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CN113939591A - 编辑rna的方法和组合物 - Google Patents

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CN113939591A
CN113939591A CN202080029167.4A CN202080029167A CN113939591A CN 113939591 A CN113939591 A CN 113939591A CN 202080029167 A CN202080029167 A CN 202080029167A CN 113939591 A CN113939591 A CN 113939591A
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赵艳霞
刘能银
易泽轩
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魏文胜
璩良
伊宗裔
朱诗优
王春慧
曹中正
周卓
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Beijing Jiyin Medical Technology Co ltd
Peking University
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Peking University
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Abstract

本发明提供一种通过在宿主细胞中引入脱氨酶招募RNA来编辑RNA的方法，用于使靶标RNA中的腺苷脱氨基。本申请还提供了在所述RNA编辑方法中使用的脱氨酶招募RNA，以及包含它的组合物。

Description

编辑RNA的方法和组合物
相关申请及引用并入
本申请要求于2019年4月15日提交的国际申请号为PCT/CN2019/082713的国际申请，和于2019年12月30日提交的国际申请号为PCT/CN2019/129952的国际申请的优先权。
前述申请，及其中或在其审查期间引用的所有文件(“申请引用的文件”)和申请引用的文件中引用的或提及的所有文件，以及本文中引用的或提及的所有文件(“本文引用的文件”)，以及本文引用的文件中引用的或提及的所有文件，连同本文中或通过提及并入本文的任何文件中提及的任何产品的任何制造商的说明、描述、产品规格和产品表，在此通过提及并入本文，并且可以在本发明的实践中使用。更具体地，所有参考文献以相同的程度通过提及并入，就好像每个单独的文件被具体地和单独地指示通过提及并入一样。
ASCII文本文件序列表的提交
以下以ASCII文本文件提交的内容在此通过提及以其整体并入：序列表的计算机可读形式(CRF)(文件名：FD0020PCT-sequence listing.TXT，记录日期：2020年4月13日，大小：133KB)。
技术领域
本发明涉及利用工程化RNA来编辑RNA的方法和组合物，工程化RNA能够招募腺苷脱氨酶用以使靶标RNA中的一个或多个腺苷脱氨基。
背景技术
基因组编辑是生物医学研究和疾病疗法开发的有力工具。到目前为止，最流行的基因组编辑技术是成簇规律间隔的短回文重复序列(Clustered Regularly InterspacedShort Palindromic Repeats(CRISPR))-Cas系统，它是从细菌和古细菌的适应性免疫系统开发出来的。CRISPR-Cas可以精确打靶和切割基因组DNA，从而生产双链DNA断裂(DSB)。DSB可以通过非同源末端连接(NHEJ)途径修复，常常导致插入或缺失(Indel)，其在大多数情况下使基因失活。备选地，同源定向修复(HDR)途径可以使用同源模板dsDNA或ssDNA修复所述DSB，从而实现精确的基因组编辑。
最近，利用脱氨酶蛋白(诸如作用于RNA的腺苷脱氨酶，ADAR)的优点，开发了用于RNA编辑的新工具。在哺乳动物细胞中，有三种类型的ADAR蛋白，ADAR1(两个同种型，p110和p150)，ADAR2和ADAR3(无催化活性)。ADAR蛋白的催化底物是双链RNA，ADAR从腺苷(A)核苷碱基中去除-NH2基团，将A变为肌苷(I)，其被识别为鸟苷(G)并且在随后的细胞转录和翻译过程中与胞苷(C)配对。研究人员将λN肽与人ADAR1或ADAR2脱氨酶结构域相融合来构建λN-ADARDD系统，该系统可由BoxB茎环和反义RNA组成的融合RNA来指导，结合特定的RNA靶标。该方法通过在靶标A碱基处引入A-C错配将靶标A转换为I()，从而导致从A至G的RNA碱基编辑。用于RNA编辑的其他方法包括将反义RNA融合至R/G基序(ADAR-招募RNA支架)以通过在哺乳动物细胞中过表达ADAR1或ADAR2蛋白来编辑靶标RNA，以及利用dCas13-ADAR精确打靶和编辑RNA。在申请PCT/EP2017/071912中，公开了一种RNA编辑的方法，其不需要外源蛋白质或核酸上的招募结构域。包含与靶标RNA互补序列的合成RNA被用于诱导A到G碱基编辑。该方法中使用的RNA短(短于54nt)，且必须进行特殊修饰以提高编辑效率。
发明概述
核酸编辑在生物学研究和治疗学的发展中具有巨大的潜力。目前用于DNA或RNA编辑的大多数工具依赖于将外源蛋白引入活的生物体，由于可能的异常效应子活性，递送限制和免疫原性，它们可能面临潜在的风险或技术障碍。还有一些其他工具需要复杂的化学修饰，但是仍然导致低的编辑效率。在一些方面，本申请提供了利用短RNA使得脱氨基酶进行靶向RNA编辑的可编程方法；在一些实施方案中，所述脱氨基酶是一种ADAR(作用于RNA的腺苷脱氨酶)蛋白；在一些实施方案中，所述ADAR是一种内源性ADAR蛋白。在一些方面，本申请提供了一种工程化的RNA，其与靶标转录物部分互补以招募ADAR1或ADAR2，以在靶标RNA中的特定位点将腺苷转化为肌苷。本文所述的方法统称为“LEAPER”(LeveragingEndogenous ADAR for Programmable Editing on RNA，利用内源性ADAR进行RNA的可编程编辑)，而招募ADAR的RNA可互换地称为“dRNA”或“arRNA”。
在一个方面，本申请提供了一种用于编辑宿主细胞中的靶标RNA的方法，包含将脱氨酶招募RNA(dRNA)或编码脱氨酶招募RNA的构建体引入宿主细胞，其中，所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中，所述dRNA能够招募脱氨基酶以将靶核苷酸脱氨基，在一些实施方案中，作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷(A)脱氨基。在某些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是鼠科细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原代细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。
在某些实施方案中，ADAR天然地或内源地存在于宿主细胞中，例如，天然地或内源地存在于真核细胞中。在一些实施方案中，ADAR由宿主细胞内源表达。在某些实施方案中，ADAR对宿主细胞而言是外源的。在一些实施方案中，ADAR由核酸(例如DNA或RNA)编码。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入宿主细胞。在一些实施方案中，该方法不包含将任何蛋白质引入宿主细胞中。在某些实施方案中，所述ADAR是ADAR1和/或ADAR2。在一些实施方案中，ADAR是选自下组的一种或多种ADAR：hADAR1、hADAR2、鼠科ADAR1和鼠科ADAR2。
在某些实施方案中，Cas(CRISPR相关蛋白)不识别所述dRNA。在一些实施方案中，所述dRNA不包含CRISPR/Cas系统中使用的crRNA、tracrRNA或gRNA。在一些实施方案中，该方法不包含将Cas或Cas融合蛋白引入宿主细胞中。
在某些实施方案中，所述靶标RNA中的靶标A的脱氨基作用导致所述靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接。在一些实施方案中，靶标RNA编码蛋白质，而所述靶标RNA中靶标A的脱氨基作用导致所述蛋白质的点突变、截短、延伸和/或错误折叠。在一些实施方案中，所述靶标RNA中靶标A的脱氨基作用导致靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复。在一些实施方案中，其中所述靶标RNA编码截短的、延长的、突变的或错误折叠的蛋白质，靶标RNA中的靶标A的脱氨基作用通过靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复产生有功能的、全长的、正确折叠的和/或野生型蛋白质。在一些实施方案中，靶标RNA是调节RNA，并且靶标A的脱氨基作用导致由靶标RNA调节的下游分子的表达的变化。在某些实施方案中，该方法用于利用内源性腺苷脱氨酶在靶标RNA上的编辑产生由靶标RNA编码的蛋白质的点突变和/或错误折叠、和/或在靶标RNA中产生过早的终止密码子、异常剪接位点、和/或的可变剪接位点。
在某些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞中的多种靶标RNA的方法，其中所述方法包含将多种dRNA或编码所述多种dRNA的构建体引入宿主细胞中，其中所述多种脱氨酶招募RNA中的每一种包含与多种靶标RNA中的相应靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中每种dRNA能够招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使相应靶标RNA中的靶标腺苷(A)脱氨基。
在一些实施方案中，提供了经编辑的RNA或宿主细胞，其具有通过如上所述的RNA编辑方法中的任一种生产的经编辑的RNA。
在一个方面，本申请提供了治疗或预防个体疾病或病况的方法，包含根据如上所述的RNA编辑方法的任何一种编辑与个体细胞中的疾病或病况相关的靶标RNA。在一些实施方案中，该方法包含离体编辑细胞中的靶标RNA。在一些实施方案中，该方法包含将经编辑的细胞施用于个体。在一些实施方案中，该方法包含向个体施用有效量的dRNA或者编码或包含该dRNA的构建体。在一些实施方案中，该方法还包含向细胞中引入ADAR或编码ADAR的构建体(例如，病毒载体)。在一些实施方案中，该方法还包含向个体施用ADAR或编码该ADAR的构建体(例如，病毒载体)。在一些实施方案中，疾病或病况是遗传性的基因疾病。在一些实施方案中，所述疾病或病况与一种或多种获得性基因突变(例如，药物抗性)相关。
本申请的一个方面提供了一种dRNA，包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，其通过招募脱氨基酶，使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。在一些实施方案中，一种作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。
在根据本文所述的方法或dRNA的任何一项的一些实施方案中，所述dRNA包含下述RNA序列，其包含与靶标RNA结合时，与在靶标RNA中待编辑的靶标腺苷直接相对的胞苷(C)、腺苷(A)或尿苷(U)。所述与在靶标RNA中待编辑的靶标腺苷直接相对的胞苷(C)、腺苷(A)及尿苷(U)统称为“靶向核苷酸”，或分别称为“靶向C”，“靶向A”，及“靶向U”。在某些实施方案中，所述RNA序列还包含一个或多个鸟苷，每个鸟苷与靶标RNA中的非靶标腺苷直接相对。在某些实施方案中，靶标RNA序列中靶标A的5'最近邻位是选自U，C，A和G的核苷酸，优先度U>C≈A>G，而且靶标RNA序列中靶标A的3'最近邻位是选自G，C，A和U的核苷酸，优先度G>C>A≈U。在某些实施方案中，在靶标RNA中靶标A处于选自下组的三碱基基序中：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。在某些实施方案中，其中所述三碱基基序是UAG，所述dRNA包含与所述三碱基基序中的U直接相对的A，与靶标A直接相对的C，和与三碱基基序中的G直接相对的C，G或U。在某些实施方案中，其中所述三碱基基序是靶标RNA中的UAG，所述dRNA包含与靶标RNA的UAG相对的ACC，ACG或ACU。
在根据本文所述的任一种方法或dRNA的一些实施方案中，所述脱氨酶招募RNA包含超过40、45、50、55、60、65、70、75或80个核苷酸。在某些实施方案中，脱氨酶招募RNA长度为40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170，70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-150或105-140个核苷酸。在一些实施方案中，dRNA长约60-200个核苷酸(例如约60-150、65-140、68-130或70-120个核苷酸)。
在根据本文所述的任一种方法或dRNA的一些实施方案中，本文所述的dRNA包含，从5'端至3'端：5'部分，与靶RNA中的靶标A直接相对的胞苷错配，和3'部分。在一些实施方案中，3’部分不短于约7nt(例如不短于8nt，不短于9nt，以及不短于10nt)核苷酸。在一些实施方案中，3'部分长约7nt-25nt核苷酸(例如约8nt-25nt，9nt-25nt，10nt-25nt，11nt-25nt，12nt-25nt，13nt-25nt，14nt-25nt，15nt-25nt，16nt-25nt，17nt-25nt，18nt-25nt，19nt-25nt，20nt-25nt，21nt-25nt，22nt-25nt，23nt-25nt，24nt-25nt，例如10nt-15nt或21nt-25nt核苷酸)。在一些实施方案中，5'部分不短于约25个核苷酸(例如不短于约30，不短于约35nt，不短于约40nt和不短于约45nt)核苷酸。在一些实施方案中，5'部分长约25nt-85nt核苷酸(例如约25nt-80nt，25nt-75nt，25nt-70nt，25nt-65nt，25nt-60nt，30nt-55nt，40nt-55nt或45nt-55nt核苷酸)。在一些实施方案中，5'部分长约25nt-85nt核苷酸(例如约25nt-80nt，25nt-75nt，25nt-70nt，25nt-65nt，25nt-60nt，30nt-55nt，40nt-55nt或45nt-55nt核苷酸)，而3'部分长约7nt-25nt核苷酸(例如长约10nt-15nt或21nt-25nt核苷酸)。在一些实施方案中，5′部分比3′部分长。在一些实施方案中，5'部分长约55个核苷酸，而3'部分长约15个核苷酸。在一些实施方案中，dRNA中胞苷错配的位置根据本文实施例中描述的任何dRNA所述，并且dRNA可以为例如Xnt-c-Ynt的格式，其中X表示5’部分的长度，Y表示3'部分的长度：55nt-c-35nt，55nt-c-25nt，55nt-c-24nt，55nt-c-23nt，55nt-c-22nt，55nt-c-21nt，55nt-c-20nt，55nt-c-19nt，55nt-c-18nt，55nt-c-17nt，55nt-c-16nt，55nt-c-15nt，55nt-c-14nt，55nt-c-13nt，55nt-c-12nt，55nt-c-11nt，55nt-c-10nt，55nt-c-9nt，55nt-c-8nt，55nt-c-7nt，55nt-n-20nt，50nt-n-20nt，45nt-n-20nt，55nt-n-15nt，50nt-n-15nt，45nt-c-45nt，45nt-c-55nt，54nt-c-12nt，53nt-c-13nt，52nt-c-14nt，51nt-c-15nt，50nt-c-16nt，49nt-c-17nt，48nt-c-18nt，47nt-c-19nt，46nt-c-20nt，45nt-c-21nt，44nt-c-22nt，43nt-c-23nt，54nt-c-15nt，53nt-c-16nt，52nt-c-17nt，51nt-c-18nt，50nt-c-19nt，49nt-c-20nt，48nt-c-21nt，47nt-c-22nt，46nt-c-23nt，54nt-c-17nt，53nt-n-18nt，52nt-n-19nt，51nt-n-20nt，50nt-n-21nt，49nt-n-22nt，和48nt-c-23。
在某些实施方案中，靶标RNA是选自下组的RNA：前信使RNA，信使RNA，核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA和小RNA(例如miRNA)。
在根据本文所述的任一种方法或dRNA的一些实施方案中，所述dRNA是单链RNA。在一些实施方案中，所述互补RNA序列是单链的，并且其中所述dRNA还包含一个或多个双链区。
在一些实施方案中，所述dRNA包含一种或多种修饰，例如2'-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，dRNA长约60-200个核苷酸，并包含一种或多种修饰(例如2'-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化)。在一些实施方案中，所述dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2′-O-甲基化和/或在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，所述dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2′-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，和在一个或多个尿苷中，例如在所有尿苷中，包含2′-O-甲基化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在单个或多个或所有尿苷中包含2'-O-甲基化，以及与靶标腺苷相对的核苷酸，和/或与靶标腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸中包含修饰。在某些实施方案中，与靶腺苷相对的核苷酸和/或与靶腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸的修饰是2’-O-甲基化。在某些实施方案中，与靶腺苷相对的核苷酸和/或与靶腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸的修饰是硫代磷酸酯连接，例如3′-硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在所有尿苷中包含2'-O-甲基化，并且与靶腺苷相对的核苷酸的3'端或5'端紧邻的核苷酸中包含2'-O-甲基化。在某些实施方案中，所述dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在第首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在所有尿苷中包含2'-O-甲基化，并且在与靶腺苷相对核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近核苷酸中包含3'-硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各5个核苷酸中包含2’-O-甲基化，并且在首尾各5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化。
在根据本文所述的任一种方法的某些实施方案中，在靶RNA上进行编辑的效率为至少约30％，例如至少约32％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％或更高中的任何一个。
在一些实施方案中，提供了编码上述任何一种dRNA的构建体(例如，病毒载体或质粒)。在一些实施方案中，所述构建体包含与编码dRNA的序列可操作地连接的启动子。在一些实施方案中，所述构建体是DNA构建体。
在一些实施方案中，提供了文库，其包含根据上述任何一种dRNA的多个dRNA或根据上述任何一种构建体的多个构建体。
还提供了组合物，宿主细胞，试剂盒和制品，其包含本文所述的任何一种dRNA，本文所述的任何一种构建体，或本文所述的任何一种文库。
附图说明
图1A-1H显示使用利用了内源ADAR1蛋白的单个dRNA的RNA编辑。图1A和1B显示使用内源ADAR1蛋白编辑RNA的示意图。图1C显示使用利用了内源ADAR1蛋白质的dRNA编辑报道分子mRNA。图1D显示图1B中的结果的统计分析。图1E显示ADAR1敲除和ADAR1(p110)，ADAR1(p150)和ADAR2的回复结果。图1F显示图1D中的结果的统计分析。图1G显示ADAR1(p110)，ADAR1(p150)或ADAR2过表达对293T-WT细胞中dRNA介导的RNA编辑的影响。图1H显示深度测序(即二代测序，NGS)结果证实了在靶向位点处从A至G的编辑。
图2A-2H显示dRNA的优化。图2A显示与靶向腺苷相对的四种碱基(A，U，C和G)识别的示意图。图2B显示与靶向腺苷相对的碱基识别对dRNA的RNA编辑效率的影响。图2C显示带有与UAG靶向位点的一个，两个或三个碱基错配的dRNA的示意图。图2D显示与UAG靶向位点的一个，两个或三个碱基错配对于由dRNA编辑的报道分子RNA的影响。dRNA优选靶向腺苷上的A-C错配。图2E显示带有变化的长度的dRNA的示意图。图2F显示基于双荧光报道分子-2，dRNA长度对于RNA编辑效率的影响。图2G显示不同A-C错配位置的示意图。图2H显示A-C错配位置对于RNA编辑效率的影响。
图3A-3B显示通过本申请的示例性RNA编辑方法的内源RNA编辑的编辑灵活性。图3A显示在所有16种不同的3-碱基基序处内源RNA编辑效率的百分比定量。图3B显示对16种不同3碱基基序的内源RNA编辑的5'侧和3'侧碱基优先度的热图。
图4A-4H显示在293T细胞中用dRNA编辑内源基因的mRNA。图4A显示KRAS mRNA靶标和带有变化的长度的dRNA的示意图。图4B显示在293T细胞中用dRNA编辑内源KRAS基因的mRNA。空白载体，dRNA-91nt质粒被分别转染到293T-WT细胞中。在60个小时后，分离RNA用于RT-PCR，然后扩增cDNA并在Illumina NextSeq上测序。图4C显示PPIB mRNA靶标(位点1，位点2和位点3)和相应的dRNA设计的示意图。图4D，4E和4F显示在293T细胞中用dRNA编辑内源PPIB基因的mRNA。图4G显示β-肌动蛋白mRNA靶标和dRNA(71-nt和131-nt)的示意图。图4H显示在293T细胞中用dRNA编辑内源β-肌动蛋白基因的mRNA。
图5A-5G显示脱靶分析。图5A显示序列窗口的示意图，其中为PPIB mRNA靶标(PPIB位点1)分析了从A至I的编辑。黑色箭头标明了靶向的腺苷。图5B显示通过靶向PPIB mRNA靶标(PPIB位点1)的151-nt dRNA对A至IRNA编辑进行深度测序定量。图5C显示序列窗口的示意图，其中针对KRAS mRNA靶标分析了A至I编辑。黑色箭头表示靶向的腺苷。图5D显示通过靶向KRAS mRNA靶标的91-nt和111-nt dRNA对A至IRNA编辑进行深度测序定量。图5E显示含有不同的A-G错配组合的设计的四种91-nt或111-nt的dRNA变体的示意图。基于在图5D中的统计结果以及关于不同氨基酸的基因代码的现有知识，设计了A-G错配。图5F显示通过dRNA以及在图5E中不同种类的dRNA变体的靶向的A56编辑的结果。图5G显示通过靶向KRAS mRNA靶标的111-nt dRNA和4种111-nt dRNA变体对A至IRNA编辑进行深度测序定量。
图6A-6H显示使用利用了内源ADAR1蛋白的单个dRNA的RNA编辑。图6A显示dLbuCas13-ADARDD融合蛋白的RNA编辑的示意图。无催化活性的dLbuCas13与ADAR1或ADAR2的RNA脱氨酶结构域相融合。图6B显示双荧光报道分子mRNA靶标和指导RNA的设计的示意图。图6C显示图6A和图6B中的结果的统计分析。图6D显示293T-WT细胞中ADAR1和ADAR2的mRNA水平。图6E显示通过基因组PCR对293T-ADAR1-KO细胞系中ADAR1基因的基因分型结果。图6F显示经由蛋白质印迹在293T-WT和293T-ADAR1-KO细胞系中ADAR1(p110)和ADAR1(p150)的表达水平。图6G显示经由FACS，ADAR1(p110)，ADAR1(p150)或ADAR2过表达对在293T-WT细胞中由dRNA介导的RNA编辑的影响。图6H显示Sanger测序结果显示在靶标腺苷位点处的从A至G的编辑。
图7A-7C显示对dRNA的优化。图7A显示带有变化长度的dRNA的示意图以及基于双荧光报道分子-1通过带有变化长度的dRNA的靶向mRNA编辑结果。图7B显示基于双荧光报道分子-1，不同的A-C错配位置和A-C错配位置对RNA编辑效率的影响的示意图。图7C显示基于双荧光报道分子-3，不同的A-C错配位置和A-C错配位置对RNA编辑效率的影响的示意图。
图8A-8B显示在293T细胞中用dRNA编辑内源基因的mRNA。图8A显示在293T细胞中用dRNA编辑内源β-肌动蛋白基因(位点2)的mRNA。图8B显示在293T细胞中用dRNA编辑内源GAPDH基因的mRNA。
图9显示在不同细胞系中通过dRNA进行RNA编辑。图9A显示报道分子质粒和dRNA质粒被共转染到不同细胞系中，结果显示dRNA在多个细胞系中可以很好地起作用，这表明了dRNA应用的普遍性。
图10A-10D显示对有效的示例性RNA编辑平台的探索。图10A，dLbuCas13a-ADAR1DD(E1008Q)融合蛋白和相应的crRNA的示意图。使用3×GGGGS接头将催化的无活性LbuCas13a融合到ADAR1的脱氨酶结构域(超活性E1008Q变体)。crRNA(crRNACas13a)由Lbu-crRNA支架和间隔区组成，其与具有A-C错配的靶向RNA互补，如图所示。图10B，双荧光报道分子系统和具有多种长度的间隔区的Lbu-crRNA的示意图，如图所示。图10C，EGFP阳性(EGFP+)细胞的定量。将稳定表达报道分子-1(Reporter-1)的HEK293T细胞用所示长度的crRNACas13a转染，并伴或不伴dLbuCas13a-ADAR1DD(E1008Q)的共表达，然后进行FACS分析。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)。图10D，用对照(Ctrl crRNA70)或靶向间隔区(crRNA70)进行的实验的代表性FACS结果。
图11A-11G显示利用内源性ADAR1蛋白进行靶向的RNA编辑的示例性方法。图11A，报道分子-1和70-nt arRNA的示意图。图11B，在稳定表达报道分子-1的野生型(HEK293T，上图)或ADAR1敲除(HEK293T ADAR1–/–，下图)细胞中，arRNA诱导的EGFP表达的代表性FACS分析。图11C，蛋白质印迹分析显示野生型和HEK293T ADAR1–/–细胞以及转染有ADAR1亚型(p110和p150)的HEK293T ADAR1–/–细胞中ADAR1蛋白的表达水平。图11D，蛋白质印迹分析显示野生型和HEK293T ADAR1–/–细胞中以及转染有ADAR2的HEK293T ADAR1–/–细胞中ADAR2蛋白的表达水平。图11E，EGFP阳性(EGFP+)细胞的定量。将报道分子-1和所示表达ADAR的构建体与Ctrl RNA70或靶向arRNA70一起共转染到HEK293T ADAR1–/–细胞中，然后进行FACS分析。通过转染效率对EGFP+百分比进行归一化，转染效率由mCherry+确定。数据为平均值±s.e.m.(n＝4)。图11F，电泳图显示Ctrl RNA70(上图)或arRNA70(下图)靶向的区域的Sanger测序结果。图11G，通过深度测序定量靶向的位点的A至I转化率。
图12A-12B显示ADAR1/ADAR2的mRNA表达水平，和arRNA介导的RNA编辑。图12A，定量PCR显示HEK293T细胞中ADAR1和ADAR2的mRNA水平。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)。图12B，来自图1E的代表性FACS结果。
图13显示定量PCR结果，该结果证明了示例性LEAPER方法对HEK293T细胞中111-ntarRNA或对照RNA的靶向的报道分子-1转录物的表达水平的影响。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)；未配对的双侧学生t检验，ns，不显著。
图14A-14D显示在多个细胞系中用示例性LEAPER方法进行靶向的RNA编辑。图14A，蛋白质印迹结果显示在所示人细胞系中ADAR1，ADAR2和ADAR3的表达水平。将β-微管蛋白用作上样对照。显示的数据是三个独立实验的代表。ADAR1–/–/ADAR2代表过表达ADAR2的ADAR1-敲除HEK293T细胞。图14B，通过β-微管蛋白表达归一化的相对ADAR蛋白表达水平。图14C，所示人细胞用报道分子-1，以及71-nt对照arRNA(Ctrl RNA71)或71-nt靶向arRNA(arRNA71)转染，然后进行FACS分析。图14D，如图14C所述分析所示小鼠细胞系。通过转染效率对EGFP+百分比进行归一化，该转染效率由mCherry+确定。图14b，14C和14D中的误差线均表示平均值±s.e.m.(n＝3)；未配对的双侧学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns，不显著。
图15A-15C显示报道分子-1(图15A)，-2(图15B)和-3(图15C)以及它们相应的arRNA的示意图。
图16A-16G显示示例性LEAPER方法的表征和优化。图16A，上图，具有与靶标UAG相对的改变的三联体(5'-CNA，N表示A，U，C或G)的arRNA的设计的示意图。下图，EGFP+百分比，其显示与靶向的腺苷相对的可变碱基对RNA编辑效率的影响。图16B，上图，具有A-C错配(5'-N1CN2)中的胞苷侧翼的改变的相邻碱基的arRNA的设计。下图，N1CN2的16种不同组合对RNA编辑效率的影响。图16C，A-C错配中胞苷的5'和3'最邻近位点的优先度的概述。图16D，上图，具有可变长度的arRNA的设计。下图，基于报道分子-1和报道分子-2，arRNA长度对RNA编辑效率的影响。图16E，上图，具有可变A-C错配位置的arRNA的设计。下图，基于报道分子1和报道分子-2，A-C错配位置对的RNA编辑效率的影响。图16F，上图，报道分子-3的三联体基序的设计，具有围绕靶向腺苷(5'-N1AN2)的可变最近邻位碱基和111-nt arRNA(arRNA111)上的相对基序(5'-N2CN1)。下图，深度测序结果显示5'-N1AN2基序中靶向的腺苷的编辑率。图16G，在“报道分子-3”处LEAPER介导的编辑的5'和3'碱基优先度的概述。16A，16B，16D，16E和16F中的误差线均表示平均值±s.e.m.(n＝3)。
图17A-17I显示用示例性LEAPER方法对内源转录物的编辑。图17A，四个疾病相关基因(PPIB，KRAS，SMAD4和FANCC)和相应arRNA的靶向内源转录物的示意图。图17B，深度测序结果显示通过引入指定长度的arRNA，对PPIB，KRAS，SMAD4和FANCC转录物的靶向的腺苷的编辑率。图17C，深度测序结果显示在内源PPIB，FANCC和IDUA转录物的非UAN位点的编辑率。图17D，两个111-nt arRNA的多重编辑率。所示arRNA可以单独转染或被共转染到HEK293T细胞中。从共转染的细胞中测量两个位点的靶向的编辑。图17E，由151-nt arRNA覆盖的PPIB转录物序列的示意图。黑色箭头指示靶向的腺苷。所有腺苷以红色标记。图17F，腺苷的编辑率的热图，该腺苷被靶向PPIB基因的所示长度的arRNA覆盖(以蓝色粗体框标记的)。对于111-nt arRNA或arRNA151-PPIB覆盖的区域，由于缺乏有效的PCR引物用于扩增该区域，因此通过RNA-seq确定A22，A30，A33和A34的编辑率。否则，通过有针对性的深度测序分析来确定编辑率。图17G，上图，报道分子-3的三联体基序的设计，具有围绕靶向腺苷(5'-N1AN2)的可变最近邻位碱基和111-nt arRNA(arRNA111)的相对基序(5’-N2’GN1’)。下图，深度测序结果显示编辑率。图17H，上图，在与5'-UAG或5'-AAG基序相对的5'-N1GN2基序中具有两个连续错配的arRNA的设计。深度测序结果显示在与5'-UAG基序(左下)或5'-AAG基序(右下)相对的5'-N1GN2基序中具有两个连续错配的arRNA111的编辑率。图17I，由靶向KRAS基因的工程化的arRNA111变体覆盖的腺苷的编辑率的热图。图17B，17C，17D，17G和17H中的数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)；未配对的双侧学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；NS，不显著。(f和i)的数据表示为平均值(n＝3)。
图18A-18B显示示例性LEAPER方法对靶向的转录物和蛋白质产物的表达水平的影响。图18A，定量PCR显示HEK293T细胞中相应的151-nt arRNA或对照RNA的PPIB，KRAS，SMAD4和FANCC的靶向的转录物的表达水平。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)；未配对的双侧学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns，不显著。图18B，蛋白质印迹结果显示在HEK293T细胞中，151-nt arRNA对靶向的KRAS基因的蛋白质产物的影响。将β-微管蛋白用作上样对照。
图19A-19F显示用示例性LEAPER方法对内源转录物的编辑。图19A，由151-ntarRNA覆盖的KARS转录物序列的示意图。箭头指示靶向腺苷。所有腺苷标记为红色。图19B，由KARS转录物中所示arRNA覆盖的腺苷的编辑率的热图(以蓝色粗框标记的)。图19C，由151-nt arRNA覆盖的SMAD4转录物的示意图。图19D，由SMAD4转录物中所示arRNA覆盖的腺苷的编辑率的热图。图19E，由151-nt arRNA覆盖的FANCC转录物的示意图。图19F，由FANCC转录物中所示arRNA覆盖的腺苷的编辑率的热图。对于每个arRNA，双链体RNA的区域以蓝色粗框突出显示。数据(图19B，19D和19F)表示为平均值(n＝3)。
图20A-20D显示LEAPER的RNA编辑的转录组范围特异性。图20A和20B，Ctrl RNA151和arRNA151-PPIB的转录组范围脱靶分析。中靶位点(PPIB)以红色突出显示。在Ctrl RNA和靶向PPIB的RNA组中识别出的潜在脱靶位点标记为蓝色。图20C，脱靶位点和相应的CtrlRNA151或arRNA151-PPIB之间的预期退火亲和力。使用在线网站工具RNAhybrid预测脱靶位点(编辑位点的上游和下游150nt)和相应的Ctrl RNA151或arRNA151-PPIB形成的双链RNA的最小自由能(ΔG)。图20D，上图，arRNA151-PPIB和指定的潜在脱靶位点之间的高度互补区域的示意图，其可通过藉由NCBI-BLAST搜索同源序列来预测。下图，深度测序显示arRNA151-PPIB的中靶位点和所有预测的脱靶位点的编辑率。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)。
图21A-21B显示潜在脱靶的评价。图21A，arRNA111-FANCC的高度互补区和指定的潜在脱靶序列的示意图，其是通过藉由NCBI-BLAST搜索同源序列来预测的。图21B，深度测序显示arRNA111-FANCC的中靶位点和所有预测的脱靶位点的编辑率。所有数据均表示为平均值±s.e.m.(n＝3)。
图22A-22F显示在哺乳动物细胞中应用示例性LEAPER方法的安全性评价。图22A和22B，通过转录组范围的RNA测序对Ctrl RNA151(a)arRNA151-PPIB(b)对天然编辑位点的作用的转录组范围的分析。皮尔逊相关系数分析(Pearson’s correlation coefficientanalysis)用于评估天然编辑位点的差异RNA编辑率。图22C和22D，用转录组水平上的RNA-seq数据对Ctrl RNA151(c)arRNA151-PPIB(d)的作用进行差异基因表达分析。皮尔逊相关系数分析用于评估差异基因表达。图22E和22F，arRNA转染对先天免疫应答的影响。将所示arRNA或聚(I:C)转染到HEK293T细胞中。然后使用定量PCR分析总RNA，以确定IFN-β(e)和IL-6(f)的表达水平。数据(e和f)表示为平均值±s.e.m.(n＝3)。
图23A-23D显示通过LEAPER恢复突变体TP53W53X的转录调节活性。图23A，上图，由含有c.158G>A临床相关无义突变(Trp53Ter)的111-nt arRNA覆盖的TP53转录物序列的示意图。黑色箭头指示靶向的腺苷。所有腺苷以红色标记。下图，设计了两个靶向TP53W53X转录物的优化的arRNA的设计，针对arRNA111-AG1在A46th上具有A-G错配，而针对arRNA111-AG4在A16th，A46th，A91th和A94th上一同具有A-G错配，以最大程度地减少“易编辑”基序的潜在脱靶。图23B，深度测序结果显示通过arRNA111，arRNA111-AG1和arRNA111-AG4对TP53W53X转录物进行靶向编辑。图23C，蛋白质印迹显示从HEK293T TP53–/–细胞中的TP53W53X转录物中恢复全长p53蛋白的产物。图23D，使用p53-萤火虫-荧光素酶报道分子系统检测恢复的p53蛋白的转录调节活性，该系统通过共转染的海藻-荧光素酶载体归一化。数据(b，c和d)表示为平均值±s.e.m.(n＝3)；未配对的双侧学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns，不显著。
图24显示通过示例性的LEAPER方法对突变体TP53W53X转录物的编辑。上图，是由111nt arRNA覆盖的TP53转录序列的示意图。箭头指示靶向的腺苷。所有腺苷以红色标记。下图，是TP53转录物中所示arRNA覆盖的腺苷的编辑率的热图。
图25显示从ClinVar数据中选择的含有G至A突变的疾病相关cDNA和相应的111-ntarRNA的示意图。
图26显示通过示例性的LEAPER方法对病原性突变的校正。通过相应的111ntarRNA从ClinVar数据对疾病相关的G>A突变进行A至I校正，针对所示的来自六个致病基因的临床相关突变(图25以及以下arRNA和对照RNA和疾病相关的cDNA的序列的表)。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)；未配对的双侧学生t检验，*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001；ns，不显著。
图27A-27C显示通过示例性LEAPER方法在多个人原代细胞中的RNA编辑。图27A，由LEAPER介导的RNA编辑诱导的EGFP阳性(EGFP+)细胞的定量。用报道分子-1，以及151-nt对照RNA(Ctrl RNA151)或151-nt靶向arRNA(arRNA151)转染人原代肺成纤维细胞和人原代支气管上皮细胞，然后进行FACS分析。图27B和27C，深度测序结果显示人原代肺成纤维细胞，人原代支气管上皮细胞(b)和人原代T细胞(c)中PPIB转录物的编辑率。a，b和未治疗组(c)中的数据表示为平均值±s.e.m.(n＝3)；Ctrl RNA151和arRNA151(c)的数据表示为平均值±s.e.m.(n＝2)。
图28A-28D显示arRNA的慢病毒转导和合成arRNA寡核苷酸的电穿孔的靶向的编辑。图28A，EGFP+细胞的定量。将稳定表达报道分子-1的HEK293T细胞用表达Ctrl-RNA或靶向arRNA的151-nt的慢病毒感染。感染后2天和8天进行FACS分析。EGFP+细胞的比率通过慢病毒转导效率(BFP+比率)归一化。图28B，深度测序结果显示慢病毒将151-nt arRNA转导入HEK293T细胞后，PPIB转录物的编辑率。图28C，PPIB序列和相应的111-nt靶向arRNA的示意图。*(以红色)表示具有2'-O-甲基化和硫代磷酸酯连接的核苷酸。图28D，深度测序结果显示当将111nt合成arRNA寡核苷酸电穿孔到人原代T细胞后，PPIB转录物的编辑率。
图29A-29E显示通过示例性LEAPER方法在源自Hurler综合征患者的原代成纤维细胞中α-L-艾杜糖醛酸酶活性的恢复。图29A，上图，源自患者的成纤维细胞GM06214中致病突变的遗传信息；中间图，IDUA基因的外显子9(Trp402Ter)中含有纯合TGG>TAG突变的GM06214细胞(黑色)的IDUA成熟mRNA序列的示意图，相应的111-nt靶向arRNA111-IDUA-V1(蓝色)；下图，GM06214细胞的IDUA pre-mRNA序列(黑色)和相应的111-nt靶向arRNA111-IDUA-V2的示意图(蓝色)。*(以红色)表示具有2'-O-甲基化和硫代磷酸酯连接的核苷酸。图29B，在不同时间点，用4-甲基伞形酮α-L-艾杜糖醛酸酶底物测量α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。数据表示为平均值±s.e.m.(n＝2)。图29C，深度测序结果显示在电穿孔后48小时，在GM06214细胞中，IDUA转录物的靶向的编辑率。图29D，上图，由111-nt arRNA覆盖的IDUA转录序列的示意图。箭头指示靶向的腺苷。所有腺苷以红色标记。下图，由IDUA转录物中所示arRNA覆盖的腺苷编辑率的热图(以蓝色粗体框显示)。e，定量PCR显示在arRNA或聚(I:C)电穿孔后，I型干扰素、干扰素刺激基因和促炎基因的表达。数据表示为平均值(n＝3)。
图30A-30C显示双荧光报道分子(报道分子-1，-2和-3)，mCherry和EGFP的三种形式。图30A，报道分子-1的结构，图30B，报道分子-2的结构，图30C，报道分子-3的结构。
图31显示pLenti-dCas13-ADAR1DD的结构。
图32显示了pLenti-MCS-mCherry骨架的结构。
图33显示pLenti-arRNA-BFP骨架的结构。
图34显示了在GM06214细胞中检测到的IDUA基因型。其基因组中存在C1205G>A突变。
图35显示了细胞的电转染条件的测试结果。
图36显示了用电穿孔分别使用设计为靶标IDUA pre-mRNA和mRNA的dRNA转染的细胞中IDUA的酶活性和所希望的突变的比率。
图37A-37B显示使用IDUA报道分子的测试。图37A显示了IDUA-报道分子的构建。图37B显示了使用电穿孔时293T-IDUA-报道分子细胞(具有IDUA-报道分子的293T细胞)中不同长度的dRNA(对称截短)的编辑效率。
图38显示了用不同长度的dRNA(对称截短)电转染的GM06214细胞在不同时间点测定的酶活性和编辑效率。
图39A-39B显示了在使用Lipofectamine RNAiMAX转染不同dRNA(对称截短，3'末端截短和5'末端截短)的细胞中测定的IDUA酶活性(图39A)和A至G突变率(图39B)。
图40A-40B显示了使用Lipofectamine RNAiMAX转染不同长度dRNA的GM06214细胞的酶活性的比较。图40A中，dRNA的3'末端的碱基从55-c-25逐个减少至55-c-10。图40B中，dRNA的3'末端的碱基从55-c-16逐个减少至55-c-5。
图41显示了用Lipofectamine RNAiMAX转染不同长度(3′末端的长度固定为15nt或20nt，而5′末端的长度逐渐减小)的dRNA的GM06214细胞中酶活性的比较。
图42显示了使用Lipofectamine RNAiMAX转染了3组dRNA的GM06214细胞中酶活性的比较。对于每组中的dRNA，从靶向核苷酸到5'末端的距离不同。此图还显示出小于60nt的dRNA编辑效率低。
图43A-43B显示了具有不同化学修饰的71nt和76nt dRNA的编辑效率。图43A显示了使用酶活性的编辑效率。图43B显示了使用A到G比率的编辑效率。
图44显示了使用本发明中的dRNA以及现有技术中用于外源酶非依赖性RNA碱基编辑的优选RNA转染的细胞的酶活性的比较。
