編集を示す図である。図１２Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２のｍＲＮＡレベルを示す定量的ＰＣＲを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。図１２Ｂ、図１Ｅからの代表的なＦＡＣＳ結果を示す図である。 図１２Ａ～１２Ｂは、ＡＤＡＲ１／ＡＤＡＲ２のｍＲＮＡ発現レベルおよびａｒＲＮＡ媒介性ＲＮＡ編集を示す図である。図１２Ａ、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２のｍＲＮＡレベルを示す定量的ＰＣＲを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。図１２Ｂ、図１Ｅからの代表的なＦＡＣＳ結果を示す図である。 図１３は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたは対照ＲＮＡによる標的レポーター－１転写物の発現レベルに対する例示的なＬＥＡＰＥＲ法の影響を実証する定量ＰＣＲ的結果を示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのＴ検定、ｎｓ、有意ではない。 図１４Ａ～１４Ｄは、複数の細胞株における例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた標的ＲＮＡ編集を示す図である。図１４Ａは、示されたヒト細胞株におけるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３の発現レベルを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。Β－チューブリンをローディングコントロールとして使用した。示されているデータは、３つの独立した実験の代表である。ＡＤＡＲ１－／－／ＡＤＡＲ２は、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＡＤＡＲ１－ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を表す。図１４Ｂ、β－チューブリン発現によって正規化された相対的ＡＤＡＲタンパク質発現レベル示す図である。図１４Ｃは、示されたヒト細胞を、レポーター－１、及び７１－ｎｔ対照ａｒＲＮＡ（対照ＲＮＡ７１）または７１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ７１）でトランスフェクトし、続いてＦＡＣＳ解析を行ったことを示す図である。図１４Ｄは、示されたマウス細胞株を、図１４に記載されるように解析したことを示す図である。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。図１４Ｂ、１４ｃ、および１４ｄのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図１４Ａ～１４Ｄは、複数の細胞株における例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた標的ＲＮＡ編集を示す図である。図１４Ａは、示されたヒト細胞株におけるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３の発現レベルを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。Β－チューブリンをローディングコントロールとして使用した。示されているデータは、３つの独立した実験の代表である。ＡＤＡＲ１－／－／ＡＤＡＲ２は、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＡＤＡＲ１－ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を表す。図１４Ｂ、β－チューブリン発現によって正規化された相対的ＡＤＡＲタンパク質発現レベル示す図である。図１４Ｃは、示されたヒト細胞を、レポーター－１、及び７１－ｎｔ対照ａｒＲＮＡ（対照ＲＮＡ７１）または７１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ７１）でトランスフェクトし、続いてＦＡＣＳ解析を行ったことを示す図である。図１４Ｄは、示されたマウス細胞株を、図１４に記載されるように解析したことを示す図である。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。図１４Ｂ、１４ｃ、および１４ｄのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図１４Ａ～１４Ｄは、複数の細胞株における例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた標的ＲＮＡ編集を示す図である。図１４Ａは、示されたヒト細胞株におけるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３の発現レベルを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。Β－チューブリンをローディングコントロールとして使用した。示されているデータは、３つの独立した実験の代表である。ＡＤＡＲ１－／－／ＡＤＡＲ２は、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＡＤＡＲ１－ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を表す。図１４Ｂ、β－チューブリン発現によって正規化された相対的ＡＤＡＲタンパク質発現レベル示す図である。図１４Ｃは、示されたヒト細胞を、レポーター－１、及び７１－ｎｔ対照ａｒＲＮＡ（対照ＲＮＡ７１）または７１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ７１）でトランスフェクトし、続いてＦＡＣＳ解析を行ったことを示す図である。図１４Ｄは、示されたマウス細胞株を、図１４に記載されるように解析したことを示す図である。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。図１４Ｂ、１４ｃ、および１４ｄのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図１４Ａ～１４Ｄは、複数の細胞株における例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた標的ＲＮＡ編集を示す図である。図１４Ａは、示されたヒト細胞株におけるＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３の発現レベルを示すウエスタンブロットの結果を示す図である。Β－チューブリンをローディングコントロールとして使用した。示されているデータは、３つの独立した実験の代表である。ＡＤＡＲ１－／－／ＡＤＡＲ２は、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＡＤＡＲ１－ノックアウトＨＥＫ２９３Ｔ細胞を表す。図１４Ｂ、β－チューブリン発現によって正規化された相対的ＡＤＡＲタンパク質発現レベル示す図である。図１４Ｃは、示されたヒト細胞を、レポーター－１、及び７１－ｎｔ対照ａｒＲＮＡ（対照ＲＮＡ７１）または７１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ７１）でトランスフェクトし、続いてＦＡＣＳ解析を行ったことを示す図である。図１４Ｄは、示されたマウス細胞株を、図１４に記載されるように解析したことを示す図である。ＥＧＦＰ＋のパーセンテージは、ｍＣｈｅｒｒｙ＋によって決定されたトランスフェクション効率によって正規化された。図１４Ｂ、１４ｃ、および１４ｄのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図１５Ａ～１５Ｃは、レポーター－１（ａ）、－２（ｂ）、および－３（ｃ）、ならびにそれらの対応するａｒＲＮＡの概略図である。 図１５Ａ～１５Ｃは、レポーター－１（ａ）、－２（ｂ）、および－３（ｃ）、ならびにそれらの対応するａｒＲＮＡの概略図である。 図１５Ａ～１５Ｃは、レポーター－１（ａ）、－２（ｂ）、および－３（ｃ）、ならびにそれらの対応するａｒＲＮＡの概略図である。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１６Ａ～１６Ｇは、例示的なＬＥＡＰＥＲ方法のキャラクタリゼーションおよび最適化を示す図である。図１６Ａの上図は、ターゲットＵＡＧに対向する変更されたトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ、Ｕ、Ｃ、またはＧを示す）を持つａｒＲＮＡの設計の概略図である。下図は、ＥＧＦＰ＋パーセントは、ＲＮＡ編集効率に対する標的アデノシンに対向する可変塩基の影響を示す図である。図１６Ｂの上図は、Ａ－Ｃミスマッチ（５’－Ｎ１ＣＮ２）のシチジンに隣接する隣接塩基が変更されたａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、ＲＮＡ編集効率に対するＮ１ＣＮ２の１６の異なる組み合わせの影響を示す図である。図１６Ｃは、Ａ－Ｃミスマッチにおけるシチジンの５’および３’の最も近い隣接部位の優先度の概略図である。図１６Ｄの上図は、可変長のａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター－１およびレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するａｒＲＮＡの長さの影響を示す図である。図１６Ｅの上図は、可変Ａ－Ｃミスマッチ位置を持つａｒＲＮＡの設計を示す図である。下図は、レポーター１とレポーター－２に基づくＲＮＡ編集効率に対するＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を示す図である。図１６Ｆの上図は、レポーター－３のトリプレットモチーフの設計を示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＣＮ１）を持つ。下図において、ディープシーケンシングの結果は、５’－Ｎ１ＡＮ２モチーフの標的アデノシンの編集率を示している。図１６Ｇは、「レポーター－３」でのＬＥＡＰＥＲを介した編集の５’および３’の塩基優先度の概略図である。図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｄ、１６Ｅ、及び１６Ｆのエラーバーはすべて、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）を示す。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１７Ａ～１７Ｉは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１７Ａは、４つの疾患関連遺伝子（ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ）および対応するａｒＲＮＡの標的化内因性転写物の概略図である。図１７Ｂは、指定された長さのａｒＲＮＡを導入することによる、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣ転写物の標的化されたアデノシンの編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｃ、内因性ＰＰＩＢ、ＦＡＮＣＣおよびＩＤＵＡ転写物の非ＵＡＮ部位での編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図１７Ｄは、２つの１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる多重編集率を示す図である。示されたａｒＲＮＡは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に単独でトランスフェクトされ、または共トランスフェクトされることができる。共トランスフェクトされた細胞において、２つの部位でのターゲティング編集は、測定された。図１７Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＰＰＩＢ転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１７Ｆは、ＰＰＩＢ遺伝子を標的とする示された長さのａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。１１１ｎｔ ａｒＲＮＡまたはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢでカバーされる領域の場合、この領域を増幅するための効果的なＰＣＲプライマーがないため、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、およびＡ３４の編集率はＲＮＡ－ｓｅｑによって決定された。それ以外の場合、編集率はターゲットとされたディープシーケンシング解析によって決定された。図１７Ｇの上図は、レポーター３のトリプレットモチーフのデザインを示す図であり、標的アデノシン（５’－Ｎ１ＡＮ２）の周囲に可変の最も近い隣接塩基を持ち、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１）上に反対のモチーフ（５’－Ｎ２ＧＮ１）を持つ。下図は、編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図１７Ｈの上図は、５’－ＵＡＧまたは５’－ＡＡＧモチーフの反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡの設計を示す図である。ディープシーケンシング結果は、５’－ＵＡＧモチーフ（左下）または５’－ＡＡＧモチーフ（右下）の反対側の５’－Ｎ１ＧＮ２モチーフに２つの連続したミスマッチがあるａｒＲＮＡ１１１による編集率を示す。図１７Ｉは、ＫＲＡＳ遺伝子を標的とする工学操作されたａｒＲＮＡ１１１バリアントによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄ、１７Ｇおよび１７Ｈのデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ＮＳ、有意ではない。（ｆおよびｉ）のデータは、平均（ｎ＝３）として表される。 図１８Ａ～１８Ｂは、標的転写物およびタンパク質産物の発現レベルに対する例示的なＬＥＡＰＥＲ法の影響を示す図である。図１８Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における対応する１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡまたは対照ＲＮＡによるＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣからの標的転写物の発現レベルを示す定量ＰＣＲを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。図１８Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる標的ＫＲＡＳ遺伝子のタンパク質産物への影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。β－チューブリンをローディングコントロールとして使用した。 図１８Ａ～１８Ｂは、標的転写物およびタンパク質産物の発現レベルに対する例示的なＬＥＡＰＥＲ法の影響を示す図である。図１８Ａは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における対応する１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡまたは対照ＲＮＡによるＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４およびＦＡＮＣＣからの標的転写物の発現レベルを示す定量ＰＣＲを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。図１８Ｂは、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによる標的ＫＲＡＳ遺伝子のタンパク質産物への影響を示すウエスタンブロットの結果を示す図である。β－チューブリンをローディングコントロールとして使用した。 図１９Ａ～１９Ｆは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１９Ａは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＫＡＲＳ転写物配列の概略図である。矢印は、標的アデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１９Ｂ、ＫＡＲＳ転写物中に示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。図１９Ｃは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＳＭＡＤ４転写物の概略図である。図１９Ｄは、ＳＭＡＤ４転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１９Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＦＡＮＣＣ転写物の概略図である。図１９Ｆは、ＦＡＮＣＣ転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。各ａｒＲＮＡについて、二重鎖ＲＮＡの領域が青色の太い枠で強調表示されている。データ（図１９Ｂ、１９Ｄ、および１９Ｆ）は、平均（ｎ＝３）として表されている。 図１９Ａ～１９Ｆは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１９Ａは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＫＡＲＳ転写物配列の概略図である。矢印は、標的アデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１９Ｂ、ＫＡＲＳ転写物中に示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。図１９Ｃは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＳＭＡＤ４転写物の概略図である。図１９Ｄは、ＳＭＡＤ４転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１９Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＦＡＮＣＣ転写物の概略図である。図１９Ｆは、ＦＡＮＣＣ転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。各ａｒＲＮＡについて、二重鎖ＲＮＡの領域が青色の太い枠で強調表示されている。データ（図１９Ｂ、１９Ｄ、および１９Ｆ）は、平均（ｎ＝３）として表されている。 図１９Ａ～１９Ｆは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１９Ａは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＫＡＲＳ転写物配列の概略図である。矢印は、標的アデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１９Ｂ、ＫＡＲＳ転写物中に示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。図１９Ｃは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＳＭＡＤ４転写物の概略図である。図１９Ｄは、ＳＭＡＤ４転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１９Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＦＡＮＣＣ転写物の概略図である。図１９Ｆは、ＦＡＮＣＣ転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。各ａｒＲＮＡについて、二重鎖ＲＮＡの領域が青色の太い枠で強調表示されている。データ（図１９Ｂ、１９Ｄ、および１９Ｆ）は、平均（ｎ＝３）として表されている。 図１９Ａ～１９Ｆは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１９Ａは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＫＡＲＳ転写物配列の概略図である。矢印は、標的アデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１９Ｂ、ＫＡＲＳ転写物中に示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。図１９Ｃは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＳＭＡＤ４転写物の概略図である。図１９Ｄは、ＳＭＡＤ４転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１９Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＦＡＮＣＣ転写物の概略図である。図１９Ｆは、ＦＡＮＣＣ転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。各ａｒＲＮＡについて、二重鎖ＲＮＡの領域が青色の太い枠で強調表示されている。データ（図１９Ｂ、１９Ｄ、および１９Ｆ）は、平均（ｎ＝３）として表されている。 図１９Ａ～１９Ｆは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１９Ａは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＫＡＲＳ転写物配列の概略図である。矢印は、標的アデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１９Ｂ、ＫＡＲＳ転写物中に示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。図１９Ｃは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＳＭＡＤ４転写物の概略図である。図１９Ｄは、ＳＭＡＤ４転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１９Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＦＡＮＣＣ転写物の概略図である。図１９Ｆは、ＦＡＮＣＣ転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。各ａｒＲＮＡについて、二重鎖ＲＮＡの領域が青色の太い枠で強調表示されている。データ（図１９Ｂ、１９Ｄ、および１９Ｆ）は、平均（ｎ＝３）として表されている。 図１９Ａ～１９Ｆは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法を用いた内因性転写物の編集を示す図である。図１９Ａは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＫＡＲＳ転写物配列の概略図である。矢印は、標的アデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。図１９Ｂ、ＫＡＲＳ転写物中に示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマークされている）である。図１９Ｃは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＳＭＡＤ４転写物の概略図である。図１９Ｄは、ＳＭＡＤ４転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。図１９Ｅは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＦＡＮＣＣ転写物の概略図である。図１９Ｆは、ＦＡＮＣＣ転写物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。各ａｒＲＮＡについて、二重鎖ＲＮＡの領域が青色の太い枠で強調表示されている。データ（図１９Ｂ、１９Ｄ、および１９Ｆ）は、平均（ｎ＝３）として表されている。 図２０Ａ～２０Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによるＲＮＡ編集のトランスクリプトーム全体の特異性を示す図である。図２０Ａおよび２０Ｂ、対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのトランスクリプトーム全体のオフターゲティング解析を示す図である。オンターゲティング部位（ＰＰＩＢ）は赤で強調表示されている。対照ＲＮＡグループとＰＰＩＢを標的とするＲＮＡグループの両方で識別された潜在的なオフターゲット部位は青色で標記されている。図２０Ｃは、オフターゲット部位と対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢの間の予測されるアニーリング親和性を示す図である。オフターゲット部位（編集部位の上流および下流１５０ ｎｔ）および対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢによって形成される二本鎖ＲＮＡの最小自由エネルギー（ΔＧ）は、オンラインウェブサイトツールであるＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して予測された。図２０Ｄの上図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢと指定された潜在的なオフターゲット部位との間の高度に相補的な領域の概略図であり、ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを介して相同配列を検索することによって予測されることができる。下図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのオンターゲット部位とすべての予測オフターゲット部位での編集率を示すディープシーケンシングを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２０Ａ～２０Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによるＲＮＡ編集のトランスクリプトーム全体の特異性を示す図である。図２０Ａおよび２０Ｂ、対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのトランスクリプトーム全体のオフターゲティング解析を示す図である。オンターゲティング部位（ＰＰＩＢ）は赤で強調表示されている。対照ＲＮＡグループとＰＰＩＢを標的とするＲＮＡグループの両方で識別された潜在的なオフターゲット部位は青色で標記されている。図２０Ｃは、オフターゲット部位と対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢの間の予測されるアニーリング親和性を示す図である。オフターゲット部位（編集部位の上流および下流１５０ ｎｔ）および対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢによって形成される二本鎖ＲＮＡの最小自由エネルギー（ΔＧ）は、オンラインウェブサイトツールであるＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して予測された。図２０Ｄの上図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢと指定された潜在的なオフターゲット部位との間の高度に相補的な領域の概略図であり、ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを介して相同配列を検索することによって予測されることができる。下図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのオンターゲット部位とすべての予測オフターゲット部位での編集率を示すディープシーケンシングを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２０Ａ～２０Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによるＲＮＡ編集のトランスクリプトーム全体の特異性を示す図である。図２０Ａおよび２０Ｂ、対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのトランスクリプトーム全体のオフターゲティング解析を示す図である。オンターゲティング部位（ＰＰＩＢ）は赤で強調表示されている。対照ＲＮＡグループとＰＰＩＢを標的とするＲＮＡグループの両方で識別された潜在的なオフターゲット部位は青色で標記されている。図２０Ｃは、オフターゲット部位と対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢの間の予測されるアニーリング親和性を示す図である。オフターゲット部位（編集部位の上流および下流１５０ ｎｔ）および対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢによって形成される二本鎖ＲＮＡの最小自由エネルギー（ΔＧ）は、オンラインウェブサイトツールであるＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して予測された。図２０Ｄの上図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢと指定された潜在的なオフターゲット部位との間の高度に相補的な領域の概略図であり、ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを介して相同配列を検索することによって予測されることができる。下図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのオンターゲット部位とすべての予測オフターゲット部位での編集率を示すディープシーケンシングを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２０Ａ～２０Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによるＲＮＡ編集のトランスクリプトーム全体の特異性を示す図である。図２０Ａおよび２０Ｂ、対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのトランスクリプトーム全体のオフターゲティング解析を示す図である。オンターゲティング部位（ＰＰＩＢ）は赤で強調表示されている。対照ＲＮＡグループとＰＰＩＢを標的とするＲＮＡグループの両方で識別された潜在的なオフターゲット部位は青色で標記されている。図２０Ｃは、オフターゲット部位と対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢの間の予測されるアニーリング親和性を示す図である。オフターゲット部位（編集部位の上流および下流１５０ ｎｔ）および対応する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢによって形成される二本鎖ＲＮＡの最小自由エネルギー（ΔＧ）は、オンラインウェブサイトツールであるＲＮＡｈｙｂｒｉｄを使用して予測された。図２０Ｄの上図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢと指定された潜在的なオフターゲット部位との間の高度に相補的な領域の概略図であり、ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを介して相同配列を検索することによって予測されることができる。下図は、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのオンターゲット部位とすべての予測オフターゲット部位での編集率を示すディープシーケンシングを示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２１Ａ～２１Ｂは、潜在的なオフターゲットの評価を示す図である。図２１Ａは、ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを介して相同配列を検索することによって予測された、ａｒＲＮＡ１１１－ＦＡＮＣＣの高度に相補的な領域および指定された潜在的なオフターゲット配列の概略図である。図２１Ｂは、ａｒＲＮＡ１１１－ＦＡＮＣＣのオンターゲット部位とすべての予測オフターゲット部位での編集率を示すディープシーケンシングを示す図である。すべてのデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２１Ａ～２１Ｂは、潜在的なオフターゲットの評価を示す図である。図２１Ａは、ＮＣＢＩ－ＢＬＡＳＴを介して相同配列を検索することによって予測された、ａｒＲＮＡ１１１－ＦＡＮＣＣの高度に相補的な領域および指定された潜在的なオフターゲット配列の概略図である。図２１Ｂは、ａｒＲＮＡ１１１－ＦＡＮＣＣのオンターゲット部位とすべての予測オフターゲット部位での編集率を示すディープシーケンシングを示す図である。すべてのデータは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２２Ａ～２２Ｆは、哺乳動物細胞において例示的なＬＥＡＰＥＲ法を適用することの安全性評価を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシングによるネイティブ編集部位に対する対照ＲＮＡ１５１（ａ）ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｂ）の効果のトランスクリプトーム全体の解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ネイティブ編集部位でのＲＮＡ編集率の差を評価した。図２２Ｃおよび２２Ｄは、トランスクリプトームレベルでのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた対照ＲＮＡ１５１（ｃ） ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｄ）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析を使用して、差次的遺伝子発現を評価した。図２２Ｅおよび２２Ｆは、自然免疫応答に対するａｒＲＮＡトランスフェクションの影響を示す図である。示されたａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に、定量ＰＣＲを使用して全ＲＮＡを解析し、ＩＦＮ－β（ｅ）およびＩＬ－６（ｆ）の発現レベルを決定した。データ（ｅ及びｆ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２２Ａ～２２Ｆは、哺乳動物細胞において例示的なＬＥＡＰＥＲ法を適用することの安全性評価を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシングによるネイティブ編集部位に対する対照ＲＮＡ１５１（ａ）ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｂ）の効果のトランスクリプトーム全体の解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ネイティブ編集部位でのＲＮＡ編集率の差を評価した。図２２Ｃおよび２２Ｄは、トランスクリプトームレベルでのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた対照ＲＮＡ１５１（ｃ） ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｄ）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析を使用して、差次的遺伝子発現を評価した。図２２Ｅおよび２２Ｆは、自然免疫応答に対するａｒＲＮＡトランスフェクションの影響を示す図である。示されたａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に、定量ＰＣＲを使用して全ＲＮＡを解析し、ＩＦＮ－β（ｅ）およびＩＬ－６（ｆ）の発現レベルを決定した。データ（ｅ及びｆ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２２Ａ～２２Ｆは、哺乳動物細胞において例示的なＬＥＡＰＥＲ法を適用することの安全性評価を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシングによるネイティブ編集部位に対する対照ＲＮＡ１５１（ａ）ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｂ）の効果のトランスクリプトーム全体の解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ネイティブ編集部位でのＲＮＡ編集率の差を評価した。図２２Ｃおよび２２Ｄは、トランスクリプトームレベルでのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた対照ＲＮＡ１５１（ｃ） ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｄ）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析を使用して、差次的遺伝子発現を評価した。図２２Ｅおよび２２Ｆは、自然免疫応答に対するａｒＲＮＡトランスフェクションの影響を示す図である。示されたａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に、定量ＰＣＲを使用して全ＲＮＡを解析し、ＩＦＮ－β（ｅ）およびＩＬ－６（ｆ）の発現レベルを決定した。データ（ｅ及びｆ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２２Ａ～２２Ｆは、哺乳動物細胞において例示的なＬＥＡＰＥＲ法を適用することの安全性評価を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシングによるネイティブ編集部位に対する対照ＲＮＡ１５１（ａ）ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｂ）の効果のトランスクリプトーム全体の解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ネイティブ編集部位でのＲＮＡ編集率の差を評価した。図２２Ｃおよび２２Ｄは、トランスクリプトームレベルでのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた対照ＲＮＡ１５１（ｃ） ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｄ）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析を使用して、差次的遺伝子発現を評価した。図２２Ｅおよび２２Ｆは、自然免疫応答に対するａｒＲＮＡトランスフェクションの影響を示す図である。示されたａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に、定量ＰＣＲを使用して全ＲＮＡを解析し、ＩＦＮ－β（ｅ）およびＩＬ－６（ｆ）の発現レベルを決定した。データ（ｅ及びｆ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２２Ａ～２２Ｆは、哺乳動物細胞において例示的なＬＥＡＰＥＲ法を適用することの安全性評価を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシングによるネイティブ編集部位に対する対照ＲＮＡ１５１（ａ）ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｂ）の効果のトランスクリプトーム全体の解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ネイティブ編集部位でのＲＮＡ編集率の差を評価した。図２２Ｃおよび２２Ｄは、トランスクリプトームレベルでのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた対照ＲＮＡ１５１（ｃ） ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｄ）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析を使用して、差次的遺伝子発現を評価した。図２２Ｅおよび２２Ｆは、自然免疫応答に対するａｒＲＮＡトランスフェクションの影響を示す図である。示されたａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に、定量ＰＣＲを使用して全ＲＮＡを解析し、ＩＦＮ－β（ｅ）およびＩＬ－６（ｆ）の発現レベルを決定した。データ（ｅ及びｆ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２２Ａ～２２Ｆは、哺乳動物細胞において例示的なＬＥＡＰＥＲ法を適用することの安全性評価を示す図である。図２２Ａおよび２２Ｂは、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシングによるネイティブ編集部位に対する対照ＲＮＡ１５１（ａ）ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｂ）の効果のトランスクリプトーム全体の解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析（Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ａｎａｌｙｓｉｓ）を使用して、ネイティブ編集部位でのＲＮＡ編集率の差を評価した。図２２Ｃおよび２２Ｄは、トランスクリプトームレベルでのＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた対照ＲＮＡ１５１（ｃ） ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ（ｄ）の効果の差次的遺伝子発現解析を示す図である。ピアソンの相関係数解析を使用して、差次的遺伝子発現を評価した。図２２Ｅおよび２２Ｆは、自然免疫応答に対するａｒＲＮＡトランスフェクションの影響を示す図である。示されたａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。次に、定量ＰＣＲを使用して全ＲＮＡを解析し、ＩＦＮ－β（ｅ）およびＩＬ－６（ｆ）の発現レベルを決定した。データ（ｅ及びｆ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。 図２３Ａ～２３Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによる変異体ＴＰ５３Ｗ５３Ｘの転写調節活性の回復を示す図である。図２３Ａの上図は、ｃ．１５８Ｇ＞Ａ臨床関連のナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を含む１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＴＰ５３転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図において、ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物をターゲットとする２つの最適化されたａｒＲＮＡが設計され、ここで、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１の場合はＡ４６ｔｈにＡ－Ｇミスマッチがあり、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４の場合はＡ１６ｔｈ、Ａ４６ｔｈ、Ａ９１ｔｈ、Ａ９４ｔｈでＡ－Ｇミスマッチがあることにより、「編集しやすい」モチーフの潜在的なオフターゲットを最小限に抑える。図２３Ｂは、ａｒＲＮＡ１１１、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１、およびａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４によるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物のターゲット編集を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２３Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞におけるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物からの完全長ｐ５３タンパク質の回復された産物を示すウエスタンブロットを示す図である。