图45A-45D显示了使用本发明的经化学修饰的dRNA对USH2A模型(c.11864G>A，p.Trp3955*)中的突变的RNA编辑结果。MFI和％GFP代表编辑效率。图45A显示USH2A构建体的构造。图45B显示3'和5'末端长度相等的dRNA的编辑效率。图45C显示了不同长度的3'和5'末端的dRNA的编辑效率。图45D显示了少于60个核苷酸的dRNA的相对较低的编辑效率。
发明详述
本申请提供RNA编辑方法(本文称为“LEAPER”方法)和经特殊设计的RNA，本文称为脱氨酶招募RNA(“dRNA”)或ADAR-招募RNA(“arRNA”)，以编辑宿主细胞中的靶标RNA。不受任何理论或假设的约束，所述dRNA通过序列特异的方式与其靶标RNA杂交而起作用，形成双链RNA，其招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(Adenosine Deaminase Acting on RNA,ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。因此，在一些实施方案中，在无宿主细胞中异位表达或过表达ADAR蛋白的情况下可以实现有效的RNA编辑。本发明还提供了使用所述RNA编辑方法治疗或预防个体疾病或病况的方法和组合物。
本文所述的RNA编辑方法不使用包含ADAR和特异性结合指导核酸的蛋白质(诸如Cas)的融合蛋白。本文描述的脱氨酶招募RNA(deaminase-recruiting RNA(“dRNA”))不包含CRISPR/Cas系统中使用的crRNA，tracrRNA或gRNA。在一些实施方案中，dRNA不包含ADAR招募结构域或化学修饰。在一些实施方案中，arRNA可以从质粒或病毒载体表达，或合成为寡核苷酸，其可以实现所需的编辑效率。不受任何理论或根本机制的束缚，已发现具有特定长度，错配位置和/或修饰模式的某些dRNA表现出更高的RNA编辑效率。因此，本申请进一步提供了改进的RNA编辑方法，其超过之前报道的那些。
本文所述的LEAPER方法对靶向的转录物和罕见的全局脱靶具有可控的脱靶率。发明人已经使用LEAPER方法通过修复特定的癌症相关点突变来恢复p53功能。本文所述的LEAPER方法还可以应用于包括多种人类原代细胞的广泛的细胞类型，并且可以用于在源自Hurler综合征患者的原代成纤维细胞中恢复α-L-艾杜糖醛酸酶催化活性，而无需引起先天免疫应答。在一些实施方案中，LEAPER方法涉及单分子(即，dRNA)系统。本文所述的LEAPER方法可实现精确而有效的RNA编辑，从而为基础研究和治疗提供了变革性的潜力。
定义
将参照特定实施方案并参考某些附图来描述本发明，但是本发明不受限于此，而是仅由权利要求进行限定。权利要求中的任何参考标记不应被解释为限制范围。当在本说明书和权利要求中使用术语“包括”时，不排除其他因素或者步骤。对于提及单数名词时使用不定冠词或定冠词的情况，例如“一个”或“一种”，“该”，它包括了该名词的复数形式，除非另有特别说明。对于本文中对核苷酸的数值范围的描述，明确考虑了其间的每个中间数值。例如，对于40-260个核苷酸的范围，除了40个核苷酸和260个核苷酸的数量之外，还考虑了40到260个核苷酸之间的任何整数个核苷酸。
提供以下术语或定义，仅用于帮助理解本发明。除非本文中具体定义，否则本文使用的所有术语对本发明所属领域技术人员具有相同的含义。从业者特别针对Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor Press，Plainsview，New York(1989)；和Ausubel等人，Current Protocols in MolecularBiology(Supplement 47)，John Wiley&Sons，New York(1999)，关于本领域的定义和术语。本文提供的定义不应被解释为具有比本领域普通技术人员所理解的范围更窄的范围。
术语“脱氨酶招募RNA”，“dRNA”，“ADAR-招募RNA”和“arRNA”在本文中可互换使用，指能招募ADAR以在RNA中使靶标腺苷脱氨基的工程化的RNA。
术语“多核苷酸”，“核苷酸序列”和“核酸”可互换使用。它们是指任何长度的聚合形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或者其类似物。两个核苷酸通过磷酸二酯键连接，多个核苷酸通过磷酸二酯键连接以形成多核苷酸或核酸。核苷酸之间的连接可以被硫代磷酸酯化，称为“硫代磷酸酯连接(phosphorothioate linkage)”或“硫代磷酸酯化连接(phosphorothioation linkage)”。
本文所用的术语“腺嘌呤”，“鸟嘌呤”，“胞嘧啶”，“胸腺嘧啶”，“尿嘧啶”和“次黄嘌呤”是指核碱基本身。术语“腺苷”，“鸟苷”，“胞苷”，“胸苷”，“尿苷”和“肌苷”是指与核糖或脱氧核糖的糖部分连接的核碱基。术语“核苷”是指与核糖或脱氧核糖连接的核碱基。术语“核苷酸”是指各自的核碱基-核糖基-磷酸酯或核碱基-脱氧核糖基-磷酸酯。有时术语腺苷和腺嘌呤(缩写“A”)，鸟苷和鸟嘌呤(缩写“G”)，胞嘧啶和胞苷(缩写“C”)，尿嘧啶和尿苷(缩写“U”)，胸腺嘧啶和胸苷(缩写“T”)，肌苷和次黄嘌呤(缩写“I”)，可互换使用，指相应的核碱基，核苷或核苷酸。有时，术语核碱基，核苷和核苷酸可互换使用，除非上下文明确要求不同。
在本申请的上下文中，“靶标RNA”是指将脱氨酶招募RNA序列设计为与其具有完全互补性或基本互补性的RNA序列，并且靶标序列与dRNA之间杂交形成含有靶标腺苷的双链RNA(dsRNA)区域，其招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，该酶使靶标腺苷脱氨基。在一些实施方案中，ADAR天然地存在于宿主细胞中，例如真核细胞(优选哺乳动物细胞，更优选人类细胞)。在一些实施方案中，将所述ADAR引入宿主细胞中。
如本文所用，“互补性”是指核酸通过传统的Watson-Crick碱基配对与另一种核酸形成氢键的能力。百分比互补性表示核酸分子中可与第二核酸形成氢键(即，Watson-Crick碱基配对)的残基的百分比(例如，10个中的约5、6、7、8、9、10个，分别为约50％，60％，70％，80％，90％和100％互补)。“完全互补”是指核酸序列的所有连续残基与第二核酸序列中相同数量的连续残基形成氢键。如本文所用，“基本上互补”是指在约40、50、60、70、80、100、150、200、250或更多个核苷酸的区域内，至少约70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，99％或100％中的任何一个的互补程度，或指在严格条件下杂交的两条核酸。
如本文所用，杂交的“严格条件”是指与靶标序列具有互补性的核酸主要与靶标序列杂交并且基本上不与非靶标序列杂交的条件。严格条件通常是序列依赖性的，并且取决于许多因素而变化。一般而言，序列越长，序列与其靶标序列特异性杂交的温度越高。在Tijssen(1993)，Laboratory Techniques In Biochemistry And Molecular Biology-Hybridization With Nucleic Acid Probes Part I，Second Chapter“Principles ofprinciples of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assay”，Elsevier，N，Y中详细描述了严格条件的非限制性实例。
“杂交”是指其中一种或多种多核苷酸反应形成复合物的反应，所述复合物经由核苷酸残基的碱基之间的氢键来稳定。所述氢键可以通过Watson Crick碱基配对，Hoogstein结合或以任何其他序列特异性的方式发生。能够与给定序列杂交的序列称为给定序列的“互补序列”。
如本文所用，术语“细胞”，“细胞系”和“细胞培养物”可互换使用，并且所有这些名称包括后代。应理解，由于故意或无意的突变，所有后代的DNA内容可能不完全相同。本发明包括了具有与原始细胞相同的功能或生物活性的变体后代。
RNA编辑方法
在本发明中，本文所用的dRNA包含RNA序列，其含有与靶标RNA结合时与靶标RNA中待编辑的靶标腺苷直接相对的胞苷(C)，腺苷(A)或尿苷(U)。与靶标腺苷直接相对的胞苷(C)，腺苷(A)和尿苷(U)统称为“靶向核苷酸”，或分别称为“靶向C”，“靶向A”和“靶向U”。靶向核苷酸和与靶向核苷酸直接相邻的两个核苷酸形成三联体，其在本文中称为“靶向三联体”。
在一些实施方案中，本发明提供了用于编辑宿主细胞(例如，真核细胞)中的靶标RNA的方法，其包括将脱氨酶招募RNA(dRNA)或编码dRNA的构建体引入宿主细胞，其中所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使靶标RNA中的靶标腺苷(A)脱氨基。
在一些实施方案中，本发明提供了用于编辑宿主细胞(例如，真核细胞)中的靶标RNA的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入宿主细胞，其中所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA招募宿主细胞的内源表达的ADAR，以使靶标RNA中的靶标A脱氨基。在一些实施方案中，该方法不包括将任何蛋白质或编码蛋白质的构建体(例如，Cas，ADAR或ADAR和Cas的融合蛋白)引入宿主细胞。
在一些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞(例如，真核细胞)中的靶标RNA的方法，其包括引入：(a)dRNA或编码dRNA的构建体，和(b)ADAR或编码ADAR的构建体到宿主细胞中，其中所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA招募ADAR，以使靶标RNA中的靶标A脱氨基。在一些实施方案中，所述ADAR是宿主细胞的内源编码的ADAR，其中所述ADAR引入包含在宿主细胞中过表达ADAR。在一些实施方案中，所述ADAR对宿主细胞是外源的。在一些实施方案中，所述编码ADAR的构建体是载体，例如质粒，或病毒载体(例如，慢病毒载体)。
在一些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞(例如，真核细胞)中的多个(例如，至少约2、3、4、5、10、20、50、100或更多个)靶标RNA的方法，其包包括入多个dRNA或编码多个dRNA的构建体至宿主细胞，其中每个dRNA包含与所述多个靶标RNA中的相应靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中每个dRNA能够招募ADAR，以使相应靶标RNA的靶标A脱氨基。
在一些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞(例如，真核细胞)中的多个(例如，至少约2、3、4、5、10、20、50、100或更多个)靶标RNA的方法，其包括引入多个dRNA或编码多个dRNA的构建体至宿主细胞，其中每个dRNA包含与所述多个靶标RNA的相应靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中每个dRNA招募内源表达的ADAR，以使相应靶标RNA中的靶标A脱氨基。
在一些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞(例如，真核细胞)中的多个(例如，至少约2、3、4、5、10、20、50、100、1000或更多个)靶标RNA的方法，其包括引入(a)多个dRNA或者编码多个dRNA的构建体，和(b)ADAR或者编码ADAR的构建体到宿主细胞中，其中每个dRNA包含互补RNA序列，其与所述多个靶标RNA中的相应靶标RNA杂交，并且其中每个dRNA招募ADAR，以使相应靶标RNA中的靶标A脱氨基。
在一个方面，本申请提供了通过引入本文所述的多个脱氨酶招募RNA，一种或多种编码脱氨酶招募RNA的构建体或文库至宿主细胞，来编辑宿主细胞中的多个RNA的方法。
在某些实施方案中，用于编辑靶标RNA的方法包括引入多种脱氨酶招募RNA或包含多种脱氨酶招募RNA的一种或多种构建体至宿主细胞中，以招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以对一个或多个靶标RNA中的一个或多个靶标腺苷进行脱氨基反应，其中每种脱氨酶招募RNA包含与相应靶标RNA互补的RNA序列。
在一个方面，本申请提供了用于在宿主细胞(例如，真核细胞)中产生靶标RNA和/或由靶标RNA编码的蛋白质的一种或多种修饰的方法，其包括引入dRNA或编码该dRNA的构建体到宿主细胞中，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述一个或多个修饰选自下组：由靶标RNA编码的蛋白质的点突变，由靶标RNA编码的蛋白质的错误折叠，靶标RNA中的过早的终止密码子，靶标RNA中的异常剪接位点和靶标RNA中的可变剪接位点。
在某些实施方案中，用于在宿主细胞(例如，真核细胞)中在靶标RNA和/或由靶标RNA编码的蛋白质中产生的一种或多种修饰的方法，其包括引入多个脱氨酶招募RNA或编码多个脱氨酶招募RNA的构建体至宿主细胞中，其中每个dRNA包含与所述多个靶标RNA中的相应靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中每个dRNA能够招募ADAR以使相应的靶标RNA的靶标A脱氨基。
在一个方面，本申请提供了根据本文所述的dRNA的任何一种的脱氨酶招募RNA的用途，用于编辑宿主细胞中的靶标RNA。在某些实施方案中，脱氨酶招募RNA包含与待编辑的靶标RNA杂交的互补RNA序列。
在一个方面，本申请提供了根据本文所述的dRNA的任何一种的脱氨酶招募RNA的用途，用于在靶标RNA和/或由靶标RNA编码的蛋白质上产生一种或多种修饰，其中所述一种或多种修饰选自下组：由靶标RNA编码的蛋白质的点突变，由靶标RNA编码的蛋白质的错误折叠，靶标RNA中的过早的终止密码子，靶标RNA中的异常剪接位点，以及靶标RNA中的可变剪接位点。在某些实施方案中，所述脱氨酶招募RNA包含与待编辑的靶标RNA杂交的互补RNA序列。
本发明还涉及利用内源性腺苷脱氨酶编辑真核细胞中的靶标RNA的方法，其包括将如本文所述的dRNA或编码dRNA的构建体引入真核细胞中以招募天然内源性的作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)，以对靶标RNA序列中的靶标腺苷进行脱氨基反应。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，dRNA包含至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸中的任何一种。在某些实施方案中，dRNA的长度为约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-200、100-150、100-175、110-200、110-175、110-150或105-140个核苷酸中的任何一种。在一些实施方案中，dRNA长约60-200个核苷酸，例如长约60-150、65-140、68-130或70-120个核苷酸中的任意。在一些实施方案中，dRNA为约71个核苷酸长。在一些实施方案中，dRNA为约111个核苷酸长。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，dRNA不包含ADAR-招募结构域。“ADAR-招募结构域”可以是与ADAR以高亲和力结合的核苷酸序列或结构，或与在工程化的ADAR构建体中与ADAR融合的结合配偶体结合的核苷酸序列。示例性ADAR招募域包括，但不限于，GluR-2，GluR-B(R/G)，GluR-B(Q/R)，GluR-6(R/G)，5HT2C和FlnA(Q/R)域；参见，例如Wahlstedt，Helene和Marie，"Site-selective versus promiscuous A-to-Iediting."Wiley Interdisciplinary Reviews:RNA 2.6(2011):761-771，其通过引用以其整体并入本文。在一些实施方案中，dRNA不包含双链部分。在一些实施方案中，dRNA不包含发夹结构，诸如MS2茎环。在一些实施方案中，dRNA是单链的。在一些实施例中，所述dRNA不包含DSB结合结构域。在一些实施方案中，dRNA由互补RNA序列组成(或基本由其组成)。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，dRNA不包含化学修饰。在一些实施方案中，dRNA不包含化学修饰的核苷酸，诸如2’-O-甲基化核苷酸或具有硫代磷酸酯连接的核苷酸。在一些实施方案中，dRNA仅在首尾各3个残基处包含2'-O-甲基化和硫代磷酸酯连接。在一些实施方案中，dRNA不是反义寡核苷酸(ASO)。
在根据本文所述的方法或用途的任何一种的某些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是真核细胞。优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。最优选地，所述宿主细胞是人类细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是鼠科细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞是植物细胞或真菌细胞。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的一些实施方案中，宿主细胞是细胞系，诸如HEK293T，HT29，A549，HepG2，RD，SF268，SW13和HeLa细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原代细胞，诸如成纤维细胞，上皮细胞或免疫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是T细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是有丝分裂后细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是中枢神经系统(CNS)的细胞，诸如脑细胞，例如小脑细胞。
在一些实施方案中，提供了在原代宿主细胞(例如，T细胞或CNS细胞)中编辑靶标RNA的方法，其包括将dRNA或编码该dRNA的构建体引入宿主细胞，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA招募宿主细胞的内源表达的ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基。
在根据本文所述的方法或用途的任何一种的某些实施方案中，所述ADAR对宿主细胞是内源的。在一些实施方案中，作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)天然地或内源地存在于宿主细胞中，例如，天然地或内源地存在于真核细胞中。在一些实施方案中，所述ADAR由宿主细胞内源表达。在某些实施方案中，将所述ADAR外源引入宿主细胞中。在一些实施例中，所述ADAR是ADAR1和/或ADAR2。在某些实施方案中，所述ADAR是选自下组的一种或多种ADAR：hADAR1，hADAR2，小鼠ADAR1和ADAR2。在一些实施方案中，ADAR是ADAR1，诸如ADAR1的p110同种型(“ADAR1p110”)和/或ADAR1的p150同种型(“ADAR1p150”)。在一些实施方案中，ADAR是ADAR2。在一些实施方案中，ADAR是通过宿主细胞表达的ADAR2，例如通过小脑细胞表达的ADAR2。
在一些实施方案中，ADAR是对宿主细胞是外源的ADAR。在一些实施方案中，ADAR是天然存在的ADAR的过度活跃的突变体。在一些实施方案中，ADAR是包含E1008Q突变的ADAR1。在一些实施方案中，ADAR不是包含结合结构域的融合蛋白。在一些实施方案中，ADAR不包含工程化的双链核酸结合结构域。在一些实施方案中，ADAR不包含与融合至dRNA中的互补RNA序列的MS2发夹结合的MCP结构域。在一些实施方案中，ADAR不包括DSB。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的一些实施方案中，宿主细胞具有高表达水平的ADAR1(诸如ADAR1p110和/或ADAR1p150)，例如相对于β-微管蛋白的蛋白质表达水平的至少约10％，20％，50％，100％，2x，3x，5x或更高中的任何一项。在一些实施方案中，宿主细胞具有高表达水平的ADAR2，例如相对于β-微管蛋白的蛋白质表达水平的至少约10％，20％，50％，100％，2x，3x，5x或更高中的任何一项。在一些实施方案中，宿主细胞具有低表达水平的ADAR3，例如相对于β-微管蛋白的蛋白质表达水平不超过约5x，3x，2x，100％，50％，20％或更少中的任何一项。
在根据本文所述的方法或用途的任何一种的某些实施方案中，所述互补RNA序列包含与靶标RNA中的靶标A直接相对的胞苷、腺苷或尿苷。在一些实施方案中，互补RNA序列包含与靶标RNA中的靶标A直接相对的胞苷错配。在一些实施方案中，胞苷错配位于距互补RNA序列的5'端至少5个核苷酸，例如至少10、15、20、25、30或更多个核苷酸。在一些实施方案中，胞苷错配位于距互补RNA序列的3'端至少20个核苷酸，例如至少25、30、35或更多个核苷酸。在一些实施方案中，胞苷错配不位于距互补RNA序列的3'端20(例如15、10、5或更少)个核苷酸内。在一些实施方案中，胞苷错配位于距互补RNA序列的3'端至少20个核苷酸(例如，至少25、30、35或更多个核苷酸)和距5'端至少5个核苷酸(例如，至少10、15、20、25、30或更多个核苷酸)。在一些实施方案中，胞苷错配位于互补RNA序列的中心。在一些实施方案中，胞苷错配位于dRNA中互补序列中心的20个核苷酸(例如15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个核苷酸)内。
本文所述的dRNA还可表征为包括，从5'端至3'端：一个5'部分，一个与靶RNA中的靶标A正好相对的胞苷错配，和一个3'部分。在一些实施方案中，3’部分不短于约7nt(例如不短于8nt，不短于9nt，以及不短于10nt)核苷酸。在一些实施方案中，3'部分长约7nt-25nt核苷酸(例如长约10nt-15nt或21nt-25nt核苷酸)。在一些实施方案中，5'部分不小于约25个核苷酸(例如不小于约30nt，不小于约35nt，不小于约40nt和不小于约45nt)核苷酸。在一些实施方案中，5'部分长约25nt-85nt核苷酸(例如长约25nt-80nt，25nt-75nt，25nt-70nt，25nt-65nt，25nt-60nt，30nt-55nt，40nt-55nt或45nt-55nt核苷酸)。在一些实施方案中，5'部分长约25nt-85nt核苷酸(例如长约25nt-80nt，25nt-75nt，25nt-70nt，25nt-65nt，25nt-60nt，30nt-55nt，40nt-55nt或45nt-55nt核苷酸)，而3'部分的长度约为7nt-25nt核苷酸(例如长约10nt-15nt或21nt-25nt核苷酸)。在一些实施方案中，5′部分比3′部分长。在一些实施方案中，5'部分长约55个核苷酸，而3'部分长约15个核苷酸。
在一些实施方案中，胞苷错配在dRNA中的位置根据本文实施例中描述的任何的dRNA所述，并且dRNA可以为例如Xnt-c-Ynt的形式，其中X表示5’部分的长度，Y表示3'部分的长度：55nt-c-35nt，55nt-c-25nt，55nt-c-24nt，55nt-c-23nt，55nt-c-22nt，55nt-c-21nt，55nt-c-20nt，55nt-c-19nt，55nt-c-18nt，55nt-c-17nt，55nt-c-16nt，55nt-c-15nt，55nt-c-14nt，55nt-c-13nt，55nt-c-12nt，55nt-c-11nt，55nt-c-10nt，55nt-c-9nt，55nt-c-8nt，55nt-c-7nt，55nt-n-20nt，50nt-n-20nt，45nt-n-20nt，55nt-n-15nt，50nt-n-15nt，45nt-c-45nt，45nt-c-55nt，54nt-c-12nt，53nt-c-13nt，52nt-c-14nt，51nt-c-15nt，50nt-c-16nt，49nt-c-17nt，48nt-c-18nt，47nt-c-19nt，46nt-c-20nt，45nt-c-21nt，44nt-c-22nt，43nt-c-23nt，54nt-c-15nt，53nt-c-16nt，52nt-c-17nt，51nt-c-18nt，50nt-c-19nt，49nt-c-20nt，48nt-c-21nt，47nt-c-22nt，46nt-c-23nt，54nt-c-17nt，53nt-n-18nt，52nt-n-19nt，51nt-n-20nt，50nt-n-21nt，49nt-n-22nt，和48nt-c-23。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，互补RNA序列还包含一个或多个鸟苷(G)，例如1、2、3、4、5、6或更多个G，每个与靶标RNA中的非靶标腺苷直接相对。在一些实施方案中，互补RNA序列包含与靶标RNA中的非靶标腺苷相对的两个或更多个连续错配核苷酸(例如2、3、4、5或更多个错配核苷酸)。在一些实施方案中，靶标RNA包含不超过约20个非靶标A，例如不超过约15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个非靶标A。与非靶标A相对的G和连续错配的核苷酸可以降低ADAR的脱靶编辑作用。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，靶标A的5'最近邻位是选自U，C，A和G的核苷酸，优先度U>C≈A>G且靶标A的3'最近邻位是选自G，C，A和U的核苷酸，优先度G>C>A≈U。在某些实施方案中，在靶标RNA中，靶标A是选自下组的三碱基基序：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。在某些实施方案中，所述三碱基基序是UAG，并且所述dRNA包含与所述三碱基基序中的U直接相对的A，与所述靶标A直接相对的C，和与三碱基基序中的G直接相对的C，G或U。在某些实施方案中，所述三碱基基序是靶标RNA中的UAG，并且所述dRNA包含与靶标RNA的UAG相对的ACC，ACG或ACU。在某些实施方案中，三碱基基序是靶标RNA中的UAG，并且dRNA包含与靶标RNA的UAG相对的ACC。
在一些实施方案中，dRNA包含一种或多种修饰。dRNA的示例性修饰包括但不限于硫代磷酸酯骨架修饰，核糖中的2'取代(例如2'-O-甲基化和2'-氟取代)，LNA和L-RNA。在一些实施方案中，dRNA包含一种或多种修饰，例如2’-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，dRNA约为60-200(此范围涵盖数字60和200之间的任何连续正整数，例如60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、130、140、150、160、170、180、190、200)个核苷酸长度，并且包含一个或多个修饰(例如2'-O-甲基化和/或3'-硫代磷酸酯化)。在一些实施方案中，dRNA长约60-200个核苷酸，并包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，dRNA长约60-200个核苷酸，并且包含2′-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化修饰。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2′-O-甲基化和/或在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2′-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，和在一个或多个尿苷中，例如在所有尿苷中，包含2′-O-甲基化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在单个或多个或所有尿苷中包含2'-O-甲基化，以及在与靶标腺苷相对的核苷酸，和/或与靶标腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸中包含修饰。在某些实施方案中，与靶标腺苷相对的核苷酸和/或与靶标腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸中的修饰是2’-O-甲基化。在某些实施方案中，与靶腺苷相对的核苷酸和/或与靶腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸中的修饰是硫代磷酸酯连接，例如3′-硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在所有尿苷中包含2'-O-甲基化，并且与靶腺苷相对的核苷酸的3'端和/或5'端紧邻的核苷酸中包含2'-O-甲基化。在某些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在第首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在单个或多个或所有尿苷中包含2'-O-甲基化，并且在与靶腺苷相对核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近核苷酸中包含3'-硫代磷酸酯化连接。在一些实施方案中，dRNA在首尾各5个核苷酸中包含2’-O-甲基化，并且在首尾各5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化。
在根据本文所述的方法或用途的任何一种的某些实施方案中，所述靶标RNA是选自下组的任何一种：前信使RNA，信使RNA，核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA和小RNA(例如，miRNA)。在一些实施方案中，靶标RNA是前信使RNA。在一些实施方案中，靶标RNA是信使RNA。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，该方法进一步包括将ADAR3的抑制剂引入宿主细胞。在一些实施方案中，ADAR3的抑制剂是针对ADAR3的RNAi，诸如针对ADAR3的shRNA或针对ADAR3的siRNA。在一些实施方案中，该方法进一步包括将干扰素的刺激剂引入宿主细胞。在一些实施方案中，ADAR可由干扰素诱导，例如，ADAR是ADARp150。在一些实施方案中，干扰素的刺激剂是IFNα。在一些实施方案中，ADAR3的抑制剂和/或干扰素的刺激剂由编码dRNA的相同构建体(例如，载体)编码。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，靶标RNA的编辑效率为至少约20％，诸如至少约25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％,75％,80％,85％,90％或更高中的任何一项。在一些实施方案中，编辑的效率通过Sanger测序来确定。在一些实施方案中，编辑的效率由下一代测序确定。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，该方法具有低的脱靶编辑率。在一些实施方案中，该方法对靶标RNA中的非靶标A具有低于约1％(例如，不超过约0.5％，0.1％，0.05％，0.01％，0.001％或更低中的任何一项)的编辑效率。在一些实施方案中，该方法不编辑靶标RNA中的非靶标A。在一些实施方案中，该方法对非靶标RNA中的A具有低于约0.1％(例如，不超过约0.05％，0.01％，0.005％，0.001％，0.0001％或更低中的任何一项)的编辑效率。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，该方法不诱导免疫应答，诸如先天免疫应答。在一些实施方案中，该方法不诱导宿主细胞中干扰素和/或白介素的表达。在一些实施方案中，该方法在宿主细胞中不诱导IFN-β和/或IL-6表达。
本发明还提供了经编辑的RNA或宿主细胞，所述宿主细胞具有通过本文所述的方法的任何一种所产生的经编辑的RNA。在一些实施方案中，经编辑的RNA包含肌苷。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含具有错义突变，过早的终止密码子，可变剪接位点或异常剪接位点的RNA。在一些实施方案中，所述宿主细胞包含突变的，截短的或错误折叠的蛋白质。
如本文所述的“宿主细胞”是指可用作宿主细胞的任何细胞类型，前提是其可如本文所述的被修饰。例如，所述宿主细胞可以是具有作用于RNA的内源性表达的腺苷脱氨酶(ADAR)的宿主细胞，或者可以是通过本领域已知的方法引入作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)的宿主细胞。例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，真核细胞或植物细胞。在一些实施方案中，所述宿主细胞源自预先建立的细胞系，例如哺乳动物细胞系，包括人类细胞系或非人类细胞系。在一些实施方案中，所述宿主细胞源自个体，例如人类个体。
本文使用的“引入(introducing)”或“引入(introduction)”是指将一种或多种多核苷酸(例如dRNA)或一种或多种构建体(包括本文所述的载体，它的一种或多种转录物)递送至所述宿主细胞。本发明用作能够靶向的编辑RNA的基础平台，例如，前信使RNA，信使RNA，核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA和小RNA(例如miRNA)。本申请的方法可以采用许多递送系统，包括但不限于：病毒，脂质体，电穿孔，显微注射和接合作用，以实现如本文所述的dRNA或构建体向宿主细胞中的引入。常规的基于病毒和非病毒的基因转移方法可用于将核酸引入哺乳动物细胞或靶标组织。此类方法可用于将编码本申请的dRNA的核酸施用于培养的细胞或宿主生物体中。非病毒载体递送系统包括DNA质粒，RNA(例如本文所述的构建体的转录物)，裸核酸和与递送运载体复合的核酸，例如脂质体。所述病毒载体递送系统包括DNA和RNA病毒，其具有游离或整合的基因组以递送至所述宿主细胞。
非病毒递送核酸的方法包括脂质转染，核转染，显微注射，生物弹道学，病毒体，脂质体，免疫脂质体，聚合阳离子或脂质:核酸缀合物，电穿孔，纳米颗粒，外泌体，微泡或基因枪，裸DNA和人工病毒粒子。
使用基于RNA或DNA病毒的系统来递送核酸在使病毒靶向特定细胞和使病毒的有效负载运输到细胞核方面具有高效率。
在根据本文描述的任何一种方法或用途的某些实施方案中，该方法包括将编码dRNA的病毒载体(诸如，慢病毒载体)引入宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括将编码dRNA的质粒引入宿主细胞。在一些实施方案中，该方法包括将dRNA(例如，合成dRNA)引入(例如，通过电穿孔)到宿主细胞中。在一些实施方案中，该方法包括将dRNA转染到宿主细胞中。
在脱氨基之后，根据靶标RNA中的靶向的腺苷的位置，可以使用不同方法确定靶标RNA和/或靶标RNA编码的蛋白质的修饰。例如，为了确定在靶标RNA中是否已将“A”编辑为“I”，可以使用本领域已知的RNA测序方法来检测RNA序列的修饰。当靶标腺苷位于mRNA的编码区中时，RNA编辑可以引起mRNA编码的氨基酸序列的改变。例如，可以将点突变引入mRNA，或者mRNA中的先天的或获得性的点突变被回复以产生野生型基因产物，因为“A”转化为“I”。通过本领域已知的方法进行氨基酸测序可用于发现编码的蛋白质中氨基酸残基的任何变化。终止密码子的修饰可以通过评估功能性的、伸长的、截短的、全长的和/或野生型的蛋白质的存在来确定。例如，当靶标腺苷位于UGA，UAG或UAA终止密码子中时，靶标A(UGA或UAG)或多个A(UAA)的修饰可创造出通读突变和/或延长的蛋白质，或者，由靶标RNA编码的截短的蛋白质可以被回复以产生有功能的、全长的和/或野生型的蛋白质。靶标RNA的编辑还可以在靶标RNA中产生异常剪接位点和/或可变的剪接位点，从而导致延长的，截短的或错误折叠的蛋白质，或者靶标RNA中编码的异常剪接或可变剪接位点可以被回复以产生有功能的、正确折叠的、全长的和/或野生型的蛋白质。在一些实施方案中，本申请考虑编辑先天的和获得性的基因变化，例如，错义突变，过早的终止密码子，异常剪接或由靶标RNA编码的可变剪接位点。使用已知方法评估由靶标RNA编码的蛋白质的功能，可以发现RNA编辑是否实现了期望的效果。因为腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基可以校正编码蛋白质的突变RNA中的靶标位置处的突变的A，所以对脱氨基为肌苷的鉴定可以提供功能蛋白质是否存在的评估，或者突变的腺苷引起的、与疾病或药物抗性相关的RNA是否已回复或部分回复的评估。类似地，因为腺苷(A)到肌苷(I)的脱氨基作用可在所得蛋白质中引入点突变，所以对脱氨基为肌苷的鉴定可以提供疾病原因或疾病相关因素的功能性指征。
当靶标腺苷的存在引起异常剪接时，读出值可以是异常剪接的发生和频率的评估。另一方面，当期望的靶标腺苷的脱氨基作用被引入剪接位点时，可以使用类似的方法来检查是否发生所需的剪接类型。使用本领域技术人员公知的方法，在靶标腺苷脱氨基之后鉴定出肌苷存在的示例性合适方法是RT-PCR和测序。
靶标腺苷的脱氨基作用包括例如点突变，过早的终止密码子，异常剪接位点，可变剪接位点和所得蛋白质的错误折叠。这些效应可以诱导与疾病相关的RNA和/或蛋白质的结构和功能变化，无论它们是基因遗传的还是由获得性基因突变引起的，或者可以诱导与抗药性发生相关的RNA和/或蛋白质的结构和功能变化。因此，通过改变与疾病相关的RNA和/或蛋白质的结构和/或功能，可以将dRNA，编码dRNA的构建体和本申请的RNA编辑方法用于预防或治疗遗传性疾病或病况，或与获得性基因突变相关的疾病或病况。
在一些实施方案中，靶标RNA是调节RNA。在一些实施方案中，待编辑的靶标RNA是核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA或小RNA(例如，miRNA，pri-miRNA，pre-miRNA，piRNA，siRNA，snoRNA，snRNA，exRNA或scaRNA)。靶标腺苷的脱氨基作用包括例如核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA或小RNA(例如，miRNA)的结构和功能变化，包括了靶标RNA的三维结构和/或功能损失或功能获得的变化。在一些实施方案中，靶标RNA中靶标A的脱氨基作用改变了靶标RNA的一种或多种下游分子(例如，蛋白质，RNA和/或代谢物)的表达水平。所述下游分子的表达水平的变化可以是表达水平的增加或减少。
本申请的一些实施方案涉及宿主细胞中靶标RNA的多重编辑，其可用于筛选靶标基因的不同变体或宿主细胞中的不同基因。在一些实施方案中，其中所述方法包含将多个dRNA引入所述宿主细胞，所述多个dRNA中的至少两个dRNA具有不同的序列和/或具有不同的靶标RNA。在一些实施方案中，每种dRNA具有不同的序列和/或不同的靶标RNA。在一些实施方案中，该方法在宿主细胞中的单个靶标RNA中产生多个(例如，至少2、3、5、10、50、100、1000或更多个)修饰。在一些实施方案中，该方法在宿主细胞中的多个(例如，至少2、3、5、10、50、100、1000或更多个)靶标RNA中产生修饰。在一些实施方案中，该方法包括：编辑多个宿主细胞群体中的多个靶标RNA。在一些实施方案中，每个宿主细胞群体接收不同的dRNA或具有与其他宿主细胞群体不同的靶标RNA的dRNA。
脱氨酶招募RNA，构建体和文库
在一个方面，本申请提供了可用于本文所述方法的任何一种的脱氨酶招募RNA。本节中描述的任何一种dRNA可用于本文所述的RNA编辑和治疗方法中。旨在将本文描述的dRNA的任何特征和参数相互组合，就好像每个组合被单独描述一样。本文描述的dRNA不包含CRISPR/Cas系统中使用的tracrRNA，crRNA或gRNA。
在一些实施方案中，提供了一种脱氨酶招募RNA(dRNA)，其通过招募ADAR对靶标RNA中的靶标腺苷进行脱氨基作用，所述ADAR包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列。
在一个方面，本发明提供了包含本文所述的任何一种脱氨酶招募RNA的构建体。在某些实施方案中，所述构建体是病毒载体(优选地，慢病毒载体)或质粒。在一些实施方案中，所述构建体编码单个dRNA。在一些实施方案中，所述构建体编码多个(例如，约1、2、3、4、5、10、20或更多个中的任一项)dRNA。
在一个方面，本申请提供了包含多个脱氨酶招募RNA或本文所述的多种构建体的文库。
在一个方面，本申请提供了包含所述脱氨酶招募RNA或本文所述构建体的组合物或宿主细胞。在某些实施方案中，所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。优选地，所述宿主细胞是哺乳动物细胞。最优选地，所述宿主细胞是人类细胞。
在根据本文所述的dRNA，构建体，文库或组合物中的任一种的某些实施方案中，所述互补RNA序列包含与在靶标RNA中待编辑的靶标腺苷直接相对的胞苷，腺苷或尿苷。在某些实施方案中，所述互补RNA序列还包含一种或多种鸟苷，其各自与靶标RNA中的非靶标腺苷直接相对。在某些实施方案中，靶标A的5'最近邻位是选自U，C，A和G的核苷酸，优先度U>C≈A>G且靶标A的3'最近邻位是选自G，C，A和U的核苷酸，优先度G>C>A≈U。在一些实施例中，靶标A的5'最近邻位是U。在一些实施例中，靶标A的5'最近邻位是C或A。在一些实施例中，靶标A的3'最近邻位是G。在一些实施方案中，靶标A的3'最近邻位是C。
在根据本文所述的dRNA，构建体，文库或组合物中的任一种的某些实施方案中，在靶标RNA中，靶标A是选自下组的三碱基基序：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。在某些实施方案中，所述三碱基基序是UAG，并且dRNA包含与三碱基基序中的U直接相对的A，与靶标A直接相对的C，和与三碱基基序中的G直接相对的C，G或U。在某些实施方案中，所述三碱基基序是靶标RNA中的UAG，并且所述dRNA包含与靶标RNA的UAG相对的ACC，ACG或ACU。
在一些实施方案中，dRNA包含与靶标RNA中的靶标A直接相对的胞苷错配。在一些实施方案中，胞苷错配靠近互补RNA序列的中心，诸如在距互补RNA序列的中心20、15、10、5、4、3、2或1个核苷酸内。在一些实施方案中，胞苷错配距互补RNA序列的5'末端至少5个核苷酸。在一些实施方案中，胞苷错配距互补RNA序列的3'末端至少20个核苷酸。
在根据本文所述的dRNA，构建体，文库或组合物中的任一种的某些实施方案中，所述dRNA包含至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90，100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240或250个核苷酸中的任一项。在某些实施方案中，所述dRNA的长度为约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-150或105-140个核苷酸中的任一项。在一些实施方案中，所述dRNA长约60-200(例如约60-150，65-140，68-130，或70-120中的任一项)个核苷酸。
本申请的dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列。所述互补RNA序列与靶标RNA完全互补或基本上互补，以允许互补RNA序列与靶标RNA杂交。在一些实施方案中，所述互补RNA序列具有100％的与靶标RNA的序列互补性。在一些实施方案中，所述互补RNA序列与靶标RNA中至少约20、40、60、80、100、150、200或更多个核苷酸中的任何一项的连续延伸至少约70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％或更高的任一项的互补。在一些实施方案中，通过互补RNA序列和靶标RNA之间的杂交形成的dsRNA具有一个或多个(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个)非Watson-Crick碱基对(即错配)。