図２３Ｄは、同時トランスフェクトされたレニラルシフェラーゼベクターによって正規化された、ｐ５３－ホタル－ルシフェラーゼレポーターシステムを使用した、回復されたｐ５３タンパク質の転写調節活性の検出を示す図である。データ（ｂ、ｃおよびｄ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図２３Ａ～２３Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによる変異体ＴＰ５３Ｗ５３Ｘの転写調節活性の回復を示す図である。図２３Ａの上図は、ｃ．１５８Ｇ＞Ａ臨床関連のナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を含む１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＴＰ５３転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図において、ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物をターゲットとする２つの最適化されたａｒＲＮＡが設計され、ここで、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１の場合はＡ４６ｔｈにＡ－Ｇミスマッチがあり、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４の場合はＡ１６ｔｈ、Ａ４６ｔｈ、Ａ９１ｔｈ、Ａ９４ｔｈでＡ－Ｇミスマッチがあることにより、「編集しやすい」モチーフの潜在的なオフターゲットを最小限に抑える。図２３Ｂは、ａｒＲＮＡ１１１、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１、およびａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４によるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物のターゲット編集を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２３Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞におけるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物からの完全長ｐ５３タンパク質の回復された産物を示すウエスタンブロットを示す図である。図２３Ｄは、同時トランスフェクトされたレニラルシフェラーゼベクターによって正規化された、ｐ５３－ホタル－ルシフェラーゼレポーターシステムを使用した、回復されたｐ５３タンパク質の転写調節活性の検出を示す図である。データ（ｂ、ｃおよびｄ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図２３Ａ～２３Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによる変異体ＴＰ５３Ｗ５３Ｘの転写調節活性の回復を示す図である。図２３Ａの上図は、ｃ．１５８Ｇ＞Ａ臨床関連のナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を含む１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＴＰ５３転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図において、ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物をターゲットとする２つの最適化されたａｒＲＮＡが設計され、ここで、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１の場合はＡ４６ｔｈにＡ－Ｇミスマッチがあり、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４の場合はＡ１６ｔｈ、Ａ４６ｔｈ、Ａ９１ｔｈ、Ａ９４ｔｈでＡ－Ｇミスマッチがあることにより、「編集しやすい」モチーフの潜在的なオフターゲットを最小限に抑える。図２３Ｂは、ａｒＲＮＡ１１１、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１、およびａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４によるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物のターゲット編集を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２３Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞におけるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物からの完全長ｐ５３タンパク質の回復された産物を示すウエスタンブロットを示す図である。図２３Ｄは、同時トランスフェクトされたレニラルシフェラーゼベクターによって正規化された、ｐ５３－ホタル－ルシフェラーゼレポーターシステムを使用した、回復されたｐ５３タンパク質の転写調節活性の検出を示す図である。データ（ｂ、ｃおよびｄ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図２３Ａ～２３Ｄは、ＬＥＡＰＥＲによる変異体ＴＰ５３Ｗ５３Ｘの転写調節活性の回復を示す図である。図２３Ａの上図は、ｃ．１５８Ｇ＞Ａ臨床関連のナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）を含む１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによってカバーされるＴＰ５３転写物配列の概略図である。黒い矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図において、ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物をターゲットとする２つの最適化されたａｒＲＮＡが設計され、ここで、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１の場合はＡ４６ｔｈにＡ－Ｇミスマッチがあり、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４の場合はＡ１６ｔｈ、Ａ４６ｔｈ、Ａ９１ｔｈ、Ａ９４ｔｈでＡ－Ｇミスマッチがあることにより、「編集しやすい」モチーフの潜在的なオフターゲットを最小限に抑える。図２３Ｂは、ａｒＲＮＡ１１１、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１、およびａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４によるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物のターゲット編集を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２３Ｃは、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞におけるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物からの完全長ｐ５３タンパク質の回復された産物を示すウエスタンブロットを示す図である。図２３Ｄは、同時トランスフェクトされたレニラルシフェラーゼベクターによって正規化された、ｐ５３－ホタル－ルシフェラーゼレポーターシステムを使用した、回復されたｐ５３タンパク質の転写調節活性の検出を示す図である。データ（ｂ、ｃおよびｄ）は平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図２４は、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による変異体ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写物の編集を示す図である。上図は、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＴＰ５３転写配列の概略図である。矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図は、ＴＰ５３転写産物中の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップである。 図２５は、ＣｌｉｎＶａｒデータおよび対応する１１１ｎｔ ａｒＲＮＡからのＧからＡへの突然変異を含む選択された疾患関連ｃＤＮＡの概略図である。 図２６は、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による病原性突然変異の修正を示す図である。示されているように６つの病原性遺伝子からの臨床関連変異を標的とする、対応する１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡによるＣｌｉｎＶａｒデータからの疾患関連Ｇ＞Ａ変異のＡからＩへの修正（図２５および以下のａｒＲＮＡと対照ＲＮＡ、および疾患関連ｃＤＮＡの配列の表）を行った。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。ペアリングしていない両側スチューデントのｔ検定、＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１；ｎｓ、有意ではない。 図２７Ａ～２７Ｃは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による複数のヒト初代細胞におけるＲＮＡ編集を示す図である。図２７Ａは、ＬＥＡＰＥＲを介したＲＮＡ編集によって誘導されたＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。ヒト初代肺線維芽細胞およびヒト初代気管支上皮細胞に、１５１ ｎｔの対照ＲＮＡ（対照ＲＮＡ１５１）または１５１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１５１）とともにレポーター－１をトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。図２７Ｂおよび２７Ｃは、ヒト初代肺線維芽細胞、ヒト初代気管支上皮細胞（ｂ）、およびヒト初代Ｔ細胞（ｃ）におけるＰＰＩＢ転写物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。ａ、ｂおよび未処理グループ（ｃ）のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１（ｃ）のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。 図２７Ａ～２７Ｃは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による複数のヒト初代細胞におけるＲＮＡ編集を示す図である。図２７Ａは、ＬＥＡＰＥＲを介したＲＮＡ編集によって誘導されたＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。ヒト初代肺線維芽細胞およびヒト初代気管支上皮細胞に、１５１ ｎｔの対照ＲＮＡ（対照ＲＮＡ１５１）または１５１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１５１）とともにレポーター－１をトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。図２７Ｂおよび２７Ｃは、ヒト初代肺線維芽細胞、ヒト初代気管支上皮細胞（ｂ）、およびヒト初代Ｔ細胞（ｃ）におけるＰＰＩＢ転写物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。ａ、ｂおよび未処理グループ（ｃ）のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１（ｃ）のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。 図２７Ａ～２７Ｃは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による複数のヒト初代細胞におけるＲＮＡ編集を示す図である。図２７Ａは、ＬＥＡＰＥＲを介したＲＮＡ編集によって誘導されたＥＧＦＰ陽性（ＥＧＦＰ＋）細胞の定量化を示す図である。ヒト初代肺線維芽細胞およびヒト初代気管支上皮細胞に、１５１ ｎｔの対照ＲＮＡ（対照ＲＮＡ１５１）または１５１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１５１）とともにレポーター－１をトランスフェクトした後、ＦＡＣＳ解析を行った。図２７Ｂおよび２７Ｃは、ヒト初代肺線維芽細胞、ヒト初代気管支上皮細胞（ｂ）、およびヒト初代Ｔ細胞（ｃ）におけるＰＰＩＢ転写物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。ａ、ｂおよび未処理グループ（ｃ）のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝３）として表される。対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１（ｃ）のデータは、平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。 図２８Ａ～２８Ｄは、ａｒＲＮＡのレンチウイルス形質導入および合成されたａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションによる標的化された編集を示す図である。図２８Ａは、ＥＧＦＰ＋細胞の定量化を示す図である。レポーター－１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃｔｒｌ－ＲＮＡまたは標的ａｒＲＮＡを発現する１５１－ｎｔのレンチウイルスを感染させた。ＦＡＣＳ解析は感染の２日後と８日後に実施された。ＥＧＦＰ＋細胞の比率は、レンチウイルス形質導入効率（ＢＦＰ＋比率）によって正規化された。図２８Ｂは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのレンチウイルス形質導入時のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２８Ｃは、ＰＰＩＢ配列および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡの概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２８Ｄは、１１１ｎｔ合成ａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドをヒト初代Ｔ細胞にエレクトロポレーションした際のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。 図２８Ａ～２８Ｄは、ａｒＲＮＡのレンチウイルス形質導入および合成されたａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションによる標的化された編集を示す図である。図２８Ａは、ＥＧＦＰ＋細胞の定量化を示す図である。レポーター－１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃｔｒｌ－ＲＮＡまたは標的ａｒＲＮＡを発現する１５１－ｎｔのレンチウイルスを感染させた。ＦＡＣＳ解析は感染の２日後と８日後に実施された。ＥＧＦＰ＋細胞の比率は、レンチウイルス形質導入効率（ＢＦＰ＋比率）によって正規化された。図２８Ｂは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのレンチウイルス形質導入時のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２８Ｃは、ＰＰＩＢ配列および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡの概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２８Ｄは、１１１ｎｔ合成ａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドをヒト初代Ｔ細胞にエレクトロポレーションした際のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。 図２８Ａ～２８Ｄは、ａｒＲＮＡのレンチウイルス形質導入および合成されたａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションによる標的化された編集を示す図である。図２８Ａは、ＥＧＦＰ＋細胞の定量化を示す図である。レポーター－１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃｔｒｌ－ＲＮＡまたは標的ａｒＲＮＡを発現する１５１－ｎｔのレンチウイルスを感染させた。ＦＡＣＳ解析は感染の２日後と８日後に実施された。ＥＧＦＰ＋細胞の比率は、レンチウイルス形質導入効率（ＢＦＰ＋比率）によって正規化された。図２８Ｂは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのレンチウイルス形質導入時のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２８Ｃは、ＰＰＩＢ配列および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡの概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２８Ｄは、１１１ｎｔ合成ａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドをヒト初代Ｔ細胞にエレクトロポレーションした際のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。 図２８Ａ～２８Ｄは、ａｒＲＮＡのレンチウイルス形質導入および合成されたａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドのエレクトロポレーションによる標的化された編集を示す図である。図２８Ａは、ＥＧＦＰ＋細胞の定量化を示す図である。レポーター－１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃｔｒｌ－ＲＮＡまたは標的ａｒＲＮＡを発現する１５１－ｎｔのレンチウイルスを感染させた。ＦＡＣＳ解析は感染の２日後と８日後に実施された。ＥＧＦＰ＋細胞の比率は、レンチウイルス形質導入効率（ＢＦＰ＋比率）によって正規化された。図２８Ｂは、１５１－ｎｔ ａｒＲＮＡのＨＥＫ２９３Ｔ細胞へのレンチウイルス形質導入時のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシング結果を示す図である。図２８Ｃは、ＰＰＩＢ配列および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡの概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２８Ｄは、１１１ｎｔ合成ａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドをヒト初代Ｔ細胞にエレクトロポレーションした際のＰＰＩＢ転写産物の編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。 図２９Ａ～２９Ｅは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復を示す図である。図２９Ａの上図は、患者由来の線維芽細胞ＧＭ０６２１４における病原性突然変異の遺伝情報を示す図である。中間図は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９（Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）にホモ接合ＴＧＧ＞ＴＡＧ変異を含むＧＭ０６２１４細胞（黒）のＩＤＵＡ成熟ｍＲＮＡ配列、および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１（青）の概略図である。下図は、ＧＭ０６２１４細胞のＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列（黒）および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２（青）の概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２９Ｂは、異なる時点での４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニダーゼ基質を用いたα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性の測定を示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。図２９Ｃは、エレクトロポレーションの４８時間後のＧＭ０６２１４細胞におけるＩＤＵＡ転写産物の標的編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図２９Ｄの上図は、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＩＤＵＡ転写配列の概略図である。矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図は、ＩＤＵＡ転写産物の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマーク）である。ｅは、ａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）エレクトロポレーション後のＩ型インターフェロン、インターフェロン刺激遺伝子、および炎症誘発性遺伝子の発現を示す定量ＰＣＲである。データは平均（ｎ＝３）として表される。 図２９Ａ～２９Ｅは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復を示す図である。図２９Ａの上図は、患者由来の線維芽細胞ＧＭ０６２１４における病原性突然変異の遺伝情報を示す図である。中間図は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９（Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）にホモ接合ＴＧＧ＞ＴＡＧ変異を含むＧＭ０６２１４細胞（黒）のＩＤＵＡ成熟ｍＲＮＡ配列、および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１（青）の概略図である。下図は、ＧＭ０６２１４細胞のＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列（黒）および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２（青）の概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２９Ｂは、異なる時点での４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニダーゼ基質を用いたα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性の測定を示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。図２９Ｃは、エレクトロポレーションの４８時間後のＧＭ０６２１４細胞におけるＩＤＵＡ転写産物の標的編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図２９Ｄの上図は、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＩＤＵＡ転写配列の概略図である。矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図は、ＩＤＵＡ転写産物の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマーク）である。ｅは、ａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）エレクトロポレーション後のＩ型インターフェロン、インターフェロン刺激遺伝子、および炎症誘発性遺伝子の発現を示す定量ＰＣＲである。データは平均（ｎ＝３）として表される。 図２９Ａ～２９Ｅは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復を示す図である。図２９Ａの上図は、患者由来の線維芽細胞ＧＭ０６２１４における病原性突然変異の遺伝情報を示す図である。中間図は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９（Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）にホモ接合ＴＧＧ＞ＴＡＧ変異を含むＧＭ０６２１４細胞（黒）のＩＤＵＡ成熟ｍＲＮＡ配列、および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１（青）の概略図である。下図は、ＧＭ０６２１４細胞のＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列（黒）および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２（青）の概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２９Ｂは、異なる時点での４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニダーゼ基質を用いたα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性の測定を示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。図２９Ｃは、エレクトロポレーションの４８時間後のＧＭ０６２１４細胞におけるＩＤＵＡ転写産物の標的編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図２９Ｄの上図は、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＩＤＵＡ転写配列の概略図である。矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図は、ＩＤＵＡ転写産物の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマーク）である。ｅは、ａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）エレクトロポレーション後のＩ型インターフェロン、インターフェロン刺激遺伝子、および炎症誘発性遺伝子の発現を示す定量ＰＣＲである。データは平均（ｎ＝３）として表される。 図２９Ａ～２９Ｅは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復を示す図である。図２９Ａの上図は、患者由来の線維芽細胞ＧＭ０６２１４における病原性突然変異の遺伝情報を示す図である。中間図は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９（Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）にホモ接合ＴＧＧ＞ＴＡＧ変異を含むＧＭ０６２１４細胞（黒）のＩＤＵＡ成熟ｍＲＮＡ配列、および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１（青）の概略図である。下図は、ＧＭ０６２１４細胞のＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列（黒）および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２（青）の概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２９Ｂは、異なる時点での４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニダーゼ基質を用いたα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性の測定を示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。図２９Ｃは、エレクトロポレーションの４８時間後のＧＭ０６２１４細胞におけるＩＤＵＡ転写産物の標的編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図２９Ｄの上図は、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＩＤＵＡ転写配列の概略図である。矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図は、ＩＤＵＡ転写産物の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマーク）である。ｅは、ａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）エレクトロポレーション後のＩ型インターフェロン、インターフェロン刺激遺伝子、および炎症誘発性遺伝子の発現を示す定量ＰＣＲである。データは平均（ｎ＝３）として表される。 図２９Ａ～２９Ｅは、例示的なＬＥＡＰＥＲ法による、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復を示す図である。図２９Ａの上図は、患者由来の線維芽細胞ＧＭ０６２１４における病原性突然変異の遺伝情報を示す図である。中間図は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９（Ｔｒｐ４０２Ｔｅｒ）にホモ接合ＴＧＧ＞ＴＡＧ変異を含むＧＭ０６２１４細胞（黒）のＩＤＵＡ成熟ｍＲＮＡ配列、および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１（青）の概略図である。下図は、ＧＭ０６２１４細胞のＩＤＵＡ ｐｒｅ－ｍＲＮＡ配列（黒）および対応する１１１－ｎｔ標的ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２（青）の概略図である。＊（赤）は、２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合が修飾されたヌクレオチドを表す。図２９Ｂは、異なる時点での４－メチルウンベリフェリルα－Ｌ－イズロニダーゼ基質を用いたα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性の測定を示す図である。データは平均±ｓ．ｅ．ｍ．（ｎ＝２）として表される。図２９Ｃは、エレクトロポレーションの４８時間後のＧＭ０６２１４細胞におけるＩＤＵＡ転写産物の標的編集率を示すディープシーケンシングの結果を示す図である。図２９Ｄの上図は、１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡでカバーされるＩＤＵＡ転写配列の概略図である。矢印は、標的となるアデノシンを示す。すべてのアデノシンは赤でマークされた。下図は、ＩＤＵＡ転写産物の示されたａｒＲＮＡによってカバーされるアデノシンの編集率のヒートマップ（青色の太い枠でマーク）である。ｅは、ａｒＲＮＡまたはポリ（Ｉ：Ｃ）エレクトロポレーション後のＩ型インターフェロン、インターフェロン刺激遺伝子、および炎症誘発性遺伝子の発現を示す定量ＰＣＲである。データは平均（ｎ＝３）として表される。 図３０Ａ～３０Ｃは、二重蛍光レポーター（レポーター－１、－２、および－３）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰの３つのバージョンを示す図である。図３０Ａは、レポーター－１の構造を、図３０Ｂは、レポーター－２の構造、図３０Ｃは、レポーター３の構造を示す図である。 図３０Ａ～３０Ｃは、二重蛍光レポーター（レポーター－１、－２、および－３）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰの３つのバージョンを示す図である。図３０Ａは、レポーター－１の構造を、図３０Ｂは、レポーター－２の構造、図３０Ｃは、レポーター３の構造を示す図である。 図３０Ａ～３０Ｃは、二重蛍光レポーター（レポーター－１、－２、および－３）、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰの３つのバージョンを示す図である。図３０Ａは、レポーター－１の構造を、図３０Ｂは、レポーター－２の構造、図３０Ｃは、レポーター３の構造を示す図である。 図３１は、ＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２およびＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２のプラスミド情報を示す図である。 図３１は、ＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２およびＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２のプラスミド情報を示す図である。 図３２Ａ～Ｂは、ＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２およびＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２を注射したＭＰＳＩマウスのα－Ｌ－イズロニダーゼ相対酵素活性を示す図である。ＧＭ０１３２３細胞は対照とされた。 図３２Ａ～Ｂは、ＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２およびＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２を注射したＭＰＳＩマウスのα－Ｌ－イズロニダーゼ相対酵素活性を示す図である。ＧＭ０１３２３細胞は対照とされた。 図３３Ａ～Ｂは、ＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２およびＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２を注射したＭＰＳＩマウスのＲＮＡ編集効率を示す図である。 図３３Ａ～Ｂは、ＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２およびＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２を注射したＭＰＳＩマウスのＲＮＡ編集効率を示す図である。
本出願は、宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するために、ＲＮＡ編集法（本明細書では「ＬＥＡＰＥＲ」法と呼ばれる）および特別に設計されたＲＮＡ（本明細書ではデアミナーゼ動員ＲＮＡ（「ｄＲＮＡ」）またはＡＤＡＲ－動員ＲＮＡ（「ａｒＲＮＡ」）と呼ばれる）を提供する。理論や仮説に縛られることなく、前記ｄＲＮＡはその標的ＲＮＡに配列特異的にハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡを形成し、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ Ａｃｔｉｎｇ ｏｎ ＲＮＡ、ＡＤＡＲ）を動員して、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化する。したがって、一部の実施形態では、宿主細胞におけるＡＤＡＲタンパク質の異所性発現または過剰発現なしに、効率的なＲＮＡ編集を達成することができる。本発明はさらに、前記ＲＮＡ編集法を使用して個体の疾患または病症を治療または予防するための方法および組成物を提供する。
本明細書に記載のＲＮＡ編集方法は、ＡＤＡＲと、ガイド核酸に特異的に結合するタンパク質（Ｃａｓなど）とを含む融合タンパク質を使用しない。本明細書に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄｅａｍｉｎａｓｅ－ｒｅｃｒｕｉｔｉｎｇ ＲＮＡ（ｄＲＮＡ））は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用されるｃｒＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡまたはｇＲＮＡを含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメイン、または化学修飾を含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、プラスミドまたはウイルスベクターから発現され得るか、またはオリゴヌクレオチドとして合成され得、これは、望ましい編集効率を達成し得る。
ここで説明するＬＥＡＰＥＲ法は、標的となる転写物とまれなグローバルオフターゲットに対して管理可能なオフターゲット率を持っている。発明者らは、ＬＥＡＰＥＲ法を使用して、特定の癌関連の点突然変異を修復することにより、ｐ５３機能を回復させた。本明細書に記載のＬＥＡＰＥＲ法は、複数のヒト初代細胞を含む広範囲の細胞型にも適用でき、自然免疫応答を誘発することなく、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イズロニダーゼ触媒活性を回復するために使用できる。一部の実施形態では、ＬＥＡＰＥＲ法は、単一分子（すなわち、ｄＲＮＡ）システムを含む。本明細書でいうＬＥＡＰＥＲ法は、正確で効率的なＲＮＡ編集を可能にし、基礎研究と治療法に変革の可能性をもたらす。
定義
本発明を、特定の実施形態を用いて特定の図面を参照して説明するが、本発明は、それに限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。請求項内の参照記号は、範囲を制限するものと解釈されるべきではない。「含む」という用語が本明細書および請求の範囲で使用される場合、それは他の要素またはステップを除外しない。単数名詞に言及する時に、例えば、「一つ」または「一種」、「当該」など、不定冠詞または定冠詞が使用される場合、特に明記されていない限り、その名詞の複数形も含まれる。本明細書におけるヌクレオチドの数値範囲に対する説明については、その間に介在する各数値が明確に考慮されている。例えば、４０～２６０ヌクレオチドの範囲については、４０ヌクレオチドおよび２６０ヌクレオチドの数の他に、４０～２６０ヌクレオチドの間の任意の整数のヌクレオチドも考慮される。
以下の用語または定義は、本発明の理解を助けるためにのみ提供されている。本明細書で具体的に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての用語は、本発明の当業者にとっての意味と同じ意味を有する。本分野の定義及び用語について、当業者は、特に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｕｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｓｖｉｅｗ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ ４７），Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９９９）を参照できる。本明細書で提供される定義は、当業者によって理解される範囲よりも狭い範囲と解釈されるべきではない。
「デアミナーゼ動員ＲＮＡ」、「ｄＲＮＡ」、「ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ」および「ａｒＲＮＡ」という用語は、本明細書では置き換えて使用でき、ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためにＡＤＡＲを動員することができる工学操作されたＲＮＡを指す。
「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」および「核酸」という用語は置き換えて使用できる。それらは、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体のいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。
本明細書で使用される「アデニン」、「グアニン」、「シトシン」、「チミン」、「ウラシル」および「ヒポキサンチン」という用語は、核酸塩基それ自体を指す。「アデノシン」、「グアノシン」、「シチジン」、「チミジン」、「ウリジン」および「イノシン」という用語は、リボースまたはデオキシリボース糖部分に連結された核酸塩基を指す。「ヌクレオシド」という用語は、リボースまたはデオキシリボースに結合した核酸塩基を指す。「ヌクレオチド」という用語は、それぞれの核酸塩基-リボシル-リン酸または核酸塩基-デオキシリボシル-リン酸を指す。アデノシンとアデニン（略して「Ａ」）、グアノシンとグアニン（略して「Ｇ」）、シトシンとシチジン（略して「Ｃ」）、ウラシルとウリジン（略して、「Ｕ」）、チミンおよびチミジン（略して「Ｔ」）、イノシンおよびヒポキサンチン（略して「Ｉ」）は、対応する核酸塩基、ヌクレオシドまたはヌクレオチドを指し、置き換えて使用されることができる。文脈が明らかに異なって要求しない限り、核酸塩基、ヌクレオシドおよびヌクレオチドという用語は交換可能に使用されることがある。
本出願の文脈において、「標的ＲＮＡ」は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ配列が完全な相補性または実質的な相補性を有するように設計され、標的配列とｄＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが、標的アデノシンを含む二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）領域を形成するＲＮＡ配列を指し、それはＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員し、この酵素は標的アデノシンを脱アミノ化する。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、真核細胞（好ましくは、哺乳動物細胞、より好ましくは、ヒト細胞）などの宿主細胞に自然に存在する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞に導入される。
本明細書で使用される場合、「相補性」は、従来のワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成によって別の核酸と水素結合を形成する核酸の能力を指す。パーセント相補性は、第２の核酸と水素結合（すなわち、ワトソン－クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうち約５、６、７、８、９、１０がそれぞれ約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、及び１００％相補的である）。「完全に相補的」とは、核酸配列のすべての連続する残基が、第２の核酸配列における同じ数の連続する残基と水素結合を形成することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、約４０、５０、６０、７０、８０、１００、１５０、２００、２５０またはそれ以上のヌクレオチドの領域にわたって、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、または１００％のいずれか１つである相補性の程度、またはストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。
本明細書で使用される場合、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が主に標的配列とハイブリダイズし、実質的に非標的配列にハイブリダイズしない条件を指す。ストリンジェントな条件は一般に配列に依存し、多くの要因によって異なる。一般に、配列が長いほど、その配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度は高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例は、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ “Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ，Ｙに詳細に記載されている。
「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが反応して、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合を介して安定化される複合体を形成する反応を指す。前記水素結合は、ワトソンクリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対形成、フーグスティーン（Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ）結合、またはその他の配列特異的な方法で発生できる。所定の配列とハイブリダイズすることができる配列は、所定の配列の「相補配列」と呼ばれる。
本明細書で使用される場合、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という用語は置き換えて使用され、これらすべての呼称には後代が含まれる。意図的または意図しない突然変異のため、すべての後代のＤＮＡ内容が完全に同じであるとは限らないことを理解されたい。本発明は、元の細胞と同じ機能または生物学的活性を有する変異体の後代を含む。
ＲＮＡ編集の方法
一部の実施形態において、本出願は、デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）またはｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）における標的ＲＮＡを編集する方法を提供し、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的アデノシン（Ａ）を脱アミノ化するようにＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる。
一部の実施形態において、本出願は、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）における標的ＲＮＡを編集する方法を提供し、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化するように宿主細胞の内因的に発現されたＡＤＡＲを動員する。一部の実施形態では、この方法は、任意のタンパク質またはタンパク質をコードする構築体（例えば、Ｃａｓ、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲとＣａｓの融合タンパク質）を宿主細胞に導入することを含まない。
一部の実施形態において、（ａ）ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体、および（ｂ）ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）における標的ＲＮＡを編集するための方法が提供され、ここで、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化するようにＡＤＡＲを動員する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞の内因的にコードされたＡＤＡＲであり、前記ＡＤＡＲの導入は、宿主細胞においてＡＤＡＲを過剰発現することを含む。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性である。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲをコードする構築体は、プラスミドなどのベクター、またはウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）である。
一部の実施形態において、複数のｄＲＮＡまたは複数のｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）における複数（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００以上）の標的ＲＮＡを編集するための方法が提供され、ここで、各ｄＲＮＡは、前記複数の標的ＲＮＡ中の対応する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、各ｄＲＮＡは、対応する標的ＲＮＡの標的Ａを脱アミノ化するようにＡＤＡＲを動員することができる。
一部の実施形態において、複数のｄＲＮＡまたは複数のｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）における複数（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００以上）の標的ＲＮＡを編集するための方法が提供され、ここで、各ｄＲＮＡは、前記複数の標的ＲＮＡ中の対応する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、各ｄＲＮＡは、対応する標的ＲＮＡの標的Ａを脱アミノ化するように内因的に発現されるＡＤＡＲを動員する。
一部の実施形態において、（ａ）複数のｄＲＮＡまたは複数のｄＲＮＡをコードする構築体、および（ｂ）ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）における複数（例えば、少なくとも約２、３、４、５、１０、２０、５０、１００、１０００以上）の標的ＲＮＡを編集するための方法が提供され、ここで、各ｄＲＮＡは、前記複数の標的ＲＮＡ中の対応する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、各ｄＲＮＡは、対応する標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化するようにＡＤＡＲを動員する。
一態様では、本出願は、複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡ、デアミナーゼ動員ＲＮＡをコードする１つ以上の構築体、または本明細書に記載のライブラリーを宿主細胞に導入することにより、宿主細胞内の複数のＲＮＡを編集する方法を提供する。
特定の実施形態において、標的ＲＮＡを編集するための方法は、複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡを含む１つ以上の構築体を宿主細胞に導入して、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員して（１つ以上の標的ＲＮＡ中の１つ以上の標的アデノシンに対する）脱アミノ化する反応を行うことを含み、各デアミナーゼ動員ＲＮＡは、対応する標的ＲＮＡに相補的なＲＮＡ配列を含む。
一態様では、本出願は、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の１つ以上の修飾を宿主細胞（例えば、真核細胞）において生成するための方法を提供し、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記１つ以上の修飾は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質のミスフォールディング、標的ＲＮＡ中の早期終止コドン、標的ＲＮＡ中の異常なスプライシング部位、及び標的ＲＮＡ中の可変的スプライシング部位からなる群より選ばれる。
一部の実施形態において、本出願は、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞（例えば、真核細胞）において、標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復するための方法を提供し、ここで、ｄＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、標的ＲＮＡが、標的ＲＮＡ中の早期終止コドン、異常なスプライス部位または可変的スプライス部位、若しくはタンパク質のミスフォールディングをもたらすＧからＡへの突然変異を有し、ｄＲＮＡがＡＤＡＲを動員してＡ変異を編集し、それによって標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復させる。
特定の実施形態において、複数の標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の１つ以上の修飾を宿主細胞（例えば、真核細胞）において生成するための方法は、複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む。ここで、各ｄＲＮＡは、前記複数の標的ＲＮＡ中の対応する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、各ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して対応する標的ＲＮＡの標的Ａを脱アミノ化することができる。一態様では、本出願は、宿主細胞内の標的ＲＮＡを編集するための、本明細書に記載のｄＲＮＡのいずれか１つによるデアミナーゼ動員ＲＮＡの使用を提供する。特定の実施形態において、デアミナーゼ動員ＲＮＡは、編集される標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含む。
一態様では、本出願は、標的ＲＮＡおよび／または標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質に１つ以上の修飾を生成するための、本明細書に記載のｄＲＮＡのいずれか１つによるデアミナーゼ動員ＲＮＡの使用を提供する。前記一つ以上の修飾は、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質のミスフォールディング、標的ＲＮＡ中の早期終止コドン、標的ＲＮＡ中の異常なスプライシング部位、及び標的ＲＮＡ中の可変的スプライシング部位からなる群より選ばれる。特定の実施形態において、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡは、編集される標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含む。
本発明はまた、本明細書に記載のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を真核細胞に導入して天然の内因性アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員し、ＡＤＡＲが標的ＲＮＡ配列中の標的アデノシンに対して脱アミノ化反応を行うようにＲＮＡに作用することを含む、内因性アデノシンデアミナーゼを利用して真核細胞中の標的ＲＮＡを編集するための方法に関する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態において、ｄＲＮＡは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０を上回るヌクレオチドのいずれか１つを含む。特定の実施形態において、ｄＲＮＡは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０、または１０５～１４０ヌクレオチドのいずれか１つである。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは約７１ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、約１１１ヌクレオチド長である。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメインを含まない。「ＡＤＡＲ動員ドメイン」は、ＡＤＡＲに高い親和性で結合するヌクレオチド配列または構造、あるいは工学操作されたＡＤＡＲ構築体においてＡＤＡＲに融合された結合パートナーに結合するヌクレオチド配列であり得る。例示的なＡＤＡＲ動員領域には、ＧｌｕＲ－２、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｒ／Ｇ）、ＧｌｕＲ－Ｂ（Ｑ／Ｒ）、ＧｌｕＲ－６（Ｒ／Ｇ）、５ＨＴ２Ｃ、およびＦｌｎＡ（Ｑ／Ｒ）ドメインが含まれるが、これらに限定されない;たとえば、Ｗａｈｌｓｔｅｄｔ、Ｈｅｌｅｎｅ、ａｎｄ Ｍａｒｉｅ，“Ｓｉｔｅ－ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ ｖｅｒｓｕｓ ｐｒｏｍｉｓｃｕｏｕｓ Ａ－ｔｏ－Ｉ ｅｄｉｔｉｎｇ”、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐｌｉｎａｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ：ＲＮＡ ２．６（２０１１）：７６１－７７１は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは二本鎖部分を含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＭＳ２ステムループなどのヘアピンを含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは一本鎖である。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、ＤＳＢ結合ドメインを含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、相補的ＲＮＡ配列からなる（または本質的に相補的ＲＮＡ配列からなる）。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、ｄＲＮＡは化学修飾を含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、２'－Ｏ－メチルヌクレオチドまたはホスホロチオエート結合を有するヌクレオチドなどの化学的に修飾されたヌクレオチドを含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、最初の３つおよび最後の３つの残基にのみ２'－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を含む。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）ではない。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、前記宿主細胞は原核細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は真核細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。一部の実施形態では、前記宿主細胞はヒト細胞である。一部の実施形態において、宿前記主細胞はマウス細胞である。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、植物細胞または真菌細胞である。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＲＤ、ＳＦ２６８、ＳＷ１３およびＨｅＬａ細胞などの細胞株である。一部の実施形態において、宿主細胞は、線維芽細胞、上皮細胞、または免疫細胞などの初代細胞である。一部の実施形態では、宿主細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、有糸分裂後の細胞である。一部の実施形態において、宿主細胞は、脳細胞、例えば、小脳細胞などの中枢神経系（ＣＮＳ）の細胞である。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、初代宿主細胞（例えば、Ｔ細胞またはＣＮＳ細胞）において標的ＲＮＡを編集する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、宿主細胞の内因的に発現されたＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、前記ＡＤＡＲは宿主細胞に対して内因性である。一部の実施形態において、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、宿主細胞に自然にまたは内因的に存在し、例えば、真核細胞に自然にまたは内因的に存在する。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞によって内因的に発現される。特定の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、宿主細胞に外因的に導入される。一部の実施形態では、前記ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２である。特定の実施形態では、前記ＡＤＡＲは、ｈＡＤＡＲ１、ｈＡＤＡＲ２、マウスＡＤＡＲ１およびＡＤＡＲ２からなる群から選択される１つ以上のＡＤＡＲである。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲ１のｐ１１０アイソフォーム（「ＡＤＡＲ１ｐ１１０」）および／またはＡＤＡＲ１のｐ１５０アイソフォーム（「ＡＤＡＲ１ｐ１５０」）などのＡＤＡＲ１である。一部の実施形態では、ＡＤＡＲはＡＤＡＲ２である。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞によって発現されるＡＤＡＲ２、例えば、小脳細胞によって発現されるＡＤＡＲ２である。
一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、宿主細胞に対して外因性のＡＤＡＲである。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、天然に存在するＡＤＡＲの多動変異体である。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、Ｅ１００８Ｑ突然変異を含むＡＤＡＲ１である。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、結合ドメインを含む融合タンパク質ではない。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、工学操作された二本鎖核酸結合ドメインを含まない。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、ｄＲＮＡの相補的ＲＮＡ配列に融合されたＭＳ２ヘアピンに結合するＭＣＰドメインを含まない。一部の実施形態では、ＡＤＡＲは、ＤＳＢ結合ドメインを含まない。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる一部の実施形態では、宿主細胞は、高い発現レベル、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、２ｘ、３ｘ、５ｘまたそれ以上のいずれか１つのＡＤＡＲ１（ＡＤＡＲ１ｐ１１０および／またはＡＤＡＲ１ｐ１５０など）を有する。一部の実施形態において、宿主細胞は、高い発現レベル、例えば、β-チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、少なくとも約１０％、２０％、５０％、１００％、２ｘ、３ｘ、５ｘまたはそれ以上のいずれか１つのＡＤＡＲ２を有する。一部の実施形態において、宿主細胞は、低い発現レベル、例えば、β－チューブリンのタンパク質発現レベルに対して、約５ｘ、３ｘ、２ｘ、１００％、５０％、２０％またはそれ以下のいずれか１つを超えないＡＤＡＲ３を有する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、前記相補的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの標的Ａの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む。一部の実施形態では、相補的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの標的Ａの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の５'末端から少なくとも５ヌクレオチド、例えば、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、またはそれ以上のヌクレオチド離れに位置している。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３'末端から少なくとも２０ヌクレオチド、例えば、少なくとも２５、３０、３５、またはそれ以上のヌクレオチド離れに位置している。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３'末端から２０（例えば、１５、１０、５以下）ヌクレオチド内に位置していない。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３'末端から少なくとも２０ヌクレオチド（例えば、少なくとも２５、３０、３５、またはそれ以上のヌクレオチド）および５'末端から少なくとも５ヌクレオチド（例えば、少なくとも１０、１５、２０）離れて位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の中心に位置する。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、ｄＲＮＡの相補的配列の中心から２０ヌクレオチド（例えば、１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１ヌクレオチド）内に位置する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、相補的ＲＮＡ配列は、１つまたは２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のＧなどの１つ以上のグアノシンをさらに含み、それらはそれぞれ標的ＲＮＡの非標的アデノシンの真向かいにある。一部の実施形態において、相補的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡの非標的アデノシンに対向する２つまたはそれ以上の連続するミスマッチヌクレオチド（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上のミスマッチヌクレオチド）を含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、約１５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２、または１以下の非標的Ａのいずれか１つなど、約２０以下の非標的Ａを含む。非標的Ａに対向するＧおよび連続するミスマッチヌクレオチドは、ＡＤＡＲによるオフターゲット編集効果を低減することができる。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、標的Ａの５'に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的Ａの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。特定の実施形態では、標的ＲＮＡにおける標的Ａが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフである。特定の実施形態では、前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡが、前記３塩基モチーフのＵの真向かいのＡ、前記標的Ａの真向かいのＣ、及び３塩基モチーフのＧの真向かいのＣ、Ｇ、またはＵを含む。特定の実施形態では、前記３塩基モチーフが標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡが、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＵを含む。特定の実施形態では、３塩基モチーフは標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣを含む。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、前記標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、及び小さいＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）からなる群から選択されるいずれか１つである。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、プレメッセンジャーＲＮＡである。一部の実施形態では、標的ＲＮＡはメッセンジャーＲＮＡである。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲ３の阻害剤を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ＡＤＡＲ３の阻害剤は、ＡＤＡＲ３に対するＲＮＡｉであり、例えば、ＡＤＡＲ３に対するｓｈＲＮＡまたはＡＤＡＲ３に対するｓｉＲＮＡなどである。一部の実施形態では、この方法は、インターフェロンのスティミュレーター（ｓｔｉｍｕｌａｔｏｒ）を宿主細胞に導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、インターフェロンによって誘導可能であり、例えば、ＡＤＡＲは、ＡＤＡＲｐ１５０である。一部の実施形態において、インターフェロンのスティミュレーターは、ＩＦＮαである。一部の実施形態において、ＡＤＡＲ３の阻害剤および／またはインターフェロンのスティミュレーターは、ｄＲＮＡをコードする同じ構築体（例えば、ベクター）によってコードされる。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、標的ＲＮＡの編集効率は、少なくとも約５％、例えば、少なくとも約６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、またはそれ以上のいずれか１つである。一部の実施形態において、インビボ（例えば、動物において）での標的ＲＮＡの編集効率は、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約７％）である。一部の実施形態において、標的ＲＮＡの編集の効率は、インビトロまたはエクスビボの細胞において少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約１５％）である。一部の実施形態では、編集の効率は、サンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシングによって決定される。一部の実施形態では、編集の効率は、次世代シーケンシングによって決定される。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、この方法は、オフターゲット編集率が低い。一部の実施形態では、この方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａに対して約１％未満（例えば、０．５％、０．１％、０．０５％、０．０１％、０．００１％またはそれ以下のいずれか１つ以下）の編集効率を有する。一部の実施形態では、この方法は、標的ＲＮＡ中の非標的Ａを編集しない。一部の実施形態において、この方法は、非標的ＲＮＡにおけるＡに対する編集効率が約０．１％未満（例えば、０．０５％、０．０１％、０．００５％、０．００１％、０．０００１％以下あるいはそれ以下のいずれか１つ）である。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、この方法は、自然免疫応答などの免疫応答を誘導しない。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞においてインターフェロンおよび／またはインターロイキンの発現を誘導しない。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞においてＩＦＮ－βおよび／またはＩＬ－６発現を誘導しない。
本発明さらに、本明細書に記載の方法のいずれか１つによって生成された編集されたＲＮＡを有する、編集されたＲＮＡまたは宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、編集されたＲＮＡはイノシンを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ミスセンス突然変異、早期終止コドン、可変的スプライシング部位、または異常なスプライシング部位を有するＲＮＡを含む。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、突然変異された、切断された、またはミスフォールディングされたタンパク質を含む。
本明細書に記載の「宿主細胞」とは、本明細書に記載のように修飾されることができるという条件で、宿主細胞として使用することができる任意の細胞型を指す。例えば、前記宿主細胞は、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を内因的に発現する宿主細胞であり得るか、またはＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）が本分野で既知の方法によって導入される宿主細胞であり得る。例えば、前記宿主細胞は、原核細胞、真核細胞、または植物細胞であってもよい。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト細胞株または非ヒト細胞株を含む哺乳動物細胞株などの予め確立された細胞株に由来する。一部の実施形態において、前記宿主細胞は、ヒト個体などの個体に由来する。
本明細書で使用される「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ）」または「導入（ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ｄＲＮＡなどの１つ以上のポリヌクレオチド、または本明細書に記載のベクターを含む１つまたは複数の構築体、その１つ以上の転写物を前記宿主細胞に送達することを意味する。本発明は、例えば、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡおよび小さいＲＮＡ（ｍｉＲＮＡなど）の標的化された編集を可能にするためのＲＮＡの基本的なプラットフォームとして使用される。本出願の方法は、ウイルス、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクションおよび接合を含むがこれらに限定されない多くの送達システムを使用して、本明細書に記載のｄＲＮＡまたは構築体の宿主細胞への導入を達成することができる。従来のウイルスおよび非ウイルスベースの遺伝子導入法を使用して、哺乳動物細胞または標的組織に核酸を導入することができる。そのような方法を使用して、本出願のｄＲＮＡをコードする核酸を、培養中の細胞または宿主生物内に投与することができる。非ウイルスベクター送達システムには、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡ（例えば、本明細書に記載の構築体の転写物）、裸の核酸、およびリポソームなどの送達ビヒクルと複合体を形成した核酸が含まれる。前記ウイルスベクター送達システムには、前記宿主細胞に送達するためのエピソームまたは統合ゲノムのいずれかを有するＤＮＡおよびＲＮＡウイルスが含まれる。
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、エレクトロポレーション、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃、裸のＤＮＡおよび人工ビリオンが含まれる。
核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスベースのシステムの使用は、ウイルスを特定の細胞に標的化し、ウイルスペイロードを細胞核に輸送するのに高い効率を有する。
本明細書に記載の方法または使用のいずれか１つによる特定の実施形態では、この方法は、ｄＲＮＡをコードするウイルスベクター（レンチウイルスベクターなど）を宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８である。一部の実施形態において、この方法は、ｄＲＮＡをコードするプラスミドを宿主細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、この方法は、ｄＲＮＡ（例えば、合成ｄＲＮＡ）を宿主細胞に（例えば、エレクトロポレーションによって）導入することを含む。一部の実施形態において、この方法は、宿主細胞へのｄＲＮＡのトランスフェクションを含む。
脱アミノ化後、標的ＲＮＡおよび/または標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の修飾は、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの位置に応じて異なる方法を使用して確定することができる。例えば、標的ＲＮＡにおいて「Ａ」が「Ｉ」に編集されているかどうかを確認するために、本分野で知られているＲＮＡ配列決定法を使用して、ＲＮＡ配列の修飾を検出することができる。標的アデノシンがｍＲＮＡのコード領域にある場合、ＲＮＡ編集によりｍＲＮＡによってコードされるアミノ酸配列が変化することができる。例えば、点突然変異をｍＲＮＡに導入することができ、または、ｍＲＮＡ中の先天のまたは後天的な点突然変異を元に戻って野生型遺伝子産物を生じることができる。これは、「Ａ」から「Ｉ」へ変換されたからである。本分野で知られている方法によるアミノ酸配列決定を使用して、コードされたタンパク質中のアミノ酸残基の変化を見つけることができる。終止コドンの修飾は、機能的、伸長、切断された、完全長および/または野生型タンパク質の存在を評価することによって決定することができる。例えば、標的アデノシンがＵＧＡ、ＵＡＧ、またはＵＡＡ終止コドンに位置する場合、標的Ａ（ＵＧＡまたはＵＡＧ）または複数のＡ（ＵＡＡ）の修飾は、リードスルー変異および/または伸長タンパク質を作製することができる。あるいは、標的ＲＮＡによってコードされる切断されたタンパク質を回復して、機能的な完全長および/または野生型タンパク質を作製することができる。標的ＲＮＡの編集はまた、標的ＲＮＡに異常なスプライシング部位および/または可変的スプライシング部位を生成することができ、したがって、伸長、切断、またはミスフォールディングされたタンパク質、または標的ＲＮＡにコードされた異常なスプライシングまたは可変的スプライシング部位の回復によって、機能的で正しくフォールディングされた完全長および/または野生型タンパク質を作製する。一部の実施形態において、本出願は、先天性および後天性の両方の遺伝的変化、例えば、ミスセンス突然変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは標的ＲＮＡによってコードされる可変的スプライシング部位の編集を考慮する。既知の方法を使用して、標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の機能を評価することで、ＲＮＡ編集が所望の効果を達成したかどうかを確認できる。アデノシン（Ａ）のイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、タンパク質をコードする変異ＲＮＡの標的位置で変異したＡを修正することができるため、イノシンへの脱アミノ化の同定は、機能性タンパク質が存在するかどうか、または変異したアデノシンの存在によって引き起こされる疾患または薬剤耐性関連ＲＮＡは、回復または部分的に回復されたかという評価を提供することができる。同様に、アデノシン（Ａ）からイノシン（Ｉ）への脱アミノ化は、得られたタンパク質に点突然変異を導入する可能性があるため、イノシンへの脱アミノ化の同定は、疾患の原因または疾患の関連因子を特定するための機能的指標を見つけることができる。
標的アデノシンの存在が異常なスプライシングを引き起こす場合、読み出しは異常なスプライシングの発生と頻度の評価であってもよい。一方、望ましいターゲットアデノシンの脱アミノ化がスプライシング部位に導入される場合、類似した方法を使用して、必要なタイプのスプライシングが起こるかどうかをチェックすることができる。当業者に周知の方法を使用して標的アデノシンの脱アミノ化後にイノシンの存在を同定するための例示的な適切な方法は、ＲＴ－ＰＣＲおよび配列決定である。
標的アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、点突然変異、早期終止コドン、異常なスプライシング部位、可変的なスプライシング部位、および得られたタンパク質のミスフォールディングが含まれる。これらの効果は、遺伝的に受け継がれているか、後天的な遺伝子変異によって引き起こされているかにかかわらず、疾患に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発するか、薬剤耐性の発生に関連するＲＮＡおよび／またはタンパク質の構造的および機能的変化を誘発することができる。したがって、疾患に関連するＲＮＡ及び／またはタンパク質の構造及び／または機能を変えることによって、ｄＲＮＡ、ｄＲＮＡをコードする構築体、および本願のＲＮＡ編集方法を、遺伝性の疾患または病症、または後天性遺伝子突然変異に関連する疾患または病症の予防または治療に使用することができる。
一部の実施形態では、標的ＲＮＡは調節ＲＮＡである。一部の実施形態において、編集される標的ＲＮＡは、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長い非コードＲＮＡまたは小さいＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ－ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ－ｍｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡまたはｓｃａＲＮＡ）である。標的アデノシンの脱アミノ化の効果には、例えば、リボソームＲＮＡ、転移ＲＮＡ、長い非コードＲＮＡまたは小さいＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ）の三次元構造及び／または機能喪失もしくは機能の獲得が含まれる。一部の実施形態において、標的ＲＮＡにおける標的Ａの脱アミノ化は、標的ＲＮＡの１つ以上の下流分子（例えば、タンパク質、ＲＮＡおよび／または代謝産物）の発現レベルを変化させる。下流分子の発現レベルの変化は、発現レベルの増加または減少であってもよい。
本出願の一部の実施形態は、宿主細胞における標的ＲＮＡのマルチプレックス編集に係り、これは、標的遺伝子の異なる変異体または宿主細胞における異なる遺伝子をスクリーニングするために使用できる。一部の実施形態では、この方法が複数のｄＲＮＡを宿主細胞に導入することを含み、前記複数のｄＲＮＡの少なくとも２つのｄＲＮＡは、異なる配列を有し、および／または異なる標的ＲＮＡを有する。一部の実施形態において、各ｄＲＮＡは、異なる配列および／または異なる標的ＲＮＡを有する。一部の実施形態では、この方法は、宿主細胞内の単一の標的ＲＮＡに複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の修飾を生成する。一部の実施形態では、この方法は、宿主細胞内の複数（例えば、少なくとも２、３、５、１０、５０、１００、１０００またはそれ以上）の標的ＲＮＡに修飾を生成する。一部の実施形態では、この方法は、複数の宿主細胞群における複数の標的ＲＮＡを編集することを含む。一部の実施形態において、各宿主細胞群は、異なるｄＲＮＡ、または他の宿主細胞群とは異なる標的ＲＮＡを有するｄＲＮＡを受ける。
デアミナーゼ動員ＲＮＡ、構築体、およびライブラリー
一態様では、本出願は、本明細書に記載の方法のいずれか１つに使用できるデアミナーゼ動員ＲＮＡを提供する。このセクションで説明されているｄＲＮＡのいずれか１つを、ここで説明されているＲＮＡ編集および治療法で使用することができる。ｄＲＮＡについて本明細書に記載されている特徴およびパラメータのいずれかを、あたかもすべての組み合わせが個別に記載されているかのように、互いに組み合わせることができることが意図されている。本明細書に記載のｄＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムで使用されるｔｒａｃｒＲＮＡ、ｃｒＲＮＡ、またはｇＲＮＡを含まない。
一部の実施形態において、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含むＡＤＡＲを動員することによって標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）が提供される。
一態様では、本発明は、本明細書に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡのいずれか１つを含む構築体を提供する。特定の実施形態において、前記構築体は、ウイルスベクター（レンチウイルスベクターなど）またはプラスミドである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＡＡＶ８などのＡＡＶである。一部の実施形態では、前記構築体は単一のｄＲＮＡをコードする。一部の実施形態では、前記構築体は、複数の（例えば、約１、２、３、４、５、１０、２０またはそれ以上の何れか一つの）ｄＲＮＡをコードする。
一態様では、本出願は、複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは本明細書に記載の複数の構築体を含むライブラリーを提供する。
一態様では、本出願は、デアミナーゼ動員ＲＮＡまたは本明細書に記載の構築体を含む組成物または宿主細胞を提供する。特定の実施形態において、前記宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。好ましくは、前記宿主細胞は哺乳動物細胞である。最も好ましくは、前記宿主細胞はヒト細胞である。
本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、ライブラリーまたは組成物のいずれか１つによる特定の実施形態では、前記相補的ＲＮＡ配列は、（標的ＲＮＡで編集される）標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシンまたはウリジンを含む。特定の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ配列は、それぞれが標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンの真向かいにある１つ以上のグアノシンをさらに含む。特定の実施形態において、標的Ａの５'に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、標的Ａの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである。一部の実施形態では、標的Ａの５'に最も近い隣接物がＣまたはＡである。一部の実施形態では、標的Ａの３’に最も近い隣接物がＧである。一部の実施形態では、標的Ａの３’に最も近い隣接物がＣである。
本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、ライブラリーまたは組成物のいずれか１つによる特定の実施形態では、標的ＲＮＡ中の標的Ａは、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフである。特定の実施形態では、前記３塩基モチーフはＵＡＧであり、ｄＲＮＡは、３塩基モチーフのＵの真向かいにあるＡ、標的Ａの真向かいにあるＣ、および３塩基モチーフのＧの真向かいにあるＣ、Ｇ、またはＵを含む。特定の実施形態では、前記３塩基モチーフは、標的ＲＮＡのＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＵを含む。
一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡ中の標的Ａの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の中心から２０、１５、１０、５、４、３、２、または１ヌクレオチド以内など、相補的ＲＮＡ配列の中心に近い。一部の実施形態では、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の５'末端から少なくとも５ヌクレオチド離れている。一部の実施形態において、シチジンミスマッチは、相補的ＲＮＡ配列の３'末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れている。