ADAR，例如，人类ADAR酶编辑具有不同特异性的双链RNA(dsRNA)结构，这取决于许多因素。一个重要因素是构成dsRNA序列的两条链的互补性的程度。所述dRNA和靶标RNA之间的完美互补性通常导致ADAR的催化结构域以非判别性方式使腺苷脱氨基。可以通过在dsRNA区域中引入错配来修饰ADAR的特异性和效率。例如，优选推荐A-C错配以增加待编辑的腺苷的脱氨基的特异性和效率。相反，在除了靶标A的其他A(腺苷)位置(即“非靶标A”)，G-A错配可以减少脱靶编辑。所述dRNA与其靶标RNA之间的dsRNA形成不一定需要完美的互补性，前提是dRNA和靶标RNA之间的杂交和dsRNA的形成具有基本的互补性。在一些实施方案中，其dRNA序列或单链RNA区域具有至少约70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％或99％序列中的任何一项的与靶标RNA的互补性，当理最佳对时。可以使用用于比对序列的任何合适的算法来确定最佳比对，所述算法的非限制性的实例包括Smith-Waterman算法，Needleman-Wimsch算法，基于Burrows-Wheeler变换的算法(例如Burrows WheelerAligner)。
与靶标腺苷相邻的核苷酸也影响脱氨基的特异性和效率。例如，在靶标RNA序列中待编辑的靶标腺苷的5'最近邻位具有优先度U>C≈A>G并且在靶标RNA序列中待编辑的靶标腺苷的3'最近邻位具有优先度：G>C>A≈U，在腺苷脱氨基的特异性和效率方面。在一些实施方案中，当在靶标RNA中，靶标腺苷可以是选自下组的三碱基基序：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU时，所述腺苷脱氨基的特异性和效率高于其他的三碱基基序中的腺苷。在一些实施方案中，待编辑的靶标腺苷处于三碱基基序UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，AAG，AAC或AAA中时，所述腺苷脱氨基的效率高于其他基序中的腺苷。对于相同的三碱基基序，dRNA的不同设计也可导致不同的脱氨基效率。以三碱基基序UAG为例，在一些实施方案中，当dRNA包含与待编辑的靶标腺苷直接相对的胞苷(C)时，所述腺苷(A)直接与尿苷相对，而胞苷(C)，鸟苷(G)或尿苷(U)与鸟苷直接相对，靶标腺苷的脱氨基的效率高于使用其他dRNA序列的脱氨基的效率。在一些实施方案中，当dRNA包含与靶标RNA的UAG相对的ACC，ACG或ACU时，所述靶标RNA的UAG中A的编辑效率可达到约25％-30％。
除了靶标腺苷外，靶标RNA中可能存在一个或多个不希望被编辑的腺苷。对于这些腺苷，优选尽可能降低它们的编辑效率。本发明发现，鸟苷与靶标RNA中的腺苷直接相对处，脱氨基效率显著降低。因此，为了减少脱靶脱氨基作用，可以将dRNA设计成包含一个或多个鸟苷，其与靶标RNA中除待编辑的靶标腺苷之外的一种或多种腺苷直接相对。
编辑靶标RNA序列的所希望的特异性水平和效率可取决于不同的应用。按照本专利申请中的说明，本领域技术人员将能够根据其需要设计具有与靶标RNA序列互补或基本上互补的序列的dRNA，并且通过一些试验和错误，获得他们所希望的结果。如本文所用，术语“错配”是指双链RNA(dsRNA)中相对的核苷酸，其根据Watson-Crick碱基配对规则不形成完美的碱基对。错配碱基对包括：例如G-A，C-A，U-C，A-A，G-G，C-C，U-U碱基对。以A-C匹配为例，其中靶标A在靶标RNA中被编辑，dRNA被设计为包含与待编辑的A相对的C，在通过靶标RNA和dRNA之间的杂交形成的dsRNA中产生A-C错配。
在一些实施方案中，通过dRNA和靶标RNA之间的杂交形成的dsRNA不包含错配。在一些实施方案中，通过dRNA和靶标RNA之间的杂交形成的dsRNA包含一个或多个，例如1、2、3、4、5、6、7或更多个错配中的任何一个(例如，不同类型错配中相同类型的错配)。在一些实施方案中，通过dRNA和靶标RNA之间的杂交形成的dsRNA包含一个或多个错配，例如，1、2、3、4、5、6、7种选自下组的错配：G-A，C-A，U-C，A-A，G-G，C-C和U-U。
通过dRNA和靶标RNA之间的杂交形成的dsRNA中的错配核苷酸可以形成凸起，其可以促进靶标RNA的编辑效率。可能存在一个(仅在靶标腺苷处形成)或更多个由错配形成的凸起。额外的诱导凸起的错配可以在靶标腺苷的上游和/或下游。所述凸起可以是单错配凸起(由一个错配的碱基对引起)或多错配凸起(由多于一个连续的错配碱基对引起，优选两个或三个连续的错配碱基对)。
dRNA中的互补RNA序列是单链的。所述dRNA可以是完全单链的或具有一个或多个(例如，1、2、3或更多个)双链区和/或一个或多个茎环区。在一些实施方案中，互补RNA序列是至少约40、45、50、55、60、65、70、75、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200或更多个核苷酸中的任何一项。在某些实施方案中，互补RNA序列的长度为约40-260、45-250、50-240、60-230、65-220、70-220、70-210、70-200、70-190、70-180、70-170、70-160、70-150、70-140、70-130、70-120、70-110、70-100、70-90、70-80、75-200、80-190、85-180、90-170、95-160、100-200、100-150、100-175、110-200、110-175、110-150或105-140个核苷酸中的任一项。在一些实施方案中，dRNA长约60-200(例如约60-150、65-140、68-130或70-120)个核苷酸。在一些实施方案中，互补RNA序列为约71个核苷酸长。在一些实施方案中，互补RNA序列为约111个核苷酸长。
在一些实施方案中，除互补RNA序列外，dRNA还可包含用于稳定dRNA的区域，例如，一个或多个双链区和/或茎环区。在一些实施方案中，dRNA的双链区或茎环区可包含不超过约200、150、100、50、40、30、20、10个或更少个碱基对中的任一项。在一些实施方案中，dRNA不包含茎环或双链区。在一些实施方案中，dRNA包含ADAR招募结构域。在一些实施方案中，dRNA不包含ADAR招募结构域。
所述dRNA可包含一个或多个修饰。在一些实施方案中，dRNA具有一个或多个经修饰的核苷酸，包括核碱基修饰和/或骨架修饰。在一些实施方案中，dRNA长约60-200个核苷酸，并包含一个或多个修饰(例如2'-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化)。在一些实施方案中，经修饰的dRNA包含，从5'端至3'端：一个5'部分，一个与靶标RNA中的靶标A正好相对的胞苷错配，和一个3'部分，其中，3’部分不短于约7nt(例如不短于8nt，不短于9nt，以及不短于10nt)核苷酸。在一些实施方案中，5'部分不短于约25个(例如不短于约30nt，不短于约35nt，不短于约40nt和不短于约45nt)核苷酸。在一些实施方案中，5'部分长约25nt-85nt核苷酸(例如长约25nt-80nt，25nt-75nt，25nt-70nt，25nt-65nt，25nt-60nt，30nt-55nt，40nt-55nt或45nt-55nt核苷酸)。在一些实施方案中，3'部分长约7nt-25nt核苷酸(例如长约10nt-15nt或21nt-25nt核苷酸)。在一些实施方案中，5'部分长约25nt-85nt核苷酸(例如长约25nt-80nt，25nt-75nt，25nt-70nt，25nt-65nt，25nt-60nt，30nt-55nt，40nt-55nt或45nt-55nt核苷酸)，而3'部分长约7nt-25nt核苷酸(例如长约10nt-15nt或21nt-25nt核苷酸)。在一些实施方案中，5′部分比3′部分长。在一些实施方案中，5'部分长约55个核苷酸，并且3'部分长约15个核苷酸。在一些实施方案中，胞苷错配在dRNA中的位置根据本文实施例中描述的任何的dRNA所述，并且dRNA可以为如Xnt-c-Ynt的格式，其中X代表5’部分的长度，Y代表3'部分的长度：55nt-c-35nt，55nt-c-25nt，55nt-c-24nt，55nt-c-23nt，55nt-c-22nt，55nt-c-21nt，55nt-c-20nt，55nt-c-19nt，55nt-c-18nt，55nt-c-17nt，55nt-c-16nt，55nt-c-15nt，55nt-c-14nt，55nt-c-13nt，55nt-c-12nt，55nt-c-11nt，55nt-c-10nt，55nt-c-9nt，55nt-c-8nt，55nt-c-7nt，55nt-n-20nt，50nt-n-20nt，45nt-n-20nt，55nt-n-15nt，50nt-n-15nt，45nt-c-45nt，45nt-c-55nt，54nt-c-12nt，53nt-c-13nt，52nt-c-14nt，51nt-c-15nt，50nt-c-16nt，49nt-c-17nt，48nt-c-18nt，47nt-c-19nt，46nt-c-20nt，45nt-c-21nt，44nt-c-22nt，43nt-c-23nt，54nt-c-15nt，53nt-c-16nt，52nt-c-17nt，51nt-c-18nt，50nt-c-19nt，49nt-c-20nt，48nt-c-21nt，47nt-c-22nt，46nt-c-23nt，54nt-c-17nt，53nt-n-18nt，52nt-n-19nt，51nt-n-20nt，50nt-n-21nt，49nt-n-22nt，和48nt-c-23。
在一些实施方案中，dRNA长约为60-200个核苷酸且包含一个或多个修饰(例如2’-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化)。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2′-O-甲基化和/或在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2′-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，和在一个或多个尿苷中，例如在所有尿苷中，包含2′-O-甲基化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在单个或多个或所有尿苷中包含2'-O-甲基化，以及与靶标腺苷相对的核苷酸，和/或与靶标腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸中包含修饰。在某些实施方案中，与靶腺苷相对的核苷酸和/或与靶腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸的修饰是2’-O-甲基化。在某些实施方案中，与靶腺苷相对的核苷酸和/或与靶腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸的修饰是硫代磷酸酯连接，例如3′-硫代磷酸酯连接。在某些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在所有尿苷中包含2'-O-甲基化，并且与靶腺苷相对的核苷酸的3'端或5'端紧邻的核苷酸中包含2'-O-甲基化。在某些实施方案中，dRNA在首尾各3个核苷酸中包含2'-O-甲基化，在第首尾各3个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化，在所有尿苷中包含2'-O-甲基化，并且在与靶腺苷相对核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸中包含3'-硫代磷酸酯化。在一些实施方案中，dRNA在首尾各5个核苷酸中包含2’-O-甲基化，并且在首尾各5个核苷酸间连接中包含硫代磷酸酯化。本申请还考虑包含本文所述dRNA的构建体。如本文所用的术语“构建体”是指包含编码核苷酸序列的DNA或RNA分子，所述编码核苷酸序列可以转录成RNA或表达成蛋白质。在一些实施方案中，所述构建体含有一个或多个调控元件，其可操作地连接到编码RNA或蛋白质的核苷酸序列。当所述构建体被引入宿主细胞时，在合适的条件下，所述构建体中的编码核苷酸序列可以被转录或表达。
在一些实施方案中，所述构建体包含与编码核苷酸序列可操作地连接或空间连接的启动子，使得所述启动子控制编码核苷酸序列的转录或表达。所述启动子可位于其控制下的编码核苷酸序列的5'侧(上游)。所述启动子和编码序列之间的距离可以与该启动子与其起源于启动子的基因中它控制的基因之间的距离大致相同。如本领域所知，可以适应该距离的变化而不丧失启动子功能。在一些实施方案中，所述构建体包含5'UTR和/或3'UTR，其调节编码核苷酸序列的转录或表达。
在一些实施方案中，所述构建体是编码本申请中公开的任何一种dRNA的载体。术语“载体”是指能够转运与其连接的另一种核酸的核酸分子。所述载体包括但不限于单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端的，没有游离末端的(例如环状)核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多种多核苷酸。一种类型的载体是“质粒”，它是指环状的双链DNA环，其中可以例如通过标准分子克隆技术插入额外的DNA区段。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非附加型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此与宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的编码核苷酸序列的转录或表达。此类载体在本文中称为“表达载体”。
所述重组表达载体可以适合于在宿主细胞中转录或表达核酸的形式包含本发明的核酸。在一些实施方案中，所述重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于待用于转录或表达的宿主细胞进行选择，其与待转录或表达的核酸序列可操作地连接。在所述重组表达载体内，“可操作地连接”旨在表示感兴趣的核苷酸序列以允许核苷酸序列表达的方式与调控元件连接(例如在体外转录/翻译系统中或当载体被引入宿主细胞时在宿主细胞中)。
在一些实施方案中，提供了构建体(例如，载体，例如病毒载体)，其包含编码dRNA的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了构建体(例如，载体，诸如病毒载体)，其包含编码所述ADAR的核苷酸序列。在一些实施方案中，提供了构建体，其包含编码所述dRNA的第一核苷酸序列和编码所述ADAR的第二核苷酸序列。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列与相同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，第一核苷酸序列和第二核苷酸序列与不同的启动子可操作地连接。在一些实施方案中，所述启动子是可诱导的。在一些实施方案中，所述构建体不编码ADAR。在一些实施方案中，载体还包含编码ADAR3的抑制剂(例如，ADAR3 shRNA或siRNA)和/或干扰素的刺激剂(例如，IFN-α)的核酸序列。
治疗方法
本文所述的RNA编辑方法和组合物可用于治疗或预防个体的疾病或病况，包括但不限于：遗传性的基因疾病以及抗药性。
在一些实施方案中，提供了一种离体编辑个体(例如人类个体)细胞中的靶标RNA的方法，包括使用本文所述的任何一种RNA编辑方法编辑靶标RNA。
在一些实施方案中，提供了一种离体编辑个体(例如人类个体)细胞中的靶标RNA的方法，包括将dRNA或编码该dRNA的构建体引入个体的细胞中，其中所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基。在一些实施方案中，所述靶标RNA与个体的疾病或病况相关。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性的基因疾病或与一种或多种获得性基因突变(例如，抗药性)相关的疾病或病况。在一些实施方案中，该方法还包含从个体获得细胞。
在一些实施方案中，提供了治疗或预防个体(例如，人类个体)中的疾病或病况的方法，包括使用本文描述的RNA编辑方法的任何一种编辑个体细胞中与疾病或病况相关的靶标RNA。
在一些实施方案中，提供了治疗或预防个体(例如，人类个体)中的疾病或病况的方法，包括将dRNA或编码该dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基。在一些实施方案中，所述ADAR是分离细胞中的内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码该ADAR的构建体以引入分离的细胞。在一些实施方案中，该方法还包含培养具有经编辑的RNA的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用具有经编辑的RNA的细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性的基因疾病或与一种或多种获得性基因突变(例如，抗药性)相关的疾病或病况。
在一些实施方案中，提供了治疗或预防个体(例如，人类个体)中的疾病或病况的方法，包括将dRNA或编码该dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA能够招募宿主细胞的内源表达的ADAR以使所述靶标RNA中的靶标A脱氨基。在一些实施方案中，该方法还包括培养具有经编辑的RNA的细胞。在一些实施方案中，该方法还包括向个体施用具有经编辑的RNA的细胞。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性的基因疾病或与一种或多种获得性基因突变(例如，抗药性)相关的疾病或病况。
在一些实施方案中，提供了治疗或预防个体(例如，人类个体)中的疾病或病况的方法，包括向个体施用有效量的dRNA或编码该dRNA的构建体，其中所述dRNA包含与和疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基。在一些实施方案中，所述ADAR是个体细胞中的内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码该ADAR的构建体。在一些实施方案中，所述疾病或病况是遗传性的基因疾病或与一种或多种获得性基因突变(例如抗药性)相关的疾病或病况。
适用于使用本申请的方法治疗的疾病和病况包括与突变相关的疾病，诸如G至A突变，例如导致RNA转录物中的错义突变，过早的终止密码子，异常剪接或可变剪接的G至A突变。可以通过本申请的方法恢复的与疾病相关的突变的例子包括但不限于与癌症相关的TP53W53X(例如，158G>A)，与I型粘多糖贮积病(MPS I)相关的IDUAW402X(例如，外显子9中的TGG>TAG突变)，与埃勒斯-当洛斯综合征相关的COL3A1W1278X(例如3833G>A突变)，与原发性肺动脉高压相关的BMPR2W298X(例如893G>A)，与朱伯特综合征相关的AHI1W725X(例如2174G>A)，与范科尼贫血相关的FANCCW506X(例如1517G>A)，与原发性家族性肥厚性心肌病相关的MYBPC3W1098X(例如3293G>A)，和与X染色体连锁性严重联合免疫缺陷症相关的IL2RGW237X(例如710G>A)。在一些实施方案中，疾病或病况是癌症。在一些实施方案中，该疾病或病况是单基因疾病。在一些实施方案中，该疾病或病况是多基因疾病。
在一些实施方案中，提供了治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的癌症的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是TP53W53X(例如158G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：195、196或197的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防癌症的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或编码该dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR使靶标RNA中的靶标A脱氨基，从而拯救靶标RNA的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是TP53W53X(例如158G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ IDNO：195、196或197的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的MPS I(例如，Hurler综合征或Scheie综合征)的方法，包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此而拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是IDUAW402X(例如，外显子9中的TGG＞TAG突变)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：204或205的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防MPS I(例如，Hurler综合征或Scheie综合征)的方法，包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救了靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是IDUAW402X(例如，外显子9中的TGG＞TAG突变)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：204或205的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗个体中与具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的埃勒斯-当洛斯综合征疾病或病况的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是COL3A1W1278X(例如，3833G>A突变)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：198的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防埃勒斯-当洛斯综合征的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是COL3A1W1278X(例如3833G>A突变)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：198的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的原发性肺动脉高压的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，从而拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是BMPR2W298X(例如，893G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：199的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防原发性肺动脉高压的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是BMPR2W298X(例如，893G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：199的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的朱伯特综合征的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是AHI1W725X(例如2174G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：200的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防朱伯特综合征的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是AHI1W725X(例如2174G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：200的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的范科尼贫血的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞中，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是FANCCW506X(例如1517G＞A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：201的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防范科尼贫血的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是FANCCW506X(例如1517G＞A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：201的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的原发性家族性肥厚性心肌病的方法，其包括将dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是MYBPC3W1098X(例如3293G＞A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：202的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防原发性家族性肥厚性心肌病的方法，其包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是MYBPC3W1098X(例如3293G＞A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：202的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种治疗与个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA相关的X染色体连锁性严重联合免疫缺陷的方法，其包括dRNA或编码dRNA的构建体引入从个体离体的分离细胞，其中dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是分离的细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括将ADAR或编码ADAR的构建体引入分离的细胞。在一些实施方案中，靶标RNA是IL2RGW237X(例如710G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：203的核酸序列。
在一些实施方案中，提供了一种用个体中具有突变(例如，G>A突变)的靶标RNA治疗或预防的X染色体连锁性严重联合免疫缺陷的方法，包括向个体施用有效量的dRNA或编码dRNA的构建体，其中dRNA包含与与疾病或病况相关的靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的靶标A脱氨基，由此拯救靶标RNA中的突变。在一些实施方案中，ADAR是个体细胞中内源表达的ADAR。在一些实施方案中，该方法包括向个体施用ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，靶标RNA是IL2RGW237X(例如710G>A)。在一些实施方案中，dRNA包含SEQ ID NO：203的核酸序列。
如本文所用，“治疗(treatment)”或“治疗(treating)”是用于获得包括临床结果的有益或希望的结果的方法。出于本发明的目的，有益的或希望的临床结果包括但不限于以下一种或多种：减少由疾病引起的再一种症状，减少疾病的程度，稳定化疾病(例如，预防或延迟疾病的恶化)，预防或延迟疾病的散布(例如，转移)，预防或延迟疾病的发生或复发，延缓或减缓疾病的进展，改善疾病症态，提供疾病的缓解(无论是部分的还是全部的)，减少治疗疾病所需的一种或多种其他药物的剂量，延迟疾病的进展，提高生活质量和/或延长生存期。“治疗”还包括减少疾病或病况的病理后果。本发明的方法考虑了这些治疗方面中的任何一个或多个。
术语“个体”，“受试者”和“患者”在本文中可互换使用以描述哺乳动物，包括人类。所述个体包括但不限于：人类，牛，马，猫，犬，啮齿类动物或灵长类动物。在一些实施方案中，所述个体是人。在一些实施方案中，所述个体患有疾病或病况，例如抗药性。在一些实施方案中，所述个体需要治疗。
如本领域所理解的，“有效量”是指足以产生所希望的治疗结果(例如，降低疾病或病况的一种或多种症状的严重性或持续时间，稳定疾病或病况的一种或多种症状的严重程度，或消除疾病或病况的一种或多种症状)的组合物(例如，dRNA或编码该dRNA的构建体)的量。对于治疗用途，有益的或希望的结果包括例如减少由疾病引起的一种或多种症状(生物化学的，组织学的和/或行为学的)，包括其在疾病发展期间呈现的并发症和中间病理表型，提高那些患有疾病或病况的人的生活质量，减少治疗疾病所需的其他药物的剂量，增强另一种药物的效果，延迟疾病的进展和/或延长患者的存活。
一般而言，组合物的剂量，时间表和施用途径(例如，dRNA或编码dRNA的构建体)可以根据个体的大小和状况，并根据标准药学实践来确定。示例性施用途径包括静脉内，动脉内，腹膜内，肺内，囊内，肌内，气管内，皮下，眼内，鞘内或经皮。
本申请的RNA编辑方法不仅可以用于动物细胞，例如哺乳动物细胞，还可以用于修饰植物或真菌的RNA，例如，在具有内源表达的ADAR的植物或真菌中。本文描述的方法可用于产生具有改善性质的基因工程化的植物和真菌。
组合物、试剂盒和制品
本文还提供了包含dRNA，构建体，文库或具有如本文所述的经编辑的RNA的宿主细胞的任何一种的组合物(例如药物组合物)。
在一些实施方案中，提供了药物组合物，其包含本文所述的dRNA或者编码该dRNA的构建体的任一种，以及药学上可接受的载体，赋形剂或稳定剂(Remington'sPharmaceutical Sciences，第16版,Osol,A.Ed.(1980))。可接受的载体，赋形剂或稳定剂在所用剂量和浓度对接受者无毒，包括缓冲剂，诸如磷酸盐，柠檬酸盐和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)的多肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸，谷氨酰胺，天冬酰胺，组氨酸，精氨酸或赖氨酸；单糖，二糖和其他碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；螯合剂诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；成盐的反离子诸如钠；金属络合物(例如锌蛋白络合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。在一些实施方案中，提供了冻干制剂。用于体内施用的药物组合物必须是无菌的。这可以通过例如通过无菌过滤膜过滤而容易地实现。
进一步提供了可用于本文所述的RNA编辑方法或治疗方法中的任一种的试剂盒，其包含如本文所述的任何一种dRNA，构建体，组合物，文库或者经编辑的宿主细胞。
在一些实施方案中，提供了用于编辑宿主细胞中的靶标RNA的试剂盒，其包含dRNA，其中所述dRNA包含与靶标RNA杂交的互补RNA序列，其中所述dRNA能够招募ADAR以使靶标RNA中的A脱氨基。在一些实施方案中，所述试剂盒还包含ADAR或编码ADAR的构建体。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含ADAR3的抑制剂或其构建体。在一些实施方案中，试剂盒进一步包含干扰素的刺激物或其构建体。在一些实施方案中，所述试剂盒还包括用于进行本文所述的任何一种RNA编辑方法的说明书。
本申请的试剂盒处于合适的包装中。合适的包装包括但不限于：小瓶，瓶子，广口瓶，软包装(例如，密封的聚酯薄膜(Mylar)或塑料袋)等。试剂盒可任选地提供额外的组分，例如转染或转导试剂，细胞培养基，缓冲液和解释性信息。
因此，本申请还提供了制品。所述制品可包括容器和容器上或与容器相关的标签或包装插页。合适的容器包括小瓶(例如密封的小瓶)，瓶子，罐子，软包装等。在一些实施方案中，所述容器容纳药物组合物，并且可以具有无菌进入口(例如，所述容器可以是静脉内溶液袋或具有可由皮下注射针刺穿的塞子的小瓶)。容纳药物组合物的容器可以是多次使用的小瓶，其允许重组制剂的重复施用(例如2-6次施用)。包装说明书是指习惯上包括在治疗产品的商业包装中的说明书，其包含关于使用这些产品的适应症，用法，剂量，施用，禁忌症和/或警告的信息。另外，所述制品还可包含第二容器，其包含药学上可接受的缓冲液，例如注射用抑菌水(BWFI)，磷酸盐缓冲盐水，林格氏溶液(Ringer'ssolution)和葡萄糖溶液。它还可以包括从商业和用户角度所希望的其他材料，包括其他缓冲剂，稀释剂，过滤器，针头和注射器。
所述试剂盒或制品可包括多个单位剂量的药物组合物和使用说明书，其以足以在药房(例如，医院药房以及配药药房)中储存和使用的量包装。
示例性实施方案
在本文提供的实施方案中是：
1.一种用于在宿主细胞中编辑靶标RNA的方法，包括将脱氨酶招募RNA(dRNA)或编码所述dRNA的构建体引入宿主细胞，其中所述dRNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，并且其中所述脱氨酶招募RNA能够招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)以使所述靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。
2.如实施方案1所述的方法，其中所述RNA序列包含与所述靶标RNA中的所述靶腺苷直接相对的胞苷，腺苷或尿苷。
3.如实施方案2所述的方法，其中所述RNA序列包含与所述靶标RNA中的所述靶腺苷直接相对的胞苷错配。
4.如实施方案3所述的方法，其中所述胞苷错配位于所述dRNA中距所述互补序列的3'端至少20个核苷酸，并且距所述互补序列的5'端至少5个核苷酸。
5.如实施方案4所述的方法，其中所述胞苷错配位于距所述dRNA中所述互补序列中心(例如，在中心)的10个核苷酸内。
6.如实施方案1-5中任一项所述的方法，其中所述RNA序列进一步包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶标RNA中的非靶腺苷相对。
7.如实施方案1-6中任一项所述的方法，其中所述互补序列包含与所述靶标RNA中的非靶腺苷相对的两个或更多个连续错配核苷酸。
8.如实施方案1-7中任一项所述的方法，其中所述靶标RNA中所述靶标腺苷的5'最近邻位是选自U，C，A和G的核苷酸，优先度U＞C≈A＞G，而所述靶标RNA中所述靶标腺苷的3'最近邻位是选自G，C，A和U的核苷酸，优先度G＞C＞A≈U。
9.如实施方案1至8中任一项所述的方法，其中所述靶标RNA中，所述靶标腺苷位于选自下组的三碱基基序中：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。
10.如实施方案9所述的方法，其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述脱氨酶招募RNA包含与所述三碱基基序中的尿苷直接相对的A，与所述靶标腺苷直接相对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷直接相对胞苷，鸟苷或尿苷。
11.如实施方案1-10中任一项所述的方法，其中所述脱氨酶招募RNA的长度为约40-260个核苷酸。
12.如实施方案11所述的方法，其中所述脱氨酶招募RNA的长度为约60-230个核苷酸。
13.如实施方案11或12所述的方法，其中所述dRNA的长度大于约60个核苷酸。
14.如实施方案11-13中任一项所述的方法，其中所述dRNA的长度为约100至约150(例如，约110-150)个核苷酸。
15.如实施方案1-14中任一项所述的方法，其中所述靶标RNA是选自下组的RNA：前信使RNA，信使RNA，核糖体RNA，转移RNA，长非编码RNA和小RNA。
16.如实施方案15所述的方法，其中所述靶标RNA是前信使RNA。
17.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述ADAR由所述宿主细胞内源表达。
18.如实施方案1-16中任一项所述的方法，其中所述ADAR对于所述宿主细胞是外源的。
19.如实施方案18所述的方法，其进一步包括将所述ADAR引入所述宿主细胞。
20.如实施方案18或19所述的方法，其中所述ADAR包含E1008突变。
21.如实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述脱氨酶招募RNA是单链RNA。
22.如实施方案1-20中任一项所述的方法，其中所述互补RNA序列是单链的，并且其中所述脱氨酶招募RNA还包含一个或多个双链区。
23.如实施方案1-22中任一项所述的方法，其中所述dRNA不包含ADAR-招募结构域(例如，DSB结合结构域，GluR2结构域或MS2结构域)。
24.如实施方案1-23中任一项所述的方法，其中所述dRNA不包含化学修饰的核苷酸(例如，2’-O-甲基化或硫代磷酸酯化)。
25.如实施方案26所述的方法，其中所述靶标RNA中的靶标腺苷的脱氨基作用导致所述靶标RNA编码的蛋白质的点突变、截短、延伸和/或错误折叠；或者凭借所述靶标RNA中的错义突变、过早的终止密码子、异常剪接或可变剪接的回复导致有功能的、全长的、正确折叠的和/或野生型的蛋白。
26.如实施方案1-27中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
27.如实施方案28所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
28.如实施方案29所述的方法，其中所述宿主细胞是人或小鼠细胞。
29.如实施方案29或30所述的方法，其中所述ADAR是ADAR1和/或ADAR2。
30.如实施方案1-31中任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是原代细胞。
31.如实施方案32所述的方法，其中所述宿主细胞是T细胞。
32.如实施方案32所述的方法，其中所述宿主细胞是有丝分裂后细胞。
33.如实施方案1-34中任一项所述的方法，其进一步包括将ADAR3的抑制剂引入所述宿主细胞。
34.如实施方案1-35中任一项所述的方法，其进一步包括将干扰素的刺激剂引入所述宿主细胞。
35.如实施方案1-36中任一项所述的方法，包括引入各自靶向不同靶标RNA的多个dRNA。
36.如实施方案1-37中任一项所述的方法，其中所述编辑靶标RNA的效率为至少约30％(例如，至少约为30％,35％,40％,45％,50％,55％,60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％或更高)。
37.如实施方案1-38中任一项所述的方法，其中所述dRNA不诱导免疫应答。
38.凭借如实施方案1-39中任一项所述的方法产生的经编辑的RNA或具有经编辑的RNA的宿主细胞。
39.一种用于治疗或预防个体的疾病或病况的方法，其包括根据实施方案1-39中任一项的方法编辑与个体细胞中的疾病或病况相关的靶标RNA。
40.如实施方案41所述的方法，其中所述疾病或病况是遗传性基因疾病或与一种或多种获得性基因突变相关的疾病或病况。
41.如实施方案41或42所述的方法，其中所述靶标RNA具有G至A突变。
42.如实施方案41-43中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况是单基因疾病或病况。
43.如实施方案41-44中任一项所述的方法，其中所述疾病或病况是多基因疾病或病况。
44.如实施方案41-45中任一项所述的方法，其中：
(i)所述靶标RNA是TP53，并且所述疾病或病况是癌症；
(ii)所述靶标RNA是IDUA，并且所述疾病或病况是I型粘多糖贮积病(MPS I)；
(iii)所述靶标RNA是COL3A1，并且所述疾病或病况是埃勒斯-当洛斯综合征；
(iv)所述靶标RNA是BMPR2，并且所述疾病或病况是朱伯特综合征；
(v)所述靶标RNA是FANCC，并且所述疾病或病况是范科尼贫血；
(vi)所述靶标RNA是MYBPC3，并且所述疾病或病况是原发性家族性肥厚性心肌病；或
(vii)所述靶标RNA是IL2RG，并且所述疾病或病况是X染色体连锁性严重联合免疫缺陷。
45.一种通过招募作用于RNA的腺苷脱氨酶(ADAR)使靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基作用的脱氨酶招募RNA(dRNA)，其包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列。
46.如实施方案47所述的脱氨酶招募RNA，其中所述RNA序列包含与所述靶标RNA中的所述靶标腺苷直接相对的胞苷，腺苷或U。
47.如实施方案48所述的dRNA，其中所述RNA序列包含与所述靶标RNA中的靶标腺苷直接相对的胞苷错配。
48.如实施方案49所述的dRNA，其中所述胞苷错配位于所述dRNA中距所述互补序列的3'端至少20个核苷酸，和距所述互补序列的5'端至少5个核苷酸。
49.如实施方案50所述的dRNA，其中所述胞苷错配位于距所述dRNA中互补序列中心(例如，在中心)的10个核苷酸内。
50.如实施方案47-51中任一项所述的脱氨酶招募RNA，其中所述RNA序列进一步包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶标RNA中的非靶标腺苷直接相对。
51.如实施方案47-51中任一项所述的dRNA，其中所述互补序列包含与所述靶标RNA中的非靶标腺苷相对的两个或更多个连续错配核苷酸。
52.如实施方案47-53中任一项所述的脱氨酶招募RNA，其中所述靶标RNA中的所述靶标腺苷位于选自下组的三碱基基序中：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。
53.如实施方案54所述的脱氨酶招募RNA，其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述dRNA包含与所述三碱基基序中的尿苷直接相对的腺苷，与所述靶标腺苷直接相对的胞嘧啶，以及与所述三碱基基序中的鸟苷直接相对的胞苷、鸟苷或尿苷。
54.如实施方案55所述的脱氨酶招募RNA，其中所述三碱基基序是所述靶标RNA中的UAG，并且其中所述脱氨酶招募RNA包括与所述靶标RNA的UAG相对的ACC，ACG或ACU。
55.如实施方案47-56中任一项所述的脱氨酶招募RNA，其中脱氨酶招募RNA的长度为约40-260个核苷酸。
56.如实施方案57所述的dRNA，其中所述dRNA的长度为约70个核苷酸。
57.如实施方案57或58所述的dRNA，其中所述dRNA的长度为约100至约150个核苷酸(例如，约110-150个)。
58.如实施方案47-59中任一项所述的dRNA，其中所述dRNA不包含ADAR招募结构域(例如，DSB结合结构域，GluR2结构域或MS2结构域)。
59.如实施方案47-60中任一项所述的dRNA，其中所述dRNA不包含化学修饰的核苷酸(例如，2'-O-甲基化或硫代磷酸酯化)。