本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、ライブラリー、または組成物のいずれか１つによる特定の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０を上回るヌクレオチドのいずれか１つを含む。特定の実施形態において、前記ｄＲＮＡの長さは、約４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～１５０、または１０５～１４０ヌクレオチドのいずれか１つである。
一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、配列番号２５～４４、１４２～２０５、３４１～３４２のいずれか１つの核酸配列を含む。
本出願のｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含む。前記相補的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと完全に相補的または実質的に相補的であり、標的ＲＮＡへの相補的ＲＮＡ配列のハイブリダイゼーションを可能にする。一部の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ配列は、標的ＲＮＡと１００％の配列相補性を有する。一部の実施形態において、前記相補的ＲＮＡ配列は、（少なくとも標的ＲＮＡ中の約２０、４０、６０、８０、１００、１５０、２００、またはそれ以上のヌクレオチドの連続ストレッチ（ｓｔｒｅｔｃｈ）にわたって）少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％以上のいずれか１つの相補性を有する。一部の実施形態において、相補的ＲＮＡ配列と標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡは、１つ以上（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上）の非ワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）塩基対（すなわち、ミスマッチ）を有する。
ＡＤＡＲ、例えば、ヒトＡＤＡＲ酵素は、多くの要因に応じて、異なる特異性を有する二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）構造を編集する。重要な要素の１つは、ｄｓＲＮＡ配列を構成する２本の鎖の相補性の程度である。前記ｄＲＮＡと標的ＲＮＡの間の完全な相補性により、通常、ＡＤＡＲの触媒ドメインが無差別にアデノシンを脱アミ化する。ＡＤＡＲの特異性と効率は、ｄｓＲＮＡ領域にミスマッチを導入することで修飾できる。例えば、編集されるアデノシンの脱アミノ化の特異性および効率を高めるために、Ａ－Ｃミスマッチが好ましく推奨される。逆に、標的Ａ以外のＡ（アデノシン）位置（つまり、「非標的Ａ」）では、Ｇ－Ａミスマッチによりオフターゲット編集を減らすことができる。前記ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡのハイブリダイゼーションおよびｄｓＲＮＡの生成に実質的な相補性があれば、ｄＲＮＡとその標的ＲＮＡとの間のｄｓＲＮＡ形成には必ずしも完全な相補性は必要とされない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡ配列またはその一本鎖ＲＮＡ領域は、標的ＲＮＡとの相補性（最適なアラインメント時）が、配列の少なくとも約７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のうちのいずれか１つである。最適なアラインメントは、配列をアラインメントするための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、その非限定的な例には、Ｓｍｉｔｈ－Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ－Ｗｉｍｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ－Ｗｈｅｅｌｅｒ変換に基づくアルゴリズム（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）が含まれる。
標的アデノシンに隣接するヌクレオチドもまた、脱アミノ化の特異性および効率に影響を及ぼす。例えば、標的ＲＮＡ配列で編集される標的アデノシンの５'最近傍は、優先度Ｕ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇを有し、標的ＲＮＡ配列で編集される標的アデノシンの３'最近傍は、アデノシンの脱アミノ化の特異性と効率の観点から、優先度Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕを有する。一部の実施形態において、標的ＲＮＡ中の標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ及びＧＡＵからなる群から選択される３塩基モチーフであり得る場合、前記アデノシンの脱アミノ化の特異性と効率は、他の３塩基モチーフのアデノシンよりも高い。一部の実施形態では、編集される標的アデノシンが３塩基モチーフＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＡＡＧ、ＡＡＣまたはＡＡＡにある場合、前記アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のモチーフのアデノシンよりも高い。同じ３塩基モチーフに関して、ｄＲＮＡの異なるデザインも異なる脱アミノ化効率につながる可能性がある。３塩基モチーフＵＡＧを例として取り上げると、一部の実施形態において、ｄＲＮＡが、編集される標的アデノシンの真向かいのシチジン（Ｃ）を含む場合、前記アデノシン（Ａ）はウリジンの真向かいにあり、シチジン（Ｃ）、グアノシン（Ｇ）、またはウリジン（Ｕ）はグアノシンの真向かいにあり、標的アデノシンの脱アミノ化の効率は、他のｄＲＮＡ配列を使用した脱アミノ化の効率よりも高い。一部の実施形態では、ｄＲＮＡが標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧまたはＡＣＵを含む場合、前記標的ＲＮＡのＵＡＧにおけるＡの編集効率は、約２５％～３０％に達することができる。
標的アデノシンに加えて、標的ＲＮＡには１つ以上の編集するのが望ましくないアデノシンが存在する可能性がある。これらのアデノシンに関しては、それらの編集効率を可能な限り低下させることが好ましい。本発明により、グアノシンが標的ＲＮＡのアデノシンの真向かいにある場合、脱アミノ化効率が有意に低下することが見出された。したがって、オフターゲット脱アミノ化を減少させるために、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡで編集される標的アデノシン以外の１つ以上のアデノシンの真向かいにある１つ以上のグアノシンを含むように設計することができる。
標的ＲＮＡ配列を編集する際の特異性と効率の望ましいレベルは、さまざまなアプリケーションによって異なる。本特許出願の説明に従って、当業者は、必要に応じて標的ＲＮＡ配列に相補的または実質的に相補的な配列を有するｄＲＮＡを設計することができ、また、試行錯誤を繰り返しながら、所望の結果を取得できる。本明細書で使用されるように、「ミスマッチ」という用語は、ワトソン-クリック（Ｗａｔｓｏｎ－Ｃｒｉｃｋ）の塩基対形成規則に従って完全な塩基対を形成しない二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）中の対向するヌクレオチドを指す。ミスマッチの塩基対には、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、Ｕ－Ｕ塩基対が含まれる。Ａ－Ｃマッチを例にとると、標的Ａが標的ＲＮＡで編集される場合、ｄＲＮＡは、編集されるＡに対向するＣを含むように設計され、標的ＲＮＡとｄＲＮＡの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡにおいてＡ－Ｃミスマッチを生成する。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡは、ミスマッチを含まない。一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つ以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７またはそれ以上のミスマッチ（例えば、異なるタイプのミスマッチにおける同じタイプのミスマッチ）を含む。一部の実施形態において、ｄＲＮＡと標的ＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションによって形成されるｄｓＲＮＡは、１つ以上の種類のミスマッチ、例えば、Ｇ－Ａ、Ｃ－Ａ、Ｕ－Ｃ、Ａ－Ａ、Ｇ－Ｇ、Ｃ－Ｃ、及びＵ－Ｕからなる群から選択される１、２、３、４、５、６、７種類のミスマッチを含む。
ｄＲＮＡと標的ＲＮＡの間のハイブリダイゼーションによって形成されたｄｓＲＮＡのミスマッチヌクレオチドはバルジを形成することができ、これは標的ＲＮＡの編集の効率を促進することができる。ミスマッチによって形成される１つ以上のバルジ（標的アデノシンでのみ形成される）が存在する可能性がある。追加のバルジを誘発するミスマッチは、標的アデノシンの上流および／または下流にあり得る。前記バルジは、単一のミスマッチのバルジ（１つのミスマッチの塩基対によって引き起こされる）または複数のミスマッチのバルジ（複数の連続するミスマッチの塩基対、好ましくは２つまたは３つの連続するミスマッチの塩基対によって引き起こされる）であってもよい。
ｄＲＮＡ中の相補的ＲＮＡ配列は一本鎖である。前記ｄＲＮＡは、完全に一本鎖であるか、１つ以上（例えば、１、２、３、またはそれ以上）の二本鎖領域および／または１つ以上のステムループ領域を有し得る。一部の実施形態において、相補的ＲＮＡ配列は、少なくとも約４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００またはそれ以上のヌクレオチドのうちのいずれか１つである。特定の実施形態において、相補的ＲＮＡ配列は、４０～２６０、４５～２５０、５０～２４０、６０～２３０、６５～２２０、７０～２２０、７０～２１０、７０～２００、７０～１９０、７０～１８０、７０～１７０、７０～１６０、７０～１５０、７０～１４０、７０～１３０、７０～１２０、７０～１１０、７０～１００、７０～９０、７０～８０、７５～２００、８０～１９０、８５～１８０、９０～１７０、９５～１６０、１００～２００、１００～１５０、１００～１７５、１１０～２００、１１０～１７５、１１０～１５０、または１０５～１４０ヌクレオチドの長さを有する。一部の実施形態において、相補的ＲＮＡ配列は、約７１ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、相補的ＲＮＡ配列は、約１１１ヌクレオチド長である。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、相補的ＲＮＡ配列の他に、ｄＲＮＡを安定化するための領域、例えば、１つ以上の二本鎖領域および／またはステムループ領域をさらに含むことができる。一部の実施形態において、ｄＲＮＡの二本鎖領域またはステムループ領域は、約２００、１５０、１００、５０、４０、３０、２０、１０またはそれ以下の塩基対のうちの１つを含むことができる。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、ステムループまたは二本鎖領域を含まない。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメインを含む。一部の実施形態では、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲ動員ドメインを含まない。
ｄＲＮＡは、１つ以上の修飾を含み得る。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、核酸塩基修飾および／または骨格修飾を含む、１つ以上の修飾されたヌクレオチドを有する。ＲＮＡへの例示的な修飾には、ホスホロチオエート骨格修飾、リボース中の２'－置換（２'－Ｏ－メチルおよび２'－フルオロ置換など）、ＬＮＡ、およびＬ－ＲＮＡが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡは、核酸塩基または骨格に対する修飾を有さない。
本出願はまた、本明細書に記載のｄＲＮＡを含む構築体を考慮する。本明細書で使用される「構築体」という用語は、ＲＮＡに転写されるかまたはタンパク質に発現され得るコードヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。一部の実施形態において、前記構築体は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された１つ以上の調節エレメントを含む。前記構築体が宿主細胞に導入されると、適切な条件下で、前記構築体中のコードヌクレオチド配列が転写または発現され得る。
一部の実施形態において、前記構築体は、プロモーターがコードヌクレオチド配列の転写または発現を制御するように、コードヌクレオチド配列に作動可能に連結されているか、または空間的に連結されているプロモーターを含む。前記プロモーターは、その制御下にあるコードヌクレオチド配列の５'（上流）に位置することができる。前記プロモーターとコード配列との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターに由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離とほぼ同じであってもよい。本分野で知られているように、この距離の変動は、プロモーター機能を失うことなく適応され得る。一部の実施形態において、前記構築体は、コードヌクレオチド配列の転写または発現を調節する５'ＵＴＲおよび／または３'ＵＴＲを含む。
一部の実施形態において、前記構築体は、本出願において開示されるｄＲＮＡのいずれか１つをコードするベクターである。「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。前記ベクターには、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子；１つ以上の自由端を含み、自由端を含まない（例えば、環状）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその両方を含む核酸分子；および本分野で知られている他の種類のポリヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されない。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローニング技術などによって、追加のＤＮＡセグメントを挿入できる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞において自律複製することができる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソマル哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入後に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが作動可能に連結されているコードヌクレオチド配列の転写または発現を指導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
前記組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の転写または発現に適した形態の本発明の核酸を含むことができる。一部の実施形態において、前記組換え発現ベクターは、転写または発現される核酸配列に作動可能に連結される、転写または発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の調節エレメントを含む。前記組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で調節エレメントに連結されていることを意味することを意図する（例えば、インビトロ、またはベクターが宿主細胞に導入された場合の宿主細胞内の転写/翻訳システムにおいて）。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む構築体（例えば、ウイルスベクターなどのベクター）が提供される。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲをコードするヌクレオチド配列を含む構築体（例えば、ウイルスベクターなどのベクター）が提供される。一部の実施形態において、前記ｄＲＮＡをコードする第１のヌクレオチド配列および前記ＡＤＡＲをコードする第２のヌクレオチド配列を含む構築体が提供される。一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、同じプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、第１のヌクレオチド配列および第２のヌクレオチド配列は、異なるプロモーターに作動可能に連結されている。一部の実施形態において、前記プロモーターは誘導性である。一部の実施形態では、前記構築体は、ＡＤＡＲをコードしない。一部の実施形態において、ベクターは、ＡＤＡＲ３の阻害剤（例えば、ＡＤＡＲ３ ｓｈＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）および／またはインターフェロンのスティミュレーター（例えば、ＩＦＮ－α）をコードする核酸配列をさらに含む。一部の実施形態では、構築体は、ＡＡＶ８などのＡＡＶである。
治療方法
本明細書に記載のＲＮＡ編集方法および組成物は、遺伝性遺伝子疾患および薬剤耐性を含むがこれらに限定されない、個体の疾患または病症を治療または予防するために使用することができる。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを使用して標的ＲＮＡを編集することを含む、エクスビボで個体（例えば、ヒト個体）の細胞内の標的ＲＮＡを編集する方法が提供される。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体の細胞に導入することを含み、エクスビボで個体（例えば、ヒト個体）の細胞において標的ＲＮＡを編集する方法が提供され、ここで、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡはＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記標的ＲＮＡは、個体の疾患または病症に関連している。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病症である。一部の実施形態では、この方法は、個体から細胞を取得することをさらに含む。
一部の実施形態において、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを使用して標的ＲＮＡを編集することを含む、疾患または病症を有する個体の細胞において標的ＲＮＡまたは標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現または活性を回復する方法が提供され、ここで、標的ＲＮＡは、疾患または病症に関連するＧからＡへの突然変異を有する。一部の実施形態では、この方法は、エクスビボで個体から単離された細胞に対して実施される。一部の実施形態では、この方法はインビボで実施される。
一部の実施形態では、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを使用して個体の細胞内の疾患または病症に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体（例えば、ヒト個体）の疾患または病症を治療または予防する方法が提供される。
一部の実施形態において、エクスビボで個体の単離された細胞にｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を導入することを含む、個体（例えば、ヒト個体）における疾患または病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病症である。
一部の実施形態において、エクスビボで個体の単離された細胞にｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を導入することを含む、個体（例えば、ヒト個体）における疾患または病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡは、宿主細胞の内因的に発現されたＡＤＡＲを動員して、前記標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化することができる。一部の実施形態では、この方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を培養することをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、編集されたＲＮＡを有する細胞を個体に投与することをさらに含む。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病症である。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体（例えば、ヒト個体）における疾患または病症を治療または予防する方法が提供され、ここで、前記ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記ｄＲＮＡがＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化することができる。一部の実施形態において、前記ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態では、前記疾患または病症は、遺伝性遺伝子疾患、または１つ以上の後天性遺伝子突然変異（例えば、薬剤耐性）に関連する疾患または病症である。
本願の方法を使用した治療に適した疾患及び病症は、ＲＮＡ転写物におけるミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的なスプライシングを引き起こすＧからＡへの突然変異のような変異に関連する疾患を含む。本出願の方法によって回復され得る疾患関連突然変異の例には、癌に関連するＴＰ５３Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）、Ｉ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）に関連するＩＤＵＡＷ４０２Ｘ（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ突然変異）、エーラース・ダンロス症候群に関連するＣＯＬ３Ａ１Ｗ１２７８Ｘ（例、３８３３Ｇ＞Ａ突然変異）、原発性肺高血圧症に関連するＢＭＰＲ２Ｗ２９８Ｘ（例、８９３Ｇ＞Ａ）、ジュベール症候群に関連するＡＨＩ１Ｗ７２５Ｘ（例、２１７４Ｇ＞Ａ）症候群、ファンコニ貧血に関連するＦＡＮＣＣＷ５０６Ｘ（例、１５１７Ｇ＞Ａ）、原発性家族性肥大性心筋症に関連するＭＹＢＰＣ３Ｗ１０９８Ｘ（例、３２９３Ｇ＞Ａ）、およびＸ連鎖重症複合免疫不全症に関連するＩＬ２ＲＧＷ２３７Ｘ（例、７１０Ｇ＞Ａ）が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、疾患または病症は癌である。一部の実施形態では、疾患または病症は単一遺伝子疾患である。一部の実施形態では、疾患または病症は多遺伝子性疾患である。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体の単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連する癌を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡはＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それによって標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号１９５、１９６または１９７の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを使用して癌を治療または予防する方法が提供される。ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ（例えば、１５８Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号１９５、１９６または１９７の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体の単離された細胞に導入することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＭＰＳ Ｉ（例えば、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群またはシャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群）を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それによって、標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡＷ４０２Ｘ（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ突然変異）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０４または２０５の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを使用してＭＰＳ Ｉ（例えば、ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群またはシャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群）を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それによって標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＩＤＵＡＷ４０２Ｘ（例えば、エクソン９におけるＴＧＧ＞ＴＡＧ突然変異）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０４または２０５の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体の単離された細胞に導入することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するエーラース－ダンロス症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡが標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＣＯＬ３Ａ１Ｗ１２７８Ｘ（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ突然変異）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号１９８の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを用いてエーラース・ダンロス症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＣＯＬ３Ａ１Ｗ１２７８Ｘ（例えば、３８３３Ｇ＞Ａ突然変異）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号１９８の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性肺高血圧症を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＢＭＰＲ２Ｗ２９８Ｘ（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号１９９の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを用いて原発性肺高血圧症を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＢＭＰＲ２Ｗ２９８Ｘ（例えば、８９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号１９９の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するジュベール症候群を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＨ１１Ｗ７２５Ｘ（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２００の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを用いてジュベール症候群を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＡＨ１１Ｗ７２５Ｘ（例えば、２１７４Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２００の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するファンコニ貧血を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＦＡＮＣＣＷ５０６Ｘ（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０１の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを用いてファンコニ貧血を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＦＡＮＣＣＷ５０６Ｘ（例えば、１５１７Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０１の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連する原発性家族性肥大型心筋症を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＭＹＢＰＣ３Ｗ１０９８Ｘ（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０２の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを用いて原発性家族性肥大型心筋症を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＭＹＢＰＣ３Ｗ１０９８Ｘ（例えば、３２９３Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０２の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体をエクスビボで個体から単離された細胞に導入することを含む、個体において突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡに関連するＸ連鎖重症複合免疫不全を治療する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、そしてｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡの突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、単離された細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を単離された細胞に導入することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＩＬ２ＲＧＷ２３７Ｘ（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０３の核酸配列を含む。
一部の実施形態において、有効量のｄＲＮＡまたはｄＲＮＡをコードする構築体を個体に投与することを含む、個体に突然変異（例えば、Ｇ＞Ａ突然変異）を有する標的ＲＮＡを用いてＸ連鎖重症複合免疫不全を治療または予防する方法が提供され、ここで、ｄＲＮＡは、疾患または病症に関連する標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して標的ＲＮＡ中の標的Ａを脱アミノ化し、それにより、標的ＲＮＡ中の突然変異を救うことができる。一部の実施形態において、ＡＤＡＲは、個体の細胞において内因的に発現されるＡＤＡＲである。一部の実施形態では、この方法は、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体を個体に投与することを含む。一部の実施形態において、標的ＲＮＡは、ＩＬ２ＲＧＷ２３７Ｘ（例えば、７１０Ｇ＞Ａ）である。一部の実施形態において、ｄＲＮＡは、配列番号２０３の核酸配列を含む。
本明細書で使用されるように、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」または「治療（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」は、臨床結果を含む有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益なまたは所望の臨床結果には、疾患に起因するもう１つの症状の減少、疾患の程度の減少、疾患の安定化（例えば、疾患の悪化の予防または疾患の悪化の遅延）、疾患の広がり（例えば、転移）の予防または遅延、疾患の発生または再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または緩慢、病状の改善、疾患の寛解の提供（部分的であろうと全体的であろうと）、病気を治療するために必要な１つ以上の他の薬剤の用量の減少、疾患の進行の遅延、生活の質の向上および/または生存期間の延長からなる群より選ばれる１つ以上が含まれるが、これらに限定されない。「治療」には、疾患または病症の病理学的結果の軽減も含まれる。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つ以上を考慮している。
「個体」、「被験者」および「患者」という用語は、本明細書では、ヒトを含む哺乳動物を説明するために置き換えて使用されるができる。個体には、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類動物、または霊長類動物が含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、前記個体はヒトである。一部の実施形態では、前記個体は、薬剤耐性などの疾患または病症を有する。一部の実施形態では、前記個体は治療を必要としている。
本分野で理解されるように、「有効量」とは、所望の治療結果（例えば、疾患または病症の１つ以上の症状の重症度の低減または期間の短縮、疾患または病症の１つ以上の症状の重症度の安定化、または疾患または病症の１つ以上の症状の排除）を生み出すのに十分な組成物（例えば、ｄＲＮＡまたはこのｄＲＮＡをコードする構築体）の量を指す。治療的使用の場合、有益なまたは所望の結果には、例えば、疾患の発症中に現れるその合併症および中間の病理学的表現型を含む、疾患に起因する１つ以上の症状（生化学的、組織学的および/または行動学的）の減少が含まれ、これは、そのような疾患または病症を有する人の生活の質の向上、疾患を治療するために必要な他の薬剤の投与量の低減、別の薬剤の効果の増強、疾患の進行の遅延、及び/または患者の生存の延長を含む。
一般に、組成物（例えば、ｄＲＮＡまたはこのｄＲＮＡをコードする構築体）の投与量、スケジュール、および投与経路は、個体のサイズおよび状態に従って、そして標準的な製薬実践に従って決定されることができる。例示的な投与経路には、静脈内、動脈内、腹腔内、肺内、小胞内、筋肉内、気管内、皮下、眼内、髄腔内、または経皮が含まれる。
本出願のＲＮＡ編集方法は、動物細胞、例えば哺乳動物細胞で使用できるだけでなく、植物または真菌のＲＮＡ、例えば、内因的にＡＤＡＲを発現する植物または真菌のＲＮＡの修飾にも使用することができる。本明細書に記載の方法は、改善された特性を有する遺伝子操作された植物および真菌を生成するために使用することができる。
組成物、キットおよび製品
本明細書はさらに、ｄＲＮＡ、構築体、ライブラリー、または本明細書に記載のように編集されたＲＮＡを有するまたは宿主細胞のいずれか１つを含む組成物（医薬組成物など）を提供する。
一部の実施形態では、本明細書に記載のｄＲＮＡまたは該ｄＲＮＡをコードする構築体のいずれか１つ、および薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤を含む医薬組成物が提供される。例示的な薬学的に許容される担体、賦形剤および安定剤は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ第１６版、Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０）に記載されている。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投与量および濃度でレシピエントに対して毒性がなく、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド;ヘキサメトニウムクロリド;ベンザルコニウムクロリド、ベンゼトニウムクロリド;フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール;ｐ－ヒドロキシ安息香酸メチルまたはｐ－ヒドロキシ安息香酸プロピルなどのｐ－ヒドロキシ安息香酸アルキル;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;３－ペンタノール;およびｍ３－クレゾールなど）;低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性重合体；グリシン、グルタミン、アスパラギン酸、ヒスチジン、アルギニンまたはリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、およびグルコース、マンノース、またはデキストリンを含む他の炭水化物;ＥＤＴＡなどのキレート剤;ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖;ナトリウムなどの塩形成対イオン;金属錯体（例：Ｚｎ－タンパク質錯体）;および／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤を含む。一部の実施形態では、凍結乾燥製剤が提供される。インビボ投与に使用される医薬組成物は、無菌でなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜による濾過によって容易に達成され得る。本明細書に記載のｄＲＮＡ、構築体、組成物、ライブラリー、または編集された宿主細胞のいずれか１つを含む、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法または治療方法のいずれか１つに使用できるキットまたは製品がさらに提供される。
一部の実施形態において、ｄＲＮＡを含む、宿主細胞内の標的ＲＮＡを編集するためのキットが提供され、ここで、前記ｄＲＮＡは、標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、ここで、前記ｄＲＮＡは、ＡＤＡＲを動員して、標的ＲＮＡ中のＡを脱アミノ化させることができる。一部の実施形態では、前記キットは、ＡＤＡＲまたはＡＤＡＲをコードする構築体をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、ＡＤＡＲ３の阻害剤またはその構築体をさらに含む。一部の実施形態において、キットは、インターフェロンのスティミュレーターまたはその構築体をさらに含む。一部の実施形態では、前記キットは、本明細書に記載のＲＮＡ編集方法のいずれか１つを実行するための説明書をさらに含む。
本出願のキットは、適切な包装に入っている。適切な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、軟包装（例えば、密封されたポリエステルフィルムまたはビニール袋）などが含まれるが、これらに限定されない。キットは、トランスフェクションまたは形質導入試薬、細胞培養培地、緩衝液、および解釈情報などの追加コンポーネントを選択可能に提供する場合がある。
したがって、本出願はまた、製品を提供する。前記製品は、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたはプロトコルを含むことができる。適切な容器には、バイアル（密封されたバイアルなど）、ボトル、ジャー、軟包装などが含まれる。一部の実施形態では、前記容器は医薬組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有してもよい（例えば、前記容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであってもよい）。医薬組成物を収容する容器は、再構成された製剤の反復投与（例えば、２～６回の投与）を可能にする複数回使用可能なバイアルであってもよい。プロトコルとは、治療用製品の市販パッケージに通常含まれている説明書を指し、そのような製品の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、禁忌、および/または警告などの情報が含まれている。また、前記製品は、注射用静菌性水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液およびデキストロース溶液などの薬学的に許容される緩衝液を含む第２の容器をさらに含んでもよい。それは、他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、および注射器を含む、商業的およびユーザーの観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
前記キットまたは製品は、薬局（例えば、病院薬局および調剤薬局）での保管および使用に十分な量で包装された、複数の単位用量の医薬組成物のおよび使用説明書を含んでもよい。
例示的な実施形態
本明細書に提供された実施形態は下記通りである。
１．デアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）または前記ｄＲＮＡをコードする構築体を宿主細胞に導入することを含む、宿主細胞において標的ＲＮＡを編集するための方法であって、前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するようにＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することができる、方法。
２．前記ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはウリジンを含む、実施形態１に記載の方法。
３．前記ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む、実施形態２に記載の方法。
４．前記シチジンミスマッチが、前記ｄＲＮＡにおいて前記相補配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、前記相補配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置する、実施形態３に記載の方法。
５．前記シチジンミスマッチが、前記ｄＲＮＡにおいて前記相補配列の中心（例えば、中心にある）から１０ヌクレオチド以内に位置する、実施形態４に記載の方法。
６．前記ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態１～５のいずれか一項に記載の方法。
７．前記相補配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態１～６のいずれか一項に記載の方法。
８．前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの５’に最も近い隣接物が、Ｕ、Ｃ、Ａ、及びＧから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＵ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇであり、前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンの３’に最も近い隣接物が、Ｇ、Ｃ、Ａ、及びＵから選ばれるヌクレオチドであり、優先度がＧ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである、実施形態１～７のいずれか一項に記載の方法。
９．前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する、実施形態１～８のいずれか一項に記載の方法。
１０．前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが、前記３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、実施形態９に記載の方法。
１１．前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが約４０～２６０ヌクレオチド長である、実施形態１～１０のいずれか一項に記載の方法。
１２．前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが約６０～２３０ヌクレオチド長である、実施形態１１に記載の方法。
１３．前記ｄＲＮＡが約７０ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態１１または１２に記載の方法。
１４．前記ｄＲＮＡが約１００から約１５０（例えば、約１１０～１５０）ヌクレオチド長である、実施形態１１～１３のいずれか一項に記載の方法。
１５．前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、及び小さいＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、実施形態１～１４のいずれか一項に記載の方法。
１６．前記標的ＲＮＡがプレメッセンジャーＲＮＡである、実施形態１５に記載の方法。
１７．前記ＡＤＡＲが前記宿主細胞によって内因的に発現される、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１８．前記ＡＤＡＲが前記宿主細胞対して外因的である、実施形態１～１６のいずれか一項に記載の方法。
１９．前記ＡＤＡＲを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１８に記載の方法。
２０．前記ＡＤＡＲがＥ１００８突然変異を含む、実施形態１８または１９に記載の方法。
２１．前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが一本鎖ＲＮＡである、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２２．前記相補的ＲＮＡ配列が一本鎖であり、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが１つ以上の二本鎖領域をさらに含む、実施形態１～２０のいずれか一項に記載の方法。
２３．前記ｄＲＮＡがＡＤＡＲ－動員ドメイン（例えば、ＤＳＢ結合ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメインまたはＭＳ２ドメイン）を含まない、実施形態１～２２のいずれか一項に記載の方法。
２４．前記ｄＲＮＡが、化学的に修飾されたヌクレオチド（例えば、２'－Ｏ－メチル修飾またはホスホロチオエート修飾）を含まない、実施形態１～２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記ｄＲＮＡをコードする、ウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）またはプラスミドである構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、実施形態２４に記載の方法。
２６．標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシング、または可変的スプライシング、若しくは前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復を引き起こす、実施形態１～２５のいずれか一項に記載の方法。
２７．前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの脱アミノ化作用が、前記標的ＲＮＡによってコードされるタンパク質の点突然変異、切断、伸長および／またはミスフォールディングを引き起こすか、または、前記標的ＲＮＡ中のミスセンス変異、早期終止コドン、異常なスプライシングまたは可変的スプライシングの回復によって、機能的で、完全長の、正しくフォールディングされた、及び／または野生型タンパク質を引き起こす、実施形態２６に記載の方法。
２８．前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態１～２７のいずれか一項に記載の方法。
２９．前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、実施形態２８に記載の方法。
３０．前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、実施形態２９に記載の方法。
３１．前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１および／またはＡＤＡＲ２である、実施形態２９または３０に記載の方法。
３２．前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態１～３１のいずれか一項に記載の方法。
３３．前記宿主細胞がＴ細胞である、実施形態３２に記載の方法。
３４．前記宿主細胞が有糸分裂後の細胞である、実施形態３２に記載の方法。
３５．ＡＤＡＲ３の阻害剤を前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～３４のいずれか一項に記載の方法。
３６．インターフェロンのスティミュレーターを前記宿主細胞に導入することをさらに含む、実施形態１～３５のいずれか一項に記載の方法。
３７．それぞれ異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡを導入することを含む、実施形態１～３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．前記標的ＲＮＡを編集する効率が少なくとも約５％（例えば、少なくとも約１０％、２０％、または３０％）である、実施形態１～３７のいずれか一項に記載の方法。
３９．前記ｄＲＮＡが免疫応答を誘導しない、実施形態１～３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．実施形態１～３９のいずれか一項に記載の方法によって生成された編集されたＲＮＡまたは編集されたＲＮＡを有する宿主細胞。
４１．実施形態１～３９のいずれか一項に記載の方法に従って、個体の細胞内の疾患または病症に関連する標的ＲＮＡを編集することを含む、個体の疾患または病症を治療または予防するための方法。
４２．前記疾患または病症が、遺伝性遺伝子疾患または１つ以上の後天性遺伝子突然変異に関連する疾患または病症である、実施形態４１に記載の方法。
４３．前記標的ＲＮＡがＧからＡへの突然変異を有する、実施形態４１または４２に記載の方法。
４４．前記疾患または病症が単一遺伝子の疾患または病症である、実施形態４１～４３のいずれか一項に記載の方法。
４５．前記疾患または病症が多遺伝子の疾患または病症である、実施形態４１～４４のいずれか一項に記載の方法。
４６．（ｉ）前記標的ＲＮＡがＴＰ５３であり、前記疾患または病症が癌である；
（ｉｉ）前記標的ＲＮＡがＩＤＵＡであり、前記疾患または病症がＩ型ムコ多糖症（ＭＰＳ Ｉ）である；
（ｉｉｉ）前記標的ＲＮＡがＣＯＬ３Ａ１であり、前記疾患または病症がエーラース・ダンロス症候群である；
（ｉｖ）前記標的ＲＮＡがＢＭＰＲ２であり、前記疾患または病症がジュベール症候群である；
（ｖ）前記標的ＲＮＡがＦＡＮＣＣであり、前記疾患または病症がファンコニ貧血である；
（ｖｉ）前記標的ＲＮＡがＭＹＢＰＣ３であり、前記疾患または病症が原発性家族性肥大型心筋症である；または
（ｖｉｉ）前記標的ＲＮＡがＩＬ２ＲＧであり、前記疾患または病症がＸ連鎖重症複合免疫不全である、
実施形態４１～４５のいずれか一項に記載の方法。
４７．標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含む、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）を動員することによって前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するためのデアミナーゼ動員ＲＮＡ（ｄＲＮＡ）。
４８．前記ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジン、アデノシン、またはＵを含む、実施形態４７に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ。
４９．前記ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の前記標的アデノシンの真向かいにあるシチジンミスマッチを含む、実施形態４８に記載のｄＲＮＡ。
５０．前記シチジンミスマッチが、前記ｄＲＮＡにおいて前記相補配列の３’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、前記相補配列の５’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置する、実施形態４９に記載のｄＲＮＡ。
５１．前記シチジンミスマッチが、前記ｄＲＮＡにおいて前記相補配列の中心（例えば、中心にある）から１０ヌクレオチド以内に位置する、実施形態５０に記載のｄＲＮＡ。
５２．前記ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む、実施形態４７～５１のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ。
５３．前記相補配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、実施形態４７～５１のいずれか一項に記載のｄＲＮＡ。
５４．前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する、実施形態４７～５３のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ。
５５．前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、前記ｄＲＮＡが、前記３塩基モチーフのウリジンの真向かいのアデノシン、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシン、またはウリジンを含む、実施形態５４に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ。
５６．前記３塩基モチーフが、前記標的ＲＮＡ中のＵＡＧであり、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが、前記標的ＲＮＡのＵＡＧに対向するＡＣＣ、ＡＣＧ、またはＡＣＵを含む、実施形態５５に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ。
５７．前記デアミナーゼ動員ＲＮＡが約４０～２６０ヌクレオチド長である、実施形態４７～５６のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ。
５８．前記ｄＲＮＡが約７０ヌクレオチドを超える長さを有する、実施形態５７に記載のｄＲＮＡ。
５９．前記ｄＲＮＡが約１００から約１５０（例えば、約１１０～１５０）ヌクレオチド長である、実施形態５７または５８に記載のｄＲＮＡ。
６０．前記ｄＲＮＡがＡＤＡＲ動員ドメイン（例えば、ＤＳＢ結合ドメイン、ＧｌｕＲ２ドメインまたはＭＳ２ドメイン）を含まない、実施形態４７～５９のいずれか一項に記載のｄＲＮＡ。
６１．前記ｄＲＮＡが、化学的に修飾されたヌクレオチド（例えば、２'－Ｏ－メチル修飾またはホスホロチオエート修飾）を含まない、実施形態４７～６０のいずれか一項に記載のｄＲＮＡ。
６２．実施形態４７～６１のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡをコードする構築体。
６３．前記構築体がウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）またはプラスミドである、実施形態６２に記載の構築体。
６４．実施形態４７～６１のいずれか一項に記載の複数のデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは実施形態６２または６３に記載の構築体を含むライブラリー。
６５．実施形態４７～６１のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡ、実施形態６２または６３に記載の構築体、または実施形態６４に記載のライブラリーを含む、組成物。
６６．実施形態４７～６１のいずれか一項に記載のデアミナーゼ動員ＲＮＡまたは実施形態６２または６３に記載の構築体を含む、宿主細胞。
６７．前記宿主細胞が真核細胞である、実施形態６６に記載の宿主細胞。
６８．前記宿主細胞が初代細胞である、実施形態６６または６７に記載の宿主細胞。
６９．デアミナーゼ動員ＲＮＡを含む、宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するためのキットであって、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡは、前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列を含み、前記デアミナーゼ動員ＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するようにＡＤＡＲを動員することができる、キット。
以下の実施例は、本出願の例示的なもののみであるため、いかなる方法でも本発明を限定すると見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、限定としてではなく、例示として提供されている。
材料及び方法
プラスミドの構築
二重蛍光レポーターは、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの第１のコドンＡＴＧが削除された）をコードするＤＮＡをＰＣＲにより増幅することによってクローン化され、３×ＧＳリンカーおよびターゲティングＤＮＡ配列がＰＣＲ中にプライマーを介して追加された。次に、ＰＣＲ産物をタイプＩＩの制限酵素ＢｓｍＢ１（Ｔｈｅｒｍｏ）とＴ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）で切断して連結し、ｐＬｅｎｔｉバックボーン（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＳＶ－Ｂｓｄ、Ｓｔａｎｌｅｙ Ｃｏｈｅｎ Ｌａｂ， Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）に挿入した。
ｄＬｂｕＣａｓ１３ ＤＮＡは、Ｌｂｕプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８３４８５）からＰＣＲにより増幅された。ＡＤＡＲ１ＤＤとＡＤＡＲ２ＤＤは、厦門大学の漢の研究室からのＡｄａｒ１（ｐ１５０）ｃＤＮＡとＡｄａｒ２ ｃＤＮＡから増幅された。ＡＤＡＲ１ＤＤまたはＡＤＡＲ２ＤＤをオーバーラップＰＣＲによってｄＬｂｕＣａｓ１３ＤＮＡに融合し、融合したＰＣＲ産物をｐＬｅｎｔｉバックボーンに挿入した。
哺乳動物細胞でのｄＲＮＡの発現のために、ｄＲＮＡ配列（短いｄＲＮＡの場合）を直接に合成し、オーバーラップｓｓＤＮＡを合成することによってアニーリングするか、またはＰＣＲ増幅し、Ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅクローニングによりＵ６発現下で対応するベクターにクローニングした。
完全長Ａｄａｒ１（ｐ１１０）およびＡｄａｒ１（ｐ１５０）はＡｄａｒ１（ｐ１５０）ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅され、完全長Ａｄａｒ２はＡｄａｒ２ ｃＤＮＡからＰＣＲにより増幅され、それぞれｐＬｅｎｔｉバックボーンにクローニングされた。
二重蛍光レポーターの３つのバージョン（レポーター－１、－２、および－３）について、ｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ（ＥＧＦＰの開始コドンＡＴＧが削除された）コード配列をＰＣＲにより増幅し、ＢｓｍＢＩ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＲ０４５２）を使用して消化し、続いて、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ、Ｍ０２０２Ｌ）を介したＧＧＧＧＳリンカーとのライゲーションが行われた。そして、ライゲーション産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯ主鎖に挿入した。
ｄＬｂｕＣａｓ１３－ＡＤＡＲＤＤ（Ｅ１００８Ｑ）を発現する構築体の場合、ＡＤＡＲ１ＤＤ遺伝子はＡＤＡＲ１ｐ１５０構築体（厦門大学のＪｉａｈｕａｉ Ｈａｎ研究室からの贈り物）から増幅された。ｄＬｂｕＣａｓ１３遺伝子は、Ｌｂｕ＿Ｃ２ｃ２＿Ｒ４７２Ａ＿Ｈ４７７Ａ＿Ｒ１０４８Ａ＿Ｈ１０５３Ａプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８３４８５）からＰＣＲによって増幅された。ＡＤＡＲ１ＤＤ（高活性Ｅ１００８Ｑ変異体）はオーバーラップＰＣＲによって生成され、ｄＬｂｕＣａｓ１３に融合された。ライゲーション産物はｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＢＳＤ主鎖に挿入された。
ａｒＲＮＡを発現する構築体の場合、ａｒＲＮＡの配列を合成し、ゴールデンゲート（ｇｏｌｄｅｎ－ｇａｔｅ）をｐＬｅｎｔｉ－ｓｇＲＮＡ－ｌｉｂ ２．０（Ａｄｄｇｅｎｅ＃８９６３８）主鎖にクローニングし、ａｒＲＮＡの転写をｈＵ６プロモーターによって駆動した。ＡＤＡＲを発現する構築体の場合、完全長ＡＤＡＲ１ｐ１１０およびＡＤＡＲ１ｐ１５０はＡＤＡＲ１ｐ１５０構築体から増幅され、完全長ＡＤＡＲ２はＡＤＡＲ２構築体（厦門大学のＪｉａｈｕａｉ Ｈａｎ研究室からの贈り物）から増幅された。次に、増幅された産物をｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＢＳＤ主鎖にクローニングした。病原性変異を有する遺伝子を発現する構築体については、ＴＰ５３の全長コード配列（Ｖｉｇｅｎｅｂｉｏから注文）および他の６つの疾患関連遺伝子（ＣＯＬ３Ａ１、ＢＭＰＲ２、ＡＨＩ１、ＦＡＮＣＣ、ＭＹＢＰＣ３およびＩＬ２ＲＧ、中国医学科学院病原体生物学研究所のＪｉａｎｗｅｉ Ｗａｎｇの研究室からの贈り物）は、Ｇ＞Ａ突然変異が導入された対応する遺伝子をコードする構築体から、誘発ＰＣＲにより増幅された。増幅産物は、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）クローニング法（非特許文献５９）によりｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ｍＣｈｅｒｒｙ主鎖にクローニングされた。
哺乳類の細胞株と細胞培養
哺乳類細胞株は、ダルベッコ改良イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ，１０－０１３－ＣＶ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ，ＭＡ，ＵＳＡ））で培養し、１０％ウシ胎児血清（蘭州百霊生物技術有限公司、蘭州、中国）を添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。前記Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞株はＥｄｉＧｅｎｅ Ｃｈｉｎａから購入し、ジェノタイピングの結果もＥｄｉＧｅｎｅ Ｃｈｉｎａから提供された。
ＨｅＬａおよびＢ１６細胞株は、Ｚ．Ｊｉａｎｇの研究室（北京大学）からのものであった。また、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞株は、Ｃ．Ｚｈａｎｇの研究室（北京大学）からのものであった。ＲＤ細胞株は、Ｊ Ｗａｎｇの研究室（北京協和医学院および中国医学科学院の病原体生物学研究所）からのものであった。ＳＦ２６８細胞株は、中国医学科学院、基礎医学研究所、セルセンターから入手した。Ａ５４９およびＳＷ１３細胞株は、ＥｄｉＧｅｎｅ Ｉｎｃ．から入手した。ＨｅｐＧ２、ＨＴ２９、ＮＩＨ３Ｔ３、およびＭＥＦ細胞株は、北京大学の我らの研究室で維持されていた。これらの哺乳動物細胞株は、１０％ウシ胎児血清（ＣｅｌｌＭａｘ、ＳＡ２０１．０２）を含むダルベッコ改良イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）で培養し、さらに１％ペニシリン-ストレプトマイシンを５％ＣＯ２下で３７℃で補充した。特に明記されていない限り、細胞はＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ、０６３６６５４６００１）で製造元の説明に従ってトランスフェクトされた。
ヒト初代肺線維芽細胞（＃３３００）およびヒト初代気管支上皮細胞（＃３２１０）は、ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．から購入し、線維芽細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、＃２３０１）および気管支上皮細胞培地（ＳｃｉｅｎＣｅｌｌ、＃３２１１）でそれぞれ培養した。両方の培地にそれぞれ１５％ウシ胎児血清（ＢＩ）と１％ペニシリン-ストレプトマイシンを添加した。初代ＧＭ０６２１４およびＧＭ０１３２３細胞は、Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈに注文し、１５％ウシ胎児血清（ＢＩ）および１％ペニシリン-ストレプトマイシンを含むダルベッコ改良イーグル培地（Ｃｏｒｎｉｎｇ、１０－０１３－ＣＶ）で培養した。すべての細胞は３７℃で５％ＣＯ２下で培養された。
レポーターシステムのトランスフェクション、ＦＡＣＳ解析およびサンガー（Ｓａｎｇｅｒ）シーケンシング
二重蛍光レポーター編集実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞または２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞を６ウェルプレートに播種し（６×１０５細胞／ウェル）、２４時間後、１．５μｇのレポータープラスミドと１．５μｇのｄＲＮＡプラスミドを播種した。Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１；Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を、サプライヤーのプロトコルに従って使用して同時トランスフェクトした。４８～７２時間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳ解析を実行した。レポーターｍＲＮＡ編集をさらに確認するために、ＦＡＣＳ Ａｒｉａフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、レポーターおよびｄＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした２９３Ｔ－ＷＴ細胞からのＥＧＦＰ陽性細胞を選別し、続いてトータルＲＮＡを単離した（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４３０）。次に、ＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）を介してｃＤＮＡに逆転写し、標的遺伝子座を対応するプライマーペア（２３ＰＣＲサイクル）でＰＣＲ増幅し、ＰＣＲ産物を精製してサンガーシーケンシングに供した。
Ａｄａｒ１（ｐ１１０）、Ａｄａｒ１（ｐ１５０）、またはＡｄａｒ２のレスキューおよび過剰発現実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞または２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－ＫＯ細胞を１２ウェルプレート（２．５×１０５細胞／ウェル）に播種し、２４時間後、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して、０．５μｇのレポータープラスミド、０．５μｇのｄＲＮＡプラスミドおよび０．５μｇのＡｄａｒ１／２プラスミド（ｐＬｅｎｔｉバックボーンを対照として）を同時トランスフェクトした。４８～７２時間後、細胞を収集し、ＦＡＣＳ解析を実行した。
内因性ｍＲＮＡ実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０５細胞／ウェル）。約７０％コンフルエントになったときに、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（０６３６６５４６００１、Ｒｏｃｈｅ、Ｍａｎｎｈｅｉｍ、ドイツ）を使用して３μｇのｄＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした。７２時間後、次のＲＮＡ分離のために、ＦＡＣＳを介して細胞を収集し、ＧＦＰ陽性またはＢＦＰ陽性細胞（対応する蛍光マーカーによる）を選別した。
ヒト初代Ｔ細胞の分離と培養
初代ヒトＴ細胞は、健康なヒトドナーからの白血球アフェレーシス産物から単離された。簡単に説明すると、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をＦｉｃｏｌｌ遠心分離（Ｄａｋｅｗｅｉ、ＡＳ１１１４５４６）で分離し、ＥａｓｙＳｅｐ人Ｔ細胞分離キット（ＳＴＥＭＣＥＬＬ、１７９５１）を使用してＴ細胞をＰＢＭＣから磁気ネガティブセレクションで分離した。分離後、Ｔ細胞をＸ－ｖｉｖｏ１５培地、１０％ＦＢＳおよびＩＬ２（１０００ Ｕ／ｍｌ）で培養し、ＣＤ３／ＣＤ２８ ＤｙｎａＢｅａｄｓ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、１１１３１Ｄ）で２日間刺激した。健康なドナーからの白血球アフェレーシス製品は、ＡｌｌＣｅｌｌｓ ＬＬＣ Ｃｈｉｎａから購入した。すべての健康なドナーはインフォームドコンセントを提供した。
レンチウイルスパッケージとレポーター細胞株の構築
発現プラスミドは、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬を介して、２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＲ８．７４およびｐＶＳＶＧ（Ａｄｄｇｅｎｅ）とともにＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ細胞に同時トランスフェクトされた。７２時間後、上清ウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ－ＷＴ細胞をレンチウイルスに感染させ、７２時間後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別して培養し、限界希釈法により、ＥＧＦＰバックグラウンドが非常に低い二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。
安定したレポーター細胞株の場合、レポーター構築体（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＰＵＲＯバックボーン）を、２つのウイルスパッケージングプラスミドｐＲ８．７４およびｐＶＳＶＧとともにＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。７２時間後、上清ウイルスを回収し、－８０℃で保存した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をレンチウイルスに感染させた後、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞をＦＡＣＳで選別して培養し、検出可能なＥＧＦＰバックグラウンドのない二重蛍光レポーターシステムを安定して発現する単一クローン細胞株を選択した。ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－およびＴＰ５３－／－細胞株は、以前に報告された方法（非特許文献６０）に従って生成された。ＡＤＡＲ１を標的とするｓｇＲＮＡとＣＭＶ駆動のピューロマイシン耐性遺伝子を含むＰＣＲ増幅ドナーＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトした。次に、トランスフェクションの７日後に細胞をピューロマイシンで処理した。ピューロマイシン耐性細胞から単一クローンを単離した後、シーケンシングとウエスタンブロットによる検証を行った。
内因性または外因性で発現した転写産物のＲＮＡ編集
二重蛍光レポーターでのＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞またはＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞を６ウェルプレート（６×１０５細胞／ウェル）に播種した。２４時間後、細胞に１．５μｇのレポータープラスミドと１．５μｇのａｒＲＮＡプラスミドを同時トランスフェクトした。ＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、またはＡＤＡＲ２タンパク質発現の影響を調べるために、編集効率をＥＧＦＰ陽性率とディープシーケンシングによってアッセイした。
ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞を１２ウェルプレートに播種した（２．５×１０５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞に０．５μｇのレポータープラスミド、０．５μｇのａｒＲＮＡプラスミドおよび０．５μｇのＡＤＡＲ１／２プラスミド（対照としてのｐＬｅｎｔｉバックボーン）を同時トランスフェクトした。編集効率は、ＥＧＦＰ陽性率とディープシーケンシングによって測定された。
内因性ｍＲＮＡ転写産物のＲＮＡ編集を評価するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０５細胞／ウェル）。２４時間後、細胞に３μｇのａｒＲＮＡプラスミドをトランスフェクトした。編集効率は、ディープシーケンシングによって解析された。
複数の細胞株でのＲＮＡ編集効率を評価するために、８～９×１０４（ＲＤ、ＳＦ２６８、ＨｅＬａ）または１．５×１０５（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞を１２ウェルプレートに播種した。ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＳＷ１３、ＮＩＨ３Ｔ３、ＭＥＦ、Ｂ１６などのトランスフェクションが困難な細胞の場合、２～２．５×１０５個の細胞を６ウェルプレートに播種した。２４時間後、レポーターとａｒＲＮＡプラスミドをこれらの細胞に同時トランスフェクトした。編集効率は、ＥＧＦＰ陽性率によって測定された。
ＥＧＦＰ陽性率を評価するために、トランスフェクションの４８～７２時間後に、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）解析によって細胞を選別して収集した。ｍＣｈｅｒｒｙシグナルは、レポーター／ａｒＲＮＡ発現細胞の蛍光選択マーカーとして機能し、ＥＧＦＰ＋／ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞のパーセンテージは編集効率の読み取り値として計算された。
ＡからＩへの編集率のＮＧＳ定量化のために、トランスフェクションの４８～７２時間後に、細胞をＦＡＣＳアッセイによって選別および収集してＲＮＡ単離（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４２０）をした。次に、ＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）を介して全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、次の表に記載されている対応するプライマーを使用して、標的遺伝子座をＰＣＲ増幅した。
Figure 0007252328000001
Figure 0007252328000002
Figure 0007252328000003
Figure 0007252328000004
Figure 0007252328000005
Figure 0007252328000006
Figure 0007252328000007
Figure 0007252328000008
Figure 0007252328000009
ＰＣＲ産物は、精製されてサンガーシーケンシングまたはＮＧＳ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎ）に供した。
ディープシーケンシング
内因性ｍＲＮＡ編集実験では、２９３Ｔ－ＷＴ細胞を６ウェルプレートに播種した（６×１０５細胞／ウェル）。約７０％コンフルエントになったら、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用してＨＥＫ２９３細胞に３μｇのｄＲＮＡをトランスフェクトした。７２時間後、ＦＡＣＳを介してＧＦＰ陽性またはＢＦＰ陽性細胞を（対応する蛍光マーカーに従って）選別し、続いてＲＮＡを単離した。次に、単離されたＲＮＡをＲＴ－ＰＣＲを介してｃＤＮＡに逆転写し、対応するプライマーペアで特異的標的遺伝子座を増幅し（２３ＰＣＲサイクル）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＮｅｘｔＳｅｑでシーケンシングした。
複数の細胞株でのテスト
ＨＥＫ２９３Ｔ（陽性対照）およびＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－（陰性対照）細胞に加えて、１つのマウス細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３）およびさまざまな組織や器官に由来する７つのヒト細胞株（ＲＤ、ＨｅＬａ、ＳＦ２６８、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ－２９、ＳＷ１３）を選択して実験を行った。トランスフェクション効率の高い細胞株では、約８～９×１０４細胞（ＲＤ、ＨｅＬａ、ＳＦ２６８）または１．５×１０５（ＨＥＫ２９３Ｔ）を１２ウェルプレートの各ウェルに播種し、トランスフェクションが困難なもの（Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＨＴ－２９、ＳＷ１３、ＮＩＨ３Ｔ３）について、２～２．５ｘ１０５細胞を６ウェルプレートに播種した。そして、これらの細胞はすべて、３７℃でダルベッコ改良イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）で維持され、この培地には、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ、ＣｅｌｌＭａｘ）及び５％ＣＯ２が補充された。２４時間後、ＣＧ２レポーターと７１ｎｔ ｄＲＮＡ（３５－Ｃ－３５）プラスミドをＸ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）で異なるタイプの細胞に同時トランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、細胞をトリプシンで処理し、ＦＡＣＳ（ＢＤ）で解析した。トランスフェクション効率の低い細胞ではｍＣｈｅｒｒｙおよびＢＦＰ陽性細胞が非常に少なかったため、６ウェルプレートに播種した細胞は、ＦＡＣＳ解析のために、総細胞数を１×１０５に増やした。
標的部位のＲＮＡ編集解析
ディープシーケンシング解析では、ａｒＲＮＡカバー配列の標的部位配列（上流および下流２０－ｎｔ）を使用してインデックスが生成された。読み取りは、ＢＷＡバージョン０．７.１０－ｒ７８９を使用してアライメントおよび定量化された。次に、ＢＡＭをＳａｍｔｏｏｌｓアライメントで選別し、ＲＥＤｉｔｏｏｌｓ １．０.４バージョンを使用してＲＮＡ編集部位を解析した。パラメータは、－Ｕ［ＡＧまたはＴＣ］－ｔ８－ｎ０．０－Ｔ６－６－ｅ－ｄ－ｕであった。フィッシャーの直接確率検定（Ｆｉｓｈｅｒ’ｓ ｅｘａｃｔ ｔｅｓｔ）（ｐ値＜０．０５）によって計算されたａｒＲＮＡ標的領域内のすべての有意なＡ＞Ｇ変換（ｐ値＜０．０５）は、ａｒＲＮＡによる編集と見なされた。標的アデノシン以外の変換は、オフターゲット編集であった。対照群と実験群に同時に現れた突然変異はＳＮＰと見なされた。
トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシング解析
ＢＦＰ発現カセットを有する対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ発現プラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後にＦＡＣＳによってＢＦＰ＋細胞が濃縮され、ＲＮＡはＲＮＡｐｒｅｐ Ｐｕｒｅ Ｍｉｃｒｏキット（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４２０）で精製された。次に、ＮＥＢＮｅｘｔ ポリ（Ａ）ｍＲＮＡ磁性分離モジュール（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｅ７４９０）を使用してｍＲＮＡを精製し、ＩｌｌｕｍｉｎａのＮＥＢＮｅｘｔ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＲＮＡライブラリープレプキット（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｅ７７７０）で処理した後、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑ Ｘ Ｔｅｎプラットフォーム（２×１５０－ｂｐペアエンド;各サンプル３０Ｇ）を使用してディープシーケンス解析を行った。トランスフェクションによる非特異的影響を排除するために、トランスフェクション試薬でのみ細胞を処理した模擬グループを含めた。各グループには４つの複製が含まれていた。
バイオインフォマティクス解析パイプラインは、Ｖｏｇｅｌら（非特許文献２２）が参照された。解析の品質管理はＦａｓｔＱＣを使用して行われ、品質トリムはＣｕｔａｄａｐｔに基づいた（各読み取りの最初の６－ｂｐがトリムされ、最大２０－ｂｐが品質トリムされた）。ＡＷＫスクリプトを使用して、導入されたａｒＲＮＡをフィルタリングした。トリミング後、９０－ｎｔ未満の長さのリードはフィルタリングされた。続いて、フィルタリングされたリードは、ＳＴＡＲソフトウェア（非特許文献６１）によってリファレンスゲノム（ＧＲＣｈ３８－ｈｇ３８）にマッピングされた。ＧＡＴＫ Ｈａｐｌｏｔｙｐｃａｌｌｅｒ（非特許文献６２）を使用してバリアントを徴用（call）した。ＧＡＴＫによって生成された原始ＶＣＦファイルは、ＧＡＴＫ ＶａｒｉａｎｔＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ、ｂｃｆｔｏｏｌｓ、およびＡＮＮＯＶＡＲ（非特許文献６３）によってフィルタリングされ、注釈が付けられた。ｄｂＳＮＰ、１０００ Ｇｅｎｏｍｅ（非特許文献６４）のバリアントからＥＶＳはろ過された。次に、各グループの４つの複製の共有バリアントがＲＮＡ編集部位として選択された。模擬グループのＲＮＡ編集レベルをバックグラウンドとして表示し、模擬グループのバリアントを差し引くことにより、対照ＲＮＡ１５１およびａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢの全体標的を取得した。
ＬＥＡＰＥＲが自然な編集ホメオスタシスを混乱させるかどうかを評価するために、模擬グループとａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢグループ（または対照ＲＮＡ１５１グループ）が共有するグローバル編集部位を解析した。ネイティブのＡからＩへの編集部位でのＲＮＡ編集率の差は、ピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関係数解析で評価された。模擬グループとａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢグループ（または対照ＲＮＡ１５１グループ）の間の編集率のピアソン相関を計算し、図６に注釈を付けた。
Figure 0007252328000010
Ｘは、模擬グループの各部位の編集率を表し、Ｙは、対照ＲＮＡ１５１グループ（図６Ａ）またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢグループ（図６Ｂ）の各部位の編集率を表す。σｘはＸの標準偏差であり、σｙはＹの標準偏差であり、μｘはＸの平均であり、μｙはＹの平均であり、Eは期待値である。
ＲＮＡ－Ｓｅｑデータは、ＲＮＡ編集イベントによって誘発される可能性のある転写変化の調査のために解析された。トランスクリプトーム全体の遺伝子発現の解析は、ＨＩＳＡＴ２およびＳＴＲＩＮＧＴＩＥソフトウェアを使用して実行された（非特許文献６５）。シーケンスデータの品質管理には、ＣｕｔａｄａｐｔとＦａｓｔＱＣを使用した。次に、ＨＩＳＡＴ２を使用してシーケンスリードをリファレンスゲノム（ＧＲＣｈ３８－ｈｇ３８）にマッピングし、前述のようにピアソン（Ｐｅａｒｓｏｎ）の相関係数解析を行った。
ウエスタンブロット
ＡＤＡＲ１（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－２７１８５４）、ＡＤＡＲ２（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－３９０９９５）、ＡＤＡＲ３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－７３４１０）、Ｐ５３（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－９９）、ＫＲＡＳ（Ｓｉｇｍａ、ＳＡＢ１４０４０１１）； ＧＡＰＤＨ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ｓｃ－４７７２４）およびβ-チューブリン（ＣＷＢｉｏｔｅｃｈ、ＣＷ００９８）に対するマウスモノクローナル一次抗体をそれぞれ使用した。ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ、１１５－０３５－００３）二次抗体は、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈから購入した。２×１０６個の細胞を選別して溶解し、等量の各溶解物をＳＤＳ－ＰＡＧＥ用にロードした。次に、サンプルタンパク質をＰＶＤＦメンブレン（Ｂｉｏ－Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に転写し、ＡＤＡＲ酵素の１つに対する一次抗体（抗ＡＤＡＲ１、１：５００、抗ＡＤＡＲ２、１：１００、抗ＡＤＡＲ３、１：８００）でイムノブロットした。続いて、二次抗体のインキュベーション（１：１０，０００）および曝露を行った。ＡＤＡＲタンパク質を剥離緩衝液（ＣＷＢｉｏｔｅｃｈ、ＣＷ００５６）で剥離した後、β-チューブリンを同じＰＶＤＦメンブレンで再プローブした。実験は３回繰り返された。半定量解析は、Ｉｍａｇｅ Ｌａｂソフトウェアを使用して行われた。
サイトカイン発現アッセイ
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１２ウェルプレートに播種した（２×１０５細胞／ウェル）。約７０％がコンフルエンシーになったら、細胞に１．５μｇのａｒＲＮＡをトランスフェクトした。陽性対照として、１μｇのポリ（Ｉ：Ｃ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ｔｌｒｌ－ｐｉｃｗ）をトランスフェクトした。４８時間後、細胞を回収し、ＲＮＡ分離（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＤＰ４３０）を行った。次に、ＲＴ－ＰＣＲ（ＴＩＡＮＧＥＮ、ＫＲ１０３－０４）を介して全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、定量ＰＣＲ（ＴＡＫＡＲＡ、ＲＲ８２０Ａ）によりＩＦＮ－βとＩＬ－６の発現を測定した。プライマーの配列は上の表に記載されている。
ｐ５３の転写調節活性アッセイ