60.一种编码实施方案47-61中任一项所述的脱氨酶招募RNA的构建体。
61.如实施方案62所述的构建体，其中所述构建体是病毒载体(例如，慢病毒载体)或质粒。
62.一种文库，其包含实施方案47-61中任一项所述的多个脱氨酶招募RNA或实施方案62或63所述的构建体。
63.一种组合物，其包含实施方案47-61中任一项所述的脱氨酶招募RNA，实施方案62或63所述的构建体，或实施方案64所述的文库。
64.一种宿主细胞，其包含实施方案47-61中任一项所述的脱氨酶招募RNA或实施方案62或63所述的构建体。
65.如实施方案66所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
66.如实施方案66或67所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原代细胞。
67.一种用于在宿主细胞中编辑靶标RNA的试剂盒，其包含脱氨酶招募RNA，其中所述脱氨酶招募RNA包含与所述靶标RNA杂交的互补RNA序列，其中所述脱氨酶招募RNA能够招募ADAR以使所述靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。
68.60-200个核苷酸的脱氨酶招募RNA(dRNA)，其中：
1)所述dRNA包含能够与靶标RNA杂交的互补RNA序列；
2)所述dRNA能够招募脱氨酶或包含脱氨酶的构建体或包含脱氨酶催化结构域的构建体以使所述靶标RNA中的靶标腺苷脱氨基。
3)所述dRNA包含一种或多种化学修饰。
69.如实施方案68所述的dRNA，其中所述dRNA长于约60nt，65nt，70nt，80nt，90nt，100nt或110nt中的任何一个。
70.如实施方案1或实施方案69所述的dRNA，其包含与互补靶标RNA区域的一个或多个错配，摆动配对(Wobble)和/或单侧突起(Bulge)。
71.如实施方案68-70中任一项所述的dRNA，其中所述互补RNA序列包含与靶标RNA中的靶标腺苷直接相对的胞苷，腺苷或尿苷。
72.如实施方案71所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷，腺苷或尿苷位于距3'端至少约7个核苷酸，例如距3'端至少约8、9、10或更多个核苷酸，或距3'端约7-25nt。
73.如实施方案71-72中任一项所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷，腺苷或尿苷位于距5'端至少约25个核苷酸，例如距5'端至少约30、35、40、45、50或55个核苷酸，或距5'端约45-55nt。
74.如实施方案71-73中任一项所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷，腺苷或尿苷侧翼的5'和3'序列的长度不相等。
75.如实施方案71-74中任一项所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷，腺苷或尿苷侧翼的5'序列的长度长于3'序列。
76.如实施方案68-75中任一项所述的dRNA，其包含与所述靶标RNA中的所述靶标腺苷直接相对的胞苷。
77.如实施方案68-76中任一项所述的dRNA，其中所述互补RNA序列包含一个或多个鸟苷，各自与所述靶标RNA中的非靶标腺苷相对。
78.如实施方案68-77中任一项所述的dRNA，其中所述互补序列包含与所述靶标RNA中的非靶标腺苷相对的两个或更多个连续错配的核苷酸。
79.如实施方案68-78中任一项所述的dRNA，其中靶标RNA中的所述靶标腺苷的5'最近邻位是选自U，C，A和G的核苷酸，优选U＞C≈A＞G，且所述靶标RNA中的所述靶标腺苷的3'最近邻位是选自G，C，A和U的核苷酸，优选G＞C＞A≈U。
80.如实施方案68-79中任一项所述的dRNA，其中所述靶标腺苷是位于靶标RNA中的一个三碱基基序，所述三碱基基序选自下组：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。
81.如实施方案80所述的dRNA，其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述dRNA包含与所述三碱基基序中的尿苷直接相对的A，与所述靶标腺苷直接相对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷直接相对的胞苷、鸟苷或尿苷。
82.如实施方案81所述的dRNA，其包含与UAG的三碱基基序直接相对的5'-CCA-3'。
83.如实施方案68-82中任一项所述的dRNA，其中所述化学修饰是甲基化和/或硫代磷酸酯化，例如2'-O-甲基化和/或核苷酸间硫代磷酸酯连接。
84.如实施方案83所述的dRNA，其中所述化学修饰包括在首尾各1-5、2-5、3-5或4-5个核苷酸的2'-O-甲基化和/或在首尾各1-5、2-5、3-5或4-5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化。
85.如实施方案83或实施方案84所述的dRNA，其中所述化学修饰包括在与所述靶标腺苷相对的核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸的2'-O-甲基化和/或3'-硫代磷酸酯化。
86.如实施方案1-85中任一项所述的dRNA，所述化学修饰选自下组：
1)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化和/或首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化；
2)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，单个或多个尿苷(例如，所有尿苷)的2'-O-甲基化；
3)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，单个或多个或所有尿苷的2'-O-甲基化，以及与所述靶标腺苷相对的所述核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸的修饰；
4)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，所有尿苷的2'-O-甲基化，和与所述靶标腺苷相对的所述核苷酸的3'端和/或5'端最邻近的核苷酸的2'-O-甲基化；
5)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，所有尿苷的2'-O-甲基化，以及与所述靶标腺苷相对的所述核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸的3'硫代磷酸酯化；和
6)首尾各5个核苷酸的2'-O-甲基化和首尾各5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化。
87.如实施方案86所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷相对的所述核苷酸和/或与所述靶标腺苷相对的所述核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸的修饰是2'-O-甲基化或硫代磷酸酯化连接，例如3'-硫代磷酸酯化连接。
88.如实施方案68-87中任一项所述的dRNA，其不包含能够形成用于结合ADAR酶的分子内茎环结构的ADAR招募结构域。
89.一种构建体，其包含或编码如68-88中任一项所述的dRNA。
90.一种用于在宿主细胞中编辑靶标RNA的方法，其包括将如实施方案68-89中任一项所述的dRNA通过感染，电转染，脂质转染，胞吞作用，脂质体或脂质纳米颗粒递送等引入宿主细胞，所述宿主细胞包括但不限于真核细胞，原代细胞，T细胞，哺乳动物细胞，人类细胞，鼠科细胞等。
91.如实施方案90所述的方法，其进一步包括将ADAR3的抑制剂引入所述宿主细胞。
92.如实施方案90或实施方案91所述的方法，其进一步包括将干扰素的刺激物引入所述宿主细胞。
93.如实施方案90-92中任一项所述的方法，其包括引入各自靶向不同靶标RNA的多个dRNA。
94.如实施方案90-93中任一项所述的方法，其中所述dRNA不诱导免疫应答。
95.如实施方案90-94中任一项所述的方法，其还包括将外源ADAR引入所述宿主细胞。
96.如实施方案95所述的方法，其中所述ADAR是包含E1008突变的ADAR1。
97.包含如实施方案68-89中任一项所述dRNA的组合物，细胞，文库或试剂盒。
实施例
下面的实施例旨在纯粹作为本申请的示例，因此不应以任何方式被认为限制本发明。通过示例说明而非限制的方式提供以下实施例和详细描述。
材料和方法
质粒构建
通过PCR扩增编码mCherry和EGFP(EGFP第一密码子ATG缺失)的DNA来克隆双荧光报道分子，在PCR期间经由引物添加3×GS接头和靶向DNA序列。然后通过II型限制酶BsmB1(Thermo)和T4 DNA连接酶(NEB)切割和连接PCR产物，然后将其插入pLenti骨架中(pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd，Stanley Cohen Lab，Stanford University)。
从Lbu质粒(Addgene#83485)PCR扩增dLbuCas13 DNA。ADAR1DD和ADAR2DD从ADAR1(p150)cDNA和ADAR2 cDNA中扩增，这两种cDNA都来自厦门大学的Han的实验室的赠予。通过重叠PCR将ADAR1DD或ADAR2DD与dLbuCas13DNA融合，并将融合的PCR产物插入pLenti骨架中。
为了在哺乳动物细胞中表达dRNA，直接合成dRNA序列(针对短dRNA)并通过合成重叠的ssDNA进行退火或PCR扩增，并通过Golden-gate克隆将产物克隆到U6表达下的相应载体中。
从ADAR1(p150)cDNA中PCR扩增全长ADAR1(p110)和ADAR1(p150)，并从ADAR2 cDNA中PCR扩增全长ADAR2，然后将其分别克隆到pLenti骨架中。
对于三种版本的双荧光报道分子(报道分子-1，-2和-3)，mCherry和EGFP(EGFP的起始密码子ATG是缺失的)编码序列进行PCR扩增，使用BsmBI(Thermo Fisher Scientific，ER0452)消化，然后用T4 DNA连接酶(NEB，M0202L)介导的与GGGGS接头的连接。随后将连接产物插入pLenti-CMV-MCS-PURO骨架。
对于表达dLbuCas13-ADAR DD(E1008Q)的构建体，从ADAR1p150构建体(来自厦门大学韩家淮(Jiahuai Han)的实验室的赠予)扩增了ADAR1DD基因。通过PCR从Lbu_C2c2_R472A_H477A_R1048A_H1053A质粒(Addgene#83485)扩增了dLbuCas13基因。通过重叠PCR生成ADAR1DD(高活性E1008Q变体)，然后融合至dLbuCas13。将连接产物插入pLenti-CMV-MCS-BSD骨架。
对于表达arRNA的构建体，合成arRNA的序列并且金门(golden-gate)克隆到pLenti-sgRNA-lib 2.0(Addgene#89638)骨架中，并且由hU6启动子驱动arRNA的转录。对于表达ADAR的构建体，从ADAR1p150构建体中扩增出全长ADAR1p110和ADAR1p150，并从ADAR2构建体中PCR扩增出全长ADAR2(来自厦门大学韩家淮的实验室的赠予)。然后将扩增的产物克隆到pLenti-CMV-MCS-BSD骨架中。
对于表达具有致病性突变的基因的构建体，TP53的全长编码序列(从Vigenebio订购)和其他6种与疾病相关的基因(COL3A1，BMPR2，AHI1，FANCC，MYBPC3和IL2RG，来自中国医学科学院病原生物学研究所的王建伟(Jianwei Wang)的实验室的赠予)通过诱变PCR从编码具有引入G>A突变的相应基因的构建体中扩增出。通过Gibson克隆方法59将扩增的产物克隆到pLenti-CMV-MCS-mCherry骨架中。
哺乳动物细胞系和细胞培养
哺乳动物细胞系在37℃、在5％CO2下，在达尔伯克改良伊格尔培养基(Dulbecco'sModified Eagle Medium，10-013-CV，Corning，Tewksbury，MA，USA)中培养，所述培养基加入10％胎牛血清(兰州百灵生物技术有限公司，兰州，中国，Lanzhou BailingBiotechnology Co.,Ltd.,Lanzhou,China)，补充有1％青霉素-链霉素。所述ADAR1-KO细胞系购自EdiGene China，基因分型结果也由EdiGene China提供。
HeLa和B16细胞系来自Z.Jiang的实验室(北京大学)。并且，HEK293T细胞系来自C.Zhang的实验室(北京大学)。RD细胞系来自J Wang的实验室(北京协和医学院和中国医学科学院，病原生物学研究所)。SF268细胞系来自中国医学科学院，基础医学研究所，细胞中心。A549和SW13细胞系来自EdiGene Inc.HepG2，HT29，NIH3T3和MEF细胞系在我们北京大学的实验室中维护。将这些哺乳动物细胞系在37℃于5％CO2下，在含10％胎牛血清(CellMax，SA201.02)的达尔伯克改良伊格尔培养基(Corning，10-013-CV)中培养，所述培养基，另外补充有1％青霉素-链霉素。除非另有说明，否则按照制造商的说明用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche，06366546001)转染细胞。
人原代肺成纤维细胞(#3300)和人原代支气管上皮细胞(#3210)购自ScienCellResearch Laboratories，Inc.，并分别在成纤维细胞培养基(ScienCell，#2301)和支气管上皮细胞培养基(ScienCell,#3211)中培养。两种培养基均补充有15％的胎牛血清(BI)和1％的青霉素-链霉素。原代GM06214(Hurler综合征患者来源的成纤维细胞；IDUA基因的外显子9中1293位核苷酸处的TGG>TAG突变[Trp402Ter(W402X)]的纯合子)和GM01323(Scheie综合征患者来源的成纤维细胞；拥有相较于WT细胞0.3％的IDUA活性。症状比Hurler综合征轻很多。复合杂合子：内含子5中，即外显子6的-7位中的G>A转变(IVS5AS-7G>A)，及在IDUA基因的外显子9中1293位核苷酸处的TGG>TAG[Trp402Ter(W402X)]。在本发明的实施例中作为阳性对照)细胞是从卡瑞尔医学研究所(Coriell Institute for Medical Research)订购的，并在含15％胎牛血清(BI)和1％青霉素-链霉素的达尔伯克改良伊格尔培养基(Corning，10-013-CV)中培养。将所有细胞在37℃在5％CO2下培养。
报道系统的转染，FACS分析和Sanger测序
对于双荧光报道编辑实验，将293T-WT细胞或293T-ADAR1-KO细胞接种在6孔板(6×105个细胞/孔)中，24小时后，根据供应商的方案，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(06366546001；Roche，Mannheim，德国)共转染1.5μg报道分子质粒和1.5μgdRNA质粒。48至72小时后，收集细胞并进行FACS分析。为了进一步确认报道分子mRNA编辑，我们使用FACSAria流式细胞仪(BD Biosciences)分选来自用报道分子和dRNA质粒转染的293T-WT细胞的EGFP阳性细胞，然后进行总RNA分离(TIANGEN，DP430)。然后经由RT-PCR(TIANGEN，KR103-04)将RNA逆转录成cDNA，并用相应的引物对(23个PCR循环)PCR扩增靶向的基因座，并纯化PCR产物用于Sanger测序。
对于ADAR1(p110)，ADAR1(p150)或ADAR2的回复和过表达实验，将293T-WT细胞或293T-ADAR1-KO细胞接种于12孔板(2.5×105个细胞/孔)中，24小时后，使用X-tremeGENEHP DNA转染试剂(06366546001，Roche，Mannheim，德国)共转染0.5μg的报道分子质粒，0.5μg的dRNA质粒和0.5μg的ADAR1/2质粒(pLenti骨架作为对照)。48至72小时后，收集细胞并进行FACS分析。
对于内源mRNA实验，将293T-WT细胞接种在6孔板(6×105个细胞/孔)中，当约70％汇合时，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(06366546001，Roche，Mannheim，德国)转染3μg的dRNA质粒。72小时后，经由FACS收集细胞和分选GFP阳性或BFP阳性细胞(根据相应的荧光标记物)用于以下的RNA分离。
人原代T细胞的分离与培养
从健康人供体的白细胞分离产物中分离出原代人T细胞。简而言之，通过Ficoll离心(Dakewei，AS1114546)分离外周血单核细胞(PBMC)，并使用EasySep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL，17951)从PBMC通过磁阴性选择分离T细胞。分离后，将T细胞在X-vivo15培养基，10％FBS和IL2(1000U/ml)中培养，并用CD3/CD28DynaBeads(ThermoFisher，11131D)刺激2天。来自健康供体的白细胞分离产品获自AllCells LLC中国。所有健康供体均提供了知情同意。
Lenti病毒包装和报道分子细胞系构建
经由X-tremeGENE HP DNA转染试剂将表达质粒与两种病毒包装质粒pR8.74和pVSVG(Addgene)一起共转染到HEK293T-WT细胞中。72小时后，收集上清液病毒并储存在-80℃。用慢病毒感染HEK293T-WT细胞，72小时后，经由FACS分选mCherry阳性细胞并培养以通过有限稀释方法选择稳定表达具有低EGFP背景的双荧光报道系统的单克隆细胞系。
对于稳定的报道分子细胞系，将报道分子构建体(pLenti-CMV-MCS-PURO骨架)与两个病毒包装质粒pR8.74和pVSVG一起共转染到HEK293T细胞中。72小时后，收集上清液病毒并保存在-80℃。用慢病毒感染HEK293T细胞，然后经由FACS分选mCherry阳性细胞并培养以选择稳定表达无可检测EGFP背景的双荧光报道系统的单克隆细胞系。HEK293T ADAR1–/–和TP53–/–细胞系是根据以前报道的方法60生成的。将靶向ADAR1的sgRNA和含有CMV驱动的嘌呤霉素抗性基因的PCR扩增供体DNA共转染到HEK293T细胞中。然后在转染后7天用嘌呤霉素处理细胞。从嘌呤霉素抗性细胞中分离出单个克隆，然后通过测序和蛋白质印迹进行验证。
内源或外源表达的转录物的RNA编辑
为了评估在双荧光报道分子上的RNA编辑，将HEK293T细胞或HEK293TADAR1-/-细胞接种在6孔板中(6×105个细胞/孔)。24小时后，将细胞用1.5μg报道分子质粒和1.5μgarRNA质粒共转染。为了检查ADAR1p110，ADAR1p150或ADAR2蛋白表达的影响，通过EGFP阳性比率和深度测序来测定编辑效率。
将HEK293T ADAR1-/-细胞接种在12孔板中(2.5×105个细胞/孔)。24小时后，将细胞与0.5μg报道分子质粒，0.5μg arRNA质粒和0.5μg ADAR1/2质粒(pLenti骨架作为对照)共转染。通过EGFP阳性比率和深度测序测定编辑效率。
为了评估内源mRNA转录物上的RNA编辑，将HEK293T细胞接种在6孔板中(6×105个细胞/孔)。二十四小时后，将细胞用3μg arRNA质粒转染。通过深度测序测定编辑效率。
为了评估多个细胞系中的RNA编辑效率，将8-9×104(RD，SF268，HeLa)或1.5×105(HEK293T)个细胞接种在12孔板中。对于难以转染的细胞，例如HT29，A549，HepG2，SW13，NIH3T3，MEF和B16，将2-2.5×105个细胞接种在6孔板中。24小时后，将报道分子和arRNA质粒共转染到这些细胞中。通过EGFP阳性比率测定编辑效率。
为了评价EGFP阳性比率，在转染后48至72小时，通过荧光激活细胞分选(FACS)分析分选并收集细胞。mCherry信号用作报道分子/表达arRNA的细胞的荧光选择标记，计算EGFP+/mCherry+细胞的百分比作为编辑效率的读数。
为了NGS定量A至I编辑率，在转染后48至72小时，通过FACS测定分选和收集细胞，然后进行RNA分离(TIANGEN，DP420)。然后，经由RT-PCR(TIANGEN，KR103-04)将总RNA逆转录为cDNA，并使用如表1中列出的相应引物PCR扩增靶向的基因座。
表1.
Figure BDA0003305483380000551
Figure BDA0003305483380000561
Figure BDA0003305483380000571
Figure BDA0003305483380000581
Figure BDA0003305483380000591
Figure BDA0003305483380000601
将PCR产物纯化用于Sanger测序或NGS(Illumina HiSeq X Ten)。
深度测序
对于内源mRNA编辑实验，将293T-WT细胞接种在6孔板上(6×105个细胞/孔)，当约70％汇合时，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche)以3μg的dRNA转染HEK293细胞。72小时后，经由FACS分选GFP阳性或BFP阳性细胞(根据相应的荧光标记)，然后进行RNA分离。然后经由RT-PCR将分离的RNA逆转录成cDNA，并用相应的引物对扩增特异性靶向的基因座(23个PCR循环)，并在Illumina NextSeq上测序。
在多个细胞系中进行测试
除了HEK293T(阳性对照)和HEK293T ADAR1-/-(阴性对照)细胞，选择一种小鼠细胞系(NIH3T3)以及源自不同组织和器官的七种人细胞系(RD，HeLa，SF268，A549，HepG2，HT-29，SW13)进行实验。对于具有较高转染效率的细胞系，将约8-9×104个细胞(RD，HeLa，SF268)或1.5×105个(HEK293T)铺板到12孔板的每个孔上，至于难以转染的那些(A549，HepG2，HT-29，SW13，NIH3T3)，把2-2.5×105个细胞铺板在6孔板中。并且将所有这些细胞维持在37℃在达尔伯克改良伊格尔培养基(DMEM，Corning)中，该培养基补充有10％胎牛血清(FBS，CellMax)和5％CO2。24小时后，用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche)将CG2报道分子和71nt dRNA(35-C-35)质粒共转染到不同类型的细胞中。转染后48小时，用胰蛋白酶处理细胞并通过FACS(BD)来分析。因为具有低转染效率的细胞具有相当少的mCherry和BFP阳性细胞，对于那些铺在6孔板上的细胞，我们将用于FACS分析的总细胞数量增加至1×105个。
针对靶向的位点的RNA编辑分析
对于深度测序分析，使用arRNA覆盖序列的靶向的位点序列(上游和下游20-nt)产生索引。使用BWA版本0.7.10-r789对读段进行比对和定量。然后通过Samtools对比对BAM进行分选，并使用REDitools 1.0.4版分析RNA编辑位点。参数如下：-U[AG或TC]-t 8 -n 0.0-T 6-6 -e -d -u。通过费舍尔精确检验(Fisher’s exact test)(p值<0.05)计算出的arRNA靶向区域内所有显著的A>G转化(p值<0.05)都被arRNA视为编辑。除靶向的腺苷外的转化均为脱靶编辑。同时出现在对照组和实验组中的突变被认为是SNP。
转录组范围的RNA测序分析
将具有BFP表达盒的表达Ctrl RNA151或arRNA151-PPIB的质粒转染到HEK293T细胞中。转染后48小时，通过FACS富集BFP+细胞，并用RNAprep Pure Micro试剂盒(TIANGEN，DP420)纯化RNA。然后使用NEBNext聚(A)mRNA磁性分离模块(New England Biolabs，E7490)纯化mRNA，并用用于Illumina的NEBNext Ultra II RNA文库制备试剂盒(New EnglandBiolabs，E7770)处理，然后使用Illumina HiSeq X Ten平台(2×150-bp配对末端；每个样品30G)进行深度测序分析。为了排除转染引起的非特异性作用，我们把模拟组包括在内，其中仅用转染试剂处理细胞。每个组包含四个重复。
生物信息学分析流程参考了Vogel等人22的工作。使用FastQC进行分析的质量控制，质量修整基于Cutadapt(每个读段的前6-bp被修整，最高20-bp被质量修整)。使用AWK脚本过滤掉引入的arRNA。修整后，将长度小于90-nt的读段过滤掉。随后，通过STAR软件61将过滤的读段映射到参考基因组(GRCh38-hg38)。我们使用GATK Haplotypcaller62来调用变体。GATK生成的原始VCF文件已通过GATK VariantFiltration，bcftools和ANNOVAR63进行了过滤和注释。在dbSNP，1000Genome64的变体中，过滤出EVS。然后选择每组四个重复的共享变体作为RNA编辑位点。将模拟组的RNA编辑水平视为背景，通过减去模拟组的变体获得CtrlRNA151和arRNA151-PPIB的整体靶标。
为了评估LEAPER是否干扰自然的编辑稳态，我们分析了由模拟组和arRNA151-PPIB组(或Ctrl RNA151组)共享的全局编辑位点。使用Pearson相关系数分析评估了天生A-至-I编辑位点的差异RNA编辑率。计算了模拟组和arRNA151-PPIB组(或Ctrl RNA151组)之间编辑率的皮尔森相关性，并在图6中进行了注释。
Figure BDA0003305483380000611
X意指模拟组中每个位点的编辑率；Y意指Ctrl RNA151组(图6A)或arRNA151-PPIB组(图6B)中每个位点的编辑率；σx是X的标准偏差；σY是Y的标准偏差；μXi是X的平均值；μY是Y的平均值；E是期望值。
分析RNA-Seq数据以询问由RNA编辑事件诱导的可能的转录变化。使用HISAT2和STRINGTIE软件进行了转录组范围的基因表达的分析65。我们使用Cutadapt和FastQC进行测序数据的质量控制。然后使用HISAT2将测序读段映射到参考基因组(GRCh38-hg38)，然后如上所述进行Pearson相关系数分析。
蛋白质印迹
我们分别使用了针对ADAR1(Santa Cruz，sc-271854)，ADAR2(Santa Cruz，sc-390995)，ADAR3(Santa Cruz，sc-73410)，p53(Santa Cruz，sc-99)，KRAS(Sigma，SAB1404011)；GAPDH(Santa Cruz，sc-47724)和β-微管蛋白(CWBiotech，CW0098)的小鼠单克隆一抗。HRP偶联的山羊抗小鼠IgG(H+L，115-035-003)二抗购自JacksonImmunoResearch。分选2×106个细胞进行裂解，并上样等量的每种裂解物进行SDS-PAGE。然后，将样品蛋白质转移到PVDF膜(Bio-Rad实验室)上，并用针对ADAR酶(抗ADAR1，1：500；抗ADAR2，1：100；抗ADAR3，1：800)之一的一抗进行免疫印迹，然后进行二抗温育(1：10,000)和暴露。用剥离缓冲液(CWBiotech，CW0056)剥离ADAR蛋白后，在同一PVDF膜上重新探测β-微管蛋白。重复实验三遍。使用Image Lab软件进行半定量分析。
细胞因子表达测定
将HEK293T细胞接种在12孔板(2×105个细胞/孔)上。当约70％汇合时，将细胞用1.5μg的arRNA转染。作为阳性对照，转染了1μg的聚(I：C)(Invitrogen，tlrl-picw)。48小时后，收集细胞并进行RNA分离(TIANGEN，DP430)。然后，经由RT-PCR(TIANGEN，KR103-04)将总RNA逆转录成cDNA，并通过定量PCR(TAKARA，RR820A)测量IFN-β和IL-6的表达。引物的序列在表1中列出。
p53的转录调控活性测定
将表达TP53W53X cDNA的质粒和表达arRNA的质粒与p53-萤火虫-荧光素酶顺式报道质粒(YRGene，VXS0446)和海肾-荧光素酶质粒(来自北京大学Z.Jiang实验室的赠予)一起共转染到HEK293T TP53-/-细胞中用于检测p53的转录调控活性。48小时后，收获细胞并根据制造商的方案用Promega Dual-Glo荧光素酶测定系统(Promega，E4030)测定。简而言之，将150μL Dual-Glo荧光素酶试剂添加到收获的细胞离心沉淀中，并在30分钟后，通过Infinite M200读取器(TECAN)将100μL Dual-Glo荧光素酶试剂(细胞裂解)添加到96孔白板中，测量萤火虫的发光。30分钟后，依次向每个孔中添加100μL Dual-Glo终止剂和Glo试剂，以测量海肾发光，并计算萤火虫发光与海肾发光的比。
原代细胞中的电穿孔
对于在人原代肺成纤维细胞或人原代支气管上皮细胞中表达arRNA的质粒进行电穿孔，将20μg质粒用NucleofectorTM 2b装置(Lonza)和Basic NucleofectorTM试剂盒(Lonza，VPI-1002)电穿孔，并且电穿孔程序是U-023。对于在人原代T细胞中表达arRNA的质粒电穿孔，将20μg质粒通过NucleofectorTM 2b装置(Lonza)和人T细胞NucleofectorTM试剂盒(Lonza，VPA-1002)电穿孔到人原代T中，电穿孔程序是T-024。电穿孔后48小时，通过FACS测定分选和收集细胞，然后进行以下深度测序以用于靶向的RNA编辑测定。电穿孔效率根据荧光标记进行归一化。
为了在人原代T细胞或原代GM06214细胞中进行化学合成arRNA或对照RNA电穿孔，将RNA寡核苷酸于终浓度为2μM的100μL opti-MEM培养基(Gbico，31985070)中溶解。然后用上述电穿孔混合物重悬1×10E6个GM06214细胞或3×10E6个T细胞，并用Agile Pulse InVivo装置(BTX)在450V电穿孔1ms。然后将细胞转移到温暖的培养基中用于以下测定。
α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)催化活性测定
将收获的细胞离心沉淀重悬并在冰上用在1×PBS缓冲液中的28μL 0.5％TritonX-100裂解30分钟。然后将25μL细胞裂解液加入25μL 190μM4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸酶底物(Cayman，2A-19543-500)中，将其溶解在0.4M含0.2％Triton X-100的甲酸钠缓冲液中，pH 3.5，并在黑暗中在37℃温育90分钟。加入200μL 0.5M NaOH/甘氨酸缓冲液，pH10.3，淬灭催化反应，然后在4℃离心2分钟。将上清液转移至96孔板，并使用Infinite M200读取器(TECAN)在365nm激发波长和450nm发射波长测量荧光。
实施例1.在报道分子上测试本发明的RNA编辑方法
据报道，Cas13家族蛋白(C2c2)可以编辑哺乳动物细胞中的RNA。我们在多种条件下进一步测试了该系统。首先，我们通过在mCherry和EGFP基因之间引入含有终止密码子的3×GS接头靶向序列，构建了基于mCherry和EGFP荧光的双荧光报道分子系统。此外，我们删除了EGFP的起始密码子ATG，以减少EGFP翻译的遗漏。
双荧光报道分子-1包含mCherry的序列(SEQ ID NO：1)，含有3×GS接头和靶向的A(SEQ ID NO：2)的序列，以及eGFP的序列(SEQ ID NO：3)。
atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag(mCherry的序列)(SEQ ID NO:1)
Figure BDA0003305483380000641
Figure BDA0003305483380000642
(含有3×GS接头(以斜体且加粗的字符示出)以及靶向的A(以加大且加粗的A示出)的序列(SEQ ID NO:2)
gtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtaa(eGFP的序列)(SEQ ID NO:3)
双荧光报道分子-2包含mCherry的序列(SEQ ID NO：1)，含有3×GS接头(显示为斜体且加粗的字符)和靶向的A(显示为加大且加粗的A)的序列(SEQ ID NO：4)，以及eGFP的序列(SEQ ID NO：3)。
Figure BDA0003305483380000643
(含有3×GS接头(显示为斜体且加粗的字符)和靶向的A(显示为加大且加粗的字符)的序列(SEQ ID NO：4)
双荧光报道分子-3包含mCherry的序列(SEQ ID NO：1)，含有1×GS接头(显示为斜体且加粗的字符)和靶向的A(SEQ ID NO：5)的序列，以及eGFP的序列(SEQ ID NO：3)。
Figure BDA0003305483380000651
(含有1×GS接头(显示为斜体且加粗的字符)和靶向的A(显示为加大且加粗的A)的序列(SEQ ID NO：5)
我们将mCherry-3×GS接头-TAG-EGFP克隆到pLenti-骨架中，并将报道分子质粒包装入慢病毒中，感染293T细胞，其构建表达双荧光报道基因的稳定细胞系。然后，我们选择具有低EGFP荧光背景的单个克隆作为报道分子系统。我们将LbucC2c2 crRNA指导分子与横跨靶向腺苷的28到78个核苷酸长的间隔区平铺在一起，以测试最佳的crRNA设计。我们发现更长的crRNA向导赋予更高的EGFP阳性效率。引人注目的是，当我们转染靶向crRNA质粒而不共转染任何表达dC2c2-ADARDD的质粒时，EGFP蛋白大量表达。例如，带有下述序列的crRNA指导分子：ggaccaccccaaaaaugaauauaaccaaaacugaacagcuccucgcccuugcucacuggcagagcccuccagcaucgcgagcaggcgcugccuccuccgcc(SEQ ID NO：6)被赋予了超过25％的EGFP阳性效率。这表明终止密码子UAG中的腺嘌呤在很大程度上被编辑。相反，随机crRNA不能使EGFP阴性细胞呈阳性(图6A，6B和6C)。基于这些结果，我们推断：单独过表达RNA转录物就可以利用内源ADAR酶来编辑RNA。
此外，我们删除了RNA指导分子上的支架RNA序列，创造了线性指导RNA。我们发现：70核苷酸长的、与带有A-C错配的靶向RNA互补的RNA(aaaccgagggaucauaggggacugaauccaccauucuucucccaaucccugcaacuccuucuuccccugc(SEQ ID NO：7)可以有效地使EGFP阴性细胞转化为EGFP阳性细胞，而70-nt的随机RNA(ugaacagcuccucgcccuugcucacuggcagagcccuccagcaucgcgagcaggcgcugccuccuccgcc(SEQ ID NO：8)不能(图1A，1B，1C和1D)。因此，我们将该RNA指定为dRNA(脱氨酶招募RNA)。为了验证细胞内源性ADAR可被招募以通过dRNA进行腺嘌呤脱氨基作用，我们在ADAR1 p110和ADAR1 p150双敲除293T细胞系中进行了实验(图6E和6F)。因为ADAR1广泛表达，而ADAR2主要在脑中以高水平表达。因此我们提出：通过dRNA的靶向腺嘌呤脱氨基作用主要由ADAR1而不是ADAR2介导。正如预期的那样，靶向dRNA不能在293T-ADAR1-/-细胞中触发EGFP表达，但是过表达外源ADAR1 p110，p150或ADAR2可以回复293T-ADAR1-/-细胞中的EGFP表达(图1E和1F)，这表明在293T细胞中，dRNA可以招募ADAR1或ADAR2来介导靶标RNA上的腺嘌呤脱氨基作用。此外，我们发现：ADAR1-p110和ADAR2具有比ADAR1-p150更高的编辑活性(图1G和图6G)，这可能是由于ADAR1-p110和ADAR1-p150的不同细胞定位。
为了确定EGFP荧光的恢复是由于靶向RNA编辑事件引起的，我们通过RT-PCR直接测量dRNA介导的报道分子2转录物的编辑，然后进行靶向的Sanger测序和二代测序。测序结果显示：靶向的腺嘌呤(A-C错配位点)中的A至G碱基转化，并且，编辑率可达到13％(图6H和图1H)。此外，我们还在靶向的腺嘌呤附近的序列窗口期间观察到略微的A到G编辑，这很可能是由于双链RNA区域增加，之后，我们将尝试用几种策略去除非预期的编辑。
实施例2.优化设计dRNA的因素
接下来，我们开始优化dRNA以实现更高的编辑效率。首先，我们的目的是确定在靶向的腺嘌呤相对位置中哪个碱基更有利于编辑。以前的研究表明，靶向的腺苷的相对的碱基会有效地影响编辑效率。因此，我们在与靶向的A相对的中间位置设计了具有错配N(A，U，C和G)的71nt dRNA。基于FACS结果，我们发现，四种不同的dRNA有效编辑如下：C>A>U>G(图2A和2B)。最近，据报道，靶标UAG位置中的小泡可能有利于编辑效率。因此，我们设计了含有两个或三个与靶标UAG位点错配碱基的dRNA来测试我们的假设。使用Golden Gate克隆方法，在具有BFP标记的dRNA载体上设计和构建16种不同的71nt dRNA。我们发现，具有CCA和GCA序列的dRNA具有最高的效率，这意味着，小泡对A-I编辑几乎没有贡献，至少在UAG靶标位点的情况下。此外，NCA序列的四个dRNA具有较高百分比的GFP阳性细胞，从而得出结论，互补的U-A碱基对可能对ADAR编辑很重要(图2C和2D)。随后，我们基于报道分子测试不同长度的dRNA的效率。dRNA设计为中间位置的错配C，长度范围为31nt至221nt。我们发现，编辑效率随着dRNA的增加而增加。报道分子系统的编辑高峰位于171nt dRNA。51nt dRNA可以以良好的效率(18％)激活报道分子系统(图2E和2F)。最后，我们检查了dRNA的错配C的位置是否影响编辑效率。dRNA保持相同的71nt长度，设计了与转录起始位置不同的错配C。基于FACS结果，我们发现，其相对的错配C的位置可能影响编辑效率，并且，位于dRNA的5'或3'的错配C具有较低的效率(图2G和2H)。
通过Gibson克隆构建出16种不同的包含靶标序列的报道分子，其含有所有可能的3种碱基基序，然后将其克隆到pLenti骨架(pLenti-CMV-MCS-SV-Bsd，Stanley Cohen Lab，Stanford University)中。所述靶标序列如下所示。
含有所有可能的3碱基基序的靶标序列：
TAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:9)
TAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:10)
TAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:11)
TAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgctagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:12)
AAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:13)
AAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:14)
AAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:15)
AAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcaagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:16)
CAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:17)
CAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:18)
CAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:19)
CAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgccagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:20)
GAT:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgatagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:21)
GAA:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgaaagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:22)
GAC:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgacagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:23)
GAG:
atggacgagctgtacaagctgcagggcggaggaggcagcgcctgctcgcgatgcgagagggctctgccagtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatc(SEQ ID NO:24)
dRNA保持相同的111bp长度，并且，在中心处朝向靶标A设计了错配C。
在12孔细胞培养集簇(cluster)中，将2×105个细胞HEK293T铺板到每个孔中，并进行每个实验三次重复。24小时后，使用X-tremeGENE HP DNA转染试剂(Roche)将0.5μg的dRNA质粒和0.5μg的报道分子靶标质粒共转染至细胞。48小时后，用胰蛋白酶处理细胞并通过FACS(BD)选择mCherry阳性细胞。收获总共4×105个细胞，并使用RNAprep纯细胞/细菌试剂盒(TIANGEN DP430)提取总RNA。使用Quantscript RT试剂盒(TIANGEN KR103-04)从2μg的总RNA合成cDNA。并通过PCR扩增111个靶标区域并进行深度测序。
我们发现，所有16种不同的3碱基基序都可以通过本申请的示例性RNA编辑方法进行编辑，尽管效率可变。总之，结果表明，要编辑的A的5'最近邻位具有优先度U>C≈A>G并且要编辑的A的3'最近邻位具有优先度G>C>A≈U。数据以图3A中的条形图或者图3B中的热图表示。
实施例3.编辑从内源基因转录的RNA
接下来，我们测试了dRNA是否可以介导从内源基因转录的mRNA。我们设计了靶向四种基因KRAS，PPIB，β-肌动蛋白和GAPDH的dRNA。对于KRAS mRNA，我们设计了91、111、131、151、171和191个核苷酸长度的dRNA(图4A)，其序列如下所示。
91-nt KRAS-dRNA
uagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgc(SEQ ID NO:25)
111-nt KRAS-dRNA
gauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaacuaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagc(SEQ ID NO:26)
131-nt KRAS-dRNA
uccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaacuaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccu(SEQ ID NO:27)
151-nt KRAS-dRNA
aucauauucguccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccucuggccccgc(SEQ ID NO:28)
171-nt KRAS-dRNA
cuauuguuggaucauauucguccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccucuggccccgccgccgccuuc(SEQ ID NO:29)