ＴＰ５３Ｗ５３Ｘ ｃＤＮＡ発現プラスミドとａｒＲＮＡ発現プラスミドを、ｐ５３の転写調節活性を検出するために、ｐ５３-ホタルルシフェラーゼシス報告プラスミド（ＹＲＧｅｎｅ、ＶＸＳ０４４６）およびレニラルシフェラーゼプラスミド（北京大学Ｚ．Ｊｉａｎｇ研究室からの贈り物）とともにＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞に同時トランスフェクトした。４８時間後、細胞を回収し、製造元のプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａ Ｄｕａｌ－Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｅ４０３０）でアッセイした。簡単に説明すると、１５０μＬのデュアルグロルシフェラーゼ試薬を採取した細胞ペレットに添加し、３０分後、１００μＬのデュアルグロルシフェラーゼ試薬（細胞溶解）をＩｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００リーダー（ＴＥＣＡＮ）で９６ウェルホワイトプレートに添加してホタルの発光を測定した。３０分後、１００μＬのデュアルグロストップとグロ試薬を各ウェルに順次添加して、レニラ発光を測定し、ホタル発光とレニラ発光の比率を計算した。
初代細胞でのエレクトロポレーション
ヒト初代肺線維芽細胞またはヒト初代気管支上皮細胞におけるａｒＲＮＡ発現プラスミドのエレクトロポレーションでは、２０μｇのプラスミドをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） ２ｂ装置（Ｌｏｎｚａ）およびＢａｓｉｃ Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）キット（Ｌｏｎｚａ、ＶＰＩ－１００２）でエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションプログラムはＵ－０２３であった。ヒト初代Ｔ細胞におけるａｒＲＮＡ発現プラスミドのエレクトロポレーションでは、２０μｇのプラスミドをＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） ２ｂ Ｄｅｖｉｃｅ（Ｌｏｎｚａ）およびＨｕｍａｎ Ｔ細胞Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標） Ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ、ＶＰＡ－１００２）を使用してヒト初代Ｔにエレクトロポレーションし、エレクトロポレーションプログラムはＴ－０２４であった。エレクトロポレーションの４８時間後、細胞をＦＡＣＳアッセイで選別および収集し、標的ＲＮＡ編集アッセイのために以下のディープシーケンシングを行った。エレクトロポレーション効率は、蛍光マーカーに従って正規化された。
ヒト初代Ｔ細胞または初代ＧＭ０６２１４細胞における化学合成ａｒＲＮＡまたは対照ＲＮＡエレクトロポレーションでは、ＲＮＡオリゴを最終濃度２μＭの１００μＬоｐｔｉ－ＭＥＭ培地（Ｇｂｉｃｏ、３１９８５０７０）に溶解した。次に、１×１０Ｅ６ ＧＭ０６２１４細胞または３×１０Ｅ６ Ｔ細胞を上記のエレクトロポレーション混合物で再懸濁し、４５０Ｖで１ｍｓの間Ａｇｉｌｅ Ｐｕｌｓｅ Ｉｎ Ｖｉｖｏデバイス（ＢＴＸ）でエレクトロポレーションした。そして、以下のアッセイのために、細胞を温かい培地に移した。
α－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）触媒活性アッセイ
採取した細胞ペレットを再懸濁し、氷上で１×ＰＢＳ緩衝液中の０．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００ ２８μＬで３０分間溶解した。次に、２５μＬの細胞溶解液を２５μＬの１９０μＭ ４－メチルウンベリフェリル－α－Ｌ－イデュロニダーゼ基質（Ｃａｙｍａｎ、２Ａ－１９５４３－５００）に添加し、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００を含む０．４Ｍギ酸ナトリウム緩衝液に溶解し、ｐＨ ３．５、暗所で３７℃で９０分間インキュベートした。触媒反応は、２００μＬの０．５Ｍ ＮａＯＨ／グリシン緩衝液、ｐＨ１０．３を添加してクエンチし、４℃で２分間遠心分離した。上清を９６ウェルプレートに移し、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ Ｍ２００リーダー（ＴＥＣＡＮ）を使用して３６５ｎｍの励起波長と４５０ｎｍの発光波長で蛍光を測定した。
実施例１
レポーターに基づいた本発明のＲＮＡ編集法の試験
Ｃａｓ１３ファミリータンパク質（Ｃ２ｃ２）が哺乳類細胞のＲＮＡを編集できることが報告されている。さらに、このシステムをさまざまな条件下でテストした。まず、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰ遺伝子の間に終止コドンを含む３×ＧＳリンカーターゲティング配列を導入することにより、ｍＣｈｅｒｒｙとＥＧＦＰの蛍光に基づく二重蛍光レポーターシステムを構築した。また、ＥＧＦＰ翻訳の漏れを減らすために、ＥＧＦＰの開始コドンＡＴＧを削除した。
二重蛍光レポーター－１は、ｍＣｈｅｒｒｙの配列（配列番号１）、３×ＧＳリンカーおよび標的Ａを含む配列（配列番号２）、およびｅＧＦＰの配列（配列番号３）を含む。
ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAACATGGCCATCATCAAGGAGTTCATGCGCTTCAAGGTGCACATGGAGGGCTCCGTGAACGGCCACGAGTTCGAGATCGAGGGCGAGGGCGAGGGCCGCCCCTACGAGGGCACCCAGACCGCCAAGCTGAAGGTGACCAAGGGTGGCCCCCTGCCCTTCGCCTGGGACATCCTGTCCCCTCAGTTCATGTACGGCTCCAAGGCCTACGTGAAGCACCCCGCCGACATCCCCGACTACTTGAAGCTGTCCTTCCCCGAGGGCTTCAAGTGGGAGCGCGTGATGAACTTCGAGGACGGCGGCGTGGTGACCGTGACCCAGGACTCCTCCCTGCAGGACGGCGAGTTCATCTACAAGGTGAAGCTGCGCGGCACCAACTTCCCCTCCGACGGCCCCGTAATGCAGAAGAAGACCATGGGCTGGGAGGCCTCCTCCGAGCGGATGTACCCCGAGGACGGCGCCCTGAAGGGCGAGATCAAGCAGAGGCTGAAGCTGAAGGACGGCGGCCACTACGACGCTGAGGTCAAGACCACCTACAAGGCCAAGAAGCCCGTGCAGCTGCCCGGCGCCTACAACGTCAACATCAAGTTGGACATCACCTCCCACAACGAGGACTACACCATCGTGGAACAGTACGAACGCGCCGAGGGCCGCCACTCCACCGGCGGCATGGACGAGCTGTACAAG （ｍＣｈｅｒｒｙの配列）（配列番号１）
Figure 0007252328000011
GTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA （ｅＧＦＰの配列）（配列番号３）
二重蛍光レポーター－２は、ｍＣｈｅｒｒｙの配列（配列番号１）、３×ＧＳリンカー（斜体及び太字で示されている）及び標的Ａ（大きい太字Ａで示されている）を含む配列（配列番号４）、及びｅＧＦＰの配列（配列番号３）を含む。
Figure 0007252328000012
二重蛍光レポーター－３は、ｍＣｈｅｒｒｙの配列（配列番号１）、１×ＧＳリンカー（斜体及び太字で示されている）及び標的Ａを含む配列（配列番号５）、及びｅＧＦＰの配列（配列番号３）を含む。
Figure 0007252328000013
ｍＣｈｅｒｒｙ－３ｘＧＳリンカー－ＴＡＧ－ＥＧＦＰをｐＬｅｎｔｉ－バックボーンにクローニングし、レポータープラスミドをレンチウイルスにパックした。レンチウイルスは２９３Ｔ細胞に感染し、二重蛍光レポーターを発現する安定した細胞株を構築した。次に、レポーターシステムとしてＥＧＦＰ蛍光バックグラウンドが低い単一のクローンを選択した。最適なｃｒＲＮＡ設計をテストするために、ターゲティングアデノシンをわたって２８～７８ヌクレオチド長のスペーサーを使用してＬｂｕｃＣ２ｃ２ ｃｒＲＮＡガイドを並べた。より長いｃｒＲＮＡガイドがより高いＥＧＦＰ陽性効率を与えることを発見した。驚くべきことに、ｄＣ２ｃ２－ＡＤＡＲＤＤを発現するプラスミドを同時トランスフェクションせずにターゲットｃｒＲＮＡプラスミドをトランスフェクトすると、ＥＧＦＰタンパク質が実質的に発現された。たとえば、次の配列を含むｃｒＲＮＡガイド：GGACCACCCCAAAAAUGAAUAUAACCAAAACUGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGCAUCGCGAGCAGGCGCUGCCUCCUCCGCC（配列番号６）には、２５％を超えるＥＧＦＰ陽性効率が与えられた。これは、終止コドンＵＡＧのアデニンが大幅に編集されていることを示している。対照的に、ランダムｃｒＲＮＡはＥＧＦＰ陰性細胞を陽性にすることができなかった（図６Ａ、６Ｂおよび６Ｃ）。これらの結果に基づいて、単一のＲＮＡ転写産物の過剰発現のみでは内因性ＡＤＡＲ酵素を利用してＲＮＡを編集できると推測した。
また、ＲＮＡガイドのスキャフォールドＲＮＡ配列を削除し、リニアガイドＲＮＡを作製した。７０ヌクレオチド長の、ＡＣミスマッチを有するターゲティングＲＮＡに相補的なＲＮＡ（AAACCGAGGGAUCAUAGGGGACUGAAUCCACCAUUCUUCUCCCAAUCCCUGCAACUCCUUCUUCCCCUGC）（配列番号７）が、ＥＧＦＰ陰性細胞を効果的にＥＧＦＰ陽性細胞に転化させることができるが、７０－ｎｔのランダムＲＮＡ（UGAACAGCUCCUCGCCCUUGCUCACUGGCAGAGCCCUCCAGCAUCGCGAGCAGGCGCUGCCUCCUCCGCC）（配列番号８）がそうすることができないことを発見した（図１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、及び１Ｄ）。したがって、このＲＮＡをｄＲＮＡ（デアミナーゼ動員ＲＮＡ）と指定した。細胞内因性ＡＤＡＲを動員してｄＲＮＡによるアデニン脱アミノ化を実施できることを確認するために、Ａｄａｒ１ ｐ１１０およびＡｄａｒ１ ｐ１５０ダブルノックアウト２９３Ｔ細胞株で実験を行った（図６Ｅ及び６Ｆ）。Ａｄａｒ１は遍在的に発現しているのに対し、Ａｄａｒ２は主に脳で高レベルに発現しているためである。そこで、ｄＲＮＡによるアデニン脱アミノ化のターゲティングは主にＡｄａｒ１によって媒介され、Ａｄａｒ２によっては媒介されていないことを提案した。予想通り、ターゲティングｄＲＮＡは２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－／－細胞でＥＧＦＰ発現をトリガーできなかったが、外因性Ａｄａｒ１ ｐ１１０、ｐ１５０、またはＡｄａｒ２のいずれかを過剰発現させると、２９３Ｔ－Ａｄａｒ１－／－細胞でＥＧＦＰ発現をレスキューすることができた（図１Ｅ及び１Ｆ）。２９３Ｔ細胞では、ｄＲＮＡがＡｄａｒ１またはＡｄａｒ２を動員して、標的ＲＮＡのアデニン脱アミノ化を媒介できることを示唆している。さらに、Ａｄａｒ１－ｐ１１０およびＡｄａｒ１－ｐ１５０の異なる細胞局在化のためかもしれないが、Ａｄａｒ１－ｐ１１０およびＡｄａｒ２は、Ａｄａｒ１－ｐ１５０よりも高い編集活性を有することが見出された（図１Ｇおよび図６Ｇ）。
ＥＧＦＰ蛍光の回復がターゲティングＲＮＡ編集イベントによるものであると確認するために、ＲＴ－ＰＣＲを通して、ｄＲＮＡを介したレポーター２転写産物の編集を直接測定し、そして、ターゲティングサンガーシーケンシングおよび次世代シーケンシングをした。シーケンシングの結果は、標的アデニン（Ａ－Ｃミスマッチ部位）におけるＡからＧへの塩基変換を示し、編集率は１３％に達する可能性があることを示した（図６Ｈおよび図１Ｈ）。さらに、標的アデニンの近くのシーケンスウィンドウでＡからＧへの編集がわずかに観察されたが、これはおそらく二本鎖ＲＮＡ領域の増加が原因であり、後でいくつかのストラテジーで予期しない編集を取り除こうとした。
実施例２
ｄＲＮＡを設計するための要因の最適化
次に、ｄＲＮＡを最適化して、より高い編集効率を実現することに着手した。まず、標的アデニンの反対側のサイトのどの塩基が編集により有利であるかを決定することを目的とした。以前の研究では、標的アデノシンの反対側の塩基が編集に効率的に影響することが示されていた。したがって、標的Ａの反対側の中央位置にミスマッチＮ（Ａ、Ｕ、Ｃ、及びＧ）を持つ７１ｎｔ ｄＲＮＡを設計した。ＦＡＣＳの結果に基づいて、４つの異なるｄＲＮＡが次のように効率的に編集されることがわかった：Ｃ＞Ａ＞Ｕ＞Ｇ（図２Ａ及び２Ｂ）。最近、標的ＵＡＧサイトの小さなバブルが編集効率に役立つ可能性があることが報告された。したがって、仮説をテストするために、標的ＵＡＧ部位を持つ２つまたは３つのミスマッチ塩基を含むｄＲＮＡを設計した。ゴールデンゲート（Ｇｏｌｄｅｎ Ｇａｔｅ）クローニング法を使用して、ＢＦＰマーカーを含むｄＲＮＡベクター上に１６種類の異なる７１ ｎｔｄＲＮＡを設計および構築した。ＣＣＡおよびＧＣＡ配列を持つｄＲＮＡが最も効率が高いことがわかった。これは、少なくともＵＡＧ標的部位の場合、小さなバブルがＡ－Ｉ編集にほとんど寄与しないことを意味する。さらに、ＮＣＡ配列の４つのｄＲＮＡはＧＦＰ陽性細胞の割合が高く、相補的なＵ－Ａ塩基対がＡＤＡＲ編集に重要である可能性があるという結論に至る（図２Ｃおよび２Ｄ）。続いて、レポーターに基づいてさまざまな長さのｄＲＮＡの効率をテストした。ｄＲＮＡは、３１ｎｔから２２１ｎｔの範囲の異なる長さで、中央の位置にミスマッチＣが設計された。ｄＲＮＡが長いほど編集効率が上がることがわかった。レポーターシステムの編集のピークは１７１ｎｔ ｄＲＮＡにある。５１ ｎｔ ｄＲＮＡは、レポーターシステムを良好な効率（１８％）で活性化させることができる（図２Ｅ及び２Ｆ）。最後に、ｄＲＮＡのミスマッチＣの位置が編集効率に影響を与えるかどうかを調べた。ｄＲＮＡは同じ７１ｎｔの長さに保たれ、転写開始とは異なる位置にミスマッチＣが設計された。ＦＡＣＳの結果に基づいて、反対側のミスマッチＣの位置が編集効率に影響を与える可能性があり、ｄＲＮＡの５’または３’にあるミスマッチＣの効率が低いことがわかった（図２Ｇおよび２Ｈ）。可能な３つの塩基モチーフすべてを含む標的配列を含む１６の異なるレポーターが、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）クローニングによって構築され、ｐＬｅｎｔｉバックボーン（ｐＬｅｎｔｉ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＳＶ－Ｂｓｄ，Ｓｔａｎｌｅｙ Ｃｏｈｅｎ Ｌａｂ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）にクローニングされた。前記標的配列を以下に示す。
可能な３塩基モチーフすべてを含む標的配列：
TAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号9)
TAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号10)
TAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号11)
TAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCTAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号12)
AAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号13)
AAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号14)
AAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号15)
AAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCAAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号16)
CAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号17)
CAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号18)
CAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号19)
CAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCCAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号20)
GAT:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGATAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号21)
GAA:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGAAAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号22)
GAC:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGACAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号23)
GAG:
ATGGACGAGCTGTACAAGCTGCAGGGCGGAGGAGGCAGCGCCTGCTCGCGATGCGAGAGGGCTCTGCCAGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATC (配列番号24)
ｄＲＮＡは同じ１１１ｂｐの長さに保たれ、標的Ａに向かって中央にミスマッチＣを設計した。
１２ウェル細胞培養クラスターでは、２×１０５細胞ＨＥＫ２９３Ｔを各ウェルにプレーティングし、各実験を３回繰り返して実施した。２４時間後、Ｘ－ｔｒｅｍｅＧＥＮＥ ＨＰ ＤＮＡトランスフェクション試薬（Ｒｏｃｈｅ）を使用して、０．５μｇのｄＲＮＡプラスミドと０．５μｇのレポーターターゲットプラスミドを細胞に同時トランスフェクトした。４８時間後、細胞をトリプシン処理し、ＦＡＣＳ（ＢＤ）を介してｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を選択した。合計４×１０５個の細胞を回収し、ＲＮＡｐｒｅｐ純細胞／バクテリアキット（ＴＩＡＮＧＥＮ ＤＰ４３０）を使用してトータルＲＮＡを抽出した。Ｑｕａｎｔｓｃｒｉｐｔ ＲＴ Ｋｉｔ（ＴＩＡＮＧＥＮ ＫＲ１０３－０４）を使用して、２μｇのトータルＲＮＡからｃＤＮＡを合成した。そして、１１１の標的領域がＰＣＲによって増幅され、ディープシーケンシングを行った。
１６の異なる３塩基モチーフすべてが、可変効率ではあるが、本出願の例示的なＲＮＡ編集方法によって編集できることを見出した。要約すると、結果は、編集されるＡの５’最近傍が優先度Ｕ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇを持ち、編集されるＡの３’最近傍が優先度Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕを持っていることを示している。データは図３Ａに棒グラフ、図３Ｂにヒートマップとして示された。
実施例３
内因性遺伝子から転写されたＲＮＡの編集
次に、ｄＲＮＡが内因性遺伝子から転写されたｍＲＮＡを媒介できるかどうかをテストした。ＫＲＡＳ、ＰＰＩＢ、β-アクチン、及びＧＡＰＤＨの４つの遺伝子を標的としたｄＲＮＡを設計した。ＫＲＡＳ ｍＲＮＡについては、以下に示す配列を有する、９１、１１１、１３１、１５１、１７１、および１９１ヌクレオチド長のｄＲＮＡ（図４Ａ）を設計した。
91-nt KRAS-dRNA
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (配列番号25)
111-nt KRAS-dRNA
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号26)
131-nt KRAS-dRNA
UCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACUACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCU (配列番号27)
151-nt KRAS-dRNA
AUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCGC (配列番号28)
171-nt KRAS-dRNA
CUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCGCCGCCGCCUUC (配列番号29)
191-nt KRAS-dRNA
UAGGAAUCCUCUAUUGUUGGAUCAUAUUCGUCCACAAAAUGAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCUACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGUUUAUAUUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGCCGCUGAGCCUCUGGCCCCGCCGCCGCCUUCAGUGCCUGCG (配列番号30)
次世代シーケンシングの結果、ｄＲＮＡが最大１１．７％の編集効率で標的ＫＲＡＳ ｍＲＮＡを編集できることを示した（図４Ｂ）。内因性ＰＰＩＢ ｍＲＮＡの場合、標的となる３つの部位：部位１、部位２、および部位３がある。以下に示す配列で、各部位に対して１５１ヌクレオチド長のｄＲＮＡを設計した（図４Ｃ）。
151-nt PPIB-dRNA (部位1)
GAGGCGCAGCAUCCACAGGCGGAGGCGAAAGCAGCCCGGACAGCUGAGGCCGGAAGAGGGUGGGGCCGCGGUGGCCAGGGAGCCGGCGCCGCCACGCGCGGGUGGGGGGGACUGGGGUUGCUCGCGGGCUCCGGGCGGGCGGCGGGCGCCG (配列番号31)
151-nt PPIB-dRNA (部位2)
UCCUGUAGCUAAGGCCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCCACAUCUUCAUCUCCAAUUCGUAGGUCAAAAUACACCUUGACGGUGACUUUGGGCCCCUUCUUCUUCUCAUCGGCC (配列番号32)
151-nt PPIB-dRNA (部位3)
GCCCUGGAUCAUGAAGUCCUUGAUUACACGAUGGAAUUUGCUGUUUUUGUAGCCAAAUCCUUUCUCUCCUGUAGCCAAGGCCACAAAAUUAUCCACUGUUUUUGGAACAGUCUUUCCGAAGAGACCAAAGAUCACCCGGCCUACAUCUUCA (配列番号33)
次世代シーケンシングの結果、ｄＲＮＡが最大１４％の編集効率でＰＰＩＢ ｍＲＮＡ部位１を効果的に編集できることを示した（図４Ｄ）。ＰＰＩＢ ｍＲＮＡ部位２および部位３の場合、編集効率は１．５％及び０．６％である（図４Ｅ及び４Ｆ）。内因性β-アクチンｍＲＮＡについて、以下に示す配列で、各部位に対して２つの標的部位及び設計されたｄＲＮＡを選択した（図４Ｇ）。
72-nt β-アクチン-dRNA (部位1)
GCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAGAAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGCCUAGAAGCAUUUGCGGUG (配列番号34)
131-nt β-アクチン-dRNA (部位1)
GCCAUGCCAAUCUCAUCUUGUUUUCUGCGCAAGUUAGGUUUUGUCAAGAAAGGGUGUAACGCAACCAAGUCAUAGUCCGCCUAGAAGCAUUUGCGGUGGACGAUGGAGGGGCCGGACUCGUCAUACUCCUG (配列番号35)
70-nt β-アクチン-dRNA (部位2)
GGACUUCCUGUAACAACGCAUCUCAUAUUUGGAAUGACCAUUAAAAAAACAACAAUGUGCAAUCAAAGUC (配列番号36)
ｄＲＮＡが部位１と部位２の両方でβ-アクチンｍＲＮＡを編集でき、各部位で最大１．４％の編集効率が得られることを発見した（図４Ｈおよび図８Ａ）。また、ｄＲＮＡが長いほど編集効率が高く、ｄＲＮＡ－７１ｎｔで０．６％、ｄＲＮＡ－１３１ｎｔで１．４％であることが観察された（図３Ｈ）。別のハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨには、71nt dRNA(CAAGGUGCGGCUCCGGCCCCUCCCCUCUUCAAGGGGUCCACAUGGCAACUGUGAGGAGGGGAGAUUCAGUG(配列番号37))を使用し、編集効率が０．３％であり、ｄＲＮＡの長さが短いからかもしれない（図８Ｂ）。
実施例４
例示的なＬＥＡＰＥＲメソッドのオフターゲット解析
治療用途では、編集の精度が極めて重要である。次に、本出願の例示的なＲＮＡ編集システムの特異性をキャラクタリゼーションすることを試みた。解析のために内因性ＰＰＩＢ部位１とＫＲＡＳ部位を選択した。ＰＰＩＢ部位１の場合、ｄＲＮＡでカバーされた領域の間に、Ａ２２、Ａ３０、Ａ３３、Ａ３４、Ａ３９、Ａ４９、Ａ８０、Ａ９１、Ａ１０７、Ａ１４０など、標的Ａ７６に隣接するいくつかのＡ塩基があることが見えた。隣接するＡ塩基がほとんど編集されていないが、標的のＡ７６塩基（Ａ－Ｃミスマッチ）が最大１４％の編集効率を示したことが明らかになった（図５Ａ及び５Ｂ）。
ＫＲＡＳ部位に関しては、ｄＲＮＡでカバーされた領域で、標的Ａ５６塩基に隣接する多くのアデニンがあり、最大２９の隣接するＡ塩基があることが見えた。ＫＲＡＳ ｍＲＮＡ編集の結果から、標的Ａ５６塩基（Ａ－Ｃミスマッチ）が最大１１．７％の編集効率を示したが、隣接するアデニンを編集できることがわかった（図５Ｃおよび５Ｄ）。複数のオフターゲットアデニンが編集されたが、Ａ４１、Ａ４３、Ａ４５、Ａ４６、Ａ７４、Ａ７９などのアデニンはより多くの編集を示した。編集されていないＡ塩基の５’最近傍はＧまたはＣであるのに対し、効率的に編集されたアデニンの５’最近傍はＴまたはＡであることがわかった。この観察に基づいて、編集されやすいそれらのアデニンのオフターゲット編集を最小限に抑えるようにｄＲＮＡの設計に着手した。私たちの研究では、ＡＤＡＲが、Ａ－ＣとＡ－Ａ、Ａ－Ｕミスマッチが好ましく、Ａ－Ｇミスマッチが最も好ましくないことが分かった。したがって、５’最近傍がＵまたはＡであるオフターゲットＡ塩基の場合、Ａ－Ｇミスマッチがオフターゲット効果を低減または減少させる可能性があることを提案した。以前の研究では、Ａ－ＧミスマッチがＡＤＡＲによる脱アミノ化の編集をブロックする可能性があることが報告されていた。
次に、図５Ｄの統計結果及び既存知識に基づいて、異なるＡ－Ｇミスマッチの組み合わせを含む３種類の９１ｎｔ ｄＲＮＡ変異体および４種類の１１１ｎｔ ｄＲＮＡ変異体（以下に示す配列を有する）を設計した：dRNA-AG1(A41，A46，A74); dRNA-AG2(A41，A43，A45，A46，A74，A79); dRNA-AG3(A31，A32，A33，A41，A43，A45，A46，A47，A74，A79); dRNA-AG4(A7，A31，A32，A33，A40，A41，A43，A45，A46，A47，A74，A79，A95)（図４Ｅ）。
KRAS-dRNA-91-AG2
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (配列番号38)
KRAS-dRNA-91-AG3
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (配列番号39)
KRAS-dRNA-91-AG4
UAGCUGGAUCGUCAAGGCACUCGUGCCGACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGGGGAGAGGCAGUCAGGGUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC (配列番号40)
KRAS-dRNA-111-AG1
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号41)
KRAS-dRNA-111-AG2
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUggAgAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号42)
KRAS-dRNA-111-AG3
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC (配列番号43)
KRAS-dRNA-111-AG4
GCUCCCCGGUGCGGGAGAGAGGCCUGCUGACCCUGACUGCCUCUCCCCUUGUGGUGGUUGGAGCUGGUGGCGUCGGCACGAGUGCCUUGACGAUCCAGCUAAUUCAGAAUC (配列番号44)
次に、これらのｄＲＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトし、空のベクターと７１－ｎｔの非標的ｄＲＮＡ対照：（TCTCAGTCCAATGTATGGTCCGAGCACAAGCTCTAATCAAAGTCCGCGGGTGTAGACCGGTTGCCATAGGA（配列番号45））を陰性対照として使用した。９１－ｎｔ ｄＲＮＡの場合、ディープシーケンシングの結果は、Ａ－ＧミスマッチのないｄＲＮＡ－９１のオンターゲット編集（Ａ５６）効率７．９％と比較して、オンターゲット（оｎ－ｔａｒｇｅｔ）編集（Ａ５６）がｄＲＮＡ－９１－ＡＧ２で２．８％、ｄＲＮＡ－９１－ＡＧ３で２．３％、ｄＲＮＡ－９１－ＡＧ４で０．７％に減少したことを示している（図４Ｆ）。９１－ｎｔ ｄＲＮＡの場合、オンターゲット編集（Ａ５６）は、Ａ－ＧミスマッチのないｄＲＮＡ－１１１のオンターゲット編集（Ａ５６）効率１５．１％と比較して、ｄＲＮＡ－１１１－ＡＧ２では５．１％、ｄＲＮＡ－１１１－ＡＧ３では４．９％に減少した（図４Ｆ）。これは、より長いｄＲＮＡがより多くのＡ－Ｇミスマッチを有する可能性があることを示している。次に、詳細なオフターゲット解析のために１１１－ｎｔ ｄＲＮＡを選択した。Ａ７およびＡ７９以外に、隣接するＡ塩基編集は、有意に解消された（図４Ｇ）。Ａ７塩基の場合、オフターゲット効果は、現在のｄＲＮＡ設計にはない、この部位でのＡ－Ｇミスマッチ設計によって防ぐことができる。Ａ７９塩基の場合、隣接する２つのＡ－ＧミスマッチＡ７８／Ａ７９を導入すると、オフターゲット効果を解消するのに役立つ場合がある。そのような結果に基づいて、遺伝病を治療するために本出願のＲＮＡ編集システムを適用することは非常に有望である。
実施例５
複数の細胞株で例示的なＬＥＡＰＥＲメソッドをテストすること
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での結果から、線形ｄＲＮＡとその標的ＲＮＡによって形成された二本鎖ＲＮＡは、Ａ－Ｉ編集のために内因性ＡＤＡＲタンパク質を動員できると考えられた。この仮説を確認するために、ＲＮＡ編集法をテストするためにさらに多くの細胞株を選択した。結果を図９に示す。複数の細胞株でのこれらの結果は、ＲＮＡ編集法の普遍性を証明した。まず、複数の編集効率にもかかわらず、ｄＲＮＡを使用して内因性ＡＤＡＲを動員することは、（７つの異なる組織および器官に由来する）複数のヒト細胞株に適した。さらに、この方法はヒト細胞だけでなくマウス細胞でも機能し、マウスで実験を行う可能性を提供する。
実施例６
ＲＮＡ編集のための内因性ＡＤＡＲの活用
効率的なＲＮＡ編集プラットフォームを探索するために、高活性Ｅ１００８Ｑ変異体ＡＤＡＲ１（ＡＤＡＲ１ＤＤ）（非特許文献４０）のデアミナーゼドメインを、ＲＮＡ誘導ＲＮＡターゲティングＣＲＩＳＰＲエフェクター（非特許文献４１）である触媒不活性ＬｂｕＣａｓ１３（ｄＣａｓ１３ａ）に融合した（図１０Ａ）。ＲＮＡ編集効率を評価するために、３×ＧＧＧＧＳコード領域とインフレームＵＡＧ終止コドンを含む配列によってリンクされたｍＣｈｅｒｒｙおよびＥＧＦＰ遺伝子を含む代替レポーターを構築した（レポーター－１、図１０Ｂ）。レポーターをトランスフェクトした細胞はｍＣｈｅｒｒｙタンパク質のみを発現したが、レポーター転写産物のＵＡＧを標的として編集すると、終止コドンがＵＩＧに変換され、その結果、下流のＥＧＦＰ発現が可能になる。このようなレポーターを使用すると、ＥＧＦＰレベルを監視することでＡからＩへの編集効率を測定できる。次に、ターゲティング用のＣａｓ１３ａ認識の対象となる５’スキャフォールドと可変長のスペーサー配列（ｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａ、ＬｂｕＣａｓ１３ ｃｒＲＮＡ配列に続く）を含むｈＵ６プロモーター駆動型ｃｒＲＮＡ（ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ）を設計した。
ＬｂｕＣａｓ１３ ｃｒＲＮＡ配列
Figure 0007252328000014
アデノシン脱アミノ化はＡ－Ｃミスマッチ部位で優先的に起こるため、標的転写物に相補的な配列はすべて、ＵＡＧコドンと対向するＣＣＡを含み、アデノシン（Ａ）とのシチジン（Ｃ）ミスマッチを引き起こす（非特許文献１３、１４）。ｃｒＲＮＡの最適な長さをテストするために、異なる長さの非標的または標的ｃｒＲＮＡを、レポーター－１を安定して発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞でｄＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤタンパク質と共発現させた。ＥＧＦＰ発現の出現によって示される明らかなＲＮＡ編集効果は、少なくとも４０ ｎｔの長さのマッチングする配列を含むｃｒＲＮＡで観察され、ｃｒＲＮＡが長いほど、ＥＧＦＰ陽性率が高くなる（図１０Ｃ）。驚くべきことに、長いｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａの発現だけでＥＧＦＰ発現を活性化するのに十分であるように見え、ｄＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤの共発現はむしろｃｒＲＮＡ活性を低下させた（図１０Ｃ、１０ｄ）。７０－ｎｔ（長さ計算用の５’スキャフォールドを除く）対照ＲＮＡはＥＧＦＰ発現を活性化できなかったため、ＥＧＦＰ発現は明らかに配列依存的であった（図１０Ｃ、１０Ｄ）。
特定の長く操作されたｃｒＲＮＡＣａｓ１３ａがｄＣａｓ１３ａ－ＡＤＡＲ１ＤＤとは独立してＲＮＡ編集を可能にするという驚くべき発見により、ｃｒＲＮＡからＣａｓ１３ａ動員スキャフォールド配列を削除することにした。ｃｒＲＮＡ７０はＥＧＦＰ発現をトリガーする最も高い活性を持っていたため（図１０Ｃ、１０Ｄ）、Ｃａｓ１３ａ動員スキャフォールのない同じ７０－ｎｔの長さのガイドＲＮＡを選択して、さらなるテストを行った（図１１Ａおよび以下の実施例で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡ配列）。
Figure 0007252328000015
Figure 0007252328000016
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Figure 0007252328000018
Figure 0007252328000019
Figure 0007252328000020
Figure 0007252328000021
Figure 0007252328000022
Figure 0007252328000023
Figure 0007252328000024
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Figure 0007252328000028
Figure 0007252328000029
Figure 0007252328000030
Figure 0007252328000031
この線形ガイドＲＮＡは、レポーター－１を含む全細胞の４０％近くで強力なＥＧＦＰ発現を誘導することが証明された（図１１Ｂ、上図）。内因性ＡＤＡＲタンパク質は二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）基質を編集できるため（非特許文献１２）、長いガイドＲＮＡが標的転写物とアニーリングしてｄｓＲＮＡ基質を形成し、それが内因性ＡＤＡＲタンパク質を標的編集のために動員できると考えた。そこで、このようなガイドＲＮＡをａｒＲＮＡ（ＡＤＡＲ動員ＲＮＡ）と名付けた。内因性ＡＤＡＲタンパク質が実際に上記の観察に関与しているかどうかを検証するために、ＡＤＡＲ欠損細胞におけるａｒＲＮＡを介したＲＮＡ編集の調査に着手した。ＡＤＡＲ２ ｍＲＮＡはＨＥＫ２９３Ｔ細胞ではほとんど検出されなかったため（図１２Ａ）、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞を生成し、この細胞株をＡＤＡＲ１とＡＤＡＲ２の両方で欠損させた（図１１Ｃ、Ｄ）。実際、ＡＤＡＲ１の枯渇は、ａｒＲＮＡ７０によって誘導されるＥＧＦＰシグナルを解消した（図１１Ｂ、下図）。さらに、ＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－細胞におけるＡＤＡＲ１ｐ１１０、ＡＤＡＲ１ｐ１５０、またはＡＤＡＲ２の外因性発現（図１１Ｃ、Ｄ）は、ａｒＲＮＡ７０によるＥＧＦＰ誘導の喪失をうまく救い（図１１Ｅ、図１２Ｂ）、ａｒＲＮＡ誘導ＥＧＦＰレポーターの発現はネイティブＡＤＡＲ１にのみ依存し、その活性がアイソフォーム（ｐ１１０およびｐ１５０）またはＡＤＡＲ２のいずれかによって再構築されることができることを証明した。ａｒＲＮＡ７０ターゲティング領域のサンガーシーケンシング解析は、ＵＡＧ内の予測されたアデノシン部位にＡ／Ｇオーバーラップピークを示し、有意なＡからＩ（Ｇ）への変換を示している（図１１Ｆ）。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）により、ＡからＩへの変換率がレポーター転写産物全体の約１３％であることがさらに確認された（図１１Ｇ）。定量的ＰＣＲ解析は、ａｒＲＮＡ７０が標的転写物の発現を低下させないことを示し（図１３）、ａｒＲＮＡのＲＮＡｉ効果の可能性を排除した。まとめると、私たちのデータは、ａｒＲＮＡが工学操作されたＡ－Ｃミスマッチを介して標的転写物に対してかなりのレベルの編集を生成できることを示した。
実施例７
ＬＥＡＰＥＲは複数の細胞株でのＲＮＡ編集を可能にする
内因性ＡＤＡＲタンパク質の発現は、ＬＥＡＰＥＲを介したＲＮＡ編集の前提条件であるため、ＨＴ２９、Ａ５４９、ＨｅｐＧ２、ＲＤ、ＳＦ２６８、ＳＷ１３、ＨｅＬａなどの異なる組織に由来する細胞株におけるＬＥＡＰＥＲのパフォーマンスをテストした。最初に、ウエスタンブロッティング解析を使用して、３種類すべてのＡＤＡＲタンパク質の内因性発現を調べた。ＡＤＡＲ１は、テストしたすべての細胞株で高度に発現し、ウエスタンブロットでの身分は陰性対照であるＨＥＫ２９３Ｔ ＡＤＡＲ１－／－株によって確認された（図１４Ａ、Ｂ）。ＡＤＡＲ３はＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞でのみ検出された（図１４Ａ、Ｂ）。ＡＤＡＲ２はどの細胞でも検出できなかった。これは、ＡＤＡＲ２を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｔ細胞からＡＤＡＲ２タンパク質を検出できたため、ウエスタンブロッティングの失敗によるものではなかった（図１４Ａ、Ｂ）。これらの発見は、ＡＤＡＲ１が遍在的に発現している一方、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３の発現が特定の組織に限定されているという以前の報告と一致している（非特許文献１１）。
次に、これらの細胞株でレポーター－１を標的とする再設計された７１－ｎｔ ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ７１）の編集効率のテストに着手した（図１５Ａおよび上記列した、この研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。
ＬＥＡＰＥＲは、効率が異なるが、このａｒＲＮＡ７１についてテストされたすべての細胞で機能した（図１４Ｃ）。これらの結果は、ＨｅｐＧ２およびＨｅＬａ細胞を除いて、ＡＤＡＲ１／２タンパク質レベルがＲＮＡ編集収量（非特許文献４２）と相関するという以前の報告と一致している。編集効率とＡＤＡＲ１レベルの次善の相関関係は、ＡＤＡＲ３がＲＮＡ編集において阻害的役割を果たすことが報告されているため、これら２つのラインに大量なＡＤＡＲ３発現があるからかもしれない（図１４Ａ、Ｂ）。重要なことに、ＬＥＡＰＥＲはマウス由来の３つの異なる細胞株（ＮＩＨ３Ｔ３、マウス胚性線維芽細胞（ＭＥＦ）およびＢ１６）でも機能し（図１４Ｄ）、動物および疾患モデルを通じてその治療の可能性をテストする道を開いた。まとめると、ＬＥＡＰＥＲは、幅広い種類の細胞やさまざまな生物に使用する多機能ツールであると結論付けた。
実施例８
ＬＥＡＰＥＲの特性と最適化
ＬＥＡＰＥＲをよりよくキャラクタリゼーションして最適化するために、標的転写物のＵＡＧトリプレット内のアデノシンと対向するヌクレオチドの選択を調査した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、レポーター１を標的とするａｒＲＮＡ７１は、可変的な編集効率を示し、標的となるＵＡＧに対向する変化したトリプレット（５’－ＣＮＡ、ＮはＡ／Ｕ／Ｃ／Ｇの一つを表す）を有する（上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡ及び対照ＲＮＡの配列）。Ａ－Ｃミスマッチは最高の編集効率をもたらし、Ａ－Ｇミスマッチは最小であるが明白な編集をもたらした（図１６Ａ）。次に、ａｒＲＮＡのＡ－Ｃミスマッチに隣接するヌクレオチドの優先度を調査した。シチジン（５’－Ｎ１ＣＮ２）の周りの５’および３’隣接部位の１６の組み合わせすべてをテストし（上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡおよび対照ＲＮＡの配列）、３’隣接アデノシンが効率的な編集に必要なものであり、アデノシンが５’部位で最も好ましくないヌクレオチドであることを発見した（図１６Ｂ、Ｃ）。したがって、ａｒＲＮＡのＣＣＡモチーフは、ＵＡＧ部位を対象とした最高の編集効率をもたらすと結論付けた。ａｒＲＮＡの３’隣接グアノシン（５’－Ｎ１ＣＧ）が有意な阻害効果を示したことに注意すべきである（図１６Ｂ、Ｃ）。
ＲＮＡの長さは、以前の報告と一致して、標的転写物の編集をガイドする際のａｒＲＮＡ効率に関連しているように見えた（図１０Ｃ）（非特許文献４２）。この効果を完全に理解するために、２つの異なるレポーター転写産物であるレポーター－１とレポーター－２を標的にした可変長のａｒＲＮＡをテストした（図１５Ａ、Ｂ）。どちらのレポーターターゲティングでも、３１－ｎｔから２１１－ｎｔの範囲の１０種類のサイズの異なるａｒＲＮＡが設計およびテストされ、ＣＣＡトリプレット（ＵＡＧターゲティング用）がちょうど中間にある（上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。レポーターのＥＧＦＰ活性に基づくと、ａｒＲＮＡの長さは、両方のレポーターで編集効率と正の相関があり、１１１～１９１－ｎｔでピークに達した（図１６Ｄ）。１つのａｒＲＮＡ５１が機能しているように見えたが、７１－ｎｔは、ａｒＲＮＡが両方のレポーターで機能するための最小の長さであった（図１６Ｄ）。
次に、編集効率に対するａｒＲＮＡ内のＡ－Ｃミスマッチ位置の影響を調査した。テスト用のすべてのａｒＲＮＡの長さを７１ｎｔに固定し、ＵＡＧを標的とするＡＣＣトリプレットをａｒＲＮＡ内で５’から３’にスライドさせた（上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。両方のレポーターでは、Ａ－Ｃミスマッチを中央領域に配置すると編集率が高くなり、ミスマッチ部位が３’末端に近いａｒＲＮＡは、５’末端に近いａｒＲＮＡよりも優れていることが事実によって証明された（図１６Ｅ）。便宜上、後続のすべての研究では、Ａ－ＣミスマッチをａｒＲＮＡの中心に配置した。
また、ＬＥＡＰＥＲのターゲティングの柔軟性をテストし、標的上のＵＡＧがＲＮＡ編集の対象となる唯一のモチーフであるかどうかを判断しようとした。レポーター－３の１６のトリプレットの組み合わせ（５’－Ｎ１ＡＮ２）すべてについて（図１５Ｃ）、固定長（１１１－ｎｔ）の対応するａｒＲＮＡを使用し、編集部位（ＡＣミスマッチ）を除き、ａｒＲＮＡとレポーターの完全な配列マッチングを保証した（図１６Ｆおよび上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡおよび対照ＲＮＡの配列）。ＮＧＳの結果は、すべてのＮ１ＡＮ２モチーフを編集できることを示した。ＵＡＮ２とＧＡＮ２は、それぞれ最も好ましいモチーフと最も好ましくないモチーフである（図１６Ｆ、Ｇ）。まとめると、標的アデノシンの最近傍優先度は５’Ｕ＞Ｃ≒Ａ＞Ｇおよび３’Ｇ＞Ｃ＞Ａ≒Ｕである（図１６Ｇ）。
実施例９
ＬＥＡＰＥＲを使用した内因性転写産物の編集