191-nt KRAS-dRNA
uaggaauccucuauuguuggaucauauucguccacaaaaugauucugaauuagcuguaucgucaaggcacucuugccuacgccaccagcuccaaccaccacaaguuuauauucagucauuuucagcaggccucucucccgcaccugggagccgcugagccucuggccccgccgccgccuucagugccugcg(SEQ ID NO:30)
二代测序结果显示：dRNA可编辑靶向的KRAS mRNA，编辑效率高达11.7％(图4B)。对于内源性PPIB mRNA，靶向的三个位点：位点1，位点2和位点3。我们为每个位点设计了151个核苷酸长度的dRNA(图4C)，其序列如下所示。
151-nt PPIB-dRNA(位点1)
gaggcgcagcauccacaggcggaggcgaaagcagcccggacagcugaggccggaagaggguggggccgcgguggccagggagccggcgccgccacgcgcgggugggggggacugggguugcucgcgggcuccgggcgggcggcgggcgccg(SEQ ID NO:31)
151-nt PPIB-dRNA(位点2)
uccuguagcuaaggccacaaaauuauccacuguuuuuggaacagucuuuccgaagagaccaaagaucacccggcccacaucuucaucuccaauucguaggucaaaauacaccuugacggugacuuugggccccuucuucuucucaucggcc(SEQ ID NO:32)
151-nt PPIB-dRNA(位点3)
gcccuggaucaugaaguccuugauuacacgauggaauuugcuguuuuuguagccaaauccuuucucuccuguagccaaggccacaaaauuauccacuguuuuuggaacagucuuuccgaagagaccaaagaucacccggccuacaucuuca(SEQ ID NO:33)
二代测序的结果显示：dRNA可以以高达14％的编辑效率有效地编辑PPIB mRNA位点1(图4D)。对于PPIB mRNA位点2和位点3，编辑效率为1.5％和0.6％(图4E和4F)。对于内源性β-肌动蛋白mRNA，我们为每个位点选择了两个靶向的位点和经设计的dRNA(图4G)，其序列如下所示。
72-ntβ-肌动蛋白-dRNA(位点1)
gcgcaaguuagguuuugucaagaaaggguguaacgcaaccaagucauaguccgccuagaagcauuugcggug(SEQ ID NO:34)
131-ntβ-肌动蛋白-dRNA(位点1)
gccaugccaaucucaucuuguuuucugcgcaaguuagguuuugucaagaaaggguguaacgcaaccaagucauaguccgccuagaagcauuugcgguggacgauggaggggccggacucgucauacuccug(SEQ ID NO:35)
70-ntβ-肌动蛋白-dRNA(位点2)
ggacuuccuguaacaacgcaucucauauuuggaaugaccauuaaaaaaacaacaaugugcaaucaaaguc(SEQ ID NO:36)
我们发现，dRNA可以编辑位点1和位点2的β-肌动蛋白mRNA，每个位点的编辑效率高达1.4％(图4H和图8A)。我们还观察到更长的dRNA被赋予更高的编辑效率，dRNA-71nt为0.6％，dRNA-131nt为1.4％(图3H)。对于另一个管家基因GAPDH，我们使用71nt dRNA(CAAGGUGCGGCUCCGGCCCCUCCCCUCUUCAAGGGGUCCACAUGGCAACUGUGAGGAGGGGAGAUUCAGUG(SEQ IDNO：37))，编辑效率为0.3％，可能是由于dRNA的长度短(图8B)。
实施例4.对示例性LEAPER方法的脱靶分析
对于治疗应用，编辑的精确度是关键的。接下来，我们试图表征本申请的示例性RNA编辑系统的特异性。我们选择内源性PPIB位点1和KRAS位点进行分析。对于PPIB位点1，我们可以看到，在dRNA覆盖区域之间，在靶向的A76的侧翼存在几个A碱基，例如A22，A30，A33，A34，A39，A49，A80，A91，A107和A140。这揭示了，那些侧翼的A碱基几乎没有受到编辑，而靶向的A76碱基(A-C错配)显示高达14％的编辑效率(图5A和5B)。
对于KRAS位点，我们可以在dRNA覆盖区域中看到，在靶向的A56碱基的侧翼存在许多腺嘌呤，多达29个侧翼A碱基。根据KRAS mRNA编辑结果，我们发现虽然靶向的A56碱基(A-C错配)显示高达11.7％的编辑效率，但是可以编辑侧翼腺嘌呤(图5C和5D)。编辑了多种脱靶的腺嘌呤，而诸如A41，A43，A45，A46，A74，A79的腺嘌呤显示出更多的编辑。我们发现那些未经编辑的A碱基的5'最近邻位是G或C，而那些有效编辑的腺嘌呤的5'最近邻位是T或A。基于这一观察，我们开始设计dRNA以最大程度减小对那些易于编辑的腺嘌呤的脱靶编辑。在我们的研究中，我们发现ADAR比A-A，A-U错配更优选A-C错配，并且A-G错配是最不优选的。因此，我们提出，对于5'最近邻位为U或A的脱靶A碱基，A-G错配可能会减少或消除脱靶效应。之前的研究报道了A-G错配可能会阻碍ADAR的脱氨基编辑。
接下来，基于图5D中的统计结果和现有知识，我们设计了三种91-nt dRNA变体和四种111-nt dRNA变体(具有如下所示的序列)，其含有不同的A-G错配组合：dRNA-AG1(A41，A46，A74)；dRNA-AG2(A41，A43，A45，A46，A74，A79)；dRNA-AG3(A31，A32，A33，A41，A43，A45，A46，A47，A74，A79)；dRNA-AG4(A7，A31，A32，A33，A40，A41，A43，A45，A46，A47，A74，A79，A95)(图4E)。KRAS-dRNA-91-AG2
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC(SEQ ID NO:38)
KRAS-dRNA-91-AG3
UAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC(SEQ ID NO:39)
KRAS-dRNA-91-AG4
UAGCUGGAUCGUCAAGGCACUCGUGCCGACGCCACCAGCUCCAACCACCACAAGGGGAGAGGCAGUCAGGGUCAGCAGGCCUCUCUCCCGC(SEQ ID NO:40)
KRAS-dRNA-111-AG1
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCUUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUgUAUAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC(SEQ ID NO:41)
KRAS-dRNA-111-AG2
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGUggAgAgUCAGUCAUUUUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC(SEQ ID NO:42)
KRAS-dRNA-111-AG3
GAUUCUGAAUUAGCUGUAUCGUCAAGGCACUCgUGCCgACGCCACCAGCUCCAACcACCACAAGgggAgAgUCAGUCAgggUCAGCAGGCCUCUCUCCCGCACCUGGGAGC(SEQ ID NO:43)
KRAS-dRNA-111-AG4
GCUCCCCGGUGCGGGAGAGAGGCCUGCUGACCCUGACUGCCUCUCCCCUUGUGGUGGUUGGAGCUGGUGGCGUCGGCACGAGUGCCUUGACGAUCCAGCUAAUUCAGAAUC(SEQ ID NO:44)
然后将这些dRNA转染到HEK293T细胞中，并将空白载体和71-nt非靶向dRNA对照：(tctcagtccaatgtatggtccgagcacaagctctaatcaaagtccgcgggtgtagaccggttgccatagga(SEQID NO：45))用作阴性对照。对于91-nt dRNA，深度测序结果显示，dRNA-91-AG2的中靶(on-target)编辑(A56)降至2.8％，dRNA-91-AG3的降至2.3％，dRNA-91-AG4的降至0.7％，这是与没有A-G错配的dRNA-91的中靶编辑(A56)效率7.9％相比(图4F)。对于91-nt dRNA，dRNA-111-AG2的中靶编辑(A56)降低至5.1％，而dRNA-111-AG3的降低至4.9％，这是与没有A-G错配的dRNA-111的中靶编辑(A56)效率15.1％相比(图4F)，这表明较长的dRNA可以具有更多的A-G错配。接下来我们选择111-nt dRNA进行详细的脱靶分析。除A7和A79外，显著消除了侧翼的A碱基编辑(图4G)。对于A7碱基，可以通过该位点的进一步A-G错配设计来防止脱靶效应，这在当前的dRNA设计中是不存在的。对于A79碱基，引入相邻的两个A-G错配A78/A79可能有助于消除脱靶效应。基于这样的结果，应用本申请的RNA编辑系统治愈基因疾病是非常有希望和鼓舞人心的。
实施例5.在多个细胞系中测试示例性LEAPER方法
通过HEK293T细胞中的结果，我们认为，由线性dRNA及其靶标RNA形成的双链RNA可以招募内源ADAR蛋白用于A-I编辑。为了证实这一假设，我们选择了更多的细胞系来测试我们的RNA编辑方法。结果如图9所示。多个细胞系的结果证明了我们RNA编辑方法有普遍性。首先，尽管具有多种编辑效率，但使用dRNA招募内源性ADAR适合于多种人类细胞系(其源自7种不同的组织和器官)。此外，该方法不仅可以在人类细胞中起作用，而且可以在小鼠细胞中起作用，提供了在小鼠上进行实验的可能性。
实施例6.利用内源性ADAR进行RNA编辑
试图探索一种有效的RNA编辑平台，我们将高活性E1008Q突变体ADAR1(ADAR1DD)40的脱氨酶结构域与催化失活的LbuCas13(dCas13a)，一种RNA指导的靶向RNA的CRISPR效应子41融合(图10A)。为了评估RNA编辑效率，我们构建了一个包含通过包含3x GGGGS编码区和框内UAG终止密码子的序列连接mCherry和EGFP基因的替代报道分子(报道分子-1，图10B)。报道分子转染的细胞仅表达mCherry蛋白，而在报道分子转录物的UAG上进行靶向的编辑可以将终止密码子转换为UIG，因此允许下游EGFP表达。这样的报道分子允许我们通过监测EGFP水平来测量A-至-I编辑效率。然后，我们设计了hU6启动子驱动的crRNA(CRISPR RNA)，其包含进行Cas13a识别的5'支架和可变长度的间隔区序列以用于靶向(crRNACas13a，紧随LbuCas13 crRNA序列)。
表2.LbuCas13 crRNA序列
Figure BDA0003305483380000741
与靶转录物互补的序列均包含与UAG密码子相对的CCA，从而引入与腺苷(A)错配的胞苷(C)(图10B)，因为腺苷脱氨作用优先发生在A-C错配位点13,14。为了测试crRNA的最佳长度，在稳定表达报道分子-1的HEK293T细胞中，将不同长度的非靶向或靶向crRNA与dCas13a-ADAR1DD蛋白共表达。用含有至少40-nt长的匹配序列的crRNA观察到了由EGFP表达出现所示的明显的RNA编辑作用，crRNA越长，EGFP阳性百分比就越高(图10C)。令人惊讶地，单独的长crRNACas13a的表达似乎足以激活EGFP表达，并且dCas13a-ADAR1DD的共表达反而降低了crRNA活性(图10C，10D)。EGFP表达显然是序列依赖性的，因为70-nt(针对长度计算不包括5'支架)对照RNA不能激活EGFP的表达(图10C，10D)。
令人惊讶的发现是，某些长期工程化的crRNACas13a能够独立于dCas13a-ADAR1DD进行RNA编辑，我们决定从crRNA中除去Cas13a招募的支架序列。因为crRNA70具有触发EGFP表达的最高活性(图10C，10D)，所以我们选择了表3中的相同的70-nt长的指导RNA，而没有Cas13a招募支架进行进一步测试(图11A和以下在实施例中使用的arRNA的和对照RNA的序列)。
表3.
Figure BDA0003305483380000751
Figure BDA0003305483380000761
Figure BDA0003305483380000771
Figure BDA0003305483380000781
Figure BDA0003305483380000791
Figure BDA0003305483380000801
Figure BDA0003305483380000811
Figure BDA0003305483380000821
Figure BDA0003305483380000831
Figure BDA0003305483380000841
Figure BDA0003305483380000851
结果证明，这种线性指导RNA在接近40％携带报道分子-1的总细胞中诱导了强的EGFP表达(图11B，上图)。由于内源性ADAR蛋白可以编辑双链RNA(dsRNA)底物12，因此我们认为长指导RNA可以与靶标转录物退火形成dsRNA底物，转而招募内源性ADAR蛋白用于靶向的编辑。因此，我们将这样的指导RNA称为arRNA(ADAR招募RNA)。
为了验证内源性ADAR蛋白是否确实对上述观察负有责任，我们着手研究在ADAR缺陷细胞中arRNA介导的RNA编辑。由于在HEK293T细胞中几乎检测不到ADAR2 mRNA(图12A)，因此我们生成了HEK293T ADAR1-/-细胞，使该细胞系在ADAR1和ADAR2中均缺乏(图11C，D)。实际上，ADAR1的消耗消除了arRNA70诱导的EGFP信号(图11B，下图)。此外，HEK293T ADAR1-/-细胞中ADAR1p110，ADAR1p150或ADAR2的外源表达(图11C，d)成功地挽救了通过arRNA70诱导EGFP的丢失(图11E，图12B)，证明了arRNA诱导的EGFP报道分子表达仅仅取决于天然的ADAR1，其活性可以通过其同种型(p110和p150)或ADAR2重建。对arRNA70靶向区域的Sanger测序分析显示，UAG中预测的腺苷位点有一个A/G重叠峰，表明明显的A至I(G)转化(图11F)。下一代测序(NGS)进一步证实了A至I的转化率约为全部报道分子转录物的13％(图11G)。定量PCR分析表明arRNA70不会减少靶向的转录物的表达(图13)，排除了arRNA可能的RNAi效应。总体而言，我们的数据表明，arRNA能够通过工程化的A-C错配对靶向的转录物产生显著水平的编辑。
实施例7.LEAPER可以在多个细胞系中进行RNA编辑
因为内源性ADAR蛋白的表达是LEAPER介导的RNA编辑的前提，所以我们测试了LEAPER在一组来自不同组织的细胞系中的性能，这些细胞系包括HT29，A549，HepG2，RD，SF268，SW13和HeLa。我们首先使用蛋白质印迹分析检查了所有三种ADAR蛋白的内源表达。ADAR1在所有测试的细胞系中都高度表达，其在蛋白质印迹中的身份已通过阴性对照HEK293T ADAR1–/–系得到证实(图14A，B)。仅在HepG2和HeLa细胞中检测到ADAR3(图14A，B)。在任何细胞中均未检测到ADAR2，其结果并非由于蛋白质印迹的失败，因为可以从过表达ADAR2的HEK293T细胞中检测到ADAR2蛋白(图14A，b)。这些发现与先前报道的一致，即ADAR1广泛表达，而ADAR2和ADAR3的表达仅限于某些组织11。
然后我们着手在这些细胞系中测试靶向报道分子-1的重新设计的71-nt arRNA(arRNA71)的编辑效率(图15A和上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。
LEAPER在该arRNA71的所有测试的细胞中都工作，尽管效率有所不同(图14C)。这些结果与先前的报道一致，即除了HepG2和HeLa细胞外，ADAR1/2蛋白水平与RNA编辑产率相关42。编辑效率与ADAR1水平的次优相关性可能是由于这两个系中都有大量的ADAR3表达(图14A，B)，因为据报道ADAR3在RNA编辑中起抑制作用。重要的是，LEAPER还在小鼠起源的三种不同细胞系(NIH3T3，小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)和B16)中起作用(图14D)，为通过动物和疾病模型测试其治疗潜力铺平了道路。总体而言，我们得出的结论是，LEAPER是一种用于广谱细胞类型以及不同生物体的多用途工具。
实施例8.LEAPER的表征和优化
为了更好地表征和优化LEAPER，我们研究了靶向的转录物的UAG三联体内与腺苷相对的核苷酸的选择。在HEK293T细胞中，靶向报道分子-1的arRNA71显示出可变的编辑效率，具有与靶向的UAG相对的变化的三联体(5’-CNA，N表示A/U/C/G之一)(上面列出的在这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。A-C错配导致最高的编辑效率，而A-G错配产生最少但明显的编辑(图16A)。然后，我们研究了arRNA中A-C错配侧翼核苷酸的优先度。我们测试了胞苷(5'-N1CN2)周围的5'和3'相邻位点的所有16个组合(上面列出的在这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)，发现3'相邻腺苷是有效编辑所必需的，而腺苷是5'位点上最不利的核苷酸(图16B，c)。因此，我们得出结论，arRNA上的CCA基序赋予了靶向UAG位点的最高编辑效率。值得注意的是，arRNA中的3'相邻鸟苷(5'-N1CG)表现出戏剧性的抑制作用(图16B，c)。
RNA的长度似乎在指导对靶向的转录物的编辑中与arRNA效率有关(图10C)，与先前的报道一致42。为了完全理解这种效果，我们测试了可变长度的arRNA，它们靶向两种不同的报道分子转录物-报道分子-1和报道分子-2(图15A，b)。对于任一报道分子靶向，设计和测试了10种不同大小的arRNA，范围从31-nt到211-nt，CCA三联体(用于UAG靶向)正好位于中间(上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。基于报道分子EGFP活性，对于两个报道分子，arRNA的长度与编辑效率正相关，在111-191-nt处达到峰值(图16D)。尽管一个arRNA51似乎起作用，但71-nt是arRNA对两个报道分子均起作用的最短长度(图16D)。
接下来，我们研究了arRNA内A-C错配位置对编辑效率的影响。我们将所有要测试的arRNA的长度固定为71-nt，并将靶向UAG的ACC三联体从arRNA中的5'滑到3'(上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。事实证明，将A-C错配放在中间区域会导致高编辑产率，并且在两个报道分子中靠近3'端错配位点的arRNA优于靠近5'端的那些(图16E)。为方便起见，对所有我们的后续研究，我们都将A-C错配置于arRNA的中心。
我们还测试了LEAPER的靶向灵活性，并试图确定靶标上的UAG是否是进行RNA编辑的唯一基序。对于报道分子-3上的所有16个三联体组合(5'-N1AN2)(图15C)，我们使用了固定长度(111-nt)的相应arRNA，并确保了除了编辑位点(A-C错配)外，arRNA和报道分子的完美序列匹配(图16F和上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。NGS结果表明，所有N1AN2基序均可编辑。UAN2和GAN2分别是最优选和最不优选的基序(图16F，g)。总体而言，靶标腺苷的最近邻位优先度为5'U>C≈A>G和3'G>C>A≈U(图16G)。
实施例9.使用LEAPER编辑内源转录物
接下来，我们检查了LEAPER是否可以对内源转录物进行有效的编辑。使用不同长度的arRNA，我们靶向PPIB，KRAS和SMAD4基因转录物中的UAG基序，以及FANCC基因转录物中的UAC基序(图17A，上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA序列)。令人鼓舞的是，所有四种转录物中的靶向的腺苷位点均由其相应的所有四种大小的arRNA编辑，尽管根据NGS结果的效率有所不同(图17B)。与我们先前的观察一致，更长的arRNA倾向于产生更高的编辑率。值得注意的是，151-nt的arRNAPPIB编辑了PPIB基因总转录物的～50％(图17B)。没有arRNA在其靶向的转录物(图18A)或最终蛋白质水平(例如KRAS，图18B)上显示出RNAi作用。此外，LEAPER能够在非UAN位点上达到理想的编辑率(图17C和上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)，显示LEAPER在编辑内源转录物上的灵活性。为了进一步探索LEAPER的功能，我们测试了LEAPER是否可以同时靶向多个位点。我们通过共表达两个arRNA(上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)观察到TARDBP和FANCC转录物的多重编辑，其效率甚至高于单个arRNA(图17D)的那些，表明LEAPER非常适合平行编辑多个靶标。
值得注意的是，ADAR1/2倾向于使RNA双链体中的多个腺苷杂乱地脱氨基44，并且A-C错配不是指导A至I转换的唯一基序(图16A)。因此，可以合理地假设，arRNA覆盖范围内靶标转录物上的所有腺苷均受到可变水平的编辑，这是不想要的修饰的主要来源。arRNA越长，这样的脱靶的可能性就越高。因此，我们检查了这些靶向的转录物中arRNA覆盖区域内的所有腺苷位点。对于PPIB转录物，在整个测序窗口中，对于可变大小的arRNA，观察到很少的脱靶编辑(图17E，f)。但是，在靶向KRAS，SMAD4和FANCC基因的情况下，检测到多个脱靶编辑(图19A-F)。特别是对于KRAS，在arRNA111的测序窗口中，30个腺苷中有11个进行了大量的A至I转化(图19A，b)。
我们接下来尝试开发策略以最小化这样的不想要的脱靶效应。因为A-G错配抑制了UAG靶向的编辑(图16A)，所以我们假设将鸟苷与非靶向腺苷配对可能会减少不希望的编辑。然后，我们测试了报道分子-3中所有可能的三联体组合(5'-N1AN2)中A-G错配对腺苷的影响(图15C和上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA序列)。与A-C错配(图16F)相比，除了UAG或AAG靶向(～2％)(图17G)，A-G错配确实降低了所有测试的靶标中对腺苷的编辑。为了进一步降低不想要的位点的编辑率，我们继续测试了两个连续错配的影响。结果表明，与UAG或AAG相对的三联体的3'端核苷酸处的额外错配消除了其相应的腺苷编辑(图17H以及上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。根据这些发现，我们尝试应用此规则以减少KRAS转录物中的脱靶(图19A)。我们首先设计了一个arRNA(arRNA111-AG6)，其在arRNA111覆盖的所有“易编辑”基序上产生了A-G错配(图17I，图19A和上面列出的研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)，包括AAU(第61位)，UAU(第63位)，UAA(第65位)，AAA(第66位)，UAG(第94位)和AAG(第99位)。该arRNA111-AG6消除了大部分脱靶编辑，同时保持了约5％的中靶编辑率。与图17G中的发现一致，单个A-G错配不能完全最大程度的减小AAG基序(第99位)的编辑(图17I和图19A)。然后，我们在arRNA111-AG6上添加了更多错配，包括双重错配(与靶向的基序5'-AAG相对的5'-CGG)，以及三个另外的A-G错配以减轻第27、98和115位腺苷的编辑(arRNA111-AG9)(上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)。因此，我们实现了大大提高的编辑的特异性，而又没有在靶标位点(A76)上额外损失编辑率(图17I)。总之，结合其他规则的工程化的LEAPER可以对内源转录物进行有效和更精确的RNA编辑。
实施例10.LEAPER的RNA编辑特异性
除了在arRNA覆盖的dsRNA区域内可能的脱靶效应外，我们还担心通过arRNA的部分碱基配对对其他转录物的潜在脱靶效应。然后，我们进行了转录组范围的RNA测序分析，以评价LEAPER的全局脱靶效应。在进行RNA-seq分析之前，先用Ctrl RNA151或PPIB特异性arRNA(arRNA151-PPIB)表达质粒转染细胞。我们在Ctrl RNA151组中确定了六个潜在脱靶(图20A)，在arRNA151-PPIB中确定了五个潜在脱靶(图20B)，基于NGS分析的PPIB中靶率为～37％(图20B)。进一步的分析表明，除来自EIF2AK2转录物的两个位点外，所有位点均位于SINE(Alu)或LINE区域(图20A，B)，均易于受到ADAR介导的编辑45，表明这些脱靶可能不是从靶标转录物和arRNA或Ctrl RNA的配对中得出的。值得注意的是，两组中出现了两种脱靶转录物，WDR73和SMYD4，表明它们不太可能是序列依赖性RNA编辑。实际上，最小自由能分析表明，所有这些可能的脱靶转录物均不能与Ctrl RNA151或arRNA151-PPIB形成稳定的双链体(图20C)。为了进一步测试arRNA是否产生序列依赖性脱靶，我们通过使用NCBI BLAST比较arRNA151-PPIB和arRNA111-FANCC的序列相似性来选择潜在的脱靶位点。arRNA151-PPIB的TRAPPC12转录物以及arRNA111-FANCC的ST3GAL1，OSTM1-AS1和EHD2转录物中的三个位点是最佳候选者(图20D和图21A)。NGS分析表明，在这些预测的脱靶位点中均不能检测到编辑(图20D和图21B)。这些结果表明，LEAPER允许在靶向的位点进行有效编辑，同时保持转录组范围的特异性，而没有可检测的序列依赖性脱靶编辑。
实施例11.LEAPER在哺乳动物细胞中的安全性评估
因为arRNA依赖于内源性ADAR蛋白来编辑靶标转录物，所以我们想知道外源性arRNA的添加是否通过占用过多的ADAR1或ADAR2蛋白来影响天然RNA编辑事件。因此，我们从转录组范围的RNA测序结果中分析了模拟组和arRNA151-PPIB组共享的A-至-I RNA编辑位点，并且还分析了模拟组和Ctrl RNA151组之间的比较。与模拟组相比，Ctrl RNA151组和arRNA151-PPIB组均未显示出显著差异(图22A，B)，这表明LEAPER对内源ADAR1催化天然A-至-I编辑事件的正常功能影响很小。
同时，我们使用RNA-seq数据进行了差异基因表达分析，以验证arRNA是否影响全局基因表达。我们发现，与模拟组相比，Ctrl RNA151和arRNA151-PPIB均不影响全局基因表达(图22C，D)。与我们先前的观察一致(图18A)，arRNA对PPIB的表达未显示任何RNAi作用(图22C，D)。
考虑到arRNA与靶标转录物形成RNA双链体并且RNA双链体可引起先天免疫应答，我们研究了arRNA的引入是否具有这样的作用。为了测试这一点，我们选择了靶向已证明有效的四个基因转录物的arRNA。我们没有观察到干扰素-β(IFN-β)(图22E)或白介素6(IL-6)(图22F)的任何mRNA诱导，这是先天免疫激活的两个标志。作为阳性对照，双链RNA的合成类似物-聚(I：C)诱导了强烈的IFN-β和IL-6表达(图22E，f)。LEAPER似乎不会在靶细胞中诱导免疫原性，一种对安全治疗很重要的特征。
实施例12.通过LEAPER恢复p53的转录调节活性
现在我们已经建立了无需引入外源蛋白质就可以进行RNA编辑的新方法，我们试图证明其治疗实用性。我们首先靶向了肿瘤抑制基因TP53，已知该基因在维持细胞稳态中起着至关重要的作用，但在>50％的人类癌症中经历频繁突变46。TP53中的c.158G>A突变是临床相关的无意义突变(Trp53Ter)，导致无功能的截短蛋白46。我们设计了一个arRNA111和两个替代性arRNA(arRNA111-AG1和arRNA111-AG4)(上面列出的本研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)，它们均靶向TP53W53X转录物(图23A)，后两个被设计为最大程度低减小潜在脱靶。我们产生了HEK293T TP53–/–细胞系，以消除天然p53蛋白的作用。靶向TP53W53X的所有三种形式的arRNA都在突变的腺苷位点上转化了TP53W53X转录物的～25-35％(图23B)，可变减少arRNA111-AG1和arRNA111-AG4的不想要的编辑(图24)。蛋白质印迹表明，基于HEK293TTP53–/–细胞中的TP53W53X转录物，arRNA111，arRNA111-AG1和arRNA111-AG4均可挽救全长p53蛋白的产生，而Ctrl RNA111则不能(图23C)。
为了验证修复的p53蛋白是否完全起作用，我们用p53-荧光素酶顺式报道系统测试了p53的转录调节活性47，48。所有三个版本的arRNA均可恢复p53活性，而优化版本的arRNA111-AG1表现最佳(图23D)。总之，我们证明了LEAPER能够修复与癌症相关的TP53的提前终止密码子(pre-mature stop codon)并恢复其功能。
实施例13.LEAPER对致病性突变的校正
接下来，我们调查了LEAPER是否可用于校正更多的致病突变。针对六个致病基因的临床相关突变：埃勒斯-当洛斯综合征(Ehlers-Danlos syndrome)的COL3A1，原发性肺动脉高压的BMPR2，朱伯特综合征(Joubert syndrome)的AHI1，范科尼贫血(Fanconi anemia)的FANCC，原发性家族性肥厚性心肌病的MYBPC3和X染色体连锁性严重联合免疫缺陷病的IL2RG，我们为携带相应致病性G>A突变的这些基因的每个设计了111-nt arRNA(图25和上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列，以及表4中示出的这项研究中使用的与疾病相关的cDNA)。
表4.这项研究中使用的与疾病相关的cDNA
Figure BDA0003305483380000921
通过在HEK293T细胞中共表达arRNA/cDNA对，我们在所有测试中鉴定了大量的具有A>G校正的靶标转录物(图24)。由于G>A突变占人类已知致病点突变的近一半10,49，因此LEAPER进行的A>G转化可为治疗提供巨大的机会。
实施例14.LEAPER在多个人类原代细胞中进行RNA编辑
为了进一步探索LEAPER的临床实用性，我们着手在多个人类原代细胞中测试该方法。首先，我们在人原代肺成纤维细胞和人原代支气管上皮细胞中用151-nt arRNA(上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA的序列)测试了LEAPER，以编辑报道分子-1(图15A)。在两个人原代细胞中，LEAPER均可获得35-45％的EGFP阳性细胞(图27A)。然后，我们测试了LEAPER在这两个原代细胞和人类原代T细胞中编辑内源性基因PPIB的结果，发现arRNA151-PPIB在人类原代肺成纤维细胞，原代支气管上皮细胞(图27B)和原代T细胞(图27C)中的编辑率可分别达到>40％，>80％和>30％。LEAPER在人原代细胞中的高编辑效率因其在治疗中的潜在应用而特别令人鼓舞。
实施例15.通过慢病毒表达和arRNA的化学合成的有效编辑
然后我们研究了是否可以通过临床上更相关的方法来递送LEAPER。我们首先通过基于慢病毒的表达测试了arRNA的作用。感染后2天(dpi)，靶向报道分子-1的arRNA151在HEK293T细胞中的40％以上带有报道分子-1的总细胞中诱导了强EGFP表达。在8dpi时，EGFP比率保持在～38％的可比水平(图28A和上面列出的这项研究中使用的arRNA和对照RNA序列)，表明LEAPER可以适合需要连续施用的疗法。对于天然基因编辑，我们通过慢病毒转导在HEK293T细胞中递送了靶向PPIB的arRNA151，并在6dpi时观察到超过6％的靶标编辑(图28B)。
我们接下来测试了用于LEAPER的合成的arRNA寡核苷酸和电穿孔递送方法。化学合成具有111-nt的靶向PPIB转录物的arRNA和Ctrl RNA，并在arRNA的首尾各3个核苷酸处进行2'-O-甲基化和硫代磷酸酯连接修饰(图28C)。通过电穿孔引入T细胞后，arRNA111-PPIB寡核苷酸在PPIB转录物上实现了～20％的编辑(图28D)，这表明LEAPER有望开发出寡核苷酸药物。
实施例16.通过LEAPER恢复源自Hurler综合征患者的原代成纤维细胞中的α-L-艾杜糖醛酸酶活性
最后，我们检查了LEAPER在治疗单基因疾病-Hurler综合征方面的潜力，该疾病是由于α-L-艾杜糖醛酸酶(IDUA)，一种负责粘多糖的降解的溶酶体代谢酶的缺乏而导致的I型粘多糖贮积病(MPS I)最严重的亚型50。我们选择了从Hurler综合征患者最初分离的原代成纤维细胞GM06214。GM06214细胞在IDUA基因的外显子9中含有纯合的TGG>TAG突变，导致蛋白质中的Trp402Ter突变。我们通过具有化学修饰的合成RNA寡核苷酸设计了两个版本的arRNA，所述化学修饰是序列首尾3个核苷酸中的2’-O-甲基化和核苷酸间硫代磷酸酯键，分别是靶向IDUA的成熟mRNA和pre-mRNA的arRNA111-IDUA-V1和arRNA111-IDUA-V2(图29A以及在上面列出的这项研究中使用arRNA和对照RNA的序列)。经由电穿孔将arRNA111-IDUA-V1或arRNA111-IDUA-V2引入GM06214细胞后，我们通过NGS分析测量了靶向的RNA编辑率，并在不同的时间点用4-MU-α-L-艾杜糖醛酸酶底物测量了α-L-艾杜糖醛酸酶的催化活性。在电穿孔后，arRNA111-IDUA-V1和arRNA111-IDUA-V2均可随着时间的推移逐渐地显著恢复IDUA-缺失的GM06214细胞中IDUA催化活性，而arRNA111-IDUA-V2的性能要比arRNA111-IDUA-V1好得多，而在三个对照组中无α-L-艾杜糖醛酸酶活性可以检测到(图29B)。
为了进一步评价LEAPER在GM06214中恢复的IDUA活性减轻Hurler综合征的程度，我们检查了GM01323细胞中的IDUA活性，GM01323细胞是来自患有Scheie综合征的患者的另一种原代成纤维细胞，该综合征是一种比Hurler轻得多的MPS I亚型，由于IDUA基因上杂合基因型导致残留IDUA活性而引起的。我们发现电穿孔后48小时，在具有arRNA111-IDUA-V2的GM06214细胞中IDUA的催化活性高于GM01323细胞(图29B)。与这些结果一致，NGS分析表明arRNA111-IDUA-V2将近30％的A转换为I编辑，比arRNA111-IDUA-V1的转化率高得多(图29C)。进一步的分析表明，在IDUA转录物的arRNA覆盖区域内检测到最少的不想要的编辑(图29D)。重要的是，LEAPER不会在原代细胞中触发免疫反应，如我们证明的，与RNA双链体聚(I：C)用作阳性对照不同，arRNA111-IDUA-V1和arRNA111-IDUA-V2均未诱导一组涉及I型干扰素和促炎反应的基因的表达(图29E)。这些结果表明LEAPER在靶向某些单基因疾病方面的治疗潜力。
实施例17.GM06214突变基因型的检测
将GM06214细胞培养于含有15％血清和1％成纤维细胞生长添加物(ScienCell，GFS，目录号2301)的成纤维细胞培养基(ScienCell，FM培养基，目录号2301)中，培养箱为37℃及5％CO2，持续2-3天。当细胞为90％汇合时，将其用0.25％的胰蛋白酶消化，然后用含有15％血清的成纤维细胞培养基终止消化。根据操作说明书，使用
Figure BDA0003305483380000941
(天根生化科技(北京)有限公司，TIANGEN Biotech(Beijing)Co.，Ltd.)细胞DNA提取试剂盒(目录号DP304-03)进行DNA提取。
使用NCBI-Primer blast(网站：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)设计IDUA突变位点上游和下游序列的引物。SEQ ID NO：304：CGCTTCCAGGTCAACAACAC(正向引物hIDUA-F1)；SEQ ID NO：305：CTCGCGTAGATCAGCACCG(反向引物hIDUA-R1)。进行PCR，并对PCR产物进行Sanger测序。如图34所示，经确认该细胞的突变是导致该疾病的G至A突变。
实施例18.GM06214细胞的转染条件测试
当GM06214达到90％汇合度时消化GM06214细胞，并在消化终止后计数。对于电转染，将600万个细胞用400μl预混合的电转染溶液(Lonza，目录号：V4XP-3024)重悬，并加入20μg GFP质粒(Lonza，目录号：V4XP-3024)。混合后，取20μl悬浮液作为电转染体系，以使用Lonza NucleofectorTM仪器测试8种条件中的每一种，所述8种条件包括7种测试电转染条件(参见图35)和一个阴性对照。每种条件的测试做一个重复。电转染后，将细胞迅速转移到含有15％血清的2ml成纤维细胞培养基(ScienCell，FM培养基，目录号：2301)中。将每种条件的细胞铺板至2个孔(6孔培养板)中，并在5％CO2和37℃的培养箱中进行培养。电转染后24小时，消化每种电转染条件的2个孔其中一孔的细胞，通过流式细胞仪测量GFP阳性细胞的比例。电转染后48小时，消化每种电转染条件的2个孔中的另一孔中的细胞，并通过流式细胞仪测量GFP阳性细胞的比例。如图35所示，细胞的最佳电转染条件是CA-137条件。
实施例19.IDUA酶活性和A至G突变率的检测
设计和合成寡聚dRNA，用于靶向由IDUA基因转录的具有pre-mRNA和成熟RNA的突变位点的序列。dRNA的序列如下所示。所有的dRNA序列都以CM0模式进行了修饰(2'-O-甲基化位于序列首尾各3个核苷酸，序列的首尾各3个核苷酸间连接是硫代磷酸酯化的)。
SEQ ID NO 204：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucauccagcagcgccagcagcgcaccccuggggugagcaccggcuu(Pre-55nt-c-55nt)；
SEQ ID NO 205：gacgcccaccgugugguugcuguccaggacggucccggccugcgacacuucggcccagagcugcuccucaucugcggggcgggggggggccgucgccgcguggggucguug(m-55nt-c-55nt)；
SEQ ID NO 341：uaccgcuacagccacgcugauuucagcuauaccugcccgguauaaagggacguucacaccggauguucuccgcggggauaucgcgauauucaggauuaaaagaagugc(随机-111nt)。
其中，合成的dRNA中与突变的碱基相对应的碱基是C，其在结合时与突变的碱基形成A-C错配。合成的dRNA的长度优选为111nt。使用实施例2中获得的最佳电转染条件电转染细胞。电转染后48小时，收集细胞用于酶活性测定和A至G突变率检测。
测定A至G突变率：
将设计的dRNA溶解在无RNA酶的水中(TransGene Biotech，目录号：GI201-01)至所需浓度，并储存在-80℃。当GM06214细胞生长至约90％汇合度时，将细胞消化，并在消化终止后计数。将100万个细胞和200pmol的dRNA混合并稀释至100μl，然后在CA-137的条件下进行电转染。电转染后48小时，对细胞计数并测量其生活力。将细胞转移至无RNA酶的离心管中并进行离心。丢弃上清液。使用QIAGEN RNA提取试剂盒(QIAGEN，目录号74134)提取RNA。根据说明，通过吸液将0.35ml缓冲液RLT Plus与5×105个细胞混合(如果直接从冷冻细胞中提取RNA，建议细胞用PBS洗涤一次)。将细胞裂解液转移至gDNA Eliminator旋转柱(spin column)，并在≥8000g离心30s。丢弃柱子并保留液体。加入与液体相同体积的70％乙醇。混合后，立即将混合物转移到RNeasyMinElute旋转柱中，并在≥8000g离心15s，并丢弃废液。将700μl的缓冲液RW1添加到RNeasyMinElute旋转柱中，并在≥8000g离心15s。丢弃废液，加入500μl缓冲液RPE，然后将RNeasyMinElute旋转柱在≥8000g离心15s。丢弃废液，加入500μl的80％乙醇，然后将RNeasyMinElute旋转柱在≥8000g离心2分钟。丢弃废液。将RNeasyMinElute丢柱放入新的2ml收集柱中，并盖上盖在最大速度离心5分钟以干燥柱子。将RNeasyMinElute旋转柱放入新的1.5ml收集柱中，并将14μl无RNA酶的水滴加到柱膜的中央，然后将柱子以最大速度离心1分钟以洗脱RNA。
通过Nanodrop(Thermo，Nanodrop2000)测定提取的RNA的浓度，并将1μg RNA进行逆转录(Thermo，逆转录酶，目录号28025013)。逆转录体系如表5-6所示。在65℃温育5分钟后，立即在冰浴中冷却逆转录体系。在37℃继续温育50分钟。逆转录酶在70℃灭活15分钟。在表7所示的条件下进行PCR。PCR后，取2μl PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳。根据电泳结果，确定PCR产物的浓度，以及条带大小是否正确。纯化后，用PCR产物制备文库以用于二代测序。
表5.逆转录体系-1
Figure BDA0003305483380000961
65℃，5分钟，并立即转移到冰上
表6.逆转录体系-2
体积(ul)
表5的产物 12μl
5X First-Strand缓冲液 4
0.1M DTT 2
RNaseOUT<sup>TM</sup>重组核糖核酸酶抑制剂 1
M-MLV 1
总体积 20
表7.PCR条件
Figure BDA0003305483380000971
本实施例中的酶活性测定：
将GM06214细胞消化，离心并重悬于28μl含有0.1％Triton X-100的1×PBS中，并在冰上裂解30分钟。然后将25μl细胞裂解液添加到25μl含190μm 4-甲基伞形酮-α-L-艾杜糖醛酸酶(4-methylumbelliferyl-α-L-iduronidase，Cayman，2A-19543-500，溶于含有0.2％Triton X-100，pH 3.5的0.4M甲酸钠缓冲液)中，在暗处于37℃温育90分钟。加入pH为10.3的200μl 0.5M NaOH/甘氨酸溶液(北京化工(Beijing Chemical Works)，NAOH，目录号：AR500G；Solarbio，甘氨酸，目录号G8200)灭活催化反应。在4℃离心2分钟后，将其上清液转移至96孔板，使用Infinite M200仪器(TECAN)测定荧光值。激发光的波长为365nm和450nm。荧光表示酶活性，在图中表示为GM01323中酶活性的倍数。
如图36所示，结果是靶向pre-mRNA的dRNA引起的酶活性和A至G突变率显著高于靶向成熟mRNA的那些。因此，以下实施例中使用的dRNA均靶向(pre-mRNA。
实施例20.电转染化学修饰的dRNA后IDUA-报道分子细胞系中编辑效率的检测
如图37A所示，将侧翼分别具有约100bp的IDUA突变位点的序列插入慢病毒质粒上表达mcherry和GFP蛋白的序列之间来构建质粒。将构建的质粒包装到病毒中，之后用于感染293T细胞。整合到基因组后，选择IDUA报道分子单克隆细胞。因为单克隆细胞受到插入序列中IDUA突变位点的TAG终止密码子的影响，所以它们仅表达mcherry蛋白。当细胞被dRNA编辑时，TAG(然后突变为TGG)后的GFP可正常表达。因此，GFP的表达被视为细胞中dRNA的编辑效率。如下表8所示，设计了4种优选的具有从51nt至111nt的不同长度的dRNA。所有的dRNA序列都以CM0模式修饰。在实施例18的电转染条件下，用不同长度的dRNA电转染细胞。在转染后第1天至第7天的每一天，通过确定细胞中GFP的比例初步地评价编辑效率。如图37B所示，编辑效率的峰值出现在第二天(48h)。最高编辑效率的序列是91nt：45-c-45，其高于111nt：55-c-55的编辑效率。因此，并非在所有情况下dRNA越长，编辑效率越高。此外，51nt dRNA的编辑效率很低。
表8.