次に、ＬＥＡＰＥＲが内因性転写物の効果的な編集を可能にするかどうかを調べた。異なる長さのａｒＲＮＡを使用して、ＰＰＩＢ、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４遺伝子の転写産物のＵＡＧモチーフ、およびＦＡＮＣＣ遺伝子転写産物のＵＡＣモチーフを標的にした（図１７Ａ、上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。心強いことに、４つの転写物すべての標的アデノシン部位は、ＮＧＳの結果によると効率が異なるが、４つのサイズすべての対応するａｒＲＮＡによって編集された（図１７Ｂ）。以前の観察と一致して、ａｒＲＮＡが長いほど編集率が高くなる傾向があった。注目すべきことに、１５１ｎｔのａｒＲＮＡＰＰＩＢはＰＰＩＢ遺伝子の全転写産物の約５０％を編集した（図１７Ｂ）。それらの標的転写物（図１８Ａ）または最終的なタンパク質レベル（例えば、ＫＲＡＳ、図１８Ｂ）に対してＲＮＡｉ効果を示すａｒＲＮＡはなかった。さらに、ＬＥＡＰＥＲは非ＵＡＮ部位で望ましい編集率を達成することができ（図１７Ｃおよび上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）、内因性転写物の編集におけるＬＥＡＰＥＲの柔軟性を示している。ＬＥＡＰＥＲの機能をさらに探求するために、複数の部位を同時に標的とすることができるかどうかをテストした。２つのａｒＲＮＡ（上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）の共発現によるＴＡＲＤＢＰとＦＡＮＣＣの両方の転写産物の多重編集を観察し、単一のａｒＲＮＡよりも効率が高いことを示している（図１７Ｄ）。これは、ＬＥＡＰＥＲが、複数の標的を並行して編集するのに適していることを示した。
ＡＤＡＲ１／２はＲＮＡ二重鎖の複数のアデノシンを乱雑に脱アミ化する傾向があり（非特許文献４４）、Ａ－ＣミスマッチがＡからＩへの変換を導く唯一のモチーフではないことは注目に値す（図１６Ａ）。したがって、ａｒＲＮＡカバレッジ内の標的転写産物上のすべてのアデノシンは、可変的なレベルの編集を受け、不要な修飾の主な由来であると合理的に想定できる。ａｒＲＮＡが長いほど、そのようなオフターゲットの可能性が高くなる。そのため、これらの標的転写物中のａｒＲＮＡカバレッジ内のすべてのアデノシン部位を調べた。ＰＰＩＢ転写産物の場合、さまざまなサイズのａｒＲＮＡのシーケンスウィンドウ全体でオフターゲット編集はほとんど観察されなかった（図１７Ｅ、Ｆ）。ただし、ＫＲＡＳ、ＳＭＡＤ４、およびＦＡＮＣＣ遺伝子を標的とする場合、複数のオフターゲット編集が検出された（図１９Ａ－Ｆ）。特にＫＲＡＳの場合、３０個のアデノシンのうち１１個が、ａｒＲＮＡ１１１のシーケンスウィンドウで大量なＡからＩへの変換を受けた（図１９Ａ、Ｂ）。
次に、このような望ましくないオフターゲット効果を最小限に抑えるための戦略の開発を試みた。Ａ－ＧミスマッチがＵＡＧターゲティングの編集を抑制したため（図１６Ａ）、グアノシンを非標的アデノシンとペアリングすると、望ましくない編集が減少する可能性があると仮定した。次に、レポーター－３において、あらゆる可能なトリプレットの組み合わせ（５’－Ｎ１ＡＮ２）でアデノシンに対するＡ－Ｇミスマッチの影響をテストした（図１５Ｃおよび上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。Ａ－Ｇミスマッチは、Ａ－Ｃミスマッチ（図１６Ｆ）と比較して、ＵＡＧまたはＡＡＧターゲティング（～２％）（図１７Ｇ）を除いて、テストしたすべてのターゲットでアデノシンの編集を確実に減少させた。不要な部位での編集率をさらに下げるために、２つの連続したミスマッチの影響をテストした。ＵＡＧまたはＡＡＧのいずれかに対向するトリプレットの３’末端ヌクレオチドでの追加のミスマッチにより、対応するアデノシン編集が解消されたことが分かった（図１７Ｈおよび上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。これらの発見によって、ＫＲＡＳ転写産物のオフターゲットを減らすためにこのルールを適用しようとした（図１９Ａ）。まず、ａｒＲＮＡ１１１でカバーされるすべての「編集しやすい」モチーフにＡＧミスマッチを生成するａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ６）を設計し（図１７Ｉ、図１９Ａ、および上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）、このａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ６は、ＡＡＵ（６１番目）、ＵＡＵ（６３番目）、ＵＡＡ（６５番目）、ＡＡＡ（６６番目）、ＵＡＧ（９４番目）、及びＡＡＧ（９９番目）を含む。このａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ６は、オフターゲット編集率を約５％に維持しながら、オフターゲット編集のほとんどを排除した。図１７Ｇの発見と一致して、単一のＡ－Ｇミスマッチは、ＡＡＧモチーフ（９９番目）の編集を完全に最小化することができなかった（図１７Ｉおよび図１９Ａ）。次に、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ６により多くのミスマッチを追加した。これには、デュアルミスマッチ（標的モチーフ５’－ＡＡＧの反対側の５’－ＣＧＧ）に加えて、２７、９８、および１１５番目のアデノシンでの編集（ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ９）を軽減する３つの別のＡ－Ｇミスマッチが追加された（上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。その結果、標的部位（Ａ７６）での編集率をさらに損なうことなく、編集の特異性を大幅に向上させることができた（図１７Ｉ）。要約すると、他のルールを組み込んだ工学操作されたＬＥＡＰＥＲは、内因性転写産物の効率的でより正確なＲＮＡ編集を可能にする。
実施例１０
ＬＥＡＰＥＲのＲＮＡ編集特異性
ａｒＲＮＡで覆われたｄｓＲＮＡ領域内で起こりうるオフターゲット効果に加えて、ａｒＲＮＡの部分的な塩基対形成による他の転写産物への潜在的なオフターゲット効果についても懸念していた。そして、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシング解析を実行して、ＬＥＡＰＥＲのグローバルなオフターゲット効果を評価した。ＲＮＡシーケンス解析を行う前に、細胞に対照ＲＮＡ１５１またはＰＰＩＢ特異的ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢ）発現プラスミドをトランスフェクトした。対照ＲＮＡ１５１グループ（図２０Ａ）で６つの潜在的なオフターゲットを特定し、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢグループ（図２０Ｂ）で５つを特定し、ＮＧＳ解析に基づくＰＰＩＢオンターゲット率は約３７％であった（図２０Ｂ）。さらなる解析により、ＥＩＦ２ＡＫ２転写産物からの２つの部位を除くすべての部位がＳＩＮＥ（Ａｌｕ）またはＬＩＮＥ領域のいずれかに位置し（図２０Ａ、Ｂ）、両方ともＡＤＡＲを介した編集の傾向があることが明らかになり（非特許文献４５）、これらのオフターゲットが標的転写産物とａｒＲＮＡまたは対照ＲＮＡとのペアリングに由来しない場合があることは示された。注目すべきなことに、オフターゲティング転写物、ＷＤＲ７３とＳＭＹＤ４が両方のグループに現れ、それらが配列依存性のＲＮＡ編集である可能性が低いことを示唆している。実際、最小自由エネルギー解析は、これらの可能なオフターゲット転写物すべてが、対照ＲＮＡ１５１またはａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのいずれかと安定した二重鎖を形成できなかったことを示唆した（図２０Ｃ）。ａｒＲＮＡが配列依存のオフターゲットを生成するかどうかをさらにテストするために、ＮＣＢＩ ＢＬＡＳＴを使用してａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢとａｒＲＮＡ１１１－ＦＡＮＣＣの配列の類似性を比較することにより、潜在的なオフターゲットサイトを選択した。ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢのＴＲＡＰＰＣ１２転写物およびａｒＲＮＡ１１１－ＦＡＮＣＣのＳＴ３ＧＡＬ１、ＯＳＴＭ１－ＡＳ１およびＥＨＤ２転写物の３つの部位が最もよい候補であった（図２０Ｄおよび図２１Ａ）。ＮＧＳ解析により、これらの予測されたオフターゲットサイトのいずれでも編集が検出されなかったことが明らかになった（図２０Ｄおよび図２１Ｂ）。これらの結果は、ＬＥＡＰＥＲが、トランスクリプトーム全体の特異性を維持しながら、標的部位での効率的な編集を許可し、配列依存のオフターゲット編集を検出しなかったことを示している。
実施例１１
哺乳類細胞におけるＬＥＡＰＥＲの安全性評価
ａｒＲＮＡは標的転写産物の編集を内因性ＡＤＡＲタンパク質に依存しているため、外因性ａｒＲＮＡの添加は、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２タンパク質を過剰に占有することにより、ネイティブＲＮＡ編集イベントに影響を与えるかどうかを知りたかった。そのため、トランスクリプトーム全体のＲＮＡシーケンシング結果から、模擬グループとａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢグループが共有するＡからＩへのＲＮＡ編集部位を解析し、模擬グループと対照ＲＮＡ１５１グループの比較も解析した。対照ＲＮＡ１５１グループもａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢグループも模擬グループと比較して有意差を示さず（図２２Ａ、Ｂ）、ＬＥＡＰＥＲがネイティブＡからＩへの編集イベントを触媒する内因性ＡＤＡＲ１の正常な機能にほとんど影響を与えなかったことを示している。
一方、ＲＮＡ－ｓｅｑデータを用いた差次的遺伝子発現解析を行い、ａｒＲＮＡがグローバルな遺伝子発現に影響を与えるかどうかを検証した。対照ＲＮＡ１５１もａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢも、模擬グループと比較してグローバルな遺伝子発現に影響を与えないことがわかった（図２２Ｃ、Ｄ）。我々の以前の観察（図１８Ａ）と一致して、ａｒＲＮＡはＰＰＩＢの発現に対してＲＮＡｉ効果を示さなかった（図２２Ｃ、Ｄ）。
ａｒＲＮＡが標的転写物とＲＮＡ二重鎖を形成し、ＲＮＡ二重鎖が自然免疫応答を誘発する可能性があることを考慮して、ａｒＲＮＡの導入がそのような効果をもたらすかどうかを調査した。これをテストするために、効果が証明されている４つの遺伝子転写産物を標的とするａｒＲＮＡを選択した。自然免疫活性化の２つの特徴であるインターフェロン-β（ＩＦＮ－β）（図２２Ｅ）またはインターロイキン－６（ＩＬ－６）（図２２Ｆ）のｍＲＮＡ誘導は観察されなかった。陽性対照として、二本鎖ＲＮＡの合成類似体-ポリ（Ｉ：Ｃ）は強いＩＦＮ－βおよびＩＬ－６発現を誘導した（図２２Ｅ、Ｆ）。ＬＥＡＰＥＲは、標的細胞に、安全な治療に重要な特徴である免疫原性を誘発しないようである。
実施例１２
ＬＥＡＰＥＲによるｐ５３の転写調節活性の回復
外因的タンパク質を導入することなくＲＮＡ編集ができる新しい方法を確立したので、その治療的有用性を実証することを試みた。まず、細胞の恒常性の維持に重要な役割を果たすことが知られている腫瘍抑制遺伝子ＴＰ５３を標的としたが、ヒトの癌の５０％超えで頻繁に変異が起こる（非特許文献４６）。ＴＰ５３中のｃ．１５８Ｇ＞Ａの変異は、臨床的に関連のあるナンセンス変異（Ｔｒｐ５３Ｔｅｒ）であり、機能しないトランケートされたタンパク質をもたらす（非特許文献４６）。１つのａｒＲＮＡ１１１と２つの代替ａｒＲＮＡ（ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１とａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４）（上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）を設計した。これらはいずれもＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写産物を標的としており（図２３Ａ）、後者の２つは最小化した潜在的なオフターゲットに設計されている。ネイティブｐ５３タンパク質の影響を排除するために、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞株を生成した。ＴＰ５３Ｗ５３Ｘを標的とするａｒＲＮＡの３つの形態はすべて、変異したアデノシン部位でＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写産物の約２５～３５％を変換し（図２３Ｂ）、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１およびａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４の不要な編集を可変的に削減した（図２４）。ウエスタンブロットは、ａｒＲＮＡ１１１、ａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１、およびａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ４がすべて、ＨＥＫ２９３Ｔ ＴＰ５３－／－細胞におけるＴＰ５３Ｗ５３Ｘ転写産物に基づく完全長ｐ５３タンパク質の産生を救うことができるのに対し、対照ＲＮＡ１１１が救うことができないことを示した（図２３Ｃ）。
修復されたｐ５３タンパク質が完全に機能するかどうかを検証するために、ｐ５３の転写調節活性をｐ５３－ルシフェラーゼシス報告システムでテストした（非特許文献４７、４８）。ａｒＲＮＡの３つのバージョンすべてがｐ５３活性を回復する可能性があり、最適化されたバージョンａｒＲＮＡ１１１－ＡＧ１が最高のパフォーマンスを示した（図２３Ｄ）。結論として、ＬＥＡＰＥＲがＴＰ５３の癌関連の早期終止コドン（ｐｒｅ－ｍａｔｕｒｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ）を修復し、その機能を回復できることを示した。
実施例１３
ＬＥＡＰＥＲによる病原性突然変異の修正
次に、ＬＥＡＰＥＲを使用してより病原性の高い変異を修正できるかどうかを調査した。エーラース・ダンロス症候群のＣＯＬ３Ａ１、原発性肺高血圧症のＢＭＰＲ２、ジュベール症候群のＡＨＩ１、ファンコニ貧血のＦＡＮＣＣ、原発性家族性肥大性心筋症のＭＹＢＰＣ３、及びＸ連鎖重症複合免疫不全症のＩＬ２ＲＧの６つの病原性遺伝子からの臨床的に関連する変異を目指して、対応する病原性Ｇ＞Ａ変異を有するこれらの遺伝子のそれぞれに対して１１１－ｎｔ ａｒＲＮＡを設計した（図２５および上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列、およびこの研究で使用された以下の疾患関連ｃＤＮＡ）。
この研究で使用された疾患関連ｃＤＮＡ
Figure 0007252328000032
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でａｒＲＮＡ／ｃＤＮＡペアを共発現させることにより、すべてのテストでＡ＞Ｇ修正を行った有意な量の標的転写産物を同定した（図２４）。Ｇ＞Ａ変異は、ヒトの既知の致病点変異のほぼ半分を占めるため（非特許文献１０、４９）、ＬＥＡＰＥＲによるＡ＞Ｇ変換は治療に巨大な機会を提供することができる。
実施例１４
ＬＥＡＰＥＲによる複数のヒト初代細胞でのＲＮＡ編集
ＬＥＡＰＥＲの臨床的有用性をさらに探求するために、複数のヒト初代細胞でこの方法をテストすることに着手した。まず、レポーター１を編集するために１５１ ｎｔ ａｒＲＮＡ（上記のこの研究で使用したａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）を使用して、ヒト初代肺線維芽細胞とヒト初代気管支上皮細胞でＬＥＡＰＥＲをテストした（図１５Ａ）。ＥＧＦＰ陽性細胞の３５～４５％は、両方のヒト初代細胞でＬＥＡＰＥＲによって取得できた（図２７Ａ）。次に、これら２つの初代細胞とヒト初代Ｔ細胞でのＬＥＡＰＥＲによる内因性遺伝子ＰＰＩＢの編集をテストしたところ、ａｒＲＮＡ１５１－ＰＰＩＢがヒト初代肺線維芽細胞、初代気管支上皮細胞（図２７Ｂ）および初代Ｔ細胞（図２７Ｃ）での編集率が＞４０％、＞８０％、＞３０％を達成できることを発見した。ヒト初代細胞におけるＬＥＡＰＥＲの高い編集効率は、治療におけるその潜在的な用途のため特に有望である。
実施例１５
レンチウイルスの発現とａｒＲＮＡの化学合成による効率的な編集
次に、ＬＥＡＰＥＲをより臨床的に適切な方法で送達できるかどうかを調査した。まず、レンチウイルスベースの発現を介してａｒＲＮＡの効果をテストした。レポーター－１を標的とするａｒＲＮＡ１５１は、感染２日後（ｄｐｉ）にＨＥＫ２９３Ｔ細胞でレポーター－１を保有する全細胞の４０％以上で強力なＥＧＦＰ発現を誘導した。８ｄｐｉでは、ＥＧＦＰ比は約３８％の同等レベルに維持され（図２８Ａおよび上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）、ＬＥＡＰＥＲは、継続的な投与を必要とする治療法に適用できることを示唆している。ネイティブ遺伝子編集では、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞でレンチウイルス形質導入を介してＰＰＩＢターゲティングａｒＲＮＡ１５１を送達し、６ｄｐｉで６％を超える標的編集を観察した（図２８Ｂ）。
次に、ＬＥＡＰＥＲのための合成ａｒＲＮＡオリゴヌクレオチドとエレクトロポレーションデリバリー法をテストした。ＰＰＩＢ転写産物を標的とする、１１１－ｎｔを有するａｒＲＮＡおよび対照ＲＮＡは化学的に合成され、ａｒＲＮＡの最初の３つおよび最後の３つの残基で２’－Ｏ－メチルおよびホスホロチオエート結合修飾を行った（図２８Ｃ）。エレクトロポレーションによってＴ細胞に導入された後、ａｒＲＮＡ１１１－ＰＰＩＢオリゴはＰＰＩＢ転写産物の編集の約２０％（～２０％）を達成し（図２８Ｄ）、ＬＥＡＰＥＲがオリゴヌクレオチド薬の開発に有望であることを示している。
実施例１６
ＬＥＡＰＥＲによるハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群患者由来の初代線維芽細胞におけるα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復
最後に、単一遺伝子疾患-ハーラー（Ｈｕｒｌｅｒ）症候群の治療におけるＬＥＡＰＥＲの可能性を検討した。この疾患は、ムコ多糖の分解に関与するリソソーム代謝酵素であるα－Ｌ－イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠損によるムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ Ｉ）の最も重篤なサブタイプ（ＭＰＳ Ｉ）である（非特許文献５０）。もともとハーラー症候群患者から分離された初代線維芽細胞ＧＭ０６２１４を選択した。ＧＭ０６２１４細胞は、ＩＤＵＡ遺伝子のエクソン９にホモ接合のＴＧＧ＞ＴＡＧ変異を含み、タンパク質にＴｒｐ４０２Ｔｅｒ変異をもたらす。化学修飾された合成ＲＮＡオリゴヌクレオチドによって、ＩＤＵＡの成熟ｍＲＮＡとプレｍＲＮＡをそれぞれ標的とするａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１とａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２の２つのバージョンのａｒＲＮＡを設計した（図２９Ａ及び上記のこの研究で使用されたａｒＲＮＡと対照ＲＮＡの配列）。エレクトロポレーションによりＧＭ０６２１４細胞にａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１またはａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２を導入した後、ＮＧＳ解析により標的ＲＮＡ編集率を測定し、４－ＭＵ－α－Ｌ－イズロニダーゼの基質によるα－Ｌ－イズロニダーゼの触媒活性を異なる時点で測定した。ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１とａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２はどちらも、エレクトロポレーション後の時間の経過とともにＩＤＵＡ欠損ＧＭ０６２１４細胞のＩＤＵＡ触媒活性を徐々に回復させ、ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２はａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１よりもはるかに優れた性能を示し、α－Ｌ－イズロニダーゼ活性は、３つの対照群で検出できなかった（図２９Ｂ）。
ＬＥＡＰＥＲによってＧＭ０６２１４で回復されたＩＤＵＡ活性がハーラー症候群を軽減する程度をさらに評価するために、シャイエ（Ｓｃｈｅｉｅ）症候群の患者からの別の初代線維芽細胞であるＧＭ０１３２３細胞でのＩＤＵＡ活性を調べた。これは、ハーラー症候群よりもはるかに軽度のＭＰＳ Ｉのサブタイプであり、ＩＤＵＡ遺伝子のヘテロ接合遺伝子型に起因する残りのＩＤＵＡ活性によるものである。ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２を含むＧＭ０６２１４細胞におけるＩＤＵＡの触媒活性は、エレクトロポレーションの４８時間後にＧＭ０１３２３細胞よりも高いことがわかった（図２９Ｂ）。これらの結果と一致して、ＮＧＳ解析は、ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２がＡからＩへの編集のほぼ３０％を変換し、ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１の変換率よりもはるかに高いことを示した（図２９Ｃ）。さらなる解析により、ＩＤＵＡ転写産物のａｒＲＮＡで覆われた領域内で最小限の不要な編集が検出されたことが明らかになった（図２９Ｄ）。重要なことに、ＬＥＡＰＥＲは一次細胞で免疫応答を引き起こすことがなく、すでに証明したように、陽性対照として機能するＲＮＡ二重鎖ポリ（Ｉ：Ｃ）とは異なり、ａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ１もａｒＲＮＡ１１１－ＩＤＵＡ－Ｖ２も、Ｉ型インターフェロンおよび炎症誘発性応答に関与する遺伝子の発現を誘導しない（図２９Ｅ）。これらの結果は、特定の単一遺伝子疾患を標的とするＬＥＡＰＥＲの治療の可能性を示している。
実施例１７
ＬＥＡＰＥＲによるハーラー症候群マウスのα－Ｌ－イデュロニダーゼ活性の回復
ＬＥＡＰＥＲがマウスで実験を行う可能性を提供するので、我々は、インビボで単一遺伝子疾患-ハーラー症候群を治療するためのＬＥＡＰＥＲの可能性を調べた。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）が送達システムとして選択されている。２つの配列（配列番号３４１および配列番号３４２）をプラスミドＡＡＶ－Ｕ６－ＣＭＶ－ＧＦＰベクターに挿入し、そしてプラスミドをＰａｃｋＧｅｎｅ ＢｉｏｔｅｃｈによってＡＡＶ８ウイルスにパッケージングした（図３１を参照）。ウイルス力価は次のとおりである。
Figure 0007252328000033
６匹のＭＰＳＩ（ｉｄｕａ Ｗ３９２Ｘマウス、Ｂ６．１２９Ｓ－Ｉｄｕａｔｍ１．１Ｋｍｋｅ／Ｊ）雄マウス（４～１０週齢）を選択して２つのグループに分け、第１のグループの３匹のマウスのそれぞれにプラスミドＡＡＶ８－ＩＤＵＡ－ａｄＲＮＡ１５１－ＫＤ２がパッケージされたＡＡＶ８ウイルスの１Ｅ１２ＧＣを尾静脈を通して注射し、第２のグループの他の３匹のマウスのそれぞれに、プラスミドＡＡＶ８－Ｒａｎｄｏｍ１５１－ＫＤ２がパッケージされたＡＡＶ８ウイルスの１Ｅ１２ＧＣと対照を尾静脈を通して注射した。注射の２８日後、マウスを頸椎脱臼により殺処分し、肝臓を採取した。２つのグループの各マウスについて、４－ＭＵ－α－Ｌ－イズロニダーゼ基質を有するマウス肝細胞におけるα－Ｌ－イズロニダーゼの酵素活性を測定した。肝臓は細かく分割されており、粉砕後の一部は（すぐに）酵素活性測定に使用された。第１のグループの平均相対酵素活性は、第２のグループのそれよりも高い（図３２Ａを参照）。第１のグループの各マウスの相対的な酵素活性は、第２のグループのそれよりも高い（図３２Ｂ、対照としてＧＭ０１３２３は、野生型細胞と比較して０．３％のα－Ｌ－イズロニダーゼ酵素活性を有する）。酵素活性の結果から、第１のグループのマウスのα－Ｌ－イドロニダーゼ活性が回復していることがわかる。ＴＧＧ＞ＴＡＧ変異が回復し、ＬＥＡＰＥＲが効果的なＲＮＡ編集を提供することを確認するために、次に、粉砕された肝臓の他の部分を使用して、２つのグループの各マウスの次世代シーケンシング解析によりマウス肝細胞の標的ＲＮＡ編集率を測定した。他の部分はＮＧＳ用のｔｒｉｚｏｌが添加された。第１のグループの平均ＲＮＡ編集効率は、第２のグループのそれよりも高い（図３３Ａを参照）。第１のグループの各マウスのＲＮＡ編集効率は、第２のグループのそれよりもほぼ高い（図３３Ｂを参照）。ＲＮＡ編集効率の結果から、ＬＥＡＰＥＲ法は最大７％の効果的なＲＮＡ編集を提供できることがわかる。
ADAR1(p110) cDNA
5’-ATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ)TAG-3’ (配列番号332)
ADAR1(p150) cDNA
5’ATGAATCCGCGGCAGGGGTATTCCCTCAGCGGATACTACACCCATCCATTTCAAGGCTATGAGCACAGACAGCTCAGATACCAGCAGCCTGGGCCAGGATCTTCCCCCAGTAGTTTCCTGCTTAAGCAAATAGAATTTCTCAAGGGGCAGCTCCCAGAAGCACCGGTGATTGGAAAGCAGACACCGTCACTGCCACCTTCCCTCCCAGGACTCCGGCCAAGGTTTCCAGTACTACTTGCCTCCAGTACCAGAGGCAGGCAAGTGGACATCAGGGGTGTCCCCAGGGGCGTGCATCTCGGAAGTCAGGGGCTCCAGAGAGGGTTCCAGCATCCTTCACCACGTGGCAGGAGTCTGCCACAGAGAGGTGTTGATTGCCTTTCCTCACATTTCCAGGAACTGAGTATCTACCAAGATCAGGAACAAAGGATCTTAAAGTTCCTGGAAGAGCTTGGGGAAGGGAAGGCCACCACAGCACATGATCTGTCTGGGAAACTTGGGACTCCGAAGAAAGAAATCAATCGAGTTTTATACTCCCTGGCAAAGAAGGGCAAGCTACAGAAAGAGGCAGGAACACCCCCTTTGTGGAAAATCGCGGTCTCCACTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACGGTCATAGCCAAGGAGCCCCAAACTCAGACCCGAGTTTGGAACCGGAAGACAGAAACTCCACATCTGTCTCAGAAGATCTTCTTGAGCCTTTTATTGCAGTCTCAGCTCAGGCTTGGAACCAGCACAGCGGAGTGGTAAGACCAGACAGTCATAGCCAAGGATCCCCAAACTCAGACCCAGGTTTGGAACCTGAAGACAGCAACTCCACATCTGCCTTGGAAGATCCTCTTGAGTTTTTAGACATGGCCGAGATCAAGGAGAAAATCTGCGACTATCTCTTCAATGTGTCTGACTCCTCTGCCCTGAATTTGGCTAAAAATATTGGCCTTACCAAGGCCCGAGATATAAATGCTGTGCTAATTGACATGGAAAGGCAGGGGGATGTCTATAGACAAGGGACAACCCCTCCCATATGGCATTTGACAGACAAGAAGCGAGAGAGGATGCAAATCAAGAGAAATACGAACAGTGTTCCTGAAACCGCTCCAGCTGCAATCCCTGAGACCAAAAGAAACGCAGAGTTCCTCACCTGTAATATACCCACATCAAATGCCTCAAATAACATGGTAACCACAGAAAAAGTGGAGAATGGGCAGGAACCTGTCATAAAGTTAGAAAACAGGCAAGAGGCCAGACCAGAACCAGCAAGACTGAAACCACCTGTTCATTACAATGGCCCCTCAAAAGCAGGGTATGTTGACTTTGAAAATGGCCAGTGGGCCACAGATGACATCCCAGATGACTTGAATAGTATCCGCGCAGCACCAGGTGAGTTTCGAGCCATCATGGAGATGCCCTCCTTCTACAGTCATGGCTTGCCACGGTGTTCACCCTACAAGAAACTGACAGAGTGCCAGCTGAAGAACCCCATCAGCGGGCTGTTAGAATATGCCCAGTTCGCTAGTCAAACCTGTGAGTTCAACATGATAGAGCAGAGTGGACCACCCCATGAACCTCGATTTAAATTCCAGGTTGTCATCAATGGCCGAGAGTTTCCCCCAGCTGAAGCTGGAAGCAAGAAAGTGGCCAAGCAGGATGCAGCTATGAAAGCCATGACAATTCTGCTAGAGGAAGCCAAAGCCAAGGACAGTGGAAAATCAGAAGAATCATCCCACTATTCCACAGAGAAAGAATCAGAGAAGACTGCAGAGTCCCAGACCCCCACCCCTTCAGCCACATCCTTCTTTTCTGGGAAGAGCCCCGTCACCACACTGCTTGAGTGTATGCACAAATTGGGGAACTCCTGCGAATTCCGTCTCCTGTCCAAAGAAGGCCCTGCCCATGAACCCAAGTTCCAATACTGTGTTGCAGTGGGAGCCCAAACTTTCCCCAGTGTGAGTGCTCCCAGCAAGAAAGTGGCAAAGCAGATGGCCGCAGAGGAAGCCATGAAGGCCCTGCATGGGGAGGCGACCAACTCCATGGCTTCTGATAACCAGCCTGAAGGTATGATCTCAGAGTCACTTGATAACTTGGAATCCATGATGCCCAACAAGGTCAGGAAGATTGGCGAGCTCGTGAGATACCTGAACACCAACCCTGTGGGTGGCCTTTTGGAGTACGCCCGCTCCCATGGCTTTGCTGCTGAATTCAAGTTGGTCGACCAGTCCGGACCTCCTCACGAGCCCAAGTTCGTTTACCAAGCAAAAGTTGGGGGTCGCTGGTTCCCAGCCGTCTGCGCACACAGCAAGAAGCAAGGCAAGCAGGAAGCAGCAGATGCGGCTCTCCGTGTCTTGATTGGGGAGAACGAGAAGGCAGAACGCATGGGTTTCACAGAGGTAACCCCAGTGACAGGGGCCAGTCTCAGAAGAACTATGCTCCTCCTCTCAAGGTCCCCAGAAGCACAGCCAAAGACACTCCCTCTCACTGGCAGCACCTTCCATGACCAGATAGCCATGCTGAGCCACCGGTGCTTCAACACTCTGACTAACAGCTTCCAGCCCTCCTTGCTCGGCCGCAAGATTCTGGCCGCCATCATTATGAAAAAAGACTCTGAGGACATGGGTGTCGTCGTCAGCTTGGGAACAGGGAATCGCTGTGTAAAAGGAGATTCTCTCAGCCTAAAAGGAGAAACTGTCAATGACTGCCATGCAGAAATAATCTCCCGGAGAGGCTTCATCAGGTTTCTCTACAGTGAGTTAATGAAATACAACTCCCAGACTGCGAAGGATAGTATATTTGAACCTGCTAAGGGAGGAGAAAAGCTCCAAATAAAAAAGACTGTGTCATTCCATCTGTATATCAGCACTGCTCCGTGTGGAGATGGCGCCCTCTTTGACAAGTCCTGCAGCGACCGTGCTATGGAAAGCACAGAATCCCGCCACTACCCTGTCTTCGAGAATCCCAAACAAGGAAAGCTCCGCACCAAGGTGGAGAACGGAGAAGGCACAATCCCTGTGGAATCCAGTGACATTGTGCCTACGTGGGATGGCATTCGGCTCGGGGAGAGACTCCGTACCATGTCCTGTAGTGACAAAATCCTACGCTGGAACGTGCTGGGCCTGCAAGGGGCACTGTTGACCCACTTCCTGCAGCCCATTTATCTCAAATCTGTCACATTGGGTTACCTTTTCAGCCAAGGGCATCTGACCCGTGCTATTTGCTGTCGTGTGACAAGAGATGGGAGTGCATTTGAGGATGGACTACGACATCCCTTTATTGTCAACCACCCCAAGGTTGGCAGAGTCAGCATATATGATTCCAAAAGGCAATCCGGGAAGACTAAGGAGACAAGCGTCAACTGGTGTCTGGCTGATGGCTATGACCTGGAGATCCTGGACGGTACCAGAGGCACTGTGGATGGGCCACGGAATGAATTGTCCCGGGTCTCCAAAAAGAACATTTTTCTTCTATTTAAGAAGCTCTGCTCCTTCCGTTACCGCAGGGATCTACTGAGACTCTCCTATGGTGAGGCCAAGAAAGCTGCCCGTGACTACGAGACGGCCAAGAACTACTTCAAAAAAGGCCTGAAGGATATGGGCTATGGGAACTGGATTAGCAAACCCCAGGAGGAAAAGAACTTTTATCTCTGCCCAGTA GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ) TAG-3’ (配列番号333)
ADAR2 cDNA
5’-ATGGATATAGAAGATGAAGAAAACATGAGTTCCAGCAGCACTGATGTGAAGGAAAACCGCAATCTGGACAACGTGTCCCCCAAGGATGGCAGCACACCTGGGCCTGGCGAGGGCTCTCAGCTCTCCAATGGGGGTGGTGGTGGCCCCGGCAGAAAGCGGCCCCTGGAGGAGGGCAGCAATGGCCACTCCAAGTACCGCCTGAAGAAAAGGAGGAAAACACCAGGGCCCGTCCTCCCCAAGAACGCCCTGATGCAGCTGAATGAGATCAAGCCTGGTTTGCAGTACACACTCCTGTCCCAGACTGGGCCCGTGCACGCGCCTTTGTTTGTCATGTCTGTGGAGGTGAATGGCCAGGTTTTTGAGGGCTCTGGTCCCACAAAGAAAAAGGCAAAACTCCATGCTGCTGAGAAGGCCTTGAGGTCTTTCGTTCAGTTTCCTAATGCCTCTGAGGCCCACCTGGCCATGGGGAGGACCCTGTCTGTCAACACGGACTTCACATCTGACCAGGCCGACTTCCCTGACACGCTCTTCAATGGTTTTGAAACTCCTGACAAGGCGGAGCCTCCCTTTTACGTGGGCTCCAATGGGGATGACTCCTTCAGTTCCAGCGGGGACCTCAGCTTGTCTGCTTCCCCGGTGCCTGCCAGCCTAGCCCAGCCTCCTCTCCCTGCCTTACCACCATTCCCACCCCCGAGTGGGAAGAATCCCGTGATGATCTTGAACGAACTGCGCCCAGGACTCAAGTATGACTTCCTCTCCGAGAGCGGGGAGAGCCATGCCAAGAGCTTCGTCATGTCTGTGGTCGTGGATGGTCAGTTCTTTGAAGGCTCGGGGAGAAACAAGAAGCTTGCCAAGGCCCGGGCTGCGCAGTCTGCCCTGGCCGCCATTTTTAACTTGCACTTGGATCAGACGCCATCTCGCCAGCCTATTCCCAGTGAGGGTCTTCAGCTGCATTTACCGCAGGTTTTAGCTGACGCTGTCTCACGCCTGGTCCTGGGTAAGTTTGGTGACCTGACCGACAACTTCTCCTCCCCTCACGCTCGCAGAAAAGTGCTGGCTGGAGTCGTCATGACAACAGGCACAGATGTTAAAGATGCCAAGGTGATAAGTGTTTCTACAGGAACAAAATGTATTAATGGTGAATACATGAGTGATCGTGGCCTTGCATTAAATGACTGCCATGCAGAAATAATATCTCGGAGATCCTTGCTCAGATTTCTTTATACACAACTTGAGCTTTACTTAAATAACAAAGATGATCAAAAAAGATCCATCTTTCAGAAATCAGAGCGAGGGGGGTTTAGGCTGAAGGAGAATGTCCAGTTTCATCTGTACATCAGCACCTCTCCCTGTGGAGATGCCAGAATCTTCTCACCACATGAGCCAATCCTGGAAGAACCAGCAGATAGACACCCAAATCGTAAAGCAAGAGGACAGCTACGGACCAAAATAGAGTCTGGTGAGGGGACGATTCCAGTGCGCTCCAATGCGAGCATCCAAACGTGGGACGGGGTGCTGCAAGGGGAGCGGCTGCTCACCATGTCCTGCAGTGACAAGATTGCACGCTGGAACGTGGTGGGCATCCAGGGATCCCTGCTCAGCATTTTCGTGGAGCCCATTTACTTCTCGAGCATCATCCTGGGCAGCCTTTACCACGGGGACCACCTTTCCAGGGCCATGTACCAGCGGATCTCCAACATAGAGGACCTGCCACCTCTCTACACCCTCAACAAGCCTTTGCTCAGTGGCATCAGCAATGCAGAAGCACGGCAGCCAGGGAAGGCCCCCAACTTCAGTGTCAACTGGACGGTAGGCGACTCCGCTATTGAGGTCATCAACGCCACGACTGGGAAGGATGAGCTGGGCCGCGCGTCCCGCCTGTGTAAGCACGCGTTGTACTGTCGCTGGATGCGTGTGCACGGCAAGGTTCCCTCCCACTTACTACGCTCCAAGATTACCAAACCCAACGTGTACCATGAGTCCAAGCTGGCGGCAAAGGAGTACCAGGCCGCCAAGGCGCGTCTGTTCACAGCCTTCATCAAGGCGGGGCTGGGGGCCTGGGTGGAGAAGCCCACCGAGCAGGACCAGTTCTCACTCACGCCC GATTACAAGGATGACGACGATAAG(標記タグ)TAG-3’ (配列番号334)
疾患関連遺伝子のコード配列（CDS）
COL3A1
5’-atgatgagctttgtgcaaaaggggagctggctacttctcgctctgcttcatcccactattattttggcacaacaggaagctgttgaaggaggatgttcccatcttggtcagtcctatgcggatagagatgtctggaagccagaaccatgccaaatatgtgtctgtgactcaggatccgttctctgcgatgacataatatgtgacgatcaagaattagactgccccaacccagaaattccatttggagaatgttgtgcagtttgcccacagcctccaactgctcctactcgccctcctaatggtcaaggacctcaaggccccaagggagatccaggccctcctggtattcctgggagaaatggtgaccctggtattccaggacaaccagggtcccctggttctcctggcccccctggaatctgtgaatcatgccctactggtcctcagaactattctccccagtatgattcatatgatgtcaagtctggagtagcagtaggaggactcgcaggctatcctggaccagctggccccccaggccctcccggtccccctggtacatctggtcatcctggttcccctggatctccaggataccaaggaccccctggtgaacctgggcaagctggtccttcaggccctccaggacctcctggtgctataggtccatctggtcctgctggaaaagatggagaatcaggtagacccggacgacctggagagcgaggattgcctggacctccaggtatcaaaggtccagctgggatacctggattccctggtatgaaaggacacagaggcttcgatggacgaaatggagaaaagggtgaaacaggtgctcctggattaaagggtgaaaatggtcttccaggcgaaaatggagctcctggacccatgggtccaagaggggctcctggtgagcgaggacggccaggacttcctggggctgcaggtgctcggggtaatgacggtgctcgaggcagtgatggtcaaccaggccctcctggtcctcctggaactgccggattccctggatcccctggtgctaagggtgaagttggacctgcagggtctcctggttcaaatggtgcccctggacaaagaggagaacctggacctcagggacacgctggtgctcaaggtcctcctggccctcctgggattaatggtagtcctggtggtaaaggcgaaatgggtcccgctggcattcctggagctcctggactgatgggagcccggggtcctccaggaccagccggtgctaatggtgctcctggactgcgaggtggtgcaggtgagcctggtaagaatggtgccaaaggagagcccggaccacgtggtgaacgcggtgaggctggtattccaggtgttccaggagctaaaggcgaagatggcaaggatggatcacctggagaacctggtgcaaatgggcttccaggagctgcaggagaaaggggtgcccctgggttccgaggacctgctggaccaaatggcatcccaggagaaaagggtcctgctggagagcgtggtgctccaggccctgcagggcccagaggagctgctggagaacctggcagagatggcgtccctggaggtccaggaatgaggggcatgcccggaagtccaggaggaccaggaagtgatgggaaaccagggcctcccggaagtcaaggagaaagtggtcgaccaggtcctcctgggccatctggtccccgaggtcagcctggtgtcatgggcttccccggtcctaaaggaaatgatggtgctcctggtaagaatggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaaggattacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccggtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggccccaggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgctggtactcctggtctgcaaggaatgcctggagaaagaggaggtcttggaagtcctggtccaaagggtgacaagggtgaaccaggcggtccaggtgctgatggtgtcccagggaaagatggcccaaggggtcctactggtcctattggtcctcctggcccagctggccagcctggagataagggtgaaggtggtgcccccggacttccaggtatagctggacctcgtggtagccctggtgagagaggtgaaactggccctccaggacctgctggtttccctggtgctcctggacagaatggtgaacctggtggtaaaggagaaagaggggctccgggtgagaaaggtgaaggaggccctcctggagttgcaggaccccctggaggttctggacctgctggtcctcctggtccccaaggtgtcaaaggtgaacgtggcagtcctggtggacctggtgctgctggcttccctggtgctcgtggtcttcctggtcctcctggtagtaatggtaacccaggacccccaggtcccagcggttctccaggcaaggatgggcccccaggtcctgcgggtaacactggtgctcctggcagccctggagtgtctggaccaaaaggtgatgctggccaaccaggagagaagggatcgcctggtgcccagggcccaccaggagctccaggcccacttgggattgctgggatcactggagcacggggtcttgcaggaccaccaggcatgccaggtcctaggggaagccctggccctcagggtgtcaagggtgaaagtgggaaaccaggagctaacggtctcagtggagaacgtggtccccctggaccccagggtcttcctggtctggctggtacagctggtgaacctggaagagatggaaaccctggatcagatggtcttccaggccgagatggatctcctggtggcaagggtgatcgtggtgaaaatggctctcctggtgcccctggcgctcctggtcatccaggcccacctggtcctgtcggtccagctggaaagagtggtgacagaggagaaagtggccctgctggccctgctggtgctcccggtcctgctggttcccgaggtgctcctggtcctcaaggcccacgtggtgacaaaggtgaaacaggtgaacgtggagctgctggcatcaaaggacatcgaggattccctggtaatccaggtgccccaggttctccaggccctgctggtcagcagggtgcaatcggcagtccaggacctgcaggccccagaggacctgttggacccagtggacctcctggcaaagatggaaccagtggacatccaggtcccattggaccaccagggcctcgaggtaacagaggtgaaagaggatctgagggctccccaggccacccagggcaaccaggccctcctggacctcctggtgcccctggtccttgctgtggtggtgttggagccgctgccattgctgggattggaggtgaaaaagctggcggttttgccccgtattatggagatgaaccaatggatttcaaaatcaacaccgatgagattatgacttcactcaagtctgttaatggacaaatagaaagcctcattagtcctgatggttctcgtaaaaaccccgctagaaactgcagagacctgaaattctgccatcctgaactcaagagtggagaatactgggttgaccctaaccaaggatgcaaattggatgctatcaaggtattctgtaatatggaaactggggaaacatgcataagtgccaatcctttgaatgttccacggaaacactggtggacagattctagtgctgagaagaaacacgtttggtttggagagtccatggatggtggttttcagtttagctacggcaatcctgaacttcctgaagatgtccttgatgtgcagctggcattccttcgacttctctccagccgagcttcccagaacatcacatatcactgcaaaaatagcattgcatacatggatcaggccagtggaaatgtaaagaaggccctgaagctgatggggtcaaatgaaggtgaattcaaggctgaaggaaatagcaaattcacctacacagttctggaggatggttgcacgaaacacactggggaatggagcaaaacagtctttgaatatcgaacacgcaaggctgtgagactacctattgtagatattgcaccctatgacattggtggtcctgatcaagaatttggtgtggacgttggccctgtttgctttttataa-3’ (配列番号335)