Figure BDA0003305483380000981
实施例21.在用化学修饰的不同长度的dRNA转染后在不同时间点，测定GM06214细胞中细胞内IDUA酶活性和RNA编辑效率
使用实施例18(参见表7)中用于将不同长度的dRNA电转染至GM06214细胞中的条件，和使用实施例19中测定酶活性和编辑效率的方法。在电转染后的第2、4、6、8、10、12和14日，测试细胞内酶活性。在第2天和第4天，测试细胞中RNA编辑的效率。如图38A所示，91nt：45-c-45引起最高的酶活性，并且IDUA酶活性一直保持高水平直至电转染后第6天。在图38B中，91nt的dRNA和111nt的dRNA呈现大致相同的编辑效率。同样，51nt的dRNA显示低的编辑效率。
实施例22.筛选化学修饰的dRNA的优选序列
通过研究文献，我们认为电转染不适合将来的疾病治疗。因此，我们将电转染换成了Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen，目录号13778-150)，用于将dRNA转染到细胞中。结果表明，Lipofectamine RNAiMAX具有比电转染更高的转染效率。首先将序列在两个末端同时截短，然后固定该序列的一个端，截短另一端。以这种方式，获得了14个dRNA和等长的4个随机序列，如下表9所示。所有的dRNA序列都以CM0模式修饰。如图39所示，在转染后48小时测定IDUA酶活性(图39A，使用实施例19中所述的方法)和RNA编辑效率(图39B，使用NGS)。事实证明，由81nt：55-c-25(SEQ ID NO 24)和71nt：55-c-15(SEQ ID NO 25)引起的IDUA酶活性和RNA编辑效率高于其他dRNA引起的IDUA酶活性和RNA编辑效率。具有较短3'端和较长5'端的dRNA总是具有较高的效率。此外，无论3'或5'端如何变化，当dRNA的长度减少至61nt或更少时，其编辑效率似乎都戏剧性地下降。
表9.
Figure BDA0003305483380000991
实施例23.确定化学修饰的dRNA的3'末端的任选长度
在实施例22中，在由具有81nt：55-c-25和71nt：55-c-15序列的dRNA编辑的细胞中检测到较高的IDUA酶活性和编辑效率。为了找出3'端的最短和最佳长度，将3'端的序列从25nt(81nt：55-c-25)截短至5nt(61nt：55-c-5)，如表10所示。所有dRNA序列均以CM0模式修饰。在分别用81nt：55-c-25至66nt：55-c-10的dRNA转染的细胞(图40A)和分别用72nt：55-c-16至61nt：55-c-5的dRNA转染的细胞上(图40B)进行了两次IDUA酶活性测定。3'端长度从25nt到9nt的dRNA轻易地将GM06214细胞中的酶促活性提高到GM0123细胞的20倍以上。因此，3'端的最佳长度为25nt-7nt。此外，与具有3'和5'端的长度相等的45nt-c-45nt相比，具有较短3'端的dRNA总是具有更高的编辑效率。
本文使用的IDUA酶活性测定描述如下。转染前一天，将每孔3×105个细胞铺板在6孔板中。转染当天换上新的培养基。使用20nM Lipofectamine RNAiMAX试剂转染后48小时，将GM06214细胞消化，离心并重悬于33μl的含0.1％Triton X-100的1×PBS中，并在冰上裂解30分钟。然后将裂解液在4℃离心2分钟。将25μl细胞裂解液添加到25μl的含190μM 4-甲基伞形甲酰基-α-L-艾杜糖苷酸酶(4-methylumbelliferyl-α-L-iduronidase，Glycosynth，44076)的底物中，该底物溶解于0.4M含有0.2％Triton X-100(pH 3.5)的甲酸钠缓冲液，并在黑暗中于37℃温育30分钟。加入pH为10.3的200μl 0.5M NaOH/甘氨酸溶液(北京化工，NAOH，目录号：AR500G；Solarbio，甘氨酸，目录号：G8200)以灭活催化反应。将其全部上清液用Infinite M200仪器(TECAN)进行检测。激发光的波长为365nm和450nm。酶活性表示为GM01323中酶活性的倍数。
表10.
Figure BDA0003305483380001001
Figure BDA0003305483380001011
实施例24.在3'端长度固定时确定化学修饰的dRNA的5'端任选长度
在两种不同长度(76nt：55-c-20和71nt：55-c-15)的dRNA上分别进行5'端截短。如表11所示，其3'端长度固定，5'端逐渐被截短。所有dRNA序列均以CM0模式修饰。如图41所示，根据IDUA酶活性测定的结果可知，5'端在55nt和45nt之间的dRNA转染的细胞具有较高的IDUA酶活性。转染使用Lipofectamine RNAiMAX。根据图39，当长度减少到小于61nt时，即使是3'和5'末端长度不等的dRNA的编辑效率都戏剧性地降低。
表11.
Figure BDA0003305483380001012
实施例27.确定靶向核苷酸位置与化学修饰的dRNA对IDUA突变位点的编辑效率之间的关系
根据以上数据，dRNA的编辑效率与靶向核苷酸在dRNA上的长度和位置有关。通常，靶向核苷酸越靠近5'端，编辑效率越低。因此，在本实施例中，设计了具有3种固定长度的3组dRNA。每组中的dRNA都是通过将靶向核苷酸从序列中间逐渐移向5'末端设计而成的。避开了不容易合成的结构。序列如表12所示。所有dRNA序列均以CM0模式修饰。使用Lipofectamine RNAiMAX将dRNA转染到GM06214细胞中。48小时后，收获细胞并根据实施例23中所述的方法测试酶活性。根据如图42所示的数据，至少当dRNA的总长度固定为67nt，70nt或72nt时，靶向核苷酸的位置变化似乎并不影响代表编辑效率的酶活性。
表12.
Figure BDA0003305483380001013
Figure BDA0003305483380001021
实施例28.化学修饰对dRNA编辑效率的影响
合成RNA的化学修饰增加了RNA稳定性并降低了脱靶的可能性。RNA相对常见的化学修饰是2'-O-甲基化(2'-O-Me)和硫代磷酸酯连接。具有不同长度：71nt或76nt以及化学修饰的组合的dRNA如表13所示。使用Lipofectamine RNAiMAX用不同的dRNA转染GM06214细胞，以编辑细胞内IDUA。转染48小时后收集细胞，并使用实施例23中所示的方法测定IDUA酶活性。根据在图42A中所示的结果，除CM5外(第五种修饰：除靶向核苷酸和其两侧各5nt外，所有核苷酸均被2'-O-Me修饰)，所有修饰均引起良好的酶活性。对靶向核苷酸或与其最邻近的两个核苷酸进行的修饰不会降低编辑效率。
通过计算A到G的取代率来进一步测定编辑效率。该方法描述如下：在GM06214细胞的IDUA基因中包含靶标腺苷的序列是CTAG，其在使用dRNA进行RNA编辑后被突变为CTGG。CTAG是限制性内切酶BfaI的识别位点。因此，成功的A到G取代不导致被BfaI消化，而野生型被BfaI消化。编辑后，提取GM06214细胞的RNA并逆转录为cDNA。使用cDNA进行PCR。引物是hIDUA-62F：CCTTCCTGAGCTACCACCCG(SEQ ID NO：415)和hIDUA-62R：CCAGGGCTCGAACTCGGTAG(SEQ ID NO：416)。PCR后，将产物纯化并与BfaI(NEB，目录号：R0568L)一起温育。使用琼脂糖凝胶电泳确定A到G的取代率或编辑效率。结果表示为未切割部分(有A到G取代)相对PCR产物中总核酸的百分比，其使用凝胶电泳图像的灰度值计算。结果如图42B所示。这与图42A中酶活性测定的结果相似。
表13.
Figure BDA0003305483380001031
Figure BDA0003305483380001041
注：“m”指核苷酸核糖上的2'-O-Me，“*”是指硫代磷酸酯化连接。
实施例29.对修饰模式的进一步验证
在另一序列上对CM1的修饰模式进行了测试。使用现有技术中优选的修饰模式作为对照。如表14所示，测试序列为55nt-c-15nt-CM1，36nt-c-13nt-CM11为阳性对照，其中，除编辑三联体“CCA”外，所有核苷酸均用2'-O-Me修饰，并且首尾各四个核苷酸间连接被硫代磷酸酯化。另外，36nt-c-13nt-CM11仅为51nt，这在本发明中不是优选的长度，而在现有技术中是一种优选的长度。使用Lipofectamine RNAiMAX将dRNA转染至GM06214细胞后48小时，使用实施例23所示的方法检测IDUA酶活性。如图44所示，55nt-c-15nt-CM1具有比36nt-c-13nt-CM11显著更高的编辑效率。
表14.
Figure BDA0003305483380001051
注：“m”指核苷酸核糖上的2-O'-Me，“*”是指硫代磷酸酯化连接。
实施例30.在其它细胞中进一步测试dRNA
该实施例集中于使用LEAPER技术修复USH2A c.11864G>A(p.Trp3955*)突变。在此实施例中设计的报道分子系统如图45A所示。在USH2A c.11864G>A(p.Trp3955*)的情况下，正常的TGG序列被突变为中止密码子TAG。因此，突变的mRNA的翻译会在该TAG处提前终止。293T(293T细胞来自北京大学C.Zhang的实验室)报道分子系统是一种慢病毒载体，如上图45A所示的mRNA由CMV启动子驱动。该系统包括以下部分：1)可稳定表达的mCherry红色荧光蛋白，2)USH2A基因的突变位点及其两侧相邻的100个碱基对，3)GFP绿色荧光蛋白。成功编辑突变位点时，TAG密码子将转换为TIG，从而允许翻译继续进行，并且USH2A序列后的GFP可以正常翻译。因此，GFP的表达代表了编辑效率。
dRNA在体外合成。该实施例中使用的所有dRNA序列如表15所示。所有dRNA序列均以CM0模式修饰。测试的具体步骤如下：
293T报告分子细胞在含10％FBS(Vistech，SE100-011)的DMEM(HycloneSH30243.01)中培养。汇合时，将细胞以15,000个细胞/孔转移到12孔板中。时间记录为0小时。
在24小时，使用Lipofectamine RNAiMAX试剂(Invitrogen 13778150)用12.5pmol的dRNA转染各孔中的293T细胞。转染方案由产品手册提供。
在72小时，用胰蛋白酶(Invitrogen，13778-150)消化每个孔中的细胞，并使用流式细胞仪检测FITC(异硫氰酸荧光素)的强度。
如图45B所示，为3'和5'端长度相等的dRNA在细胞中的编辑效率。NC代表没有dRNA转染的对照细胞。根据上述实施例，用111nt，91nt和71nt的dRNA转染的细胞的GFP阳性率超过90％，而用51nt dRNA转染的细胞导致GFP阳性率非常低。由左侧的MFI(平均荧光强度)的数据，111nt dRNA导致荧光强度最高。
如图45C所示，分别将3'和5'端长度不同的dRNA和3'和5'端相等的111nt dRNA分别转染到细胞中。如本实施例中所使用的，具有55nt 5'端的dRNA，其3'端为55nt，45nt，35nt，25nt或5nt。类似地，具有55nt 3'末端的dRNA，其5'端为55nt，45nt，35nt，25nt或5nt。根据图45C的结果，当dRNA的长度减少到61nt时，编辑效率戏剧性地下降，而较长的dRNA具有明显更高的编辑效率。其中，55nt-c-25nt的dRNA具有最高的编辑效率。因此，将dRNA的3'端固定为25nt，而5'端的长度从55nt到25nt不等。用这些dRNA转染的细胞的结果显示在图45D中。有来自两个不同批次的两个55nt-c-25nt的dRNA。显然5'端越短，编辑效率越低。另外，图45D中的结果再次表明，为了确保编辑效率，dRNA的长度优选地不小于61nt。
表15.
Figure BDA0003305483380001061
ADAR1(p110)cDNA
5’-atggccgagatcaaggagaaaatctgcgactatctcttcaatgtgtctgactcctctgccctgaatttggctaaaaatattggccttaccaaggcccgagatataaatgctgtgctaattgacatggaaaggcagggggatgtctatagacaagggacaacccctcccatatggcatttgacagacaagaagcgagagaggatgcaaatcaagagaaatacgaacagtgttcctgaaaccgctccagctgcaatccctgagaccaaaagaaacgcagagttcctcacctgtaatatacccacatcaaatgcctcaaataacatggtaaccacagaaaaagtggagaatgggcaggaacctgtcataaagttagaaaacaggcaagaggccagaccagaaccagcaagactgaaaccacctgttcattacaatggcccctcaaaagcagggtatgttgactttgaaaatggccagtgggccacagatgacatcccagatgacttgaatagtatccgcgcagcaccaggtgagtttcgagccatcatggagatgccctccttctacagtcatggcttgccacggtgttcaccctacaagaaactgacagagtgccagctgaagaaccccatcagcgggctgttagaatatgcccagttcgctagtcaaacctgtgagttcaacatgatagagcagagtggaccaccccatgaacctcgatttaaattccaggttgtcatcaatggccgagagtttcccccagctgaagctggaagcaagaaagtggccaagcaggatgcagctatgaaagccatgacaattctgctagaggaagccaaagccaaggacagtggaaaatcagaagaatcatcccactattccacagagaaagaatcagagaagactgcagagtcccagacccccaccccttcagccacatccttcttttctgggaagagccccgtcaccacactgcttgagtgtatgcacaaattggggaactcctgcgaattccgtctcctgtccaaagaaggccctgcccatgaacccaagttccaatactgtgttgcagtgggagcccaaactttccccagtgtgagtgctcccagcaagaaagtggcaaagcagatggccgcagaggaagccatgaaggccctgcatggggaggcgaccaactccatggcttctgataaccagcctgaaggtatgatctcagagtcacttgataacttggaatccatgatgcccaacaaggtcaggaagattggcgagctcgtgagatacctgaacaccaaccctgtgggtggccttttggagtacgcccgctcccatggctttgctgctgaattcaagttggtcgaccagtccggacctcctcacgagcccaagttcgtttaccaagcaaaagttgggggtcgctggttcccagccgtctgcgcacacagcaagaagcaaggcaagcaggaagcagcagatgcggctctccgtgtcttgattggggagaacgagaaggcagaacgcatgggtttcacagaggtaaccccagtgacaggggccagtctcagaagaactatgctcctcctctcaaggtccccagaagcacagccaaagacactccctctcactggcagcaccttccatgaccagatagccatgctgagccaccggtgcttcaacactctgactaacagcttccagccctccttgctcggccgcaagattctggccgccatcattatgaaaaaagactctgaggacatgggtgtcgtcgtcagcttgggaacagggaatcgctgtgtaaaaggagattctctcagcctaaaaggagaaactgtcaatgactgccatgcagaaataatctcccggagaggcttcatcaggtttctctacagtgagttaatgaaatacaactcccagactgcgaaggatagtatatttgaacctgctaagggaggagaaaagctccaaataaaaaagactgtgtcattccatctgtatatcagcactgctccgtgtggagatggcgccctctttgacaagtcctgcagcgaccgtgctatggaaagcacagaatcccgccactaccctgtcttcgagaatcccaaacaaggaaagctccgcaccaaggtggagaacggagaaggcacaatccctgtggaatccagtgacattgtgcctacgtgggatggcattcggctcggggagagactccgtaccatgtcctgtagtgacaaaatcctacgctggaacgtgctgggcctgcaaggggcactgttgacccacttcctgcagcccatttatctcaaatctgtcacattgggttaccttttcagccaagggcatctgacccgtgctatttgctgtcgtgtgacaagagatgggagtgcatttgaggatggactacgacatccctttattgtcaaccaccccaaggttggcagagtcagcatatatgattccaaaaggcaatccgggaagactaaggagacaagcgtcaactggtgtctggctgatggctatgacctggagatcctggacggtaccagaggcactgtggatgggccacggaatgaattgtcccgggtctccaaaaagaacatttttcttctatttaagaagctctgctccttccgttaccgcagggatctactgagactctcctatggtgaggccaagaaagctgcccgtgactacgagacggccaagaactacttcaaaaaaggcctgaaggatatgggctatgggaactggattagcaaaccccaggaggaaaagaacttttatctctgcccagtagattacaaggatgacgacgataag(标记标签)TAG-3’(SEQ ID NO:332)
ADAR1(p150)cDNA
5’atgaatccgcggcaggggtattccctcagcggatactacacccatccatttcaaggctatgagcacagacagctcagataccagcagcctgggccaggatcttcccccagtagtttcctgcttaagcaaatagaatttctcaaggggcagctcccagaagcaccggtgattggaaagcagacaccgtcactgccaccttccctcccaggactccggccaaggtttccagtactacttgcctccagtaccagaggcaggcaagtggacatcaggggtgtccccaggggcgtgcatctcggaagtcaggggctccagagagggttccagcatccttcaccacgtggcaggagtctgccacagagaggtgttgattgcctttcctcacatttccaggaactgagtatctaccaagatcaggaacaaaggatcttaaagttcctggaagagcttggggaagggaaggccaccacagcacatgatctgtctgggaaacttgggactccgaagaaagaaatcaatcgagttttatactccctggcaaagaagggcaagctacagaaagaggcaggaacaccccctttgtggaaaatcgcggtctccactcaggcttggaaccagcacagcggagtggtaagaccagacggtcatagccaaggagccccaaactcagacccgagtttggaaccggaagacagaaactccacatctgtctcagaagatcttcttgagccttttattgcagtctcagctcaggcttggaaccagcacagcggagtggtaagaccagacagtcatagccaaggatccccaaactcagacccaggtttggaacctgaagacagcaactccacatctgccttggaagatcctcttgagtttttagacatggccgagatcaaggagaaaatctgcgactatctcttcaatgtgtctgactcctctgccctgaatttggctaaaaatattggccttaccaaggcccgagatataaatgctgtgctaattgacatggaaaggcagggggatgtctatagacaagggacaacccctcccatatggcatttgacagacaagaagcgagagaggatgcaaatcaagagaaatacgaacagtgttcctgaaaccgctccagctgcaatccctgagaccaaaagaaacgcagagttcctcacctgtaatatacccacatcaaatgcctcaaataacatggtaaccacagaaaaagtggagaatgggcaggaacctgtcataaagttagaaaacaggcaagaggccagaccagaaccagcaagactgaaaccacctgttcattacaatggcccctcaaaagcagggtatgttgactttgaaaatggccagtgggccacagatgacatcccagatgacttgaatagtatccgcgcagcaccaggtgagtttcgagccatcatggagatgccctccttctacagtcatggcttgccacggtgttcaccctacaagaaactgacagagtgccagctgaagaaccccatcagcgggctgttagaatatgcccagttcgctagtcaaacctgtgagttcaacatgatagagcagagtggaccaccccatgaacctcgatttaaattccaggttgtcatcaatggccgagagtttcccccagctgaagctggaagcaagaaagtggccaagcaggatgcagctatgaaagccatgacaattctgctagaggaagccaaagccaaggacagtggaaaatcagaagaatcatcccactattccacagagaaagaatcagagaagactgcagagtcccagacccccaccccttcagccacatccttcttttctgggaagagccccgtcaccacactgcttgagtgtatgcacaaattggggaactcctgcgaattccgtctcctgtccaaagaaggccctgcccatgaacccaagttccaatactgtgttgcagtgggagcccaaactttccccagtgtgagtgctcccagcaagaaagtggcaaagcagatggccgcagaggaagccatgaaggccctgcatggggaggcgaccaactccatggcttctgataaccagcctgaaggtatgatctcagagtcacttgataacttggaatccatgatgcccaacaaggtcaggaagattggcgagctcgtgagatacctgaacaccaaccctgtgggtggccttttggagtacgcccgctcccatggctttgctgctgaattcaagttggtcgaccagtccggacctcctcacgagcccaagttcgtttaccaagcaaaagttgggggtcgctggttcccagccgtctgcgcacacagcaagaagcaaggcaagcaggaagcagcagatgcggctctccgtgtcttgattggggagaacgagaaggcagaacgcatgggtttcacagaggtaaccccagtgacaggggccagtctcagaagaactatgctcctcctctcaaggtccccagaagcacagccaaagacactccctctcactggcagcaccttccatgaccagatagccatgctgagccaccggtgcttcaacactctgactaacagcttccagccctccttgctcggccgcaagattctggccgccatcattatgaaaaaagactctgaggacatgggtgtcgtcgtcagcttgggaacagggaatcgctgtgtaaaaggagattctctcagcctaaaaggagaaactgtcaatgactgccatgcagaaataatctcccggagaggcttcatcaggtttctctacagtgagttaatgaaatacaactcccagactgcgaaggatagtatatttgaacctgctaagggaggagaaaagctccaaataaaaaagactgtgtcattccatctgtatatcagcactgctccgtgtggagatggcgccctctttgacaagtcctgcagcgaccgtgctatggaaagcacagaatcccgccactaccctgtcttcgagaatcccaaacaaggaaagctccgcaccaaggtggagaacggagaaggcacaatccctgtggaatccagtgacattgtgcctacgtgggatggcattcggctcggggagagactccgtaccatgtcctgtagtgacaaaatcctacgctggaacgtgctgggcctgcaaggggcactgttgacccacttcctgcagcccatttatctcaaatctgtcacattgggttaccttttcagccaagggcatctgacccgtgctatttgctgtcgtgtgacaagagatgggagtgcatttgaggatggactacgacatccctttattgtcaaccaccccaaggttggcagagtcagcatatatgattccaaaaggcaatccgggaagactaaggagacaagcgtcaactggtgtctggctgatggctatgacctggagatcctggacggtaccagaggcactgtggatgggccacggaatgaattgtcccgggtctccaaaaagaacatttttcttctatttaagaagctctgctccttccgttaccgcagggatctactgagactctcctatggtgaggccaagaaagctgcccgtgactacgagacggccaagaactacttcaaaaaaggcctgaaggatatgggctatgggaactggattagcaaaccccaggaggaaaagaacttttatctctgcccagtagattacaaggatgacgacgataaG(标记标签)TAG-3’(SEQ ID NO:333)
ADAR2 cDNA
5’-atggatatagaagatgaagaaaacatgagttccagcagcactgatgtgaaggaaaaccgcaatctggacaacgtgtcccccaaggatggcagcacacctgggcctggcgagggctctcagctctccaatgggggtggtggtggccccggcagaaagcggcccctggaggagggcagcaatggccactccaagtaccgcctgaagaaaaggaggaaaacaccagggcccgtcctccccaagaacgccctgatgcagctgaatgagatcaagcctggtttgcagtacacactcctgtcccagactgggcccgtgcacgcgcctttgtttgtcatgtctgtggaggtgaatggccaggtttttgagggctctggtcccacaaagaaaaaggcaaaactccatgctgctgagaaggccttgaggtctttcgttcagtttcctaatgcctctgaggcccacctggccatggggaggaccctgtctgtcaacacggacttcacatctgaccaggccgacttccctgacacgctcttcaatggttttgaaactcctgacaaggcggagcctcccttttacgtgggctccaatggggatgactccttcagttccagcggggacctcagcttgtctgcttccccggtgcctgccagcctagcccagcctcctctccctgccttaccaccattcccacccccgagtgggaagaatcccgtgatgatcttgaacgaactgcgcccaggactcaagtatgacttcctctccgagagcggggagagccatgccaagagcttcgtcatgtctgtggtcgtggatggtcagttctttgaaggctcggggagaaacaagaagcttgccaaggcccgggctgcgcagtctgccctggccgccatttttaacttgcacttggatcagacgccatctcgccagcctattcccagtgagggtcttcagctgcatttaccgcaggttttagctgacgctgtctcacgcctggtcctgggtaagtttggtgacctgaccgacaacttctcctcccctcacgctcgcagaaaagtgctggctggagtcgtcatgacaacaggcacagatgttaaagatgccaaggtgataagtgtttctacaggaacaaaatgtattaatggtgaatacatgagtgatcgtggccttgcattaaatgactgccatgcagaaataatatctcggagatccttgctcagatttctttatacacaacttgagctttacttaaataacaaagatgatcaaaaaagatccatctttcagaaatcagagcgaggggggtttaggctgaaggagaatgtccagtttcatctgtacatcagcacctctccctgtggagatgccagaatcttctcaccacatgagccaatcctggaagaaccagcagatagacacccaaatcgtaaagcaagaggacagctacggaccaaaatagagtctggtgaggggacgattccagtgcgctccaatgcgagcatccaaacgtgggacggggtgctgcaaggggagcggctgctcaccatgtcctgcagtgacaagattgcacgctggaacgtggtgggcatccagggatccctgctcagcattttcgtggagcccatttacttctcgagcatcatcctgggcagcctttaccacggggaccacctttccagggccatgtaccagcggatctccaacatagaggacctgccacctctctacaccctcaacaagcctttgctcagtggcatcagcaatgcagaagcacggcagccagggaaggcccccaacttcagtgtcaactggacggtaggcgactccgctattgaggtcatcaacgccacgactgggaaggatgagctgggccgcgcgtcccgcctgtgtaagcacgcgttgtactgtcgctggatgcgtgtgcacggcaaggttccctcccacttactacgctccaagattaccaaacccaacgtgtaccatgagtccaagctggcggcaaaggagtaccaggccgccaaggcgcgtctgttcacagccttcatcaaggcggggctgggggcctgggtggagaagcccaccgagcaggaccagttctcactcacgcccgattacaaggatgacgacgataag(标记标签)TAG-3’(SEQ ID NO:334)
疾病相关基因的编码序列(CDS)
COL3A1
5’-atgatgagctttgtgcaaaaggggagctggctacttctcgctctgcttcatcccactattattttggcacaacaggaagctgttgaaggaggatgttcccatcttggtcagtcctatgcggatagagatgtctggaagccagaaccatgccaaatatgtgtctgtgactcaggatccgttctctgcgatgacataatatgtgacgatcaagaattagactgccccaacccagaaattccatttggagaatgttgtgcagtttgcccacagcctccaactgctcctactcgccctcctaatggtcaaggacctcaaggccccaagggagatccaggccctcctggtattcctgggagaaatggtgaccctggtattccaggacaaccagggtcccctggttctcctggcccccctggaatctgtgaatcatgccctactggtcctcagaactattctccccagtatgattcatatgatgtcaagtctggagtagcagtaggaggactcgcaggctatcctggaccagctggccccccaggccctcccggtccccctggtacatctggtcatcctggttcccctggatctccaggataccaaggaccccctggtgaacctgggcaagctggtccttcaggccctccaggacctcctggtgctataggtccatctggtcctgctggaaaagatggagaatcaggtagacccggacgacctggagagcgaggattgcctggacctccaggtatcaaaggtccagctgggatacctggattccctggtatgaaaggacacagaggcttcgatggacgaaatggagaaaagggtgaaacaggtgctcctggattaaagggtgaaaatggtcttccaggcgaaaatggagctcctggacccatgggtccaagaggggctcctggtgagcgaggacggccaggacttcctggggctgcaggtgctcggggtaatgacggtgctcgaggcagtgatggtcaaccaggccctcctggtcctcctggaactgccggattccctggatcccctggtgctaagggtgaagttggacctgcagggtctcctggttcaaatggtgcccctggacaaagaggagaacctggacctcagggacacgctggtgctcaaggtcctcctggccctcctgggattaatggtagtcctggtggtaaaggcgaaatgggtcccgctggcattcctggagctcctggactgatgggagcccggggtcctccaggaccagccggtgctaatggtgctcctggactgcgaggtggtgcaggtgagcctggtaagaatggtgccaaaggagagcccggaccacgtggtgaacgcggtgaggctggtattccaggtgttccaggagctaaaggcgaagatggcaaggatggatcacctggagaacctggtgcaaatgggcttccaggagctgcaggagaaaggggtgcccctgggttccgaggacctgctggaccaaatggcatcccaggagaaaagggtcctgctggagagcgtggtgctccaggccctgcagggcccagaggagctgctggagaacctggcagagatggcgtccctggaggtccaggaatgaggggcatgcccggaagtccaggaggaccaggaagtgatgggaaaccagggcctcccggaagtcaaggagaaagtggtcgaccaggtcctcctgggccatctggtccccgaggtcagcctggtgtcatgggcttccccggtcctaaaggaaatgatggtgctcctggtaagaatggagaacgaggtggccctggaggacctggccctcagggtcctcctggaaagaatggtgaaactggacctcagggacccccagggcctactgggcctggtggtgacaaaggagacacaggaccccctggtccacaaggattacaaggcttgcctggtacaggtggtcctccaggagaaaatggaaaacctggggaaccaggtccaaagggtgatgccggtgcacctggagctccaggaggcaagggtgatgctggtgcccctggtgaacgtggacctcctggattggcaggggccccaggacttagaggtggagctggtccccctggtcccgaaggaggaaagggtgctgctggtcctcctgggccacctggtgctgctggtactcctggtctgcaaggaatgcctggagaaagaggaggtcttggaagtcctggtccaaagggtgacaagggtgaaccaggcggtccaggtgctgatggtgtcccagggaaagatggcccaaggggtcctactggtcctattggtcctcctggcccagctggccagcctggagataagggtgaaggtggtgcccccggacttccaggtatagctggacctcgtggtagccctggtgagagaggtgaaactggccctccaggacctgctggtttccctggtgctcctggacagaatggtgaacctggtggtaaaggagaaagaggggctccgggtgagaaaggtgaaggaggccctcctggagttgcaggaccccctggaggttctggacctgctggtcctcctggtccccaaggtgtcaaaggtgaacgtggcagtcctggtggacctggtgctgctggcttccctggtgctcgtggtcttcctggtcctcctggtagtaatggtaacccaggacccccaggtcccagcggttctccaggcaaggatgggcccccaggtcctgcgggtaacactggtgctcctggcagccctggagtgtctggaccaaaaggtgatgctggccaaccaggagagaagggatcgcctggtgcccagggcccaccaggagctccaggcccacttgggattgctgggatcactggagcacggggtcttgcaggaccaccaggcatgccaggtcctaggggaagccctggccctcagggtgtcaagggtgaaagtgggaaaccaggagctaacggtctcagtggagaacgtggtccccctggaccccagggtcttcctggtctggctggtacagctggtgaacctggaagagatggaaaccctggatcagatggtcttccaggccgagatggatctcctggtggcaagggtgatcgtggtgaaaatggctctcctggtgcccctggcgctcctggtcatccaggcccacctggtcctgtcggtccagctggaaagagtggtgacagaggagaaagtggccctgctggccctgctggtgctcccggtcctgctggttcccgaggtgctcctggtcctcaaggcccacgtggtgacaaaggtgaaacaggtgaacgtggagctgctggcatcaaaggacatcgaggattccctggtaatccaggtgccccaggttctccaggccctgctggtcagcagggtgcaatcggcagtccaggacctgcaggccccagaggacctgttggacccagtggacctcctggcaaagatggaaccagtggacatccaggtcccattggaccaccagggcctcgaggtaacagaggtgaaagaggatctgagggctccccaggccacccagggcaaccaggccctcctggacctcctggtgcccctggtccttgctgtggtggtgttggagccgctgccattgctgggattggaggtgaaaaagctggcggttttgccccgtattatggagatgaaccaatggatttcaaaatcaacaccgatgagattatgacttcactcaagtctgttaatggacaaatagaaagcctcattagtcctgatggttctcgtaaaaaccccgctagaaactgcagagacctgaaattctgccatcctgaactcaagagtggagaatactgggttgaccctaaccaaggatgcaaattggatgctatcaaggtattctgtaatatggaaactggggaaacatgcataagtgccaatcctttgaatgttccacggaaacactggtggacagattctagtgctgagaagaaacacgtttggtttggagagtccatggatggtggttttcagtttagctacggcaatcctgaacttcctgaagatgtccttgatgtgcagctggcattccttcgacttctctccagccgagcttcccagaacatcacatatcactgcaaaaatagcattgcatacatggatcaggccagtggaaatgtaaagaaggccctgaagctgatggggtcaaatgaaggtgaattcaaggctgaaggaaatagcaaattcacctacacagttctggaggatggttgcacgaaacacactggggaatggagcaaaacagtctttgaatatcgaacacgcaaggctgtgagactacctattgtagatattgcaccctatgacattggtggtcctgatcaagaatttggtgtggacgttggccctgtttgctttttataa-3’(SEQ ID NO:335)
BMPR2
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FANCC
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MYBPC3
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IL2RG
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讨论
基因组编辑技术正在彻底改变生物医学研究。高活性核酸酶，诸如锌指核酸酶(ZFN)1，转录激活因子样效应子核酸酶(TALEN)2-4和CRISPR的Cas蛋白(聚簇规则间隔短回文重复序列)系统5-7已成功工程化成可操纵无数生物体中的基因组。最近，已经利用脱氨基酶精确地改变了基因密码而不破坏双链DNA。通过将胞苷或腺苷脱氨酶与CRISPR-Cas9系统联合，研究人员创建了可编程的碱基编辑器，使基因组DNA中的C·G转化为T·A或A·T转化为G·C8-10，为纠正致病突变提供新的机会。
除了DNA之外，RNA是用于基因校正的引人注目的靶标，因为RNA修饰可以改变蛋白质功能而不会对基因组产生任何永久性变化。目前已利用ADAR腺苷脱氨酶对RNA实现精确的碱基编辑。在哺乳动物中已鉴定出三种ADAR蛋白，即ADAR1(亚型p110和p150)，ADAR2和ADAR3(催化失活)11,12，其底物是双链RNA，其中与胞嘧啶(C)错配的腺苷(A)优先被脱氨基为肌苷(I)。肌苷被认为在翻译过程中可模拟鸟苷(G)13,14。为了实现靶向RNA编辑，将ADAR蛋白或其催化结构域与λN肽15-17，SNAP-tag18-22或Cas蛋白(dCas13b)23融合，并设计了一个指导RNA来招募嵌合的ADAR蛋白至特定位点。或者，也有报道称过表达的ADAR1或ADAR2蛋白与带有R/G基序的指导RNA一起可以使靶向RNA编辑24-27成为可能。
在哺乳动物系统中所有这些已报道的核酸编辑方法都依赖于两种成分的异位表达：一种酶和一种指导RNA。尽管这些二进制系统在大多数研究中都能有效地工作，但是一些固有的障碍限制了它们的广泛应用，尤其是在治疗中。因为基因治疗最有效的体内递送是通过病毒载体28，并且高度理想的腺相关病毒(AAV)载体受到负荷大小(～4.5kb)的限制，因此使同时容纳蛋白质和指导RNA成为挑战29,30。最近有报道称，由于RNA的异常过度编辑31，ADAR1的过表达赋予多发性骨髓瘤的致癌性，并产生大量的全局脱靶编辑32。此外，异位表达蛋白质或其非人类来源的结构域具有引发免疫原性的潜在风险30,33。此外，预先存在的适应性免疫和p53介导的DNA损伤反应可能会损害治疗性蛋白质(诸如Cas934-38)的功效。尽管已经尝试利用内源性机制进行RNA编辑，但是仅通过将预组装的靶标转录物：RNA双链体注射入非洲爪蟾(Xenopus)胚胎中进行尝试。非常需要不依赖蛋白质异位表达的强健的核酸编辑替代技术。在这里，我们开发了一种利用内源性ADAR进行RNA编辑的新方法。我们表明，表达经过精心设计的指导RNA可以对内源RNA进行高效且精确的编辑，并纠正致病突变。该一元核酸编辑平台可以为治疗和研究开辟新的途径。
特别地，我们表明具有足够长度的线性arRNA的表达能够引导内源ADAR蛋白在靶向转录物上将腺苷编辑成肌苷。该系统称为LEAPER，它利用内源性ADAR蛋白来实现可编程的核酸编辑，因此比现有方法具有优势。
LEAPER的罕见品质是其简单性，因为它仅依赖于小分子RNA来指导内源蛋白质进行RNA编辑。这使人想起RNAi，其中小的dsRNA可以调用靶向RNA降解的天然机制51。由于尺寸小，arRNA可以很容易地通过多种病毒和非病毒载体递送。与RNAi不同，LEAPER催化精确的A至I转换，而不会产生靶向转录物的切割或降解(图18A)。尽管arRNA的长度要求比RNAi长，但它既不诱导细胞水平的免疫刺激作用(图22E，f和图29E)，也不影响内源性ADAR蛋白的功能(图22A，B)，使其为RNA靶向的安全策略。引人注目的是，据报道，ADAR蛋白或其催化结构域的异位表达会诱导大量全局脱靶编辑32，并可能引发癌症31。
最近，几个研究小组报道，由于效应蛋白的表达，胞嘧啶碱基编辑器可在小鼠胚胎，水稻或人类细胞系中产生大量脱靶的单核苷酸变体，这示例说明了LEAPER针对潜在治疗应用的优势52-54。令人欣慰的是，LEAPER能够进行有效的编辑，同时又引起罕见的全局脱靶编辑(图20和图21)。此外，LEAPER可以最大程度地减少潜在的免疫原性或克服其他需要引入外源蛋白质的方法通常共有的递送障碍。
对于LEAPER，我们建议使用最小大小高于70-nt的arRNA以实现所希望的活性。在天然环境中，ADAR蛋白非特异性编辑具有300-nt以上双链体的Alu重复序列55。值得注意的是，Alu重复序列形成稳定的分子内双链体，而LEAPER导致arRNA与mRNA或pre-mRNA之间的分子间双链体，这应该是不稳定的，更难以形成。因此，我们假设长于70nt的RNA双链体在化学计量上对于招募或船坞ADAR蛋白进行有效编辑很重要。实际上，更长的arRNA导致异位表达的报道分子和内源转录物的更高编辑产率(图16D和图17B)。但是，由于ADAR蛋白混杂地使RNA双链体中的腺苷碱基脱氨基，因此更长的arRNA可在靶向窗口内引起更多的脱靶。
虽然LEAPER可以有效地打靶天然转录物，但是它们的编辑效率和脱靶率却有所不同。对于PPIB转录物靶向，我们可以将50％的靶向腺苷转化为肌苷，而在覆盖窗口内没有明显的脱靶(图17B，F)。对于其他转录物，脱靶变得更加严重。我们已经设法减少了脱靶，诸如引入A-G错配或连续错配以抑制不希望的编辑。但是，太多的错配会降低中靶效率。考虑到效率和潜在的脱靶，我们会建议使用长度在100到150-nt之间的arRNA对内源转录物进行编辑。如果有选择，最好选择腺苷较少的区域，以最大程度地减少不想要的编辑的机会。令人鼓舞的是，我们没有在arRNA靶向的转录双链体之外检测到任何脱靶(图20)。
我们已经优化了arRNA的设计以实现提高的编辑效率，并证明了可以利用LEAPER来操纵基因功能或纠正致病突变。我们还表明，LEAPER不仅限于在UAG上起作用，替代的，它还与可能的任何腺苷一起起作用，而不管其侧翼核苷酸如何(图16F，G和图17C)。这样的灵活性对于由某些单点突变引起的遗传疾病的潜在治疗校正是有利的。有趣的是，在编辑IDUA转录物时，靶向pre-mRNA的arRNA比靶向成熟RNA的更有效，这表明核是ADAR蛋白的主要作用位点，并且LEAPER可通过修饰pre-mRNA中的剪接位点来操纵剪接。更重要的是，LEAPER证明了同时靶向多个基因转录物的高效性(图17D)。LEAPER的这种多路复用能力可能在将来被开发用于治疗某些多基因疾病。
在RNA水平上进行遗传校正是有益的。首先，在靶向转录物上进行编辑不会永久改变基因组或全套转录组(transcriptome repertoire)，从而使RNA编辑方法比基因组编辑方法更安全地用于治疗。此外，暂时编辑非常适合于临时控制治疗由在特定状态中的偶尔改变导致的疾病。其次，LEAPER和其他RNA编辑方法不会在基因组上引入DSB，从而避免了产生不希望的大DNA片段缺失的风险37。采用切口酶Cas9的DNA碱基编辑方法仍可在基因组中产生插入缺失8。此外，独立于天然DNA修复机制，LEAPER也应在有丝分裂后的细胞中起作用，诸如ADAR2高表达的小脑细胞11。
我们已经证明，LEAPER可以应用于广泛的细胞类型，诸如人类细胞系(图14C)，小鼠细胞系(图14D)和包括原代T细胞的人类原代细胞(图27和图28D)。通过慢病毒递送或合成的寡核苷酸进行的有效编辑为治疗发展提供了更大的潜力(图28)。此外，LEAPER可以在多种应用中产生表型或生理变化，包括恢复p53的转录调控活性(图7)，纠正致病突变(图26)以及恢复源自Hurler综合征患者原代成纤维细胞的α-L-艾杜糖醛酸酶活性(图29)。因此可以设想，LEAPER在疾病治疗方面具有巨大潜力。
Stafforst及其同事报道了一种新的，看似相似的RNA编辑方法，称为RESTORE，其通过使用合成的反义寡核苷酸招募内源性ADAR而起作用56。RESTORE和LEAPER之间的根本区别在于用于招募内源性ADAR的指导RNA的独特性质。RESTORE的指导RNA限于化学合成反义寡核苷酸(ASO)，取决于复杂的化学修饰，而LEAPER的arRNA可以多种方式生成，化学合成和表达来自病毒的或非病毒的载体(图28和图29)。重要的是，经过大量化学修饰，ASO只能在疾病治疗中短暂起作用。相比之下，arRNA可以通过表达产生，一种对于不断编辑的目的而言尤其重要的特征。
关于LEAPER的效率和特异性，仍有改进的余地。由于LEAPER依赖于内源性ADAR，因此靶细胞中ADAR蛋白的表达水平是成功编辑的决定因素之一。根据先前的报道57和我们的观察(图14A，b)，ADAR1p110在组织中广泛表达，确保了LEAPER的广泛适用性。ADAR1p150是干扰素诱导的同种型58，并已证明在LEAPER中具有功能(图11E，图12B)。因此，在某些情况下，干扰素刺激性RNA与arRNA的共转染可进一步提高编辑效率。或者，由于ADAR3发挥抑制作用，因此抑制ADAR3可增强表达ADAR3的细胞的编辑效率。此外，arRNA的其他修饰可提高其编辑效率。例如，与某些ADAR招募支架融合的arRNA可增加局部ADAR蛋白浓度，从而提高编辑产率。到目前为止，我们只能利用内源性ADAR1/2蛋白进行A至I碱基的转化。探索是否可以类似地利用更多的天然机制来修饰遗传元件，特别是实现有效的核酸编辑，是令人兴奋的。
总体上，我们提供了原理证明，可以共同选择细胞中的内源性机制来编辑RNA转录物。我们证明了LEAPER是一个简单，有效和安全的系统，为基于基因编辑的疗法和研究开辟了一条新途径。
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序列表
<110> 博雅辑因（北京）生物科技有限公司
北京大学
<120> 编辑RNA的方法和组合物
<130> PE01705A
<150> PCT/CN2019/082713
<151> 2019-04-15
<150> PCT/CN2019/129952
<151> 2019-12-30
<160> 416
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 1
atggtgagca agggcgagga ggataacatg gccatcatca aggagttcat gcgcttcaag 60
gtgcacatgg agggctccgt gaacggccac gagttcgaga tcgagggcga gggcgagggc 120
cgcccctacg agggcaccca gaccgccaag ctgaaggtga ccaagggtgg ccccctgccc 180
ttcgcctggg acatcctgtc ccctcagttc atgtacggct ccaaggccta cgtgaagcac 240
cccgccgaca tccccgacta cttgaagctg tccttccccg agggcttcaa gtgggagcgc 300
gtgatgaact tcgaggacgg cggcgtggtg accgtgaccc aggactcctc cctgcaggac 360
ggcgagttca tctacaaggt gaagctgcgc ggcaccaact tcccctccga cggccccgta 420
atgcagaaga agaccatggg ctgggaggcc tcctccgagc ggatgtaccc cgaggacggc 480
gccctgaagg gcgagatcaa gcagaggctg aagctgaagg acggcggcca ctacgacgct 540
gaggtcaaga ccacctacaa ggccaagaag cccgtgcagc tgcccggcgc ctacaacgtc 600
aacatcaagt tggacatcac ctcccacaac gaggactaca ccatcgtgga acagtacgaa 660
cgcgccgagg gccgccactc caccggcggc atggacgagc tgtacaag 708
<210> 2
<211> 99
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 2
ctgcagggcg gaggaggcag cggcggagga ggcagcggcg gaggaggcag cagaaggtat 60
acacgccgga agaatctgta gagatccccg gtcgccacc 99
<210> 3
<211> 717
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 3
gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc 60
gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc 120
aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc 180
gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc ttcagccgct accccgacca catgaagcag 240
cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc 300
aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg 360
aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag 420
ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc 480
atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac 540
cactaccagc agaacacccc catcggcgac ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac 600
ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg 660
ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact ctcggcatgg acgagctgta caagtaa 717
<210> 4
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 4
ctgcagggcg gaggaggcag cggcggagga ggcagcggcg gaggaggcag cgcctgctcg 60
cgatgctaga gggctctgcc a 81
<210> 5
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 5
ctgcagggcg gaggaggcag cgcctgctcg cgatgctaga gggctctgcc 50
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<211> 101
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 6
ggaccacccc aaaaaugaau auaaccaaaa cugaacagcu ccucgcccuu gcucacuggc 60
agagcccucc agcaucgcga gcaggcgcug ccuccuccgc c 101
<210> 7
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 7
aaaccgaggg aucauagggg acugaaucca ccauucuucu cccaaucccu gcaacuccuu 60
cuuccccugc 70
<210> 8
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 8
ugaacagcuc cucgcccuug cucacuggca gagcccucca gcaucgcgag caggcgcugc 60
cuccuccgcc 70
<210> 9
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 9
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgctatagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 10
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 10
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgctaaagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 11
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 11
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgctacagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 12
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 12
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgctagagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 13
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 13
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcaatagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 14
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 14
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcaaaagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 15
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 15
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcaacagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 16
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 16
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcaagagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 17
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 17
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgccatagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 18
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 18
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgccaaagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
<210> 19
<211> 111
<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 19
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgccacagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
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<211> 111
<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 20
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgccagagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
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<211> 111
<212> DNA
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<223> dRNA/arRNA
<400> 21
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcgatagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
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<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 22
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcgaaagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
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<211> 111
<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 23
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcgacagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
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<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 24
atggacgagc tgtacaagct gcagggcgga ggaggcagcg cctgctcgcg atgcgagagg 60
gctctgccag tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat c 111
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 25
uagcuguauc gucaaggcac ucuugccuac gccaccagcu ccaaccacca caaguuuaua 60
uucagucauu uucagcaggc cucucucccg c 91
<210> 26
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 26
gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucuugccuac gccaccagcu ccaacuacca 60
caaguuuaua uucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccugggag c 111
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<212> RNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 27
uccacaaaau gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucuugccuac gccaccagcu 60
ccaacuacca caaguuuaua uucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccugggag 120
ccgcugagcc u 131
<210> 28
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 28
aucauauucg uccacaaaau gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucuugccuac 60
gccaccagcu ccaaccacca caaguuuaua uucagucauu uucagcaggc cucucucccg 120
caccugggag ccgcugagcc ucuggccccg c 151
<210> 29
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 29
cuauuguugg aucauauucg uccacaaaau gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac 60
ucuugccuac gccaccagcu ccaaccacca caaguuuaua uucagucauu uucagcaggc 120
cucucucccg caccugggag ccgcugagcc ucuggccccg ccgccgccuu c 171
<210> 30
<211> 191
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 30
uaggaauccu cuauuguugg aucauauucg uccacaaaau gauucugaau uagcuguauc 60
gucaaggcac ucuugccuac gccaccagcu ccaaccacca caaguuuaua uucagucauu 120
uucagcaggc cucucucccg caccugggag ccgcugagcc ucuggccccg ccgccgccuu 180
cagugccugc g 191
<210> 31
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 31
gaggcgcagc auccacaggc ggaggcgaaa gcagcccgga cagcugaggc cggaagaggg 60
uggggccgcg guggccaggg agccggcgcc gccacgcgcg gguggggggg acugggguug 120
cucgcgggcu ccgggcgggc ggcgggcgcc g 151
<210> 32
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 32
uccuguagcu aaggccacaa aauuauccac uguuuuugga acagucuuuc cgaagagacc 60
aaagaucacc cggcccacau cuucaucucc aauucguagg ucaaaauaca ccuugacggu 120
gacuuugggc cccuucuucu ucucaucggc c 151
<210> 33
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 33
gcccuggauc augaaguccu ugauuacacg auggaauuug cuguuuuugu agccaaaucc 60
uuucucuccu guagccaagg ccacaaaauu auccacuguu uuuggaacag ucuuuccgaa 120
gagaccaaag aucacccggc cuacaucuuc a 151
<210> 34
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 34
gcgcaaguua gguuuuguca agaaagggug uaacgcaacc aagucauagu ccgccuagaa 60
gcauuugcgg ug 72
<210> 35
<211> 131
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 35
gccaugccaa ucucaucuug uuuucugcgc aaguuagguu uugucaagaa aggguguaac 60
gcaaccaagu cauaguccgc cuagaagcau uugcggugga cgauggaggg gccggacucg 120
ucauacuccu g 131
<210> 36
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 36
ggacuuccug uaacaacgca ucucauauuu ggaaugacca uuaaaaaaac aacaaugugc 60
aaucaaaguc 70
<210> 37
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 37
caaggugcgg cuccggcccc uccccucuuc aaggggucca cauggcaacu gugaggaggg 60
gagauucagu g 71
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
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uagcuguauc gucaaggcac ucgugccgac gccaccagcu ccaaccacca caaggggaga 60
gucagucagg gucagcaggc cucucucccg c 91
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<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
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uagcuguauc gucaaggcac ucuugccgac gccaccagcu ccaaccacca caaguguaua 60
gucagucauu uucagcaggc cucucucccg c 91
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<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 40
uagcuggauc gucaaggcac ucgugccgac gccaccagcu ccaaccacca caaggggaga 60
ggcagucagg gucagcaggc cucucucccg c 91
<210> 41
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 41
gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucuugccgac gccaccagcu ccaaccacca 60
caaguguaua gucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccugggag c 111
<210> 42
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 42
gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucgugccgac gccaccagcu ccaaccacca 60
caaguggaga gucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccugggag c 111
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 43
gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucgugccgac gccaccagcu ccaaccacca 60
caaggggaga gucagucagg gucagcaggc cucucucccg caccugggag c 111
<210> 44
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
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gagcuggugg cgucggcacg agugccuuga cgauccagcu aauucagaau c 111
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 45
tctcagtcca atgtatggtc cgagcacaag ctctaatcaa agtccgcggg tgtagaccgg 60
ttgccatagg a 71
<210> 46
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 46
ggaccacccc aaaaaugaag gggacuaaaa c 31
<210> 47
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 47
aaaccgaggg aucauagggg acugaaucca ccauucuucu cccaaucccu gcaacuccuu 60
cuuccccugc 70
<210> 48
<211> 14
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 48
gcagagccuc cagc 14
<210> 49
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 49
cucacuggca gagccuccag c 21
<210> 50
<211> 27
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 50
cccuugcuca cuggcagagc cuccagc 27
<210> 51
<211> 33
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 51
cucucgcccu ugcucacugg cagagccucc agc 33
<210> 52
<211> 38
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 52
cucucgcccu ugcucacugg cagagccucc agcaucgc 38
<210> 53
<211> 45
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 53
ugaacagcuc ucgcccuugc ucacuggcag agccuccagc aucgc 45
<210> 54
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 54
ugaacagcuc cucgcccuug cucacuggca gagcccucca gcaucgcgag caggcgcugc 60
cuccuccgcc 70
<210> 55
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 55
aaaccgaggg aucauagggg acugaaucca ccauucuucu cccaaucccu gcaacuccuu 60
cuuccccugc 70
<210> 56
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 56
ugaacagcuc cucgcccuug cucacuggca gagcccucca gcaucgcgag caggcgcugc 60
cuccuccgcc 70
<210> 57
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 57
ucucagucca auguaugguc cgagcacaag cucuaaucaa aguccgcggg uguagaccgg 60
uugccauagg a 71
<210> 58
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 58
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 59
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 59
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucaagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 60
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 60
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucuagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 61
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 61
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 62
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 62
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugcagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 63
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 63
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuucagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 64
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 64
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuacagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 65
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 65
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccugca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 66
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 66
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugcugca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 67
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 67
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuucugca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 68
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 68
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuacugca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 69
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 69
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucccgca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 70
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 70
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugccgca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 71
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 71
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuuccgca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 72
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 72
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuaccgca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 73
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 73
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccggca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 74
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 74
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugcugca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 75
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 75
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuucggca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 76
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 76
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuacggca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 77
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 77
acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag g 31
<210> 78
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 78
gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc c 51
<210> 79
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 79
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 80
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 80
accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag 60
gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg c 91
<210> 81
<211> 131
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 81
gcucgaccag gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag 60
cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc 120
cuccgcccug c 131
<210> 82
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 82
ucgccgucca gcucgaccag gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc 60
acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg 120
ccgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac a 151
<210> 83
<211> 171
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 83
gccguuuacg ucgccgucca gcucgaccag gaugggcacc accccgguga acagcuccuc 60
gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu 120
gccuccuccg ccgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 171
<210> 84
<211> 191
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 84
ugaacuugug gccguuuacg ucgccgucca gcucgaccag gaugggcacc accccgguga 60
acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc 120
cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca 180
ugccgccggu g 191
<210> 85
<211> 211
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 85
ccggacacgc ugaacuugug gccguuuacg ucgccgucca gcucgaccag gaugggcacc 60
accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag 120
gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac 180
agcucgucca ugccgccggu ggaguggcgg c 211
<210> 86
<211> 31
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 86
gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg c 31
<210> 87
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 87
gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc u 51
<210> 88
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 88
ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc 60
uucugcugcc u 71
<210> 89
<211> 91
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 89
gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg 60
cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg c 91
<210> 90
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 90
caccaccccg gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag 60
auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg cugccuccuc c 111
<210> 91
<211> 131
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 91
ccaggauggg caccaccccg gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg 60
aucuccacag auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg cugccuccuc 120
cgccgcugcc u 131
<210> 92
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 92
uccagcucga ccaggauggg caccaccccg gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug 60
gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg 120
cugccuccuc cgccgcugcc uccuccgccc u 151
<210> 93
<211> 171
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 93
cggcgacgua uccagcucga ccaggauggg caccaccccg gugaacagcu ccucgcccuu 60
gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc 120
uccuccgccg cugccuccuc cgccgcugcc uccuccgccc ugcagcuugu a 171
<210> 94
<211> 191
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 94
uguggccguu uacgucgccg uccagcucga ccaggauggg caccaccccg gugaacagcu 60
ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc 120
uucugcugcc uccuccgccg cugccuccuc cgccgcugcc uccuccgccc ugcagcuugu 180
acagcucguc c 191
<210> 95
<211> 211
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 95
acgcugaacu uguggccguu uacgucgccg uccagcucga ccaggauggg caccaccccg 60
gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg 120
cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg cugccuccuc cgccgcugcc uccuccgccc 180
ugcagcuugu acagcucguc caugccgccg g 211
<210> 96
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 96
cagcaucgcg agcaggcgcu gccuccuccg ccgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg 60
cccugcagcu u 71
<210> 97
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 97
cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu gccuccuccg ccgcugccuc 60
cuccgcccug c 71
<210> 98
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 98
cagagcccuc cagcaucgcg agcaggcgcu gccuccuccg ccgcugccuc cuccgccgcu 60
gccuccuccg c 71
<210> 99
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 99
acuggcagag cccucccagc aucgcgagca ggcgcugccu ccuccgccgc ugccuccucc 60
gccgcugccu cc 72
<210> 100
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 100
ugcucacugg cagagcccuc cagcaucgcg agcaggcgcu gccuccuccg ccgcugccuc 60
cuccgccgcu g 71
<210> 101
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 101
gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgccgcu 60
gccuccuccg c 71
<210> 102
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 102
uccucgcccu ugcucacugg cagagcccuc cagcaucgcg agcaggcgcu gccuccuccg 60
ccgcugccuc c 71
<210> 103
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 103
ggugaacagc uccucgcccu ugcucacugg cagagcccuc cagcaucgcg agcaggcgcu 60
gccuccuccg c 71
<210> 104
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 104
accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca ucgcgagcag 60
gcgcugccuc c 71
<210> 105
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 105
gcaccacccc ggugaacagc uccucgcccu ugcucacugg cagagcccuc cagcaucgcg 60
agcaggcgcu g 71
<210> 106
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 106
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag g 71
<210> 107
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 107
accaggaugg gcaccacccc ggugaacagc uccucgcccu ugcucacugg cagagcccuc 60
cagcaucgcg a 71
<210> 108
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 108
gcucgaccag gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag 60
cccuccagca u 71
<210> 109
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 109
guccagcucg accaggaugg gcaccacccc ggugaacagc uccucgcccu ugcucacugg 60
cagagcccuc c 71
<210> 110
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 110
cacagauucu uccggcgugu auaccuucug cugccuccuc cgccgcugcc uccuccgccg 60
cugccuccuc c 71
<210> 111
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 111
aucuccacag auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg cugccuccuc 60
cgccgcugcc u 71
<210> 112
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 112
cggggaucuc cacagauucu uccggcgugu auaccuucug cugccuccuc cgccgcugcc 60
uccuccgccg c 71
<210> 113
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 113
gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc uccuccgccg 60
cugccuccuc c 71
<210> 114
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 114
cgguggcgac cggggaucuc cacagauucu uccggcgugu auaccuucug cugccuccuc 60
cgccgcugcc u 71
<210> 115
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 115
gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg cguguauacc uucugcugcc 60
uccuccgccg c 71
<210> 116
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 116
cccuugcuca cgguggcgac cggggaucuc cacagauucu uccggcgugu auaccuucug 60
cugccuccuc c 71
<210> 117
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 117
cagcuccucg cccuugcuca cgguggcgac cggggaucuc cacagauucu uccggcgugu 60
auaccuucug c 71
<210> 118
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 118
gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag auucuuccgg 60
cguguauacc u 71
<210> 119
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 119
ccccggugaa cagcuccucg cccuugcuca cgguggcgac cggggaucuc cacagauucu 60
uccggcgugu a 71
<210> 120
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 120
caccaccccg gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg aucuccacag 60
auucuuccgg c 71
<210> 121
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 121
augggcacca ccccggugaa cagcuccucg cccuugcuca cgguggcgac cggggaucuc 60
cacagauucu u 71
<210> 122
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 122
ccaggauggg caccaccccg gugaacagcu ccucgcccuu gcucacggug gcgaccgggg 60
aucuccacag a 71
<210> 123
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 123
cucgaccagg augggcacca ccccggugaa cagcuccucg cccuugcuca cgguggcgac 60
cggggaucuc c 71
<210> 124
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 124
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 125
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 125
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugcagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 126
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 126
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuucagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 127
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 127
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuacagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 128
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 128
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 129
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 129
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugcggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 130
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 130
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuucggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 131
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 131
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuacggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 132
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 132
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuccugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 133
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 133
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugcugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 134
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 134
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuacugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 135
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 135
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuucugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 136
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 136
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucccgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 137
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 137
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccugccgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 138
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 138
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuuccgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 139
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 139
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuaccgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 140
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 140
uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60
gcgauguucu cugcugggga auugcgcgau auucaggauu aaaagaagug c 111
<210> 141
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 141
acuacaguug cuccgauauu uaggcuacgu caauaggcac uaacuuauug gcgcugguga 60
acggacuucc ucucgaguac cagaagauga cuacaaaacu ccuuuccauu gcgaguaucg 120
gagucuggcu caguuuggcc agggaggcac u 151
<210> 142
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 142
cggaagaggg uggggccgcg guggccaggg agccggcgcc gccacgcgcg g 51
<210> 143
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 143
cagcugaggc cggaagaggg uggggccgcg guggccaggg agccggcgcc gccacgcgcg 60
gguggggggg a 71
<210> 144
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 144
ggaggcgaaa gcagcccgga cagcugaggc cggaagaggg uggggccgcg guggccaggg 60
agccggcgcc gccacgcgcg gguggggggg acugggguug cucgcgggcu c 111
<210> 145
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 145
gaggcgcagc auccacaggc ggaggcgaaa gcagcccgga cagcugaggc cggaagaggg 60
uggggccgcg guggccaggg agccggcgcc gccacgcgcg gguggggggg acugggguug 120
cucgcgggcu ccgggcgggc ggcgggcgcc g 151
<210> 146
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 146
ucuugccuac gccaccagcu ccaaccacca caaguuuaua uucagucauu u 51
<210> 147
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 147
gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucuugccuac gccaccagcu ccaaccacca 60
caaguuuaua uucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccugggag c 111
<210> 148
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 148
aucauauucg uccacaaaau gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucuugccuac 60
gccaccagcu ccaaccacca caaguuuaua uucagucauu uucagcaggc cucucucccg 120
caccugggag ccgcugagcc ucuggccccg c 151
<210> 149
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 149
ucggcauggu augaaguacu ucguccagga gcuggagggc ccgguguaag u 51
<210> 150
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 150
gggucugcaa ucggcauggu augaaguacu ucguccagga gcuggagggc ccgguguaag 60
ugaauuucaa u 71
<210> 151
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 151
gaccucaguc uaaagguugu gggucugcaa ucggcauggu augaaguacu ucguccagga 60
gcuggagggc ccgguguaag ugaauuucaa uccagcaagg uguuucuuug a 111
<210> 152
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 152
uaagggcccc aacgguaaaa gaccucaguc uaaagguugu gggucugcaa ucggcauggu 60
augaaguacu ucguccagga gcuggagggc ccgguguaag ugaauuucaa uccagcaagg 120
uguuucuuug augcucuguc uuggguaauc c 151
<210> 153
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 153
ugggggguuc ggcugccgac aucagcaauu gcucugccac caucucagcc c 51
<210> 154
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 154
agcagggccg ugggggguuc ggcugccgac aucagcaauu gcucugccac caucucagcc 60
cauccuccga a 71
<210> 155
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 155
aguagaaggc caagagccac agcagggccg ugggggguuc ggcugccgac aucagcaauu 60
gcucugccac caucucagcc cauccuccga agugaaugaa caggaaccag c 111
<210> 156
<211> 151
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 156
ccucccauca cgggggccgu aguagaaggc caagagccac agcagggccg ugggggguuc 60
ggcugccgac aucagcaauu gcucugccac caucucagcc cauccuccga agugaaugaa 120
caggaaccag cucucaaagg gaccuccgca g 151
<210> 157
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 157
gccaaacacc acatgcttgc catctagcca ggctgtcttg actgtcgtga tgaagaactg 60
ggagccgttg gtgtccttgc ctgcgttggc catgctcacc cagccaggcc cgtagtgctt 120
cagtttgaag ttctcatcgg ggaagcgctc a 151
<210> 158
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 158
gggagtgggt ccgctccacc agatgccagc accggggcca gtgcagctca gagccctgtg 60
gcggactaca gggcccgcac agacggtcac tcaaagaaag atgtccctgt gccctactcc 120
ttggcgatgg caaagggctt ctccacctcg a 151
<210> 159
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 159
tgcattttgt aaaatagata ctagcagatt gtcccaagat gtgtacagct cattctcaca 60
gcccagcgag ggcacctact ccacaaatgc gtggccacag gtcatcacct gtcctgtggc 120
cctggcgagc ctgatccctc acgccgggca c 151
<210> 160
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 160
gctcattctc acagcccagc gagggcactt actccacaaa tgcgtggcca caggtcatca 60
cctgtcctgt ggccccggcg agcctgatcc ctcacgccgg gcacccacac ggcctgcgtg 120
ccttctagac ttgagttcgc agctctttaa g 151
<210> 161
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 161
tcggccgggc cctgggggcg gtgggcgctg gccaggacgc ccaccgtgtg gttgctgtcc 60
aggacggtcc cggcccgcga cacttcggcc cagagctgct cctcatccag cagcgccagc 120
agccccatgg ccgtgagcac cggcttgcgc a 151
<210> 162
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 162
ugaccagucu uaagaucuuu cuugaccugc accauaagaa cuucuccaaa gguaccaaaa 60
uacucuuuca gguccuguuc gguuguuuuc caugggagac ccaacacuau u 111
<210> 163
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 163
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 164
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 164
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuggagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 165
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 165
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuugagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 166
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 166
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuagagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 167
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 167
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 168
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 168
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuggggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 169
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 169
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuugggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 170
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 170
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuagggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 171
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 171
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 172
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 172
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuggugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 173
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 173
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuagugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 174
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 174
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuugugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 175
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 175
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgcgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 176
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 176
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuggcgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 177
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 177
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuugcgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 178
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 178
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuagcgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 179
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 179
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 180
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 180
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuggagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 181
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 181
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuugagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 182
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 182
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuagagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 183
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 183
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 184
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 184
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 185
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 185
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgcgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 186
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 186
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 187
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 187
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuggugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 188
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 188
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuugugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 189
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 189
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccuagugca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 190
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 190
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgagca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 191
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 191
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgcgca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 192
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 192
gaugggcacc accccgguga acagcuccuc gcccuugcuc acuggcagag cccucgggca 60
ucgcgagcag gcgcugccuc cuccgcccug cagcuuguac agcucgucca u 111
<210> 193
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 193
gauucugaau uagcuguauc gucaaggcac ucgugccgac gccaccagcu ccaaccacca 60
caaguggaga gucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccugggag c 111
<210> 194
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 194
gauucugaau uagcuggauc gucaaggcac ucgggccgac gccaccagcu ccaaccacca 60
caaguggaga gucagucauu uucagcaggc cucucucccg caccggggag c 111
<210> 195
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 195
gggagcagcc ucuggcauuc ugggagcuuc aucuggaccu gggucuucag ugaaccauug 60
uucaauaucg uccggggaca gcaucaaauc auccauugcu ugggacggca a 111
<210> 196
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 196
gggagcagcc ucuggcauuc ugggagcuuc aucuggaccu gggucuucag ugaaccauug 60
uucaagaucg uccggggaca gcaucaaauc auccauugcu ugggacggca a 111
<210> 197
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 197
gggagcagcc ucuggcaguc ggggagcuuc aucuggaccu gggucuucag ugaaccauug 60
uucaagaucg uccggggaca gcaucaaauc auccagugcu ugggacggca a 111
<210> 198
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 198
cauauuacag aauaccuuga uagcauccaa uuugcauccu ugguuagggu caacccagua 60
uucuccacuc uugaguucag gauggcagaa uuucaggucu cugcaguuuc u 111
<210> 199
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 199
gugaagauaa gccaguccuc uaguaacaga augagcaaga cggcaagagc uuacccaguc 60
acuugugugg agacuuaaau acuugcauaa agauccauug ggauaguacu c 111
<210> 200
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 200
gugaacguca aacugucgga ccaauauggc agaaucuucu cucaucucaa cuuuccauau 60
ccguaucaug gaaucauagc auccuguaac uacuagcucu cuuacagcug g 111
<210> 201
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 201
gccaaugauc ucgugaguua ucucagcagu gugagccauc agggugauga caucccaggc 60
gaucgugugg ccuccaggag cccagagcag gaaguugagg agaaggugcc u 111
<210> 202
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 202
caagacggug aaccacucca uggucuucuu gucggcuuuc ugcacugugu acccccagag 60
cuccguguug ccgacauccu gggguggcuu ccacuccaga gccacauuaa g 111
<210> 203
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 203
aggauucucu uuugaaguau ugcuccccca guggauuggg uggcuccauu cacuccaaug 60
cugagcacuu ccacagagug gguuaaagcg gcuccgaaca cgaaacgugu a 111
<210> 204
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 204
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca uccagcagcg ccagcagccc cauggccgug agcaccggcu u 111
<210> 205
<211> 111
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 205
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca ucugcggggc gggggggggc cgucgccgcg uggggucguu g 111
<210> 206
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 206
tataactagt atggtgagca agggcgagga g 31
<210> 207
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 207
tatacgtctc atctacagat tcttccggcg tgtatacctt c 41
<210> 208
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 208
tatacgtctc atagagatcc ccggtcgcca ccgtgagcaa gggcgaggag ctg 53
<210> 209
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 209
tataggcgcg ccttacttgt acagctcgtc catgcc 36
<210> 210
<211> 94
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 210
tatacgtctc aaggcgctgc ctcctccgcc gctgcctcct ccgccgctgc ctcctccgcc 60
ctgcagcttg tacagctcgt ccatgccgcc ggtg 94
<210> 211
<211> 62
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 211
tatacgtctc agcctgctcg cgatgctaga gggctctgcc agtgagcaag ggcgaggagc 60
tg 62
<210> 212
<211> 70
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 212
tataactagt atggtggatt acaaggatga cgacgataag atgaaagtga cgaaggtagg 60
aggcatttcg 70
<210> 213
<211> 60
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 213
atatggcgcg ccgttttcag actttttctc ttccattttg tattcaaaca taatcttcac 60
<210> 214
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 214
tataggcgcg ccaggcggag gaggcagcgg cggaggaggc agcctcctcc tctcaaggtc 60