BMPR2
5’-atgacttcctcgctgcagcggccctggcgggtgccctggctaccatggaccatcctgctggtcagcgctgcggctgcttcgcagaatcaagaacggctatgtgcgtttaaagatccgtatcagcaagaccttgggataggtgagagtagaatctctcatgaaaatgggacaatattatgctcgaaaggtagcacctgctatggcctttgggagaaatcaaaaggggacataaatcttgtaaaacaaggatgttggtctcacattggagatccccaagagtgtcactatgaagaatgtgtagtaactaccactcctccctcaattcagaatggaacataccgtttctgctgttgtagcacagatttatgtaatgtcaactttactgagaattttccacctcctgacacaacaccactcagtccacctcattcatttaaccgagatgagacaataatcattgctttggcatcagtctctgtattagctgttttgatagttgccttatgctttggatacagaatgttgacaggagaccgtaaacaaggtcttcacagtatgaacatgatggaggcagcagcatccgaaccctctcttgatctagataatctgaaactgttggagctgattggccgaggtcgatatggagcagtatataaaggctccttggatgagcgtccagttgctgtaaaagtgttttcctttgcaaaccgtcagaattttatcaacgaaaagaacatttacagagtgcctttgatggaacatgacaacattgcccgctttatagttggagatgagagagtcactgcagatggacgcatggaatatttgcttgtgatggagtactatcccaatggatctttatgcaagtatttaagtctccacacaagtgactgggtaagctcttgccgtcttgctcattctgttactagaggactggcttatcttcacacagaattaccacgaggagatcattataaacctgcaatttcccatcgagatttaaacagcagaaatgtcctagtgaaaaatgatggaacctgtgttattagtgactttggactgtccatgaggctgactggaaatagactggtgcgcccaggggaggaagataatgcagccataagcgaggttggcactatcagatatatggcaccagaagtgctagaaggagctgtgaacttgagggactgtgaatcagctttgaaacaagtagacatgtatgctcttggactaatctattgggagatatttatgagatgtacagacctcttcccaggggaatccgtaccagagtaccagatggcttttcagacagaggttggaaaccatcccacttttgaggatatgcaggttctcgtgtctagggaaaaacagagacccaagttcccagaagcctggaaagaaaatagcctggcagtgaggtcactcaaggagacaatcgaagactgttgggaccaggatgcagaggctcggcttactgcacagtgtgctgaggaaaggatggctgaacttatgatgatttgggaaagaaacaaatctgtgagcccaacagtcaatccaatgtctactgctatgcagaatgaacgcaacctgtcacataataggcgtgtgccaaaaattggtccttatccagattattcttcctcctcatacattgaagactctatccatcatactgacagcatcgtgaagaatatttcctctgagcattctatgtccagcacacctttgactataggggaaaaaaaccgaaattcaattaactatgaacgacagcaagcacaagctcgaatccccagccctgaaacaagtgtcaccagcctctccaccaacacaacaaccacaaacaccacaggactcacgccaagtactggcatgactactatatctgagatgccatacccagatgaaacaaatctgcataccacaaatgttgcacagtcaattgggccaacccctgtctgcttacagctgacagaagaagacttggaaaccaacaagctagacccaaaagaagttgataagaacctcaaggaaagctctgatgagaatctcatggagcactctcttaaacagttcagtggcccagacccactgagcagtactagttctagcttgctttacccactcataaaacttgcagtagaagcaactggacagcaggacttcacacagactgcaaatggccaagcatgtttgattcctgatgttctgcctactcagatctatcctctccccaagcagcagaaccttcccaagagacctactagtttgcctttgaacaccaaaaattcaacaaaagagccccggctaaaatttggcagcaagcacaaatcaaacttgaaacaagtcgaaactggagttgccaagatgaatacaatcaatgcagcagaacctcatgtggtgacagtcaccatgaatggtgtggcaggtagaaaccacagtgttaactcccatgctgccacaacccaatatgccaatgggacagtactatctggccaaacaaccaacatagtgacacatagggcccaagaaatgttgcagaatcagtttattggtgaggacacccggctgaatattaattccagtcctgatgagcatgagcctttactgagacgagagcaacaagctggccatgatgaaggtgttctggatcgtcttgtggacaggagggaacggccactagaaggtggccgaactaattccaataacaacaacagcaatccatgttcagaacaagatgttcttgcacagggtgttccaagcacagcagcagatcctgggccatcaaagcccagaagagcacagaggcctaattctctggatctttcagccacaaatgtcctggatggcagcagtatacagataggtgagtcaacacaagatggcaaatcaggatcaggtgaaaagatcaagaaacgtgtgaaaactccctattctcttaagcggtggcgcccctccacctgggtcatctccactgaatcgctggactgtgaagtcaacaataatggcagtaacagggcagttcattccaaatccagcactgctgtttaccttgcagaaggaggcactgctacaaccatggtgtctaaagatataggaatgaactgtctgtga-3’ (配列番号336)
AHI1
5’-atgcctacagctgagagtgaagcaaaagtaaaaaccaaagttcgctttgaagaattgcttaagacccacagtgatctaatgcgtgaaaagaaaaaactgaagaaaaaacttgtcaggtctgaagaaaacatctcacctgacactattagaagcaatcttcactatatgaaagaaactacaagtgatgatcccgacactattagaagcaatcttccccatattaaagaaactacaagtgatgatgtaagtgctgctaacactaacaacctgaagaagagcacgagagtcactaaaaacaaattgaggaacacacagttagcaactgaaaatcctaatggtgatgctagtgtagaggaagacaaacaaggaaagccaaataaaaaggtgataaagacggtgccccagttgactacacaagacctgaaaccggaaactcctgagaataaggttgattctacacaccagaaaacacatacaaagccacagccaggcgttgatcatcagaaaagtgagaaggcaaatgagggaagagaagagactgatttagaagaggatgaagaattgatgcaagcatatcagtgccatgtaactgaagaaatggcaaaggagattaagaggaaaataagaaagaaactgaaagaacagttgacttactttccctcagatactttattccatgatgacaaactaagcagtgaaaaaaggaaaaagaaaaaggaagttccagtcttctctaaagctgaaacaagtacattgaccatctctggtgacacagttgaaggtgaacaaaagaaagaatcttcagttagatcagtttcttcagattctcatcaagatgatgaaataagctcaatggaacaaagcacagaagacagcatgcaagatgatacaaaacctaaaccaaaaaaaacaaaaaagaagactaaagcagttgcagataataatgaagatgttgatggtgatggtgttcatgaaataacaagccgagatagcccggtttatcccaaatgtttgcttgatgatgaccttgtcttgggagtttacattcaccgaactgatagacttaagtcagattttatgatttctcacccaatggtaaaaattcatgtggttgatgagcatactggtcaatatgtcaagaaagatgatagtggacggcctgtttcatcttactatgaaaaagagaatgtggattatattcttcctattatgacccagccatatgattttaaacagttaaaatcaagacttccagagtgggaagaacaaattgtatttaatgaaaattttccctatttgcttcgaggctctgatgagagtcctaaagtcatcctgttctttgagattcttgatttcttaagcgtggatgaaattaagaataattctgaggttcaaaaccaagaatgtggctttcggaaaattgcctgggcatttcttaagcttctgggagccaatggaaatgcaaacatcaactcaaaacttcgcttgcagctatattacccacctactaagcctcgatccccattaagtgttgttgaggcatttgaatggtggtcaaaatgtccaagaaatcattacccatcaacactgtacgtaactgtaagaggactgaaagttccagactgtataaagccatcttaccgctctatgatggctcttcaggaggaaaaaggtaaaccagtgcattgtgaacgtcaccatgagtcaagctcagtagacacagaacctggattagaagagtcaaaggaagtaataaagtggaaacgactccctgggcaggcttgccgtatcccaaacaaacacctcttctcactaaatgcaggagaacgaggatgtttttgtcttgatttctcccacaatggaagaatattagcagcagcttgtgccagccgggatggatatccaattattttatatgaaattccttctggacgtttcatgagagaattgtgtggccacctcaatatcatttatgatctttcctggtcaaaagatgatcactacatccttacttcatcatctgatggcactgccaggatatggaaaaatgaaataaacaatacaaatactttcagagttttacctcatccttcttttgtttacacggctaaattccatccagctgtaagagagctagtagttacaggatgctatgattccatgatacggatatggaaagttgagatgagagaagattctgccatattggtccgacagtttgacgttcacaaaagttttatcaactcactttgttttgatactgaaggtcatcatatgtattcaggagattgtacaggggtgattgttgtttggaatacctatgtcaagattaatgatttggaacattcagtgcaccactggactataaataaggaaattaaagaaactgagtttaagggaattccaataagttatttggagattcatcccaatggaaaacgtttgttaatccataccaaagacagtactttgagaattatggatctccggatattagtagcaaggaagtttgtaggagcagcaaattatcgggagaagattcatagtactttgactccatgtgggacttttctgtttgctggaagtgaggatggtatagtgtatgtttggaacccagaaacaggagaacaagtagccatgtattctgacttgccattcaagtcacccattcgagacatttcttatcatccatttgaaaatatggttgcattctgtgcatttgggcaaaatgagccaattcttctgtatatttacgatttccatgttgcccagcaggaggctgaaatgttcaaacgctacaatggaacatttccattacctggaatacaccaaagtcaagatgccctatgtacctgtccaaaactaccccatcaaggctcttttcagattgatgaatttgtccacactgaaagttcttcaacgaagatgcagctagtaaaacagaggcttgaaactgtcacagaggtgatacgttcctgtgctgcaaaagtcaacaaaaatctctcatttacttcaccaccagcagtttcctcacaacagtctaagttaaagcagtcaaacatgctgaccgctcaagagattctacatcagtttggtttcactcagaccgggattatcagcatagaaagaaagccttgtaaccatcaggtagatacagcaccaacggtagtggctctttatgactacacagcgaatcgatcagatgaactaaccatccatcgcggagacattatccgagtgtttttcaaagataatgaagactggtggtatggcagcataggaaagggacaggaaggttattttccagctaatcatgtggctagtgaaacactgtatcaagaactgcctcctgagataaaggagcgatcccctcctttaagccctgaggaaaaaactaaaatagaaaaatctccagctcctcaaaagcaatcaatcaataagaacaagtcccaggacttcagactaggctcagaatctatgacacattctgaaatgagaaaagaacagagccatgaggaccaaggacacataatggatacacggatgaggaagaacaagcaagcaggcagaaaagtcactctaatagagta-3’ (配列番号337)
FANCC
5’-atggctcaagattcagtagatctttcttgtgattatcagttttggatgcagaagctttctgtatgggatcaggcttccactttggaaacccagcaagacacctgtcttcacgtggctcagttccaggagttcctaaggaagatgtatgaagccttgaaagagatggattctaatacagtcattgaaagattccccacaattggtcaactgttggcaaaagcttgttggaatccttttattttagcatatgatgaaagccaaaaaattctaatatggtgcttatgttgtctaattaacaaagaaccacagaattctggacaatcaaaacttaactcctggatacagggtgtattatctcatatactttcagcactcagatttgataaagaagttgctcttttcactcaaggtcttgggtatgcacctatagattactatcctggtttgcttaaaaatatggttttatcattagcgtctgaactcagagagaatcatcttaatggatttaacactcaaaggcgaatggctcccgagcgagtggcgtccctgtcacgagtttgtgtcccacttattaccctgacagatgttgaccccctggtggaggctctcctcatctgtcatggacgtgaacctcaggaaatcctccagccagagttctttgaggctgtaaacgaggccattttgctgaagaagatttctctccccatgtcagctgtagtctgcctctggcttcggcaccttcccagccttgaaaaagcaatgctgcatctttttgaaaagctaatctccagtgagagaaattgtctgagaaggatcgaatgctttataaaagattcatcgctgcctcaagcagcctgccaccctgccatattccgggttgttgatgagatgttcaggtgtgcactcctggaaaccgatggggccctggaaatcatagccactattcaggtgtttacgcagtgctttgtagaagctctggagaaagcaagcaagcagctgcggtttgcactcaagacctactttccttacacttctccatctcttgccatggtgctgctgcaagaccctcaagatatccctcggggacactggctccagacactgaagcatatttctgaactgctcagagaagcagttgaagaccagactcatgggtcctgcggaggtccctttgagagctggttcctgttcattcacttcggaggatgggctgagatggtggcagagcaattactgatgtcggcagccgaaccccccacggccctgctgtggctcttggccttctactacggcccccgtgatgggaggcagcagagagcacagactatggtccaggtgaaggccgtgctgggccacctcctggcaatgtccagaagcagcagcctctcagcccaggacctgcagacggtagcaggacagggcacagacacagacctcagagctcctgcacaacagctgatcaggcaccttctcctcaacttcctgctctgggctcctggaggccacacgatcgcctgggatgtcatcaccctgatggctcacactgctgagataactcacgagatcattggctttcttgaccagaccttgtacagatggaatcgtcttggcattgaaagccctagatcagaaaaactggcccgagagctccttaaagagctgcgaactcaagtctag-3’ (配列番号338)
MYBPC3
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IL2RG
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討論
ゲノム編集技術は生物医学研究を徹底的に変えている。ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（非特許文献１）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）（非特許文献２－４）、およびＣＲＩＳＰＲのＣａｓタンパク質（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）システム（非特許文献５－７）などの高活性ヌクレアーゼは、無数の生物のゲノムを操縦するように成功裏に操作された。最近、デアミナーゼは、二本鎖ＤＮＡを破壊することなく遺伝暗号を正確に変更するために利用されている。シチジンまたはアデノシンデアミナーゼをＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９システムと結合することにより、研究者は、ゲノムＤＮＡ中のＣ・ＧからＴ・ＡまたはＡ・ＴからＧ・Ｃへの変換（非特許文献８－１０）を可能にするプログラム可能な塩基編集器を作製し、致病変異の修正の新しい機会を提供する。
ＲＮＡ修飾がゲノムに永続的な変化をもたらすことなくタンパク質の機能を変化させることができるため、ＤＮＡの他に、ＲＮＡは遺伝子修正に使用される注目される標的である。現在、ＡＤＡＲアデノシンデアミナーゼは、ＲＮＡの正確な塩基編集を実現するために利用されている。哺乳類では、ＡＤＡＲ１（アイソフォームｐ１１０およびｐ１５０）、ＡＤＡＲ２およびＡＤＡＲ３（触媒不活性）（非特許文献１１、１２）の３種類のＡＤＡＲタンパク質が同定されており、その基質は二本鎖ＲＮＡであり、シトシン（Ｃ）とミスマッチするアデノシン（Ａ）は優先的にイノシン（Ｉ）に脱アミノ化される。イノシンは、翻訳中にグアノシン（Ｇ）を模倣できると考えられている（非特許文献１３、１４）。標的ＲＮＡ編集を実現するために、ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインをλＮペプチド（非特許文献１５－１７）、ＳＮＡＰ－ｔａｇ（非特許文献１８－２２）またはＣａｓタンパク質（ｄＣａｓ１３ｂ）（非特許文献２３）と融合させ、キメラＡＤＡＲタンパク質を特定の部位に動員するガイドＲＮＡが設計された。あるいは、過剰発現されたＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２タンパク質をＲ／Ｇモチーフを持つガイドＲＮＡと一緒に標的ＲＮＡの編集を実現することができることも報告されている（非特許文献２４－２７）。
哺乳類のシステムで報告されているこれらすべての核酸編集方法は、酵素とガイドＲＮＡの２つの成分の異所性発現に依存している。これらのバイナリシステムはほとんどの研究で効率的に機能するが、いくつかの固有の障害が、それらの幅広い使用、特に治療における使用を制限する。遺伝子治療のための最も効果的なインビボ送達はウイルスベクター（非特許文献２８）によるものであり、非常に望ましいアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターは荷重サイズ（～４．５ｋｂ）に制限されているため、タンパク質とガイドＲＮＡの両方を収容するのはチャレンジである（非特許文献２９、３０）。ＡＤＡＲ１の過剰発現は、ＲＮＡの異常な過剰編集により多発性骨髄腫に発癌性を与え（非特許文献３１）、大量なグローバルなオフターゲティング編集を生成することが最近報告されている（非特許文献３２）。さらに、タンパク質またはヒト以外に由来するドメインの異所性発現は、免疫原性を誘発する潜在的なリスクを持っている（非特許文献３０、３３）。また、既存の適応免疫とｐ５３を介したＤＮＡ損傷応答は、Ｃａｓ９（非特許文献３４－３８）などの治療用タンパク質の有効性を損なう可能性がある。ＲＮＡ編集に内因性メカニズムを利用することが試みられたが、これは、事前に組み立てられた標的転写物であるＲＮＡ二重鎖をＸｅｎｏｐｕｓ胚に注入することによってのみ試みられた（非特許文献３９）。タンパク質の異所性発現に依存しない、堅牢な核酸編集のための代替技術が非常に必要とされている。ここでは、ＲＮＡ編集のために内因性ＡＤＡＲを活用する新しいアプローチを開発した。意図的に設計されたガイドＲＮＡを発現させることにより、内因性ＲＮＡの効率的かつ正確な編集が可能になり、病原性変異が修正されることを示した。この単一核酸編集プラットフォームは、治療と研究のための新しい道を開くことができる。
特に、十分な長さの線形ａｒＲＮＡの発現は、内因性ＡＤＡＲタンパク質を誘導して、標的転写物上のアデノシンをイノシンに編集できることを示した。ＬＥＡＰＥＲと呼ばれるこのシステムは、内因性ＡＤＡＲタンパク質を利用して、プログラム可能な核酸編集を実現するため、既存の方法と比べて優勢がある。
ＬＥＡＰＥＲは、ＲＮＡ編集のために小さいＲＮＡ分子のみに依存して内因性タンパク質をガイドするため、その珍しい品質が簡単さである。これはＲＮＡｉを想到させ、小さいｄｓＲＮＡが標的ＲＮＡ分解のネイティブメカニズムを引き起こすことができる（非特許文献５１）。サイズが小さいため、ａｒＲＮＡはさまざまなウイルスおよび非ウイルスビヒクルによって容易に送達できる。ＲＮＡｉとは異なり、ＬＥＡＰＥＲは、標的となる転写産物の切断や分解を引き起こすことなく、正確なＡからＩへの変換を触媒する（図１８Ａ）。ａｒＲＮＡの必要な長さはＲＮＡｉよりも長いであるが、細胞レベルで免疫刺激効果を誘発することもなく（図２２Ｅ、Ｆおよび図２９Ｅ）、内因性ＡＤＡＲタンパク質の機能に影響を与えることもなく（図２２Ａ、Ｂ）、ＲＮＡターゲティングのための安全な戦略となる。注目すべきことに、ＡＤＡＲタンパク質またはその触媒ドメインの異所性発現は、大量なグローバルなオフターゲット編集を誘発し（非特許文献３２）、癌を誘発する可能性があることが報告されている（非特許文献３１）。
最近、いくつかの研究グループが、エフェクタータンパク質の発現により、シトシン塩基編集器がマウス胚、イネ、またはヒト細胞株で大量なオフターゲット単一塩基変異体を生成する可能性があることを報告した。これは、潜在的な治療用途におけるＬＥＡＰＥＲの利点を示している（非特許文献５２－５４）。喜ばしいことに、ＬＥＡＰＥＲは効率的な編集を可能にし、まれなグローバルなオフターゲット編集を引き出す（図２０および図２１）。さらに、ＬＥＡＰＥＲは、潜在的な免疫原性を最小限に抑えるか、外来タンパク質の導入を必要とする他の方法で一般的に存在する送達の障害を克服することができる。
ＬＥＡＰＥＲの場合、望ましい活性を達成するために、最小サイズが７０ｎｔを超えるａｒＲＮＡを使用することを勧める。自然環境では、ＡＤＡＲタンパク質は３００－ｎｔ以上の二重鎖を持つＡｌｕリピートを非特異的に編集する（非特許文献５５）。注目すべきことに、Ａｌｕリピートは安定した分子内二重鎖を形成するが、ＬＥＡＰＥＲはａｒＲＮＡとｍＲＮＡまたはｐｒｅ－ｍＲＮＡの間に分子間二重鎖をもたらす。これは安定性が低く、形成がより困難であると考えられている。したがって、７０ｎｔより長いＲＮＡ二重鎖は、効果的な編集のためにＡＤＡＲタンパク質を動員またはドッキングするために化学量論的に重要であると仮定した。実際、より長いａｒＲＮＡは、異所的に発現されたレポーターと内因性転写物の両方でより高い編集収率をもたらした（図１６Ｄおよび図１７Ｂ）。ただし、ＡＤＡＲタンパク質はＲＮＡ二重鎖のアデノシン塩基を乱雑に脱アミ化するため、ａｒＲＮＡが長いほど、ターゲティングウィンドウ内でより多くのオフターゲットが発生する可能性がある。
ＬＥＡＰＥＲはネイティブの転写物を効果的に標的にすることができたが、編集効率とオフターゲット率はさまざまであった。ＰＰＩＢ転写物ターゲティングの場合、カバーウィンドウ内に明らかなオフターゲットがなくても、標的アデノシンの５０％をイノシンに変換できる（図１７Ｂ、Ｆ）。オフターゲットは、他の転写物ではより深刻になった。Ａ－Ｇミスマッチや連続ミスマッチを導入して不要な編集を抑制するなど、オフターゲットを減らすことができた。ただし、ミスマッチが多すぎると、オンターゲットの効率が低下する可能性がある。効率と潜在的なオフターゲットを考慮すると、内因性転写産物の編集には、長さが１００～１５０ｎｔの範囲のａｒＲＮＡの使用を勧める。選択肢がある場合は、不要な編集の可能性を最小限に抑えるために、アデノシンの少ない領域を選択することを勧める。心強いことに、ａｒＲＮＡを標的とする転写二重鎖以外のオフターゲットは検出されなかった（図２０）。
ａｒＲＮＡの設計を最適化して編集効率を向上させ、ＬＥＡＰＥＲを利用して遺伝子機能を操作したり病原性変異を修正したりできることを実証した。また、ＬＥＡＰＥＲはＵＡＧでのみ機能するだけでなく、隣接するヌクレオチドに関係なく、任意のアデノシンと一緒に使用できることも示した（図１６Ｆ、Ｇ、および図１７Ｃ）。このような柔軟性は、特定の単一点突然変異によって引き起こされる遺伝病の潜在的な治療的修正に有利である。興味深いことに、ＩＤＵＡ転写産物の編集では、ｐｒｅ－ｍＲＮＡを標的とするａｒＲＮＡは成熟ＲＮＡを標的とするものよりも効果的であり、核がＡＤＡＲタンパク質の主要な作用部位であり、ＬＥＡＰＥＲを利用してｐｒｅ－ｍＲＮＡ内のスプライシング部位を修飾することでスプライシングを操作できることを示している。さらに重要なのは、ＬＥＡＰＥＲは、複数の遺伝子転写産物を同時に標的とする高い効率を示している（図１７Ｄ）。ＬＥＡＰＥＲのこの多重化機能は、将来、特定の多遺伝子性疾患を治療するために開発される可能性がある。
ＲＮＡレベルで遺伝子修正を行うことは有益である。第一に、標的転写物を編集しても、ゲノムまたはトランスクリプトームのレパートリー（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）が恒久的に変化することはなく、ＲＮＡ編集法はゲノム編集法よりも治療に安全に使用される。さらに、一時的な編集は、特定の状態のまれの変化によって引き起こされる疾患の一時的な制御及び治療に非常に適している。第二に、ＬＥＡＰＥＲおよび他のＲＮＡ編集方法はゲノムにＤＳＢを導入せず、大きなＤＮＡフラグメントの望ましくない欠失を生成するリスクを回避する（非特許文献３７）。ニッカーゼＣａｓ９を採用したＤＮＡ塩基編集法は、依然としてゲノムに挿入欠失を生成する可能性がある（非特許文献８）。さらに、ネイティブＤＮＡ修復メカニズムとは独立して、ＬＥＡＰＥＲはＡＤＡＲ２の高発現を伴う小脳細胞などの有糸分裂後の細胞でも機能するはずである（非特許文献１１）。
ＬＥＡＰＥＲは、ヒト細胞株（図１４Ｃ）、マウス細胞株（図１４Ｄ）、および初代Ｔ細胞を含むヒト初代細胞（図２７および図２８Ｄ）などの幅広い細胞タイプに適用できることを実証した。レンチウイルスデリバリーまたは合成オリゴによる効率的な編集により、治療法開発の可能性が高まる（図２８）。さらに、ＬＥＡＰＥＲは、ｐ５３の転写調節活性の回復（図７）、病原性変異の修正（図２６）、ハーラー症候群患者由来の初代線維芽細胞のα－Ｌ－イドロニダーゼ活性の回復（図２９）など、さまざまな使用で表現型または生理学的変化を引き起こすことができる。したがって、ＬＥＡＰＥＲは疾患治療において大きな可能性を秘めていると考えられる。
Ｓｔａｆｆｏｒｓｔらは、合成アンチセンスオリゴヌクレオチドを使用して内因性ＡＤＡＲを動員することで機能する、ＲＥＳＴＯＲＥと呼ばれる新しい一見類似したＲＮＡ編集方法を報告した（非特許文献５６）。ＲＥＳＴＯＲＥとＬＥＡＰＥＲの根本的な違いは、内因性ＡＤＡＲを動員するためのガイドＲＮＡの独特な性質にある。ＲＥＳＴＯＲＥのガイドＲＮＡは、複雑な化学修飾に応じて化学合成アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）に限定されるが、ＬＥＡＰＥＲのａｒＲＮＡは、ウイルスまたは非ウイルスベクターを通じる化学合成および発現など、さまざまな方法で生成できる（図２８および図２９）。重要なのは、化学的に大幅に修飾されているため、ＡＳＯは疾患の治療で一時的に作用するしかないに対して、ａｒＲＮＡは発現によって生成されることができ、これは、絶え間ない編集を行うために特に重要な特徴である。
ＬＥＡＰＥＲの効率と特異性に関してはまだ改善の余地がある。ＬＥＡＰＥＲは内因性ＡＤＡＲに依存しているため、標的細胞におけるＡＤＡＲタンパク質の発現レベルは、編集を成功させるための決定要因の１つである。以前の報告（非特許文献５７）と我々の観察（図１４Ａ、Ｂ）によると、ＡＤＡＲ１ｐ１１０は組織全体に遍在的に発現しており、ＬＥＡＰＥＲの幅広い適用性を保証している。ＡＤＡＲ１ｐ１５０はインターフェロン誘導性アイソフォーム（非特許文献５８）であり、ＬＥＡＰＥＲで機能することが証明されている（図１１Ｅ、図１２Ｂ）。したがって、インターフェロン刺激ＲＮＡとａｒＲＮＡの同時トランスフェクションは、特定の状況下で編集効率をさらに向上させる可能性がある。あるいは、ＡＤＡＲ３が阻害的役割を果たすため、ＡＤＡＲ３の阻害は、ＡＤＡＲ３発現細胞の編集効率を高める可能性がある。さらに、ａｒＲＮＡの他の変更により、編集効率が向上する可能性がある。たとえば、特定のＡＤＡＲ動員スキャフォールドと融合したａｒＲＮＡは、局所のＡＤＡＲタンパク質濃度を増加させ、その結果、編集の収量を高める。これまでのところ、ＡからＩへの塩基変換には内因性ＡＤＡＲ１／２タンパク質しか活用できなかった。より多くのネイティブメカニズムを同様に遺伝子要素の修飾に利用できるかどうか、特に効果的な核酸編集を実現するために調査することは興味深いことである。
全体として、ＲＮＡ転写物を編集するために細胞内の内因性メカニズムを共同選択できることを証明するための原理を提供した。ＬＥＡＰＥＲはシンプルで効率的かつ安全なシステムであり、遺伝子編集に基づく治療法と研究に新しい道を開いたことを実証した。

Claims (35)

  1. インビトロで宿主細胞における標的ＲＮＡを編集する方法であって、標的ＲＮＡとハイブリダイズさせた複合体ではないｄＲＮＡ、または前記ｄＲＮＡをコードする構築体を前記宿主細胞に導入することを含み、
    前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞内で前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列と、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、
    前記シチジンまたはアデノシンのミスマッチは、前記ｄＲＮＡの５’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、前記ｄＲＮＡの３’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置し、
    前記ｄＲＮＡは７１～２６０ヌクレオチド長であり、化学的に修飾されたヌクレオチドを含まず、
    前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員することができ、
    前記ｄＲＮＡがＡＤＡＲ動員ドメインを含まない、方法。
  2. 前記ｄＲＮＡが１００～１５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載の方法。
  3. 前記ｄＲＮＡをコードする、ウイルスベクターまたはプラスミドである構築体を前記宿主細胞に導入することを含む、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記シチジンのミスマッチが、前記ｄＲＮＡの中心から１０ヌクレオチド以内に位置する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記相補的ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記相補的ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、
    前記ｄＲＮＡが、前記３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシンまたはウリジンを含む、請求項７に記載の方法。
  9. 前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、及び小さいＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、請求項１～８のいずれか一項に記載の方法。
  10. それぞれ異なる標的ＲＮＡを標的とする複数のｄＲＮＡを導入することを含む、請求項１～９のいずれか一項に記載の方法。
  11. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１～１０のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１～１１のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項１～１２のいずれか一項に記載の方法。
  14. 宿主細胞における標的ＲＮＡを編集するための医薬組成物の調製における、標的ＲＮＡとハイブリダイズさせた複合体ではないｄＲＮＡ、または前記ｄＲＮＡをコードする構築体の使用であって、
    前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞内で前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列と、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、
    前記シチジンまたはアデノシンのミスマッチは、前記ｄＲＮＡの５’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、前記ｄＲＮＡの３’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置し、
    前記ｄＲＮＡは７１～２６０ヌクレオチド長であり、化学的に修飾されたヌクレオチドを含まず、
    前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員することができ、
    前記ｄＲＮＡがＡＤＡＲ動員ドメインを含まない、使用。
  15. 前記ｄＲＮＡが１００～１５０ヌクレオチド長である、請求項１４に記載の使用。
  16. 前記シチジンのミスマッチが、前記ｄＲＮＡの中心から１０ヌクレオチド以内に位置する、請求項１４または１５に記載の使用。
  17. 前記相補的ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項１４～１６のいずれか一項に記載の使用。
  18. 前記相補的ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項１４～１７のいずれか一項に記載の使用。
  19. 前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する、請求項１４～１８のいずれか一項に記載の使用。
  20. 前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、
    前記ｄＲＮＡが、前記３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシンまたはウリジンを含む、請求項１９に記載の使用。
  21. 前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、及び小さいＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、請求項１４～２０のいずれか一項に記載の使用。
  22. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項１４～２１のいずれか一項に記載の使用。
  23. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項１４～２２のいずれか一項に記載の使用。
  24. 前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項１４～２３のいずれか一項に記載の使用。
  25. 宿主細胞における標的ＲＮＡの編集に使用するための、標的ＲＮＡとハイブリダイズさせた複合体ではないｄＲＮＡ、または前記ｄＲＮＡをコードする構築体であって、
    前記ｄＲＮＡは、前記宿主細胞内で前記標的ＲＮＡにハイブリダイズする相補的ＲＮＡ配列と、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンの真向かいのシチジンまたはアデノシンのミスマッチを含み、
    前記シチジンまたはアデノシンのミスマッチは、前記ｄＲＮＡの５’末端から少なくとも２０ヌクレオチド離れ、前記ｄＲＮＡの３’末端から少なくとも５ヌクレオチド離れて位置し、
    前記ｄＲＮＡは７１～２６０ヌクレオチド長であり、化学的に修飾されたヌクレオチドを含まず、
    前記ｄＲＮＡは、前記標的ＲＮＡ中の標的アデノシンを脱アミノ化するように、前記宿主細胞によって内因的に発現されたＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２を動員することができ、
    前記ｄＲＮＡがＡＤＡＲ動員ドメインを含まない、ｄＲＮＡまたは構築体。
  26. 前記ｄＲＮＡが１００～１５０ヌクレオチド長である、請求項２５に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  27. 前記シチジンのミスマッチが、前記ｄＲＮＡの中心から１０ヌクレオチド以内に位置する、請求項２５または２６に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  28. 前記相補的ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンのそれぞれに対向する１つ以上のグアノシンをさらに含む、請求項２５～２７のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  29. 前記相補的ＲＮＡ配列が、前記標的ＲＮＡ中の非標的アデノシンに対向する２つ以上の連続するミスマッチヌクレオチドを含む、請求項２５～２８のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  30. 前記標的ＲＮＡにおける前記標的アデノシンが、ＵＡＧ、ＵＡＣ、ＵＡＡ、ＵＡＵ、ＣＡＧ、ＣＡＣ、ＣＡＡ、ＣＡＵ、ＡＡＧ、ＡＡＣ、ＡＡＡ、ＡＡＵ、ＧＡＧ、ＧＡＣ、ＧＡＡ、及びＧＡＵからなる群より選ばれる３塩基モチーフに位置する、請求項２５～２９のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  31. 前記３塩基モチーフがＵＡＧであり、
    前記ｄＲＮＡが、前記３塩基モチーフのウリジンの真向かいのＡ、前記標的アデノシンの真向かいのシチジン、及び前記３塩基モチーフのグアノシンの真向かいのシチジン、グアノシンまたはウリジンを含む、請求項３０に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  32. 前記標的ＲＮＡが、プレメッセンジャーＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、トランスファーＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、及び小さいＲＮＡからなる群より選ばれるＲＮＡである、請求項２５～３１のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  33. 前記宿主細胞が真核細胞である、請求項２５～３２のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  34. 前記宿主細胞が哺乳動物細胞である、請求項２５～３３のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
  35. 前記宿主細胞がヒトまたはマウス細胞である、請求項２５～３４のいずれか一項に記載のｄＲＮＡまたは構築体。
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