cccagaagc 69
<210> 215
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 215
tatacctgca ggctacacct tgcgtttttt cttgggtact gggcagagat aaaagttctt 60
ttcc 64
<210> 216
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 216
cactccaccg gcggcatgga cgag 24
<210> 217
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 217
cacgctgaac ttgtggccgt ttacgtcg 28
<210> 218
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 218
tataactagt atgaatccgc ggcaggggta ttccctcagc 40
<210> 219
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 219
tataggcgcg ccctacttat cgtcgtcatc cttgtaatct actgggcaga gataaaagtt 60
cttttcctcc tgg 73
<210> 220
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 220
tataactagt atggatatag aagatgaaga aaacatgagt tc 42
<210> 221
<211> 67
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 221
tataggcgcg ccctacttat cgtcgtcatc cttgtaatcg ggcgtgagtg agaactggtc 60
ctgctcg 67
<210> 222
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 222
tataactagt atggccgaga tcaaggagaa aatctgc 37
<210> 223
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 223
tataggcgcg ccctacttat cgtcgtcatc cttgtaatct actgggcaga gataaaagtt 60
cttttcctcc tgg 73
<210> 224
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 224
cgccatttcg gactgggag 19
<210> 225
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 225
agagacaggt ttctccatca attac 25
<210> 226
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 226
gagcccgcga gcaacc 16
<210> 227
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 227
gcagcaggaa gaagacggac 20
<210> 228
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 228
agaagcagtt gaagaccaga ctc 23
<210> 229
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 229
ggccttcacc tggaccatag 20
<210> 230
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 230
agagaagcag ttgaagacca ga 22
<210> 231
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 231
cggccttcac ctggaccata 20
<210> 232
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 232
cagagaagca gttgaagacc aga 23
<210> 233
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 233
cggccttcac ctggaccata 20
<210> 234
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 234
tttgtgaaag gctggggacc 20
<210> 235
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 235
acaggattgt attttgtagt ccacc 25
<210> 236
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 236
aggatgagtt ttgtgaaagg ctg 23
<210> 237
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 237
attttgtagt ccaccatcct gata 24
<210> 238
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 238
gatgagtttt gtgaaaggct gg 22
<210> 239
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 239
attttgtagt ccaccatcct gataa 25
<210> 240
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 240
cgaagagaac gagaccgcat 20
<210> 241
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 241
gaagatggtg cacaccggg 19
<210> 242
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 242
gacagatgct tcatcagcag tg 22
<210> 243
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 243
cgaacaaagc caaacccctt t 21
<210> 244
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 244
tctgttaatg gacaaataga aagcc 25
<210> 245
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 245
ggaacattca aaggattggc act 23
<210> 246
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 246
agtcactgca gatggacgca 20
<210> 247
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 247
atctcgatgg gaaattgcag gt 22
<210> 248
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 248
tcagagtttt acctcatcct tcttt 25
<210> 249
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 249
cctgaataca tatgatgacc ttcag 25
<210> 250
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 250
agggcacaga cacagacctc 20
<210> 251
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 251
agggctttca atgccaagac g 21
<210> 252
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 252
tgacaagcca agtcctccc 19
<210> 253
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 253
attgccaatg atgagctctg g 21
<210> 254
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 254
ttatagacat aagttctcct tgcct 25
<210> 255
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 255
tcaatcccat ggagccaaca 20
<210> 256
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 256
tacacgacgc tcttccgatc ttaagtagag gccgccactc caccggcggc 50
<210> 257
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 257
tacacgacgc tcttccgatc tatcatgctt agccgccact ccaccggcgg c 51
<210> 258
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 258
tacacgacgc tcttccgatc tgatgcacat ctgccgccac tccaccggcg gc 52
<210> 259
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 259
tacacgacgc tcttccgatc tcgattgctc gacgccgcca ctccaccggc ggc 53
<210> 260
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 260
tacacgacgc tcttccgatc ttcgatagca attcgccgcc actccaccgg cggc 54
<210> 261
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 261
tacacgacgc tcttccgatc tatcgatagt tgcttgccgc cactccaccg gcggc 55
<210> 262
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 262
tacacgacgc tcttccgatc tgatcgatcc agttaggccg ccactccacc ggcggc 56
<210> 263
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 263
tacacgacgc tcttccgatc tcgatcgatt tgagcctgcc gccactccac cggcggc 57
<210> 264
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 264
tacacgacgc tcttccgatc tacgatcgat acacgatcgc cgccactcca ccggcggc 58
<210> 265
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 265
tacacgacgc tcttccgatc ttacgatcga tggtccagag ccgccactcc accggcggc 59
<210> 266
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 266
agacgtgtgc tcttccgatc ttaagtagag tcgccgtcca gctcgaccag 50
<210> 267
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 267
agacgtgtgc tcttccgatc tatcatgctt atcgccgtcc agctcgacca g 51
<210> 268
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 268
agacgtgtgc tcttccgatc tgatgcacat cttcgccgtc cagctcgacc ag 52
<210> 269
<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 269
agacgtgtgc tcttccgatc tcgattgctc gactcgccgt ccagctcgac cag 53
<210> 270
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 270
agacgtgtgc tcttccgatc ttcgatagca attctcgccg tccagctcga ccag 54
<210> 271
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 271
agacgtgtgc tcttccgatc tatcgatagt tgctttcgcc gtccagctcg accag 55
<210> 272
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 272
agacgtgtgc tcttccgatc tgatcgatcc agttagtcgc cgtccagctc gaccag 56
<210> 273
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 273
agacgtgtgc tcttccgatc tcgatcgatt tgagccttcg ccgtccagct cgaccag 57
<210> 274
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 274
agacgtgtgc tcttccgatc tacgatcgat acacgatctc gccgtccagc tcgaccag 58
<210> 275
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 275
agacgtgtgc tcttccgatc ttacgatcga tggtccagat cgccgtccag ctcgaccag 59
<210> 276
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 276
ggggaactcg ggcaacct 18
<210> 277
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 277
gaatcggatc tgccccgtg 19
<210> 278
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 278
catcgaggcc aagctggaa 19
<210> 279
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 279
gtagtgagga gggagacccc 20
<210> 280
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 280
aagcctcctt ccttccccaa 20
<210> 281
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 281
atcgatacac tccctagccc a 21
<210> 282
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 282
acaaattcgg tacatcctcg ac 22
<210> 283
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 283
ttcagccatc tttggaaggt t 21
<210> 284
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 284
acgccgcatt gaccatctat 20
<210> 285
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 285
tagccaggag gttctcaaca 20
<210> 286
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 286
ggcatggact gtggtcatga g 21
<210> 287
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 287
tgcaccacca actgcttagc 20
<210> 288
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 288
ccccgtaatg cagaagaaga cc 22
<210> 289
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 289
gtccttcagc ttcagcctct g 21
<210> 290
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 290
aacgcaacat gaaggtgctc 20
<210> 291
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 291
accttgacgg tgactttggg 20
<210> 292
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 292
cagtgcaatg agggaccagt 20
<210> 293
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 293
aggaccatag gtacatcttc agag 24
<210> 294
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 294
cgaacgagtt gtatcacctg ga 22
<210> 295
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 295
cgatggctgt ccctcaaagt 20
<210> 296
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 296
agttgctctt ttcactcaag gtc 23
<210> 297
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 297
ttctctctga gttcagacgc t 21
<210> 298
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 298
tacacgacgc tcttccgatc ttaagtagag tggcacagga ggaaagagca tc 52
<210> 299
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 299
agacgtgtgc tcttccgatc ttaagtagag gcaccacctc catgccctc 49
<210> 300
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 300
tacacgacgc tcttccgatc ttaagtagag catcgcagac tgcggcaag 49
<210> 301
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 301
agacgtgtgc tcttccgatc ttaagtagag agtccatggg cctgtggaat gt 52
<210> 302
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 302
gaaaaactgg cccgagagc 19
<210> 303
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 303
ctgagtctgg gctgagggac 20
<210> 304
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 304
cgcttccagg tcaacaacac 20
<210> 305
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 305
ctcgcgtaga tcagcaccg 19
<210> 306
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 306
cccctctgag tcaggaaaca t 21
<210> 307
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 307
gaagatgaca ggggccagg 19
<210> 308
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 308
tagcactggc tggaatgag 19
<210> 309
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 309
gtttcggagg taacctgtaa g 21
<210> 310
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 310
tacagcaacc atgagtacaa 20
<210> 311
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 311
tcaggtgttt cacataggc 19
<210> 312
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 312
ctgcaaccat gagtgagaa 19
<210> 313
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 313
cctttgaggt gctttagata g 21
<210> 314
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 314
gccctgagaa aggagacat 19
<210> 315
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 315
ctgttctgga ggtactctag gtat 24
<210> 316
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 316
tttgaagagg gctgagaa 18
<210> 317
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 317
tgttctggat atttcatgg 19
<210> 318
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 318
catctgcctc cccatattcc 20
<210> 319
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 319
tccatcctag ctcatctcca aa 22
<210> 320
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 320
tgctccagaa ggccagac 18
<210> 321
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 321
ttcataaata ctactaaggc acagg 25
<210> 322
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 322
acagatgaag tgctccttcc a 21
<210> 323
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 323
gtcggagatt cgtagctgga t 21
<210> 324
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 324
cattgtggcc aaggagatct g 21
<210> 325
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 325
cttcggagtt tgggtttgct t 21
<210> 326
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 326
catcacttgc tgctgacacg 20
<210> 327
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 327
tgtggaatct gccgggag 18
<210> 328
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 328
ctgactctaa gtggcatt 18
<210> 329
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 329
tgatggcctt cgattctg 18
<210> 330
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 330
cggagtcaac ggatttggtc gta 23
<210> 331
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 331
agccttctcc atggtggtga agac 24
<210> 332
<211> 2820
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 332
atggccgaga tcaaggagaa aatctgcgac tatctcttca atgtgtctga ctcctctgcc 60
ctgaatttgg ctaaaaatat tggccttacc aaggcccgag atataaatgc tgtgctaatt 120
gacatggaaa ggcaggggga tgtctataga caagggacaa cccctcccat atggcatttg 180
acagacaaga agcgagagag gatgcaaatc aagagaaata cgaacagtgt tcctgaaacc 240
gctccagctg caatccctga gaccaaaaga aacgcagagt tcctcacctg taatataccc 300
acatcaaatg cctcaaataa catggtaacc acagaaaaag tggagaatgg gcaggaacct 360
gtcataaagt tagaaaacag gcaagaggcc agaccagaac cagcaagact gaaaccacct 420
gttcattaca atggcccctc aaaagcaggg tatgttgact ttgaaaatgg ccagtgggcc 480
acagatgaca tcccagatga cttgaatagt atccgcgcag caccaggtga gtttcgagcc 540
atcatggaga tgccctcctt ctacagtcat ggcttgccac ggtgttcacc ctacaagaaa 600
ctgacagagt gccagctgaa gaaccccatc agcgggctgt tagaatatgc ccagttcgct 660
agtcaaacct gtgagttcaa catgatagag cagagtggac caccccatga acctcgattt 720
aaattccagg ttgtcatcaa tggccgagag tttcccccag ctgaagctgg aagcaagaaa 780
gtggccaagc aggatgcagc tatgaaagcc atgacaattc tgctagagga agccaaagcc 840
aaggacagtg gaaaatcaga agaatcatcc cactattcca cagagaaaga atcagagaag 900
actgcagagt cccagacccc caccccttca gccacatcct tcttttctgg gaagagcccc 960
gtcaccacac tgcttgagtg tatgcacaaa ttggggaact cctgcgaatt ccgtctcctg 1020
tccaaagaag gccctgccca tgaacccaag ttccaatact gtgttgcagt gggagcccaa 1080
actttcccca gtgtgagtgc tcccagcaag aaagtggcaa agcagatggc cgcagaggaa 1140
gccatgaagg ccctgcatgg ggaggcgacc aactccatgg cttctgataa ccagcctgaa 1200
ggtatgatct cagagtcact tgataacttg gaatccatga tgcccaacaa ggtcaggaag 1260
attggcgagc tcgtgagata cctgaacacc aaccctgtgg gtggcctttt ggagtacgcc 1320
cgctcccatg gctttgctgc tgaattcaag ttggtcgacc agtccggacc tcctcacgag 1380
cccaagttcg tttaccaagc aaaagttggg ggtcgctggt tcccagccgt ctgcgcacac 1440
agcaagaagc aaggcaagca ggaagcagca gatgcggctc tccgtgtctt gattggggag 1500
aacgagaagg cagaacgcat gggtttcaca gaggtaaccc cagtgacagg ggccagtctc 1560
agaagaacta tgctcctcct ctcaaggtcc ccagaagcac agccaaagac actccctctc 1620
actggcagca ccttccatga ccagatagcc atgctgagcc accggtgctt caacactctg 1680
actaacagct tccagccctc cttgctcggc cgcaagattc tggccgccat cattatgaaa 1740
aaagactctg aggacatggg tgtcgtcgtc agcttgggaa cagggaatcg ctgtgtaaaa 1800
ggagattctc tcagcctaaa aggagaaact gtcaatgact gccatgcaga aataatctcc 1860
cggagaggct tcatcaggtt tctctacagt gagttaatga aatacaactc ccagactgcg 1920
aaggatagta tatttgaacc tgctaaggga ggagaaaagc tccaaataaa aaagactgtg 1980
tcattccatc tgtatatcag cactgctccg tgtggagatg gcgccctctt tgacaagtcc 2040
tgcagcgacc gtgctatgga aagcacagaa tcccgccact accctgtctt cgagaatccc 2100
aaacaaggaa agctccgcac caaggtggag aacggagaag gcacaatccc tgtggaatcc 2160
agtgacattg tgcctacgtg ggatggcatt cggctcgggg agagactccg taccatgtcc 2220
tgtagtgaca aaatcctacg ctggaacgtg ctgggcctgc aaggggcact gttgacccac 2280
ttcctgcagc ccatttatct caaatctgtc acattgggtt accttttcag ccaagggcat 2340
ctgacccgtg ctatttgctg tcgtgtgaca agagatggga gtgcatttga ggatggacta 2400
cgacatccct ttattgtcaa ccaccccaag gttggcagag tcagcatata tgattccaaa 2460
aggcaatccg ggaagactaa ggagacaagc gtcaactggt gtctggctga tggctatgac 2520
ctggagatcc tggacggtac cagaggcact gtggatgggc cacggaatga attgtcccgg 2580
gtctccaaaa agaacatttt tcttctattt aagaagctct gctccttccg ttaccgcagg 2640
gatctactga gactctccta tggtgaggcc aagaaagctg cccgtgacta cgagacggcc 2700
aagaactact tcaaaaaagg cctgaaggat atgggctatg ggaactggat tagcaaaccc 2760
caggaggaaa agaactttta tctctgccca gtagattaca aggatgacga cgataagtag 2820
<210> 333
<211> 3705
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 333
atgaatccgc ggcaggggta ttccctcagc ggatactaca cccatccatt tcaaggctat 60
gagcacagac agctcagata ccagcagcct gggccaggat cttcccccag tagtttcctg 120
cttaagcaaa tagaatttct caaggggcag ctcccagaag caccggtgat tggaaagcag 180
acaccgtcac tgccaccttc cctcccagga ctccggccaa ggtttccagt actacttgcc 240
tccagtacca gaggcaggca agtggacatc aggggtgtcc ccaggggcgt gcatctcgga 300
agtcaggggc tccagagagg gttccagcat ccttcaccac gtggcaggag tctgccacag 360
agaggtgttg attgcctttc ctcacatttc caggaactga gtatctacca agatcaggaa 420
caaaggatct taaagttcct ggaagagctt ggggaaggga aggccaccac agcacatgat 480
ctgtctggga aacttgggac tccgaagaaa gaaatcaatc gagttttata ctccctggca 540
aagaagggca agctacagaa agaggcagga acaccccctt tgtggaaaat cgcggtctcc 600
actcaggctt ggaaccagca cagcggagtg gtaagaccag acggtcatag ccaaggagcc 660
ccaaactcag acccgagttt ggaaccggaa gacagaaact ccacatctgt ctcagaagat 720
cttcttgagc cttttattgc agtctcagct caggcttgga accagcacag cggagtggta 780
agaccagaca gtcatagcca aggatcccca aactcagacc caggtttgga acctgaagac 840
agcaactcca catctgcctt ggaagatcct cttgagtttt tagacatggc cgagatcaag 900
gagaaaatct gcgactatct cttcaatgtg tctgactcct ctgccctgaa tttggctaaa 960
aatattggcc ttaccaaggc ccgagatata aatgctgtgc taattgacat ggaaaggcag 1020
ggggatgtct atagacaagg gacaacccct cccatatggc atttgacaga caagaagcga 1080
gagaggatgc aaatcaagag aaatacgaac agtgttcctg aaaccgctcc agctgcaatc 1140
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<210> 334
<211> 2130
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 334
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<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
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ggccctgttt gctttttata a 4401
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<223> dRNA/arRNA
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ctctcattta cttcaccacc agcagtttcc tcacaacagt ctaagttaaa gcagtcaaac 3060
atgctgaccg ctcaagagat tctacatcag tttggtttca ctcagaccgg gattatcagc 3120
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<210> 338
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 338
atggctcaag attcagtaga tctttcttgt gattatcagt tttggatgca gaagctttct 60
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<211> 3825
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 339
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gtctctgaca ccacggtctc cctcaagtgg cggcccccag agcgcgtggg agcaggaggc 2700
ctggatggct acagcgtgga gtactgccca gagggctgct cagagtgggt ggctgccctg 2760
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caggttgttg acaagccaag tcctccccag gatctccggg tgactgacgc ctggggtctt 3240
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gtggggctga acacgacaat tctgacgccc aatgggaatg aagacaccac agctgatttc 120
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<212> DNA
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<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 342
uaauccugaa uaucgcgcaa uuccccagca gagaacaucg cggugugaac gucccuuuau 60
accgggcagg uauagcugaa aucagcgugg c 91
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<212> RNA
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<220>
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uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc gcgauguucu cugcugggga 60
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<212> RNA
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gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca 60
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<212> RNA
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<220>
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<212> RNA
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gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca ucugcggggc gggggggggc cgucgccgcg u 101
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<212> RNA
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gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca ucugcggggc gggggggggc c 91
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cugcuccuca ucugcggggc g 81
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cgucgccgcg uggggucguu g 81
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uggggucguu g 71
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<212> RNA
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cggcccagag cugcuccuca ucugcggggc gggggggggc cgucgccgcg uggggucguu 60
g 61
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gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca ucugcggggc 80
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cugcuccuca ucugcgggg 79
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<223> dRNA/arRNA
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gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
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cugcuccuca ucugc 75
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gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca ucu 73
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<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 365
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuca uc 72
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<212> RNA
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cugcuccuca 70
<210> 367
<211> 69
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 367
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccuc 69
<210> 368
<211> 68
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 368
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuccu 68
<210> 369
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 369
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcucc 67
<210> 370
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 370
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcuc 66
<210> 371
<211> 65
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 371
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugcu 65
<210> 372
<211> 64
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 372
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cugc 64
<210> 373
<211> 63
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 373
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cug 63
<210> 374
<211> 62
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 374
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
cu 62
<210> 375
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 375
gacgcccacc gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag 60
c 61
<210> 376
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 376
uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60
gcgauguucu 70
<210> 377
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 377
uaccgcuaca gccacgcuga uuucagcuau accugcccgg uauaaaggga cguucacacc 60
gcgaug 66
<210> 378
<211> 71
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 378
ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60
ccucaucugc g 71
<210> 379
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 379
gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca 60
ucugcg 66
<210> 380
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 380
guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu ccucaucugc 60
g 61
<210> 381
<211> 56
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 381
uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca ucugcg 56
<210> 382
<211> 66
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 382
ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60
ccucau 66
<210> 383
<211> 61
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 383
gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca 60
u 61
<210> 384
<211> 56
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 384
guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu ccucau 56
<210> 385
<211> 51
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 385
uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca u 51
<210> 386
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 386
acgcccaccg ugugguugcu guccaggacg gucccggccu gcgacacuuc ggcccagagc 60
ugcuccu 67
<210> 387
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 387
cgcccaccgu gugguugcug uccaggacgg ucccggccug cgacacuucg gcccagagcu 60
gcuccuc 67
<210> 388
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 388
gcccaccgug ugguugcugu ccaggacggu cccggccugc gacacuucgg cccagagcug 60
cuccuca 67
<210> 389
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 389
cccaccgugu gguugcuguc caggacgguc ccggccugcg acacuucggc ccagagcugc 60
uccucau 67
<210> 390
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 390
ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60
ccucauc 67
<210> 391
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 391
caccgugugg uugcugucca ggacgguccc ggccugcgac acuucggccc agagcugcuc 60
cucaucu 67
<210> 392
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 392
accguguggu ugcuguccag gacggucccg gccugcgaca cuucggccca gagcugcucc 60
ucaucug 67
<210> 393
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 393
ccgugugguu gcuguccagg acggucccgg ccugcgacac uucggcccag agcugcuccu 60
caucugc 67
<210> 394
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 394
cgugugguug cuguccagga cggucccggc cugcgacacu ucggcccaga gcugcuccuc 60
aucugcg 67
<210> 395
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 395
gugugguugc uguccaggac ggucccggcc ugcgacacuu cggcccagag cugcuccuca 60
ucugcgg 67
<210> 396
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 396
ugugguugcu guccaggacg gucccggccu gcgacacuuc ggcccagagc ugcuccucau 60
cugcggg 67
<210> 397
<211> 67
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 397
gugguugcug uccaggacgg ucccggccug cgacacuucg gcccagagcu gcuccucauc 60
ugcgggg 67
<210> 398
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 398
acgcccaccg ugugguugcu guccaggacg gucccggccu gcgacacuuc ggcccagagc 60
ugcuccucau 70
<210> 399
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 399
cgcccaccgu gugguugcug uccaggacgg ucccggccug cgacacuucg gcccagagcu 60
gcuccucauc 70
<210> 400
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 400
gcccaccgug ugguugcugu ccaggacggu cccggccugc gacacuucgg cccagagcug 60
cuccucaucu 70
<210> 401
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 401
cccaccgugu gguugcuguc caggacgguc ccggccugcg acacuucggc ccagagcugc 60
uccucaucug 70
<210> 402
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 402
ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60
ccucaucugc 70
<210> 403
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 403
caccgugugg uugcugucca ggacgguccc ggccugcgac acuucggccc agagcugcuc 60
cucaucugcg 70
<210> 404
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 404
accguguggu ugcuguccag gacggucccg gccugcgaca cuucggccca gagcugcucc 60
ucaucugcgg 70
<210> 405
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 405
ccgugugguu gcuguccagg acggucccgg ccugcgacac uucggcccag agcugcuccu 60
caucugcggg 70
<210> 406
<211> 70
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 406
cgugugguug cuguccagga cggucccggc cugcgacacu ucggcccaga gcugcuccuc 60
aucugcgggg 70
<210> 407
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 407
acgcccaccg ugugguugcu guccaggacg gucccggccu gcgacacuuc ggcccagagc 60
ugcuccucau cu 72
<210> 408
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 408
cgcccaccgu gugguugcug uccaggacgg ucccggccug cgacacuucg gcccagagcu 60
gcuccucauc ug 72
<210> 409
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 409
gcccaccgug ugguugcugu ccaggacggu cccggccugc gacacuucgg cccagagcug 60
cuccucaucu gc 72
<210> 410
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 410
cccaccgugu gguugcuguc caggacgguc ccggccugcg acacuucggc ccagagcugc 60
uccucaucug cg 72
<210> 411
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 411
ccaccgugug guugcugucc aggacggucc cggccugcga cacuucggcc cagagcugcu 60
ccucaucugc gg 72
<210> 412
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 412
caccgugugg uugcugucca ggacgguccc ggccugcgac acuucggccc agagcugcuc 60
cucaucugcg gg 72
<210> 413
<211> 72
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 413
accguguggu ugcuguccag gacggucccg gccugcgaca cuucggccca gagcugcucc 60
ucaucugcgg gg 72
<210> 414
<211> 50
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dRNA/arRNA
<400> 414
cuguccagga cggucccggc cugcgacacu ucggcccaga gcugcuccuc 50
<210> 415
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 正向引物: hIDUA-62F
<400> 415
ccttcctgag ctaccacccg 20
<210> 416
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 反向引物: hIDUA-62R
<400> 416
ccagggctcg aactcggtag 20

Claims (31)

1.60-200个核苷酸的脱氨酶招募RNA(dRNA)，其中：
a)所述dRNA包含能够与靶标RNA杂交的互补RNA序列；
b)所述dRNA能够招募脱氨酶或包含脱氨酶的构建体或包含脱氨酶的催化结构域的构建体以使所述靶标RNA中的靶标腺苷脱氨；以及
c)所述dRNA包含一种或多种化学修饰。
2.如权利要求1所述的dRNA，其中所述dRNA长于约60nt，65nt，70nt，80nt，90nt，100nt或110nt中的任何一个。
3.如权利要求1或权利要求2所述的dRNA，其包含与互补的靶标RNA区域的一个或多个错配，摆动和/或突起。
4.如权利要求1-3中任一项所述的dRNA，其中所述互补RNA序列包含与所述靶标RNA中的靶标腺苷直接相对的胞苷、腺苷或尿苷。
5.如权利要求4所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷，腺苷或尿苷位于距3'末端至少约7个核苷酸，例如距3'末端至少约8、9或10个核苷酸。
6.如权利要求4-5中任一项所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷、腺苷或尿苷位于距5'末端至少约25个核苷酸，例如距5'末端至少约30、35、40、45、50或55个核苷酸。
7.如权利要求4-6中任一项所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷、腺苷或尿苷侧翼的5'和3'序列的长度不相等。
8.如权利要求4至7中任一项所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷直接相对的所述胞苷、腺苷或尿苷侧翼的5'序列的长度长于所述3'序列。
9.如权利要求1至8中任一项所述的dRNA，其在所述靶标RNA中包含与所述靶标腺苷直接相对的胞苷。
10.如权利要求1至9中任一项所述的dRNA，其中所述互补RNA序列包含一个或多个鸟苷，其各自与所述靶标RNA中的非靶标腺苷相对。
11.如权利要求1-10中任一项所述的dRNA，其中所述互补序列包含与所述靶标RNA中的非靶标腺苷相对的两个或更多个连续错配的核苷酸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的dRNA，其中所述靶标RNA中的所述靶标腺苷的5'最近邻是选自U、C、A和G的核苷酸，优选U＞C≈A＞G，并且所述靶标RNA中的所述靶标腺苷的3'最近邻是选自G、C、A和U的核苷酸，优选G＞C＞A≈U。
13.如权利要求1至12中任一项所述的dRNA，其中所述靶标腺苷位于所述靶标RNA中的一个三碱基基序，所述三碱基基序选自下组：UAG，UAC，UAA，UAU，CAG，CAC，CAA，CAU，AAG，AAC，AAA，AAU，GAG，GAC，GAA和GAU。
14.如权利要求13所述的dRNA，其中所述三碱基基序是UAG，并且其中所述dRNA包含与所述三碱基基序中的尿苷直接相对的A，与所述靶标腺苷直接相对的胞苷，以及与所述三碱基基序中的鸟苷直接相对的胞苷、鸟苷或尿苷。
15.如权利要求14所述的dRNA，其包含与UAG的三碱基基序直接相对的5'-CCA-3'。
16.如权利要求1-15中任一项所述的dRNA，其中所述化学修饰包括甲基化和/或硫代磷酸酯化。
17.如权利要求16所述的dRNA，其中所述化学修饰包括2'-O-甲基化和/或核苷酸间硫代磷酸酯连接。
18.如权利要求16所述的dRNA，其中所述化学修饰包括首尾各1-5、2-5、3-5、4-5个核苷酸的2'-O-甲基化和/或首尾各1-5、2-5、3-5、4-5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化。
19.如权利要求16至18中任一项所述的dRNA，其中所述化学修饰包括与所述靶标腺苷相对的核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸的2'-O-甲基化和/或3'-硫代磷酸酯化。
20.如权利要求1至19中任一项所述的dRNA，所述化学修饰选自下组：
1)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化和/或首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化；
2)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化和/或首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，和单个或多个或所有尿苷的2'-O-甲基化；
3)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，单个或多个或所有尿苷中的2'-O-甲基化，以及与所述靶标腺苷相对的核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸的修饰；
4)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，单个或多个或所有尿苷的2'-O-甲基化，以及与所述靶标腺苷相对的核苷酸的3'端和/或5'端最邻近的核苷酸的2'-O-甲基化；
5)首尾各3个核苷酸的2'-O-甲基化，首尾各3个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化，单个或多个或所有尿苷的2'-O-甲基化，以及与所述靶标腺苷相对的核苷酸和/或其5'和/或3'最邻近的核苷酸的硫代磷酸酯化连接；
6)首尾各1-5个核苷酸的2'-O-甲基化和/或首尾各1-5个核苷酸间连接的硫代磷酸酯化。
21.如权利要求20所述的dRNA，其中与所述靶标腺苷相对的核苷酸和/或与所述靶腺苷相对的核苷酸最邻近的一个或两个核苷酸的修饰是2'-O-甲基化和/或硫代磷酸酯化连接。
22.如权利要求1-21中任一项所述的dRNA，其不包含能够形成用于结合ADAR酶的分子内茎环结构的ADAR招募结构域。
23.一种包含或编码如权利要求1-22中任一项所述的dRNA的构建体。
24.一种用于在宿主细胞中编辑靶标RNA的方法，包括将如权利要求1-23中任一项所述的dRNA引入宿主细胞。
25.如权利要求24所述的方法，其进一步包括将ADAR3的抑制剂引入所述宿主细胞。
26.如权利要求24或权利要求25所述的方法，其进一步包括将干扰素的刺激物引入所述宿主细胞。
27.如权利要求24-26中任一项所述的方法，其包括引入各自靶向不同靶标RNA的多个dRNA。
28.如权利要求24-27中任一项所述的方法，其中所述dRNA不诱导免疫应答。
29.如权利要求24-28中任一项所述的方法，进一步包括将外源ADAR引入所述宿主细胞。
30.如权利要求29所述的方法，其中所述ADAR是包含E1008突变的ADAR1。
31.一种构建体、组合物、细胞、文库或试剂盒，其包含如权利要求1-23中任一项所述的dRNA。
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